ES2604490T3 - Proteínas beta-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes con estabilidad aumentada y actividad catalítica retenida aumentada - Google Patents

Proteínas beta-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes con estabilidad aumentada y actividad catalítica retenida aumentada Download PDF

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Abstract

Una proteína ß-glucocerebrosidasa humana recombinante, variante que tiene una mutación seleccionada de: F316A y L317F; H145L; H145F; H145L, F316A y L317F; K321A; y K321V; respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

Description

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fosfato potásico 0,1 M (pH 7,5)/Triton X-100 al 0,2% (v/v)/BSA al 0,2% (p/v) en tubos de microcentrífuga de 0,5 ml. Asimismo, la proteína β-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre purificada se diluyó en serie hasta
1:12.500 en medio DMEM/FBS al 10% y se añadieron 60 µl de esta muestra proteína β-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre diluida a 420 µl de fosfato potásico 0,1 M (pH 7,5)/Triton X-100 al 0,2% (v/v)/BSA al 0,2% (p/v) para obtener una dilución final de 1:100.000. (Esta cantidad de proteína β-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre se determinó empíricamente para que contuviera cantidades similares de actividad enzimática a las proteínas β-glucocerebrosidasa recombinantes expresadas de forma transitoria). Todas las muestras se incubaron en un baño de agua de 37ºC y se retiraron 70 µl de cada muestra en puntos temporales especificados (0, 30, 60, 90, 120 o 180 min) y se añadieron a tubos nuevos de microcentrífuga de 0,5 ml que contenían 20 µl de NaOAc 0,5 M (pH 5,2). Las muestras se mezclaron minuciosamente y se usaron 25 µl de cada muestra diluida para medir la actividad enzimática residual de la proteína β-glucocerebrosidasa recombinante (por triplicado) como se ha descrito anteriormente. La actividad enzimática inicial (a t = 0 min) se designó como el 100% para cada proteína β-glucocerebrosidasa recombinante mientras que las actividades enzimáticas para todos los puntos temporales posteriores se normalizaron a la actividad inicial para determinar la actividad enzimática residual sobre el curso completo de tiempo. Se usaron los datos de múltiples experimentos (al menos 2 experimentos diferentes) para obtener valores promedio para actividad residual de proteína β-glucocerebrosidasa recombinante para puntos temporales individuales y se representaron en gráfico respecto al tiempo de incubación, como se muestra.
Ejemplo 2
Se comparó la expresión de proteínas β-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes con sustituciones específicas de aminoácidos con la proteína β-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre ("GlcCerasa de tipo silvestre") usando experimentos de transfección transitoria descritos anteriormente (Figura 1). Como puede observarse en la Figura 1A, la proteína β-glucocerebrosidasa recombinante, variante con las variaciones F316A y L317F ("GlcCerasa-F316A/L317F"), la proteína β-glucocerebrosidasa recombinante, variante con la variación K321N ("GlcCerasa-K321N"), la proteína β-glucocerebrosidasa recombinante, variante con la variación H145L ("GlcCerasa-H145L"), las proteínas β-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes con las variaciones F316A, L317F y K321N ("GlcCerasa-F316A/L317F/K321N"), las proteínas β-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes con las variaciones H145L y K321N ("GlcCerasa-H145L/K321N") se expresaron de forma transitoria con la GlcCerasa de tipo silvestre en células HEK293T. El medio de cultivo celular condicionado se recogió 48 horas después de la transfección y se ensayó para la actividad enzimática β-glucocerebrosidasa usando el sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-β-D-glucósido (4-MUG) para evaluar el nivel relativo de expresión de estas enzimas GlcCerasa variantes en comparación con la GlcCerasa de tipo silvestre. Estos resultados demuestran que se expresaban diferentes enzimas GlcCerasa variantes tan bien o mejor que la GlcCerasa de tipo silvestre, como se evidencia por la mayor actividad enzimática medida en el medio de cultivo celular. También se expresaban otras enzimas GlcCerasa variantes incluyendo GlcCerasa-H145F, GlcCerasa-H145L/F316A/L317F/K321N mejor que la GlcCerasa de tipo silvestre (datos no mostrados). La GlcCerasa-K321A y GlcCerasa-H145F/F316A/L317F/K321N se expresaban a aproximadamente el mismo nivel que la GlcCerasa de tipo silvestre mientras que la GlcCerasa-K321V se expresaba de forma menor eficaz que la GlcCerasa de tipo silvestre (datos no mostrados).
La cantidad de proteínas GlcCerasa variantes y GlcCerasa de tipo silvestre presente en medio de cultivo celular condicionado se evaluó usando transferencia de Western como se ha descrito anteriormente. Como puede observarse en la Figura 1B, estaban presentes cantidades mayores de proteínas GlcCerasa-F316A/L317F y GlcCerasa-K321N en medio de cultivo celular condicionado que GlcCerasa de tipo silvestre. Estos datos de transferencia de Western son coherentes con los resultados de actividad enzimática GlcCerasa y confirman que ciertas enzimas GlcCerasa variantes se expresan y secretan mejor que la GlcCerasa de tipo silvestre. Se observaron resultados similares para otras proteínas GlcCerasa variantes (datos no mostrados).
Ejemplo 3
La proteína β-glucocerebrosidasa recombinante, variante con las variaciones F316A y L317F ("GlcCerasa-F316A/L317F") se comparó con la proteína β-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre purificada ("GlcCerasa de tipo silvestre") usando el ensayo de estabilidad in vitro descrito anteriormente. Las condiciones usadas para las proteínas variantes y de tipo silvestre fueron idénticas. Como puede observarse en la Figura 2, la GlcCerasa-F316A/L317F es significativamente más estable que la GlcCerasa de tipo silvestre a aproximadamente pH neutro y aproximadamente 37ºC sobre un curso de tiempo de dos o tres horas. La GlcCerasa-F316A/L317F retenía el 85% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa-F316A/L317F retenía el 73% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa-F316A/L317F retenía el 50% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa-F316A/L317F retenía el 34% de su actividad inicial después de 180 minutos de incubación. Por comparación, la GlcCerasa de tipo silvestre tratada en las mismas condiciones experimentales retenía el 68% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 46% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 20% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 8% de su actividad inicial después de 180 minutos de incubación.
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La semivida estimada (definida operativamente en este estudio como el tiempo de incubación a aproximadamente pH 7,5 y aproximadamente 37ºC que provocaba una pérdida del 50% de la actividad enzimática inicial) para la GlcCerasa-F316A/L317F es de aproximadamente 120 minutos mientras que la semivida estimada para la GlcCerasa de tipo silvestre es de aproximadamente 50 minutos en estas condiciones experimentales. La GlcCerasa-F316A/L317F se ensayó también a aproximadamente pH 8 y aproximadamente 37ºC y presentó una tendencia similar (Figura 3). Tanto la GlcCerasa-F316A/L317F como la GlcCerasa de tipo silvestre eran menos estable a aproximadamente pH 8 y aproximadamente 37ºC, pero estos resultados confirman que la GlcCerasa-F316A/L317F es más estable a mayor pH que la GlcCerasa de tipo silvestre.
Ejemplo 4
La proteína β-glucocerebrosidasa recombinante, variante con la variación K321N ("GlcCerasa-K321N") se comparó con la proteína β-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre purificada ("GlcCerasa de tipo silvestre") usando el ensayo descrito anteriormente. Las condiciones usadas para las proteínas variantes y de tipo silvestre fueron idénticas. Como puede observarse en la Figura 2, la GlcCerasa-K321N es significativamente más estable que la GlcCerasa de tipo silvestre a aproximadamente pH neutro y aproximadamente 37ºC sobre un curso de tiempo de tres horas. La GlcCerasa-K321N retenía el 104% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa-K321N retenía el 91% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa-K321N retenía el 76% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa-K321N retenía el 54% de su actividad inicial después de 180 minutos de incubación. Por comparación, la GlcCerasa de tipo silvestre tratada en las mismas condiciones experimentales retenía el 68% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 46% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 20% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 8% de su actividad inicial después de 180 minutos de incubación.
La semivida estimada (definida operativamente en este estudio como el tiempo de incubación a aproximadamente pH 7,5 y aproximadamente 37ºC que provocaba una pérdida del 50% de la actividad enzimática inicial) para la GlcCerasa-K321N es de aproximadamente 180 minutos mientras que la semivida estimada para la GlcCerasa de tipo silvestre es de aproximadamente 50 minutos en estas condiciones experimentales.
Ejemplo 5
La proteína β-glucocerebrosidasa recombinante, variante con la variación H145L ("GlcCerasa-H145L") se comparó con la proteína β-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre purificada ("GlcCerasa de tipo silvestre") usando el ensayo descrito anteriormente. Las condiciones usadas para las proteínas variantes y de tipo silvestre fueron idénticas. Como puede observarse en la Figura 2, la GlcCerasa-H145L es significativamente más estable que la GlcCerasa de tipo silvestre a aproximadamente pH neutro y aproximadamente 37ºC sobre un curso de tiempo de tres horas. La GlcCerasa-H145L retenía el 92% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa-H145L retenía el 87% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa-H145L retenía el 62% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa-H145L retenía el 42% de su actividad inicial después de 180 minutos de incubación. Por comparación, la GlcCerasa de tipo silvestre tratada en las mismas condiciones experimentales retenía el 68% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 46% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 20% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 8% de su actividad inicial después de 180 minutos de incubación.
La semivida estimada (definida operativamente en este estudio como el tiempo de incubación a aproximadamente pH 7,5 y aproximadamente 37ºC que provocaba una pérdida del 50% de la actividad enzimática inicial) para la GlcCerasa-H145L es de aproximadamente 160 minutos mientras que la semivida estimada para la GlcCerasa de tipo silvestre es de aproximadamente 50 minutos en estas condiciones experimentales.
Ejemplo 6
La proteína β-glucocerebrosidasa recombinante, variante con la variación H145F ("GlcCerasa-H145F") se comparó con la proteína β-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre purificada ("GlcCerasa de tipo silvestre") usando el ensayo descrito anteriormente. Las condiciones usadas para las proteínas variantes y de tipo silvestre fueron idénticas. Como puede observarse en la Figura 1, la GlcCerasa-H145F es significativamente más estable que la GlcCerasa de tipo silvestre a aproximadamente pH neutro y aproximadamente 37ºC sobre un curso de tiempo de tres horas. La GlcCerasa-H145F retenía el 94% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa-H145F retenía el 80% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa-H145F retenía el 37% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa-H145F retenía el 17% de su actividad inicial después de 180 minutos de incubación. Por comparación, la GlcCerasa de tipo silvestre tratada en las mismas condiciones experimentales retenía el 68% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 46% de su actividad inicial después de 60 minutos de
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La semivida estimada (definida operativamente en este estudio como el tiempo de incubación a aproximadamente pH 7,5 y aproximadamente 37ºC que provocaba una pérdida del 50% de la actividad enzimática inicial) para la GlcCerasa-H145L/K321N es de aproximadamente 180 minutos mientras que la semivida estimada para la GlcCerasa de tipo silvestre es de aproximadamente 50 minutos en estas condiciones experimentales.
Ejemplo 10
La proteína β-glucocerebrosidasa recombinante, variante con la variación K321A ("GlcCerasa-K321A") se comparó con la proteína β-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre purificada ("GlcCerasa de tipo silvestre") usando el ensayo descrito anteriormente. Las condiciones usadas para las proteínas variantes y de tipo silvestre fueron idénticas. Como puede observarse en la Figura 2, la GlcCerasa-K321A es significativamente más estable que la GlcCerasa de tipo silvestre a aproximadamente pH neutro y aproximadamente 37ºC sobre un curso de tiempo de tres horas. La GlcCerasa-K321A retenía el 90% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa-K321A retenía el 89% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa-K321A retenía el 68% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa-K321A retenía el 49% de su actividad inicial después de 180 minutos de incubación. Por comparación, la GlcCerasa de tipo silvestre tratada en las mismas condiciones experimentales retenía el 68% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 46% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 20% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 8% de su actividad inicial después de 180 minutos de incubación.
La semivida estimada (definida operativamente en este estudio como el tiempo de incubación a aproximadamente pH 7,5 y aproximadamente 37ºC que provocaba una pérdida del 50% de la actividad enzimática inicial) para la GlcCerasa-K321A es de aproximadamente 170 minutos mientras que la semivida estimada para la GlcCerasa de tipo silvestre es de aproximadamente 50 minutos en estas condiciones experimentales.
Ejemplo 11
La proteína β-glucocerebrosidasa recombinante, variante con la variación K321A ("GlcCerasa-K321V") se comparó con la proteína β-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre purificada ("GlcCerasa de tipo silvestre") usando el ensayo descrito anteriormente. Las condiciones usadas para las proteínas variantes y de tipo silvestre fueron idénticas. La GlcCerasa-K321V es significativamente más estable que la GlcCerasa de tipo silvestre a aproximadamente pH neutro y aproximadamente 37ºC sobre un curso de tiempo de tres horas. La GlcCerasa-K321V retenía el 74% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa-K321V retenía el 55% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa-K321V retenía el 29% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa-K321V retenía el 15% de su actividad inicial después de 180 minutos de incubación. Por comparación, la GlcCerasa de tipo silvestre tratada en las mismas condiciones experimentales retenía el 68% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 46% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 20% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 8% de su actividad inicial después de 180 minutos de incubación.
La semivida estimada (definida operativamente en este estudio como el tiempo de incubación a aproximadamente pH 7,5 y aproximadamente 37ºC que provocaba una pérdida del 50% de la actividad enzimática inicial) para la GlcCerasa-K321V es de aproximadamente 70 minutos mientras que la semivida estimada para la GlcCerasa de tipo silvestre es de aproximadamente 50 minutos en estas condiciones experimentales.
Los resultados anteriores se resumen en la Tabla 1
Tabla 1
Proteína GlcCerasa recombinante
n = Actividad residual (3 h) Semivida estimada Mejora factorial
Tipo silvestre
7 8% ~50 min -
H145L
4 42% ~160 min 3,2
H145F
2 17% ~100 min 2,0
F316A/L317F
4 34% ~120 min 2,4
K321N
4 54% >180 min >3,6
K321A
2 49% ~170 min 3,4
K321V
1 15% ~70 min 1,4
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35
40
45
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60
F316A/L317F/K321N
5 52% >180 min >3,6
H145L/ F316A/L317F
1 39% ~135 min 2,7
H145L/K321N
2 62% >180 min >3,6
La actividad residual es la cantidad de actividad enzimática que permanece después de la incubación de tres horas y se expresa como el porcentaje de la actividad enzimática inicial (a t=0 min) para cada proteína β-glucocerebrosidasa recombinante, variante en el ensayo de estabilidad. Cada proteína β-glucocerebrosidasa recombinante se ensayó en al menos dos experimentos diferentes (indicados por n en la Tabla 1) para determinar las actividades residuales promedio durante el curso de tiempo de tres horas excepto para la GlcCerasa-K321V y la GlcCerasa-H145L/F316A/L317F que se ensayaron solamente una vez. La mejora factorial se refiere al aumento en las semividas aparentes de las proteínas GlcCerasa recombinantes, variantes respecto a la proteína GlcCerasa recombinante, de tipo silvestre purificada.
La proteína β-glucocerebrosidasa recombinante, variante que tiene una variación de aminoácido en la posición 145, 316, 317 o 321 o la GlcCerasa-F316A/L317F, GlcCerasa-K321N, GlcCerasa-K321A, GlcCerasa-K321V, GlcCerasa-H145L, GlcCerasa-H145F, o GlcCerasa-F316A/L317F/K321N o GlcCerasa-F316A/L317F/K321A o GlcCerasa-F316A/L317F/K321V o GlcCerasa-H145L/F316A/L317F o GlcCerasa-H145L/K321N que puede caracterizarse por retener más actividad catalítica respecto a la β-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre podrían prepararse en células de levadura, células vegetales, células de mamífero o animales transgénicos usando técnicas de biología molecular y de purificación de proteínas conocidas para los expertos en la materia.
Una composición que comprende la proteína β-glucocerebrosidasa recombinante, variante que tiene una variación de aminoácido en la posición 145, 316, 317 o 321 o la GlcCerasa-F316A/L317F, GlcCerasa-K321N, GlcCerasa-K321A, GlcCerasa-K321V, GlcCerasa-H145L, GlcCerasa-H145F, o GlcCerasa-F316A/L317F/K321N o GlcCerasa-F316A/L317F/K321A o GlcCerasa-F316A/L317F/K321V o GlcCerasa-H145L/F316A/L317F o GlcCerasa-H145L/K321N y un vehículo farmacéuticamente aceptable podría prepararse usando vehículos farmacéuticamente aceptables conocidos para los expertos en la materia.
Una composición que comprende la proteína β-glucocerebrosidasa recombinante, variante que tiene una variación de aminoácido en la posición 145, 316, 317 o 321 o la GlcCerasa-F316A/L317F, GlcCerasa-K321N, GlcCerasa-K321A, GlcCerasa-K321V, GlcCerasa-H145L, GlcCerasa-H145F, o GlcCerasa-F316A/L317F/K321N o GlcCerasa-F316A/L317F/K321A o GlcCerasa-F316A/L317F/K321V o GlcCerasa-H145L/F316A/L317F o GlcCerasa-H145L/K321N y un tampón farmacéuticamente aceptable podría prepararse usando tampones farmacéuticamente aceptables conocidos para los expertos en la materia.
Ejemplo 12
Como la proteína GlcCerasa es estable a pH ácido y muy eficaz en eliminar el sustrato glucosilceramida acumulado dentro de los lisosomas, se puede desarrollar una ERT con GlcCerasa más estable que puede resistir mejor el entorno desfavorable (pH neutro) para retener su actividad catalítica de modo que se suministre una cantidad mayor de fármaco activo a los lisosomas para una eficacia mejorada. La enzima GlcCerasa puede estabilizarse a aproximadamente pH neutro cuando se une (e inhibe) por el inhibidor enzimático de sitio activo isofagomina (IFG). La estabilidad de la proteína para la GlcCerasa recombinante a aproximadamente pH neutro se mejora significativamente con IFG, como se evidencia por un aumento de hasta 15ºC en la temperatura de fusión térmica (Tm). Se cree que el mecanismo de acción para la estabilización de GlcCerasa inducida por IFG resulta de la red extensiva de enlaces de hidrógeno entre IFG y seis restos de sitio activo de GlcCerasa para restringir el desplegamiento del sitio activo y las regiones adyacentes para mantener una conformación de GlcCerasa más estable. Mantener la apropiada estructura de GlcCerasa en el sitio activo y las regiones adyacentes ayuda a la actividad catalítica y la estabilidad global de GlcCerasa. Varias modificaciones diferentes en GlcCerasa pueden ayudar a retener la actividad catalítica y mantener una estructura proteica más estable a aproximadamente pH neutro. En este documento se proporciona la construcción de una serie de diferentes enzimas GlcCerasa con sustituciones específicas de aminoácidos en localizaciones estratégicas dentro de estructuras de bucle cerca del sitio activo para ayudar a formar una región más ordenada cerca del sitio activo que son menos propensas a desenrollarse a aproximadamente pH neutro. Además, en este documento se proporcionan modificaciones en una hélice α cerca del sitio activo que pueden ayudar a mover esta hélice y un bucle adyacente desde el sitio catalítico para mantener una conformación abierta y activa.
Se utilizó una aproximación para generar una serie de enzimas GlcCerasa modificadas que se había predicho que tenían estabilidad proteica superior que la GlcCerasa de tipo silvestre. En primer lugar, se usaron dos estrategias diferentes pero complementarias: (1) modificación de ciertos bucles y hélices cerca del sitio catalítico para imitar las conformaciones preferidas de GlcCerasa activa sin inhibir realmente la enzima; y (2) modificación de una región de enrollamiento aleatorio que puede potenciar las interacciones entre diferentes restos y estructuras secundarias para una estabilidad proteica mejorada.
En un ejemplo, se modificaron varios restos dentro de la región del bucle 1 (posiciones 311-319) para ayudar a formar una región más ordenada cerca del sitio activo que sería menos propensa a desenrollamiento a
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clonación del producto de PCR en los vectores de expresión. Las reacciones de PCR se combinaron y el producto resultante de PCR de ~1,6 kilobases (kb) se separó y se escindió de un gel preparativo de agarosa al 1% (p/v) y se aisló usando el kit de extracción de gel de QIAGEN™. El producto de PCR se digirió posteriormente durante una noche con las endonucleasas de restricción BglII y NotI a 37ºC y se volvió a purificar usando el kit de limpieza de PCR de QIAGEN™ según las instrucciones del fabricante. El vector de expresión en mamífero pEF6/V5-HisA™ se digirió con BamHI y NotI, se desfosforiló usando fosfatasa Antarctic™ y se aisló usando el kit de limpieza de PCR de QIAGEN™. El producto de PCR digerido con BglII-NotI (2 µl) se ligó en el vector BamHI-NotI pEF6/V5-HisA™ (1 µl) usando ADN ligasa T4 (NEB™) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se transformaron células de E. coli químicamente competentes con 1 µl de la reacción de ligamiento y se sembraron en placas de agar Luria-Bertani (LB) que contenían 100 µg/ml de ampicilina y se incubaron durante una noche a 37ºC para formar distintas colonias bacterianas que se habían transformado con el ADN plasmídico que contenía el gen de la β-lactamasa para conferir resistencia a ampicilina. Se picaron colonias bacterianas individuales resistentes a ampicilina y se expandieron en 4 ml de caldo LB (que contenía 100 µg/ml de ampicilina) durante una noche a 37ºC y se aisló el ADN plasmídico en el siguiente día por Miniprep™ (QIAGEN™) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ADN plasmídicos aislados se comprobaron mediante dos reacciones diferentes de digestión de restricción usando EcoRI y NheI, y BamHI, respectivamente. Se eligió un ADN plasmídico correcto del clon 4 (denominado como pHD101.4) y se usó para volver a transformar células de E. coli competentes como se ha descrito anteriormente para una replicación de alto nivel del ADN plasmídico. Entonces se picó una colonia de la placa de agar LB-ampicilina y se cultivó en 200 ml de caldo LB durante una noche a 37ºC y se aisló el plásmido pHD101.4 por Maxiprep™ (Promega™). El plásmido pHD101.4 (que codifica el ADNc de GlcCerasa humana de tipo silvestre) se verificó por secuenciación de ADN y se usó para la construcción de otras enzimas GlcCerasa y para experimentos de transfección transitoria.
Se incorporó un sitio de restricción BglII en el cebador 1 de modo que el ligamiento del producto de PCR de GlcCerasa digerido con BglII en el sitio BamHI compatible del vector pEF6/V5-HisA™ eliminara el sitio de restricción BamHI dentro del sitio de clonación múltiple y este vector de expresión modificado se mencionará como pEF6’ a partir de ahora. La eliminación de este sitio BamHI dentro pEF6/V5-HisA™ era necesaria de modo que pueda utilizarse un sitio BamHI único dentro del ADNc de GlcCerasa para insertar fragmentos de ADN con sustituciones específicas de nucleótidos para generar enzimas GlcCerasa modificadas.
Para generar GlcCerasa-F316A/L317F (denominada como pHD105), se sintetizó un minigén de GlcCerasa que contenía estas sustituciones de aminoácidos por Integrated DNA Technologies™ entre sitios de restricción BsrGI 5' y BamHI 3' flanqueantes naturales. El fragmento de ADN de GlcCerasa modificado sintético (~0,5 kb) se liberó del plásmido pIDTSMART™ por digestión de restricción con BsrGI y BamHI y se aisló posteriormente por gel preparativo de agarosa al 1% y se ligó en fase en pHD101.4 que se había digerido previamente con BsrGI y BamHI y desfosforilado. Se usó un microlitro de esta reacción de ligamiento para transformar células de E. coli competentes y la muestra se procesó como se ha descrito anteriormente para pHD101. Se aisló ADN Miniprep de clones individuales y se ensayó por digestión de restricción con EcoRI y XbaI. El clon 5 (denominado como pHD105.5) se eligió, se verificó por secuenciación de ADN y se usó para caracterización adicional.
Para generar GlcCerasa-K321N (denominada como pHD109), la sustitución de aminoácidos se introdujo por PCR solapante. En resumen, el fragmento N-terminal (~1,1 kb) se generó usando los cebadores A y D, y pHD101.4 como ADN molde en la reacción de PCR 1 mientras el fragmento C-terminal (~0,5 kb) se generó usando los cebadores B y C, y pHD101.4 como molde en la reacción de PCR 2. Después se sintetizó el ADNc completo de la K321N GlcCerasa en la reacción de PCR 3 añadiendo 1 µl de las reacciones de PCR A y B y los cebadores 1 y 2. El producto de PCR resultante 3 (~1,6 kb) se aisló de un gel preparativo de agarosa al 1% como anteriormente y se digirió con endonucleasas de restricción EcoRI y NotI. El producto de PCR 3 se volvió a purificar y se ligó en el vector pEF6' digerido con EcoRI/NotI y desfosforilado y se procesó como se ha descrito anteriormente. Se aisló ADN Miniprep de clones individuales y se ensayó por digestión de restricción con EcoRI y XbaI. El clon 3 (denominado como pHD109.3) se eligió, se verificó por secuenciación de ADN y se usó para caracterización adicional.
Para generar GlcCerasa-H145L (denominada como pHD110), la sustitución de aminoácidos se introdujo por PCR solapante. El fragmento N-terminal (~0,55 kb) se generó usando los cebadores A y F y, pHD101.4 como ADN molde en la reacción de PCR 4 mientras el fragmento C-terminal (~1 kb) se generó usando los cebadores B y E, y pHD101.4 como molde en la reacción de PCR 5. El ADNc completo de H145L GlcCerasa se generó en la reacción de PCR 6 añadiendo 1 µl de las reacciones de PCR 4 y 5 y los cebadores A y B. El producto de PCR resultante 6 (~1,6 kb) se aisló de un gel preparativo de agarosa al 1% como anteriormente y se digirió con endonucleasas de restricción EcoRI y NotI. El producto de PCR 6 se volvió a purificar y se ligó en el vector pEF6' digerido con EcoRI/NotI y desfosforilado y se procesó como anteriormente. Se aisló ADN Miniprep de clones individuales y se ensayó por digestión de restricción con EcoRI y XbaI. El clon 2 (denominado como pHD110.2) se eligió, se verificó por secuenciación de ADN y se usó para caracterización adicional.
Para generar GlcCerasa-H145F (denominada como pHD111), la sustitución de aminoácidos se introdujo por PCR solapante. El fragmento N-terminal (~0,55 kb) se generó usando los cebadores A y H, y pHD101.4 como ADN molde en la reacción de PCR 7 mientras el fragmento C-terminal (~1 kb) se generó usando los cebadores B y G, y pHD101.4 como molde en la reacción de PCR 8. El ADNc completo de H145L GlcCerasa se generó en la reacción de PCR 9 añadiendo 1 µl de las reacciones de PCR 7 y 8 y los cebadores A y B. El producto de PCR resultante 9
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Para generar GlcCerasa-K321V (denominada como pHD118), la sustitución de aminoácidos se introdujo por PCR solapante. En resumen, el fragmento N-terminal (~1,1 kb) se generó usando los cebadores A y L, y pHD101.4 como ADN molde en la reacción de PCR 22 mientras el fragmento C-terminal (~0,5 kb) se generó usando los cebadores B y K. y pHD101.4 como molde en la reacción de PCR 23. Los productos de PCR 22 y 23 se aislaron por gel preparativo de agarosa al 1% y se usaron como ADN molde para sintetizar el fragmento de ADNc completo de K321A GlcCerasa en la reacción de PCR 24 usando los cebadores A y B. El producto de PCR resultante 24 (~1,6 kb) se aisló de un gel preparativo de agarosa al 1% como anteriormente y se digirió con endonucleasas de restricción EcoRI y NotI. El producto de PCR 24 se volvió a purificar y se ligó en el vector pEF6' digerido con EcoRI/NotI y desfosforilado y se procesó como se ha descrito anteriormente. Se aisló ADN Miniprep de clones individuales y se ensayó por digestión de restricción con EcoRI y XbaI. El clon 7 (denominado como pHD118.7) se eligió y se usó para caracterización adicional.
Para generar GlcCerasa-F316A/L317F/K321A (denominada como pHD119), la sustitución de aminoácidos se introducirá en pHD105.5 por PCR solapante. El fragmento N-terminal (~1,1 kb) se generará usando los cebadores A y J, y pHD105.5 como ADN molde en la reacción de PCR 25 mientras el fragmento C-terminal (~0,5 kb) se generará usando los cebadores B e I, y pHD105.5 como molde en la reacción de PCR 26. Los productos de PCR 25 y 26 se aislarán por gel preparativo de agarosa al 1% y se usarán como ADN molde para sintetizar el fragmento de ADNc completo de F316A/L317F/K321A/K321A GlcCerasa en la reacción de PCR 27 usando los cebadores A y B. El producto de PCR resultante 27 (~1,6 kb) se aislará de un gel preparativo de agarosa al 1% como anteriormente y se digerirá con endonucleasas de restricción EcoRI y NotI. El producto de PCR 27 se volverá a purificar y se ligará en el vector pEF6' digerido con EcoRI/NotI y desfosforilado como se ha descrito anteriormente. Se aislará ADN Miniprep de clones individuales y se ensayará por digestión de restricción usando EcoRI y XbaI para identificar la cepa bacteriana transformada con el ADNc correcto de GlcCerasa-F316A/L317F/K321A. La construcción de ADN seleccionada se verificará por secuenciación de ADN y se usará para caracterización adicional.
Para generar GlcCerasa-F316A/L317F/K321V (denominada como pHD120), la sustitución de aminoácidos se introducirá en pHD105.5 por PCR solapante. El fragmento N-terminal (~1,1 kb) se generará usando los cebadores A y L, y pHD105.5 como ADN molde en la reacción de PCR 28 mientras el fragmento C-terminal (~ 0,5 kb) se generará usando los cebadores B y K, y pHD105.5 como molde en la reacción de PCR 29. Los productos de PCR 28 y 29 se aislarán por gel preparativo de agarosa al 1% y se usarán como ADN molde para sintetizar el fragmento de ADNc completo de F316A/L317F/K321A/K321V GlcCerasa en la reacción de PCR 30 usando los cebadores A y B. El producto de PCR resultante 30 (~1,6 kb) se aislará de un gel preparativo de agarosa al 1% como anteriormente y se digerirá con endonucleasas de restricción EcoRI y NotI. El producto de PCR 30 se volverá a purificar y se ligará en el vector pEF6' digerido con EcoRI/NotI y desfosforilado como se ha descrito anteriormente. Se aislará ADN Miniprep de clones individuales y se ensayará por digestión de restricción usando EcoRI y XbaI para identificar la cepa bacteriana transformada con el ADNc correcto de GlcCerasa-F316A/L317F/K321V. La construcción de ADN seleccionada se verificará por secuenciación de ADN y se usará para caracterización adicional.
Para generar GlcCerasa-H145L/K321A (denominada como pHD121), se digerirán tanto pHD117.1 y pHD110.2 con las enzimas de restricción BsrGI y BamHI y el fragmento de ~0,5 kb de pHD117.1 y el fragmento de ~6,9 kb de pHD110.2 (después del tratamiento con fosfatasa Antarctic™) se aislarán por gel preparativo de agarosa al 1%. El fragmento de ~0,5 kb de pHD117.1 (que contiene la sustitución de aminoácido K321A) se ligará en fase en el plásmido pHD110.2 (contiene la modificación H145L) y se procesará como anteriormente. Se aisló ADN Miniprep de clones individuales y se ensayó por digestión de restricción con EcoRI y XbaI para identificar la cepa bacteriana transformada con el ADNc correcto de GlcCerasa-H145L/K321A. La construcción de ADN seleccionada se verificará por secuenciación de ADN y se usará para caracterización adicional.
Para generar GlcCerasa-H145L/K321V (denominada como pHD122), se digerirán tanto pHD118.7 como pHD110.2 con las enzimas de restricción BsrGI y BamHI y el fragmento de ~0,5 kb de pHD118.7 y el fragmento de ~6,9 kb de pHD110.2 (después del tratamiento con fosfatasa Antarctic) se aislarán por gel preparativo de agarosa al 1%. El fragmento de ~0,5 kb de pHD118.7 (que contiene la sustitución de aminoácido K321V) se ligará en fase en el plásmido pHD110.2 (contiene la modificación H145L) y se procesará como anteriormente. Se aisló ADN Miniprep de clones individuales y se ensayó por digestión de restricción con EcoRI y XbaI para identificar la cepa bacteriana transformada con el ADNc correcto de GlcCerasa-H145L/K321V. La construcción de ADN seleccionada se verificará por secuenciación de ADN y se usará para caracterización adicional.
La Tabla 3 resume las secuencias de cebadores mencionadas anteriormente para construir las enzimas GlcCerasa modificadas.
Tabla 3
SEQ ID NO:
Cebador Hebra Secuencia oligonucleotídica (5'->3')
25
A + ggcaagatctgaattcgggatggagttttcaagtccttccagag
26
B - tcgagcggccgcaagctagcttatcactggcgacgccacaggtag
27
C + tccagccaacgccaccctag
28
D - ctagggtggcgttggctgga
29
E + tgatttccagttgttgaacttcagcctc
30
F - gaggctgaagttcaacaactggaaatca
31
G + tgatttccagttgttcaacttcagcctc
32
H - gaggctgaagttgaacaactggaaatca
33
I + tccagccgcagccaccctag
34
J - ctagggtggctgcggctgga
35
K + tccagccgtagccaccctagg
36
L - cctagggtggctacggctgga
Aunque la presente invención se ha descrito en relación a realizaciones particulares de la misma, muchas otras variaciones y modificaciones y otros usos son evidentes para los expertos en la materia. Se prefiere, por lo tanto, que la presente invención esté delimitada no por la descripción específica de este documento, sino solamente por
5 las reivindicaciones adjuntas.
Secuencias
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SEQ ID NO: 2
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SEQ ID NO: 3
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Claims (1)

  1. imagen1
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