KR20140004110A - 백혈구 또는 단핵구의 분리 방법, 분리재 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 과제는, 각 혈구 성분을 포함하는 체액으로부터 효율적으로 백혈구 또는 단핵구를 분리하는 분리 시스템 및 분리재를 제공하는 것이다. 평균 섬유 직경이 2.0 ㎛ 이상 6.0 ㎛ 이하이며, 통기도계수 M이 6.2 이상 35 이하인 분리재에 각 혈구 성분을 포함하는 체액을 접촉시켜, 백혈구를 분리재에 포착하고, 박리 용액을 이용하여 포착된 백혈구 또는 단핵구를 회수함으로써 효율적으로 백혈구 또는 단핵구를 분리할 수 있다.
Description
본 발명은 각 혈구 성분을 포함하는 체액으로부터, 백혈구 또는 단핵구를 선택적으로 회수하기 위한 분리재, 분리 방법에 관한 것이다.
최근 혈액학이나 과학 테크놀로지의 급속한 진보에 따라, 전혈·골수·제대혈·조직 추출물을 비롯한 체액으로부터 필요한 혈액 분획만을 분리하여 환자에게 투여함으로써 치료 효과를 높이고, 나아가 치료에 필요없는 분획은 투여하지 않음으로써 부작용을 억제한다는 치료 스타일이 널리 보급되고 있다.
예를 들면, 혈액 수혈도 그 중 하나이다. 적혈구 제제는, 출혈 및 적혈구가 부족한 경우, 또는 적혈구의 기능 저하에 의해 산소가 결핍된 경우에 사용되는 혈액 제제이다. 적혈구 제제에는, 이상한 면역 반응이나 이식편대숙주병(GVHD) 등의 부작용을 유도하는 백혈구는 불필요하여, 필터로 백혈구를 제거할 필요가 있다. 경우에 따라서는 백혈구에 추가로 혈소판도 제거하는 경우도 있다.
한편, 혈소판 제제는, 혈액 응고 인자의 결핍에 의한 출혈 내지 출혈 경향이 있는 환자에게 사용되는 혈액 제제이다. 혈소판 제제의 제조를 위해서는, 원심 분리에 의해, 혈소판 이외의 불필요한 세포나 성분은 제거되고, 필요로 하는 혈소판 성분만이 채취되고 있다.
게다가, 최근 백혈병이나 고형암 치료를 향한 조혈 줄기세포 이식이 활발히 행해지게 되어, 치료에 필요한, 조혈 줄기세포를 포함한 백혈구군을 분리하여 투여하는 방법이 취해지고 있다. 이 조혈 줄기세포의 소스(source)로서, 도너(donor)의 부담이 적고, 증식 능력이 우수하다는 등의 이점으로부터, 골수나 말초혈 뿐만 아니라 제대혈도 주목을 받고 있다. 또한 최근, 월경혈 중에도 줄기세포가 풍부하게 존재한다는 것이 시사되어, 지금까지 폐기되고 있던 월경혈도 귀중한 줄기세포 소스로서 이용될 가능성이 있다.
골수나 말초혈에 관하여, 불필요한 세포를 제거하고 백혈구를 분리·순화하여 투여하는 것이 요망되고 있는 한편, 제대혈에 대해서도 혈연자를 위한 뱅킹이 활발히 이루어져, 사용시까지 동결 보존할 필요성이 있어, 동결 보존에 의한 적혈구 용혈을 방지하는 것을 목적으로 백혈구는 분리·순화되고 있다.
백혈구의 분리 방법으로는, 피콜(ficoll)을 이용한 비중액에 의한 원심 분리법이나 적혈구 침강제인 히드록시에틸스타치를 이용한 원심 분리법이 제안되어 있지만, 폐쇄계에서의 처리가 불가능하여 이물질이나 균이 혼입되고, 처리하는 데에 장시간을 요하는 등의 문제를 갖고 있다.
원심 분리법을 이용하지 않는 세포 분리 방법으로서, 최근에는 적혈구와 혈소판은 포착되지 않고 백혈구만을 포착하는 필터 재료를 이용하여 백혈구를 회수하는 방법(특허문헌 1, 특허문헌 2)도 보고되어 있다. 그러나, 종래 필터에 백혈구를 포착시키기 위해서는 섬유 직경이 3 ㎛ 미만일 필요가 있다고 보고되고 있으며(비특허문헌 1), 각 문헌의 보고에서도 사용되고 있는 분리재의 섬유 직경은 2.5 ㎛ 미만이다(특허문헌 1, 특허문헌 2, 특허문헌 3). 이는, 종래의 백혈구 제거 필터가 백혈구를 극한까지 제거하는 것을 목적으로 하고 있기 때문이고, 백혈구의 포착률이 높은 반면, 체액 처리시에 막히기 쉬워, 회수 조작시에 압 상승을 야기하여 세포 회수율의 저하나 수기적인 문제를 유발하는 등의 문제가 있었다.
따라서, 백혈구를 회수하기 위한 필터로는, 종래의 백혈구 제거 필터를 전용하여도 충분한 기능을 하는 것은 불가능하였다.
섬유 학회지 Vol.61, No.8 p.P215-216(2005)
본 발명의 목적은, 각 혈구 성분을 포함하는 체액으로부터, 압 상승을 회피하면서, 백혈구 또는 단핵구를 높은 효율로 회수하기 위한 고효율의 분리재를 제공하는 것 및 해당 분리재를 이용한 세포 분리 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 체액으로부터 효율적으로 백혈구 또는 단핵구를 분리할 수 있으며, 압 상승을 야기하기 어려운 분리재나, 세포 분리 방법에 대해서 예의 검토를 행하였다. 그 결과, 특정한 분리재를 이용함으로써, 고효율로 백혈구 또는 단핵구를 분리할 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉 본 발명은 평균 섬유 직경이 2.0 ㎛ 이상 6.0 ㎛ 이하이면서, 통기도계수 M이 6.2 이상 35 이하인 부직포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 체액으로부터 백혈구 또는 단핵구를 분리하기 위한 분리재에 관한 것이다. 부직포가 폴리올레핀, 폴리아미드 및 폴리에스테르로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개를 포함하는 것이 바람직하다. 체액이 말초혈, 제대혈, 골수, 월경혈 및 조직 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기한 분리재를, 체액의 입구와 출구를 갖는 용기에 충전하여 얻어지는 세포 분리용 용기에 관한 것이다. 세포 분리용 용기에 있어서, 분리재가 체액이 흐르는 방향으로 1매 또는 복수매 적층하여 충전되어 있는 것이 바람직하고, 체액이 흐르는 방향으로 압축된 상태로 충전되어 있는 것이 바람직하다. 세포 분리용 용기는 칼럼 타입인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기한 분리재에 체액을 접촉시켜 백혈구 또는 단핵구를 분리하는 공정을 포함하는 세포 분리 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기한 세포 분리용 용기에 체액을 접촉시켜 백혈구 또는 단핵구를 분리재에 포착시키는 제1 공정 및 박리 용액을 이용하여 백혈구 또는 단핵구를 분리재로부터 회수하는 제2 공정을 포함하는 백혈구 또는 단핵구의 세포 분리 방법에 관한 것이다. 이 세포 분리 방법에 있어서, 제1 공정이 상기한 세포 분리용 용기의 입구로부터 체액을 도입하고, 출구로부터 배출하는 공정이고, 제2 공정이 세포 분리용 용기의 출구로부터 박리 용액을 도입하고, 입구로부터 백혈구 또는 단핵구를 회수하는 공정인 것이 바람직하다. 또한, 제1 공정 이후이면서 제2 공정 전에, 입구로부터 생리식염수 또는 완충액을 도입함으로써, 세포 분리용 용기 내의 협잡 성분을 제거하는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 제1 공정 전에 분리재를 생리식염수 또는 완충액과 접촉시키는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 제1 공정 전에 세포 분리 용기의 체액의 입구를 세포 분리 용기의 체액의 출구보다 낮은 높이로 고정시키는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 백혈구와 혈소판이 실질적으로 분리재에 포착되고, 적혈구가 실질적으로 포착되지 않은 것이 바람직하다. 분리된 백혈구 또는 단핵구가 조혈 줄기세포 및/또는 간엽계 줄기세포를 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기한 세포 분리 방법에 의해서 얻어진 세포를 액체 질소 환경하로 하는 것을 특징으로 하는 동결 보존 방법에 관한 것이다. 액체 질소 환경하는 -196℃ 내지 -30℃인 것이 바람직하다. 이 동결 보존 방법에 있어서, 디메틸술폭시드, 덱스트란, 알부민 및 히드록시에틸스타치로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 동결 보호제를 사용하는 것이 바람직하다. 동결 보존한 줄기세포의 생존율이 80％ 이상인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기한 세포 분리 방법에 의해서 얻어진 백혈구, 단핵구 또는 줄기세포에 관한 것이다. 줄기세포는 CD34 양성 세포, CD133 양성 세포, CD34 음성 또한 CD133 양성 세포, CD34 양성 또한 CD133 양성 세포, CD34 양성 또한 CD133 음성 세포, CD45 음성 또한 CD44 양성 또한 CD73 양성 또한 CD90 양성 세포, CD45 음성 또한 CD235a 음성 또한 CD33 음성 또한 CD7 음성 세포, CD45 양성 또한 CD133 양성 또한 CD117 양성 세포, CD45 양성 또한 CD133 음성 또한 CD117 양성 세포, CD45 양성 또한 CD133 양성 또한 CD164 양성 세포, CD45 양성 또한 CD133 음성 또한 CD164 양성 세포 및 CD45 음성 또한 CD309 양성 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 세포를 포함하는 것이 바람직하다. 백혈구는 CD45 양성 또한 CD164 양성 세포, 또는 CD45 양성 또한 CD117 양성 세포를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면, 전혈·골수·제대혈·월경혈·조직 추출물을 비롯한 체액으로부터, 간편하면서 신속하게, 클로깅(clogging)이나 압 상승을 일으키기 어려워 효율적으로 백혈구 또는 단핵구를 분리할 수 있다.
본 발명의 분리재 및 세포 분리 방법을 이용하면, 종래 보고되어 있는 것보다도 클로깅을 일으키기 어려울 뿐 아니라, 백혈구나 단핵구의 회수율이 높다는 다면적인 이점이 있다. 또한, 이 기술은 버피 코트(buffy coat) 등의 전처리를 한 후에 사용하는 것도 가능하지만, 기본적으로는 그와 같은 전처리를 하지 않고, 말초혈, 제대혈, 골수, 월경혈, 조직 추출물로부터 백혈구 또는 단핵구를 분리하는 것이 가능하다.
본 발명의 분리재를 용기에 충전하여 얻어지는 필터는 무균적인 폐쇄계에서의 처리에 사용하는 것도 가능하다. 회수된 백혈구 함유액 또는 단핵구 함유액은 조혈 줄기세포나 간엽계 줄기세포가 풍부하게 포함되는 세포군으로, 백혈병 치료, 심근 재생이나 혈관 재생 등의 재생 의료를 위한 치료 세포 제조용 필터로서 제공하는 것이 가능하다.
본 발명의 분리재를 사용하여 얻어지는 백혈구는 적혈구의 혼입률이 매우 낮아, 사용시까지 동결 보존하여도 용혈 등에 기인하는 영향은 매우 적다. 또한, 백혈구는 무균적으로 분리되어 있기 때문에, 그대로 증폭하여 세포를 제조할 수도 있다. 이 때문에, 본 발명의 분리재는, 수혈용 제제 제조 용도 뿐 아니라, 재생 의료용 세포 소스를 제조하기 위한 필터로서 매우 유용하다. 본 발명의 분리재를 사용함으로써 부작용이 적고 안정성이 높은 치료용 세포의 제조가 가능해진다.
[도 1] 신선 소 말초혈의 백혈구 회수율의 결과
[도 2] 신선 인간 말초혈의 백혈구 회수율의 결과
[도 3] 신선 돼지 골수의 백혈구 회수율의 결과
[도 4] 신선 소 말초혈의 백혈구 회수율의 결과
[도 5] 신선 인간 말초혈의 백혈구 회수율의 결과
[도 6] 신선 돼지 골수의 백혈구 회수율의 결과
[도 7] 칼럼의 모식도
[도 8] 조혈계 줄기세포를 포함하는 콜로니 사진
[도 9] 혈구 성분 분리 시스템의 일례
[도 10] 혈구 성분 분리 시스템의 일례(입구가 출구보다 낮은 경우)
[도 2] 신선 인간 말초혈의 백혈구 회수율의 결과
[도 3] 신선 돼지 골수의 백혈구 회수율의 결과
[도 4] 신선 소 말초혈의 백혈구 회수율의 결과
[도 5] 신선 인간 말초혈의 백혈구 회수율의 결과
[도 6] 신선 돼지 골수의 백혈구 회수율의 결과
[도 7] 칼럼의 모식도
[도 8] 조혈계 줄기세포를 포함하는 콜로니 사진
[도 9] 혈구 성분 분리 시스템의 일례
[도 10] 혈구 성분 분리 시스템의 일례(입구가 출구보다 낮은 경우)
이하에 본 발명에 대해서 상세히 설명하지만, 본 발명이 이하의 설명으로 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 평균 섬유 직경이 2.0 ㎛ 이상 6.0 ㎛ 이하이면서, 통기도계수 M이 6.2 이상 35 이하인 부직포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 체액으로부터 백혈구 또는 단핵구를 분리하기 위한 분리재에 관한 것이다.
분리재는, 재료와 체액의 접촉 시간의 관점에서 섬유상이며 용이하게 제작이나 입수가 가능한 부직포에 의해 구성된다. 부직포의 제조 방법으로는, 크게 나눠 습식과 건식, 또한 레진본드, 서멀본드, 스판레이스, 니들펀치, 스티치본드, 스판본드, 멜트 블로우 등을 들 수 있지만, 이들 제조 방법으로 한정되는 것은 아니다. 10 ㎛ 이하의 섬유 직경을 갖는 부직포의 경우, 멜트 블로우법이나 스판레이스법이 바람직하다. 부직포는 캘린더 가공이나 플라즈마 처리가 실시될 수도 있다.
부직포 섬유로는 복합 단사를 복수로 분할한, 이른바 분할 섬유도 바람직하게 사용할 수 있다. 섬유가 복잡하게 얽혀 혈구 분리 효율이 양호하기 때문이다.
분리재는 용기에 넣지 않고 사용할 수도 있고, 체액의 입구와 출구를 구비한 용기에 분리재를 넣고 사용할 수도 있다. 이 중, 실용성을 고려하면, 용기에 넣고 사용하는 후자의 양태가 바람직하다.
부직포를 구성하는 섬유의 평균 섬유 직경은 2.0 ㎛ 이상 6.0 ㎛ 이하인 것이 바람직하고, 2.5 ㎛ 이상 5.7 ㎛ 이하인 것이 보다 바람직하고, 3.5 ㎛ 이상 5.0 ㎛ 이하인 것이 더욱 바람직하다. 평균 섬유 직경이 2.0 ㎛보다 작으면, 클로깅이 발생하기 쉬워져 회수율이 저하되는 경향이 있다. 평균 섬유 직경이 6.0 ㎛보다 크면, 백혈구의 분리재에 대한 포착능이 저하되는 경향이 있다.
또한, 평균 섬유 직경이란 섬유축에 대하여 직각 방향의 섬유의 폭이다. 섬유 직경의 측정은, 부직포를 포함하는 분리재를 주사형 전자 현미경으로 사진 촬영하고, 사진에 기재된 스케일로부터 구한 섬유 직경의 계산값을 평균함으로써 구해진다. 즉, 측정한 섬유 직경의 평균값을 의미하고 있으며, 50개 이상, 바람직하게는 100개 이상의 평균값이다. 다만, 섬유가 다수로 중첩되어 있는 경우, 다른 섬유가 방해를 하여 그 폭을 측정할 수 없는 경우, 또는 현저히 직경이 다른 섬유가 혼재하고 있는 경우 등은, 그 데이터는 제외하고 섬유 직경을 산출한다.
분리재의 통기도계수 M은 6.2 이상 35 이하인 것이 바람직하고, 7.0 이상 14.2 이하인 것이 보다 바람직하고, 9.2 이상 10.0 이하인 것이 더욱 바람직하다. 통기도계수가 6.2보다 작으면, 세포가 밀하게 분리재에 포착되기 때문에 회수 성능이 저하되는 경향이 있다. 통기도계수가 35보다 크면, 세포가 분리재에 포착되기 어려워지는 경향이 있다.
또한, 통기도계수 M은, 분리재의 통기도(cc/㎠·초)와 두께(mm)의 곱으로 정의되는 값이고, 분리재의 두께의 영향을 제외한 본질적인 파라미터이다. 즉, 통기도는 분리재의 공경의 크기에 의존하는 파라미터이지만, 동일한 통기도여도 분리재의 두께가 얇을수록 본질적인 통기도는 보다 작고, 동일한 두께 상당으로 환산하면 통기도는 작아진다. 따라서 통기도와 두께를 곱함으로써, 분리재의 본질적인 공경을 나타내는 파라미터가 된다.
통기도는 예를 들면, JIS L1096-1999에 기재된 프라질형법(Fragzier method)에 준하거나, 또는 준거하여 용이하게 측정하는 것이 가능하다. 또한 두께에 대해서도 디지털 노기스(digital caliper)를 비롯하여 다양한 기기로 측정하는 것이 가능하다. 다만, 통기도의 측정 방법은 이들 측정 방법으로 한정되는 것은 아니다.
분리재의 평균 섬유 직경이 2.0 ㎛ 이상 6.0 ㎛ 이하이면서, 분리재의 통기도계수 M이 6.2 이상 35 이하이면, 백혈구 또는 단핵구를 효율적으로 분리할 수 있다.
분리재에 이용되는 재료로는, 멸균 내성이나 세포에의 안전성 관점에서, 폴리올레핀, 폴리아미드, 폴리에스테르 등이 바람직하다. 폴리올레핀으로는 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 고밀도 폴리에틸렌, 저밀도 폴리에틸렌 등을 들 수 있고, 폴리아미드로는 나일론 등을 들 수 있고, 폴리에스테르로는 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리부틸렌테레프탈레이트 등을 들 수 있다. 또한, 폴리비닐알코올, 염화비닐리덴, 레이온, 비닐론, 아크릴(폴리메틸메타크릴레이트, 폴리히드록시에틸메타크릴레이트, 폴리아크릴니트릴, 폴리아크릴산, 폴리아크릴레이트), 나일론, 폴리이미드, 아라미드(방향족 폴리아미드), 폴리아미드, 큐프라, 카본, 페놀, 폴리에스테르, 펄프, 삼, 폴리우레탄, 폴리스티렌, 폴리카르보네이트 등의 합성 고분자, 아가로스, 셀룰로오스, 셀룰로오스아세테이트, 키토산, 키틴 등의 천연 고분자, 유리 등의 무기 재료나 금속 등도 이용되지만, 그 중에서도 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리부틸렌테레프탈레이트, 폴리프로필렌, 아크릴, 나일론, 폴리우레탄, 유리가 바람직하다. 또한, 이들 재료는 1종 단독으로는 한정되지 않으며, 필요에 따라 재료를 복합·혼합·융합하여 이용할 수도 있다. 또한 필요하면, 단백질, 펩티드, 아미노산, 당류 등, 특정한 세포에 친화성을 갖는 분자를 재료에 고정시킬 수도 있다.
체액이란, 전혈, 말초혈, 골수, 제대혈, 월경혈, 조직 추출물 및 이들의 조합을 의미하며, 조분리한 것이어도 관계없다. 또한, 체액의 채취원이 되는 동물종으로는, 예를 들면 인간, 소, 마우스, 래트, 돼지, 원숭이, 개, 고양이 등의 포유동물을 들 수 있다.
체액은 미리 항응고제로 처리된 것일 수도 있다. 항응고제로는 ACD(애시드-시트레이트-덱스트로오스; acid-citrate-dextrose)액, CPD(시트레이트-포스페이트-덱스트로오스; citrate-phosphate-dextrose)액, CPDA(시트레이트-포스페이트-덱스트로오스-아데닌; citrate-phosphate-dextrose-adenine)액 등의 시트르산 항응고제, 헤파린, 저분자 헤파린, 후탄(Futhan)(메틸산나파모스타트; nafamostat mesilate), EDTA 등의 항응고제를 들 수 있다. 각 분획의 사용 목적에 영향이 없으면, 특히 체액의 보존 조건은 관계없다.
상기한 분리재에 의해 분리할 수 있는 백혈구 또는 단핵구로는, 구체적으로는 림프구, 단구, CD3 양성 세포, CD14 양성 세포, CD19 양성 세포, 조혈 줄기세포, 간엽계 줄기세포를 들 수 있다.
본 발명은 또한 상기한 분리재를 체액의 입구와 출구를 갖는 용기에 충전하여 얻어지는 세포 분리용 용기에 관한 것이다.
분리재를 충전하는 용기의 형태, 크기, 재질은 특별히 한정되지 않는다. 용기의 형태는 공, 콘테이너, 카세트, 백(bag), 튜브, 칼럼 등 임의의 형태일 수도 있다. 바람직한 구체예로는, 예를 들면 용량 약 0.1 mL 내지 400 mL 정도, 직경 약 0.1 cm 내지 15 cm 정도의 반투명한 통상 용기를 들 수 있다. 또한, 한 변의 길이가 0.1 cm 내지 20 cm 정도인 직사각형 또는 정사각형이고, 두께가 0.1 cm 내지 5 cm 정도인 사각 기둥 용기 등을 들 수 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
용기의 형태로는, 크로스플로우 타입, 칼럼 타입 등을 들 수 있다. 크로스플로우 타입 또는 칼럼 타입 중 어느 것도 사용할 수 있고, 특히 용기의 타입은 한정되지 않지만, 회수액을 균일하게 도입할 수 있다는 관점에서 칼럼 타입이 보다 바람직하다. 종래의 유핵 세포를 포착하는 세포 분리 용기에 있어서는, 효율적으로 세포를 회수할 수 있다는 관점에서 크로스플로우 타입이 사용되고 있지만, 높은 점도의 박리 용액밖에 사용할 수 없다는 제한이 있었다. 그러나, 본 발명의 분리재를 칼럼 타입의 용기와 조합하면, 낮은 점도의 박리 용액이어도 세포 회수율의 저하는 없어, 높은 분리 성능이 얻어진다.
칼럼 타입이란, 예를 들면 필터면에 대하여 면의 중심 부근에 액의 입구와 출구가 붙어 있는 용기, 또는 필터면에 대하여 수직으로 입구부와 출구부가 위치하고 있는 용기, 또는 필터면에 대하여 수직 방향으로 액이 흐르는 것을 특징으로 하는 용기, 또는 분리재의 압축 방향에 대하여 평행하게 액이 흐르는 것을 특징으로 하는 용기를 말한다. 도 7에 칼럼 타입의 일례를 나타내었다.
한편, 크로스플로우 타입이란, 백혈구 제거 필터(아사히 가세이 메디칼 가부시끼가이샤 제조 "세파셀", 폴사 제조 "퓨어셀 RC")로 대표되는 바와 같이, 필터면에 대하여 액의 입구와 출구의 위치가 면의 중심으로부터 떨어져 있고, 필터면에 대하여 평행하게 입구부와 출구부가 위치하고 있는 용기를 가리킨다. 여기서 필터면에 대하여 입구부와 출구부가 수직으로 위치하고 있다는 것은 면으로부터 입구와 출구의 각도(예각)가 45도 이상 90도 미만인 것을 가리키며, 필터면에 대하여 입구부와 출구부가 평행하게 위치하고 있다는 것은 면으로부터 입구와 출구의 각도(예각)가 0도 이상 45도 미만인 것을 의미한다.
용기는 임의의 구조 재료를 사용하여 제작할 수 있다. 구조 재료로는 구체적으로는, 비반응성 중합체, 생물 친화성 금속, 합금, 유리 등을 들 수 있다. 비반응성 중합체로는, 아크릴로니트릴부타디엔스티렌 터폴리머 등의 아크릴로니트릴 중합체; 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리클로로트리플루오로에틸렌, 테트라플루오로에틸렌과 헥사플루오로프로필렌의 공중합체, 폴리염화비닐 등의 할로겐화 중합체; 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리술폰, 폴리카르보네이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리비닐클로라이드아크릴 공중합체, 폴리카르보네이트아크릴로니트릴부타디엔스티렌, 폴리스티렌, 폴리메틸펜텐 등을 들 수 있다. 용기의 재료로서 유용한 금속 재료(생물 친화성 금속, 합금)에 대해서, 스테인리스강, 티탄, 백금, 탄탈, 금 및 이들의 합금 및 금도금 합금철, 백금도금 합금철, 코발트크롬 합금, 질화티탄 피복 스테인리스강 등을 들 수 있다.
이들 중에서, 멸균 내성을 갖는 구조 재료가 바람직하고, 구체적으로는 폴리프로필렌, 폴리염화비닐, 폴리에틸렌, 폴리이미드, 폴리카르보네이트, 폴리술폰, 폴리메틸펜텐 등을 들 수 있다.
분리재는 부직포를 포함하는 분리재를 적당한 크기로 절단하고, 두께 1 mm 내지 200 mm 정도로, 체액이 흐르는 방향으로 1매 또는 복수매 적층하여 사용되는 것이 바람직하다. 각 분획의 분리 효율의 측면에서, 적층의 두께는 1.5 mm 내지 150 mm인 것이 보다 바람직하고, 2 mm 내지 100 mm인 것이 더욱 바람직하다.
분리재를 용기에 충전하는 경우에는, 체액이 흐르는 방향으로 1매 또는 복수매 적층 상태에서 사용할 수 있고, 두께는 1 mm 내지 50 mm 정도인 것이 바람직하다. 각 분획의 분리 효율의 측면에서 1.5 mm 내지 40 mm인 것이 보다 바람직하고, 2 mm 내지 35 mm인 것이 더욱 바람직하다.
또한 분리재를 롤상으로 감아 용기에 충전할 수도 있다. 롤상으로 사용하는 경우, 상기 롤의 내측으로부터 외측을 향하여 체액을 처리함으로써 혈구를 분리할 수도 있고, 또는 그 반대로 상기 롤의 외측으로부터 내측을 향하여 체액을 처리할 수도 있다.
분리재를 용기에 충전할 때는, 체액이 흐르는 방향으로 압축하여 용기에 충전할 수도 있고, 압축하지 않고 용기 충전할 수도 있다. 압축의 유무는, 분리재의 재질 등에 따라 적절하게 선정할 수 있다.
세포 분리 용기에 있어서, 분리재는 적당한 크기로 절단한 평판상으로 충전될 수도 있고, 롤상으로 감은 형상으로 충전될 수도 있다. 또한, 2종 이상 병용할 수도 있고, 상술한 분리재 이외의 분리재를 병용할 수도 있으며, 실질적으로 백혈구를 포착하여 회수하는 분리 시스템을 구성할 수 있으면 된다. 실질적으로 백혈구를 포착한다는 것은, 분리재와 접촉한 체액에 포함되는 백혈구 중 60％ 이상이 분리재에 포착되는 것을 의미한다. 또한, 세포 분리용 용기 전체에 포착되는 백혈구 중, 본 발명의 분리재가 포착한 백혈구가 60％ 이상의 비율을 차지하는 것이 바람직하다.
세포 분리 용기는 적혈구를 실질적으로 포착하지 않고, 백혈구를 실질적으로 포착한다는 특징을 갖는다. 여기서 적혈구를 실질적으로 포착하지 않는다는 것은, 분리재와 접촉된 체액에 포함되는 적혈구 중 60％ 이상이 분리재를 통과하는 성질을 갖는 것을 의미한다. 또한, 본 발명의 분리재는 혈소판이 실질적으로 포착되는 재료일 수도 있지만, 이것으로 한정되지 않는다. 혈소판이 실질적으로 포착된다는 것은, 분리재와 접촉한 체액에 포함되는 혈소판 중 50％ 이상이 분리재에 포착되는 것을 의미한다. 60％ 이상이 분리재에 포착되는 것이 보다 바람직하다.
또한, 본 발명은 상술한 분리재에 체액을 접촉시켜, 백혈구 또는 단핵구를 분리하는 공정을 포함하는 세포 분리 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상술한 세포 분리 용기에 체액을 접촉시켜 백혈구 또는 단핵구를 분리재에 포착시키는 제1 공정 및 박리 용액을 이용하여, 포착한 백혈구 또는 단핵구를 분리재로부터 회수하는 제2 공정을 포함하는 세포 분리 방법에 관한 것이다.
구체적으로는, 제1 공정으로서, 분리재가 충전된 용기에 체액을 입구측으로부터 주입하고, 백혈구 또는 단핵구를 포착시켜 적혈구는 통과시킨다. 이어서 제2 공정으로서, 용기의 출구 방향으로부터, 즉 체액이나 세정액의 통액 방향과는 역방향으로부터, 박리 용액을 흘림으로써, 분리재에 포착된 백혈구 또는 단핵구를 고수율로 분리 회수할 수 있다. 또한 반드시 필요한 것은 아니지만, 체액을 분리재에 접촉시켜 백혈구를 분리재에 포착시키는 공정 후에, 세정액을 동일한 방향으로부터 통액함으로써 용기 내에 저장된 적혈구를 효율적으로 회수·분리할 수도 있다.
체액의 입구와 출구를 갖는 세포 분리 용기에 체액을 흘릴 때는, 체액의 입구를 체액의 출구보다도 높아지도록 세팅하여, 중력과 동일한 방향으로 체액을 흘릴 수도 있지만, 체액의 입구를 체액의 출구보다도 낮아지도록 세팅하여, 중력과 반대 방향으로 체액을 흘릴 수도 있다. 중력과 반대 방향으로 체액을 흘림으로써, 체액이 용기 내에 균일하게 흐르기 때문에 분리 효율을 더욱 향상시킬 수 있다.
상기한 세포 분리 용기를 사용하여 혈구 성분 분리 시스템을 구성할 수 있다. 혈구 성분 분리 시스템은, 세포 분리 용기 이외에, 세정 용액이나 박리 용액의 입구나 출구, 적혈구 회수의 백(bag), 백혈구 회수의 백 등을 동시에 구비하는 것이 실용적이고 바람직하다. 이 경우, 세포 분리 용기는 체액이 유입되는 입구와 유출되는 출구를 갖고 있고, 추가로 체액의 입구나 체액의 입구와는 독립적으로 용기 내에 저장된 적혈구를 흘리는 세정 용액의 유입부를 갖고, 추가로 체액의 출구나 체액의 출구와는 독립적으로 세정액의 유출부를 가지면서, 상기 체액 및 세정액의 유출부 또는 유출부 이외에 독립적으로 박리 용액을 도입하기 위한 입구도 구비하는 것이 바람직하다. 용기에 부속된 세정액의 입구나 출구는 체액의 입구나 출구로서 기능할 수도 있어, 입구측의 회로에 삼방활전(three-way stopcock) 등을 통해 혈액 백과 세정 용액 백이 접속되어 있을 수도 있다. 분리 용액의 도입구는 체액의 출구로서 기능할 수도 있다. 또한, 박리 용액의 회수측은 체액의 입구로서 기능할 수도 있고, 마찬가지로 삼방활전을 통해 각 백이나 시린지 등이 접속되어 있을 수도 있다. 도 9 및 도 10에 혈구 성분 분리 시스템의 일례를 나타낸다.
혈구 성분 분리 시스템에는, 추가로 체액의 보존 백, 분리된 백혈구를 회수하기 위한 박리 용액 회수 백, 적혈구 회수 백 등이 구비되어 있는 것이 바람직하다. 이들 백이 상기에 기재된 각 용액의 입구나 출구에 접속됨으로써, 무균적인 폐쇄계에서 체액을 분리하는 것이 가능해진다. 또한 각 백은 사용 후에 분리하여 사용할 수 있는 것이 바람직하고, 일반적으로 사용되고 있는 혈액 백과 같은 형상을 하고 있을 수도 있지만, 평판상의 카트리지 방식 등일 수도 있다. 각 백의 형태로는, 필요에 따라 세포 배양 가능한 백, 동결 보존 내성을 갖는 백 등을 선택할 수도 있다.
본 발명의 분리 방법에 대해서 구체적으로 설명한다.
1) 체액 송액 공정
분리재를 충전한 용기의 체액 입구측으로부터 체액을 통액할 때에는, 체액을 넣은 용기로부터 송액 회로를 통하여 자연 낙하로 송액할 수도 있고, 펌프에 의해 송액할 수도 있다. 또한, 체액을 넣은 시린지를 직접, 용기에 접속하고, 손으로 시린지를 누를 수도 있다. 펌프에 의해 통액하는 경우에는, 송액 속도가 너무 빠르면 분리 효율이 떨어지고, 너무 느리면 처리 시간이 걸리는 경향이 있다. 송액 속도로는, 예를 들면 0.1 mL/분 내지 100 mL/분의 속도를 들 수 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
또한 체액 송액 공정의 전처리로서, 생리식염수나 완충액으로 분리재를 침지시키는 공정을 실시할 수도 있다. 이 조작은 반드시 필요한 것은 아니지만, 분리재의 상기 용액에의 침지가 분리 효율의 향상과 혈액 유로 확보에 영향을 준다고 생각되기 때문에, 경우에 따라서는 실시할 수도 있다. 이 전처리 용액은 이하의 세정 공정에 이용하는 용액과 동일할 필요는 없지만, 동일하면 용액 백을 공유할 수 있기 때문에, 회로 시스템의 단순화와 조작성 측면에서 동일한 것이 바람직하다. 전처리의 액량으로는, 분리재가 충전되는 용기의 1배 내지 100배 정도가 실용적이고 바람직하다. 사용할 수 있는 완충액으로는 특별히 한정되지 않지만, 링겔액, 세포 배양에 이용하는 배지, 인산 완충액 등의 일반적인 완충액이 바람직하다.
2) 세정 공정
본 공정은 반드시 필요한 것은 아니지만, 협잡물의 제거 효율을 높이는 경우에는 실시할 수도 있다. 이 공정에 의해 제거할 수 있는 협잡물로서, 적혈구, 혈장 등의 비혈구 성분을 들 수 있다. 세정액의 유입측으로부터 체액 송액 공정과 동일한 방향으로부터 세정액을 통액할 때는, 세정액은 회로를 통하여 자연 낙하로 송액할 수도 있고, 펌프에 의해 송액할 수도 있다. 펌프에 의해 송액하는 경우의 유속은, 체액 송액 공정과 동일한 정도이고, 0.1 mL/분 내지 100 mL/분의 속도를 들 수 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 세정량은 용기의 용량에 따라 다르지만, 세정량이 너무 적으면 용기에 잔존하는 적혈구 성분이 많아지고, 세정량이 너무 많으면 분리 효율이 떨어질 뿐 아니라 많은 시간을 요하기 때문에, 용기의 0.5배 내지 100배 정도의 액량으로 세정하는 것이 바람직하다.
사용할 수 있는 세정액으로는, 적혈구만을 세정하는 것이 가능하여 회수되는 백혈구 중 다른 혈구의 혼입을 억제할 수 있으며, 혈구의 포착 상태를 유지할 수 있으면 어떠한 용액을 이용하여도 관계없지만, 생리식염수, 링겔액, 세포 배양에 이용하는 배지, 인산 완충액 등의 일반적인 완충액이 바람직하다.
3) 백혈구 또는 단핵구의 박리
분리재를 충전한 용기에 체액의 통액과는 역방향(체액 유출측)으로부터 박리 용액을 주입하여 백혈구를 박리시킨다. 박리 용액을 주입할 때는, 박리 용액을 미리 시린지 등에 넣어 놓고, 시린지의 플런저를 손이나 기기를 이용하여 세게 압출함으로써 실행할 수 있다. 회수액량이나 유속은, 용기의 용량이나 처리양에 따라 다르지만, 용기의 1배 내지 100배 정도의 액량으로, 유속 0.5 mL/초 내지 20 mL/초의 유속이 바람직하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
박리 용액은 저장액이면 특별히 한정되지 않지만, 생리적 식염수, 링겔액, 덱스트란 당주, 히드록시에틸스타치 등의 주사용제로서 사용 실적이 있는 것이나, 완충액, 세포 배양용 배지 등을 들 수 있다.
또한 포착된 세포의 회수율을 높이기 위해 회수액의 점장도를 높일 수도 있다. 이 때문에 상기 분리 용액에 알부민, 피브리노겐, 글로불린, 덱스트란, 히드록시에틸스타치, 히드록시에틸셀룰로오스, 콜라겐, 히알루론산, 젤라틴 등을 첨가할 수 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 박리 용액의 점도는 특별히 한정되지 않지만, 점도가 너무 높으면 회수 조작을 행하기 어려워지는 경향이 있기 때문에, 20 mPa·s 이하가 보다 바람직하다. 칼럼 타입의 용기이면 저점도의 박리 용액을 사용하여도 분리 성능은 저하되지 않기 때문에 10 mPa·s 이하에서도 사용할 수 있다. 또한 5 mPa·s 이하의 박리 용액으로도 사용하는 것이 가능하다.
상기한 세포 분리 방법에 의해 회수된 백혈구에는, 조혈 줄기세포, 간엽계 줄기세포, CD34 양성 세포가 포함되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기한 세포 분리 방법에 의해서 얻어진 세포를 액체 질소 환경하로 하는 것을 특징으로 하는 동결 보존 방법에 관한 것이다. 상기한 세포 분리 방법은, 종래의 원심 분리법에 비하여 세포에 가해지는 스트레스가 매우 낮기 때문에, 이 세포 분리 방법으로 얻어진 세포는, 동결 보존 후의 활성이 매우 높다.
세포를 동결 보존할 때는, 동결시의 세포를 보호할 목적으로 동결 보호제가 첨가된다. 첨가되는 동결 보호제의 종류는 특별히 제한되지 않지만, 디메틸술폭시드, 덱스트란, 알부민, 히드록시에틸스타치 등을 사용할 수 있다. 상기 동결 보호제는 단독으로 사용할 수도 있지만 여러 종류를 조합하여 사용할 수도 있다.
동결 보존 방법으로는, 세포는 액체 질소 환경하에서 보존될 수 있고, 액체 질소에 침지된 상태에서 보존할 수도 있으며, 액체 질소의 기체하에서 보존하여도 관계없다. 보존시의 온도는 특별히 한정되지 않지만, 세포의 활성 저하를 방지하기 위해 -196℃ 내지 -30℃인 것이 바람직하다. -196℃ 내지 -50℃인 것이 보다 바람직하고, -196℃ 내지 -70℃인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명은 또한 상술한 동결 보존 방법에 의해서 얻어진 백혈구, 단핵구, 줄기세포에 관한 것이다. 상술한 동결 보존 방법에 의해서 얻어지는 줄기세포로는, 체액 내에 포함되는, 자기 복제능을 가지면서 분화능을 갖는 세포이면 어떠한 줄기세포여도 관계없다. 구체적으로는, 조혈 줄기세포, 간엽계 줄기세포, 배아-유사 줄기세포(Embryonic-like Stem Cell), 혈관 내피 전구 세포 등을 들 수 있다.
조혈 줄기세포의 예로는, CD34 양성 세포, CD133 양성 세포, CD34 음성 또한 CD133 양성 세포, CD34 양성 또한 CD133 양성 세포, CD34 양성 또한 CD133 음성 세포, CD45 양성 또한 CD133 양성 또한 CD117 양성 세포, CD45 양성 또한 CD133 음성 또한 CD117 양성 세포, CD45 양성 또한 CD133 양성 또한 CD164 양성 세포, CD45 양성 또한 CD133 음성 또한 CD164 양성 세포를 들 수 있다.
일반적인 조혈 줄기세포로는, CD34 양성 세포 또는 CD133 양성 세포를 들 수 있지만, 제대혈로는 조혈 줄기세포가 CD34 음성 또한 CD133 양성 세포, CD34 양성 또한 CD133 양성 세포, CD34 양성 또한 CD133 음성 세포로 분화한다고 생각되고 있다. 본 발명의 분리재를 사용하면 이들 조혈 줄기세포도 분리할 수 있으며, 분리 후의 세포는 동결하여도 활성의 저하는 적다. 또한 조혈 줄기세포 중에서도 특히 이식시의 생착에 관한 것이라 불리는, 조혈 증식인자(Stem Cell Factor)의 수용체인 CD117 양성 세포, 세포 접착에 관한 CD164 양성 세포에 대해서도, 본 발명의 분리재로 분리 후에 동결하여도 활성의 저하는 적다.
또한 제대혈 중 간엽계 줄기세포라 생각되고 있는 CD45 음성 또한 CD44 양성 또한 CD73 양성 또한 CD90 양성 세포도, 본 발명의 분리재로 분리한 후에 동결하여도 활성의 저하는 적다. 제대혈 중에는 간엽계 줄기세포는 약간밖에 존재하지 않아, 원심 분리에서는 손실이 커서 분리하기 어렵다는 문제가 있었지만, 본 발명의 분리재에서는 효율적으로 분리하는 것이 가능하다.
제대혈 중에는 리니지 네거티브 줄기세포(Lineage Negative Stem Cell)라는 다분화능을 갖는 흥미로운 줄기세포가 존재하고, 배아-유사 줄기세포라 불리고 있다. 본 발명의 분리재에서는, 이 CD45 음성 또한 CD235a 음성 또한 CD33 음성 또한 CD7 음성 세포를 효율적으로 분리하는 것이 가능하고, 동결하여도 활성의 저하는 적다.
혈관 내피 전구 세포의 CD45 음성 또한 CD309 양성 세포에 대해서도, 본 발명의 분리재로 분리 후에 동결하여도 활성의 저하는 적다.
또한, 백혈구 중 CD45 양성 또한 CD164 양성 세포, CD45 양성 또한 CD117 양성 세포에 대해서도, 본 발명의 분리재로 분리 후에 동결하여도 활성의 저하는 적다.
동결 보존 후의 세포의 생존율은 80％ 이상인 것이 바람직하고, 85％ 이상인 것이 보다 바람직하다.
[실시예]
이하, 실시예에서 본 발명에 대해서 상세히 서술하지만, 본 발명이 이하의 실시예의 양태로 한정되는 것은 아니다. 이하의 실시예 및 비교예에 나타낸 부직포는 비압축시의 두께가 전부 일정한 범위가 되도록 매수를 조정하고, 충전하고 있다. 또한 실시예 및 비교예에서의 분리재를 충전한 용기는 도 7에 도시한 바와 같은 칼럼 타입이며, 액의 입구와 출구는 필터의 면에 대하여 중심에 위치하고 있고, 필터면에 대하여 수직으로 액의 입구와 출구가 위치하고 있다.
(실시예 1)
두께 6 mm 직경 18 mm의 폴리카르보네이트를 포함하는 칼럼상의 용기에, 폴리부틸렌테레프탈레이트제 부직포(평균 섬유 직경 2.0 ㎛, 통기도계수 M=7.0) 28매를 적층 상태에서, 도 7에 도시한 양태가 되도록 충전하였다. 우선 생리식염수 45 mL를 입구측으로부터 시린지를 이용하여 손으로 눌러 통액하였다. 다음으로 CPD 항응고의 신선 소 혈액 20 mL(CPD:혈액=200:28로 혼합한 12％ CPD를 포함하는 소 말초혈)를 2.5 mL/분의 속도로 통액하고, 다음으로 동일한 방향으로부터 생리식염수 10 mL를 통액하였다. 그 후, 역방향으로부터 10％ FBS 첨가 α MEM 배지 30 mL(점도 2.9 mPa·s)를 시린지를 이용하여 손으로 눌러 통액함으로써 백혈구를 회수하였다. 박리 용액은 원활하게 도입할 수 있었다. 처리 전 혈액의 혈산(血算), 회수한 용액의 혈산을 혈구 카운터(시스멕스사 제조, K-4500)에 의해 측정하고, 백혈구의 회수율을 산출하였다. 결과는 하기 표 1, 도 1 및 도 4에 나타내었다.
(실시예 2)
폴리프로필렌제 부직포(평균 섬유 직경 3.5 ㎛, 통기도계수 M=9.6)를 28매 적층 상태에서 충전한 것 이외에는 실시예 1과 동일한 조작을 실시하였다. 결과는 표 1, 도 1 및 도 4에 나타내었다.
(실시예 3)
폴리부틸렌테레프탈레이트제 부직포(평균 섬유 직경 2.9 ㎛, 통기도계수 M=10.0)를 28매 적층 상태에서 충전한 것 이외에는 실시예 1과 동일한 조작을 실시하였다. 결과는 표 1, 도 1 및 도 4에 나타내었다.
(실시예 4)
나일론제 부직포(평균 섬유 직경 5.0 ㎛, 통기도계수 M=9.2)를 32매 적층 상태에서 충전한 것 이외에는 실시예 1과 동일한 조작을 실시하였다. 결과는 표 1, 도 1 및 도 4에 나타내었다.
(비교예 1)
폴리부틸렌테레프탈레이트제 부직포(평균 섬유 직경 1.7 ㎛, 통기도계수 M=5.9)를 84매 적층 상태에서 충전한 것 이외에는 실시예 1과 동일한 조작을 실시하였다. 회수 조작시에 약간 저항이 가해졌기 때문에, 칼럼 내압이 높게 채워져 있는 것이 시사되었다. 결과는 표 1, 도 1 및 도 4에 나타내었다.
(비교예 2)
폴리프로필렌제 부직포(평균 섬유 직경 2.1 ㎛, 통기도계수 M=6.0)를 30매 적층 상태에서 충전한 것 이외에는 실시예 1과 동일한 조작을 실시하였다. 결과는 표 1, 도 1 및 도 4에 나타내었다.
(비교예 3)
폴리프로필렌제 부직포(평균 섬유 직경 4.9 ㎛, 통기도계수 M=39.6)를 24매 적층 상태에서 충전한 것 이외에는 실시예 1과 동일한 조작을 실시하였다. 결과는 표 1, 도 1 및 도 4에 나타내었다.
(실시예 5)
CPD 항응고의 신선 소 혈액 20 mL 대신에 CPD 항응고의 신선 인간 혈액 10 mL를 이용한 것 이외에는 실시예 1과 동일한 분리재를 이용하고, 동일한 조작을 실시하였다. 또한, 처리 전의 혈액, 회수한 분리 용액을 FACS 용해 용액(Lysing Solution)으로 용혈한 후, 유세포 분석기(BD FACSCanto)에 의해 단핵구 양성률을 구하고, 백혈구수와 단핵구 양성률을 곱하여 총단핵구수를 산출하였다. 회수한 용액 내의 총단핵구수를 처리 전의 총단핵구수로 나눈 비율을 단핵구 회수율로 하였다. 결과는 하기 표 2, 도 2 및 도 5에 나타내었다.
(실시예 6)
CPD 항응고의 신선 소 혈액 20 mL 대신에 CPD 항응고의 신선 인간 혈액 10 mL를 이용한 것 이외에는, 실시예 2와 동일한 분리재를 이용하여 동일한 조작을 실시하였다. 결과는 표 2, 도 2 및 도 5에 나타내었다.
(실시예 7)
CPD 항응고의 신선 소 혈액 20 mL 대신에 CPD 항응고의 신선 인간 혈액 10 mL를 이용한 것 이외에는, 실시예 3과 동일한 분리재를 이용하여 동일한 조작을 실시하였다. 또한, 처리 전의 혈액, 회수한 분리 용액을 용해 용액으로 용혈한 후, 유세포 분석기(BD FACSCanto)에 의해 단핵구 양성률을 구하고, 백혈구수와 단핵구 양성률을 곱하여 총단핵구수를 산출하였다. 회수한 용액 내의 총단핵구수를 처리 전의 총단핵구수로 나눈 비율을 단핵구 회수율로 하였다. 결과는 표 2, 도 2 및 도 5에 나타내었다.
(실시예 8)
폴리부틸렌테레프탈레이트제 부직포(평균 섬유 직경 2.9 ㎛, 통기도계수 M=10.0) 대신에 폴리프로필렌제 부직포(섬유 직경 5.7 ㎛, 통기도계수 M=14.2)를 40매 적층 상태에서 충전한 것 이외에는 실시예 7과 동일하게 조작을 실시하였다. 결과는 표 2, 도 2 및 도 5에 나타내었다.
(비교예 4)
CPD 항응고의 신선 소 혈액 20 mL 대신에 CPD 항응고의 신선 인간 혈액 10 mL를 이용한 것 이외에는, 비교예 1과 동일한 분리재를 이용하여 동일한 조작을 실시하였다. 회수 조작시에 약간 저항이 가해졌기 때문에, 칼럼 내압이 높게 채워져 있는 것이 시사되었다. 결과는 표 2, 도 2 및 도 5에 나타내었다.
(비교예 5)
CPD 항응고의 신선 소 혈액 20 mL 대신에 CPD 항응고의 신선 인간 혈액 10 mL를 이용한 것 이외에는, 비교예 2와 동일한 분리재를 이용하여 동일한 조작을 실시하였다. 결과는 표 2, 도 2 및 도 5에 나타내었다.
(실시예 9)
CPD 항응고의 신선 소 혈액 20 mL 대신에 헤파린(최종 농도 50 단위/mL)과 CPD(최종 농도 12％)로 항응고한 신선 돼지 골수 10 mL를 이용한 것 이외에는, 실시예 3과 동일한 분리재를 이용하여 동일한 조작을 실시하였다. 결과는 하기 표 3, 도 3 및 도 6에 나타내었다.
(실시예 10)
폴리부틸렌테레프탈레이트제 부직포(평균 섬유 직경 5.3 ㎛, 통기도계수 M=20.0)를 24매 적층 상태에서 충전한 것 이외에는 실시예 9와 동일한 조작을 실시하였다. 결과는 표 3, 도 3 및 도 6에 나타내었다.
(비교예 6)
비교예 2의 분리재를 이용한 것 이외에는 실시예 9와 동일한 조작을 실시하였다. 회수 조작시에 시린지로 압출하는 데에 매우 저항이 있어, 원활하게 압출할 수 없기 때문에, 칼럼 내압이 높게 채워져 있는 것이 시사되었다. 결과는 표 3, 도 3 및 도 6에 나타내었다.
(실시예 11)
실시예 3의 분리재, 12％ CPD를 포함한 신선 소 혈액 25 mL를 이용하여, 10％ ACD-A, 10％ FBS 함유 α MEM 배지 30 mL(점도 2.9 mPa·s)로 회수 조작을 행하였다. 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
(실시예 12)
10％ ACD-A, 4％ 인간 혈청 알부민 함유 저분자 덱스트란 당주(오츠카 세이야꾸사 제조)(점도 7.3 mPa·s)를 이용하는 것 이외에는 실시예 11과 동일한 분리재, 동일한 방법으로 실험을 실시하였다. 결과는 표 4에 나타내었다.
(실시예 13)
10％ ACD-A 함유 살린헤스 수액 6％(프레이제니우스 카비 재팬사 제조)(점도 2.3 mPa·s)를 이용하는 것 이외에는 실시예 11과 동일한 분리재, 동일한 방법으로 실험을 실시하였다. 결과는 표 4에 나타내었다.
(실시예 14)
10％ ACD-A, 4％ 인간 혈청 알부민 함유 살린헤스 수액 6％(프레이제니우스 카비 재팬사 제조)(점도 4.3 mPa·s)를 이용하는 것 이외에는 실시예 11과 동일한 분리재, 동일한 방법으로 실험을 실시하였다. 결과는 표 4에 나타내었다.
(실시예 15)
10％ ACD-A 함유 20％ 수크로오스를 이용하는 것 이외에는 실시예 11과 동일한 분리재, 동일한 방법으로 실험을 실시하였다. 결과는 표 4에 나타내었다.
(실시예 16)
10％ ACD-A 함유 생리식염수(오츠카 세이야꾸사 제조)(점도 1.1 mPa·s)를 이용하는 것 이외에는 실시예 11과 동일한 분리재, 동일한 방법으로 실험을 실시하였다. 결과는 표 4에 나타내었다.
실시예 11 내지 16의 결과에 나타난 바와 같이, 본 발명의 분리재를 이용하면, 어떠한 회수액을 이용하여도 높은 회수율로 백혈구를 회수할 수 있다.
(실시예 17)
실시예 8에서 회수된 세포를 백혈구 농도 2×106이 되도록 제조하고, 메틸셀룰로오스 배지 메쏘쿨트(MethoCult) H4034(스템셀 테크놀로지스(StemCell Technologies)사 제조) 3 mL에 대하여 0.3 mL를 첨가한 후, 혼합액 1.1 mL를 페트리 접시에 분주하고, 37℃, 5％ CO2하에서 배양하였다. 14일 후에 현미경으로 관측한 바, 적혈구계 전구 세포나 백혈구 전구 세포 등의 조혈계 줄기세포를 포함하는 각종 콜로니가 형성되어, 회수된 세포가 CD34 양성 세포나 조혈 줄기세포를 포함하는 것이 확인되었다. 조혈계 줄기세포를 포함하는 콜로니의 사진을 도 8에 도시하였다.
(실시예 18)
실시예 9, 실시예 10에서 회수된 세포 용액의 3 mL를 10％ FBS 함유 α MEM 배지로 합계 10 mL로 하고, 10 cm의 페트리 접시에 파종하고, 37℃, 5％ CO2하에서 배양하였다. 3일마다 배지 교환을 행하고, 9일간 배양한 결과, 페트리 접시에 접착된 간엽계 줄기세포의 콜로니가 확인되고, 회수된 세포가 간엽계 줄기세포를 포함하는 것이 확인되었다.
(실시예 19)
두께 12 mm 직경 44 mm의 폴리카르보네이트를 포함하는 칼럼상의 용기에, 폴리부틸렌테레프탈레이트제 부직포(평균 섬유 직경 3.5 ㎛, 통기도계수 M=8.9) 112매를 적층 상태에서 도 7에 도시한 양태가 되도록 충전하였다. 도 10에 도시한 바와 같이 입구가 출구보다 낮아지도록 세포 분리 용기를 세팅하였다. 우선 생리식염수 약 50 mL를 체액의 입구로부터 출구로 흐르도록 통액하였다. 다음으로 CPD 항응고 인간 말초혈 80 mL를 동일한 방향으로 통액하여, 백혈구를 세포 분리 용기에 포착시켰다. 마지막으로 라인을 전환하여, 통액과는 역방향 즉 체액의 출구로부터 입구로 흐르도록 4％ 인간 혈청 알부민 함유 살린헤스 수액 6％(프레이제니우스 카비 재팬사 제조)(점도 4.3 mPa·s)를, 시린지를 이용하여 손으로 눌러 도입하고, 세포를 세포 회수 백에 회수하였다. 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
(실시예 20)
4％ 인간 혈청 알부민 함유 살린헤스 수액 6％(프레이제니우스 카비 재팬사 제조)(점도 4.3 mPa·s) 대신에 생리식염수(점도 1.1 mPa·s)를 이용하는 것 이외에는 실시예 19와 동일한 조작을 행하였다. 결과는 표 5에 나타내었다.
(실시예 21)
CPD 항응고 인간 말초혈 대신에 CPD 항응고 인간 제대혈을 이용하는 것 이외에는 실시예 19와 동일한 조작을 행하였다. 결과는 표 5에 나타내었다.
(실시예 22)
두께 12 mm 직경 44 mm의 폴리카르보네이트를 포함하는 칼럼상의 용기에, 폴리부틸렌테레프탈레이트제 부직포(평균 섬유 직경 3.5 ㎛, 통기도계수 M=8.9) 112매를 적층 상태에서 도 7에 도시한 양태가 되도록 충전하였다. 도 9에 도시한 바와 같이 입구가 출구보다 높아지도록 세포 분리 용기를 세팅하였다. 우선 생리식염수 약 50 mL를 체액의 입구로부터 출구로 흐르도록 통액하였다. 다음으로 CPD 항응고 인간 제대혈 80 mL를 동일한 방향으로 통액하여, 백혈구를 세포 분리 용기에 포착시켰다. 마지막으로 라인을 전환하여, 통액과는 역방향 즉 체액의 출구로부터 입구로 흐르도록 4％ 인간 혈청 알부민 함유 살린헤스 수액 6％(프레이제니우스 카비 재팬사 제조)(점도 4.3 mPa·s)를, 시린지를 이용하여 손으로 눌러 도입하고, 세포를 세포 회수 백에 회수하였다. 결과는 표 5에 나타내었다.
(실시예 23)
CPD 항응고 인간 말초혈 80 mL 대신에 CPD 항응고 소 말초혈 150 mL를 이용하는 것 이외에는 실시예 19와 동일한 조작을 행하였다. 결과는 표 5에 나타내었다.
(실시예 24)
CPD 항응고 인간 제대혈 80 mL 대신에 CPD 항응고 소 말초혈 150 mL를 이용하는 것 이외에는 실시예 22와 동일한 조작을 행하였다. 결과는 표 5에 나타내었다.
이상의 결과로부터, 본 발명의 분리재 및 분리 방법을 이용함으로써, 압 상승을 야기하기 어려울 뿐 아니라, 박리 용액의 종류에 의존하지 않고, 효율적으로 백혈구 또는 단핵구를 분리하는 것이 가능하다는 것을 알 수 있다. 입구가 출구보다 낮아지도록 세포 분리 용기를 세팅함으로써, 백혈구 회수율을 더욱 향상시킬 수 있다. 한편, 비교예에 나타낸 바와 같이, 섬유 직경이나 통기도계수 M이 작은 부직포를 사용하면, 압이 상승하는 경향이 있어, 대개 백혈구 회수율이 저하되는 경향이 있다.
(실시예 25)
실시예 21 및 실시예 22에서 분리한 세포를 동결 보존하고, 동결 보존 후의 세포의 활성을 평가하였다. 분리한 세포를 크리오백(Cryobag)(Macopharma사 제조)에 옮겨 4℃로 식힌 후, DMSO의 최종 농도가 10％가 되도록 동결 보호제로서 DMSO와 덱스트란 40의 혼합액을 첨가하였다. 그 후 프로그램 냉동고에서 조금씩 단계적으로 온도를 낮춰, 액체 질소 탱크 내(-196℃)에서 동결 상태로 보존하였다. 14일간 후, 동결 보존한 세포를 37℃의 온욕 내에서 해동하고, 덱스트란과 알부민의 혼합액에 옮겼다. 그의 혼합액을 원심하여 상청을 제거한 후, 세포를 덱스트란과 알부민의 혼합액에 재차 현탁하고, 세포를 카운트하였다. 분리 후 회수율로서, 분리 전의 세포수에 대한, 분리 후의 처리액 내에 포함되는 세포수의 비율을 산출하였다. 또한, 동결 후 회수율로서, 동결 전의 세포수에 대한, 동결 후의 처리액 내에 포함되는 세포수의 비율을 산출하였다.
실시예 21에서 얻어진 세포에 대해서는, 백혈구, 단핵구, CD34 양성 세포, CD133 양성 세포, CD34 음성 또한 CD133 양성 세포, CD34 양성 또한 CD133 양성 세포, CD45 양성 또한 CD133 양성 또한 CD117 양성 세포, CD45 양성 또한 CD133 음성 또한 CD164 양성 세포 및 CD45 양성 또한 CD117 양성 세포에 대해서 분리 후의 회수율, 동결 보존 후의 회수율, 동결 보존 후의 생존율을 산출하였다. 결과는 하기 표 6에 나타내었다.
실시예 22에서 얻어진 세포에 대해서는, 백혈구, 단핵구, CD34 양성 세포, CD133 양성 세포, CD34 음성 또한 CD133 양성 세포, CD34 양성 또한 CD133 양성 세포, CD34 양성 또한 CD133 음성 세포, CD45 음성 또한 CD44 양성 또한 CD73 양성 또한 CD90 양성 세포, CD45 음성 또한 CD235a 음성 또한 CD33 음성 또한 CD7 음성 세포, CD45 양성 또한 CD133 양성 또한 CD117 양성 세포, CD45 양성 또한 CD133 음성 또한 CD117 양성 세포, CD45 양성 또한 CD133 양성 또한 CD164 양성 세포, CD45 양성 또한 CD133 음성 또한 CD164 양성 세포, CD45 음성 CD309 양성 세포, CD45 양성 또한 CD164 양성 세포, CD45 양성 또한 CD117 양성 세포에 대해서, 분리 후의 회수율, 동결 보존 후의 회수율, 동결 보존 후의 생존율을 산출하였다. 결과는 하기 표 7에 나타내었다.
이상과 같이, 본 발명의 세포 분리 방법은 세포에 가해지는 스트레스가 매우 낮기 때문에, 이 세포 분리 방법으로 얻어진 세포는 동결 보존 후에도 높은 활성을 유지하고 있다.
1 체액의 입구
2 체액의 출구
3 분리재
4, 5 분리재를 압축시키기 위한 와셔(washer)
6 용기
7 혈구 분리 칼럼
8 챔버
9 혈구 분리재가 충전된 용기
10 체액 백
11 프라이밍액 백(겸 세정액 백)
12 적혈구 회수 백
13 백혈구 회수 백(단핵구 회수 백)
14 회수 포트
15, 16, 17 삼방활전
18 내지 24 회로
2 체액의 출구
3 분리재
4, 5 분리재를 압축시키기 위한 와셔(washer)
6 용기
7 혈구 분리 칼럼
8 챔버
9 혈구 분리재가 충전된 용기
10 체액 백
11 프라이밍액 백(겸 세정액 백)
12 적혈구 회수 백
13 백혈구 회수 백(단핵구 회수 백)
14 회수 포트
15, 16, 17 삼방활전
18 내지 24 회로
Claims (22)
- 평균 섬유 직경이 2.0 ㎛ 이상 6.0 ㎛ 이하이면서, 통기도계수 M이 6.2 이상 35 이하인 부직포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 체액으로부터 백혈구 또는 단핵구를 분리하기 위한 분리재.
- 제1항에 있어서, 부직포가 폴리올레핀, 폴리아미드 및 폴리에스테르로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 분리재.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 체액이 말초혈, 제대혈, 골수, 월경혈 및 조직 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 분리재.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 분리재를, 체액의 입구와 출구를 갖는 용기에 충전하여 얻어지는 세포 분리용 용기.
- 제4항에 있어서, 분리재가 체액이 흐르는 방향으로 1매 또는 복수매 적층하여 충전되어 있는 것을 특징으로 하는 세포 분리용 용기.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 분리재가 체액이 흐르는 방향으로 압축된 상태에서 충전되어 있는 것을 특징으로 하는 세포 분리용 용기.
- 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 칼럼 타입인 것을 특징으로 하는 세포 분리용 용기.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 분리재에 체액을 접촉시켜 백혈구 또는 단핵구를 분리하는 공정을 포함하는 세포 분리 방법.
- 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 세포 분리용 용기에 체액을 접촉시켜 백혈구 또는 단핵구를 분리재에 포착시키는 제1 공정 및 박리 용액을 이용하여, 포착한 백혈구 또는 단핵구를 분리재로부터 회수하는 제2 공정을 포함하는 세포 분리 방법.
- 제9항에 있어서, 제2 공정이 세포 분리용 용기의 출구로부터 박리 용액을 도입하고, 입구로부터 백혈구 또는 단핵구를 회수하는 공정인 세포 분리 방법.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 추가로 제1 공정 이후이면서 제2 공정 전에 입구로부터 생리식염수 또는 완충액을 도입함으로써, 세포 분리용 용기 내의 협잡 성분을 제거하는 공정을 포함하는 세포 분리 방법.
- 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 제1 공정 전에 분리재를 생리식염수 또는 완충액과 접촉시키는 공정을 포함하는 세포 분리 방법.
- 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 제1 공정 전에 세포 분리 용기의 체액의 입구를 세포 분리 용기의 체액의 출구보다 낮은 높이로 고정시키는 공정을 포함하는 세포 분리 방법.
- 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 백혈구와 혈소판이 실질적으로 분리재에 포착되고, 적혈구가 실질적으로 포착되지 않은 것을 특징으로 하는 세포 분리 방법.
- 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 백혈구 또는 단핵구가 조혈 줄기세포 및/또는 간엽계 줄기세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 분리 방법.
- 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 세포 분리 방법에 액체 질소 환경하로 하는 공정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포의 동결 보존 방법.
- 제16항에 있어서, 액체 질소 환경하가 -196℃ 내지 -30℃인 것을 특징으로 하는 동결 보존 방법.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 디메틸술폭시드, 덱스트란, 알부민 및 히드록시에틸스타치로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 동결 보호제를 사용하는 것을 특징으로 하는 동결 보존 방법.
- 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 동결 보존한 줄기세포의 생존율이 80％ 이상인 것을 특징으로 하는 동결 보존 방법.
- 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 세포 분리 방법에 의해서 얻어진 백혈구, 단핵구 또는 줄기세포.
- 제20항에 있어서, CD34 양성 세포,
CD133 양성 세포,
CD34 음성 또한 CD133 양성 세포,
CD34 양성 또한 CD133 양성 세포,
CD34 양성 또한 CD133 음성 세포,
CD45 음성 또한 CD44 양성 또한 CD73 양성 또한 CD90 양성 세포,
CD45 음성 또한 CD235a 음성 또한 CD33 음성 또한 CD7 음성 세포,
CD45 양성 또한 CD133 양성 또한 CD117 양성 세포,
CD45 양성 또한 CD133 음성 또한 CD117 양성 세포,
CD45 양성 또한 CD133 양성 또한 CD164 양성 세포,
CD45 양성 또한 CD133 음성 또한 CD164 양성 세포 및 CD45 음성 또한 CD309 양성 세포
로 이루어지는 군으로부터 선택되는
어느 하나의 세포를 포함하는 줄기세포. - 제20항에 있어서, CD45 양성 또한 CD164 양성 세포, 또는
CD45 양성 또한 CD117 양성 세포를 포함하는 백혈구.
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