JP2020195329A - 耐圧性細胞分離フィルタ容器 - Google Patents

Abstract

【課題】内部に細胞分離材を収容する細胞分離フィルタの濾過面積を広げても変形せず、細胞回収率を減少させることがない細胞分離フィルタ容器であり、かつ細胞分離材の細孔の閉塞時における回収液通過時の応力集中に耐えられる、耐圧性の細胞分離フィルタ容器を提供する。【解決手段】細胞分離材を充填するための空間６を形成する側壁部７と、前記側壁部の一端側において前記空間を閉鎖する第１壁部８Ａと、前記側壁部の他端側において前記空間を閉鎖する第２壁部８Ｂとを備え、前記第１壁部には、液体を導入又は導出するための第１通液口９Ａが形成されており、前記第２壁部には、液体を導入又は導出するための第２通液口９Ｂが形成されており、第１壁部の端部と側壁部の端部が、Ｕ字もしくはＣ字形状部を介して繋がっている細胞分離フィルタ容器１。【選択図】図２

Description

本発明は、耐圧性の細胞分離フィルタ容器、それを用いた細胞分離フィルタ及び耐圧性の細胞分離フィルタ容器を利用した細胞濃縮液の製造方法に関する。

近年、血液学や科学テクノロジーの急速な進歩に伴い、全血・骨髄・臍帯血・組織抽出物をはじめとする体液から必要な血液分画のみを分離して患者に投与することで治療効果を高め、さらに、治療に必要のない分画は投与しないことで副作用を抑制する、という治療スタイルが広く普及している。

例えば、血液輸血もその１つである。赤血球製剤は、出血や赤血球が不足する場合、又は赤血球の機能低下により酸素が欠乏している場合に使用される血液製剤である。赤血球製剤には、異常な免疫反応や移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）等の副作用を誘導する白血球は不要であり、フィルタで白血球を除去する必要がある。場合によっては白血球に加えて血小板も除去することもある。

一方、血小板製剤は、血液凝固因子の欠乏による出血ないし出血傾向にある患者に使用される血液製剤である。血小板製剤の製造のためには、遠心分離により、血小板以外の不要な細胞や成分は除去され、必要とされる血小板成分のみが採取されている。

加えて近年、白血病や固形癌治療に向けた造血幹細胞移植が盛んに行われるようになり、治療に必要な、造血幹細胞を含む白血球群を分離し投与する方法がとられている。この造血幹細胞のソースとして、ドナーの負担が少ない、増殖能力が優れている、等の利点から、骨髄や末梢血に加えて臍帯血も注目を浴びている。また近年、月経血中にも幹細胞が豊富に存在することが示唆され、これまで廃棄されていた月経血も貴重な幹細胞ソースとして利用される可能性がある。

骨髄や末梢血に関して、不要な細胞を除き白血球を分離・純化して投与することが望まれている一方で、臍帯血についても血縁者のためのバンキングが盛んになり、使用時まで凍結保存する必要性から、凍結保存による赤血球溶血を防ぐことを目的に白血球は分離・純化されている。

血液から治療に必要な血球成分を分離する方法として、比重液を用いた比重遠心法、赤血球凝集剤を用いた赤血球凝集法、抗体を用いたアフィニティ分離法などが挙げられる。しかしながら、比重遠心法は比重液に原料細胞を重層させる際に液面を乱してはならない等、非常に熟練を要する煩雑な操作である。また、赤血球凝集法では、ヒドロキシエチルスターチ等と混和して、赤血球の連銭形成により赤血球を凝集、沈降させ、白血球層を分離する方法であるが、作業は煩雑であり、分離性能も十分とは言えない。また、アフィニティ分離法では、特異性は高いものの分離した細胞を回収するためには、結合した抗体分子を酵素処理するため、細胞の損傷、コスト高、操作の煩雑さなどの問題があった。

前述の煩雑さを解決する方法として、例えば、特許文献１、特許文献２において、血液中の目的細胞をフィルタに捕捉した後、回収液をフィルタに通液することにより剪断力を利用して目的細胞を回収するフィルタ法が開示されている。

ところが、これらのフィルタ法においては、血液処理量が増加していくと、血液を濾過する際、血液中の目的細胞がフィルタの細胞分離材の深層に到達してしまい、少量の決められた量の回収液では細胞分離材の深層まで到達した目的細胞を十分に回収しきれずに、細胞の回収率が低減してしまう。さらに、血液中の血球などの凝集塊による細胞分離材の細孔の閉塞により、目詰まりを起こして回収液の通液時にフィルタ容器の一部に過大な応力が集中することによって容器が破損するといった課題があった。

この対策として、濾過面積を広げて単位断面積あたりの濾過量を低減させる方法が取られる。特許文献３にあるように、回収液整流化材を有核細胞分離材に対して特定の配列となるように併用し、かつ、フィルタの有効濾過膜面積と充填厚みが特定の比率にある比較的扁平なフィルタを用いることで、濾過時の流速確保と回収液の均一流れによる有核細胞の高回収を達成している。濾過面積を広げていくと、細胞分離材の細孔の閉塞のリスクは下がる。

特開平１０−２０１４７０号公報 特開２０１６−１０３９４号公報 特開２００４−３２９０３４号公報

しかしながら、実際に処理する血液個体は、血液量も、血液の総細胞数やヘマトクリット値、血小板の活性度合い等の血液の特性が個体によって大きくばらつく。そのため、血液処理量が多い個体や、フィブリン塊や破壊した血球などの凝集塊が多い個体の血液処理時に、細胞分離材の細孔の閉塞により目詰まりを起こす可能性も存在する。目詰まりが起きている細胞分離フィルタに回収液を通液して細胞分離フィルタ容器に圧力をかけると、濾過面積を広げる前に比べてより大きな応力が容器の一部に集中し、容器の破損のリスクが高まる。さらに、回収液を通液する際の圧力負荷によって、ろ過面積を広げる前と比べて容器がより大きく変形することとなる。その結果、細胞分離材と容器の間にできた隙間から回収液が偏流する事で、細胞捕捉材に捕捉された細胞に十分な剪断力がかからず、細胞の回収率が低減してしまうといった新たな課題が発生する。

そこで、本願の発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねたところ、細胞分離フィルタの容器の応力が集中する箇所を均一な厚みの面一構造にせずにＵ字もしくはＣ字形状部を設ける事で、濾過面積を広げても、容器の変形を抑える事で細胞回収率を減少させることなく、かつ細胞分離材の細孔の閉塞時における回収液通過時の応力集中に耐えられることを見出した。

すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
本発明は、
（１）．
細胞分離材を充填するための空間を形成する側壁部と、
前記側壁部の一端側において前記空間を閉鎖する第１壁部と、
前記側壁部の他端側において前記空間を閉鎖する第２壁部と、を備え、
前記第１壁部には、液体を導入又は導出するための第１通液口が形成されており、前記第２壁部には、液体を導入又は導出するための第２通液口が形成されており、
第１壁部の端部と側壁部の端部が、Ｕ字もしくはＣ字形状部を介して繋がっている細胞分離フィルタ容器、
（２）．
前記第１壁部の内面には、前記空間に前記細胞分離材が充填されたときに、前記第２壁部と協働して前記細胞分離材を挟み込んで圧縮するように、前記内面から前記空間に向けて突出する複数の第１放射状突起部が形成されている、（１）に記載の細胞分離フィルタ容器、
（３）．
第１放射状突起部を囲むように第１環状突起部が形成されており、第１環状突起部は側壁部とともに環状の第１溝部を形成し、第１環状突起部は側壁部の内面よりも内側に配置されている、（１）または（２）に記載の細胞分離フィルタ容器、
（４）．
前記第２壁部の内面には、前記空間に前記細胞分離材が充填されたときに、前記第１壁部と協働して前記細胞分離材を挟み込んで圧縮するように、前記内面から前記空間に向けて突出する複数の第２放射状突起部が形成され、
前記側壁部とともに環状の第２溝部を形成するように、前記側壁部の内面よりも内側に配置され、かつ第２放射状突起部を囲むように第２環状突起部が形成されている、（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞分離フィルタ容器、
（５）．
前記側壁部と前記第１壁部とが一体的に形成されている、（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞分離フィルタ容器、
（６）．
前記第１溝部が、前記Ｕ字もしくはＣ字形状部に形成されることを特徴とする、
（１）〜（５）のいずれかに記載の細胞分離フィルタ容器、
（７）．
前記第１溝部の幅をR₁、前記第１溝部の形状の曲率をκ₁、前記第２溝部の幅をR₂、前記第２溝部の形状の曲率をκ₂とした場合に、以下の関係式を満たすことを特徴とする、
（１）〜（６）に記載の細胞分離フィルタ容器、

κ₁≧2/(R₁) かつ κ₂≧2/(R₂)

（８）．
前記曲率κ₁が、前期側壁部側κ₁__outerと前期第1環状突起部側κ₁__innerとで異なり、前記曲率κ₂が、前期側壁部側κ₂__outerと前期第２環状突起部側κ₂__innerとで異なり、以下の関係式を満たすことを特徴とする、
（１）〜（７）に記載の細胞分離フィルタ容器、

κ₁__inner ＞ κ₁__outer かつ／または κ₂__inner ＞ κ₂__outer

（９）．
前記曲率κ₁__innerとκ₁__outerおよび／またはκ₂__innerとκ₂__outerが以下の関係式を満たすことを特徴とする、
（１）〜（８）に記載の細胞分離フィルタ容器。

κ₁__inner：κ₁__{outer =} ６：５ かつ／または κ₂__inner：κ₂__{outer =} ６：５

（１０）．
（１）〜（９）のいずれか１項に記載の細胞分離フィルタ容器と、
前記細胞分離フィルタ容器の空間に充填された細胞分離材と、
を備える細胞分離フィルタ、
（１１）．
前記細胞分離材が不織布または多孔質セルロース粒子である（１０）に記載の細胞分離フィルタ、
（１２）．
（１０）または（１１）に記載の細胞分離フィルタの前記第一通液口又は前記第二通液口から細胞含有液を導入し吸着材と接触させる接触工程、及び前記細胞分離フィルタの前記第一通液口又は前記第二通液口から細胞濃縮液を回収する回収工程、を有する細胞濃縮液の製造方法、
に関する。

本発明に係る細胞分離フィルタ容器によればＵ字もしくはＣ字形状部を有することで、細胞回収液通液時の圧力負荷時の応力集中を低減することが可能となる。応力集中の低減によりカラムの変形が抑制され、細胞分離材と容器の間にできた隙間から回収液が偏流することなく、捕捉された細胞に十分な剪断力がかかって、細胞の回収率を増加させ安定化させることが出来る。

さらに、細胞分離材の細孔の閉塞が起こった細胞分離フィルタにおいても、細胞回収液通液時の圧力負荷時に発生する応力集中に耐えられる構造になる。同様に、応力集中の低減によりカラムの変形が抑制され、細胞分離材と容器の間にできた隙間から回収液が偏流することなく、捕捉された細胞に十分な剪断力がかかって、細胞分離材の閉塞が起こった細胞分離フィルタにおいても、細胞の回収率は大きく低減しない。

蓋固定部材２を、細胞分離材を内包した蓋部材３とボディ部材４に取り付けて本発明の細胞分離フィルタを組み立てる流れを示す図である。（a）は、蓋固定部材２を取り付ける前の状態を示す。（b）は、蓋固定部材２の角ネジオスがボディ部材４の角ネジメスと接し、嵌合する前の状態を示す。（c）は、（b）の状態から蓋固定のみを回転させる事により、蓋固定部材２の角ネジオスがボディ部材４の角ネジメスと勘合して細胞分離フィルタ容器が組み立てられた状態を示す。 本発明の実施の形態１に係る、Ｕ字形状部を有する細胞分離フィルタの容器の構成例を示す図であり、（ａ）は縦断面図、（ｂ）は斜視図である。 本発明の実施の形態１に係る、C字形状部を有する細胞分離フィルタの容器の構成例を示す図であり、（ａ）は縦断面図、（ｂ）は斜視図である。 本発明の実施の形態１および２に係る、蓋部材３の構成例を示す図である。（a）は蓋部材３を、不織布と接する面から見た平面図である。（b）はボディ部材４を不織布と接する面から見た平面図である。 本発明の実施の形態１に係る環状突起部と側壁部７の間に形成される溝部の曲率を示す縦断面拡大図である。 本発明の細胞分離フィルタを用いて閉鎖的に細胞を分離する回路の例を示す概略構成図である。 本発明の実施の形態１に係る細胞分離フィルタ容器１との比較検討のための、Ｕ字およびＣ字形状部を有さない細胞分離フィルタ容器１の相当応力分布の解析結果を示す。 本発明の実施の形態１に係る細胞分離フィルタ容器１の相当応力分布の解析結果を示す。

以下、本発明について詳細に説明する。
＜細胞分離フィルタ容器＞
図１（a）、図１（b）、図１（c）に、蓋固定部材２をボディ部材４の嵌合に合わせて容器１を組み立てる際の一連の流れを示す。容器１において、蓋固定部材２の嵌合部とボディ部材４の嵌合部とが嵌み合う事で、細胞分離材の圧縮率を一定に保ち、細胞回収液通液時に圧力が負荷された際に容器が耐えられるようになる。蓋固定部材２の角ネジメス１５Ｂがボディ部材４の角ネジオス１５Ａの嵌合部に嵌る一連の流れを示している。図１（a）に示すように、細胞分離材が蓋部材３とボディ部材４に挟み込まれるようにして組み立てられている。ボディ部材４には、ボディ部材を一周取り巻くようにして角ネジオス１５Ａが配置されており、角ネジオス１５Ａによって溝が等間隔で４箇所に配置されている。蓋固定部材２の内側には前記角ネジオス１５Ａの溝と嵌合するように、角ネジメス１５Ｂが等間隔で４箇所に配置されている。図１（b）に示すように、蓋固定部材２の角ネジメス１５Ｂが、ボディ部材４の角ネジオス１５Ａの溝に嵌る。図１（c）に示すように、ボディ部材および蓋部材３を固定した状態で蓋固定部材２を時計回りに４０°回転させる事で容器１が組み立てられる。ネジ部は角ネジに限らず、三角ネジ、台形ネジ、のこ刃ネジ、丸ネジ、ボールネジなどでもよい。また、ネジのピッチを細かく取ったメートルネジ、メートル台形ネジ、管用平行ネジ、管用テーパネジ、条ネジであってもよい。さらに、容易に蓋固定部材２が回転して外れないように、逆回転防止のためのスナップフィット構造を嵌合部に設けてもよい。さらに嵌合部は、ネジ式には限らず、超音波溶着や接着剤による固定でもよい。

細胞分離フィルタに用いられる容器は、任意の構造材料を使用して作成することができる。当該容器の構造材料としては特に限定されないが、非反応性ポリマー、生物親和性金属、合金、ガラス等が挙げられる。

非反応性ポリマーとしては、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等のアクリロニトリルポリマー；ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、テトラフルオロエチレンとヘキサフルオロプロピレンのコポリマー、ポリ塩化ビニル等のハロゲン化ポリマー；ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、ポリカーボネートアクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリスチレン、ポリメチルペンテン等が挙げられる。

生物親和性金属及び合金としては、ステンレス鋼、チタン、白金、タンタル、金、及びそれらの合金、並びに金メッキ合金鉄、白金メッキ合金鉄、コバルトクロミウム合金、窒化チタン被膜ステンレス鋼等が挙げられる。

滅菌耐性を有する点から、当該容器の構造材料として、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルペンテン等が好ましい。

本発明の細胞分離フィルタで使用される細胞分離材の形態は、特に限定されず、連通孔構造の多孔質担体、繊維の集合体、織物等が挙げられる。好ましくは繊維で構成されるものであり、より好ましくは不織布である。

不織布の材質は特に制限されないが、滅菌耐性や細胞への安全性の観点からは、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレン、高密度ポリエチレン、低密度ポリエチレン、ポリビニルアルコール、塩化ビニリデン、レーヨン、ビニロン、ポリプロピレン、アクリル（ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクリルニトリル、ポリアクリル酸、ポリアクリレート）、ナイロン、ポリイミド、アラミド（芳香族ポリアミド）、ポリアミド、キュプラ、カーボン、ポリフェノール、ポリエステル、パルプ、麻、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリカーボネート等の合成高分子、アガロース、セルロース、セルロースアセテート、キトサン、キチン等の天然高分子、ガラス等の無機材料や金属等が挙げられる。好ましくは、細胞捕捉能が高いポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリプロピレン、アクリル、ナイロン、ポリウレタンである。さらに好ましくは、有核細胞捕捉能が高いポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタラート、ナイロンである。２種以上の材質を組み合わせて繊維とする場合の繊維の形態としては、１本の繊維が異成分同士の材質よりなる繊維でもよく、異成分同士が剥離分割した分割繊維でもよい。また異成分同士の材質よりなる繊維をそれぞれ複合化した形態でもよい。ここでいう複合化とは、特に制限は無く、２種以上の繊維が混在した状態より構成される形態、あるいは単独の材質よりなる形態をそれぞれ張り合わせたもの等が挙げられる。さらに、蛋白質、ペプチド、アミノ酸、糖類等のように、特定の細胞に親和性のある分子を固定してもよい。

また、不織布に親水化処理を施してもよく、親水化処理により有核細胞以外の細胞の非特異的な捕捉が抑制され、体液や生体組織の処理液が偏りなく細胞分離フィルタ中を通過するので、性能の向上、必要細胞の回収率の向上等を付与することができる。親水化処理としては、水溶性多価アルコール、又は水酸基やカチオン基、アニオン基を有するポリマー、あるいはその共重合体（例えば、ヒドロキシエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート、あるいはその共重合体等）を吸着させる方法；水溶性高分子（ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等）を吸着させる方法；疎水性膜に親水性高分子を固定化する方法；細胞分離フィルタに電子照射する方法；含水状態で細胞分離フィルタに放射線を照射することで親水性高分子を架橋不溶化する方法；疎水性膜の表面をスルホン化する方法；親水性高分子と、疎水性ポリマードープとの混合物から膜をつくる方法；アルカリ水溶液処理（ＮａＯＨ、ＫＯＨ等）により膜表面に親水基を付与する方法；疎水性多孔質膜をアルコールに浸漬した後、水溶性ポリマー水溶液で処理、乾燥後、熱処理や放射線等で不溶化処理する方法；界面活性作用を有する物質を吸着させる方法等が挙げられる。親水性高分子としては、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、エチレン−ビニルアルコール共重合体、水溶性多価アルコール等が挙げられる。

不織布に固定するタンパク質としては、特定の細胞に親和性のあるタンパク質であれば特に限定されないが、具体的にはフィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、コラーゲン等が挙げられる。また、不織布に固定する糖類としては、細胞に親和性のある糖類であれば特に限定されないが、セルロース、キチン、キトサン等の多糖類やマンノース、グルコース、ガラクトース、フコース等のオリゴ糖等が挙げられる。

多孔質担体としては、セルロース、アセチルセルロース、デクストリン等の多糖類、及びポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリビニルアルコール等の、合成ポリマーからなる有機担体が含まれる。これらは、ヒドロキシエチルメタクリレートのようなヒドロキシル基含有のポリマー材料や、ポリエチレンオキサイド鎖含有モノマーや、他の重合化モノマーの共重合体のような、グラフト共重合体からなるコーティング層を有していても構わない。活性基が担体表面に容易に導入されることから、これらの中ではセルロースやポリビニルアルコールのような合成ポリマーが実用的には好ましい。特に多孔質セルロース粒子が最も好ましい。

多孔質担体（特に多孔質セルロース粒子）には、ｌｏｇＰ（Ｐはオクタノール−水系での分配係数）値が２．５０以上の化合物を固定化してなるものであることが好ましい。

ｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物としては、トリプトファン誘導体、ポリアニオン性化合物等が挙げられ、トリプトファン誘導体及びポリアニオン性化合物が多孔質担体に固定されていることが好ましい。

ｌｏｇＰ値とは、化合物の疎水性のパラメータであり、代表的なオクタノール−水系での分配係数Ｐは以下のように求められる。まず、化合物をオクタノール（又は水）に溶解し、これに等量の水（又はオクタノール）を加え、グリッフィン・フラスク・シェイカー（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｆｌａｓｋ ｓｈａｋｅｒ）（グリッフィン・アンド・ジョージ・リミテッド（Ｇｒｉｆｆｉｎ ＆ Ｇｅｏｒｇｅ Ｌｔｄ．）製）で３０分間振盪する。そののち２０００ｒｐｍで１〜２時間遠心分離し、オクタノール層及び水層中の化合物の各濃度を分光学的又はＧＬＣなどの種々の方法で測定する。これらの値を次式に代入することにより、Ｐが求められる。

Ｐ＝Ｃｏｃｔ／Ｃｗ（Ｃｏｃｔ：オクタノール層中の化合物濃度、Ｃｗ：水層中の化合物濃度）
これまでに多くの研究者らにより種々の化合物のｌｏｇＰ値が実測されているが、それらの実測値はシー・ハンシュ（Ｃ．Ｈａｎｓｃｈ）らによって整理されている（「パーティション・コーフィシエンツ・アンド・ゼア・ユージズ；ケミカル・レビューズ（ＰＡＲＴＩＴＩＯＮ ＣＯＥＦＦＩＣＩＥＮＴＳ ＡＮＤ ＴＨＥＩＲ ＵＳＥＳ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ）、７１巻、５２５頁、１９７１年」参照）。

また実測値の知られていない化合物についてはアール・エフ・レッカー（Ｒ．Ｆ．Ｒｅｋｋｅｒ）がその著書「ザ・ハイドロフォビック・フラグメンタル・コンスタント（ＴＨＥ ＨＹＤＲＯＰＨＯＢＩＣ ＦＲＡＧＭＥＮＴＡＬ ＣＯＮＳＴＡＮＴ）」，エルセビア・サイエンティフィック・パブリッシング・カンパニー・アムステルダム（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉ．Ｐｕｂ．Ｃｏｍ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）（１９７７）中に示している疎水性フラグメント定数ｆを用いて計算した値（Σｆ）が参考となる。疎水性フラグメント定数は数多くのｌｏｇＰ実測値をもとに、統計学的処理を行い決定された種々のフラグメントの疎水性を示す値であり、化合物を構成するおのおののフラグメントのｆ値の和はｌｏｇＰ値とほぼ一致すると報告されている。

（実施の形態）
図２（ａ）の縦断面図に示すように、本発明の実施の形態１に係る細胞分離フィルタの容器１は、蓋固定部材２、蓋部材３、ボディ部材４、封止材５の４つの部材からなる。

また、容器１内は、ボディ部材４側面の側壁部７と、第1壁部８Ａ、蓋部材３の第２壁部８Ｂによって細胞分離材を充填するための空間６が形成され、前記細胞分離材が収容される。なお、図面を見やすくするために前記細胞分離材の図示を省略している。

ボディ部材４には中央部に第１通液口９Ａが、蓋部材３にも同様に中央部に第２通液口９Ｂが配置されている。

図４（a）に細胞分離材と接する面から見た蓋部材３の平面図を示す。図４（a）に示されるように、蓋部材３には、細胞分離材と接する面に第２放射状突起部１０Ｂが中心から放射状に等間隔で配置され、さらに、第２環状突起部１２Ｂが、ボディ部材の側壁部７よりも内側に配置される形で第２放射状突起部１０Ｂを囲むように環状に形成されている。

図４（b）に細胞分離材と接する面から見たボディ部材４の平面図を示す。図４（b）に示されるように、ボディ部材４も同様に細胞分離材と接する面に第１放射状突起部１０Ａが中心から放射状に等間隔で配置され、さらに、第１環状突起部１２Ａが、側壁部７よりも内側寄せられた形で第１放射状突起部１０Ａを囲むように環状に形成されている。これらの第１放射状突起部１０Ａと第１環状突起部１２Ａが第２放射状突起部１０Ｂと第２環状突起部１２Ｂと共に細胞分離材を挟み込んで圧縮し、細胞分離フィルタとして機能を発揮する。

図２に示すようにボディ部材４の側壁部７と第１環状突起部１２Ａの間には、第１溝部１１Ａが、ボディ部材４の側壁部７と第２環状突起部１２Ｂの間には、第２溝部１１Ｂが形成されている。本実施の形態１においては、第１溝部１１Ａの溝の深さは、第１放射状突起部１０Ａの高さよりも深くなっており、ボディ部材４の下面から下の方向に膨らんだ形状の第１Ｕ字形状部１３Ａを形成している。第１Ｕ字形状部１３Ａと第１溝部１１Ａによって、回収液通液時の圧力付加時において第１溝部１１Ａへ応力を分散する事で応力集中を防ぎ、さらに、細胞回収率低下につながるカラムの変形を低減することが可能となっている。

第２溝部１１Ｂも同様のＵ字形状となってもよいし、第１溝部１１Ａおよび第２溝部１１Ｂの形状はＵ字形状に限定されるものではなく、図３（a）、図３（b）に示すようにC字形状であってもよい。

ここで、Ｕ字形状とは、溝部１１の側壁部７側の曲面の曲率をκ_outer、環状突起部１２側の曲面の曲率をκ_innerとした場合に、溝部１１のκ_outerとκ_innerが等しいものをいい、Ｃ字形状とは、溝部１１のκ_outerとκ_innerが異なるものをいう。いずれもボディ部材４の下面から下の方向に膨らんだ形状を有している。

前記第１溝部１１Ａの幅をR₁、前記第１溝部１１Ａの形状の曲率をκ₁、前記第２溝部１１Ｂの幅をR₂、前記第２溝部１１Ｂの形状の曲率をκ₂とした場合に、κ₁≧2/(R₁)かつκ₂≧2/(R₂)とすることが望ましい。

図５（a）に第1溝部１１Ａを拡大した図を示す。第１溝部１１Ａの側壁部７側の曲面の曲率をκ₁__outer、第1環状突起部１２Ａ側の曲面の曲率をκ₁__innerとする時に、κ₁__inner＞κ₁__outerとすることが望ましく、κ₁__inner:κ₁__outer ＝ 6:5とすることが更に望ましい。同様に、第２溝部１１Ｂの側壁部７側の曲面の曲率をκ₂__outer、第２環状突起部１２Ｂ側の曲面の曲率をκ₂__innerとする時に、κ₂__inner＞κ₂__outerとすることが望ましく、κ₂__inner:κ₂__outer ＝ 6:5とすることが更に望ましい。

＜細胞濃縮液の製造方法＞
本発明の細胞濃縮液の製造方法は、前記細胞分離フィルタの第１通液口９Ａ又は第２通液口９Ｂから細胞含有液を導入し、細胞分離材と接触させる接触工程、及び細胞分離フィルタの第１通液口９Ａ又は第２通液口９Ｂから細胞濃縮液を回収する回収工程、を有する。

細胞含有液とは、末梢血、骨髄、臍帯血、月経血、組織抽出物等の有核細胞を含有する体液、あるいはこれらの体液を生理食塩液、カルシウムイオンやマグネシウムイオン等の２価カチオンを含むリンゲル液、細胞培養に使用するＲＰＭＩ、ＭＥＭ、ＩＭＥＭ、ＤＭＥＭ等の培地、ＰＢＳ等のリン酸緩衝液で希釈したもの、あるいは体液から細胞を粗分離したものであっても構わない。また動物種も、哺乳動物であれば特に限定されず、例えばヒト、ウシ、マウス、ラット、ブタ、サル、イヌ、ネコ等が挙げられる。細胞含有液が抗凝固剤を含有する場合も、抗凝固剤の種類は限定されず、例えばヘパリン、低分子ヘパリン、フサン（メチル酸ナフォモスタット）、ＥＤＴＡ、ＡＣＤ（ａｃｉｄ-ｃｉｔｒａｔｅ-ｄｅｘｔｒｏｓｅ）液、ＣＰＤ（ｃｉｔｒａｔｅ-ｐｈｏｓｐｈａｔｅ-ｄｅｘｔｒｏｓｅ）液等のクエン酸抗凝固が挙げられる。使用する目的に影響がなければ、保存条件も限定されない。

有核細胞とは、核を含有する細胞であれば特に限定されず、例えば、単核球、白血球、顆粒球、好中球、好酸球、好塩基球、赤芽球、骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、リンパ球、単球、マクロファージ、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、ＮＫ／Ｔ細胞、樹状細胞、多核巨細胞、上皮細胞、内皮細胞、間葉系細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞及び幹細胞等が挙げられる。

細胞濃縮液とは、有核細胞を含有する液体であって、前記細胞含有液と比較して液体中における有核細胞数が多い、又は細胞密度が高い液体をいう。なお、幹細胞とは、体液中から分離され、多分化能及び自己複製能を有する細胞をいう。

間葉系幹細胞は、分化誘導因子の添加により骨芽細胞、軟骨細胞、血管内皮細胞、心筋細胞、あるいは、脂肪、歯周組織構成細胞であるセメント芽細胞、歯周靱帯繊維芽細胞等へ分化する細胞である。また、造血幹細胞は、白血球、リンパ球、好中球、好酸球、好塩基球、顆粒球、単球、マクロファージ、赤血球、血小板、巨核球、樹状細胞等の血球系細胞を分化する細胞である。

本発明における細胞分離フィルタから細胞濃縮液を回収する工程は、フィルタを通過して得られる有核細胞を多く含有する液体を回収する工程であり、細胞分離フィルタの性質に応じて、細胞濃縮液を回収できればよい。

フィルタ内に充填された細胞分離材が、除去目的とする細胞や夾雑物と親和性を持つ場合は、フィルタの流入口から細胞含有液を導入し、細胞分離材と細胞含有液を接触させる接触工程の後、流出口から細胞濃縮液を回収することができる。フィルタの流出口から細胞濃縮液を回収する際に、回収液をフィルタの流入口から導入して細胞濃縮液を流出口から回収することが好ましい。除去目的の細胞としては、例えば顆粒球、単球、血小板、Ｂリンパ球、特定のサブクラスを有するリンパ球等が挙げられる。具体的には、顆粒球をフィルタに捕捉して除去し、単核球含有分画を回収する方法が挙げられる。

フィルタ内に充填された細胞分離材が、回収目的とする有核細胞と親和性を持つ場合は、フィルタの流入口から細胞含有液を導入して、除去目的とする細胞や夾雑物を流出口より流出させた後、流入口から細胞濃縮液を回収することができる。フィルタの流入口から細胞濃縮液を回収する際に、回収液をフィルタの流出口から導入し細胞濃縮液を流入口から回収することが好ましい。除去目的の細胞としては、例えば赤血球、Ｔリンパ球、特定のサブクラスを有するリンパ球等が挙げられる。具体的には、不要な細胞を通過させ、フィルタに捕捉された幹細胞を回収する方法が挙げられる。

また、回収液をフィルタの流出口から導入して細胞濃縮液を回収する場合には、回収の前に、洗浄液をフィルタの流入口から導入することで、より効率的に、除去目的とする細胞や夾雑物を流出口より流出させることができる。洗浄液は除去目的とする細胞や夾雑物のみを洗い流すことができれば特に限定されず、例えば生理食塩水、リンゲル液、細胞培養に用いる培地、リン酸緩衝液等の一般的な緩衝液、あるいはこれら溶液に血清やタンパク質を添加した溶液が挙げられる。

回収液は、フィルタ内に捕捉された有核細胞、あるいはフィルタ内に残留する単核球を回収する目的で好適に使用される。回収液は特に限定されず、例えば生理食塩水の他、マグネシクムイオンやカルシウムイオン等の２価カチオン、糖類、血清、蛋白質を含む液体、緩衝液、培地、血漿やそれらを含む液体等が挙げられる。フィルタに捕捉された有核細胞の回収率を上げるために、回収液の粘張度を上げても良い。粘張度を上げるために回収液に添加する物質は特に限定されず、例えばアルブミン、フィブリノーゲン、グロブリン、デキストラン、ヒドロキシエチルスターチ、ヒドロキシルセルロース、コラーゲン、ヒアルロン酸、ゼラチン等が挙げられる。

細胞含有液及び回収液を通液する速度及びその方法は特に制限されず、例えば重力を利用して通液する方法、ローラークレンメやシリンジポンプを用いて流速を一定にしながら通液する方法、高い圧力をかけて一気に通液する方法等が挙げられる。フィルタ内に捕捉された有核細胞を回収する目的には、有核細胞回収効率の点から、回収液を高い圧力をかけて一気に通液する方法が好ましい。シリンジを用いて手動もしくは、ポンプを用いて９０ｍＬ／ｍｉｎ以上での流速で通液する方法が、より多くの有核細胞を回収することができる点で好ましい。

本発明の細胞分離フィルタを用いて閉鎖的に細胞を分離する回路の例を図６に示す。
図６に記載の回路は、細胞含有液を収容する容器１６は通液口を備え、通液可能な配管２４を通して三方活栓２１に接続されている。同様に、プライミング用の液体を収容する容器１７も通液口を備え、通液可能な配管２５を通して三方活栓２１と接続している。三方活栓２１と三方活栓２２は通液可能な配管２６で接続されている。細胞濃縮液を収容する容器１８は通液口を備え、通液可能な配管２７を通して三方活栓２２と接続している。本発明の細胞分離フィルタについては、流入口が三方活栓２２と接続した配管２８と、流出口が配管２９と接続している。細胞回収液を収納する容器１９は通液口を備え、通液可能な配管３０を通して三方活栓２３と接続している。同様に、細胞分離フィルタを通過したプライミング用の液体および細胞含有液を収容する容器２０は通液口を備え、通液可能な配管３１を通して、三方活栓２３と接続している。

図６に記載の回路を用いた具体的な細胞濃縮液の製造手順は次の通りである。
まず初めに、細胞分離フィルタ内のエアーを除去する目的、細胞捕捉効率を向上する目的、及び血液流路を確保する目的でプライミングを行う為に、容器１７に収納されているプライミング用の液体を、細胞分離フィルタを通過させて、容器２０へと流す。この時、三方活栓２１は配管２５と配管２６を導通し、配管２４への流れを遮断している。三方活栓２２は配管２６および配管２８と細胞分離フィルタを導通し、配管２７への流れを遮断している。さらに三方活栓２３は、細胞分離フィルタと配管２９および配管３１を導通し、配管３０への流れを遮断している。

次に、細胞含有液を細胞分離フィルタ内の細胞分離材に接触させるために、容器１６に収容されている細胞含有液を、細胞分離フィルタに通過させて、容器２０へと流す。この時、三方活栓２１は配管２４と配管２６を導通し、配管２５への流れを遮断している。三方活栓２２は配管２８と配管２６を導通し、配管２７への流れを遮断している。さらに三方活栓２３は、細胞分離フィルタと配管２９および配管３１を導通し、配管３０への流れを遮断している。

最後に、細胞濃縮液を回収するために、容器１９に収容されている細胞回収液を細胞分離フィルタに通過させて、容器１８へと流す。この時、三方活栓２３は配管３０と配管２９を導通し、配管３１への流れを遮断している。さらに三方活栓２２は、細胞分離フィルタと配管２８および配管２７を導通し、配管２６への流れを遮断している。

回路は、液の流れを制御するために、三方活栓、ローラークレンメ、クランプ等を備えていることが好ましい。

細胞分離フィルタに細胞含有液を導入し細胞分離材と接触させる接触工程を、細胞分離フィルタの切り換え機構によりクロスフロー方式にした状態で行うことにより、細胞含有液の流れが、細胞分離材表面への粒子の堆積や目詰まりによる流動抵抗の上昇を緩やかにし、細胞分離材の全面を使って大量の細胞含有液を濾過できる。

＜構造解析＞
発明者らは、Ｕ字形状部およびＣ字形状部を有さない細胞分離フィルタ容器と、上述した実施の形態１に係る図２に示す細胞分離フィルタ容器に対して、構造解析を実施した。構造解析はアンシス・ジャパン株式会社が提供する構造解析ソフトウェア
ANSYS Structural 15.0（http://www.ansys.com/ja-JP/Products/structures）を用いて行った。

フィルタ内の細胞分離材が血液中の血球などの凝集塊による細胞分離材の細孔の閉塞により、目詰まりを起こして通血が完全に止まってしまうことを完全閉塞と呼ぶ。以下に示す解析において、完全閉塞の際に回収液を通液する場合の条件として、細胞分離フィルタ容器内部全体に０．８０MPaの圧力を負荷した。この０．８０MPaという数値は、実験で完全閉塞が起こった際に得られた圧力データを基にしている。更に、不織布の反発力を容器の第１放射状突起部１０Ａおよび第２放射状突起部１０Ｂと第１環状突起部１２Ａおよび第２環状突起部１２Ｂに０．３０MPa、接触面に対して鉛直方向に付加している。この０．３０MPaという数値も、実験により得られたデータを用いている。

材料に関しては、ポリカーボネートを想定し、材料の機械的物性値として、密度１．２０(kg/m³)、ヤング率２，１３４(MPa)、ポアソン比０．３８、引張降伏強さ６２．０(MPa)、引張極限強さ７０．５(MPa)として解析を実施した。

図７に比較検討のために、Ｕ字形状部およびＣ字形状部を有さない細胞分離フィルタ容器に完全閉塞時の０．８０MPaと不織布の反発力０．３０MPaを負荷した際の応力分布を示す。図７に示す解析モデルを（１）とする。

図８に、前記実施の形態１の細胞分離フィルタ容器に完全閉塞時の０．８０MPaと不織布の反発力０．３０MPaを負荷した際の応力分布を示す。図８に示す解析モデルを（２）とする。

表１に、解析モデル（１）、解析モデル（２）の最大相当応力の最大値を示す。解析モデル（２）は、Ｕ字形状部を有する事で、解析モデル（１）で見られた溝部の応力が分散し、最大相当応力値が低減した。

１ 細胞分離フィルタ容器
２ 蓋固定部材
３ 蓋部材
４ ボディ部材
５ 封止材
６ 細胞分離材を充填するための空間
７ 側壁部
８Ａ 第１壁部
８Ｂ 第２壁部
９Ａ 第１通液口
９Ｂ 第２通液口
１０Ａ 第１放射状突起部
１０Ｂ 第２放射状突起部
１１Ａ 第１溝部
１１Ｂ 第２溝部
１２Ａ 第1環状突起部
１２Ｂ 第２環状突起部
１３Ａ Ｕ字形状部、Ｃ字形状部
１５Ａ 角ネジオス
１５Ｂ 角ネジメス
１６ 容器
１７ 容器
１８ 容器
１９ 容器
２０ 容器
２１ 三方活栓
２２ 三方活栓
２３ 三方活栓
２４ 配管
２５ 配管
２６ 配管
２７ 配管
２８ 配管
２９ 配管
３０ 配管
３１ 配管

Claims (12)

1. 細胞分離材を充填するための空間を形成する側壁部と、
   前記側壁部の一端側において前記空間を閉鎖する第１壁部と、
   前記側壁部の他端側において前記空間を閉鎖する第２壁部と、を備え、
   前記第１壁部には、液体を導入又は導出するための第１通液口が形成されており、前記第２壁部には、液体を導入又は導出するための第２通液口が形成されており、
   第１壁部の端部と側壁部の端部が、Ｕ字もしくはＣ字形状部を介して繋がっている細胞分離フィルタ容器。
   
2. 前記第１壁部の内面には、前記空間に前記細胞分離材が充填されたときに、前記第２壁部と協働して前記細胞分離材を挟み込んで圧縮するように、前記内面から前記空間に向けて突出する複数の第１放射状突起部が形成されている、請求項1に記載の細胞分離フィルタ容器。
   
3. 第１放射状突起部を囲むように第１環状突起部が形成されており、第１環状突起部は側壁部とともに環状の第１溝部を形成し、第１環状突起部は側壁部の内面よりも内側に配置されている、請求項1または請求項２に記載の細胞分離フィルタ容器。
   
4. 前記第２壁部の内面には、前記空間に前記細胞分離材が充填されたときに、前記第１壁部と協働して前記細胞分離材を挟み込んで圧縮するように、前記内面から前記空間に向けて突出する複数の第２放射状突起部が形成され、
   前記側壁部とともに環状の第２溝部を形成するように、前記側壁部の内面よりも内側に配置され、かつ第２放射状突起部を囲むように第２環状突起部が形成されている、請求項１〜請求項３のいずれかに記載の細胞分離フィルタ容器。
   
5. 前記側壁部と前記第１壁部とが一体的に形成されている、請求項１〜請求項４のいずれかに記載の細胞分離フィルタ容器。
   
6. 前記第１溝部が、前記Ｕ字もしくはＣ字形状部に形成されることを特徴とする、
   請求項１〜請求項５のいずれかに記載の細胞分離フィルタ容器。
   
7. 前記第１溝部の幅をR₁、前記第１溝部の形状の曲率をκ₁、前記第２溝部の幅をR₂、前記第２溝部の形状の曲率をκ₂とした場合に、以下の関係式を満たすことを特徴とする、
   請求項１〜請求項６に記載の細胞分離フィルタ容器。
   
   κ₁≧2/(R₁) かつ κ₂≧2/(R₂)
   
8. 前記曲率κ₁が、前期側壁部側κ₁__outerと前期第1環状突起部側κ₁__innerとで異なり、前記曲率κ₂が、前期側壁部側κ₂__outerと前期第２突起部側κ₂__innerとで異なり、以下の関係式を満たすことを特徴とする、
   請求項１〜請求項７に記載の細胞分離フィルタ容器。
   
   κ₁__inner ＞ κ₁__outer かつ／または κ₂__inner ＞ κ₂__outer
   
9. 前記曲率κ₁__innerとκ₁__outerおよび／またはκ₂__innerとκ₂__outerが以下の関係式を満たすことを特徴とする、
   請求項１〜請求項８に記載の細胞分離フィルタ容器。
   
   κ₁__inner：κ₁__outer ＝ ６：５ かつ／または κ₂__inner：κ₂__outer ＝ ６：５
   
10. 請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の細胞分離フィルタ容器と、
    前記細胞分離フィルタ容器の空間に充填された細胞分離材と、
    を備える細胞分離フィルタ。
    
11. 前記細胞分離材が不織布または多孔質セルロース粒子である請求項１０に記載の細胞分離フィルタ。
    
12. 請求項１０または請求項１１に記載の細胞分離フィルタの前記第一通液口又は前記第二通液口から細胞含有液を導入し吸着材と接触させる接触工程、及び前記細胞分離フィルタの前記第一通液口又は前記第二通液口から細胞濃縮液を回収する回収工程、を有する細胞濃縮液の製造方法。