JP2018186813A - 単球を含む細胞含有液の取得方法 - Google Patents

Abstract

【課題】単球を含む粗細胞含有液をフィルター部材に供給して、単球をフィルター部材に捕捉させ、捕捉された単球をフィルター部材から回収する方法であって、高い回収効率で単球を回収できる、単球を含む細胞含有液の取得方法を提供すること。【解決手段】フィルター部材を収容する細胞分離用フィルター装置に、単球を含む粗細胞含有液を供給して、フィルター部材に単球を捕捉させた後に、細胞分離用フィルター装置内に、フィルター部材両面での圧力差である差圧が２０ｋＰａ以上２００ｋＰａ以下の範囲内であるように、回収液を供給して、単球を含む細胞含有液を取得する。【選択図】図２

Description

本発明は、単球を含む細胞含有液の取得方法に関する。

近年、血液学や科学テクノロジーの急速な進歩に伴い、全血・骨髄・臍帯血・組織抽出物をはじめとする体液から必要な血液分画のみを分離して患者に投与することで治療効果を高め、さらに、治療に必要のない分画は投与しないことで副作用を抑制するという治療スタイルが広く普及している。

例えば、血液輸血もその１つである。赤血球製剤は、出血又は赤血球が不足する場合、又は赤血球の機能低下により酸素が欠乏している場合に使用される血液製剤である。赤血球製剤には、異常な免疫反応や移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）等の副作用を誘導する白血球は不要であり、フィルターで白血球を除去する必要がある。場合によっては白血球に加えて血小板も除去することもある。

一方、血小板製剤は、血液凝固因子の欠乏による出血ないし出血傾向にある患者に使用される血液製剤である。血小板製剤の製造のためには、遠心分離により、血小板以外の不要な細胞や成分は除去され、必要とされる血小板成分のみが採取されている。

加えて近年、白血病に向けた造血幹細胞移植が盛んに行われるようになり、治療に必要な、造血幹細胞を含む白血球群を分離し投与する方法がとられている。この造血幹細胞のソースとして、ドナーの負担が少ない、増殖能力が優れている、等の利点から、骨髄や末梢血に加えて臍帯血も注目を浴びている。また近年、月経血中にも幹細胞が豊富に存在することが示唆され、これまで廃棄されていた月経血も貴重な幹細胞ソースとして利用される可能性がある。
また固形癌の治療に対しては樹状細胞療法が盛んに行われており、患者の血液や細胞培養液から治療のもととなる単球を含む細胞群を分離するケースがある。

細胞分離方法として、最近では、赤血球と血小板は捕捉されず白血球のみを捕捉するフィルター材料を用いて白血球を回収する方法も報告されている（特許文献１、特許文献２、及び特許文献３を参照）。従来は遠心分離又は比重液を使用した密度勾配遠心法によって分離操作を行っていたが、フィルターを用いることで操作の簡略化や大型のセルプロセッシング施設が必要ない等の利点がある。
しかしながら、特許文献１〜３等に記載の白血球の回収方法を、単球の回収に適用してみても、十分に高い回収率で単球を回収しにくい問題がある。

特表２００１−５１８７９２号公報 国際公開第９８／３２８４０号 特開平１０−３１３８５５号公報

上記のような事情に鑑み、本発明は、内部にフィルター部材を収容する細胞分離用フィルター装置を用いることにより、高い回収効率で単球を回収できる、単球を含む細胞含有液の取得方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、フィルター部材を収容する細胞分離用フィルター装置に、単球を含む粗細胞含有液を供給して、フィルター部材に単球を捕捉させた後に、細胞分離用フィルター装置内に、フィルター部材両面での圧力差である差圧が２０ｋＰａ以上２００ｋＰａ以下の範囲内であるように、回収液を供給して、単球を含む細胞含有液を取得することにより上記の課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。

〔１〕単球を含む細胞含有液の取得方法であって、
単球を含む粗細胞含有液をフィルター部材の第１面から第２面に通液して、単球をフィルター部材に捕捉させることと、
フィルター部材の第２面から第１面に回収液を通液して、フィルター部材に捕捉された単球を回収液中に遊離させて細胞含有液を生じさせることと、
細胞含有液を回収することと、
を含み、
フィルター部材の第１面と第２面とでの差圧が２０ｋＰａ以上２００ｋＰａ以下である条件で、回収液のフィルター部材への供給と、細胞含有液の回収とが行われる方法。

〔２〕粗細胞含有液を、フィルター部材をその内部に収容する細胞分離用フィルター装置を通過させることで、フィルター部材に単球を捕捉させ、
細胞分離用フィルター装置が、液体導入口と、液体導出口とを備え、
細胞分離用フィルター装置内において、液体導入口と、液体導出口との間にフィルター部材が収容され、
粗細胞含有液が、液体導入口から液体導出口に向けて、細胞分離用フィルター装置内を通過し、
回収液が、液体導出口から細胞分離用フィルター装置内に供給され、
細胞含有液が、液体導入口から回収される、〔１〕に記載の単球を含む細胞含有液の取得方法。

〔３〕回収液の供給と、細胞含有液の回収とを行う際に、フィルター部材の液体導出口側の面での圧力が、フィルター部材の液体導入口側の面での圧力よりも高い、〔１〕又は〔２〕に記載の単球を含む細胞含有液の取得方法。

〔４〕回収液を、細胞分離用フィルター装置内に供給する際の流速が、５ｍＬ／秒以上３０ｍＬ／秒以下である、〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載の単球を含む細胞含有液の取得方法。

〔５〕細胞分離用フィルター装置の容量が、４ｍＬ以上５０ｍＬ以下である〔１〕〜〔４〕のいずれか１つに記載の単球を含む細胞含有液の取得方法。

〔６〕フィルター部材のろ過面の面積が、４ｃｍ^２以上１００ｃｍ^２以下である請求項〔１〕〜〔５〕のいずれか１つに記載の単球を含む細胞含有液の取得方法。

〔７〕単球を含む粗細胞含有液が、血液及び／又は骨髄液である〔１〕〜〔６〕のいずれか１つに記載の単球を含む細胞含有液の取得方法。

〔８〕フィルター部材の通気度（ｃｃ／ｃｍ^２・ｓｅｃ）と、厚み（ｍｍ）との積である通気度係数Ｍの値が、７以上１４以下である、〔１〕〜〔７〕のいずれか１項に記載の単球を含む細胞含有液の取得方法。

〔９〕フィルター部材が繊維で構成される織布又は不織布であり、フィルター部材を構成する繊維の繊維径が、２μｍ以上６μｍ以下である、〔１〕〜〔８〕のいずれか１項に記載の単球を含む細胞含有液の取得方法。

〔１０〕フィルター部材の圧縮されていない状態での充填密度が、０．０５ｇ／ｃｍ^３以上０．１７ｇ／ｃｍ^３以下である、〔１〕〜〔９〕のいずれか１つに記載の単球を含む細胞含有液の取得方法。

〔１１〕フィルター部材の目付けが、２０ｇ／ｍ^２以上８０ｇ／ｍ^２以下である、〔１〕〜〔１０〕のいずれか１つに記載の単球を含む細胞含有液の取得方法。

本発明によれば、単球を含む粗細胞含有液をフィルター部材に供給して、単球をフィルター部材に捕捉させ、捕捉された単球をフィルター部材から回収する方法であって、高い回収効率で単球を回収できる、単球を含む細胞含有液の取得方法を提供することができる。

細胞分離用フィルター装置の１例の概略を示す図である。 フィルター部材を収容した状態の細胞分離用フィルター装置の１例についての断面を示す図である。 実施例及び比較例で用いた細胞分離用デバイスの回路の概略を示す図である。

以下、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明する。

≪単球を含む細胞含有液の取得方法≫
単球を含む細胞含有液の取得方法は、
単球を含む粗細胞含有液をフィルター部材の第１面から第２面に通液して、単球をフィルター部材に捕捉させることと、
フィルター部材の第２面から第１面に回収液を通液して、フィルター部材に捕捉された単球を回収液中に遊離させて細胞含有液を生じさせることと、
細胞含有液を回収することと、
を含む。
また、回収液のフィルター部材への供給と、細胞含有液の回収とは、フィルター部材の第１面と第２面とでの差圧が２０ｋＰａ以上２００ｋＰａ以下である条件で行われる。
なお、本願明細書において、単球を含む液のうち、フィルター部材によって処理される液を「粗細胞含有液」と記し、フィルター部材による処理後に回収される液を「細胞含有液」と記す。

単球を含む細胞含有液を取得するために使用される装置は、フィルター部材を用いて、上記の所定の操作を行うことが出来れば特に限定されない。通常、フィルター部材をその内部に収容する細胞分離用フィルター装置を用いて、細胞含有液の取得が行われる。
細胞含有液の取得に用いられる好ましい細胞分離用フィルター装置は、液体導入口と、液体導出口とを備える。また、細胞分離用フィルター装置内において、液体導入口と、液体導出口との間にフィルター部材が収容される。
以下、上記の好ましい細胞分離用フィルター装置を用いる、細胞含有液の取得方法について説明する。

上記方法により単球を含む細胞含有液を取得する際には、粗細胞含有液をフィルター部材の第１面から第２面に通液して、単球をフィルター部材に捕捉させる。ここで、第１面と第２面とは、互いに表裏の関係にある。また、第１面は、粗細胞含有液を導入させる液体導入口側の面であり、第２面は液体導出口側の面である。
具体的には、粗細胞含有液は、液体導入口から液体導出口に向けて、細胞分離用フィルター装置内を通過するように、細胞分離用フィルター装置内に供給される。

また、フィルター部材の第２面から第１面に向けて回収液を通液する。具体的には、液体導出口から細胞分離用フィルター装置内に回収液が供給される。
回収液の供給により生じた、単球を含む細胞含有液は、液体導入口から回収される。

上記方法における、回収液の供給と、細胞含有液の回収とは、フィルター部材の両面（第１面と第２面と）での差圧が２０ｋＰａ以上２００ｋＰａ以下である条件で行われる。
このような条件下で細胞含有液を生じさせることで、単球を含む細胞含有液を取得する際の単球の回収率を高めることができる。
理由は定かではないが、上記の条件で回収液の供給と、細胞含有液の回収とを行うことによって、よりカラム内の圧力変化が小さくなる。つまり外部刺激がより少ない環境となり、フィルター部材に捕捉された物理強度面で脆い単球の破壊を抑制しつつ、単球を回収液中に遊離させることができ、その結果、単球の回収率が向上していると考えられる。

以下、単球を含む粗細胞含有液を、フィルター部材をその内部に収容する細胞分離用フィルター装置に通過させることで、単球をフィルター部材に捕捉させることを、「単球捕捉」とも記す。
また、細胞分離用フィルター装置内に回収液を供給することで、フィルター部材に捕捉された単球を回収液中に遊離させて細胞含有液を生じさせることを、「細胞含有液生成」とも記す。
さらに、細胞含有液を細胞分離用フィルター装置内から回収することを、「細胞含有液回収」とも記す。

以下、単球を含む細胞含有液の取得方法が備える各工程について説明する。

＜単球捕捉＞
単球捕捉では、単球を含む粗細胞含有液を、フィルター部材をその内部に収容する細胞分離用フィルター装置に通過させることで、単球をフィルター部材に捕捉させる。
細胞分離用フィルター装置は、液体導入口と、液体導出口とを備え、液体導入口と、液体導出口との間にフィルター部材を収容できるものであれば特に限定されない。

〔細胞分離用フィルター装置〕
以下、細胞分離用フィルター装置の好ましい一例について、図１、図２（ａ）、及び図２（ｂ）を用いて説明する。
細胞分離用フィルター装置１は、細胞分離用フィルター容器２と、フィルター部材１１とを備える。
細胞分離用フィルター容器２は、液体導入口９と、液体導出口１０と、フィルター部材収容部３とを有する。
以下、細胞分離用フィルター容器について、単に「容器」とも記す。
かかる細胞分離用フィルター容器２内に、不織布等からなるフィルター部材１１を収容することにより、細胞分離用フィルター装置１が構成される。細胞分離用フィルター容器２内に収容されたフィルター部材１１において、液体導入口９側の面が第１面であり、液体導出口１０側の面が第２面である。
以下、細胞分離用フィルター装置について単に「フィルター装置」とも記す。

上記の細胞分離用フィルター容器２の構成について以下説明する。

（細胞分離用フィルター容器）
例えば、図１、２（ａ）、２（ｂ）に示される、容器２の好ましい態様では、円筒形状の容器２が、円筒状の収容部３と、その上部及び下部にある開口部に蓋をすることができるノズル付内蓋４、５と、収容部３とノズル付内蓋４、５とを固定するための環状外蓋６、７とで構成される。

フィルター部材収容部３は、両端に開口を有する筒状の部材である。フィルター部材収容部３は、後述するフィルター部材１１を収容する。
以下、フィルター部材収容部３について、収容部３とも記す。

収容部３の形状は、両端に開口を有する筒状である。筒状について、径方向の断面の形状は円形であっても、多角形のような円形以外の形状であってもよい。
収容部３の形状の好ましい具体例としては、例えば、容量約０．１ｍＬ以上４００ｍＬ以下程度、内径０．１ｃｍ以上１５ｃｍ以下程度、厚さ０．１ｃｍ以上５ｃｍ以下程度の円筒状や、底面に当たる両端の形状が一片の長さ０．１ｃｍ以上２０ｃｍ以下程度の正方形又は長方形で、厚さが０．１ｃｍ以上５ｃｍ以下程度の四角柱状等が挙げられる。

良好な回収率で単球を回収しやすい点からは、細胞分離用フィルター装置１の容量は４ｍＬ以上５０ｍＬ以下が好ましく、１０ｍＬ以上２５ｍＬ以下がより好ましい。
なお、細胞分離用フィルター装置１の容量は、筒状の収容部３と、筒状の収容部の両端を封鎖する二つの面とで囲まれる空間の容量である。図１、図２（ａ）、及び図２（ｂ）に示される細胞分離用フィルター装置１では、細胞分離フィルター装置１の容量は、液体導入口９を含むノズル付き内蓋４と、液体導出口１０を含むノズル付き内蓋５と、収容部３とで囲まれる内部空間の容量である。
また、同じく、良好な回収率で単球を回収しやすい点からは、収容部３に収容されたフィルター部材１１のろ過面の面積が、４ｃｍ^２以上１００ｃｍ^２以下であるのが好ましく、１２ｃｍ^２以上３５ｃｍ^２以下であるのがより好ましい。

ノズル付内蓋４、５には、容器２内部に液体を導入するための液体導入口９と、容器２から液体を排出するための液体導出口１０とがそれぞれ設けられている。
液体導入口９及び液体導出口１０は液体を送液するためのチューブを接続しやすくするために、ノズルで構成されている。前記ノズルの形状や大きさについては特に限定はない。
なお、便宜上、液体導入口９、液体導出口１０と称するが、フィルター装置１の使用時には、液体導入口９から液体が排出されてもよく、液体導出口１０から液体が導入されてもよい。

ノズル付内蓋４、５は栓型になっており、収容部３の内腔に押し込むことで、収容部３の内面と接して固定される。
ノズル付内蓋４、５と収容部３との接触面にはシール８が設けられるのが好ましい。このシール８により、ノズル付内蓋４、５と収容部３との気密性を確実にして外部からの微生物等の侵入を防ぐことができる。シール８としては、例えば、図２（ｂ）に示すように、ノズル付内蓋４、５の表面に設けた溝の周囲に樹脂製のパッキン（Ｏリング）を設けることが挙げられるが、シール８の配置や構成については特に限定はない。

ノズル付き内蓋４、５は、収容部３に直接固定できるようにしてもよい（図示せず）。ノズル付き内蓋と収容部とが接触する面に、例えば、ネジを設けることでノズル付き内蓋と収容部とを固定することができる。この場合、図２（ｂ）に示す環状外蓋６、７は不要となる。
また、ノズル付き内蓋４は、フィルター装置１に取り付けた場合にフィルター部材１１と対向する面に、１つ又は複数の第１突起１２ａを備えていてもよい。第１突起１２ａは、ノズル付き内蓋４において、収容部３の内壁面近傍に設けられた第１環状支持体１２ｂにより支持されるのが好ましい。
ノズル付き内蓋５も、ノズル付き内蓋４と同様に、第２突起１３ａと、第２環状支持体１３ｂとを備えていてもよい。
ノズル付き内蓋４，５が、それぞれ、第１突起１２ａ、第１環状支持体１２ｂ、及び第２突起１３ａ、及び第２環状支持体１３ｂを備える場合、収容部３内で、フィルター部材１１が、第１突起１２ａ、第１環状支持体１２ｂと第２突起１３ａ、第２環状支持体１３ｂとで挟み込まれてしっかりと支持される。これによって、収容部３内で、フィルター部材１１が弛んだ箇所を、粗細胞含有液、回収液、細胞含有液等がショートパスすることを防ぎつつ、細胞含有液を取得する操作を行うことができる。

容器２内では、フィルター部材１１として前記細胞分離材が積層されて充填される。例えば、繊維径の異なる細胞分離材を２層以上積層したフィルターとすることにより、細胞を捕捉する箇所が分散され、目詰まりの発生が抑制されるとともに、フィルターからの細胞の分離・回収も効率的に行うことができる。なお、繊維径が同じ細胞分離材が連続して積層された部分は、積層された細胞分離材の枚数によらず１層として扱う。

また、容器２には、液体導入口９側に独立して細胞分離材内に留まっている非付着細胞を洗浄するための洗浄液導入口を設けたり（図示せず）、液体導出口１０側に独立して細胞分離材に捕捉された細胞を回収するための細胞回収液導入口（細胞含有液及び洗浄液の流れとは逆方向から細胞回収液を流すため）を備えていたりしてもよい（図示せず）。

容器２は、任意の構造材料を使用して作製することができる。構造材料としては、具体的には非反応性ポリマー、生体親和性金属、合金、ガラス等が挙げられる。非反応性ポリマーとしては、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー（ＡＢＳ）等のアクリルニトリルポリマー；ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、テトラフルオロエチレンとヘキサフルオロプロピレンのコポリマー、ポリ塩化ビニル等のハロゲン化ポリマー；ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、ポリカーボネートアクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリスチレン、ポリメチルペンテン等が挙げられる。容器の材料として有用な金属材料（生体親和性金属、合金）としては、ステンレス鋼、チタン、白金、タンタル、金、及びそれらの合金、並びに金メッキ合金鉄、白金メッキ合金鉄、コバルトクロミウム合金、窒化チタン被覆ステンレス鋼等が挙げられる。特に好ましくは、耐滅菌製を有する素材であるが、具体的には、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルペンテン等が挙げられる。

（フィルター部材）
フィルター部材１１の形態は、特に限定されず、連通孔構造の多孔質体、繊維の集合体、織物等が挙げられる。好ましくは繊維で構成される織布又は不織布であり、より好ましくは不織布である。

フィルター部材１１の材質としては、例えば、ポリオレフィン（例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、高密度ポリエチレン、及び低密度ポリエチレン等）、ポリエステル、塩化ビニル、ポリビニルアルコール、塩化ビニリデン、レーヨン、ビニロン、ポリスチレン、アクリル系樹脂（例えば、ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクロニトリル、ポリアクリル酸、ポリアクリレート等）、ナイロン（例えば、脂肪族ポリアミド、芳香族ポリアミド（アラミド））、ポリウレタン、ポリイミド、キュプラ、ケブラー、カーボン、フェノール樹脂、テトロン、パルプ、麻、セルロース、ケナフ、キチン、キトサン、ガラス、綿等を挙げることができる。中でも、ポリエステル、ポリプロピレン、アクリル、レーヨン、ナイロン、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート等の高分子を好適に用いることができる。フィルター部材１１は、これらの材質のうち、単一の材質からなってもよいし、複数の材質を組み合わせた複合材からなってもよい。

フィルター部材１１の平均繊維径としては、目的の細胞の種類に合わせて適宜選択すればよく特に限定はない。

フィルター部材１１の性能をより向上させるために、フィルター部材１１に親水化処理を行ってもよい。
親水化処理により、目的とする必要細胞以外の細胞における非特異的な捕捉の抑制、細胞含有液を偏り無くフィルター部材１１中に通過させる性能の向上、必要細胞の回収効率向上等の効果が付与され得る。

親水化処理方法としては、
水溶性多価アルコール、又は水酸基やカチオン基、アニオン基を有するポリマー、あるいはその共重合体（例えば、ヒドロキシエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート、あるいはその共重合体等）を吸着させる方法；
水溶性高分子（ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等）を吸着させる方法；
疎水性膜に親水性高分子を固定する方法（例えば、表面に親水性モノマーを化学的に結合させる方法等）；
電子線照射する方法；
含水状態で細胞分離フィルターに放射線を照射することで親水性高分子を架橋不溶化する方法；
乾燥状態で熱処理することにより親水性高分子を不溶化し固定する方法；
疎水性膜の表面をスルホン化する方法；
親水性高分子と疎水性ポリマードープとの混合物から膜をつくる方法；
アルカリ（ＮａＯＨ、ＫＯＨ等）の水溶液による処理により膜表面に親水基を付与する方法；
疎水性多孔質膜をアルコールに浸漬した後、水溶性ポリマー水溶液で処理乾燥後、熱処理や放射線等で不溶化処理する方法；又は、
界面活性作用を有する物質を吸着させる方法等が挙げられる。

親水性高分子としては、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、多糖類（セルロース、キチン、キトサン等）、水溶性多価アルコール等が挙げられる。

疎水性ポリマーとしては、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリオレフィン（ポリエチレン、ポリプロピレン等）、アクリル、ウレタン、ビニロン、ナイロン、ポリエステル等が挙げられる。

さらに回収目的とする細胞のフィルター部材への付着性を向上させるために、細胞付着性のタンパク質や、目的とする幹細胞上に発現されている特異的抗原に対する抗体を、フィルター部材上に固定化してもよい。細胞付着性のタンパク質としては、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、コラーゲン等が挙げられる。抗体としては、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ２７１等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、固定化方法としては、例えば、一般的なタンパク質の固定化方法である、臭化シアン活性化法、酸アジド誘導体法、縮合試薬法、ジアゾ法、アルキル化法、架橋法等の方法を任意に用いることができる。

フィルター部材１１の厚さは特に限定されない。フィルター部材１１の厚さは、前述の第１突起１２ａと第１環状支持体１２ｂと、第２突起１３ａと第２環状支持体１３ｂとの間隔を考慮して適宜決定される。典型的には、フィルター部材１１の厚さは、３ｍｍ以上２０ｍｍ以下が好ましく、５ｍｍ以上１０ｍｍ以下がより好ましい。
フィルター部材の開口径としては、通気度（ｃｃ／ｃｍ^２・ｓｅｃ）と厚み（ｍｍ）の積（通気度係数Ｍ）から定義することができる。範囲としては７以上１４以下が好ましく、８以上１２以下がより好ましく、９以上１０．５以下が最も好ましい。
また、細胞に対するふるい効果の観点から、目付け（ｇ／ｍ^２）は２０以上８０以下が好ましく、２５以上７０以下がより好ましく、３０以上５０以下が特に好ましい。
フィルター部材１１が繊維で構成される織布又は不織布である場合、単球回収率を高めやすい点からフィルター部材を構成する繊維の繊維径（μｍ）は２以上６以下の範囲内が好ましく、２以上５．５以下がより好ましく、２以上５以下がさらにより好ましく、２以上４．５以下が最も好ましい。繊維径（μｍ）の下限は、例えば、２．５以上、３以上、又は３．５以上であってもよい。
繊維径が上記の範囲内でもやや細めであるほうが、単球の回収率を高めやすい。繊維が細いことに起因して、繊維が細胞の形状に応じて変形しやすいと思われる。これにより、単球のフィルター部材１１への捕捉と、単球のフィルター部材１１からの遊離が容易である。
細胞含有液の回収時のフィルター部材１１の目詰まりを抑制しつつ、良好な単球回収率を達成しやすい点から、フィルター部材１１の充填密度（ｇ／ｃｍ^３）は、０．０５以上０．１７以下が好ましく、０．０５５以上０．１５以下がより好ましく、０．０６以上０．１４以下がさらにより好ましく、０．０７以上０．１２５以下が特に好ましい。なお、充填密度は、フィルター部材１１が圧縮されていない状態での密度である。
なお、上記の、通気度係数Ｍ、目付け、繊維径、及び充填密度のそれぞれについて、フィルター部材１１が２種以上の異なるフィルター部材を積層して構成されている場合、２種以上の異なるフィルター部材の少なくとも１つにおいて、上記の範囲内であるのが好ましく、２種以上の異なるフィルター部材の全てにおいて、上記の範囲内であるのがより好ましい。

〔粗細胞含有液〕
粗細胞含有液としては、少なくとも単球と、単球よりも平均サイズが同等、もしくは小さな細胞とを含む細胞を含む懸濁液であれば特に限定されず用いることができる。かかる細胞の好適な具体例としては、顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球）、リンパ球、赤血球、血小板等が挙げられる。例えば、臍帯等の生体組織を酵素処理や破砕処理や抽出処理や分解処理や超音波処理等をした後の懸濁液、血液や骨髄液、臍帯血、末梢血等の体液、血液や骨髄液を密度勾配遠心処理やろ過処理や酵素処理や分解処理や超音波処理等の前処理をして調製された細胞懸濁液等が粗細胞含有液として例示される。これらの中でも、粗細胞含有液としては、血液及び／又は骨髄液が好ましい。
また、粗細胞含有液は、上記した白血球等の細胞を生体外で培養液や刺激因子等を用いて培養や増殖等をした後の懸濁液であってもよい。
ここで、「粗細胞含有液」とは、細胞分離用フィルター装置１による細胞を取得する処理に供される細胞含有液を意味する。

〔フィルター部材での単球の捕捉〕
細胞分離用フィルター装置１の液体導入口９から粗細胞含有液を導入する際には、液体導入口９と液体導出口１０との間に差圧を生じさせればよい。差圧を生じさせる方法は、特に限定されず、粗細胞含有液を加圧させたり、重力差を利用することで細胞分離用フィルター装置１内へ粗細胞含有液を導入させたりする方法や、液体導出口１０側を減圧して、細胞分離用フィルター装置１内へ粗細胞含有液を吸入する方法等が挙げられる。
このようにして、細胞分離用フィルター装置１内に粗細胞含有液を供給し、粗細胞含有液をフィルター部材１１と接触させて、単球をフィルター部材１１に捕捉させる。
差圧の程度としては、容器２や、フィルター部材１１に破損が生じたり、粗細胞含有液に含まれる細胞の過度の破砕が生じたりしない程度であれば、特に限定されない。好ましい差圧の範囲としては、２００ｋＰａ以下が好ましい。差圧は、液体導入口９及び液体導出口１０に三方活栓を介して圧力センサーを付けることによって測定することができる。
フィルター部材１１は、単球を捕捉できるものを使用すればよい。

以上説明した操作は、室温下で行ってもよいし、冷蔵温度下で行ってもよい。冷蔵温度下で行う場合、冷蔵された粗細胞含有液を処理することが挙げられる。粗細胞含有液の保管としては、冷蔵温度に設定した冷蔵庫による保管、ウォーターバスによる保管、及びドライアイスによる保管等が挙げられる。汎用性から冷蔵庫で保存することが好ましい。冷蔵温度としては、１℃以上６℃以下が好ましく、より好ましくは３℃以上５℃以下が好ましい。冷蔵温度が１℃未満では細胞は死滅し、６℃を超えて保存すると細菌が繁殖しコンタミネーションを起こす可能性がある。

また、フィルター部材１１の状態を整えて、単球を捕捉しやすくする観点から、細胞分離用フィルター装置１内に粗細胞含有液を供給する前に、液体導入口９又は液体導出口１０から生理食塩水又は緩衝液を細胞分離用フィルター装置１内に導入し、フィルター部材１１と生理食塩水又は緩衝液とを接触させてもよい。

＜細胞含有液生成＞
細胞含有液生成では、細胞分離用フィルター装置１内に回収液を供給することで、フィルター部材１１に捕捉された単球を回収液中に遊離させて細胞含有液を生じさせる。
細胞含有液生成において、回収液は、液体導出口１０から、細胞分離用フィルター装置１内に供給される。
なお、細胞分離用フィルター装置１で生成した単球を含む細胞含有液は、通常、生成後すぐに、液体導入口９から回収される。

細胞含有液生成の際には、フィルター部材１１の液体導出口１０側と、液体導入口９側との圧力差である差圧を生じさせつつ、回収液の供給が行われる。差圧は、２０ｋＰａ以上２００ｋＰａ以下であり、５０ｋＰａ以上２００ｋＰａ以下が好ましく、７０ｋＰａ以上１９０ｋＰａ以下がより好ましい。
差圧は、細胞分離用フィルター装置１内に回収液を供給する際に、回収液を加圧して細胞分離用フィルター装置１に導入することで生じさせてもよく、細胞分離用フィルター装置内のフィルター部材１１よりも液体導入口９側を減圧することで生じさせてもよく、これらの双方を行って生じさせてもよい。

回収液の供給と、細胞含有液の回収とを行う際には、フィルター部材１１の液体導出口１０側の面での圧力が、フィルター部材１１の液体導入口９側の面での圧力よりも高いのが好ましい。このようにして差圧を生じさせる場合、フィルター部材１１に捕捉された単球を、フィルター部材１１の液体導入口９側の面に向けて遊離させやすく、より高い単球の回収率を実現しやすい。

このような差圧を生じさせた状態で、回収液を液体導出口１０から細胞分離用フィルター装置１内に供給することで、単球を回収液に良好に遊離させることができ、その結果として、高い単球の回収率にて、単球を含む細胞含有液の取得が可能である。
なお、回収液は、差圧を生じさせる操作の後に細胞分離用フィルター装置１内へ供給されてもよく、差圧を生じさせる操作と同時に細胞分離用フィルター装置１内へ供給されてもよい。
通常、加圧された回収液が細胞分離用フィルター装置１内へ供給されることが多く、この場合、差圧を生じさせる操作と、回収液の供給とは実質的に同時である。

また、回収液の供給と、細胞含有液の回収とを行う際に、回収液を、細胞分離用フィルター装置１内に供給する際の流速は、５ｍＬ／秒以上３０ｍＬ／秒以下が好ましく、８ｍＬ／秒以上２５ｍＬ／秒以下がより好ましく、１０ｍＬ／秒以上２５ｍＬ／秒以下が特に好ましい。このような流速で回収液を供給することにより、単球の破壊を防ぎつつ、フィルター部材１１から回収液に単球を遊離させやすく、より高い単球の回収率を実現しやすい。

回収液は、細胞と等張である溶液であれば特に限定はないが、生理食塩液やリンゲル液等の注射溶剤として使用実績のあるものや、緩衝液、細胞培養用の培地等が挙げられる。特に、培養工程を経る際はそのまま培養が行える培地が好ましく、培養工程を経ずそのまま治療に用いる際は、生理食塩液等の点滴等に使用実績のある等張液等、安全性が保証されている回収液を使用することが好ましい。

細胞含有液生成の操作は、単球捕捉の操作と同様、室温下で行ってもよいし、冷蔵温度下で行ってもよい。

回収液を用いて単球を含む細胞含有液を生じさせる前に、生理食塩水又は緩衝液を液体導入口９から導入して液体導出口１０から導出させることにより、フィルター部材１１内の夾雑成分を除去でき、これにより回収される細胞（単球）内へ不要成分を低減することができる。

＜細胞含有液回収＞
細胞含有液回収では、細胞含有液生成で生成させた単球を含む回収液を、細胞分離用フィルター装置１内から回収する。
回収方法は特に限定されないが、液体導入口に回収専用の所定のバッグを接続して、単球を含む細胞含有液を、当該バッグ内に回収すればよい。

以下、実施例において本発明に関して詳細に述べるが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。

（実施例１〜７、比較例１、及び比較例２）
表１に示すフィルター容量、濾過面積の細胞分離用フィルター装置１を用いた。
具体的には、円筒状の収容部３に、丸型にカットしたフィルター部材１１を充填し、収容部３の上下の開口部に、第１突起１２ａを備えるノズル付内蓋４と、第２突起１３ａを備えるノズル付き内蓋５とを差し込み、その上から環状外蓋６、７でネジ止めし、図１、２（ａ）、２（ｂ）に示すような構造を有する細胞分離用フィルター装置１を作製した。
フィルター部材１１としては、以下の不織布Ａ〜Ｃを用いた。各実施例、及び比較例で使用されたフィルター部材１１の種類を表１に示す。
不織布Ａ：ポリエステル不織布（目付け：３５ｇ／ｍ^２、繊維径：４μｍ、充填密度：０．１１６ｇ／ｃｍ^３、通気度係数Ｍ：１０．４）
不織布Ｂ：ポリプロピレン不織布（目付け：５０ｇ／ｍ^２、繊維径：３．５μｍ、充填密度：０．０８３ｇ／ｃｍ^３、通気度係数Ｍ：９．６）
不織布Ｃ：ナイロン不織布（目付け：６２ｇ／ｍ^２、繊維径：５μｍ、充填密度：０．１３５ｇ／ｃｍ^３、通気度係数Ｍ：９．２）

次に、細胞分離用フィルター装置１の液体導入口９と液体導出口１０に、図３で示した回路を接続して細胞分離用デバイス２２を作製した。

図３に示す回路において、液体導入口９にはチューブ１４ａを接続し、このチューブ１４ａには、細胞懸濁液を収容する手段１５及びプライミング用生理食塩水を収容する手段１６に接続したチューブ１４ｂと、フィルターを通過した回収液を収容する手段（回収バッグ）１７及び回収バッグ等に回収された回収液を回収する手段１８に接続したチューブ１４ｃとを、流路切り替え手段１９ｃを介して接続した。
チューブ１４ｂには流路切り替え手段１９ｂを介して、細胞懸濁液を収容する手段１５とプライミングやカラムの洗浄に用いる生理食塩水を収容する手段１６とを接続した。
チューブ１４ｃには流路切り替え手段１９ｃを介して、フィルターを通過した回収液を収容する手段１７と回収バッグ等に回収された回収液を回収する手段１８とを接続した。
また、液体導出口１０にはチューブ１４ｄを接続し、流路切り替え手段１９ｄを介して、フィルターを通過した細胞懸濁液を収容する手段（廃液バッグ）２０及び回収液を回収する手段２１と接続した。

細胞分離用デバイス２２を用いて細胞（単球）分離操作を実施した。なお、各流路切り替え手段の操作は、細胞分離用フィルター装置１に通液する液体の種類、送液する目的の手段に応じて、適宜行った。
まず、生理食塩水を収容する手段１６の生理食塩水５０ｍＬ〜１５０ｍＬを用いて細胞分離用フィルター装置１のプライミング操作を行い、廃液バッグ２０に細胞分離用フィルター装置１を通過した生理食塩液を回収した。
次に、細胞懸濁液を収容する手段１５から白血球濃厚液（ＣＰＤで抗凝固したブタ血液）１００ｍＬを、細胞分離用フィルター装置１に重力を利用して通液し、通過液は廃液バッグ２０に回収した。
上記操作で使用した白血球濃厚液は、ＣＰＤで抗凝固したブタ血液を３０００ｒｐｍ、３０分遠心分離して得たバッフィーコートより、処理する白血球数が１．０×１０^９ｃｅｌｌｓ〜４．０×１０^９ｃｅｌｌｓになるように調製した。
その後、流路切り替え手段１９ｂを用いて、生理食塩水を収容する手段１６の生理食塩水１００ｍＬを細胞分離用フィルター装置１に重力を利用して通液し、通過液は廃液バッグ２０に回収した。
最後に、生理食塩水５０ｍＬを、表１に記載の差圧に加圧し、また表１に記載の流量で、細胞分離用フィルター装置１の液体導出口１０より導入し、液体導入口９に接続した回収バッグ１７に回収した。
差圧に関しては、導入口及び導出口に三方活栓を介して圧力センサー（ＦＰ１０１−Ｃ３１−Ｌ２０Ａ＊Ｂ、横河電機）を接続し、測定した。
回収液（細胞含有液）、及び、処理前の細胞懸濁液（粗細胞含有液）の白血球濃度を、血球カウンター（Ｋ−４５００、シスメックス社）により測定した。また、単球濃度に関しては、細胞表面マーカーであるＣＤ１４に対して蛍光標識し、上記血球カウンター及びフローサイトメーター（ＦＡＣＳ ｃａｎｔｏ、ＢＤ社）により測定した。その後、処理前の細胞懸濁液と回収液の体積より白血球数及び単球数を算出して、白血球回収率、単球回収率をそれぞれ求めた。
それぞれの結果は表１に示した。

実施例１〜７によれば、単球を捕捉したフィルター部材１１を収容する細胞分離用フィルター装置１に、フィルター部材１１両面での圧力差である差圧が２０ｋＰａ以上２００ｋＰａ以下の範囲内であるように、回収液を供給して、単球を含む細胞含有液を取得する場合、高い単球の回収率を実現できることが分かる。
他方、２００ｋＰａを超える差圧で回収液を供給して、単球を含む細胞含有液を取得した比較例１及び比較例２では、単球回収率が著しく低かった。

表１によれば、実施例２と、実施例５と、実施例７との条件は、フィルター部材として用いた不織布の種類を除いて、互いに類似していることが分かる。実施例２及び実施例５と、実施例７との比較によれば、フィルター部材の充填密度（ｇ／ｃｍ^３）が、例えば０．０７以上０．１２５以下である場合に、フィルター部材の充填密度（ｇ／ｃｍ^３）が０．１２５超である場合よりも、単球回収率を高めやすいことが分かる。
また、実施例２及び実施例５と、実施例７との比較によれば、フィルター部材の目付（ｇ／ｍ^２）が、例えば３０以上５０以下である場合に、フィルター部材の目付（ｇ／ｍ^２）が５０超である場合よりも、単球回収率を高めやすいことが分かる。
さらに、実施例２及び実施例５と、実施例７との比較によれば、フィルター部材を構成する繊維の繊維径（μｍ）が、例えば２以上４．５以下である場合に、フィルター部材を構成する繊維の繊維径（μｍ）が４．５超である場合よりも、単球回収率を高めやすいことが分かる。

実施例２、及び比較例１で得られた細胞含有液に関して、横軸をＦＳＣ（前方散乱光）、縦軸をＳＳＣ（側方散乱光）とするＦＳＣ−ＳＳＣ平面状に、上記フローサイトメーターにより測定されたＦＳＣの値とＳＳＣの値とに基づいてプロットを行った。これにより、実施例２、及び比較例１で得られた細胞含有液中の細胞分布を確認した。
その結果、実施例２で得た細胞含有液中の細胞分布と、比較例１で得た細胞含有液中の細胞分布とでは、単球画分のみに大きな違いがあった。具体的には、比較例１で得た細胞含有液では、実施例２で得た細胞含有液よりも、単球画分がＦＳＣが小さい方向（細胞が小さい方向）に変動していた。この分布の違いは回収時の単球の破壊に起因する。
以上より、実施例によれば、高品質で単球純度の高い細胞含有液を得ることができることが分かる。

１ 細胞分離用フィルター装置
２ 細胞分離用フィルター容器
３ フィルター部材収容部
４、５ ノズル付き内蓋
６、７ 環状外蓋
８ シール
９ 液体導入口
１０ 液体導出口
１１ フィルター部材
１２ａ 第１突起
１２ｂ 第１環状支持体
１３ａ 第２突起
１３ｂ 第２環状支持体

Claims (11)

1. 単球を含む細胞含有液の取得方法であって、
   前記単球を含む粗細胞含有液をフィルター部材の第１面から第２面に通液して、前記単球を前記フィルター部材に捕捉させることと、
   前記フィルター部材の前記第２面から前記第１面に回収液を通液して、前記フィルター部材に捕捉された前記単球を前記回収液中に遊離させて前記細胞含有液を生じさせることと、
   前記細胞含有液を回収することと、
   を含み、
   前記フィルター部材の前記第１面と前記第２面とでの差圧が２０ｋＰａ以上２００ｋＰａ以下である条件で、前記回収液の前記フィルター部材への供給と、前記細胞含有液の回収とが行われる方法。
2. 前記粗細胞含有液を、前記フィルター部材をその内部に収容する細胞分離用フィルター装置を通過させることで、前記フィルター部材に前記単球を捕捉させ、
   前記細胞分離用フィルター装置が、液体導入口と、液体導出口とを備え、
   前記細胞分離用フィルター装置内において、前記液体導入口と、前記液体導出口との間に前記フィルター部材が収容され、
   前記粗細胞含有液が、前記液体導入口から前記液体導出口に向けて、前記細胞分離用フィルター装置内を通過し、
   前記回収液が、前記液体導出口から前記細胞分離用フィルター装置内に供給され、
   前記細胞含有液が、前記液体導入口から回収される、請求項１に記載の単球を含む細胞含有液の取得方法。
3. 前記回収液の供給と、前記細胞含有液の回収とを行う際に、前記フィルター部材の前記液体導出口側の面での圧力が、前記フィルター部材の前記液体導入口側の面での圧力よりも高い、請求項１又は２に記載の単球を含む細胞含有液の取得方法。
4. 前記回収液を、前記細胞分離フィルター装置内に供給する際の流速が、５ｍＬ／秒以上３０ｍＬ／秒以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単球を含む細胞含有液の取得方法。
5. 前記細胞分離フィルター装置の容量が、４ｍＬ以上５０ｍＬ以下である請求項１〜４のいずれか１項に記載の単球を含む細胞含有液の取得方法。
6. 前記フィルター部材のろ過面の面積が、４ｃｍ^２以上１００ｃｍ^２以下である請求項１〜５のいずれか１項に記載の単球を含む細胞含有液の取得方法。
7. 前記単球を含む粗細胞含有液が、血液及び／又は骨髄液である請求項１〜６のいずれか１項に記載の単球を含む細胞含有液の取得方法。
8. 前記フィルター部材の通気度（ｃｃ／ｃｍ^２・ｓｅｃ）と、厚み（ｍｍ）との積である通気度係数Ｍの値が、７以上１４以下である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単球を含む細胞含有液の取得方法。
9. 前記フィルター部材が繊維で構成される織布又は不織布であり、前記フィルター部材を構成する前記繊維の繊維径が、２μｍ以上６μｍ以下である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の単球を含む細胞含有液の取得方法。
10. 前記フィルター部材の圧縮されていない状態での充填密度が、０．０５ｇ／ｃｍ^３以上０．１７ｇ／ｃｍ^３以下である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単球を含む細胞含有液の取得方法。
11. 前記フィルター部材の目付けが、２０ｇ／ｍ^２以上８０ｇ／ｍ^２以下である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単球を含む細胞含有液の取得方法。

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