KR20130140204A - 거대고리형 뎁시펩티드 및 신규 중간체의 제조 방법 - Google Patents
거대고리형 뎁시펩티드 및 신규 중간체의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 하기 화학식 I의 뎁시펩티드의 화학적 제조 방법 또는 공정, 신규 중간체 및 그의 제조, 뿐만 아니라 관련 발명 실시양태에 관한 것이다.
<화학식 I>
상기 식에서, 기호는 명세서에서 정의된 의미를 갖는다.
<화학식 I>
상기 식에서, 기호는 명세서에서 정의된 의미를 갖는다.
Description
발명의 개요
본 발명은, 거대고리형 뎁시펩티드의 제조 방법 또는 공정, 신규 중간체 및 그의 제조, 뿐만 아니라 관련 발명 실시양태에 관한 것이다.
시클릭 뎁시펩티드는 약리학에서 수많은 용도를 갖는다. 일례로, WO 2009/024527에 개시된 뎁시펩티드는 각종 질환의 치료에 유용하다. 예를 들어, WO 2009/024527에 언급된 화학식 II의 화합물은 염증성 및/또는 과다증식성 및 소양성 피부 질환, 예컨대 아토피성 피부염, 건선, 농포성 건선, 장미증, 켈로이드, 비후성 반흔, 여드름, 네테르톤 증후군(Netherton's syndrome) 또는 다른 소양성 피부병, 예컨대 결절성 양진, 노인의 비정형 가려움증 뿐만 아니라 상피 장벽 기능장애를 갖는 다른 질환, 예컨대 노화 피부의 치료 및 예방에 유용하다.
이전에 시아노박테리움 노스톡(Nostoc)으로부터 단리된 노스토펩틴 BN920이 또한 마이크로시스티스로부터 단리되었다. 노스토펩틴 BN920은 31 nM의 IC50 값으로 키모트립신을 억제하였다 (문헌 [J. Nat. Prod. 68(9), 1324-7 (2005)] 참조).
이들 화합물은, 각각 소위 ahp-서브구조 (ahp: 3-아미노-6-히드록시-피페리딘-2-온) 및 상응하는 데히드로-ahp 서브구조 (데히드로-ahp: 3-아미노-3,4-디히드로-1H-피리딘-2-온) (또한 본원에서 "탈수물(dehydrate)이"라 함)를 포함하는 다른 뎁시펩티드와 함께 발효 (콘드로미세스 크로악투스(chondromyces croactus), 점액세균 사용)시킴으로써 제조될 수 있다. 따라서, 이들 화합물 중 임의의 단일의 것과 관련된 발효의 수율은 다소 낮다.
본 발명은, 증가된 수율 및/또는 우수한 순도로 이러한 시클릭 뎁시펩티드를 얻을 수 있게 하는 공정 또는 방법에 관한 것이다.
많은 가능한 이성질체와의 복합 분자의 합성에서 에피머화, 호변이성체화 등과 같은 많은 위험요소를 고려할 때, 바람직하게는, 우수한 수율 및/또는 요구되는 입체이성질체 순도로, 특히 이들 둘 다로 화학식 I의 시클릭 뎁시펩티드를 제조할 수 있는, 고체 상 펩티드 합성 및 용액 중에서의 반응의 혼합물을 포함하는 제조 방법을 찾는 것이 가능하였다. 상기와 같은 부산물, 특히 데히드로-ahp 서브구조 및/또는 ahp 대신에 5원 고리를 갖는 목적한 ahp-포함 생성물의 유사체를 목적한 최종 생성물로 전환시킴으로써 부산물의 양을 감소시키고, 심지어 수율을 향상시킬 수 있다. 이는 수율을 더욱 증가시킨다. 지금까지 이러한 분야에서 고체 상 펩티드 합성을 이용하는 합성은 본 발명자들의 관심 대상이 아니었다.
(i/a) 제1 실시양태에서, 본 발명은,
하기 화학식 II, 특히 하기 화학식 IIA의 화합물을 선택적으로 탈보호하여 하기 화학식 III, 특히 하기 화학식 IIIA의 화합물을 얻고,
유리 히드록실 기를 산화 조건 하에 반응시켜 하기 화학식 IV, 특히 하기 화학식 IVA의 화합물을 형성하고,
잔류 보호기를 제거하여 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 염을 얻고,
원하는 경우, 화학식 I, 또는 특히 IA의 유리 화합물을 염으로, 화학식 I의 화합물의 염을 화학식 I, 또는 특히 IA의 화합물의 상이한 염으로, 또는 화학식 I, 또는 특히 IA의 유리 화합물로 전환시키고/거나 화학식 I, 또는 특히 IA의 화합물의 탈수물 유사체 및/또는 5 고리 유사체를 상응하는 화학식 I, 또는 특히 IA의 화합물로 전환시키는 것
을 포함하는, 화학식 I, 특히 화학식 IA의 시클릭 뎁시펩티드 화합물 또는 그의 염의 제조 방법 또는 공정에 관한 것이다.
<화학식 I>
<화학식 IA>
상기 식에서,
A1은 말단 카르복시 또는 카르바모일 기를 갖는 아미노산, 특히 아스파라긴 또는 글루타민의 2가 모이어티이고, 화학식 I에서 우측 (C-말단에 상응함)에서 카르보닐 (바람직하게는 그의 α-카르복실 기의 카르보닐)을 통해 분자의 나머지 부분에 결합되거나, 또는 C1 -8-알카노일 또는 인산화된 히드록시-C1 -8-알카노일이고;
X는 A1의 N을 통해 결합되고 아실이거나, 또는 A1이 C1 -8-알카노일 또는 인산화된 히드록시-C1 -8-알카노일인 경우에는 부재하고;
R2는 C1 -8-알킬, 특히 메틸이고;
R3은 아미노산, 특히 류신, 이소류신 또는 발린의 측쇄이고;
R5는 아미노산, 바람직하게는 페닐알라닌, 류신, 이소류신 또는 발린의 측쇄이고;
R6은 히드록시 아미노산, 특히 티로신의 측쇄이고;
R7은 아미노산, 바람직하게는 아미노산 류신, 이소류신 또는 발린의 측쇄이고;
Y는 수소 또는 C1 -8-알킬이다.
<화학식 II>
<화학식 IIA>
상기 식에서, Prot는 보호기이고, Y는 화학식 I의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, X*, A1 *, R2 *, R3 *, R5 *, R6 * 및 R7 *는 각각 화학식 I에서의 X, A1, R2, R3, R5, R6 및 R7에 상응하되, 단 이들 모이어티 상의 반응성 관능기 (예컨대 아미노, 이미노, 히드록시, 카르복시, 술프히드릴, 아미디노, 구아니디노, O-포스포노 (-O-P(=O)(OH)2)는 이들이 원치않는 부반응에 참여할 수 있는 경우 적어도 보호된 형태로 존재한다.
<화학식 III>
<화학식 IIIA>
<화학식 IV>
<화학식 IVA>
상기 식에서, X*, A1 *, R2 *, R3 *, R5 *, R6 * 및 R7 *는 상기에 정의된 의미를 갖는다.
화학식 III 또는 특히 화학식 IIIA의 화합물의 산화에 적합한 산화 조건은, 통상적으로 DMSO 중의 IBX (문헌 [J. Org. Chem. 1995, 60, 7272-7276]); 피리디늄 디크로메이트 또는 피리디늄 클로로크로메이트 (문헌 [Tetrahedron Lett. 1979, 5, 399-402]); 옥살릴 클로라이드, 디메틸 술폭시드 및 3급 아민 (문헌 [J. Peptide Sci. 2006, 12, 140-146]), 옥소암모늄 염 (문헌 [J. Org. Chem. 1985, 50, 1332-1334]); 옥소암모늄 염에 의해 촉매화된 알칼리 하이포클로라이트 (문헌 [J Org. Chem. 1989, 54, 2970-2972]); 옥소아미늄 염 (문헌 [Tetrahedron Lett. 1988, 29, 5671-5672]), RuCl2(PPh3)3 (문헌 [Tetrahedron Lett. 1981, 22, 1605-1608]); 나트륨 하이포클로라이트의 존재 하에서의 TEMPO (1 mol%) (문헌 [Tetrahedron Lett. 1990, 31, 2177-2180]); NaIO4, TEMPO, NaBr (문헌 [Tetrahedron 2006, 62, 8928-8932]); SiO2 지지된 산화바나듐(IV) 및 t-BuOOH (문헌 [Advanced Synthesis & Catalysis 2007, 349, 846-848])를 사용하는 것이다. 바람직하게는, 반응을 DMSO, 또는 바람직하게는 불활성 용매, 예컨대 테트라히드로푸란 중의 IBX를 사용하여, DMSO의 존재 하에, 0 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 25℃의 온도에서 수행한다.
(ii/a) 본 발명의 추가의 실시양태는, 상응하는 출발 아미노산 및 측쇄 전구체로부터 고체 상 펩티드 합성 (특히, 하기에 제공되는 화학식 VIII 또는 특히 VIIIA의 올리고펩티드 전구체에 대한 하기에 제공되는 전구체 XX 또는 특히 XXA의, 또는 하기에 제공되는 화학식 XXV 또는 특히 XXVA의 올리고펩티드 전구체에 대한 하기에 제공되는 화학식 XXIV 또는 특히 XXIVA의 올리고펩티드 전구체의 합성에 대해) 및 용액 상 합성 (특히 상기에 언급된 화합물로부터 최종 생성물로)의 조합에 의해 화학식 IV 또는 특히 IVA의 화합물을 제조하는 것을 추가로 포함하는, 상기에 기재된 방법 또는 공정에 관한 것이다.
(iii/a) 본 발명의 또한 추가의 실시양태는, 상기 화학식 II의 화합물의 합성을 위해, 하기 화학식 VI, 특히 하기 화학식 VIA의 화합물을 하기 화학식 VII의 산 또는 그의 반응성 유도체와 반응시키고;
<화학식 VI>
<화학식 VIA>
(상기 식에서, Prot는 보호기이고, Y는 화학식 I의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, R2 *, R3 *, R5 *, R6 * 및 R7 *는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
<화학식 VII>
(상기 식에서, X**는 아미노 보호기 또는 X*이고, X* 및 A1 *는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
또한 X**가 아미노 보호기인 경우에는, 상기 아미노 보호기 X**를 제거하여 화학식 II (특히 IIA)의 유도체를 얻고 (여기서는, X* 대신에, H (수소)가 존재함), 생성된 아미노 기를 상응하는 산 X*-OH 또는 그의 반응성 유도체를 사용하여 아실 기 X*와 커플링시키는 것 (여기서, X*는 상기에 정의된 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)을 추가로 포함하는, 상기에 기재된 바와 같은 방법 또는 공정에 관한 것이다.
(iv/a) 본 발명의 또 다른 실시양태는, N-말단 아미노 기 및 C-말단 카르복시 기를 갖는, 선형, 즉 아직 시클릭이 아닌 화학식 VI의 화합물의 전구체 펩티드의 락탐화 하에서의 고리화를, 상기 아미노 기 및 상기 카르복시 기로부터의 아미드 결합 형성을 가능하게 하는 반응 조건 하에, 바람직하게는 용액 상 화학을 이용하여 수행하는 것을 추가로 포함하는, 상기에, 특히 이전 단락에 기재된 방법 또는 공정에 관한 것이다.
용액 중에서의 락탐화는, 올리고머화 및 중합을 피하기 위해 통상적으로 매우 낮은 기재 농도에서 수행된다. 이는 반응을 수행하기 위해 막대한 양의 용매 및 매우 큰 반응기를 필요로 한다. 예를 들어, 올리고펩티드의 매크로락탐화는 2 mMol/리터의 농도에서 수행된다 (문헌 [Yokokawa et al., Tetrahedron 2005, 61, 1459-1480] 참조). 이러한 난점은, 3급 염기 및 커플링 시약을 용해시킴으로써, 또한 조절된 방식으로 이 용액에 올리고펩티드의 용액을 첨가함으로써 회피될 수 있다. 조절된, 특히 느린 올리고펩티드-용액의 첨가는 영구적으로 용액 중의 낮은 농도의 활성화된 올리고펩티드를 생성하고, 따라서 올리고머화 및 중합을 막는다. 올리고펩티드 용액의 첨가 속도는 거대고리화에 대한 반응 속도에 따라 조정될 수 있다: 거대고리화가 빠른 반응인 경우, 올리고펩티드의 용액을 빠르게 첨가할 수 있다. 거대고리화가 느린 경우, 용액의 첨가는 활성화된 올리고펩티드의 영구적인 저농도를 보장하도록 느려야 한다. 따라서, 올리고펩티드의 조절된 첨가는 훨씬 적은 용매량으로, 또한 여전히 활성화된 올리고펩티드의 농도를 10-3 mM 미만으로, 예를 들어 10-4 내지 10-6 mM의 범위로 또는 훨씬 더 낮게 유지하면서 작업하는 것을 가능하게 한다. 이러한 커플링 시약 용액에 대한 올리고펩티드의 조절된 첨가의 변법은 본 발명의 일 실시양태이다.
(v/a) 추가의 실시양태에서, 본 발명은, 선형 (이 용어가 사용되는 경우 이는 아직 시클릭이 아님을 의미함) 전구체 펩티드가 하기 화학식 VIII, 특히 하기 VIIIA를 가지며, 화학식 VIII, 특히 VIIIA의 화합물의 고리화 후에, 보호기 Prot*를 계내 제거하여 화학식 VI, 특히 VIA의 화합물을 얻는 것을 추가로 포함하는, 상기, 특히 이전 단락에 기재된 바와 같은 방법 또는 공정에 관한 것이다.
<화학식 VIII>
<화학식 VIIIA>
상기 식에서, Prot*는 존재하는 다른 보호기에 영향을 주지 않으면서 선택적으로 절단될 수 있고 선형 전구체 펩티드의 합성 동안의 탈보호 단계 동안 안정적인 보호기 (예를 들어 알릴옥시카르보닐)이고, R2 *, R3 *, R5 *, R6 * 및 R7 *는 상기에 기재된 바와 같은 화학식 VI의 화합물에 대해 정의된 바와 같다.
(vi/a) 또 다른 실시양태에서, 본 발명은, 화학식 VIII, 특히 VIIIA의 선형 전구체 펩티드를 상응하는 아미노산으로부터 고체 상 펩티드 합성 및 그 후 사용된 고체 지지체로부터의 절단에 의해 합성하는 것인, 상기, 특히 이전 단락에 기재된 바와 같은 방법 또는 공정에 관한 것이다.
(vii/a) 본 발명의 실시양태는 추가로,
변법 a)에서, 하기 화학식 IX, 특히 하기 화학식 IXA의 아미노산 또는 상기 아미노산의 반응성 유도체를, (예를 들어 화학식 (X-L)z-RES (여기서, L 및 RES는 상기에 정의된 바와 같고, X는 예를 들어 할로, 예를 들어 클로로이고, z는 0 초과의 수, 예를 들어 자연수임)의 수지와의 반응에 의해) 고체 수지 RES에 결합되어 있는 절단가능한 링커 L에 산소를 통해 커플링시키고, 보호기 Prot**를 제거하고;
<화학식 IX>
<화학식 IXA>
(상기 식에서, R3 *는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, Prot**는 다른 결합의 절단 없이 수지 상에서 제거될 수 있는 아미노 보호기임)
수득가능한 하기 화학식 X, 특히 하기 XA로 표시되는 수지 결합 아미노산을 하기 화학식 XI, 특히 하기 XIA의 아미노산 또는 상기 아미노산의 반응성 유도체와 커플링시키고, 수득가능한 하기 화학식 XII, 특히 하기 XIIA로 표시되는 수지 결합 디펩티드를 유리 히드록시 기를 통해 하기 화학식 XIII, 특히 하기 XIIIA의 아미노산 또는 상기 아미노산의 반응성 유도체와 커플링시키고, 보호기 Prot**를 제거하는 것;
<화학식 X>
<화학식 XA>
(상기 식에서, RES 및 R3 *는 화학식 IX의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, n은 0 초과의 수 (예를 들어 자연수)이고, L은 절단가능한 링커임)
<화학식 XI>
<화학식 XIA>
(상기 식에서, Prot*는 상기 화학식 VIII의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, R2 *는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
<화학식 XII>
<화학식 XIIA>
(상기 식에서, Prot*는 상기 화학식 VIII의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, R2 * 및 R3 *는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, n, L 및 RES는 화학식 X의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
<화학식 XIII>
<화학식 XIIIA>
(상기 식에서, Prot**는 화학식 IX의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, R7 *는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
또는, 변법 b)에서, 하기 화학식 XXVII, 특히 하기 화학식 XXVIIA의 디펩티드 또는 상기 디펩티드의 반응성 유도체를, 변법 a) 하에 기재된 바와 같이 수득가능하고, 하기 화학식 X, 특히 하기 XA를 가지며, 고체 수지 RES에 결합되어 있는 절단가능한 링커 L에 산소를 통해 결합된 아미노 아실 모이어티에 커플링시키고, 보호기 Prot**를 제거하는 것;
<화학식 XXVII>
<화학식 XXVIIA>
(상기 식에서, R3 * 및 Prot**는 화학식 IX, 특히 IXA의 화합물에 대해 기재된 바와 같고, Prot*는 상기 화학식 VIII의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
<화학식 X>
<화학식 XA>
(상기 식에서, RES 및 R3 *는 화학식 IX의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, L 및 RES는 상기에 정의된 바와 같음)
또한, 변법 a) 또는 변법 b)의 반응 후에,
(viii/a) 수득가능한 하기 화학식 XIV, 특히 하기 XIVA의 화합물을 하기 화학식 XV, 특히 하기 화학식 XVA의 아미노산 또는 상기 아미노산의 반응성 유도체와 커플링시키고, 보호기 Prot**를 제거하는 것;
<화학식 XIV>
<화학식 XIVA>
(상기 식에서, R2 *, R3 * 및 R7 *는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, Prot*는 상기 화학식 VIII의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, n, L 및 RES는 화학식 X의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
<화학식 XV>
<화학식 XVA>
(상기 식에서, R6 * 및 Y는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, Prot**는 상기 화학식 IX의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
(ix/a) 바람직하게는 수득가능한 하기 화학식 XVI, 특히 하기 화학식 XVIA의 화합물을 하기 화학식 XVII, 특히 하기 화학식 XVIIA의 아미노산 또는 상기 아미노산의 반응성 유도체와 커플링시키고, 보호기 Prot**를 제거하는 것;
<화학식 XVI>
<화학식 XVIA>
(상기 식에서, Y, R2 *, R3 *, R7 * 및 R6 *는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, Prot*는 상기 화학식 VIII의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, n, L 및 RES는 화학식 X의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
<화학식 XVII>
<화학식 XVIIA>
(상기 식에서, R5 *는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, Prot**는 화학식 IX의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
또한 바람직하게는
(x/a) 마지막으로 하기 화학식 XVIII, 특히 하기 XVIIIA의 생성 화합물을 하기 화학식 XIX, 특히 하기 화학식 XIXA의 비천연 아미노산 (= 합성단위체) 또는 상기 합성단위체의 활성화된 유도체에 커플링시키고, 보호기 Prot**를 제거하여 하기 화학식 XX, 특히 하기 XXA의 화합물을 얻는 것;
<화학식 XVIII>
<화학식 XVIIIA>
(상기 식에서, Y, R2 *, R3 *, R7 *, R6 * 및 R5 *는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, Prot*는 상기 화학식 VIII의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, n, L 및 RES는 상기 화학식 X의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
<화학식 XIX>
<화학식 XIXA>
(상기 식에서, Prot는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, Prot**는 화학식 IX의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
<화학식 XX>
<화학식 XXA>
(상기 식에서, Prot, Y, R2 *, R3 *, R7 *, R6 * 및 R5 *는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, Prot*는 상기 화학식 VIII의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, n, L 및 RES는 화학식 X의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
및
(xi/a) 화학식 XX에서의 고체 상 결합 펩티드에서, 고체 상 L-RES를 절단하여 상기에 나타낸 바와 같은 상응하는 화학식 VIII, 특히 VIIIA의 화합물을 얻는 것
을 추가로 포함하는, 상기 (특히 이전 단락 (vi/a))에 기재된 바와 같은 방법 또는 공정에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는, 섹션 (i/a)에 따른 상기에 제공된 바와 같은 화학식 II의 화합물의 합성에, 바람직하게는 섹션 (ii/a)에 따른 또는 더욱 바람직하게는 섹션 (iii/a)에 따른 반응이 선행하는; 바람직하게는 여기에 섹션 (iv/a) 또는 바람직하게는 (v/a)에 따른 반응이 선행하는, 바람직하게는 여기에 섹션 (vi/a)에 따른 반응이 선행하는, 바람직하게는 여기에 섹션 (x/a)에 따른 반응이 선행하는, 바람직하게는 여기에 섹션 (ix/a)에 따른 반응이 선행하는, 바람직하게는 여기에 섹션 (viii/a)에 따른 반응이 선행하는, 바람직하게는 여기에 섹션 (vii/a)에 따른 반응이 선행하는, 합성에 관한 것이다.
(i/b) 본 발명의 또 다른 실시양태는, 상기에 제공된 화학식 II의 화합물의 합성을 위해, N-말단 아미노 기 및 C-말단 카르복시 기를 갖는 선형인 (아직 시클릭이 아닌) 화학식 II의 화합물의 전구체 펩티드의 락탐화 하에서의 고리화를, 상기 아미노 기 및 상기 카르복시 기로부터의 아미드 결합 형성을 가능하게 하는 반응 조건 하에, 바람직하게는 용액 상 화학을 이용하여 수행하는 것을 포함하는 상기 방법 또는 공정에 관한 것이다.
(ii/b) 본 발명의 추가의 실시양태는, 선형 전구체 펩티드가 하기 화학식 XXV, 특히 하기 XXVA를 갖는, 이전 단락 (i/b)에 따른 방법 또는 공정에 관한 것이다.
<화학식 XXV>
<화학식 XXVA>
상기 식에서, X*, A1 *, R2 *, R3 *, R5 *, R6 *, R7 * 및 Prot는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같다.
(iii/b) 또 다른 실시양태는, 화학식 XXV의 화합물의 합성을 위해, 하기 화학식 XXIV, 특히 하기 XXIVA의 화합물을 절단하고, (절단 전에, 그와 병행하여 또는 그 이후에) 보호기 Prot**를 제거하여 화학식 XXV의 화합물을 얻는 것을 추가로 포함하는, 이전 단락 (ii/b)에 따른 방법 또는 공정에 관한 것이다.
<화학식 XXIV>
<화학식 XXIVA>
상기 식에서, X*, A1 *, R2 *, R3 *, R5 *, R6 *, R7 * 및 Prot는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, L은 절단가능한 링커이고, RES는 고체 수지이고, n은 자연수이고, Prot**는 보호기 Prot의 병행 제거 없이 생성물을 수지 상에 남기면서 제거될 수 있는 아미노 보호기이다.
(iv/b) 본 발명의 추가의 실시양태는, 화학식 XXIV의 화합물의 합성을 위해, 하기 화학식 XIX, 특히 하기 XIXA의 아미노산 또는 상기 아미노산의 활성화된 유도체를 하기 화학식 XXIII, 특히 하기 XXIIIA의 화합물과 커플링시키는 것을 추가로 포함하는, 이전 단락 (iii/b)에 따른 방법 또는 공정에 관한 것이다.
<화학식 XIX>
<화학식 XIXA>
상기 식에서, Prot는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, Prot**는 상기 화학식 XXIV의 화합물에 대해 정의된 바와 같다.
<화학식 XXIII>
<화학식 XXIIIA>
상기 식에서, X*, A1 *, R2 *, R3 *, R5 *, R6 * 및 R7 *는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, L은 절단가능한 링커이고, RES는 고체 수지이고, n은 자연수이다.
(v/b) 본 발명의 또한 추가의 실시양태는, 화학식 XXIII의 화합물의 합성을 위해, 하기 화학식 XVII*, 특히 하기 XVIIA*의 아미노산 또는 상기 아미노산의 반응성 유도체를 하기 화학식 XXII, 특히 하기 XXIIA의 화합물과 커플링시키고, 보호기 Prot***를 제거하는 것을 추가로 포함하는, 이전 단락 (iv/b)에 따른 방법 또는 공정에 관한 것이다.
<화학식 XVII*>
<화학식 XVIIA*>
상기 식에서, R5 *는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, Prot***는 존재하는 다른 보호기에 영향을 주지 않고 생성물을 수지 상에 남기면서 선택적으로 절단될 수 있는 아미노 보호기이다.
<화학식 XXII>
<화학식 XXIIA>
상기 식에서, X*, A1 *, R2 *, R3 *, R6 * 및 R7 *는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, L은 절단가능한 링커이고, RES는 고체 수지이고, n은 자연수이다.
(vi/b) 또한 추가의 실시양태에서, 본 발명은, 화학식 XXII의 화합물의 합성을 위해, 하기 화학식 XV*, 특히 하기 XVA*의 아미노산 또는 상기 아미노산의 반응성 유도체를 하기 화학식 XXI, 특히 하기 XXIA의 화합물과 커플링시키고, 보호기 Prot***를 제거하는 것을 추가로 포함하는, 이전 단락 (v/b)에 따른 방법 또는 공정에 관한 것이다.
<화학식 XV*>
<화학식 XVA*>
상기 식에서, R6 * 및 Y는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, Prot***는 존재하는 다른 보호기에 영향을 주지 않고 생성물을 수지 상에 남기면서 선택적으로 절단될 수 있는 아미노 보호기이다.
<화학식 XXI>
<화학식 XXIA>
상기 식에서, X*, A1 *, R2 *, R3 * 및 R7 *는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, L은 절단가능한 링커이고, RES는 고체 수지이고, n은 자연수이다.
(vii/b) 본 발명의 또 다른 실시양태는, 화학식 XXI의 화합물의 합성을 위해, 하기 화학식 XIII*, 특히 하기 XIIIA*의 아미노산 또는 상기 아미노산의 반응성 유도체를 하기 화학식 XXVI, 특히 하기 XXVIA의 화합물의 히드록실 기와 반응시키고, 보호기 Prot***를 제거하는 것을 추가로 포함하는, 이전 단락 (vi/b)에 따른 방법 또는 공정에 관한 것이다.
<화학식 XIII*>
<화학식 XIIIA*>
상기 식에서, Prot***는 존재하는 다른 보호기에 영향을 주지 않고 생성물을 수지 상에 남기면서 선택적으로 절단될 수 있는 아미노 보호기이고, R7 *는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같다.
<화학식 XXVI>
<화학식 XXVIA>
상기 식에서, X*, A1 *, R2 * 및 R3 *는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, L은 절단가능한 링커이고, RES는 고체 수지이고, n은 자연수이다.
(viii/b) 추가의 실시양태에서, 본 발명은, 화학식 XXVI, 특히 XXVIA의 화합물의 합성을 위해, 하기 화학식 XII*, 특히 하기 XIIA*로 표시되는 수지 결합 디펩티드를, 보호기 Prot****를 제거한 후에 이에 따라 수득가능한 유리 아미노 기를 통해 하기 화학식 VII의 산 또는 상기 산의 반응성 유도체와 커플링시키고;
<화학식 XII*>
<화학식 XIIA*>
(상기 식에서, Prot****는 상기에 정의된 바와 같은 화학식 II의 화합물 중에 존재하는 다른 보호기에 영향을 주지 않고 생성물을 수지 상에 남기면서 선택적으로 절단될 수 있는 보호기이고, R2 * 및 R3 *는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, L은 절단가능한 링커이고, RES는 고체 수지이고, n은 자연수임)
<화학식 VII>
(상기 식에서, X**는 아미노 보호기 또는 X*이고, X* 및 A1 *는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
또한 X**가 아미노 보호기인 경우에는, 상기 아미노 보호기 X**를 제거하여 화학식 II의 유도체를 얻고 (여기서는, X* 대신에, H가 존재함), 생성된 아미노 기를 상응하는 산 X*-OH 또는 상기 산의 반응성 유도체를 사용하여 아실 기 X*와 커플링시키는 것 (여기서, X*는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)을 추가로 포함하는, 이전 단락 (vii/b)에 따른 방법 또는 공정에 관한 것이다.
(ix/b) 본 발명의 또한 추가의 실시양태는, 화학식 XII의 화합물의 합성을 위해, 하기 화학식 X, 특히 하기 XA로 표시되는 수지 결합 아미노산을 하기 화학식 XI*, 특히 하기 XIA*의 아미노산 또는 상기 아미노산의 반응성 유도체와 커플링시키는 것을 추가로 포함하는, 이전 단락 (viii/b)에 따른 방법 또는 공정에 관한 것이다.
<화학식 X>
<화학식 XA>
상기 식에서, R3 *는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, L은 절단가능한 링커이고, RES는 고체 수지이고, n은 자연수이다.
<화학식 XI*>
<화학식 XIA*>
상기 식에서, Prot****는 존재하는 다른 보호기에 영향을 주지 않고 생성물을 수지 상에 남기면서 선택적으로 절단될 수 있는 보호기이고, R2 *는 상기 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같다.
(x/b) 본 발명의 추가의 실시양태는, 화학식 X의 수지 결합 아미노산을 얻기 위해, 하기 화학식 IX*, 특히 하기 IXA*의 아미노산 또는 상기 화학식 IX의 아미노산의 반응성 유도체를, 고체 수지 RES에 결합되어 있는 절단가능한 링커 L에 커플링시키고, 보호기 Prot***를 제거하는 것을 추가로 포함하는, 이전 단락 (ix/b)에 따른 방법 또는 공정에 관한 것이다.
<화학식 IX*>
<화학식 IXA*>
상기 식에서, R3 *는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, Prot***는 존재하는 다른 보호기에 영향을 주지 않고 생성물을 수지 상에 남기면서 선택적으로 절단될 수 있는 아미노 보호기이다.
(i/c) 본 발명의 또 다른 실시양태는,
기호 A1, R2, R3, R5, R6, R7, X 및 Y 또는 상응하는 비보호 또는 보호된 모이어티 R2 *, R3 *, R5 *, R6 *, R7 *, X* 및 Y3이,
생성된 화학식 I의 화합물 또는 그의 염에서,
A1은 α-카르복시 기의 카르보닐을 통해 화학식 I에서 A1의 우측에서 아미노 기에 결합되고 α-아미노 기를 통해 X에 결합된 L-글루타민의 2가 라디칼이거나, 또는 2S-(2-히드록시-3-포스포노옥시)-프로피오닐이고;
R2는 메틸이고;
R3은 이소프로필, 이소부틸 (2-메틸-n-프로필, 사용되는 경우) 또는 벤질, 특히 이소부틸이고;
R5는 sec-부틸 또는 벤질, 특히 sec-부틸이고;
R6은 4-히드록시벤질이고;
R7은 이소프로필 또는 sec-부틸 (1-메틸-n-프로필, 사용되는 경우), 특히 sec-부틸이고;
X는 아세틸 또는 이소부티릴이거나, 또는 A1이 2S-(2-히드록시-3-포스포노옥시)-프로피오닐인 경우에는 부재하고,
Y는 메틸이 되도록 선택되는 것인, 이전 단락 (i/a) 내지 (x/b) 중 어느 하나에 따른 방법 또는 공정에 관한 것이다. 이 단락은 하기에서 또한 단락 a)라 불린다.
(i/d) 또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명은, 상기에 제공된 또는 특히 이전 단락 (i/c)에 정의된 바와 같은 치환기를 갖는 화학식 I의 화합물의 탈수물 (여기서, 탈수물은 하기 화학식 V, 특히 하기 VA를 가짐)을 상응하는 화학식 I의 화합물로 전환시키는 방법 또는 공정;
<화학식 V>
<화학식 VA>
(상기 식에서, Y, X, A1, R2, R3, R5, R6 및 R7은 상기 화학식 I의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
또는 특히 화학식 I의 화합물 및 그의 상응하는 탈수물, 및/또는 또한 부산물로서 형성될 수 있고, 하기 화학식 V*, 특히 하기 화학식 VA*를 가지며, 화학식 I에서의 ahp 구조 대신에 5-고리를 갖는 그의 상응하는 헤미아미날 유사체의 혼합물의 평형을 화학식 I의 화합물의 편으로 이동시키는 방법 또는 공정
<화학식 V*>
<화학식 VA*>
(상기 식에서, Y, X, A1, R2, R3, R5, R6 및 R7은 각각 상기 화학식 I의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
에 관한 것이며, 상기 방법 또는 공정은 반응성 용매로서 수성 산을 사용하여 반응을 유도하는 것을 포함한다. 이 방법은, 수율을 증가시키거나 화학식 V, 특히 VA의 화합물, 및/또는 화학식 I에서의 ahp 구조 대신에 5원 고리를 갖는 유사체를 상응하는 화학식 I의 화합물로 재-전환시키기 위해, 독립적으로 (예를 들어 또한 발효 또는 생합성의 생성물에 대해) 또는 상기 및 하기에 기재된 다른 공정 또는 방법에 추가로 사용될 수 있다.
탈수물 및/또는 5 고리 유사체 (항상 목적한 ahp 고리에 대하여)를 목적한 화학식 I 또는 특히 IA의 화합물로 전환시키는 것 (예를 들어 실시예 3B로부터의 화합물 A-탈수물을 화합물 A로 전환시키는 것)에 대해 기재된 방법은, 이러한 유형의 화합물의 직접적인 합성을 가능하게 한다. 지금까지, 최종 단계로서의 산 처리는 생성물의 탈수를 피하기 위해 회피되어야 했다.
(i/e) 본 발명의 추가의 실시양태는, 산이 카르복실산, 특히 할로 치환된 C1-8알칸산, 더욱 특히 트리플루오로아세트산 또는 트리클로로아세트산인, 이전 단락 (i/d)에 따른 방법에 관한 것이다.
(i/f) 본 발명은, 또한 추가의 실시양태에서, 하기 화학식 II의 화합물에 관한 것이다.
<화학식 II>
상기 식에서, Prot는 보호기이고, Y는 상기 첫번째 경우에 또는 특히 제17항에서와 같이 화학식 I의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, X*, A1 *, R2 *, R3 *, R5 *, R6 * 및 R7 *는 각각 제1항 또는 상기에 제공된 단락 (ia)에서 정의된 바와 같은 화학식 I에서의 X, A1, R2, R3, R5, R6 및 R7에 상응하되, 단 이들 모이어티 상의 반응성 관능기는 보호된 형태로 존재한다.
(i/g) 추가의 실시양태에서, 본 발명은, 화학식 II, III, IV, V, VI, VIII, X, XII, XIV, XVI, XVIII, XIX, XX, XXI, XXII, XXIII, XXIV, XXV, XXVI 및 XXVIII의 화합물, 또한 특히 화학식 IIA, IIIA, IVA, VA, VIA, VIIIA, XA, XIIA, XIVA, XVIA, XVIIIA, XIXA, XXA, XXIA, XXIIA, XXIIIA, XXIVA, XXVA, XXVIA 및 XXVIIIA의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 신규 화합물, 또한 더욱 특히 하기 예에 제공된 화합물로 이루어진 군에 관한 것이다: 반응식 1로부터: 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 합성단위체 1; 반응식 2로부터: 화합물 5; 실시예 1B(2)에 따른 Fmoc-Leu-링커-수지; 실시예 1B(3)에 따른 Fmoc-Thr-Leu-링커-수지; 실시예 1B(4)에 따른 Fmoc-Gln(Trt)-Thr-Leu-링커-수지; 실시예 1B(5)에 따른 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr-Leu-링커-수지; 실시예 1B(6)에 따른 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Fmoc)-Leu-링커-수지; 실시예 1B(7)의 생성물 = 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Tyr(tBu)Me-Fmoc)-Leu-링커-수지 (이전 명칭: 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-N-me-Tyr(tBu)-Fmoc)-Leu-링커-수지); 실시예 1B(8)에 따른 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Tyr(tBu)Me-Ile-Fmoc)-Leu-링커-수지 (이전 명칭: 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-N-me-Tyr(tBu)-Ile-Fmoc)-Leu-링커-수지); 실시예 1B(9)에 따른 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Tyr(tBu)Me-Ile-합성단위체 1-H)-Leu-링커-수지 (이전 명칭: 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-N-Me-Tyr(tBu)-Ile-합성단위체 1-H)-Leu-링커-수지); 실시예 1B(10) 및 반응식 3에 따른 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Tyr(tBu)Me-Ile-합성단위체 1-H)-Leu-OH (이전 명칭: 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-N-Me-Tyr(tBu)-Ile-합성단위체 1-H)-Leu-OH); 실시예 1B(12)에 따른 H-Thr-Leu-수지; 실시예 1B(13)에 따른 H-Gln(Trt)-Thr-Leu-수지; 실시예 1B(14)에 따른 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr-Leu-수지 ; 실시예 1B(15)에 따른 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-H)-Leu-수지; 실시예 1B(16)에 따른 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Tyr(tBu)Me-H)-Leu-수지; 실시예 1B(17)에 따른 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Tyr(tBu)Me-Ile-H)-Leu-수지; 실시예 1B(18)에 따른 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Tyr(tBu)Me-Ile-합성단위체 1-H)-Leu-수지; 반응식 3으로부터, 화합물 6 및/또는 7 (후자가 바람직함); 반응식 4로부터: 화합물 8 및 5-고리 헤미아미날-이성질체; 반응식 5로부터, 전구체 펩티드 2, 화합물 9, 화합물 10 (이는 반응식 5에 대해 본 목록에서 바람직한 것임), 및/또는 화합물 11; 실시예 2A(1)로부터의 Fmoc-Thr-Leu-Trt-텐타겔(Tentagel)-S; 실시예 2A(2)에 따른 Fmoc-Gln(Trt)-Thr-Leu-Trt-텐타겔-S; 실시예 2A(3)에 따른 Ac-Gln(Trt)-Thr-Leu-Trt-텐타겔-S; 실시예 2A(4)에 따른 Ac-Gln(Trt)-Thr(Val-Fmoc)-Leu-Trt-텐타겔-S; 실시예 2A(5)에 따른 Ac-Gln(Trt)-Thr(Val-Tyr(tBu)Me-Fmoc)-Leu-Trt-텐타겔-S (이전 명칭: Ac-Gln(Trt)-Thr(Val-N-Me-Tyr(tBu)-Fmoc)-Leu-Trt-텐타겔-S); 실시예 2A(6)에 따른 Ac-Gln(Trt)-Thr(Val-Tyr(tBu)Me-Phe-Fmoc)-Leu-Trt-텐타겔-S (이전 명칭: Ac-Gln(Trt)-Thr(Val-N-Me-Tyr(tBu)-Phe-Fmoc)-Leu-Trt-텐타겔-S); 및 실시예 2A(7)에 따른 Ac-Gln(Trt)-Thr(Val-Tyr(tBu)Me-Phe-합성단위체 1-H)-Leu-OH (이전 명칭: Ac-Gln(Trt)-Thr(Val-N-Me-Tyr(tBu)-Phe-합성단위체 1-H)-Leu-OH) (전구체 펩티드 2).
하기 정의 (또는 또한 상기에서 이미 포함된 정의)는, 본 발명의 추가의 실시양태를 정의하기 위해 상기 및 하기 발명 실시양태에서 사용되는 보다 일반적 용어로 대체될 수 있으며, 여기서 이러한 발명 실시양태를 정의하기 위해 하나, 둘 이상 또는 모든 일반적 용어는 보다 구체적인 용어로 대체될 수 있다:
말단 카르복시 또는 카르바모일 기를 갖는 아미노산의 2가 모이어티는 바람직하게는 알파-카르바모일 또는 카르복실-C1 -8-치환된 아미노산, 특히 아스파라긴 또는 글루타민의 2가 모이어티이고, 이는 화학식 I에서 우측에서 카르보닐 (바람직하게는 그의 α-카르복실 기의 카르보닐)을 통해 분자의 나머지 부분에 결합된다.
C1 -8-알카노일 또는 인산화된 히드록시-C1 -8-알카노일 (히드록실 및 포스포노 (-O-P(=O)(OH)2) 기 둘 다를 갖는 C1 -8-알카노일) A1은 예를 들어 2,3-디히드록시-프로파노일 (바람직하게는 S-형태) 또는 2-히드록시-3-포스포노-프로파노일 (바람직하게는 S-형태)이다.
R2 및 R2 *는 C1 -8-알킬, 특히 메틸 (언급되는 경우)이다.
R3은 아미노산, 특히 천연 아미노산의 측쇄이다. 바람직하게는, 이는 분지형 또는 선형일 수 있는 C1 -8-알킬이다. 가장 특히, C1 -8-알킬은 n-(2-메틸)프로필 (이소부틸), n-(1-메틸프로필 (sec-부틸) 또는 메틸이고, 즉, 상기 모이어티를 함유하는 아미노산은 류신, 이소류신 또는 발린이다.
R3 *는, 반응에 참여하기 위해 장애되어야 하는 관능기가 존재하는 경우에는 보호된 형태의 상응하는 측쇄이다. 바람직하게는, 이는 특히 이전 단락에서 정의된 바와 같은 분지형 또는 선형일 수 있는 C1 -8-알킬이다.
"아미노산의 측쇄"는 임의의 모이어티, 예를 들어 모노- 또는 폴리시클릭, 선형, 포화, 불포화 (예를 들어 공액 이중 결합을 가짐) 또는 부분 포화 유기 모이어티 (예를 들어 기본 구조 내에 최대 20개의 탄소 원자 및 상응하는 수의 탄소 원자를 대체하는 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5개의 헤테로원자를 가짐)로부터 선택될 수 있고, 이는 아미노, 이미노, 히드록시, 카르복시, 카르바모일, 술프히드릴, 아미디노, 구아니디노, O-포스포노 (-O-P(=O)(OH)2)로부터 선택된 최대 3개의 모이어티에 의해 치환될 수 있다. 바람직하게는, 측쇄는 20종의 표준 알파-아미노산 아르기닌, 히스티딘, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 글리신, 알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 발린 및 추가로 프롤린 (또한 이는 알파-아미노 기를 포함하는 내부 고리화를 가짐)의 것들로부터 선택된다.
아미노산에 대해, 이들의 명칭 또는 통상적인 3 문자 코드가 하기 표에 따라 본 개시내용에서 사용된다:
R5는 아미노산, 바람직하게는 표준 아미노산의 측쇄이다. 바람직하게는, 분지형 또는 선형일 수 있고 치환되지 않은 또는 페닐에 의해 치환된 C1 -8-알킬이다. 가장 특히 이는 벤질, n-(2-메틸)프로필, 이소부틸 또는 메틸이고, 즉 상기 모이어티를 함유하는 아미노산은 페닐알라닌, 류신, 이소류신 또는 발린이다.
R6은 히드록시 아미노산, 특히 티로신의 측쇄이다.
R7은 아미노산, 특히 천연 아미노산의 측쇄이다. 바람직하게는, 이는 분지형 또는 선형일 수 있는 C1 - 8알킬이다. 가장 특히 이는 n-(2-메틸)프로필 (이소부틸), n-(1-메틸)프로필 (sec-부틸) 또는 메틸이고, 즉 상기 모이어티를 함유하는 아미노산은 류신, 이소류신 또는 발린이다.
C1 -8-알킬은 선형이거나 1회 이상 분지화될 수 있고; 예를 들어, 이는 n-(2-메틸)프로필, n-(1-메틸)프로필 또는 메틸일 수 있다.
모든 화합물은, 염-형성 기, 예컨대 염기성 기, 예를 들어 아미노 또는 이미노, 또는 산성 기, 예를 들어 카르복실 또는 페놀계 히드록실이 존재하는 경우, 유리 형태로 또는 염으로서 또는 염 및 유리 형태의 혼합물로서 사용될 수 있다. 따라서 화합물이 언급된 경우, 이는 모든 이들 변형물을 포함한다. 예를 들어, 염기성 기는 산, 예컨대 할로겐화수소산, 예를 들어 HCl, 황산 또는 유기 산, 예컨대 아세트산과 염을 형성할 수 있고, 산성 기는 양성 이온, 예를 들어 암모늄, 알킬암모늄, 알칼리 또는 알칼리-토금속 염 양이온, 예를 들어 Ca, Mg, Na, K 또는 Li 양이온 등과 염을 형성할 수 있다.
본 개시내용에서 사용되는 경우 "~등"은, 이러한 표현 앞에 언급된 것들에 대한 다른 대안이 당업자에게 공지되어 있으며, 이들이 구체적으로 언급된 표현에 추가될 수 있다는 사실을 나타내며; 다른 실시양태에서는, "~등"이 하나 이상 또는 모든 발명 실시양태에서 삭제될 수 있다.
보호기 Prot, Prot*, Prot**, Prot***, Prot**** 및 모이어티 A*, R2 *, R3 *, R5 *, R6 *, R7 *, X* 상에 존재하는 임의의 추가의 보호기는, 본 명세서 및 특허청구범위 전반에 걸쳐 언급되는 경우, 이들은 직교 보호를 가능하게 하도록 선택된다.
직교 보호는, 다른 보호기(들) 또는 수지에 대한 결합 (예를 들어, 고체 합성 수지 상의 링커를 통한)에 영향을 주지 않으면서 제공된 반응 조건의 세트에서 원하는 경우 하나씩 (또는 그 이상씩, 그러나 전부는 아님) 다수의 보호기를 탈보호하는 것을 가능하게 하는 전략이다. 다시 말하면, 상기 전략에서는 상이한 화학적 메카니즘에 의해, 또한 고체 상 펩티드 합성의 경우 적절한 링커를 사용하여 (링커-수지 결합이 함께 카르복시 보호기로서 고려될 수 있음) 제거되는 다양한 부류의 보호기를 사용한다.
바람직하게는, 보호기는 하기와 같이 선택된다:
보호기 Prot는, 바람직하게는 뎁시펩티드의 본 발명에 따른 합성 동안 사용되거나 존재하는 임의의 다른 보호기의 제거에 저항하도록 선택되고, 예를 들어 이는 온화한 염기에 저항할 수 있지만 (Prot* 참조), (특히 무수 조건 하에) 플루오라이드 이온과 함께 제거가능하다 (예를 들어 Bu4N+F- (또한 계내 생성되는 경우, 예를 들어 Bu4N+Cl-와 KF·H2O, KF와 18-크라운-6, LiBr과 18-크라운-6, BF3·디에틸에테르, 피리딘-HF, 우레아 중 HF, Et3N(HF)3 (상기 식에서, Et는 에틸임) 등을 사용함), 여기서 용매는 예를 들어 N,N-디메틸포름아미드, 아세토니트릴, 클로로포름 및 테트라히드로푸란으로 이루어진 군으로부터 선택됨).
바람직하게는, Prot는, 특히 tert-부틸디페닐실릴, 트리메틸실릴, 트리이소프로필실릴, tert-부틸디메틸실릴, 트리페닐실릴, 디페닐메틸실릴, ti-tert-부틸디메틸실릴, tert-부틸메톡시페닐실릴, 트리스(트리메틸실릴)실릴 등과 같은, 실릴 모이어티가 탄소를 통해 (임의로 추가의 Si 원자를 통해) 결합된 최대 3개의 유기 잔기를 갖는 실릴 보호기로 이루어진 군으로부터 선택된 에테르 보호기이다.
Prot*는 존재하는 다른 보호기에 영향을 주지 않으면서, 또한 뎁시펩티드 형성 에스테르 결합 또는 수지 RES에 대한 링커에 영향을 주지 않으면서 선택적으로 절단될 수 있고, 선형 전구체 펩티드의 합성 동안의 탈보호 단계 동안 안정적인 보호기이고 (예를 들어 알릴옥시카르보닐의 제거); 이는 적절한 용매, 예를 들어 테트라히드로푸란 중에서 금속 수소화물 또는 다른 환원제, 예를 들어 (PH3P)4Pd (바람직하게는 디-n-부틸 주석 수소화물 또는 트리-n-부틸 주석 수소화물과 조합됨), 페닐실란, 수소화붕소나트륨 또는 디메돈의 존재 하에 특정 트리페닐포스핀 착물에 의해 제거가능한 보호기이고, 또한 바람직하게는 보호기 Prot**의 제거를 가능하게 하는 조건 하에서는 절단가능하지 않으며; 예를 들어, 또한 Prot*는 C3-C8알크-2-에닐옥시카르보닐 모이어티, 예를 들어 알릴-옥시카르보닐 (Alloc), 1-이소프로필알릴옥시카르보닐, 4-니트로신나밀옥시카르보닐 및 3-(3'-피리딜)프로프-2-에닐옥시카르보닐로 이루어진 군으로부터 선택된다.
Prot**는 다른 결합의 절단 없이 (그의 카르보닐 기 (특히 하기에 언급되는 링커 L을 통한 결합에 대한 α-카르복실 기)를 통한 아미노산 또는 펩티드 결합의 절단 없이; 또한 일단 존재하는 보호기 Prot의 절단 없이) 수지 상에서 제거될 수 있는 보호기, 특히 뎁시펩티드 또는 뎁시펩티드 전구체 내의 에스테르 (아미드 대신) 결합의 절단 없이, 또한 보호기 Prot* 및 Prot에 대한 조건 이외의 조건 하에, 존재하는 경우 수지 RES에 대한 링커를 통한 결합을 보존하면서 제거가능한 보호기이고; 이는 바람직하게는 적절한 용매, 예를 들어 N,N-디메틸포름아미드, 메틸렌 클로라이드 중의 온화한 염기, 예를 들어 피페리딘, 모르폴린, 디시클로헥실아민, p-디메틸-아미노-피리딘, 디이소프로필아민, 피페라진, 트리스-(2-아미노에틸)아민에 의해 제거가능하며; Prot**는, 예를 들어, 플루오렌-9-일메톡시카르보닐 (Fmoc); 2-(2' 또는 4'-피리딜)에톡시-카르보닐 및 2,2-비스(4'니트로페닐)에톡시카르보닐로 이루어진 군으로부터 선택된다.
Prot*** (존재하는 다른 보호기에 영향을 주지 않고 생성물을 수지 상에 남기면서 선택적으로 절단될 수 있는 아미노 보호기) 및 Prot**** (상기 및 하기에 정의된 바와 같은 화학식 II의 화합물 중에 존재하는 다른 보호기에 영향을 주지 않고 생성물을 수지 상에 남기면서 선택적으로 절단될 수 있는 보호기)는 바람직하게는 Prot**로서 제거될 수 있는 보호기이며, 이들은 예를 들어 R**에 대해 언급된 것들, 예를 들어 플루오렌-9-일메톡시카르보닐 (Fmoc)로부터 선택된다.
이 경우에 바람직한 직교 합성 방법에서는, 용액 상 매크로락탐화 및 추가의 화학적 전환과 조합된 고체 상 펩티드 합성을 이용한 펩티드 합성에 대해 일반적으로 공지된 Fmoc 방법을 이용한다.
대안적으로, 예를 들어 Boc 보호기가 Fmoc Prot**, Prot*** 및 Prot**** 대신에 사용될 수 있다.
그러나, 이는 상이한 측쇄 보호기를 필요로 할 것이고, 또한 이 경우 N-메틸-Tyr의 히드록시-기는 보호 기의 직교성을 유지하기 위해 상이한 방식으로 보호되어야 할 것이다.
존재하는 다른 보호기 뿐만 아니라 존재하는 경우 수지 RES에 대한 결합 링커는 바람직하게는, Prot* 및 Prot**가 제거될 수 있는 조건 하에 제거가능하지 않고, 예를 들어 A*에서, 아미드는 트리틸 (트리페닐메틸)로 N-보호 (예를 들어 이는 트리플루오로 아세트산 (TFA)으로 절단됨)될 수 있고; R6 *에서, 티로신 히드록시는 t-부틸-에테르로서 보호되거나, 또는 tert-부틸디메틸실릴, 메톡시메틸, Boc (tert-부톡시카르보닐) 또는 아릴아세테이트에 의해 보호 (TFA로 절단됨)될 수 있다.
적절한 보호기, 또한 이들의 도입 및 제거 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 보호기, 이들의 도입 및 제거 방법은 표준 교본, 예컨대 문헌 ["Protective Groups in Organic Synthesis", 3rd ed., T.W. Green and P.G.M. Wuts (Eds.). J. Wiley & Sons, Inc., New York etc. 1999]에 기재된 것들로부터 선택될 수 있다.
따라서, 보호기 Prot, Prot*, Prot**, Prot***, Prot**** 및 다른 보호기는 상기에 언급된 것들로 제한되지 않고, 대신에 이들은, 예를 들어 상기 또는 하기에 기재된 바와 같이 이들이 직교 보호에 적절하게 되도록 하는 조건을 만족하여야 한다.
뎁시펩티드 (에스테르) 결합의 절단을 피하기 위해서는 지나치게 염기성인 조건을 피하는 것이 권고된다 (Fmoc 절단에 대해 기재된 염기, 예컨대 피페리딘이 통상적으로 허용가능하지만).
고체 상 펩티드 합성 (SPPS)을 위해 가능한 고체 지지체 중, 하기의 것들을 언급할 수 있다:
- 스페이서를 갖지 않거나 갖는 겔-유형 지지체: 이들은 동일한 분포의 관능기를 갖는 고도로 용매화된 중합체이다. 이러한 유형의 지지체가 가장 통상적이고, 이는 하기의 것들을 포함한다:
폴리스티렌: 예를 들어 1 내지 2% 디비닐벤젠으로 가교된 스티렌; 폴리아크릴아미드 또는 폴리메타크릴아미드: 폴리스티렌에 대한 친수성 대체물; 폴리에틸렌 글리콜 (PEG): PEG-폴리스티렌 (PEG-PS)이 폴리스티렌보다 더 안정적이며, 이는 합성 부위를 중합체 주쇄로부터 떨어져 있게 함; PEG-기재의 지지체: PEG-폴리프로필렌 글리콜 네트워크 또는 PEG와 폴리아미드 또는 폴리스티렌 (이들은 이미 스페이서, PEG를 포함함)으로 구성됨.
- 표면-유형 지지체: 조절된 다공성 유리, 셀룰로스 섬유, 및 고도로 가교된 폴리스티렌을 포함한, 표면 관능화를 위해 개발된 물질.
- 복합체: 경질 매트릭스에 의해 지지된 겔-유형 중합체.
통상적으로 이들 겔은, 상기 및 하기 다양한 전구체에 대해 언급된 바와 같은 링커 L이 결합될 수 있는 반응성 기를 갖는다. 예를 들어, 이러한 기는 아미노메틸 기, 말단 히드록시를 갖는 폴리에틸렌글리콜 기 등을 포함한다.
임의의 이러한 지지체가 본 발명의 실시양태에서 사용될 수 있다.
겔 유형 지지체는 본 발명의 또 다른 특정 실시양태에서 사용된다. 이들 중, 폴리스티렌 (디비닐벤젠 가교된 것); 폴리아크릴아미드 및 폴리메타크릴아미드 수지가 특히 바람직하다.
가능한 링커 중, 통상적으로 공지되고 적절한 모든 것이 사용될 수 있다.
본 발명의 가능한 실시양태에서의 예는, 2-메톡시-4-벤질옥시-벤질 알콜 링커 (사스린(Sasrin)-링커, 사스린은 초강산 민감성 수지를 나타내고, 알콜성 OH를 통해 아미노산 또는 펩티드에 결합됨); 트리틸 링커 부류 (예를 들어, 트리틸, 2Cl-트리틸, 이는 OH를 통해 아미노산 또는 펩티드에 결합됨); 4-(2,4-디메톡시페닐히드록시-메틸)페녹시메틸-링커 (링크-애시드-링커(Rink-Acid-Linker), 이는 OH를 통해 아미노산 또는 펩티드에 결합됨); 또는 트리스(알콕시)벤질 에스테르 링커 (HAL-링커, 이는 OH를 통해 아미노산 또는 펩티드에 결합됨)이다.
산의 반응성 유도체, 특히 아미노산, 또는 펩티드, 예를 들어 디펩티드가 언급되는 경우, 이들은 계내 형성될 수 있거나 또는 그대로 사용될 수 있다.
그대로 사용되는 반응성 (또는 활성) 유도체는 아실-할라이드, 예를 들어 아실-클로라이드, -플루오라이드 또는 -니트로페닐 에스테르, 예를 들어 2,4-디니트로페닐 에스테르, 또는 반응되는 산의 카르복시 기의 산 무수물 (대칭적인 또는 예를 들어 아세트산과의)을 포함한다.
계내 아미노산 활성화를 위해, 통상적인 커플링제가 적용될 수 있다. 이러한 시약은 당업자에게 공지되어 있고, 많은 공급원, 예를 들어 "Aldrich ChemFiles - Peptide Synthesis" (알드리치 케미칼 컴파니 인코포레이티드(Aldrich Chemical Co., Inc.), 시그마-알드리치 코포레이션(Sigma-Aldrich Corporation, 미국 위스콘신주 밀와우키 소재)) Vol. 7 No. 2, 2007 ("http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Aldrich/Brochure/al_chemfile_v7_n2.Par.0001.File.tmp/al_chemfile_v7_n2.pdf" 참조)로부터 편리하게 구입할 수 있다. 아미드 및 에스테르 결합 합성을 위해 가능한 커플링제 중, 하기의 것들을 언급할 수 있다:
트리아졸, 우로늄 또는 헥사플루오로포스포늄 유도체, 예를 들어 1-히드록시-벤조트리아졸 (HOBt), 1-히드록시-7-아자-벤조트리아졸 (HOAt), 에틸 2-시아노-2-(히드록시이미노)아세테이트, 2-(1H-7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 메탄아미늄 (HATU), 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로-포스페이트 (PyBOP), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP), 1-(메시틸렌-2-술포닐)-3-니트로-1,2,4-트리아졸 (MSNT), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄-헥사플루오로포스페이트 (HBTU), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄-헥사플루오로보레이트 (TBTU), 2-숙신이미도-1,1,3,3-테트라메틸우로늄-테트라플루오로보레이트 (TSTU), 2-(5-노르보르넨-2,3-디카르복스이미도)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄-테트라플루오로보레이트 (TNTU), O-[(시아노(에톡시카르보닐)-메틸리덴)아미노]-1,1,3,3-테트라메틸우로늄-테트라플루오로보레이트 (TOTU), O-(벤조트리아졸-1-일)-1,3-디메틸-1,3-디메틸렌 우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBMDU), O-(벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-비스(테트라메틸렌)우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBPyU), O-(벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-비스(펜타메틸렌)우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBPipU), 3-히드록시-4-옥소-3,4-디히드로-1,2,3-벤조트리아진 (HODhbt), 1-히드록시-7-아자-벤조트리아졸 및 그의 상응하는 우로늄 또는 포스포늄 염, 지정된 HAPyU 및 AOP, 1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴아미노옥시-디메틸아미노-모르폴리노-카르베늄 헥사플루오로포스페이트 (COMU), 클로로트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyCloP) 등;
카르보디이미드, 예를 들어 디시클로헥실카르보디이미드, N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드, 1-tert-부틸-3-에틸카르보디이미드, N-시클로헥실-N'-2-모르폴리노에틸)카르보디이미드 또는 디이소프로필카르보디이미드 (특히 카르복실 기의 O-아실 우레아 형성을 통한 에스테르 형성에 대해); 또는
활성 에스테르 형성제, 예를 들어 2-메르캅토벤조티아졸 (2-MBT),
아지드 형성제, 예를 들어 디페닐 포스포릴 아지드,
산 무수물, 예컨대 프로판 포스폰산 무수물,
산 할로겐화제, 예를 들어 1-클로로-N,N,2-트리메틸-1-프로페닐아민, 클로로-N,N,N',N'-비스(테트라메틸렌)포름아미디늄 테트라플루오로보레이트 또는 헥사플루오로포스페이트, 클로로-N,N,N',N'-테트라메틸포름아미디늄 헥사플루오로포스페이트, 플루오로-N,N,N',N'-테트라메틸포름아미디늄 헥사플루오로포스페이트, 플루오로-N,N,N',N'-비스(테트라메틸렌)포름아미디늄 헥사플루오로포스페이트,
등, 또는 2종 이상의 상기 작용제의 혼합물.
또한, 각각 화학식 XII 또는 XIIA의 화합물과 화학식 XIII 또는 XIIIA의 화합물의 에스테르 커플링, 또는 각각 화학식 XIII* 또는 XIIIA*의 화합물과 화학식 XXVI 또는 XXVIA의 화합물의 에스테르 커플링을 위해서는, 상응하는 반응성 카르복실 화합물이 사용되거나 계내 형성될 수 있다. 여기서, 특히 MSNT가 높은 입체특이성 유지를 가능하게 하기 때문에 커플링제로서 바람직하다.
반응은, 적절한 경우, 온화한 염기 (예를 들어 N-메틸모르폴린, 트리알킬아민, 예를 들어 에틸디이소프로필아민, 디-(알킬)아미노피리딘, 예컨대 N,N-디메틸아미노피리딘 등의 존재 하에 (조건이 에스테르 기, 예를 들어 화학식 I의 화합물의 전구체 내에 존재하는 뎁시펩티드 에스테르 기의 가수분해를 허용하도록 지나치게 염기성이 되지 않도록 주의함), 적절한 또는 필요한 경우 적절한 용매 또는 용매 혼합물, 예를 들어 N,N-디알킬-포름아미드, 예컨대 디메틸포름아미드, 할로겐화 탄화수소, 예를 들어 디클로로메탄, N-알킬피롤리돈, 예컨대 N-메틸피롤리돈, 니트릴, 예를 들어 아세토니트릴, 또는 추가의 방향족 탄화수소, 예를 들어 톨루엔, 또는 2종 이상의 혼합물의 존재 하에 수행될 수 있으며, 이 경우 과량의 커플링제가 존재하는 경우에는 또한 물이 존재할 수 있다. 온도는 주변 온도 또는 보다 저온 또는 고온, 예를 들어 -20℃ 내지 50℃의 범위일 수 있다.
화학식 IX, IXA, XI, XIA, XIII, XIIIA, XV, XVA, XVII, XVIIA, XXVII (예를 들어 용액 상 합성에 의해 수득가능함), XVII*, XVIIA*, XV*, XVA*, XIII*, XIIIA*, XI*, XIA*, IX* 및 IXA*의 아미노산은 공지되어 있거나 또는 이들은 당업계에 공지된 방법에 따라 합성될 수 있고/거나, 이들은 시판되고/거나, 이들은 당업계에 공지된 방법과 유사하게 합성될 수 있다.
또한 나머지 출발 물질, 예를 들어 화학식 XIX 또는 VII의 산, 또는 화학식 XXVII 또는 XXVIIA의 디펩티드는 공지되어 있거나 또는 이들은 당업계에 공지된 방법에 따라 합성될 수 있고/거나, 이들은 시판되고/거나, 이들은 당업계에 공지된 방법과 유사하게 합성될 수 있다.
예를 들어, 화학식 XIX의 합성단위체는 실시예 1 A(4) (이는 본 발명의 특정 실시양태임)에 기재된 바와 같이 또는 그와 유사하게 제조될 수 있다. 중간체 화합물 1의 합성 (반응식 1)은 문헌 [Tetrahedron 61, 1459-1480 (2005)]에 기재되어 있다.
디펩티드에 대한 커플링 반응에서는 유리 형태 또는 활성화된 형태의 상응하는 아미노산의 카르복실 기가 사용된다.
실시예: 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것이며, 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.
약어
aq. 수성
Boc/BOC tert-부톡시카르보닐
염수 물 중 염화나트륨 용액 (RT에서 포화)
Bzl 벤질
COMU 1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴아미노옥시-디메틸아미노-모르폴리노-카르베늄 헥사플루오로포스페이트
DCM 디클로로메탄
DIPEA N,N-디이소프로필에틸아민
DMAP 4-디메틸아미노피리딘
DMF N,N-디메틸포름아미드
Fmoc/FMOC 9-플루오레닐메톡시카르보닐
Et 에틸
HATU 2-(1H-7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 메탄아미늄
HFIP 헥사플루오로이소프로판올
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
HR-MS 고해상도 질량 분광분석법
IPA 이소프로필아세테이트
IPC 공정 중 조절
IR 적외선 분광분석법
IT 내부 온도
카이저(Kaiser) 시험
SPPS에서의 탈보호를 모니터링하기 위한 닌히드린에 기초한 테스트 (문헌 [E. Kaiser, R. L. Colescott, C. D. Bossinger, P. I. Cook, Analytical Biochemistry 1970, 34 595]); OK라고 언급된 경우, 이는 성공적인 탈보호를 의미한다.
me 메틸
MS 질량 분광분석법
MSNT 1-(메시틸렌-2-술포닐)-3-니트로-1,2,4-트리아졸
NMR 핵 자기 공명 분광분석법
PyBOP 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트
BOP 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트
RP 역상
RT/rt 실온
SPPS 고체 상 펩티드 합성
TBME tert-부틸-메틸에테르
TFA 트리플루오로아세트산
TEMPO 2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리디닐옥시, 자유 라디칼.
RBF 둥근 바닥 플라스크
아미노산 약어에 대해서는 상기 표를 참조한다.
화합물 명칭.
개방 사슬 올리고펩티드의 명칭은, 문헌 [Pure & Appl. Chem. 1984, 56, 595-624]에서 공개된 생화학 명명법 합동 위원회(Joint Commission on Biochemical Nomenclature) ("국제 순수 응용 화학 연합(International Union of Pure and Applied Chemistry)" 및 "국제 생화학 연합(International Union of Biochemistry)")의 권고에 따라 유래되었다. 이전에는, 단순 펩티드 명명 규칙이 이들 화합물에 대해 사용되었다. 이전 명칭은 괄호 안에 기재하였다.
실시예
1: 화합물 A의 합성
1A 합성단위체 1의 합성
(i) 별법 1:
반응식 1:
1A(1) 화합물 1의 제조
(S)-벤질 2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-5-히드록시펜타노에이트
화합물 1을 문헌 [R. K. Olson, K. Ramasamy, T. Emery, J. Org. Chem. 1984, 49, 3527]에 보고된 절차와 유사한 절차에 의해 제조하였다. BOC-Glu-OBzl (50 g, 148.2 mmol)을 테트라히드로푸란 (800 mL) 중에 용해시키고, 트리에틸아민 (47.3 g, 467.4 mmol)을 첨가하였다. 용액을 IT= -10℃로 냉각시켰다. IT = -10 내지 -15℃에서 온도를 유지하며, 에틸-클로로포르메이트 (51.8 g, 98% 순도, 467.8 mmol)를 서서히 첨가하였다. 이렇게 얻어진 현탁액을 추가의 시간 동안 교반하였다. IPC (HPLC)에서는 출발 물질이 사라진 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 0℃로 가온시키고, 물 (800 mL)을 0 내지 5℃에서 25 내지 30분 내에 첨가하였다. 혼합물의 2-상으로의 분리가 가시적이 되었다. 강력한 교반 하에, 0 내지 5℃에서 수소화붕소나트륨 (11.8 g, 299.4 mmol)을 10 부분으로 나누어 첨가하였다. 수소화붕소나트륨의 첨가 동안 수소 기체가 방출됨에 따라 주의를 기울였다. 반응 혼합물을 0 내지 5℃에서 추가의 5분 동안 교반하고, 온도를 30분 내에 20 내지 25℃로 상승시켰다. 온도 상승 동안 수소-기체 방출이 계속됨에 따라 주의를 요하였다. 반응 혼합물을 20 내지 25℃에서 15분 동안 교반한 후, 후처리하였다.
후처리를 위해, 물 (1250 mL)을 반응 혼합물에 첨가한 후, 에틸 아세테이트 (1250 mL)를 첨가하였다. 상을 분리하고, 수성 상을 에틸 아세테이트 (600 mL)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 염수 (2x 600 mL)로 세척하였다. 유기 층을 황산마그네슘에서 건조시키고, 용매를 감압 및 40 내지 45℃에서 증발시켜 50.8 g의 조 생성물을 수득하였다. HPLC 순도: 94 a%. 조 생성물을 이동 상으로서 헥산 분획/에틸 아세테이트 (7:3 내지 1:1)를 사용하여 실리카겔 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
수율: 40.85 g (85.2%). 순도: 98% (HPLC). MS 및 NMR에서는 목적한 구조가 확인되었다.
1A(2) 화합물 2의 제조: (S)-벤질 2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)5-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)펜타노에이트
이전 단계로부터의 알콜 (화합물 1) (40.3 g, 124.6 mmol)을 디메틸 포름아미드 (200 mL) 중에 용해시키고, 이미다졸 (12.8 g, 99.5% 순도, 186.9 mmol)을 첨가하였다. 용액이 형성될 때까지 (5 내지 10분) 혼합물을 실온에서 교반하였다. tert.-부틸-디페닐-실릴-클로라이드 (41.9 g, 98% 순도, 149.5 mmol)를 10분 내에 적가하고, 실온에서 추가의 15분 동안 교반을 계속하였다. IPC (HPLC)에서는 출발 물질 (알콜)이 사라진 것으로 나타났다. 후처리를 위해, 이소프로필 아세테이트 (400 mL)를 반응 혼합물에 첨가한 후, 반-포화 aq. 중탄산나트륨 용액 (400 mL)을 서서히 첨가하였다. 첨가가 발열성이고, 기체 방출이 일어남에 따라 주의를 기울였다. 상을 분리하고, 수성 상을 이소프로필 아세테이트 (400 mL)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 물 (400 mL)로 추출하였다. 유기 층을 황산마그네슘에서 건조시키고, 용매를 40 내지 45℃에서 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 밤새 진공 하에 25℃에서 건조시켜 83.25 g의 조 생성물을 무색 오일로서 수득하였다. HPLC 분석에서는 81 a%의 목적 생성물 및 18.6 a%의 상응하는 실라놀의 존재가 나타났다. 조 생성물을 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. 정제된 샘플의 NMR 및 HR-MS에서는 목적한 구조가 확인되었다.
1A(3) 화합물 4의 제조:
(S)-벤질 2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)-5-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)펜타노에이트
이전 단계로부터의 조 생성물 83.25 g (화합물 2의 70 g 이론적 수율에 상응함, 124.6 mmol)을 디클로로메탄 (650 mL) 중에 용해시키고, 트리플루오로아세트산 (358.8 g, 99% 순도, 3115 mmol)을 강력히 교반된 용액에 적가하였다. 30분 후 IPC (HPLC)에서는 BOC 보호기의 완전한 절단이 나타났다. 반응 혼합물 (투명한 용액)을 기계적 교반기를 갖는 6 L 4-바닥 플라스크로 옮기고, 디클로로메탄 1000 mL로 희석하였다. 수성 반-포화 탄산나트륨 용액 (1800 mL)을 강력히 교반된 용액에 서서히 첨가하였다. 탄산나트륨의 첨가 동안 강력한 기체 방출이 나타남에 따라 주의를 기울였다. 첨가 완료 후 수성 상의 pH: 9 내지 10. 반응 혼합물을 추가의 15분 동안 교반하고, 상을 분리하였다. 수성 상을 디클로로메탄 (1000 mL)으로 추출하고, 유기 층을 합하여 디클로로메탄 중 생성물의 용액을 수득하였다. 다음 단계를 위해 용액을 40 내지 45℃에서 감압 하에 ca. 650 mL의 최종 부피로 농축시켰다. HPLC에서는 80.5%의 화합물 3 및 19.5 a%의 실라놀 (용액 중)의 존재가 나타났다.
FMOC화를 위해, 포화 aq. 중탄산나트륨 용액 (650 mL)을 화합물 3의 강력히 교반된 용액에 서서히 첨가한 후, FMOC-클로라이드 (36.55 g, 97% 순도, 137 mmol)를 첨가하였다. FMOC-Cl의 첨가 동안 기체 방출이 나타남에 따라 주의를 기울였다. 교반을 15분 동안 실온에서 계속하였다. 유기 층의 IPC (HPLC)에서는 중간체 화합물 3이 사라지고, 화합물 4로 완전히 전환된 것으로 나타났다. 후처리를 위해, 층을 분리하고, 수성 상을 디클로로메탄 (650 mL)으로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 물 (650 mL)로 추출하였다. 유기 층을 황산마그네슘에서 건조시키고, 용매를 감압 하에 40 내지 45℃에서 제거하여 112.6 g의 조 생성물을 수득하였다.
조 생성물을 에탄올/이소프로판올/물 (89:5:6; 2400 mL) 중에 현탁시키고, 현탁액을 IT 50℃로 가열하여 용액을 수득하였다. 용액을 45℃로 냉각시키고, 시드 결정을 첨가하고, 온도를 1시간 내에 20 내지 25℃로 계속 냉각시켰다. ca. 40℃에서 결정화가 개시되었다. 현탁액을 20 내지 25℃에서 밤새 교반하고, 이어서 30분 내에 IT 0 내지 5℃로 냉각시키고, 교반을 추가의 2시간 동안 0 내지 5℃에서 계속하였다. 생성물을 여과에 의해 단리하고, 여과 케이크를 에탄올/이소프로판올/물 (89:5:6; 240 mL)로 세척하고, 감압 하에 건조시켜, 순수한 화합물 4 (HPLC에 따라, 100 a% 순도)를 수득하였다. 수율: 66 g (77.4%). 생성물은 MS 및 NMR에 의해 완전히 특징규명되었다.
모액은 HPLC에 따라 30 a%의 생성물 및 29 a%의 실라놀을 포함하는 발포체 30.6 g을 제공하였다.
1A(4) 화합물 4로부터 합성단위체 1의 제조:
(S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)-5-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)펜탄산
화합물 4 (66 g, 96.6 mmol)를 에탄올/이소프로필알콜/물 (89:5:6; 3000 mL) 중에 현탁시키고, 현탁액을 IT 45℃로 가열하여 용액을 수득하였다. 용액을 IT 30℃로 냉각시켰다. 아르곤으로 불활성화한 후, 팔라듐-촉매 (황산바륨 상 10%; 6.6 g)를 아르곤 스트림 하에 용액에 첨가하였다. 이어서, 생성물을 30 내지 35℃에서 대기압 약간 초과의 수소 압력 하에 수소화하였다. HPLC에 따르면 1.5h 후에 수소화가 완료되었다. 반응 혼합물을 셀룰로스 기재의 여과 조제 (셀플록(Cellflock) 40; 셀룰로스 기재의 여과 조제) 상에서 여과하고, 여과 조제를 에탄올/이소프로판올/물 (89:5:6; 600 mL)로 세척하였다. 감압 하에 45 내지 50℃에서 용매를 증발시켜 59.58 g의 발포체를 조 생성물로서 수득하였다. 조 생성물을 이동 상으로서 디클로로메탄/메탄올 95:5 내지 80:20을 사용하여 2 부분으로 실리카겔 상 크로마토그래피 (2x1 kg 실리카겔 60)에 의해 정제하였다. 생성물은 MS 및 NMR에 의해 완전히 특징규명되었다.
(ii) 별법 2:
반응식 2:
1A(5) 화합물 5를 통한 Fmoc-Glu-OBzl로부터의 화합물 4의 단일 반응기(one-pot) 제조:
Fmoc-Glu-OBzl (5 g, 10.88 mmol)을 테트라히드로푸란 (80 mL) 중에 용해시키고, 트리에틸아민 (3.3 g, 32.6 mmol)을 첨가하였다. 용액을 -15℃로 냉각시키고, 에틸 클로로포르메이트 (7.3 g, 67.27 mmol)를 -12℃에서 30분에 걸쳐 용액에 첨가하였다. 이렇게 얻어진 현탁액을 추가의 시간 동안 -10 내지 -15℃에서 교반하고, 온도를 0℃로 상승시켰다. 온도를 0℃에서 유지하면서, 반응 혼합물에 물 (80 mL)을 적가하였다. 수소화붕소나트륨 (총 0.805 g, 21.27 mmol)을 0℃에서 3 부분 (10분마다 1 부분)으로 나누어 첨가하고, 반응 혼합물을 추가의 1h 동안 0℃에서 교반하였다. 수소 기체가 방출됨에 따라 주의를 기울였다. 반응 혼합물을 물 (100 mL)로 희석하고, 이소프로필 아세테이트 (150 mL)로 추출하고, 층을 분리하였다. 수성 상을 이소프로필 아세테이트 (100 mL)로 다시 추출하고, 유기 층을 합하였다. 합한 유기 상을 반-포화 염화나트륨 용액 (2x 50 mL)으로 세척하고, 용액을 감압 하에 ca. 50 mL의 최종 부피로 농축시켰다. 농축된 용액을 투명-여과하고, 여과 잔류물을 이소프로필 아세테이트 (20 mL)로 세척하였다. 이렇게 얻어진 화합물 5의 용액을 둥근 바닥 플라스크로 옮기고, 이미다졸 (1.49 g, 21.89 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 Rt에서 15분 동안 교반하고, tert.-부틸-디페닐-실릴-클로라이드 (4.45 g, 16.19 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 15h 동안 rt에서 교반하였다. 후처리를 위해, 현탁액을 이소프로필 아세테이트 (20 mL)로 희석하고, 물 (3x50 mL)로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 용매를 감압 하에 증발시켜 9.95 g의 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 이동 상으로서 이소프로필 아세테이트/헥산 (2:8)을 사용하여 실리카겔 상 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 6.5 g의 고체를 수득하였고, 이를 헥산 중에 현탁시키고, 3h 동안 rt에서 교반하였다. 침전물을 여과에 의해 단리하고, 50℃에서 감압 하에 건조시켜, 5.6 g의 화합물 4를 수득하였다. 수율: 2 단계에 걸쳐 75%.
1A(6) 에틸-클로로포르메이트 대신에 이소프로필-클로로포르메이트를 사용하는 화합물 5를 통한 Fmoc-Glu-OBzl로부터의 화합물 4의 대안적 단일 반응기 제조:
Fmoc-Glu-OBzl (60 g, 130.579 mmol)을 테트라히드로푸란 (550 mL) 중에 용해시키고, 트리에틸아민 (40.8 g, 403.202 mmol)을 첨가하였다. 일부 침전물과 함께 탁한 용액이 얻어졌다. 이 탁한 용액/현탁액을 적하 깔때기로 옮기고, -35 내지 -30℃에서, 첨가 동안 이 온도를 유지하면서 4.5 L 반응기 내에서 테트라히드로푸란 (300 mL) 중의 이소부틸-클로로포르메이트 (54.96 g, 402.41 mmol)의 예비냉각된 용액에 첨가하였다. 적하 깔때기 내의 잔류물을 추가의 테트라히드로푸란 (50 mL)으로 세척하고, 반응 혼합물을 -35 내지 -30℃에서 추가의 2시간 동안 교반하였다. 물 (960 mL)을 45분 내에 반응 혼합물에 첨가하면서, 온도를 0℃까지 상승시켰다. 현탁액이 형성되었다. 수소화붕소나트륨 (14.4 g, 380.625 mmol)을 0℃에서 1h 내에 20 부분으로 나누어 첨가하고, 반응 혼합물을 추가의 시간 동안 0℃에서 교반하였다. 수소 기체가 방출됨에 따라 주의를 기울였다.
현탁액을 t-부틸-메틸에테르 (600 mL) 상에 붓고, 반응 플라스크를 물 (600 mL)로 세척하고, 이를 생성물 혼합물 (2-상)에 첨가하였다. 상을 분리하고, 수성 상을 t-부틸-메틸에테르 (600 mL)로 추출하고, 유기 상을 합하였다. 유기 상을 물 (2x600 mL)로 세척하고, 무수 황산마그네슘 (200 g)에서 건조시키고, 1 L의 최종 부피가 달성될 때까지 용매를 감압 하에 제거하였다. 용액을 디메틸-포름아미드 (600 g)로 희석하고, 400 mL의 최종 부피가 달성될 때까지 용매를 감압 하에 증발시켰다. 이렇게 얻어진 화합물 5의 용액을 둥근 바닥 플라스크로 옮겼다. 이미다졸 (14.4 g, 211.524 mmol)을 화합물 5의 DMF 용액에 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 rt에서 교반하였다. 마지막으로, TBDPS-Cl (39.6 g, 144.07 mmol)을 20분 동안 20 내지 25℃에서 적가하고, 반응 혼합물을 이 온도에서 추가의 시간 동안 교반하였다.
이어서, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (1200 mL) 상에 붓고, 혼합물을 물 (700 mL)로 추출하였다. 층을 분리하고, 유기 층을 물 (3x300 mL)로 세척하였다. 감압 하에 용매를 증발시켜 106 g의 조 생성물을 수득하였다.
조 생성물 (106 g)을 40 내지 50℃에서 에탄올/이소프로판올/물 (89:5:6; 1200 mL) 중에 용해시키고, 시드 결정 (0.5 g 화합물 4)을 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 17시간 동안 rt에서 교반하였다. 현탁액을 -20℃로 냉각시키고, 2시간 동안 -20℃에서 교반하였다. 생성물을 여과에 의해 단리하고, 여과 케이크를 용매 혼합물 에탄올/이소프로판올/물 (89:5:6; 3x200 mL)로 세척하고, 40℃에서 감압 하에 건조시켜, 66.5 g의 화합물 4 (2 단계에 걸쳐 74.6% 수율)를 수득하였다. HPLC에서는 생성물에 대해 >99 a% 순도가 나타났다.
추가의 생성물을 모액으로부터 단리할 수 있고 (용매 증발 후 34 g), 이는 HPLC에 따라 ca. 30 a% 화합물 4를 함유한다.
1B. SPPS에 의한 전구체 펩티드 1의 합성
전구체 펩티드 1: 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Tyr(tBu)Me-Ile-합성단위체 1-H)-Leu-OH
전구체 펩티드 1을 2종의 상이한 고체 지지체를 사용하여 제조하였다.
장비:
저부에 여과포 또는 소결 유리 여과판을 갖는 고체 상 합성 반응기. 질소 매니폴드는 여과포 또는 소결 유리 여과판 및 저부 밸브를 통해 반응기 내용물의 배출을 가능하게 한다.
1B(1) 트리틸-링커의 고체 지지체로의 커플링:
아미노메틸-폴리스티렌 수지 (1% 디비닐 벤젠으로 가교됨, 아미노메틸 기 1 mmol/g의 로딩) (공급원: 센 케미칼즈 아게(Senn Chemicals AG), 스위스 디엘스도르프 소재) 200 g을 교대로 여러 부분의 디메틸포름아미드 (1600 mL) 및 이소프로판올 (1600 mL)과 함께 교반하였다. 디메틸포름아미드로 2회 최종 세척 후, 수지를 미리 제조된 디메틸포름아미드 (1600 mL) 중 4-히드록시-디페닐메틸-벤조산 (91.3 g 300 mmol), 1-히드록시-벤조트리아졸 일수화물 (45.9 g, 300 mmol) 및 디이소프로필카르보디이미드 (75.7 g, 600 mmol)의 용액으로 처리하였다. 반응 혼합물을 1.5h 동안 교반하고, 닌히드린 시험을 수행하였다. 시험에서는 여전히 유리 아미노 기가 나타났고, 따라서 디이소프로필카르보디이미드 (7.6 g, 60 mmol)를 첨가하고, 반응물을 밤새 교반하였다. 아침에 추가의 닌히드린 시험은 음성이었고, 반응 혼합물을 여과하였다. 수지를 디메틸포름아미드 및 이소프로판올로 교대로 세척하였다. 수지를 진공 하에 건조시켜, 257 g의 건조 링커-수지를 수득하였다. 물질을 추가 분석 없이 다음 합성 단계에서 사용하였다.
1B(2) Fmoc-Leu-OH의 커플링
Fmoc-Leu-링커-수지의 제조
링커-수지 (190 g, 147.8 mmol)를 톨루엔 (1400 mL) 중에서 교반함으로써 팽윤시켰다. 용매를 여과하고, 톨루엔 (1400 mL) 및 아세틸 클로라이드 (53 mL, 1478 mmol)의 용액으로 대체하였다. 이 혼합물을 2h 동안 교반하고, 여과하고, 동일한 혼합물로 대체하고, 이를 추가의 2h 동안 교반한 후 여과하였다. 염소화 수지를 톨루엔으로 2회 및 디클로로메탄으로 3회 세척하였다.
둥근 바닥 플라스크 내에서, 디클로로메탄 (600 mL) 중 Fmoc-Leu-OH (104.8 g, 296 mmol) 및 N-메틸-모르폴린 (49 mL, 444 mmol)의 용액을 제조하였다. 이 용액을 수지에 첨가하고, 밤새 교반하였다. 아침에, 용액을 여과하고, 수지를 디클로로메탄 및 이소프로판올로 교대로 세척하였다. 수지를 진공 하에 건조시켜, 234.7 g의 건조 Fmoc-Leu-링커-수지를 수득하였다. Fmoc-기의 로딩은 0.787 mmol/g으로 측정되었고, 이는 185 mmol의 수율 (이론치의 125%)을 제공하였다. 외부 컨트랙터(contractor)에서의 아미노산 분석에서는 <0.1% D-Leu 거울상이성질체가 확인되었다.
1B(3) Fmoc-Thr-OH의 커플링
Fmoc-Thr-Leu-링커-수지의 제조
Fmoc-Leu-링커-수지 (140 g, 109 mmol)를 각각 30분 동안 연속적 2 부분의 디메틸포름아미드 (1100 mL) 중에서 교반함으로써 팽윤시켰다.
Fmoc 보호기를 각각 5분 및 15분 동안 디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘으로 2회 연속 세척하여 절단하였다. 수지를 디메틸포름아미드 및 이소프로판올로 교대로 수회 세척함으로써 세척하였다. 페놀프탈레인 및 물을 최종 세척 용액 샘플에 첨가하였다. 핑크색의 부재로부터 피페리딘의 성공적인 제거가 확인되었다.
수지를 테트라히드로푸란 (1200 mL)으로 3회 세척하여 다음 커플링 단계를 준비하였다.
둥근 바닥 플라스크 내에서, 테트라히드로푸란 (600 mL) 중 Fmoc-Thr-OH (112.1 g, 328 mmol), 히드록시벤조트리아졸 일수화물 (51.25 g, 334 mmol) 및 디이소프로필카르보디이미드 (51 mL, 655 mmol)의 용액을 제조하였다.
용액을 수지에 첨가하고, 즉시 pH를 검사하였다 (pH= 6.5). 반응 혼합물을 닌히드린 시험에서 완전한 반응이 나타날 때까지 1.5h 동안 교반하였다. 용액을 여과하고, 수지를 디메틸포름아미드 및 이소프로판올로 교대로 세척하였다. 수지의 작은 샘플을 건조시키고, 아미노산 분석하였고 (0.13% D-Leu, <0.1% D-Thr, <0.1% L-알로-Thr, <0.1% D-알로-Thr), 벌크 물질을 추가 건조 없이 다음 단계에 적용하였다.
1B(4) Fmoc-Gln(Trt)-OH의 커플링
Fmoc-Gln(Trt)-Thr-Leu-링커-수지의 제조
이전 단계로부터의 Fmoc-Thr-Leu-링커-수지를 각각 30분 동안 연속적 2 부분의 디메틸포름아미드 (1100 mL) 중에서 교반함으로써 팽윤시켰다.
Fmoc 보호기를 각각 5분 및 15분 동안 디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘으로 2회 연속 세척하여 절단하였다. 수지를 디메틸포름아미드 및 이소프로판올로 교대로 수회 세척함으로써 세척하였다. 페놀프탈레인 및 물을 최종 세척 용액 샘플에 첨가하였다. 핑크색의 부재로부터 피페리딘의 성공적인 제거가 확인되었다.
수지를 디메틸포름아미드 (1100 mL)로 3회 세척하여 다음 커플링 단계를 준비하였다.
둥근 바닥 플라스크 내에서, 디메틸포름아미드 (400 mL) 중 Fmoc-Gln(Trt)-OH (138.6 g, 226 mmol), HATU (86.2 g, 226 mmol) 및 에틸디이소프로필아민 (58.4 g, 452 mmol)의 용액을 제조하였다.
용액을 수지에 첨가하고, 즉시 pH를 검사하였다 (pH= 10). 반응 혼합물을 닌히드린 시험에서 완전한 반응이 나타날 때까지 3h 동안 교반하였다. 용액을 여과하고, 수지를 디메틸포름아미드 및 이소프로판올로 교대로 세척하였다.
수지를 진공 하에 건조시켜, 170 g의 건조 Fmoc-Gln(Trt)-Thr-Leu-링커-수지를 수득하였다. Fmoc-기의 로딩은 0.60 mmol/g으로 측정되었고, 이는 102 mmol의 수율 (이론치의 94%, 최종 2 단계에 걸쳐)을 나타내었다. 외부 컨트랙터에서의 아미노산 분석에서는 하기 값을 얻었다: (0.13% D-Leu, <0.1% D-Thr, <0.1% L-알로-Thr, <0.1% D-알로-Thr, <0.8% D-Gln).
1B(5) 이소부티르산의 커플링
이소부티릴-Gln(Trt)-Thr-Leu-링커-수지의 제조
Fmoc-Gln(Trt)-Thr-Leu-링커-수지 (169 g, 101 mmol)를 각각 30분 동안 연속적 2 부분의 디메틸포름아미드 (1300 mL) 중에서 교반함으로써 팽윤시켰다.
Fmoc 보호기를 각각 5분 및 15분 동안 디메틸포름아미드 (1300 mL) 중 20% 피페리딘으로 2회 연속 세척하여 절단하였다. 수지를 디메틸포름아미드 및 이소프로판올로 교대로 수회 세척함으로써 세척하였다. 페놀프탈레인 및 물을 최종 세척 용액 샘플에 첨가하였다. 핑크색의 부재로부터 피페리딘의 성공적인 제거가 확인되었다.
수지를 디메틸포름아미드 (1100 mL)로 3회 세척하여 다음 커플링 단계를 준비하였다.
둥근 바닥 플라스크 내에서, 디메틸포름아미드 (550 mL) 중 이소부티르산 (17.9 g, 203 mmol), PyBOP (105.5 g, 203 mmol) 및 에틸디이소프로필아민 (52.4 g, 406 mmol)의 용액을 제조하였다.
용액을 수지에 첨가하고, 즉시 pH를 검사하였다 (pH= 9.5). 반응 혼합물을 닌히드린 시험에서 완전한 반응이 나타날 때까지 2.5h 동안 교반하였다. 용액을 여과하고, 수지를 디메틸포름아미드 및 이소프로판올로 교대로 세척하였다.
배치를 건조 및 추가 분석 없이 다음 단계에 직접적으로 적용하였다.
1B(6) Fmoc-Ile-OH의 커플링 (에스테르화)
이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Fmoc)-Leu-링커-수지의 제조
이소부티릴-Gln(Trt)-Thr-Leu-링커-수지 (상기 단계로부터 습윤, 101 mmol)를 각각 20분 동안 연속적 3 부분의 디클로로메탄 (1200 mL) 중에서 교반함으로써 팽윤시켰다.
용매를 여과하고, MSNT (88 g, 297 mmol) 및 Fmoc-Ile-OH (105 g, 297 mmol)를 고체로서 첨가하였다. 디클로로메탄 (500 mL)을 첨가하고, 또한 디클로로메탄 (100 mL) 중 N-메틸 이미다졸 (18.2 g, 223 mmol) 및 에틸디이소프로필아민 (51.2 g, 396 mmol)의 용액을 첨가하였다. HPLC (공정 중 조절)에서 완전한 반응이 나타날 때까지 2h 동안 반응 혼합물을 교반하였다. 용액을 여과하고, 수지를 3 부분의 디클로로메탄, 3 부분의 디메틸포름아미드 및 3 부분의 이소프로판올로 연속하여 세척하였다. 수지를 진공 하에 건조시켜, 172 g의 건조 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Fmoc)-Leu-링커-수지를 수득하였다. Fmoc 로딩은 0.418 mmol/g으로 측정되었고, 따라서 72 mmol의 수율 (71%, 최종 2 단계에 걸쳐)을 나타내었다.
1B(7) Fmoc-N-메틸-Tyr(tBu)-OH의 커플링
이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Tyr(tBu)Me-Fmoc)-Leu-링커-수지
(이전 명칭: 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-N-me-Tyr(tBu)-Fmoc)-Leu-링커-수지)의 제조
이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Fmoc)-Leu-링커-수지 (172 g, 72 mmol)를 각각 30분 동안 연속적 2 부분의 디메틸포름아미드 (1300 mL) 중에서 교반함으로써 팽윤시켰다.
Fmoc 보호기를 각각 5분 및 15분 동안 디메틸포름아미드 (1400 mL) 중 20% 피페리딘으로 2회 연속 세척하여 절단하였다. 수지를 디메틸포름아미드 및 이소프로판올로 교대로 수회 세척함으로써 세척하였다. 페놀프탈레인 및 물을 최종 세척 용액 샘플에 첨가하였다. 핑크색의 부재로부터 피페리딘의 성공적인 제거가 확인되었다.
수지를 테트라히드로푸란 (1100 mL)으로 3회 세척하여 다음 커플링 단계를 준비하였다.
디메틸포름아미드 (700 mL) 중 Fmoc-N-메틸-Tyr(tBu)-OH (68.7 g, 144 mmol) 및 HATU (55.1 g, 144 mmol)의 용액을 제조하고, 펩티드-수지에 첨가한 후, 디메틸포름아미드 (100 mL) 중 에틸-디이소프로필아민 (37.5 g, 289 mmol)의 용액을 교반 하에 첨가하였다. 커플링 용액의 첨가 직후 및 반응 1h 후 pH 검사에서는 동일한 결과가 나타났다 (pH 10). 용액을 닌히드린 시험에서 완전한 반응이 나타날 때까지 2h 동안 교반하였다. 용액을 여과하고, 수지를 디메틸포름아미드 및 이소프로판올로 교대로 세척하였다.
배치를 건조 및 추가 분석 없이 다음 단계에 직접적으로 적용하였다.
1B(8) Fmoc-Ile-OH의 커플링
이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Tyr(tBu)Me-IleFmoc)-Leu-링커-수지
(이전 명칭: 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-N-me-Tyr(tBu)-Ile-Fmoc)-Leu-링커-수지)의 제조
습윤 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Tyr(tBu)Me-Fmoc)-Leu-링커-수지 (72 mmol)를 각각 30분 동안 연속적 2 부분의 디메틸포름아미드 (1200 mL 및 1300 mL) 중에서 교반함으로써 팽윤시켰다. Fmoc 보호기를 각각 5분 및 15분 동안 디메틸포름아미드 (1400 mL) 중 20% 피페리딘으로 2회 연속 세척하여 절단하였다. 수지를 디메틸포름아미드 및 이소프로판올로 교대로 수회 세척함으로써 세척하였다. 페놀프탈레인 및 물을 최종 세척 용액 샘플에 첨가하였다. 핑크색의 부재로부터 피페리딘의 성공적인 제거가 확인되었다.
수지를 디메틸포름아미드 (1100 mL)로 3회 세척하여 다음 커플링 단계를 준비하였다.
둥근 바닥 플라스크 내에서, 디클로로메탄 (440 mL) 및 디메틸포름아미드 (440 mL) 중 Fmoc-Ile-OH (103.9 g, 294 mmol) COMU (125.9 g, 294 mmol) 및 에틸디이소프로필아민 (76 g, 588 mmol)의 용액을 제조하였다.
용액을 수지에 첨가하고, 반응 혼합물을 20h 동안 교반하였다. 그 후, 닌히드린 시험을 수행하였고, 완전한 반응이 나타났다. 용액을 여과하고, 수지를 디메틸포름아미드 및 이소프로판올로 교대로 세척하였다.
수지를 진공 하에 건조시켜, 185.5 g의 건조 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Tyr(tBu)Me-Ile-Fmoc)-Leu-링커-수지를 수득하였다. Fmoc 기의 로딩은 0.40 mmol/g인 것으로 측정되었다. 따라서 74 mmol의 정량적 수율을 얻었다.
1B(9) 합성단위체 1의 커플링 및 최종 Fmoc 보호기의 절단:
이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Tyr(tBu)Me-Ile-합성단위체 1-H)-Leu-링커-수지
(이전 명칭: 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-N-me-Tyr-Ile-합성단위체 1-H)-Leu-링커-수지)의 제조
이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Tyr(tBu)Me-Ile-Fmoc)-Leu-링커-수지 (30 g, 12 mmol)을 각각 30분 동안 연속적 2 부분의 디메틸포름아미드 (240 mL 및 250 mL) 중에서 교반함으로써 팽윤시켰다.
Fmoc 보호기를 각각 5분 및 15분 동안 디메틸포름아미드 (250 mL) 중 20% 피페리딘으로 2회 연속 세척하여 절단하였다. 수지를 디메틸포름아미드 및 이소프로판올로 교대로 수회 세척함으로써 세척하였다. 페놀프탈레인 및 물을 최종 세척 용액 샘플에 첨가하였다. 핑크색의 부재로부터 피페리딘의 성공적인 제거가 확인되었다.
수지를 디메틸포름아미드 (250 mL)로 3회 세척하여 다음 커플링 단계를 준비하였다.
둥근 바닥 플라스크 내에서, 디메틸포름아미드 (120 mL) 중 합성단위체 1 (14.6 g, 24.6 mmol), PyBOP (12.85 g, 24.6 mmol) 및 에틸디이소프로필아민 (6.4 g, 49.2 mmol)의 용액을 제조하였다.
용액을 수지에 첨가하고, 반응 혼합물을 3h 동안 교반하였다. 그 후, 닌히드린 시험에서 완전한 반응이 확인되었다. 용액을 여과하고, 수지를 디메틸포름아미드 및 이소프로판올로 교대로 세척하였다.
생성된 펩티드-수지를 각각 30분 동안 연속적 2 부분의 디메틸포름아미드 (250 mL) 중에서 교반함으로써 팽윤시켰다.
Fmoc 보호기를 각각 5분 및 15분 동안 디메틸포름아미드 (250 mL) 중 20% 피페리딘으로 2회 연속 세척하여 절단하였다. 펩티드-수지를 디메틸포름아미드 및 이소프로판올로 교대로 수회 세척함으로써 세척하였다.
마지막으로 펩티드-수지를 디클로로메탄 (250 mL)으로 3회 세척하여 펩티드의 절단을 준비하였다.
1B(10) 고체 지지체로부터 전구체 펩티드 1의 절단
이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Tyr(tBu)Me-Ile-합성단위체 1-H)-Leu-OH (= 전구체 펩티드 1)
(이전 명칭: 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-N-me-Tyr(tBu)-Ile-합성단위체 1-H)-Leu-OH)의 제조
습윤 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Tyr(tBu)Me-Ile-합성단위체 1-H)-Leu-링커-수지에, 아세트산 (125 mL) 및 디클로로메탄 (125 mL)의 혼합물을 첨가하고, 현탁액을 2h 동안 교반하였다. 현탁액을 여과하고, 둥근 바닥 플라스크 내에서 여액을 수집하였다 (여액 1). 수지를 디클로로메탄 (250 mL)으로 2회 세척하고, 세척물을 여액 1과 합하였다.
수지를 추가의 2h 동안 신선한 부분의 아세트산 (125 mL) 및 디클로로메탄 (125 mL)으로 처리하였다. 현탁액을 여과하고, 둥근 바닥 플라스크 내에서 여액을 수집하였다 (여액 2). 수지를 디클로로메탄 (250 mL)으로 2회 세척하고, 세척물을 여액 2와 합하였다.
아세트산 (200 mL) 및 디클로로메탄 (50 mL)을 수지에 첨가하고, 현탁액을 밤새 교반하였다. 현탁액을 여과하고, 여액을 여액 3으로서 수집하였다.
3개 여액을 별도로 후처리하여 절단 방법의 효과를 평가하였다. 회전 증발기에서 여액을 농축시키고, 잔류 아세트산을 3 부분의 톨루엔 (100 mL)으로 공비 증류에 의해 제거하였다. 이어서, 오일 잔류물을 고 진공 하에 동결건조기에서 건조시켰다. 수율: 여액 1: 12.5 g, 여액 2: 2.1 g, 여액 3: 0.3 g.
조 물질, 전구체 펩티드 1를 RP-크로마토그래피에 의해 정제하고, 분획물을 회전 증발기에서 농축시키고, 농축물을 동결 건조시켰다. 순도: 98.8%. 수율: 8.5 g (48%, 최종 2 단계 동안). 생성물을 1H-NMR, 13C-NMR 및 HR-MS에 의해 특징규명하였다. 스펙트럼에서 목적한 구조가 확인되었다. NMR 스펙트럼에서 여러 형태의 존재가 나타났다.
염소화 수지를 사용한 전구체 펩티드 1의 제2 SPPS-합성
1B(11) 제1 아미노산 (Fmoc-Leu-OH)의 고정
2-클로로트리틸 클로라이드 수지 (30 g, L= 1.2 mmol/g; 머크 노바바이오켐(Merck Novabiochem) 855017)를 10분 동안 건조 DCM 240 ml로 팽윤시키고, 이어서 용매를 배출시키고, 고체 상 반응기를 연질 질소 스트림 하에 밀폐 유지시켰다. 그 동안, 둥근 바닥 플라스크 내에서 Fmoc-Leu-OH (42.6 g, 120.8 mmol) 및 100 ml의 건조 1,4-디옥산을 혼합하였다. 용매를 진공 하에 45℃에서 증발시키고, 이어서 제2 부분의 1,4-디옥산을 첨가하였다. 용매를 무색의 오일 잔류물이 얻어질 때까지 다시 진공 하에 45℃에서 증발시켰다. 이어서, 이 오일 잔류물에 순차적으로 건조 DCM (155 mL) 및 DIPEA (40.4 mL)를 첨가하고, 용액을 예비-팽윤된 수지에 한꺼번에 첨가하고, 이어서 5분 후에 제2 부분의 DIPEA (16.5 mL)를 첨가하였다. 현탁액을 2h 동안 교반하고, 반응 매질을 배출시켰다. 가능한 미반응 클로라이드를 켄칭시키기 위해, 240 ml의 DCM/MeOH/DIPEA (70/15/15, v/v)의 켄칭 용액을 첨가하고, 혼합물을 10분 동안 교반하였다. 0.95 mmol/g의 로딩이 측정되었다.
Fmoc 절단을 위한 일반적 프로토콜:
예비-팽윤된 수지에 DMF 중 25% 피페리딘의 용액 240 ml를 첨가하고, 현탁액을 5분 동안 교반하고, 이어서 반응 혼합물을 여과에 의해 제거하고, 이어서 제2 부분의 동일한 피페리딘 용액을 첨가하고, 현탁액을 15분 동안 교반하고, 이어서 용매를 여과에 의해 제거하였다.
수지를 건조시키며 세척하였다:
수지를 하기와 같이 세척하였다:
250 ml의 DMF (6x2분)
250 ml의 IPA (3x2분)
250 ml의 TBME (6x2분)
수지를 밤새 진공 하에 40℃에서 건조시켜 35.7 g의 H-Leu-수지를 수득하였다.
1B(12): H-Thr-Leu-수지의 SPPS 합성
이전 단계로부터의 H-Leu-수지 (30 g)를 30분 동안 270 ml의 DMF로 팽윤시키고, 이어서 용매를 배출시켰다.
둥근 바닥 플라스크 (RBF) 내에서, Fmoc-Thr-OH (25.0 g, 73.2 mmol), BOP (40.4 g, 91.5 mmol) 및 DMF (250 mL)를 혼합하고, 혼합물을 2분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA (18.9 g, 146.4 mmol)를 첨가하였다. 이렇게 얻어진 혼합물을 예비-팽윤된 펩티드-수지에 한꺼번에 첨가하고, 반응 혼합물을 2.5h 동안 교반하였다. 카이저 시험은 양성이었고, 따라서 제2 커플링을 이전에 기재된 조건에 따라 수행하였다. 1.0h 후, 카이저 시험은 음성이었고, 반응이 완료된 것으로 여겨졌으며, 반응 매질을 여과에 의해 제거하였다.
수지를 하기와 같이 세척하였다:
250 ml DMF (4x2분)
250 ml IPA (3x2분)
250 ml TBME (5x2분).
수지를 밤새 진공 하에 40℃에서 건조시켜, 52.2 g의 Fmoc-Thr-Leu-수지를 수득하여 Fmoc-절단 단계를 준비하였다.
Fmoc 절단:
수지 (52.2 g)를 272 ml의 DMF 중에 현탁시키고, 1.0h 동안 교반하고, 이어서 용매를 여과에 의해 제거하였다.
Fmoc 보호기를 1B(11)에 기재된 것과 동일한 방식으로 절단하고, 펩티드-수지를 하기와 같이 세척하였다:
250 ml DMF (6x2분)
250 ml IPA (3x2분)
250 ml TBME (6x2분)
수지를 밤새 진공 하에 40℃에서 건조시켜, 39.9 g의 H-Thr-Leu-수지를 수득하였다.
1B(13): H-Gln(Trt)-Thr-Leu-수지의 SPPS 합성
이전 단계로부터의 H-Thr-Leu-수지 (39.9 g)을 30분 동안 270 ml의 DMF로 팽윤시키고, 이어서 용매를 배출시켰다.
RBF 내에서, Fmoc-Gln(Trt)-OH (44.7 g, 73.2 mmol), BOP (40.4 g, 91.5 mmol) 및 250 ml의 DMF를 혼합하였다. 혼합물을 2분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA (18.9 g, 146.4 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 예비-팽윤된 H-Thr-Leu-수지에 한꺼번에 첨가하고, 반응 혼합물을 2.5h 동안 교반하였고, 카이저 시험은 음성이었고, 이어서 반응이 완료된 것으로 여겨졌으며, 반응 매질을 여과에 의해 제거하였다.
수지를 하기와 같이 세척하였다:
250 ml DMF (4x2분)
250 ml IPA (3x2분)
250 ml DMF (4x2분)
습윤 펩티드-수지를 임의의 추가 조작 없이 Fmoc-절단 단계에 사용하였다.
Fmoc 절단:
fmoc 보호기를 단계 1B(11)에 기재된 절차에 따라 절단하였다. 이어서, 수지를 하기와 같이 세척하였다:
250 ml DMF (4x2분)
250 ml IPA (3x2분)
250 ml TBME (5x2분)
수지를 밤새 진공 하에 40℃에서 건조시켜, 54.4 g의 H-Gln(Trt)-Thr-Leu-수지를 수득하였다.
1B(14): 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr-Leu-수지의 SPPS 합성
이전 단계로부터의 펩티드-수지 (54.4 g)를 30분 동안 270 ml의 DMF로 팽윤시키고, 이어서 용매를 배출시켰다.
RBF 내에서, 이소부티르산 (6.4 g, 73.2 mmol), PyBop (38.1 g, 73.2 mmol) 및 230 ml의 DMF를 혼합하고, 혼합물을 2분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA (28.3 g, 219.6 mmol)를 첨가하였다. 용액을 예비-팽윤된 펩티드-수지에 한꺼번에 첨가하고, 반응 혼합물을 1.5h 동안 교반하였다. 카이저 시험은 음성이었고, 이어서 반응이 완료된 것으로 여겨졌으며, 반응 매질을 여과에 의해 제거하였다.
수지를 하기와 같이 세척하였다:
250 ml DMF (4x2분)
250 ml IPA (3x2분)
250 ml TBME (5x2분).
수지를 밤새 진공 하에 40℃에서 건조시켜, 55.8 g의 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr-Leu-수지를 수득하였다.
1B(15): 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-H)-Leu-수지의 SPPS 합성
이전 단계로부터의 펩티드-수지 (55.8 g)를 1.0h 동안 250 ml의 건조 DCM 중에 현탁시켰다. 이어서, 용매를 여과에 의해 제거하고, 습윤 펩티드-수지를 연질 질소 스트림 하에 유지시키고, 온도를 0 내지 5℃로 조정하였다.
RBF 내에서, Fmoc-Ile-OH (51.7 g, 146.4 mmol), 및 150 ml의 건조 디옥산을 혼합하였다. 용매를 오일 잔류물이 나타날 때까지 진공 하에 45℃에서 증발시켰다. 증류 공정을 반복하고, 이어서 잔류물에 150 ml의 건조 DCM을 첨가하고, 용액을 -10℃로 냉각시키고, MSNT (43.3 g, 146.4 mmol)를 첨가하고, 현탁액을 3분 동안 교반하고, 이어서 N-메틸-이미다졸 (14.2 g, 173 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 2분 동안 교반하고, 용액을 10분 내에 상기에서 제조된 펩티드-수지에 적가하였다. 첨가 완료 후, 현탁액을 질소 대기 하에 2.0h 동안 교반하였다.
수지를 하기와 같이 세척하였다:
250 ml DMC (4x2분)
250 ml DMF (3x2분)
습윤 펩티드-수지를 임의의 추가 조작 없이 Fmoc-절단 단계에서 사용하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 1B(11)에 기재된 일반적 프로토콜에 따라 절단하였다.
Fmoc 절단을 수행한 후, 수지를 하기와 같이 세척하였다:
250 ml DMF (5x2분)
250 ml IPA (3x2분)
250 ml TBME (5x2분)
수지를 밤새 진공 하에 40℃에서 건조시켜, 57.2 g의 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(O-Ile-H)-Leu-수지를 수득하였다.
1B(16): 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(O-Ile-Tyr(tBu)MeN)-Leu-수지의 SPPS 합성
이전 단계로부터의 펩티드-수지 (57.2 g)를 팽윤을 위해 30분 동안 250 ml DMF 중에 현탁시키고, 이어서 용매를 여과에 의해 제거하였다.
RBF 내에서, Fmoc-NMeTyr(tBu)-OH (52.0 g, 109.8 mmol), HATU (41.7 g, 109.8 mmol) 및 230 ml의 DMF를 혼합하고, 혼합물을 2분 동안 교반하였다. 이어서, DIPEA (28.3 g, 219.6 mmol)를 첨가하고, 용액을 2.0분 동안 교반하였다. 이어서, 생성된 용액을 예비-팽윤된 펩티드-수지에 첨가하였다.
반응 혼합물을 1.0h 동안 교반하고, 카이저-시험을 수행하였다. 카이저 시험은 음성이었다. 반응이 완료된 것으로 여겨졌고, 반응 매질을 여과에 의해 제거하였다.
펩티드-수지를 하기와 같이 세척하였다:
250 ml DMF (4x2분)
250 ml IPA (1x2분)
습윤 펩티드-수지를 임의의 추가 조작 없이 Fmoc-절단 단계에서 사용하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 1B(11)에서 사용된 일반적 프로토콜에 따라 절단하였다.
Fmoc 절단을 수행한 후, 수지를 하기와 같이 세척하였다:
250 ml DMF (5x2분)
250 ml IPA (1x2분)
250 ml DMF (5x2분)
수득된 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Tyr(tBu)Me-H)-Leu-수지를 건조시키지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
1B(17): 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Tyr(tBu)Me-Ile-H)-Leu-수지의 SPPS 합성
이전 단계로부터의 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Tyr(tBu)Me-H)-Leu-수지를 30분 동안 270 ml의 DMF로 팽윤시키고, 이어서 용매를 배출시켰다.
둥근 바닥 플라스크 내에서, Fmoc-Ile-OH (38.8 g, 109.8 mmol), HATU (41.7 g, 109.8 mmol) 및 DMF (250 mL)를 혼합하고, 혼합물을 2분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA (28.3 g, 219.6 mmol)를 첨가하였다. 용액을 예비-팽윤된 펩티드-수지에 한꺼번에 첨가하고, 반응 혼합물을 2.0h 동안 교반하였다. 클로라닐 시험은 양성이었고, 이어서 Fmoc-Ile-OH와의 제2 커플링을 수행하였다. 제2 커플링 3h 후, 펩티드-수지를 여과에 의해 단리하였다.
펩티드-수지를 하기와 같이 세척하였다:
250 ml DMF (4x2분)
250 ml IPA (3x2분)
250 ml DMF (4x2분)
습윤 펩티드-수지를 임의의 추가 조작 없이 Fmoc-절단 단계에서 사용하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 1B(11)에 기재된 것과 동일한 방식으로 제거하고, 펩티드-수지를 하기와 같이 세척하였다.
250 ml DMF (5x2분)
250 ml IPA (3x2분)
250 ml TBME (4x2분).
펩티드-수지를 밤새 진공 하에 40℃에서 건조시켜, 67.0 g의 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Tyr(tBu)Me-Ile-H)-Leu-수지를 수득하였다.
1B(18): 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Tyr(tBu)Me-Ile-합성단위체 1-H)-Leu-수지의 SPPS 합성
이전 단계로부터의 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Tyr(tBu)Me-Ile-H)-Leu-수지 (33.5 g)를 30분 동안 150 ml의 DMF 중에 현탁시키고, 이어서 용매를 배출시켰다. RBF 내에서, Fmoc-합성단위체 1-OH (34.3 g, 57.8 mmol), PyBop (30.0 g, 57.7 mmol) 및 113 ml의 DMF를 혼합하고, 혼합물을 2분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA (14.9 g, 115.2 mmol)를 첨가하였다. 용액을 예비-팽윤된 펩티드-수지에 한꺼번에 첨가하고, 반응 혼합물을 2.0h 동안 교반하였다. 반응 매질을 여과에 의해 제거하였다.
펩티드-수지를 하기와 같이 세척하였다:
150 ml DMF (4x2분)
150 ml IPA (3x2분)
150 ml DMF (4x2분)
습윤 펩티드-수지를 임의의 추가 조작 없이 Fmoc-절단 단계에서 사용하였다.
Fmoc 절단:
Fmoc 보호기를 1B(11)에서와 동일한 방식으로, 그러나 150 ml의 피페리딘 용액을 사용하여 제거하고, 펩티드-수지를 하기와 같이 세척하였다.
150 ml DMF (5x2분)
150 ml IPA (3x2분)
150 ml TBME (4x2분)
펩티드-수지를 밤새 진공 하에 40℃에서 건조시켜, 36.0 g의 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Tyr(tBu)Me-Ile-합성단위체 1-H)-Leu-수지를 수득하였다.
1B(19): 대안적인 SPPS 합성: 고체 지지체로부터 펩티드의 절단
이전 단계로부터의 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Tyr(tBu)Me-Ile-합성단위체 1-H)-Leu-수지 (29.75 g)를 1.0h 동안 350 ml의 건조 DCM으로 처리하고, 용매를 여과에 의해 제거하고, 이어서 350 ml의 DCM 중 30% v/v HFIP의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 10분 동안 교반하고, 이어서 용매를 여과에 의해 제거하고, 따로 유지하였다. 습윤 수지에 제2 부분의 동일한 HFIP 용액을 첨가하고, 용액을 10분 동안 교반하고, 이어서 용매를 여과에 의해 제거하고, 이전 용액과 함께 모았다. 수지를 DCM (350 ml)으로 3회 세척하고, 세척물을 절단 용액과 합하였다.
합한 용액을 오일 잔류물이 나타날 때까지 진공 하에 농축시키고, 이어서 200 ml의 톨루엔을 첨가하고, 용매를 오일 잔류물이 얻어질 때까지 감압 하에 45℃에서 증발시켰다. 350 ml의 헥산을 첨가하고, 현탁액을 2h 동안 교반하였다. 용매를 여과에 의해 제거하고, 여과 케이크를 헥산 (50 ml)으로 세척하고, 습윤 케이크를 밤새 진공 하에 35℃에서 건조시켜 19.24 g의 조 전구체 펩티드 1 (= 이소부티릴-Gln(Trt)-Thr(Ile-Tyr(tBu)Me-Ile-합성단위체 1-H)-Leu-OH)을 수득하였다.
조 전구체 펩티드 1 (6.0 g)의 부분을 RP-크로마토그래피에 의해 정제하고, 생성물 분획을 회전 증발기 내에서 농축시키고, 농축물을 동결 건조시켜 2.2 g의 순수한 전구체 펩티드 1을 99.3 %a 순도로 수득하였다. 부 분획을 함유하는 생성물을 유사하게 처리하여 추가의 1.25 g의 보다 덜 순수한 전구체 펩티드를 71.4 %a 순도로 수득하였다. 조 전구체 펩티드 1의 전량 (19.24 g)을 외삽 추정할 때, 이는 주 분획으로부터의 7.05 g의 순수한 전구체 펩티드 1 및 부 분획으로부터의 추가의 4.01 g 전구체 펩티드 1 (71.4 %a 순도)에 상응한다.
1C 화합물 8의 용액 상 합성
반응식 3
1C(1) 화합물 6의 합성
(S)-N1-((3S,6S,9S,12S,15S,18S,19R)-6-(4-(tert-부톡시)벤질)-3,9-디((S)-sec-부틸)-12-(3-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)프로필)-15-이소부틸-7,19-디메틸-2,5,8,11,14,17-헥사옥소-1-옥사-4,7,10,13,16-펜타아자시클로노나데칸-18-일)-2-이소부티르아미도-N5-트리틸펜탄디아미드
아세토니트릴 (120 mL) 중의 전구체 펩티드 1 (1.9 g, 1.28 mmol)의 탁한 용액/현탁액을 90분 동안 35℃에서 아세토니트릴 (100 mL) 중 HATU (972 mg, 2.56 mmol) 및 DMAP (468.6 mg, 3.84 mmol)의 교반된 혼합물에 첨가하였다. 적하 깔때기를 아세토니트릴 (30 mL)로 세척하였다. 현탁액의 첨가 후 IPC (HPLC)에서는 전구체 펩티드의 부재 및 고리화의 완료가 나타났다. 후처리를 위해, 용매를 ca. 50 mL의 최종 부피까지 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 이소프로필 아세테이트 (250)로 희석하였다. 유기 상을 물 (2x100 mL)로 추출하고, 용매를 감압 하에 증발시켜 2.3 g의 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 이동 상으로서 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카겔 상 플래쉬-크로마토그래피에 의해 정제하여 1.79 g (1.22 mmol)의 화합물 6을 발포체로서 수득하였다. 수율: 95%. 생성물을 1H-NMR, 13C-NMR 및 HR-MS에 의해 특징규명하였다. 스펙트럼에서 목적한 구조가 확인되었다. NMR 스펙트럼은 여러 형태의 존재를 나타내었다.
화합물 6의 제2 합성예 (15 g 스케일)
t-부틸-메틸-에테르 (750 mL) 중 전구체 펩티드 1 (15.0 g)의 용액을 1.5h 동안 0℃에서 아세토니트릴 (375 mL) 중 DMAP (2.80 g) 및 HATU (5.87 g)의 예비-냉각된 용액에 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 추가의 30분 동안 실온에서 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 t-부틸-메틸-에테르 (750 mL)로 희석하고, 반-포화 aq. NaCl-용액 (1500 mL) 상에 부었다. 상을 분리하고, 유기 상을 다시 반-포화 aq. NaCl-용액 (1500 mL)으로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 용매를 감압 하에 ca. 175 mL의 최종 부피로 부분 증발시켰다. 이 용액을 이동 상으로서 t-부틸-메틸-에테르를 사용하여 실리카겔 (225 g 실리카겔을 갖는 컬럼) 상에서 여과하였다. 용매를 증발시키고 진공 하에 40 내지 45℃에서 건조시켜, 화합물 6을 HPLC에 따라 97.53% 순도로 수득하였다. 수율: 14.19 g (95.7%).
1C(2) 화합물 7의 합성
(S)-N1-((3S,6S,9S,12S,15S,18S,19R)-6-(4-(tert-부톡시)벤질)-3,9-디((S)-sec-부틸)-12-(3-히드록시프로필)-15-이소부틸-7,19-디메틸-2,5,8,11,14,17-헥사옥소-1-옥사-4,7,10,13,16-펜타아자시클로노나데칸-18-일)-2-이소부티르아미도-N5-트리틸펜탄디아미드
화합물 6 (1.79 g, 1.22 mmol)을 테트라히드로푸란 (60 mL) 중에 용해시키고, 실온에서 Et3N(HF)3 (6.62 g, 41.1 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 8.5시간 동안 교반하고, 이어서 이소프로필 아세테이트 (200 mL)로 희석하고, 생성된 용액/현탁액을 강력히 교반된 포화 aq. NaHCO3-용액에 서서히 첨가하였다. 유기 상을 분리하고, 물 (100 mL)로 추출하였다. 용매를 감압 하에 증발시켜 1.86 g의 조 생성물을 수득하였고, 이를 이동 상으로서 에틸 아세테이트/이소프로판올 (95:5)을 사용하여 실리카겔 상 플래쉬-크로마토그래피에 의해 정제하여 1.24 g (1.00 mmol)의 화합물 7을 수득하였다. 수율: 82%.
생성물을 IR, NMR 및 MS에 의해 완전히 특징규명하였다. 스펙트럼에서 목적한 구조가 확인되었다.
화합물 7의 제2 제조예 (14 g 스케일)
화합물 6 (14.0 g, 9.537 mmol)을 테트라히드로푸란 (220 mL) 중에 용해시키고, t-부틸-메틸-에테르 (116 mL)를 첨가하였다. 용액을 Et3N(HF)3 (23.05 g)으로 10분 내에 서서히 첨가하여 처리하였다. 반응 혼합물을 24h 동안 실온에서 교반하였다. 후처리를 위해, 반응 혼합물을 t-부틸-메틸-에테르 (570 mL)로 희석하고, 혼합물을 반-포화 aq. NaHCO3-용액 (632 mL) 상에 부었다. 2상 혼합물을 30분 동안 교반하고, 상을 분리하였다. 유기 상을 물 (280 mL)로 추출하였다. 두 수성 상을 t-부틸-메틸-에테르 (380 mL)로 추출하고, 유기 상을 합하였다. 유기 상을 무수 MgSO4 (8.0 g)에서 건조시키고, 용매를 ca. 100 mL의 최종 부피로 감압 하에 부분 증발시켰다. 톨루엔 (140 mL)을 첨가하고, 용매를 다시 80 mL의 최종 부피로 증발시켰다. 이 용액을 t-부틸-메틸-에테르 (70 mL)로 희석하고, 생성물을 30분 동안 헵탄 (140 mL)을 서서히 첨가하여 침전시켰다. 형성된 현탁액을 50 내지 55℃로 가열하고, 30분 동안 이 온도에서 교반하였다. 이어서, 현탁액을 30분 내에 0℃로 냉각시키고, 0℃에서 2h 동안 교반하고, 생성물을 여과에 의해 단리하였다. 생성물, 백색 침전물을 진공 하에 건조시켜 11.08 g의 화합물 7을 수득하였다 (94.5% 수율). 생성물의 HPLC에서는 97 a% 순도가 나타났다.
1C(3) 화합물 8의 합성 (구조에 대해 반응식 4 참조)
(S)-N1-((3S,6S,9S,12S,15S,18S,19R)-6-(4-(tert-부톡시)벤질)-3,9-디((S)-sec-부틸)-15-이소부틸-7,19-디메틸-2,5,8,11,14,17-헥사옥소-12-(3-옥소프로필)-1-옥사-4,7,10,13,16-펜타아자시클로노나데칸-18-일)-2-이소부티르아미도-N5-트리틸펜탄디아미드
화합물 7 (1.2 g, 0.98 mmol)을 테트라히드로푸란 (190 mL) 및 디메틸 술폭시드 (62 mL)의 혼합물 중에 용해시켰다. 1-히드록시-1,2-벤즈아이오독솔-3(1H)-온 1-옥시드 (IBX) (2.42 g, 45% g/ g, 3.9 mmol)를 첨가하고, 용액을 ca. 4.5시간 동안 교반하고, 그 후 HPLC에서는 출발 물질 (화합물 7)이 사라진 것으로 나타났다. 이어서, 반응 혼합물을 포화, aq. NaHCO3-용액 (300 mL) 상에 붓고, 디클로로메탄 (2x300 mL)으로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 물 (2x300 mL)로 세척하였다. 용매를 감압 하에 증발시켜 2.31 g의 조 생성물을 발포체로서 수득하였다. 조 생성물을 에틸 아세테이트/이소프로판올 (95:5)을 사용하여 실리카겔 상 플래쉬-크로마토그래피에 의해 정제하여, LC-MS에서 목적한 질량을 갖는 2종 이상의 생성물을 포함하는, 1.16 g의 생성물 혼합물을 수득하였다. 생성물 혼합물을 그대로 다음 단계에서 사용하였다.
화합물 8의 제2 합성예 (10 g 스케일)
화합물 7 (10.0 g, 8.13 mmol)을 테트라히드로푸란 (127 mL) 및 디메틸술폭시드 (42 mL) 중에 용해시켰다. 이 용액에, 1-히드록시-1,2-벤즈아이오독솔-3(1H)-온 1-옥시드 (IBX) (15.18 g, 45% m/m, 24.4 mmol)를 실온에서 강력한 교반 하에 첨가하였다. 반응 혼합물을 16h 동안 실온에서 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 aq. NaHCO3-용액 (500 mL) 상에 붓고, 에틸 아세테이트 (250 mL)를 첨가하였다. 2상 혼합물을 30분 동안 교반하고, 층을 분리하였다. 유기 상을 반-포화 aq. NaCl-용액 (250 mL)으로 세척하고, 층을 분리하였다. 수층을 에틸 아세테이트 (250 mL)로 추출하고, 유기 상을 합하였다. 합한 유기 상을 무수 황산마그네슘에서 건조시키고, 용매를 부분 증발시켜, ca. 50 g의 용액을 수득하였다. 이 용액을 이동 상으로서 에틸 아세테이트/메탄올 (98:2 v/v)을 사용하여 실리카겔 컬럼 (100 g 실리카겔) 상에서 플래슁하였다. 이렇게 얻어진 생성물 용액 (537.4 g)을 톨루엔 (135 mL)으로 처리하고, 생성된 용액을 45℃에서 감압 하에 용매의 부분 증발에 의해 112 g의 최종 중량으로 농축시켰다. 생성된 용액을 0℃로 냉각시키고, 헵탄 (135 mL)을 30분 동안 첨가하였다. 이렇게 얻어진 현탁액을 1h 동안 0℃에서 교반하고, 생성물을 여과에 의해 단리하고, 헵탄 (2x30 mL)으로 세척하였다. 마지막으로 생성물을 진공 하에 45℃에서 밤새 건조시켜 8.824 g의 화합물 8 및 그의 헤미아미날-이성질체의 혼합물을 수득하였다. 수율: 88.4%.
1D 화합물 A의 합성
(S)-N1-((2S,5S,8S,11R,12S,15S,18S,21R)-2,8-디-(S)-sec-부틸-21-히드록시-5-(4-히드록시벤질)-15-이소부틸-4,11-디메틸-3,6,9,13,16,22-헥사옥소-10-옥사-1,4,7,14,17-펜타아자비시클로[16.3.1]도코산-12-일)-2-이소부티르아미도펜탄디아미드
반응식 4:
화합물 8 (2.0 g)을 디클로로메탄 (400 mL) 중에 용해시키고, 용액을 0℃로 냉각시켰다. 트리플루오로아세트산 (115.9 g)을 0℃에서 교반된 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 4h 동안 0℃에서 교반하였다. 디클로로메탄 (400 mL)을 이 온도에서 첨가한 후, 물 (20 g)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고, 추가의 5시간 동안 실온에서 교반을 계속하였다. 후처리를 위해, 반응 혼합물을 물 (800 mL) 중 아세트산나트륨 (165.1 g)의 교반된 용액에 첨가하고, 에틸 아세테이트 (400 mL)를 첨가하여 용액을 수득하였다. 상부 층 (수성 상)을 제거하고, 하부 유기 상 (디클로로메탄 상)을 물 (2x200 mL)로 세척하였다. 수층을 에틸 아세테이트 (200 mL)로 추출하고, 유기 층을 합하였다. 용매를 감압 하에 제거하여 조 화합물 A를 5- 및 6-고리 이성질체의 혼합물로서 수득하였고 (반응식 5 참조), 트리틸 알콜 및 다른 반응 부산물이 수반되었다.
조 생성물을 이동 상으로서 아세토니트릴/물 구배를 이용하여 실리카 크로마실(Silica Kromasil) 100-10-C8 상 RP-크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 증발시켜 아세토니트릴을 제거하고, 침전물을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 용매를 감압 하에 제거하여 0.895 g의 화합물 A를 수득하였다; 수율: 59.1%. 생성물을 NMR 및 MS에 의해 완전히 특징규명하였고, 생성물의 스펙트럼은 발효로부터의 화합물 A와 동일하였다.
화합물 A의 제2 합성예 (8.5 g 스케일)
화합물 8 (8.5 g, 6.924 mmol)을 디클로로메탄 (595 mL) 중에 용해시키고, 용액을 0℃로 냉각시켰다. 디클로로메탄 (127.5 mL) 중 트리플루오로아세트산 (127.5 mL)의 용액을 0 내지 5℃의 온도에서 유지하면서 냉각된 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 5.5h 동안 0℃에서 교반하고, 디클로로메탄 (850 mL)으로 희석한 후, 물 (42.5 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고, 17.5h 동안 실온에서 교반하였다. 후처리를 위해, 반응 혼합물을 교반된, 수성 아세트산나트륨 (722 g 물 중 169 g 아세트산나트륨) 및 에틸 아세테이트 (700 mL)의 2상 혼합물 상에 부었다. 상을 분리하고, 유기 상을 다시 수성 아세트산나트륨 용액 (722 g 물 중 169 g 아세트산나트륨)으로 세척하였다. 층을 분리하고, 유기 상을 물 (2x850 mL)로 세척하였다. 개개의 수성 상을 에틸 아세테이트 (700 mL)로 추출하고, 유기 층을 합하였다. 유기 층을 무수 황산마그네슘에서 건조시키고, 용매를 40 내지 45℃에서 감압 하에 부분 증발시켜 187 g의 묽은 현탁액을 수득하였다. 헵탄 (187 g)을 15분 내에 첨가하고, 형성된 현탁액을 0℃로 냉각시켰다. 현탁액을 1h 동안 0℃에서 교반하고, 생성물을 여과에 의해 단리하였다. 조 생성물을 진공 하에 40℃에서 건조시켜 5.65 g의 조 화합물 A를 수득하였다. 조 수율: 87.8%.
0.96 g의 조 생성물을 이동 상으로서 아세토니트릴/물의 구배를 이용하여 실리카 크로마실 100-10-C8 상 RP-크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 증발시켜 아세토니트릴을 제거하고, 침전물을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 용매를 감압 하에 부분 제거하여 40 g의 용액을 수득하였다. 헵탄 (40 g)을 30분 동안 실온에서 교반된 용액에 첨가하고, 생성된 현탁액을 실온에서 추가의 2h 동안 교반하였다. 생성물을 여과에 의해 단리하고, 에틸 아세테이트/헵탄 (1:1, 2x10 mL)으로 세척하였다. 생성물을 진공 하에 40 내지 45℃에서 16h 동안 건조시켜 0.702 g의 화합물 A를 수득하였다. RP-크로마토그래피 및 침전 후 수율: 64%.
실시예
2: 화합물 B (
노스토펩틴
BN920
)의 합성
(S)-2-아세트아미도-N1-((1S,2S,5S,8S,11R,12S,15S,18S,21R)-2-벤질-21-히드록시-5-(4-히드록시벤질)-15-이소부틸-8-이소프로필-4,11-디메틸-3,6,9,13,16,22-헥사옥소-10-옥사-1,4,7,14,17-펜타아자비시클로[16.3.1]도코산-12-일)펜탄디아미드
반응식 5:
2A SPPS에 의한 전구체 펩티드 2의 합성:
Ac-Gln(Trt)-Thr(Val-Tyr(tBu)Me-Phe-합성단위체 1-H)-Leu-OH
장비:
250 ml 유리-반응기와 프릿 및 자동 용매 전달, 시약 진탕 및 흡인을 위한 매니폴드를 갖는 펩티드-합성기.
2A(1) Fmoc-Thr-Leu-Trt-텐타겔-S의 합성
Fmoc-Leu-Trt-텐타겔-S-수지 (18.7 g 로딩 0.37 mmol/g (랩 폴리메레 게엠베하(Rapp Polymere GmBH, 독일 튀빙겐 소재))를 30분 동안 진탕시켜 DMF 중에 팽윤시켰다.
Fmoc 보호기를 각각 5분 및 15분 동안 DMF 중 20% 피페리딘으로 2회 연속 처리하여 절단하였다. 수지를 DMF 및 이소프로판올로 교대로 수회 세척함으로써 세척하고, 최종 세척 단계에 대한 페놀프탈레인 및 물 첨가 후 핑크색의 부재로 염기의 완전한 제거를 검사하였다.
4.7 g의 Fmoc-Thr-OH, 5.26 g의 HATU 및 1.8 g의 DIPEA를 50 ml의 DMF 중에 용해시켰다. 5분 교반 후, 추가의 1.8 g의 DIPEA를 첨가하였다. pH (>11) 검사 후, 혼합물을 탈보호된 수지에 첨가하고, 2h 동안 진탕시켰다. 수행된 카이저 시험은 OK였고, 수지를 DMF 및 이소프로판올로 교대로 수회 세척함으로써 세척하였다. 건조 후 수지 중량은 19.01 g이였다. 작은 샘플을 절단하고, HPLC에 의해 검사하였다. 단일 주 피크는 성공적인 전환을 나타내었다.
2A(2) Fmoc-Gln(Trt)-Thr-Leu-Trt-텐타겔-S의 합성
19.01 g의 Fmoc-Thr-Leu-Trt-텐타겔-S-수지 (6.6 mmol)를 DMF 중에 예비-팽윤시키고, Fmoc 보호기를 각각 5분 및 15분 동안 DMF 중 20% 피페리딘으로 2회 연속 처리하여 절단하였다. 수지를 DMF 및 이소프로판올로 교대로 수회 세척함으로써 세척한 후, 최종 세척 단계에 대한 페놀프탈레인 및 물 첨가 후 핑크색의 부재로 염기의 완전한 제거를 검사하였다.
8.07 g의 Fmoc-Gln(Trt)-OH, 5.01 g의 HATU 및 3.4 g의 DIPEA를 50 ml의 DMF 중에 용해시켰다. pH (>11) 검사 후, 혼합물을 탈보호된 수지에 첨가하고, 1.5h 동안 진탕시켰다. 수행된 카이저 시험은 OK였고, 수지를 DMF 및 이소프로판올로 교대로 수회 세척함으로써 세척하였다. 생성된 수지를 하기 다음 단계에서 직접 사용하였고, 단지 작은 샘플만을 절단하고, HPLC에 의해 검사하였다. 단일 주 피크는 성공적인 전환을 나타내었다.
2A(3) Ac-Gln(Trt)-Thr-Leu-Trt-텐타겔-S의 합성
상기로부터의 Fmoc-Gln(Trt)-Thr-Leu-Trt-텐타겔-S 수지를 10분 동안 DMF 중에서 진탕시켜 DMF 중에 재-팽윤시켰다. Fmoc 보호기를 각각 5분 및 15분 동안 DMF 중 20% 피페리딘으로 2회 연속 처리하여 절단하였다. 수지를 DMF 및 이소프로판올로 교대로 수회 세척함으로써 세척하였다. 페놀프탈레인 및 물을 최종 세척 용액의 샘플에 첨가하였다. 핑크색의 부재로부터 피페리딘의 성공적인 제거가 확인되었다.
0.774 g의 아세트산, 6.707 g의 PyBOP 및 3.33 g의 DIPEA를 50 ml의 DMF 중에 용해시켰다. pH (>11) 검사 후, 혼합물을 탈보호된 수지에 첨가하고, 2.5h 동안 진탕시켰다. 수행된 카이저 시험은 OK였고, 수지를 DMF 및 이소프로판올로 교대로 수회 세척함으로써 세척하였다. 생성된 수지를 하기 다음 단계에서 직접 사용하였고, 단지 작은 샘플만을 절단하고, HPLC에 의해 검사하였다. 단일 주 피크는 성공적인 전환을 나타내었다.
2A(4) Ac-Gln(Trt)-Thr(Val-Fmoc)-Leu-Trt-텐타겔-S (이전 명칭: Ac-Gln(Trt)-Thr(Val-Fmoc)-Leu-Trt-텐타겔-S)의 합성 (측쇄 에스테르화)
상기로부터의 Ac-Gln(Trt)-Thr-Leu-Trt-텐타겔-S 수지를 10분 동안 DMF 중에서 진탕시켜 DMF 중에 재-팽윤시켰다.
8.7 g의 Fmoc-Val-OH 및 8.3 g의 DIPEA를 25 ml의 DCM 중에 용해시켰다. 이와 병행하여 2.76 g의 MSNT를 추가의 25 ml의 DCM 중에 용해시켰다. 두 용액을 합하고, 3분 예비-활성화 후 펩티드 수지에 첨가하고, 2h 동안 진탕시켰다. 수지를 DMF 및 이소프로판올로 교대로 수회 세척함으로써 세척하였다. 생성된 수지를 하기 다음 단계에서 직접 사용하였고, 단지 작은 샘플만을 절단하고, HPLC에 의해 검사하였다. 단일 주 피크는 성공적인 전환을 나타내었다.
2A(5) Ac-Gln(Trt)-Thr(Val-Tyr(tBu)Me-Fmoc)-Leu-Trt-텐타겔-S (이전 명칭: Ac-Gln(Trt)-Thr(Val-N-me-Tyr(tBu)-Fmoc)-Leu-Trt-텐타겔-S)의 합성
상기로부터의 Ac-Gln(Trt)-Thr(Val-Fmoc)-Leu-Trt-텐타겔-S 수지를 10분 동안 DMF 중에서 진탕시켜 DMF 중에 재-팽윤시켰다.
Fmoc 보호기를 각각 5분 및 15분 동안 DMF 중 20% 피페리딘으로 2회 연속 처리하여 절단하였다. 수지를 DMF 및 이소프로판올로 교대로 수회 세척함으로써 세척하였다. 페놀프탈레인 및 물을 최종 세척 용액의 샘플에 첨가하였다. 핑크색의 부재로부터 피페리딘의 성공적인 제거가 확인되었다.
6.1 g의 Fmoc-N-Me-Tyr(tBu)-OH, 4.8 g의 HATU 및 3.3 g의 DIPEA를 50 ml의 DMF 중에 용해시켰다. pH (>11) 검사 후, 혼합물을 탈보호된 수지에 첨가하고, 2.5h 동안 진탕시켰다. 수행된 카이저 시험은 OK였고, 수지를 DMF 및 이소프로판올로 교대로 수회 세척함으로써 세척하였다. 생성된 수지를 하기 다음 단계에서 직접 사용하였고, 단지 작은 샘플만을 절단하고, HPLC에 의해 검사하였다. 단일 주 피크는 성공적인 전환을 나타내었다.
2A(6) Ac-Gln(Trt)-Thr(Val-Tyr(tBu)Me-Phe-Fmoc)-Leu-Trt-텐타겔-S (이전 명칭: Ac-Gln(Trt)-Thr(Val-N-me-Tyr(tBu)-Phe-Fmoc)-Leu-Trt-텐타겔-S)의 합성
상기로부터의 Ac-Gln(Trt)-Thr(Val-Tyr(tBu)Me-Fmoc)-Leu-Trt-텐타겔-S 수지를 10분 동안 DMF 중에서 진탕시켜 DMF 중에 재-팽윤시켰다.
Fmoc 보호기를 각각 5분 및 15분 동안 DMF 중 20% 피페리딘으로 2회 연속 처리하여 절단하였다. 수지를 DMF 및 이소프로판올로 교대로 수회 세척함으로써 세척하였다. 페놀프탈레인 및 물을 최종 세척 용액의 샘플에 첨가하였다. 핑크색의 부재로부터 피페리딘의 성공적인 제거가 확인되었다.
9.66 g의 Fmoc-Phe-OH, 9.48 g의 HATU 및 6.4 g의 DIPEA를 100 ml의 DMF 중에 용해시켰다. pH (>11) 검사 후, 혼합물을 탈보호된 수지에 첨가하고, 2h 동안 진탕시켰다. 수행된 카이저 시험은 OK였고, 수지를 DMF 및 이소프로판올로 교대로 수회 세척함으로써 세척하였다. 생성된 수지를 하기 다음 단계에서 직접 사용하였고, 단지 작은 샘플만을 절단하고, HPLC에 의해 검사하였다. 단일 주 피크는 성공적인 전환을 나타내었다.
2A(7) Ac-Gln(Trt)-Thr(Val-Tyr(tBu)Me-Phe-합성단위체 1-H)-Leu-OH (이전 명칭: Ac-Gln(Trt)-Thr(Val-N-me-Tyr(tBu)-Phe-합성단위체 1-H)-Leu-OH) (= 전구체 펩티드 2)의 합성
상기로부터의 Ac-Gln(Trt)-Thr(Val-Tyr(tBu)Me-Phe-Fmoc)-Leu-Trt-텐타겔-S 수지를 10분 동안 DMF 중에서 진탕시켜 DMF 중에 재-팽윤시켰다.
Fmoc 보호기를 각각 5분 및 15분 동안 DMF 중 20% 피페리딘으로 2회 연속 처리하여 절단하였다. 수지를 DMF 및 이소프로판올로 교대로 수회 세척함으로써 세척하였다. 페놀프탈레인 및 물을 최종 세척 용액의 샘플에 첨가하였다. 핑크색의 부재로부터 피페리딘의 성공적인 제거가 확인되었다.
6.77 g의 합성단위체 1, 5.9 g의 PyBOP 및 2.95 g의 DIPEA를 100 ml의 DMF 중에 용해시켰다. pH (>11) 검사 후, 혼합물을 탈보호된 수지에 첨가하고, 2h 동안 진탕시켰다. 수행된 카이저 시험은 OK였고, 수지를 DMF 및 이소프로판올로 교대로 수회 세척함으로써 세척하였다. HPLC 검사를 위해 작은 샘플을 취한 후, Fmoc 보호기를 각각 5분 및 15분 동안 DMF 중 20% 피페리딘으로 2회 연속 처리하여 절단하였다. 수지를 DMF 및 이소프로판올로 교대로 수회 세척함으로써 세척하였다. 마지막으로 수지를 DCM으로 2회 세척하였다. 수지로부터 합성된 펩티드의 절단은 DCM 중 80%의 아세트산의 혼합물 중에서 밤새 진탕시킴으로써 달성되었다. 생성된 펩티드 용액을 여과하고, 수지를 DCM으로 2회 세척하였다. 합한 여액을 증발시키고, 마지막으로 구배 시스템을 이용하여 RP-크로마토그래피에 의해 정제하였다. 수집된 분획을 HPLC에 의해 분석하고, 순수한 분획을 모으고, 증발시키고, 마지막으로 동결건조시켰다.
수율: 3.54 g (42%) 전구체 펩티드 2.
2B 화합물 B의 합성
(S)-2-아세트아미도-N1-((1S,2S,5S,8S,11R,12S,15S,18S,21R)-2-벤질-21-히드록시-5-(4-히드록시벤질)-15-이소부틸-8-이소프로필-4,11-디메틸-3,6,9,13,16,22-헥사옥소-10-옥사-1,4,7,14,17-펜타아자비시클로[16.3.1]도코산-12-일)펜탄디아미드
2B(0) 화합물 9의 합성
(S)-2-아세트아미도-N1-((3S,6S,9S,12S,15S,18S,19R)-9-벤질-6-(4-(tert-부톡시)벤질)-12-(3-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)프로필)-15-이소부틸-3-이소프로필-7,19-디메틸-2,5,8,11,14,17-헥사옥소-1-옥사-4,7,10,13,16-펜타아자시클로노나데칸-18-일)-N5-트리틸펜탄디아미드
전구체 펩티드 2의 락탐화로부터 화합물 B의 수득을, 화합물 6의 제조에 대해 기재된 것과 유사한 조건 하에 수행하였다. 생성물, 화합물 9를 IR, NMR 및 MS에 의해 완전히 특징규명하였다. 스펙트럼에서 목적한 구조가 확인되었다.
2B(1) 화합물 10의 합성
(S)-2-아세트아미도-N1-((3S,6S,9S,12S,15S,18S,19R)-9-벤질-6-(4-(tert-부톡시)벤질)-12-(3-히드록시프로필)-15-이소부틸-3-이소프로필-7,19-디메틸-2,5,8,11,14,17-헥사옥소-1-옥사-4,7,10,13,16-펜타아자시클로노나데칸-18-일)-N5-트리틸펜탄디아미드
탈실릴화(de-silylation) 반응으로부터 화합물 10의 수득을, 화합물 7의 제조에 대해 기재된 것과 유사한 조건 하에 수행하였다. 생성물을 IR, NMR 및 MS에 의해 완전히 특징규명하였다. 스펙트럼에서 목적한 구조가 확인되었다.
2B(2) 화합물 11 (알데히드)의 합성
(S)-2-아세트아미도-N1-((3S,6S,9S,12S,15S,18S,19R)-9-벤질-6-(4-(tert-부톡시)벤질)-15-이소부틸-3-이소프로필-7,19-디메틸-2,5,8,11,14,17-헥사옥소-12-(3-옥소프로필)-1-옥사-4,7,10,13,16-펜타아자시클로노나데칸-18-일)-N5-트리틸펜탄디아미드
화합물 10의 산화로부터 화합물 11의 수득을, 화합물 8의 제조에 대해 기재된 것과 유사한 조건 하에 수행하였다. LC-MS 분석에서는 목적한 질량을 갖는 여러 피크가 나타났고, 이는 알데히드, 5-고리-헤미아미날 및 6-고리-헤미아미날의 혼합물의 존재를 나타내었다. 혼합물을 그대로 다음 단계에서 사용하였다.
2B(3) 화합물 11로부터 화합물 B (노스토펩틴 BN920)의 합성
(S)-2-아세트아미도-N1-((1S,2S,5S,8S,11R,12S,15S,18S,21R)-2-벤질-21-히드록시-5-(4-히드록시벤질)-15-이소부틸-8-이소프로필-4,11-디메틸-3,6,9,13,16,22-헥사옥소-10-옥사-1,4,7,14,17-펜타아자비시클로[16.3.1]도코산-12-일)펜탄디아미드
화합물(들) 11 (1.0 g, 0.82 mmol)을 디클로로메탄 (200 mL) 중에 용해시켰다. 트리플루오로아세트산 (57.8 g)을 15 내지 25℃에서 10분 동안 첨가하고, 반응 혼합물을 45시간 동안 실온에서 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 디클로로메탄 (200 mL)으로 희석하고, 물 (10 mL)을 첨가하였다. 추가의 24시간 동안 실온에서 교반을 계속하였다. 반응 혼합물을 20분 내에 포화 aq. NaHCO3-용액 (700 mL) 상에 붓고, 디클로로메탄 (500 mL), 이소프로판올 (50 mL) 및 물 (500 mL)을 순차적으로 첨가하였다. 층을 분리하고, 수성 층을 디클로로메탄 (500 mL) 중 이소프로판올 (50 mL)의 용액으로 추출하였다. 층을 다시 분리하고, 수성 층을 디클로로메탄 (5x300 mL)으로 수회 추출하였다. 유기 층을 합하고, 용매를 감압 하에 증발시켜 목적한 노스토펩틴 BN920을 트리틸 알콜 및 다른 반응 부산물과 함께 포함하는 조 생성물 혼합물 (1.0 g)을 수득하였다. 조 생성물을 이동 상으로서 디클로로메탄/이소프로판올을 사용하여 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 순수한 노스토펩틴 BN920 (212 mg, 97 %(A) 순도)을 수득하였다. 보다 덜 순수한 분획의 수집으로부터 추가의 402 mg의 생성물을 90 %(A) 순도로 수득하였다. 모든 분획으로부터의 수율: 614 mg (81%). 생성물을 IR, NMR 및 MS에 의해 완전히 특징규명하였다. 스펙트럼에서 목적한 구조가 확인되었다.
실시예
3: 평형의 이동
반응식 4는 화합물 A의 탈수물 형태의 존재를 나타낸다. 본 발명에서, 이는 하기 반응식에 도시된 탈수물 형태의 수화를 위한 간단한 절차를 이용하여 화합물 A로 용이하게 (다시) 전환될 수 있다는 것이 발견되었다.
반응식 6:
이는 임의의 합성 유형에서 (본 개시내용에서와 같은 화학적 합성의 경우 또는 WO 2009/024527에서와 같은 발효를 이용하여) 화합물 A의 수율 향상을 가능하게 한다.
예를 들어, ahp-서브유닛을 포함하는 화합물, 예를 들어 실시예 1에서의 화합물 A에서 산 민감성 보호기의 절단 동안, 다량의 상응하는 탈수 부산물의 형성이 나타난다. 이 부산물은 통상적으로 예를 들어 크로마토그래피에 의해 분리되고 처리된다. 이는 이 단계에서 가치있는 생성물의 손실 및 낮은 수율을 초래한다. 예를 들어, 화합물 8의 산화 생성물(들)에 산성 조건을 적용하여 트리틸- 및 t-부틸 보호기를 제거하는 경우 (반응식 4), 상당량의 화합물-A-탈수물이 부산물로서 형성된다. 산 농도 및 반응 조건에 따라, 화합물-A-탈수물은 심지어 이러한 생성물 혼합물에서 주 생성물로서 형성될 수 있다.
예를 들어, 산화 단계 후에 트리플루오로아세트산/디클로로메탄 (5:95 v/v)을 사용하여 보호기를 제거하는 경우, 화합물 A/화합물 A-탈수물 비율 (1:2)이 나타났다 (실시예 1).
따라서, 탈수물 부산물을 목적한 생성물로 전환시키는 방법이 연구되었다. 본 발명에서, 이는 잘 한정된 조건 하에 물의 존재 하에 생성물 혼합물의 산 촉매화된 평형에 의해 달성될 수 있는 것으로 나타났다. 물을 실시예 1의 반응 혼합물에 첨가한 후, 실온에서 19h 동안 교반하여, 화합물 A/화합물 A-탈수물 비율이 ca. 96:4인 생성물 혼합물을 수득하였다. 따라서, 산-촉매화된 탈보호 단계 (반응식 4) 후에 반응 혼합물에 물을 첨가함으로써, 화합물 A/화합물 A-탈수물 비율이 물이 없는 조건 하에 (1:2)로부터 물 첨가 및 평형 후에 (96:4)로 변하였다.
산성 탈보호 조건 하에서의 화합물 A로부터 화합물 A-탈수물의 형성은, DCM 중 트리플루오로아세트산을 사용한 순수한 화합물 A에서 화합물 A-탈수물로의 전환에 의해 확인되었다. 화합물 A를 2h 동안 실온에서 DCM 중 33% (v/v) TFA로 처리하여 화합물 A-탈수물/화합물 A의 생성물 혼합물을 HPLC에 따라 78:22의 비율로 수득하였다. 수분 흡수제, 예컨대 분자 체를 반응 혼합물에 첨가한 경우, 탈수는 >95% 전환율로 조정될 수 있었다. 따라서, 분자 체의 존재 하에 TFA/DCM의 1:2 혼합물 중에서 순수한 화합물 A를 교반하여 탈수-생성물을 정량적 조 수율 및 ca. 96 면적% HPLC 순도로 수득하였다 (실시예 3B). 여전히 ca. 4 면적%의 화합물 A가 조 생성물 중에 존재하였다.
실시예 3B로부터의 화합물 A-탈수물의 화합물 A로의 전환은 화합물 A-탈수물을 트리플루오로아세트산 및 물의 존재 하에 디클로로메탄 중에서 교반함으로써 나타났다 (실시예 3 C). 이렇게 얻어진 생성물은 HPLC에 따라 95.6 면적%의 화합물 A 및 단지 4.4 면적%의 화합물 A-탈수물을 포함하였다.
반응식 7:
실시예 3에 대한 실험적 상세사항
3A:
산화로부터의 23 mg의 생성물 혼합물 (화합물 8 및 이로부터 유도된 시클릭 아미날)을 DCM (5.7 mL) 중에 용해시키고, TFA (0.3 mL)를 강력한 교반 하에 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을, IPC (HPLC)에서 보호기의 완전한 절단이 나타날 때까지 5h 동안 실온에서 교반하였다. 추가의 부산물과 함께, 화합물 A 및 화합물 A-탈수물이 1:2의 비율로 반응 혼합물 중에 존재하였다. 반응 혼합물을 DCM (5.7 mL)으로 희석하고, 강력히 교반된 용액을 물 (0.23 mL)로 처리하였다. 실온에서 19h 교반 시간 후 HPLC에서, 화합물 A/화합물 A-탈수물에 대해 96:4의 비율이 나타났다.
후처리를 위해, 반응 혼합물을 물 (23 mL) 중 아세트산나트륨 (1.62 g)의 용액 상에 붓고, 에틸 아세테이트 (35 mL)를 첨가하였다. 상을 분리하고, 유기 층을 물 (2x25 mL)로 추출하였다. 수층을 에틸 아세테이트 (35 mL)로 추출하고, 유기 층을 합하였다. 용매를 감압 하에 증발시켜 22 mg의 조 생성물을 발포체로서 수득하였다. 조 생성물을 에틸 아세테이트/메탄올 (95:5 내지 90:10)을 사용하여 실리카겔 상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 A를 96.8 면적%의 순도로 수득하였고, 1.8 면적%의 5-고리 이성질체가 수반되었다.
3B:
화합물 A (250 mg)를 디클로로메탄 (10 mL) 중에 용해시키고, 트리플루오로아세트산 (5 mL)을 첨가한 후, 분자 체 (1 g)를 첨가하였다. 1h 후 IPC (HPLC)에서는 화합물 A/화합물 A-탈수물에 대해 17:83의 비율이 나타났다. 반응 혼합물을 총 72h 동안 실온에서 교반하였다. 후처리를 위해, 분자 체를 여과에 의해 제거하고, 용액을 포화 aq. NaHCO3-용액 상에 부었다. 수성 층을 에틸 아세테이트 (50 mL)로 추출하였다. 유기 상을 물 (20 mL)로 세척하고, 용매를 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 진공 하에 건조시켜, 정량적 수율 (245 mg)의 조 생성물을 발포체로서 수득하였다. 조 생성물의 HPLC 분석에서는 화합물 A/화합물 A-탈수물이 ca. 4:96 면적%의 비율로 존재하는 것으로 나타났다.
화합물 A-탈수물의 구조를 1H-NMR에 의해 확인하였다.
3C:
실시예 2로부터의 화합물 A-탈수물 (110 mg)을 DCM (20 mL) 중에 용해시켰다. TFA (1 g) 및 물 (0.2 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 20h 동안 실온에서 교반하였다. 후처리를 위해, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (50 mL) 상에 붓고, 에틸 아세테이트 용액을 포화 aq. NaHCO3-용액 (50 mL)으로 추출하였다. 유기 층을 물 (20 mL)로 추출하고, 용매를 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트/이소프로판올 9:1 (20 mL) 중에 용해시키고, 용액을 0.45 마이크로미터 필터 상에서 투명 여과하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 진공 하에 45℃에서 건조시켜 100 mg의 조 생성물을 수득하였다. HPLC 분석에서는 ca. 95.6 면적%의 화합물 A 및 ca. 4.4 면적%의 화합물 A-탈수물이 존재하는 것으로 나타났다.
Claims (22)
- 하기 화학식 II의 화합물을 선택적으로 탈보호하여 하기 화학식 III의 화합물을 얻고,
유리 히드록실 기를 산화 조건 하에 반응시켜 하기 화학식 IV의 화합물을 형성하고,
잔류 보호기를 제거하여 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 염을 얻고,
임의로, 화학식 I의 유리 화합물을 염으로, 화학식 I의 화합물의 염을 화학식 I의 화합물의 상이한 염 또는 화학식 I의 유리 화합물로 전환시키고/거나 화학식 I의 화합물의 탈수 유사체를 상응하는 화학식 I의 화합물로 전환시키는 것
을 포함하는, 화학식 I의 시클릭 뎁시펩티드 화합물 또는 그의 염의 제조 방법 또는 공정.
<화학식 I>
상기 식에서,
A1은 말단 카르복시 또는 카르바모일 기를 갖는 아미노산, 특히 아스파라긴 또는 글루타민의 2가 모이어티이고, 화학식 I에서 우측에서 카르보닐을 통해 분자의 나머지 부분에 결합되거나, 또는 C1-8-알카노일 또는 인산화된 히드록시-C1-8-알카노일이고;
X는 A1의 N을 통해 결합되고 아실이거나, 또는 A1이 C1 -8-알카노일 또는 인산화된 히드록시-C1 -8-알카노일인 경우에는 부재하고;
R2는 C1 -8-알킬, 특히 메틸이고;
R3은 아미노산, 특히 류신, 이소류신 또는 발린의 측쇄이고;
R5는 아미노산, 바람직하게는 페닐알라닌, 류신, 이소류신 또는 발린의 측쇄이고;
R6은 히드록시 아미노산, 특히 티로신의 측쇄이고;
R7은 아미노산, 바람직하게는 아미노산 류신, 이소류신 또는 발린의 측쇄이고;
Y는 수소 또는 C1 -8-알킬이다.
<화학식 II>
상기 식에서, Prot는 보호기이고, Y는 화학식 I의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, X*, A1 *, R2 *, R3 *, R5 *, R6 * 및 R7 *는 각각 화학식 I에서의 X, A1, R2, R3, R5, R6 및 R7에 상응하되, 단 이들 모이어티 상의 반응성 관능기는 이들이 원치않는 부반응에 참여할 수 있는 경우 적어도 보호된 형태로 존재한다.
<화학식 III>
<화학식 IV>
상기 식에서, X*, A1 *, R2 *, R3 *, R5 *, R6 * 및 R7 *는 상기에 정의된 의미를 갖는다. - 제1항에 있어서, 화학식 IV의 화합물이 상응하는 출발 아미노산 및 측쇄 전구체로부터 고체 상 펩티드 합성 및 용액 상 합성의 조합에 의해 합성된 것인 방법 또는 공정.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1항에 나타낸 화학식 II의 화합물의 합성을 위해, 하기 화학식 VI의 화합물을 하기 화학식 VII의 산 또는 그의 반응성 유도체와 반응시키고;
<화학식 VI>
(상기 식에서, Prot는 보호기이고, Y는 화학식 I의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, R2 *, R3 *, R5 *, R6 * 및 R7 *는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
<화학식 VII>
(상기 식에서, X**는 아미노 보호기 또는 X*이고, X* 및 A1 *는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
또한 X**가 아미노 보호기인 경우에는, 상기 아미노 보호기 X**를 제거하여 X* 대신에 H를 얻고, 생성된 아미노 기를 상응하는 산 X*-OH 또는 그의 반응성 유도체를 사용하여 아실 기 X*와 커플링시키는 것 (여기서, C*는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)을 추가로 포함하는 방법 또는 공정. - 제3항에 있어서, N-말단 아미노 기 및 C-말단 카르복시 기를 갖는 화학식 VI의 화합물의 선형 전구체 펩티드의 락탐화 하에서의 고리화를, 상기 아미노 기 및 상기 카르복시 기로부터의 아미드 결합 형성을 가능하게 하는 반응 조건 하에, 바람직하게는 용액 상 화학을 이용하여 수행하는 것을 추가로 포함하는 방법 또는 공정.
- 제4항에 있어서, 선형 전구체 펩티드가 하기 화학식 VIII을 가지며, 화학식 VIII, 특히 VIIIA의 화합물의 고리화 후에, 보호기 Prot*를 계내 제거하여 화학식 VI의 화합물을 얻는 것을 추가로 포함하는 방법 또는 공정.
<화학식 VIII>
상기 식에서, Prot*는 존재하는 다른 보호기에 영향을 주지 않으면서 선택적으로 절단될 수 있고 선형 전구체 펩티드의 합성 동안의 탈보호 단계 동안 안정적인 보호기 (예를 들어 알릴옥시카르보닐)이고, R2 *, R3 *, R5 *, R6 * 및 R7 *는 제4항에서 화학식 VI의 화합물에 대해 정의된 바와 같다. - 제5항에 있어서, 화학식 VIII, 특히 VIIIA의 선형 전구체 펩티드가 상응하는 아미노산으로부터 고체 상 펩티드 합성 및 그 후 사용된 고체 상으로부터의 절단에 의해 합성된 것인 방법 또는 공정.
- 제6항에 있어서,
변법 a)에서, 하기 화학식 IX의 아미노산 또는 상기 아미노산의 반응성 유도체를, 고체 수지 RES에 결합되어 있는 절단가능한 링커 L에 산소를 통해 커플링시키고, 보호기 Prot**를 제거하고;
<화학식 IX>
(상기 식에서, R3 *는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, Prot**는 다른 결합의 절단 없이 수지 상에서 제거될 수 있는 아미노 보호기임)
수득된 하기 화학식 X로 표시되는 수지 결합 아미노산을 하기 화학식 XI의 아미노산 또는 상기 아미노산의 반응성 유도체와 커플링시키고, 수득된 하기 화학식 XII로 표시되는 수지 결합 디펩티드를 유리 히드록시 기를 통해 하기 화학식 XIII의 아미노산 또는 상기 아미노산의 반응성 유도체와 커플링시키고, 보호기 Prot**를 제거하거나;
<화학식 X>
(상기 식에서, RES 및 R3 *는 화학식 IX의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, n은 자연수이고, L은 절단가능한 링커임)
<화학식 XI>
(상기 식에서, Prot*는 제5항에서 화학식 VIII의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, R2 *는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
<화학식 XII>
(상기 식에서, Prot*는 제5항에서 화학식 VIII의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, R2 * 및 R3 *는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, n, L 및 RES는 화학식 X의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
<화학식 XIII>
(상기 식에서, Prot**는 화학식 IX의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, R7 *는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
또는, 변법 b)에서, 하기 화학식 XXVII의 디펩티드 또는 상기 디펩티드의 반응성 유도체를, 변법 a) 하에 기재된 바와 같이 수득가능하고, 하기 화학식 X를 가지며, 고체 수지 RES에 결합되어 있는 절단가능한 링커 L에 산소를 통해 결합된 아미노 아실 모이어티에 커플링시키고, 보호기 Prot**를 제거하고;
<화학식 XXVII>
(상기 식에서, R3 * 및 Prot**는 화학식 IX, 특히 IXA의 화합물에 대해 기재된 바와 같고, Prot*는 제5항에서 화학식 VIII의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
<화학식 X>
(상기 식에서, RES 및 R3 *는 화학식 IX의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, L 및 RES는 상기에 정의된 바와 같음)
또한, 변법 a) 또는 변법 b)의 반응 후에, 수득된 하기 화학식 XIV의 화합물을 하기 화학식 XV의 아미노산 또는 상기 아미노산의 반응성 유도체와 커플링시키고, 보호기 Prot**를 제거하고;
<화학식 XIV>
(상기 식에서, R2 *, R3 * 및 R7 *는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, Prot*는 제5항에서 화학식 VIII의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, n, L 및 RES는 화학식 X의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
<화학식 XV>
(상기 식에서, R6 * 및 Y는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, Prot**는 화학식 IX의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
수득된 하기 화학식 XVI의 화합물을 하기 화학식 XVII의 아미노산 또는 상기 아미노산의 반응성 유도체와 커플링시키고, 보호기 Prot**를 제거하고;
<화학식 XVI>
(상기 식에서, Y, R2 *, R3 *, R7 * 및 R6 *는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, Prot*는 제5항에서 화학식 VIII의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, n, L 및 RES는 화학식 X의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
<화학식 XVII>
(상기 식에서, R5 *는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, Prot**는 화학식 IX의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
마지막으로 하기 화학식 XVIII의 생성 화합물을 하기 화학식 XIX의 합성단위체 또는 상기 합성단위체의 활성화된 유도체에 커플링시키고, 보호기 Prot**를 제거하여 하기 화학식 XX의 화합물을 얻고;
<화학식 XVIII>
(상기 식에서, Y, R2 *, R3 *, R7 *, R6 * 및 R5 *는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, Prot*는 제5항에서 화학식 VIII의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, n, L 및 RES는 화학식 X의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
<화학식 XIX>
(상기 식에서, Prot는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, Prot**는 화학식 IX의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
<화학식 XX>
(상기 식에서, Prot, Y, R2 *, R3 *, R7 *, R6 * 및 R5 *는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, Prot*는 제5항에서 화학식 VIII의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, n, L 및 RES는 화학식 X의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
화학식 XX에서의 고체 상 결합 펩티드에서, 고체 상 L-RES를 절단하여 제5항에 나타낸 바와 같은 상응하는 화학식 VIII, 특히 VIIIA의 화합물을 얻는 것
을 포함하는 방법 또는 공정. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1항의 화학식 II의 화합물의 합성을 위해, N-말단 아미노 기 및 C-말단 카르복시 기를 갖는 화학식 II의 화합물의 선형 전구체 펩티드의 락탐화 하에서의 고리화를, 상기 아미노 기 및 상기 카르복시 기로부터의 아미드 결합 형성을 가능하게 하는 반응 조건 하에, 바람직하게는 용액 상 화학을 이용하여 수행하는 것을 포함하는 방법 또는 공정.
- 제8항에 있어서, 선형 전구체 펩티드가 하기 화학식 XXV를 갖는 것인 방법 또는 공정.
<화학식 XXV>
상기 식에서, X*, A1 *, R2 *, R3 *, R5 *, R6 *, R7 * 및 Prot는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같다. - 제9항에 있어서, 화학식 XXV의 화합물의 합성을 위해, 하기 화학식 XXIV의 화합물을 절단하고, (절단 전에, 그와 병행하여 또는 그 이후에) 보호기 Prot**를 제거하여 화학식 XXV의 화합물을 얻는 것을 추가로 포함하는 방법 또는 공정.
<화학식 XXIV>
상기 식에서, X*, A1 *, R2 *, R3 *, R5 *, R6 *, R7 * 및 Prot는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, L은 절단가능한 링커이고, RES는 고체 수지이고, n은 자연수이고, Prot**는 보호기 Prot의 병행 제거 없이 생성물을 수지 상에 남기면서 제거될 수 있는 아미노 보호기이다. - 제10항에 있어서, 화학식 XXIV의 화합물의 합성을 위해, 하기 화학식 XIX의 아미노산 또는 상기 아미노산의 활성화된 유도체를 하기 화학식 XXIII의 화합물과 커플링시키는 것을 추가로 포함하는 방법 또는 공정.
<화학식 XIX>
상기 식에서, Prot는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, Prot**는 제10항에서 화학식 XXIV의 화합물에 대해 정의된 바와 같다.
<화학식 XXIII>
상기 식에서, X*, A1 *, R2 *, R3 *, R5 *, R6 * 및 R7 *는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, L은 절단가능한 링커이고, RES는 고체 수지이고, n은 자연수이다. - 제11항에 있어서, 화학식 XXIII의 화합물의 합성을 위해, 하기 화학식 XVII*의 아미노산 또는 상기 아미노산의 반응성 유도체를 하기 화학식 XXII의 화합물과 커플링시키고, 보호기 Prot***를 제거하는 것을 추가로 포함하는 방법 또는 공정.
<화학식 XVII*>
상기 식에서, R5 *는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, Prot***는 존재하는 다른 보호기에 영향을 주지 않고 생성물을 수지 상에 남기면서 선택적으로 절단될 수 있는 아미노 보호기이다.
<화학식 XXII>
상기 식에서, X*, A1 *, R2 *, R3 *, R6 * 및 R7 *는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, L은 절단가능한 링커이고, RES는 고체 수지이고, n은 자연수이다. - 제12항에 있어서, 화학식 XXII의 화합물의 합성을 위해, 하기 화학식 XV*의 아미노산 또는 상기 아미노산의 반응성 유도체를 하기 화학식 XXI의 화합물과 커플링시키고, 보호기 Prot***를 제거하는 것을 추가로 포함하는 방법 또는 공정.
<화학식 XV*>
상기 식에서, R6 * 및 Y는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, Prot***는 존재하는 다른 보호기에 영향을 주지 않고 생성물을 수지 상에 남기면서 선택적으로 절단될 수 있는 아미노 보호기이다.
<화학식 XXI>
상기 식에서, X*, A1 *, R2 *, R3 * 및 R7 *는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, L은 절단가능한 링커이고, RES는 고체 수지이고, n은 자연수이다. - 제13항에 있어서, 화학식 XXI의 화합물의 합성을 위해, 하기 화학식 XIII*의 아미노산 또는 상기 아미노산의 반응성 유도체를 하기 화학식 XXVI의 화합물의 히드록실 기와 반응시키고, 보호기 Prot***를 제거하는 것을 추가로 포함하는 방법 또는 공정.
<화학식 XIII*>
상기 식에서, Prot***는 존재하는 다른 보호기에 영향을 주지 않고 생성물을 수지 상에 남기면서 선택적으로 절단될 수 있는 아미노 보호기이고, R7 *는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같다.
<화학식 XXVI>
상기 식에서, X*, A1 *, R2 * 및 R3 *는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, L은 절단가능한 링커이고, RES는 고체 수지이고, n은 자연수이다. - 제14항에 있어서, 화학식 XXVI의 화합물의 합성을 위해, 하기 화학식 XII*로 표시되는 수지 결합 디펩티드를, 보호기 Prot****를 제거한 후에 이에 따라 수득된 유리 아미노 기를 통해 하기 화학식 VII의 산 또는 상기 산의 반응성 유도체와 커플링시키고;
<화학식 XII*>
(상기 식에서, Prot****는 제1항에서 정의된 바와 같은 화학식 II의 화합물 중에 존재하는 다른 보호기에 영향을 주지 않고 생성물을 수지 상에 남기면서 선택적으로 절단될 수 있는 보호기이고, R2 * 및 R3 *는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, L은 절단가능한 링커이고, RES는 고체 수지이고, n은 자연수임)
<화학식 VII>
(상기 식에서, X**는 아미노 보호기 또는 X*이고, X* 및 A1 *는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)
또한 X**가 아미노 보호기인 경우에는, 상기 아미노 보호기 X**를 제거하여 X* 대신에 H를 얻고, 생성된 아미노 기를 상응하는 산 X*-OH 또는 상기 산의 반응성 유도체를 사용하여 아실 기 X*와 커플링시키는 것 (여기서, X*는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)을 추가로 포함하는 방법 또는 공정. - 제15항에 있어서, 화학식 XII의 화합물의 합성을 위해, 하기 화학식 X로 표시되는 수지 결합 아미노산을 하기 화학식 XI*의 아미노산 또는 상기 아미노산의 반응성 유도체와 커플링시키는 것을 추가로 포함하는 방법 또는 공정.
<화학식 X>
상기 식에서, R3 *는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, L은 절단가능한 링커이고, RES는 고체 수지이고, n은 자연수이다.
<화학식 XI*>
상기 식에서, Prot****는 존재하는 다른 보호기에 영향을 주지 않고 생성물을 수지 상에 남기면서 선택적으로 절단될 수 있는 보호기이고, R2 *는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같다. - 제16항에 있어서, 화학식 X의 수지 결합 아미노산을 얻기 위해, 하기 화학식 IX*의 아미노산 또는 상기 화학식 IX의 아미노산의 반응성 유도체를, 고체 수지 RES에 결합되어 있는 절단가능한 링커 L을 통해 결합된 히드록시 기에 커플링시키고, 보호기 Prot***를 제거하는 것을 추가로 포함하는 방법 또는 공정.
<화학식 IX*>
상기 식에서, R3 *는 제1항에서 화학식 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, Prot***는 존재하는 다른 보호기에 영향을 주지 않고 생성물을 수지 상에 남기면서 선택적으로 절단될 수 있는 아미노 보호기이다. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 기호 A1, R2, R3, R5, R6, R7, X 및 Y 또는 상응하는 비보호 또는 보호된 모이어티 R2 *, R3 *, R5 *, R6 *, R7 *, X* 및 Y3이,
생성된 화학식 I의 화합물 또는 그의 염에서,
A1은 α-카르복실 기의 카르보닐을 통해 화학식 I에서 A1의 우측에서 아미노 기에 결합되고 α-아미노 기를 통해 X에 결합된 L-글루타민의 2가 라디칼이거나, 또는 2S-(2-히드록시-3-포스포노옥시)-프로피오닐이고;
R2는 메틸이고;
R3은 이소프로필, 이소부틸 또는 벤질, 특히 이소부틸이고;
R5는 sec-부틸 또는 벤질, 특히 sec-부틸이고;
R6은 4-히드록시벤질이고;
R7은 이소프로필 또는 sec-부틸, 특히 sec-부틸이고;
X는 아세틸 또는 이소부티릴이거나, 또는 A1이 2S-(2-히드록시-3-포스포노옥시)-프로피오닐인 경우에는 부재하고,
Y는 메틸이 되도록 선택되는 것인 방법 또는 공정. - 반응성 용매로서 수성 산을 사용하여 반응을 유도하는 것을 포함하는,
하기 화학식 V를 가지며, 제1항에서 제공되거나 또는 제18항에서 정의된 바와 같은 치환기를 갖는 화학식 I의 화합물의 탈수물을, 상응하는 화학식 I의 화합물로 전환시키고/거나, 또한 부산물로서 형성될 수 있고, 하기 화학식 V*, 특히 하기 화학식 VA*를 가지며, 화학식 I에서의 ahp 구조 대신에 5-고리를 갖는 상응하는 헤미아미날 유사체로 전환시키는 방법 또는 공정; 또는
화학식 I의 화합물 및 그의 상응하는 탈수물 및/또는 헤미아미날의 혼합물의 평형을 화학식 I의 화합물의 편으로 이동시키는 방법 또는 공정.
<화학식 V>
상기 식에서, Y, X, A1, R2, R3, R5, R6 및 R7은 제1항 또는 제18항에서 화학식 I의 화합물에 대해 정의된 바와 같다.
<화학식 V*>
<화학식 VA*>
상기 식에서, Y, X, A1, R2, R3, R5, R6 및 R7은 각각 제1항 또는 제18항에서 화학식 I의 화합물에 대해 정의된 바와 같다. - 제19항에 있어서, 산이 카르복실산, 특히 할로 치환된 C1 - 8알칸산, 더욱 특히 트리플루오로아세트산 또는 트리클로로아세트산인 방법.
- 하기 화학식 II의 화합물.
<화학식 II>
상기 식에서, Prot는 보호기이고, Y는 제1항 또는 제18항에서 화학식 I의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, X*, A1 *, R2 *, R3 *, R5 *, R6 * 및 R7 *는 각각 제1항 또는 제18항에서 정의된 바와 같은 화학식 I에서의 X, A1, R2, R3, R5, R6 및 R7에 상응하되, 단 이들 모이어티 상의 반응성 관능기는 비보호 또는 보호된 형태로 존재한다. - 하기 화학식 III의 화합물.
<화학식 III>
상기 식에서, Y는 제1항 또는 제18항에서 화학식 I의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, X*, A1 *, R2 *, R3 *, R5 *, R6 * 및 R7 *는 각각 제1항 또는 제18항에서 정의된 바와 같은 화학식 I에서의 X, A1, R2, R3, R5, R6 및 R7에 상응하되, 단 이들 모이어티 상의, 화학식 III에서 최상부에 나타낸 히드록시 이외의 반응성 관능기는 비보호 또는 보호된 형태로 존재한다.
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