EA025546B1

EA025546B1 - Способы получения макроциклических депсипептидов и новых промежуточных соединений

Info

Publication number: EA025546B1
Application number: EA201391554A
Authority: EA
Inventors: Мурат Асемоглу; Хериберт ХЕЛЛЬШТЕРН; Феликс Колльмер; Джон Лопес; Роберт ШРАЙБЕР; Кристиан Шпрехер; Ханс Штеттлер
Original assignee: Новартис Аг
Priority date: 2011-04-20
Filing date: 2012-04-19
Publication date: 2017-01-30
Also published as: AU2012245980A1; WO2012143888A1; TN2013000385A1; BR112013026660A2; US8614289B2; CN103476789A; EP2699585A1; GT201300256A; MA35034B1; IL228727A0; US20120277406A1; KR101580729B1; AR086168A1; CN103476789B; US20140080995A1; MX337526B; CO6801799A2; MX2013012188A; PE20141206A1; TW201249863A

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу химического получения депсипептидов формулы (I), где указанные символы имеют значения, определенные в описании, к новым промежуточным соединениям и их получению, так же, как к соответствующим вариантам изобретения.

Description

Настоящее изобретение относится к способу получения макроциклических депсипептидов, к новым промежуточным соединениям и их получению, так же, как к соответствующим вариантам изобретения.

Предшествующий уровень техники

Циклические депсипептиды находят многочисленные применения в фармакологии. Так, например, депсипептиды, раскрытые в \УО 2009/024527, можно использовать для лечения различных заболеваний. Например, указанное соединение формулы II, упомянутое в \УО 2009/024527, можно использовать для лечения и профилактики воспалительных и/или гиперпролиферативных и сопровождаемых зудом заболеваний кожи, таких как атопический дерматит, псориаз, пустулезный псориаз, розацеа, келоиды, гипертрофические шрамы, угри, синдром Нетертона или других сопровождающихся зудом дерматозов, таких как узелковая почесуха, неспецифический зуд в старческом возрасте, также как других заболеваний с дисфункцией эпителиального барьера, таких как старая кожа.

Ностопептин ΒΝ920, ранее выделенный из цианобактерий Νοδΐοο, был выделен также из водорослей микроцистис. Ностопептин ΒΝ920 ингибирует химотрипсин со значением ИК₅₀=31 нМ (см. I. Ναι. Ρτοά. 68(9), 1324-7 (2005)).

Указанные соединения можно получить путем ферментации (используя сбопбтотусек стоас1и8, миксобактерии) вместе с другими депсипептидами, включающими так называемые абр-субструктуры (абр: 3-амино-6-гидрокси-пиперидин-2-он) и соответствующие дегидро-абр-субструктуры (дегидро-абр: 3-амино-3,4-дигидро-1Н-пиридин-2-он), здесь называемые дегидратами соответственно. Поэтому выход процесса ферментации, касающийся любого одного из указанных соединений, весьма низок.

Настоящее изобретение относится к способам, которые позволяют получать такие циклические депсипептиды с повышенным выходом и/или высокого качества.

Учитывая многочисленные риски, такие как эпимеризация, таутомеризация и т.п., при синтезе сложных молекул с множеством возможных изомеров, оказалось возможным найти процесс производства, предпочтительно включающий комбинацию твердофазного пептидного синтеза и жидкофазного синтеза, что обеспечивает получение циклических депсипептидов формулы I с хорошим выходом и/или необходимой стереоизомерной степенью чистоты, особенно и того, и другого вместе. Авторам до сих пор не встречалось использование твердофазного пептидного синтеза в рассматриваемой области.

Настоящее изобретение относится к способу получения циклического депсипептидного соединения формулы I

где А₁ представляет собой двухвалентный фрагмент аминокислоты с концевой карбоксильной или карбамоильной группой, и связан с правой стороны в формуле I через карбонил с остальной частью молекулы; или представляет собой С_£-8-алканоил или фосфорилированный гидрокси-С1_-8-алканоил;

X связан через N фрагмента А! и представляет собой ацил, выбранный из ацетила или изобутирила, или отсутствует, если А₁ представляет собой С_£-8-алканоил или фосфорилированный гидрокси-Сиалканоил;

К₂ представляет собой С_£-8-алкил;

К₃ представляет собой боковую цепь лейцина, изолейцина или валина;

К₅ представляет собой боковую цепь фенилаланина или изолейцина;

К₆ представляет собой боковую цепь гидроксиаминокислоты;

К₇ представляет собой боковую цель изолейцина или валина;

Υ представляет собой водород или С_£-8-алкил; или его соли;

причем указанный способ включает селективное удаление защитных групп из соединения формулы II

- 1 025546

где РгоГ представляет собой силильную защитную группу, Υ имеет значения, указанные для соединения формулы I, и X*, А!*, Р₂*, Р₃*, Р₅*, Р₆* и Р₇* соответствуют значениям X, А!, Р₂, Р₃, Р₅, Р₆ и Р₇ в формуле I соответственно, но при условии, что реакционноспособные функциональные группы у указанных фрагментов присутствуют в защищенной форме, по меньшей мере, если они могут принимать участие в нежелательных побочных реакциях, с получением в результате соединения формулы III

где X*, А!*, Р₂*, Р₃*, Р₅*, Р₆* и Р₇* имеют указанные выше значения;

взаимодействие свободной гидроксильной группы в условиях окисления с получением соединения формулы IV

и удаление оставшихся защитных групп с получением соединения формулы I, или его соли.

Необязательно, свободное основание соединения формулы I превращают в соль соединения формулы I, или соль соединения формулы I превращают в другую соль соединения формулы I; или соль соединения формулы I превращают в свободное основание соединения формулы I.

В качестве подходящих условий для окисления соединения формулы III обычно используют ГВХ в ДМСО (I. Огд. СНет. 1995, 60, 7272-7276); пиридинийдихромат или пиридинийхлорхромат (ТейаНейгои Ьей. 1979, 5, 399-402); оксалилхлорид, диметилсульфоксид и третичный амин (1. РЕРТШЕ §сЕ 2006, 12, 140-146), соли оксоаммония (1. Огд. СНет. 1985, 50, 1332-1334); гипохлориты щелочей, катализируемые солями оксоаммония (1. Огд. СНет. 1989, 54, 2970-2972); соли оксоаммония (ТеГгаНейгои ЬеН. 1988, 29, 5671-5672), РиС1₂ (РРН₃)₃ (ТейаНейгои ЬеН. 1981, 22, 1605-1608); ТЕМРО (1 моль%) в присутствии гипохлорита натрия (ТейаНейгои Ьей. 1990, 31, 2177-2180); ЫаЮ₄, ТЕМРО, ЫаВг (ТейаНейгои 2006, 62, 89288932); оксида ванадия (IV) и Г-ВиООН на подложке 8Ю₂ (Айуаисей 8уиГНе818 & Са1а1у818 2007, 349, 846848). Предпочтительно вести реакцию, используя ГВХ в ДМСО, или предпочтительно в инертном растворителе, таком как тетрагидрофуран, в присутствии ДМСО, при температуре между 0-50°С, предпочтительно между 20-25°С.

- 2 025546

Указанное выше соединение формулы II получают взаимодействием соединения формулы VI

где Ρτοΐ представляет собой силильную защитную группу, Υ имеет значения, указанные для соединения формулы I, и К₂*, К₃*, К₅*, К₆* и К₇* имеют значения, указанные для соединения формулы II выше, с кислотой формулы VII

или ее реакционноспособным производным, представляющим собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры кислоты формулы VII, где X** представляет собой аминозащитную группу или представляет собой X*, и где X* и А!* имеют значения, указанные для соединения формулы II выше; и, если X** представляет собой аминозащитную группу, удаление указанной аминозащитной группы X** для получения Н вместо X*, и осуществление реакции сочетания полученной аминогруппы с группой ацила X*, используя соответствующую кислоту Х*-ОН, где X* имеет значения, указанные для соединения формулы II выше, или ее реакционноспособным производным, представляющим собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры кислоты Х*-ОН.

Предпочтительно соединение формулы II получают циклизацией в условиях лактамизации линейного, т.е. еще не циклического, пептида-предшественника соединения формулы VI, содержащего Ν-концевую аминогруппу и С-концевую карбоксигруппу, в таких условиях реакции, которые обеспечивают образование амидной связи из указанных амино- и карбоксигрупп, предпочтительно используя жидкофазную технологию.

Лактамизацию в растворах обычно осуществляют при очень низких концентрациях субстрата, чтобы избежать процессов олигомеризации и полимеризации. Проведение таких реакций требует больших количеств растворителей и очень больших реакторов. Например, макролактамизацию олигопептида осуществляют при концентрации 2 ммоль/л в ссылке ΥοΚοΚανα с1 а1., Тейакейгои 2005, 61, 1459-1480. Указанные затруднения можно обойти, растворяя третичное основание и связующий реагент и контролируемым образом добавляя раствор олигопептида к полученному раствору. Контролируемое, особенно медленное добавление олигопептидного раствора создает постоянно низкие концентрации активированного олигопептида в растворе, и таким образом предотвращает олигомеризацию и полимеризацию. Скорость добавления олигопептидного раствора можно устанавливать в соответствии со скоростью реакции для макроциклизации: если указанная макроциклизация является быстрой реакцией, раствор олигопептида можно добавлять быстро. Если макроциклизация происходит медленно, добавление раствора должно происходить медленно, чтобы обеспечить постоянно низкую концентрацию активированного олигопептида. Таким образом, контролируемое добавление олигопептида позволяет работать с гораздо меньшими количествами растворителя, все еще поддерживая концентрацию активированного олигопептида ниже 10^-3 мМ, например в интервале от 10^-4 до 10^-6 мМ или еще ниже. Представленный вариант контролируемого добавления олигопептида к раствору связующего реагента является вариантом настоящего изобретения.

- 3 025546

Так, соединение формулы II получают циклизацией в условиях лактамизации линейного пептидапредшественника соединения формулы VIII

где Рго!* представляет собой защитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, и которая остается стабильной на стадиях удаления защитных групп во время синтеза указанного линейного пептида-предшественника, и К₂*, К₃*, К₅*, Кб* и Р-* имеют значения, указанные выше для соединения формулы VI, с последующим удалением ίη δίίυ указанной защитной группы Рго!* и получением соединения формулы VI;

где Рго!* выбирают из группы, состоящей из С₃-С₈-алк-2-енилоксикарбонильных групп.

Указанный линейный пептид-предшественник формулы VIII предпочтительно синтезируют из соответствующих аминокислот, используя твердофазный пептидный синтез и последующее отщепление полученного пептида от используемого твердого носителя.

Так, соединение формулы VIII получают в варианте а) сочетанием аминокислоты формулы IX

где К₃* имеет значения, указанные выше для соединения формулы II, и Рго!** представляет собой аминозащитную группу, которую можно удалить на смоле без разрушения других связей, или реакционноспособного производного указанной аминокислоты, через кислород с отщепляемым линкером Ь, который связан с твердой смолой КЕ§, и удалением указанной защитной группы Рго!**;

сочетанием полученной аминокислоты, связанной со смолой и представленной формулой X

где КЕ§ и К₃* имеют значения, указанные для соединения формулы IX, η представляет собой натуральное число, и Ь представляет собой отщепляемый линкер, с аминокислотой формулы XI

где Рго!* имеет значения, указанные выше для соединения формулы VIII, и К₂* имеет значения, указанные для соединения формулы II, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты, осуществляя реакцию сочетания связанного со смолой дипептида, представленного формулой XII

- 4 025546

где Рго!* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII, Р₂* и К₃* имеют значения, указанные для соединения формулы II, и п, Ь и КЕ8 имеют значения, указанные для соединения формулы X, через свободную гидроксигруппу с аминокислотой формулы XIII

где Рго!** имеет значения, указанные для соединения формулы IX, и К₇* имеет значения, указанные для соединения формулы II, или реакционноспособным производным указанной аминокислоты, и удаление указанной защитной группы Рго!**;

или, в варианте Ь), сочетанием дипептида формулы XXVII

где К₃* и Рго!** имеют значения, указанные для соединения формулы IX, и Рго!* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII, или реакционноспособного производного указанного дипептида, с аминоацильным фрагментом, связанным через кислород с отщепляемым линкером Ь, который связан с твердой смолой КЕ8, формулы X

который можно получить, как раскрыто в варианте а), где РЕ8 и К₃* имеют значения, указанные для соединения формулы IX; и значения Ь и КЕ8 только что определены; и удаление указанной защитной группы Рго!**;

и, после осуществления реакции по варианту а) или по варианту Ь), осуществление реакции сочетания получаемого соединения формулы XIV

где К₂*, й₃* и К₇* имеют значения, указанные для соединения формулы II, Рго!* имеет значения,

- 5 025546 указанные для соединения формулы VIII, и п, Ь и КЕ§ имеют значения, указанные для соединения формулы X, с аминокислотой формулы XV

где Кб* и Υ имеют значения, указанные для соединения формулы II, и Рго1** имеет значения, указанные для соединения формулы IX, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты, и удаление указанной защитной группы Рго1**;

осуществление реакции сочетания получаемого соединения формулы XVI

где Υ, К₂*, К₃*, К₇* и Кб* имеют значения, указанные для соединения формулы II, Рго1* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII, и п, Ь и КЕ§ имеют значения, указанные для соединения формулы X, с аминокислотой формулы XVII

где К₅* имеет значения, указанные для соединения формулы II, и Рго1** имеет значения, указанные для соединения формулы IX, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты, и удаление указанной защитной группы Рго1**;

и, наконец, осуществление реакции сочетания полученного соединения формулы XVIII

где Υ, К₂*, К₃*, К₇*, К_б* и К₅* имеют значения, указанные для соединения формулы II, Рго1* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII, и п, Ь и КЕ§ имеют значения, указанные для соединения формулы X, с синтоном формулы XIX

где Рго1 имеет значения, указанные для соединения формулы II, и Рго1** имеет значения, указанные для соединения формулы IX, или с активированным производным указанного сиитона, и удаление защитной группы Рго1** с получением соединения формулы XX

где Рго!, Υ, Κ₂*, К_з*, Κ₇*, Κ₆* и Κ₅* имеют значения, указанные для соединения формулы II, Рго!* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII, и п, Ь и КЕ§ имеют значения, указанные для соединения формулы X;

и отщепление связанного с твердой фазой пептида формулы XX от указанной твердой фазы Ь-РЕ§ с получением соответствующего соединения формулы VIII;

где реакционноспособные производные аминокислот IX, XI, XIII, XXVII, XV, XVII и XIX представляют собой независимо их хлорангидриды, фторангидриды, ангидриды или нитрофениловые эфиры;

где Рго! представляет собой силильную защитную группу, Рго!* выбирают из группы, состоящей из С₃-С₈-алк-2-енилоксикарбонильных групп, и Рго!** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9илметоксикарбонила (Ртое); 2-(2' или 4'-пиридил) этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'нитрофенил)этоксикарбонила.

Согласно другому предпочтительному варианту настоящего изобретения соединение формулы II получают циклизацией в условиях лактамизации линейного пептида-предшественника соединения формулы XXV

где X*, Л!*, К₂*, К_з*, К₅*, К₆*, К₇* и Рго! имеют значения, указанные выше для соединения формулы II.

Соединение формулы XXV предпочтительно получают расщеплением соединения формулы XXIV

где X*, Άι*, К₂*, К_з*, К₅*, К₆*, К₇* и Рго! имеют значения, указанные для соединения формулы II, Ь представляет собой отщепляемый линкер, РЕ§ представляет собой твердую смолу, п представляет собой натуральное число и Рго!** представляет собой аминозащитную группу, которую можно удалить без одновременного удаления указанной защитной группы Рго!, причем продукт остается на смоле, и (перед отщеплением, одновременно с ним. или после него) удаление защитной группы Рго!** с получением ука- 7 025546 занного соединения формулы XXV;

где Ργοϊ представляет собой силильную защитную группу, и Ργοϊ** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Ртос); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'нитрофенил)этоксикарбонила.

Указанное выше соединение формулы XXIV предпочтительно получают сочетанием аминокислоты формулы XIX

где Ργοϊ имеет значения, указанные для соединения формулы II, и Ργοϊ** имеет значения, указанные для соединения формулы XXIV, или активированного производного указанной аминокислоты, которое представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XIX, с соединением формулы XXIII

где X*, Άι*_; К₂*, К₃*· К₅*, Кб* и К₇* имеют значения, указанные для соединения формулы II, Ь ₂*, К₃*, к₅*, К_б* и К₇* представляет собой отшепляемый линкер, КЕ8 представляет собой твердую смолу, η представляет собой натуральное число.

В предпочтительном варианте настоящего изобретения соединение формулы XXIII получают сочетанием аминокислоты формулы XVII*

РгоГ**-] /=°

НО

XVII где К₅* имеет значения, указанные для соединения формулы II, и Ργοϊ*** представляет собой аминозащитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле, или реакционноспособного производного указанной аминокислоты, с соединением формулы XXII

где X*, Άί*, К₂*, К₃*, К_б* и К₇* имеют значения, указанные для соединения формулы II, Ь представляет собой отщепляемый линкер, КЕ8 представляет собой твердую смолу, η представляет собой натуральное число, и удаление указанной защитной группы Ργοϊ***;

где реакционноспособное производное аминокислоты XVII* представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XVII*;

- 8 025546 где Рго!*** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Ртос); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.

Предпочтительно соединение формулы XXII получают сочетанием аминокислоты формулы XV*

где Кб* и Υ имеют значения, указанные для соединения формулы II, и Рго!*** представляет собой аминозащитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты, с соединением формулы XXI

где X*, Άι*, К₂*, К₃* и К₇* имеют значения, указанные для соединения формулы II, Ь представляет собой отщепляемый линкер, КЕ§ представляет собой твердую смолу, η представляет собой натуральное число, и удаление указанной защитной группы Рго!***;

где реакционноспособное производное аминокислоты XV* представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XV*;

где Рго!*** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Ртос); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.

Согласно предпочтительному варианту настоящего изобретения соединение формулы XXI получают осуществлением взаимодействия аминокислоты формулы XIII*

где Рго!*** представляет собой аминозащитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле, и К₇* имеет значения, указанные для соединения формулы II, или реакционноспособного производного указанной аминокислоты, с гидроксильной группой соединения формулы XXVI

где X*, Άι*, К₂* и К₃* имеют значения, указанные для соединения формулы II, Ь представляет собой отщепляемый линкер, КЕ§ представляет собой твердую смолу, η представляет собой натуральное число;

и удаление указанной защитной группы Рго!***;

- 9 025546 где реакционноспособное производное аминокислоты XIII* представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XIII*;

В следующем предпочтительном варианте настоящего изобретения соединение формулы XXVI получают сочетанием связанного со смолой дипептида, представленного формулой XII*

где Рго!**** представляет собой защитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные защитные группы, присутствующие в соединении формулы II, как определено выше, причем продукт остается при этом на смоле, К₂* и К₃* имеют значения, указанные для соединения формулы II, Ь представляет собой отщепляемый линкер, РЕ§ представляет собой твердую смолу, и η представляет собой натуральное число, после удаления указанной защитной группы Рго!**** через полученную таким образом свободную аминогруппу, с кислотой формулы VII

где X** представляет собой аминозащитную группу или представляет собой X*, и где X* и А!* имеют значения, указанные для соединения формулы II, или с реакционноспособным производным указанной кислоты;

и, если X** представляет собой аминозащитную группу, удаление указанной аминозащитной группы X** до получения Н вместо X* и осуществление реакции сочетания полученной аминогруппы с ацильной группой X*, используя соответствующую кислоту Х*-ОН, где X* имеет значения, указанные для соединения формулы II, или реакционноспособное производное указанной кислоты;

где реакционноспособное производное аминокислот VII* или Х*-ОН представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты VII* или Х*-ОН соответственно;

где Рго!**** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Ртос); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.

Предпочтительно соединение формулы XII получают сочетанием связанной со смолой аминокислоты, представленной формулой X

где К₃* имеет значения, указанные для соединения формулы II, Ь представляет собой отщепляемый линкер, РЕ§ представляет собой твердую смолу, и η представляет собой натуральное число;

с аминокислотой формулы XI*

где Рго!**** представляет собой защитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле, и К₂* имеет значения, указанные для соединения формулы II, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты;

где реакционноспособное производное аминокислоты XI* представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XI*;

- 10 025546 где Рго!**** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Ртос); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.

Согласно предпочтительному варианту настоящего изобретения вязанную со смолой аминокислоту формулы X получают сочетанием аминокислоты формулы IX*

где К₃* имеет значения, указанные для соединения формулы II, и Рго!*** представляет собой аминозащитную группу, которую можно удалить селективно, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле; или реакционноспособного производного указанной аминокислоты формулы IX, с гидроксигруппой, связанной через отщепляемый линкер Ь, который связан с твердой смолой КЕ8, и удаление указанной защитной группы Рго!***;

где реакционноспособное производное аминокислоты IX* представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты IX*;

Другой предпочтительный вариант настоящего изобретения относится к способу, где указанные символы Άΐ, К₂, К₃, К₅, Кб, К-7, X и Υ или соответствующие незащищенные или защищенные фрагменты К₂*, К₃*, К₅*, Кб*, К₇*, X* и Υ₃ выбирают таким образом, что в полученном соединении формулы I, или в его соли;

А представляет собой двухвалентный радикал Ь-глутамина, связанный через карбонил его α-карбоксигруппы с аминогруппой справа от А₁ в формуле I и через его α-аминогруппу с X, или представляет собой 28-(2-гидрокси-3-фосфоноокси)пропионил;

К2 представляет собой метил;

К₃ представляет собой изобутил;

К₅ представляет собой втор-бутил или бензил;

Кб представляет собой 4-гидроксибензил;

К₇ представляет собой изопропил или втор-бутил;

X представляет собой ацетил или изобутирил или отсутствует, если Ά₁ представляет собой 28-(2гидрокси-3 -фосфоноокси)пропионил;

Υ представляет собой метил.

Настоящее изобретение также относится к соединению б

представленному на схеме 3.

Настоящее изобретение также относится к соединению 7

- 11 025546

представленному на схеме 3.

Соединение формулы I предпочтительно представляет соединение формулы ΙΑ

соединение формулы II предпочтительно представляет соединение формулы ΙΙΑ

соединение формулы III предпочтительно представляет соединение формулы ΙΙΙΑ

соединение формулы IV предпочтительно представляет соединение формулы ΙνΑ

- 12 025546

соединение формулы VI предпочтительно представляет соединение формулы ΥΙΆ

соединение формулы VIII предпочтительно представляет соединение формулы νΐΙΙΑ

соединение формулы IX предпочтительно представляет соединение формулы ΚΑ

соединение формулы X предпочтительно представляет соединение формулы ХА

СН.·

КЕЗ

ХА соединение формулы XI предпочтительно представляет соединение формулы Х!А

соединение формулы XII предпочтительно представляет соединение формулы ΧΠΑ

- 13 025546

соединение формулы XIII предпочтительно представляет соединение формулы XIIIΑ

ΝΗ-ΡγοΙ**

XI НА да о

соединение формулы XXVII предпочтительно представляет соединение формулы XXVIIΑ

соединение формулы XIV предпочтительно представляет соединение формулы XIVΑ

соединение формулы XV предпочтительно представляет соединение формулы XVΑ

⁶ ХУА соединение формулы XVI предпочтительно представляет соединение формулы XVIΑ

соединение формулы XVII предпочтительно представляет соединение формулы XVIIΑ

- 14 025546

^πυ ΧνΐΙΑ соединение формулы XVIII предпочтительно представляет соединение формулы XVIIIΑ

Соединение формулы XIX предпочтительно представляет соединение формулы XIXΑ

соединение формулы XX предпочтительно представляет соединение формулы ХХА

соединение формулы XXV предпочтительно представляет соединение формулы XXVΑ

Соединение формулы XXIV предпочтительно представляет соединение формулы XXIVΑ

- 15 025546

соединение формулы XIX предпочтительно представляет соединение формулы ΧΙΧΑ

соединение формулы XXIII предпочтительно представляет соединение формулы ΧΧΙΙΙΑ

соединение формулы XVII предпочтительно представляет соединение формулы XVIIΑ*

ΡγοΓ-ΝΗ

ГЧН в *

Хо но

XVI 1А‘ соединение формулы XXII предпочтительно представляет соединение формулы XXIIΑ

соединение формулы XV* предпочтительно представляет соединение формулы XVΑ*

соединение формулы XXI предпочтительно представляет соединение формулы XXIΑ

- 16 025546

соединение формулы XIII* предпочтительно представляет соединение формулы ΧΙΙΙΑ*

^υ ΧΙΙΙΑ* соединение формулы XXVI предпочтительно представляет соединение формулы ΧΧνΙΑ

соединение формулы XII* предпочтительно представляет соединение формулы ΧΙΙΑ*

соединение формулы XI* предпочтительно представляет соединение формулы XIΑ*

соединение формулы IX* предпочтительно представляет соединение формулы ΚΑ*

Следующие определения (или также определения, уже включенные в вышеизложенное) могут заменять более общие термины, используемые ранее и далее в вариантах изобретения для определения дальнейших вариантов настоящего изобретения, с одним, двумя или более общими терминами, которые

- 17 025546 можно заменить более конкретными терминами для определения таких вариантов изобретения:

Двухвалентный фрагмент аминокислоты с концевой карбоксильной или карбамоильной группой представляет собой предпочтительно альфа-карбамоил или карбоксил-С_1-8-замещенную аминокислоту, особенно двухвалентный фрагмент аспарагина или глутамина, и связан со своей правой стороны в формуле I через карбонил (предпочтительно карбонил его α-карбоксильной группы) с остальной частью молекулы.

С_1-8-алканоил или фосфорилированный гидрокси-С_1-8-алканоил (С_1-8-алканоил, содержащий как гидроксил, так и фосфоногруппу (-О-Р(=О)(ОН)₂)А₁, представляет собой, например, 2,3-дигидроксипропаноил (предпочтительно в δ-форме) или 2-гидрокси-3-фосфонопропаноил (предпочтительно в δ-форме).

Р2 и Р2* представляют собой С1-8-алкил, особенно метил, где бы ни были упомянуты.

Р3 представляет собой боковую цепь аминокислоты, особенно природной аминокислоты. Предпочтительно, чтобы он представлял собой С1-8-алкил, который может быть неразветвленным или разветвленным. Особенно предпочтителен С1-8-алкил, который представляет собой н-(2-метил)пропил(изобутил), н-(1-метилпропил(втор-бутил) или метил, т.е., чтобы аминокислотой фрагмента был лейцин, изолейцин или валин.

Р₃* представляет собой соответствующую боковую цепь в защищенной форме, если присутствует функциональная группа, которую следует защитить от участия в реакции. Предпочтительно, чтобы это был С_1-8-алкил, который может быть неразветвленным или разветвленным, особенно, как определено в предшествующем пункте.

Боковую цепь аминокислоты можно выбрать из любого фрагмента, например моно- или полициклического, линейного, насыщенного, ненасыщенного (например, с сопряженными двойными связями) или частично насыщенного органического фрагмента, например содержащего вплоть до 20 атомов углерода и 0-5 гетероатомов в основной структуре, независимо выбранных из Ν, О и δ и заменяющих соответствующее число атомов углерода, и она может быть замещена вплоть до тремя фрагментами, выбранными из амино, имино, гидрокси, карбокси, карбамоила, сульфгидрила, амидино, гуанидино, О-фосфоно (-О-Р(=О)(ОН)2). Предпочтительно указанные боковые цепи выбирают из указанных 20 стандартных альфа-аминокислот: аргинин, гистидин, лизин, аспарагиновая кислотя, глутаминовая кислотя, серии, треонин, аспарагин, глутамин, цистеин, глицин, аланин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, тирозин, валин и дополнительно пролин (в этом случае с внутренней циклизацией, включающей альфа-аминогруппу).

Для указанных аминокислот в рассматриваемом описании используют или их названия, или обычные трехбуквенные коды в соответствии со следующей таблицей:

Аминокислота	Трехбуквенный код
Аланин	А1а
Аргинин	Агд
Аспарагин	Азп
Аспарагиновая кислота	Азр
Аспарагин или аспарагиновая кислота	Азх
Цистеин	Суз
Глутаминовая кислота	<31и
Глутамин	С1п
Глутамин или глутаминовая кислота	<31х
Глицин	О1у
Гистидин	ΗΪ3
Изолейцин	Не
Лейцин	Ьеи
Лизин	Ьуз
Метионин	Меб
Фенилаланин	РЬе
Пролин	Рго
Серин	Зег
Треонин	ТКг
Триптофан	Тгу
Тирозин	Туг
Валин	Уа1

- 18 025546

Κ₅ представляет собой боковую цепь аминокислоты, предпочтительно стандартной аминокислоты. Предпочтительно, если он представляет собой С1_-8-алкил, который может быть неразветвленным или разветвленным и который незамещен или замещен фенилом. Наиболее предпочтительны бензил, н-(2-метил)пропил, изононил или метил, т.е. фрагменты, содержащие такие аминокислоты, как фенилаланин, лейцин, изолейцин или валин.

К₆ представляет собой боковую цепь гидроксиаминокислоты, особенно тирозина.

К₇ представляет собой боковую цепь аминокислоты, особенно природной аминокислоты. Предпочтительно, чтобы он представлял собой С1_-8-алкил, который может быть неразветвленным или разветвленным. Наиболее предпочтительны н-(2-метил)пропил(изобутил), н-(1-метил)пропил(втор-бутил) или метил, т.е. фрагменты, содержащие такие аминокислоты, как лейцин, изолейцин или валин.

С1_-8-алкил может быть неразветвленным или разветвленным один или более раз; например, он может представлять собой н-(2-метил)пропил, н-(1-метил)пропил или метил.

Все соединения, в которых присутствуют солеобразующие группы, такие как основные группы, например амино- или имино-, или кислотные группы, например карбоксил или фенольный гидроксил, можно использовать в свободной форме, или в виде соли, или в виде смесей солей и свободных форм. Т.е. в случае, если упомянуто любое соединение, оно включает все указанные варианты. Например, основные группы могут образовывать соли с кислотами, такими как галогеноводородные кислоты, например НС1, серная кислота, или с органическими кислотами, такими как уксусная кислота, тогда как кислотные группы могут образовывать соли с положительными ионами, например с аммонием, алкиламмонием, катионами солей щелочных или щелочноземельных металлов, например с катионами Са, Мд, Να, К или Ы или т.п.

Выражения или т.п. или и т.п., используемые в рассматриваемом описании, относятся к тому факту, что другие альтернативы упомянутых ранее выражений известны специалистам в данной области и могут быть добавлены к конкретно указанным выражениям; в других вариантах выражения или т.п. и и т.п. можно исключить в одном или более, или во всех вариантах изобретения.

Указанные защитные группы Ρτοΐ, Ρτοΐ*, Ρτοΐ**, Ρτοΐ***, Ρτοΐ**** и любые другие защитные группы, присутствующие во фрагментах А*, Κ₂*, Κ₃*, Κ₅*, Κ₆*, Κ₇*, X*, где бы они ни были указаны во всем описании и в формуле изобретения, выбирают таким образом, чтобы они обеспечивали возможность ортогональной защиты.

Ортогональная защита представляет собой стратегию, которая обеспечивает удаление нескольких защитных групп (одной или более, но не всех) в нужный момент времени, в соответствии с указанными условиями реакций, но при этом не затрагиваются остальные группы или связи со смолой, например через линкеры на твердых смолах. Другими словами: указанная стратегия использует различные классы защитных групп, которые можно удалять, используя различные химические механизмы, также используя соответствующие линкеры в случае твердофазного пептидного синтеза (где указанную связь линкерсмола вместе можно рассматривать как карбоксизащитную группу).

Предпочтительно указанные защитные группы выбирать следующим образом.

Защитную группу Ρτοΐ предпочтительно выбирают такой, чтобы не происходило удаления любых других используемых или присутствующих защитных групп в процессе синтеза депсипептида способом по настоящему изобретению, например под действием слабых оснований (см. Ρτοΐ*), но которую можно удалить, используя ион фтора (особенно в безводных условиях), например Βιι₄Ν'Ρ^- (также, если образуется ίη δίΐιι. например при использовании Βιι4ΝΌ^- с КР-Н2О, КР с 18-краун-6, МВт с 18-краун-6, ВР₃-диэтиловый эфир, пиридин-НР, НР в мочевине, Εΐ₃Ν(ΗΡ)₃ (где Εΐ представляет собой этил) или т.п., где растворитель, например, выбирают из группы, состоящей из Ν,Ν-диметилформамида, ацетонитрила, хлороформа и тетрагидрофурана.

Предпочтительно Ρτοΐ представляет собой эфирную защитную группу, особенно, выбранную из группы, состоящей из силильных защитных групп, в которых силильный фрагмент содержит вплоть до трех органических фрагментов, связанных через углерод (необязательно через другой атом δί), таких как трет-бутилдифенилсилил, триметилсилил, триизопропилсилил, трет-бутилдиметилсилил, трифенилсилил, дифенилметилсилил, три-трет-бутилдиметилсилил, трет-бутилметоксифенилсилил, трис(триметилсилил)силил или т.п.

Ρτοΐ* представляет собой защитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, и также не затрагивая депсипептидную сложноэфирную связь или линкер со смолой ΚΕδ, и которая является стабильной на стадиях удаления защитных групп во время процесса синтеза линейного пептида-предшественника (например, удаления аллилоксикарбонила); он предпочтительно представляет собой защитную группу, удаляемую специфическими трифенилфосфиновыми комплексами в присутствии гидридов металлов или других восстановителей, например (ГН^^й, предпочтительно в комбинации с гидридом ди-н-бутилолова или гидридом три-н-бутилолова, фенилсиланом, боргидридом натрия или димедоном, в соответствующем растворителе, например в тетрагидрофуране, и предпочтительно не отщепляется в условиях, которые обеспечивают, например, удаление защитной группы Ρτοΐ**; и Ρτοΐ* выбирают из группы, состоящей из С₃-С₈-алк-2енилоксикарбонильных фрагментов, например аллилоксикарбонила (ΑΙΙοο),

- 19 025546

1-изспропилаллилоксикарбонила, 4-нитроциннамилоксикарбонила и З-(З'-пиридил) проп-2енилоксикарбонила.

Рго!** представляет собой защитную группу, которую можно удалить на смоле без разрушения других связей (без отщепления аминокислоты или пептидной связи через ее карбонил (особенно αкарбоксильной группы для связывания через линкер Ь, упомянутый далее; также без отщепления защитной группы Рго!, если она присутствует), особенно защитную группу, удаляемую без разрушения сложноэфирной (вместо амидной) связи в депсипептиде или предшественнике депсипептида, и в условиях, отличающихся от тех, которые используют для указанных защитных групп Рго!* и Рго!, сохраняя при этом связывание через линкер со смолой КЕ§, если присутствует; предпочтительно, чтобы ее можно было удалить слабым основанием, например пиперидином, морфолином, дициклогексиламином, пдиметиламинопиридином, диизопропиламином, пиперазином, трис-(2-аминоэтил)амином, в соответствующем растворителе, например Ν,Ν-диметилформамиде, метиленхлоиде; Рго!**, например, выбирают из группы, состоящей из флуорен-9-илметоксикарбонила (Ртос); 2-(2'- или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.

Рго!*** (аминозащитная группа, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле) и Рго!**** (защитная группа, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные защитные группы, присутствующие в соединении формулы II, как определено выше и далее, причем продукт при этом остается на смоле) представляют собой предпочтительно защитные группы, которые можно удалить Рго!**, и которые, например, выбирают из групп, которые указаны для К**, например флуорен-9-илметоксикарбонила (Ртос).

В предпочтительном способе ортогонального синтеза в данном случае используют способ с использованием Ртос, который общеизвестен для пептидного синтеза с использованием твердофазного пептидного синтеза, комбинированного с жидкофазной макролактамизацией, и дальнейших химических превращений,

Альтернативно, например, Вос-защитную группу можно использовать вместо Ртос Рго!**, Рго!*** и Рго!****.

Однако такой вариант потребует других защитных групп для боковых цепей, а также понадобится другим способом защищать гидроксигруппу в Ν-метил-Туг для сохранения ортогональности защитных групп.

Другие присутствующие защитные группы, также как линкеры, связывающие со смолой КЕ§, если присутствуют, предпочтительно не удаляются в условиях, в которых можно удалить Рго!* и Рго!**, например в А*, амид может быть Ν-защищен, например, тритилом (трифенилметилом) (удаление, например, трифторуксусной кислотой (ТРА); в Кб* гидрокси тирозина может быть защищен как третбутиловый эфир, или защищен трет-бутилдиметилсилилом, метоксиметилом, Вос-(третбутоксикарбонилом) или арилацетатом (удаление с использованием ТРА).

Соответствующие защитные группы хорошо известны специалистам в данной области, также как способы их введения и удаления. Например, защитные группы, способы их введения и удаления можно выбрать из тех, что раскрыты в стандартных учебниках, таких как Рго!ес!ще Огоирк ίη Огдашс 8уп!Ье515, З^гб еб., Т.^. Огееп апб Р.О.М. ^и!5 (Ебк.). I. \УПеу & §опк, Шс., Νον Уогк е!с. 1999.

Таким образом, указанные защитные группы Рго!, Рго!*, Рго!**, Рго!***, Рго!**** и другие защитные группы не ограничены перечисленными выше-скорее, они должны соответствовать условиям, которые делают их подходящими для ортогональной защиты, например, как раскрыто выше или далее.

Рекомендуется избегать слишком щелочных условий (хотя основания, раскрытые для удаления Ртос, такие как пиперидин, обычно считаются приемлемыми), чтобы избежать разрушения депсипептидной (сложноэфирной) связи.

Среди возможных твердых носителей для твердофазного пептидного синтеза (8оМ РЬазе Пептид 8уп!Ье515 (8РР8)) можно указать следующие:

носители гелевого типа со спейсерами или без них: Оки представляют собой сильно сольватированные полимеры с равномерным распределением функциональных групп. Указанный тип носителей является наиболее общепринятым и включает полистирол: стирол поперечносшитый, например 1-2% дивинилбензолом; полиакриламид или полиметакриламид: в качестве гидрофильной альтернативы полистиролу; полиэтиленгликоль (РЕО): РЕОполистирол (РЕО-Р8) более стабилен, чем полистирол и отделяет сайт синтеза от основной цепи полимера; носители на основе РЕО: состоят из сетки РЕО-полипропиленгликоля или РЕО с полиамидом или полистиролом (они уже включены в спейсер, РЕО);

носители поверхностного типа: материалы, созданные для функционализации поверхностей, включая стекло с контролируемым размером пор, целлюлозные волокна и полистирол с высокой степенью сетчатости сруктуры;

композиты: полимеры гелевого типа, нанесенные на жесткие матрицы.

Обычно указанные гели содержат реакционноспособные группы, с которыми может быть связан линкер Ь, как указано выше и далее, для различных предшественников. Например, такие группы включают аминометильные группы, группы полиэтиленгликоля с концевыми гидрокси, и т.п.

- 20 025546

Любой из указанных носителей можно использовать в вариантах настоящего изобретения.

Носители гелевого типа используют в других специальных вариантах настоящего изобретения. Среди них, полистирол (поперечносшитый дивинилбензолом); полиакриламидные и полиметакриламидные смолы особенно предпочтительны. Среди возможных линкеров можно использовать все общеизвестные и соответствующие.

Примерами возможных вариантов настоящего изобретения служат 2-метокси-4бензилоксибензиловый спирт линкер (8а8гш-линкер, 8а8гш-обозначение для смолы, суперчувствительной к кислоте, связывает аминокислоты или пептиды через спиртовую группу ОН); семейство тритильных линкеров (например, тритил, 2С1-тритил, которые связывают аминокислоты или пептиды через ОН); 4-(2,4-диметоксифенилгидроксиметил)феноксиметил-линкер (кислота Ринка-линкер, связывает аминокислоты или пептиды через ОН); или линкеры трис-(алкокси)бензилового эфира (НАЬ-линкер, связывает аминокислоты или пептиды через ОН).

В случаях, где указаны реакционноспособные производные кислот, особенно аминокислот, или пептидов, например дипептиды, они могут образоваться ίη δίΐιι. или они могут быть использованы как таковые.

Реакционноспособные (или активные) производные, используемые как таковые, включают ацилгалогениды, например ацилхлориды, ацилфториды или ацилнитрофениловые эфиры, например 2,4-динитрофениловые эфиры, или ангидриды кислот (симметричные или, например, с уксусной кислотой) карбоксильных групп кислот подлежащих реакции.

Для ίη δϊΐιι активации аминокислот можно использовать обычные сочетающие агенты. Такие реагенты хорошо известны специалистам в данной области, и их можно получить из многих источников, например от АИпсН СЬетТИек-Рерйбе δνηΐΐϊδίδ (А16псН СЬетюа1 Со., Шс., Шдта-АИпсН Согрогайоп, МЛтеаикее, ОД, И8А) Уо1. 7 Νθ. 2, 2007 (см.

НИр://тетете.518таа16г1сН.сот/е1с/те61аПЬ/6ос5/А16г1сН/ВгосНиге/а1_сНетП1е_ν7_η2. Раг. 0001. Рт1е.

1тр/а1_сЬетй1е_у7_п2.р6Г). Среди возможных сочетающих агентов для синтеза амидных и сложноэфирных связей можно указать следующие.

Триазолы, производные урония или гексафторфосфония, например 1-гидрокси-бензотриазол (НОВ1), 1-гидрокси-7-азабензотриазол (НОА1), этил 2-циано-2-(гидроксиимино)ацетат, 2-(1Н-7азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуронийгексафторфосфат метанаминий (НАТИ), бензотриазол-1ил-окситрипирролидинофосфонийгексафторфосфат (РуВОР), бензотриазол-1-илокси-трис(диметиламино)фосфонийгексафторфосфат (ВОР), 1-(мезитилен-2-сульфонил)-3-нитро-1,2,4-триазол (Μ8ΝΤ), 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуронийгексафторфосфат (НВТИ), 2-(1Нбензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуроний-гексафторборат (ТВТИ), 2-сукцинимидо-1,1,3,3тетраметилуронийтетрафторборат (Т8ТИ), 2-(5-норборнен-2,3-дикарбоксимидо)-1,1,3,3тетраметилуронийтетрафторборат (ТЛТи), О-[(циано(этоксикарбонил)метилиден)амино] -1,1,3,3тетраметилуронийтетрафторборат (ТОТИ), О-(бензотриазол-1 -ил) -1,3 -диметил-1,3диметиленуронийгексафторфосфат (НВМОи), О-(бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-бис(тетраметилен)уронийгексафторфосфат (НВРуИ), О-(бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-бис(пентаметилен)уронийгексафторфосфат (НВР1рИ), 3-гидрокси-4-оксо-3,4-дигидро-1,2,3-бензотриазин (НООЬЫ), 1-гидрокси-7-азабензотриазол и их соответствующие соли урония или фосфония, обозначаемые НАРуИ и АОР, 1-циано-2-этокси-2-оксоэтилиденаминооксидиметиламиноморфолинокарбенийгексафторфосфат (СОМИ), хлортрипирролидинофосфонийгексафторфосфат (РуС1оР) или т.п.

Карбодиимиды, например дициклогексилкарбодиимид, ^(3-диметиламинопропил)-№этилкарбодиимид, 1-трет-бутил-3-этилкарбодиимид, ^циклогексил-№-2-морфолиноэтил) карбодиимид или диизопропилкарбодиимид (особенно для образования сложного эфира через образование О-ацилмочевины карбоксильной группы); или агенты, образующие активные сложные эфиры, например 2-меркаптобензотиазол (2-МВТ), азидобразующие агенты, например дифенилфосфорилазид, ангидриды кислот, такие как ангидрид пропанфосфоновой кислоты, агенты галогенирования кислот, например 1 -\лор-КК2-триметил-1 -пропениламин, хлорА^№,№-бис(тетраметилен)формамидинийтетрафторборат или гексафторфосфат, хлор-Ν,Ν,Ν',Ν¹тетраметилформамидинийгексафторфосфат, фтор-Н,№,№,№-тетраметилформамидинийгексафторфосфат, фтор-Н,^№,№-бис-(тетраметилен)формамидинийгексафторфосфат или т.п., или смеси двух или более таких агентов.

Также для осуществления реакции сочетания сложного эфира соединений формул XII или XIIА с соединениями формул XIII или XIIIА соответственно, или соединений формул XIII* или XIIIА* с соединениями формул XXVI или XXVIА соответственно, соответствующие реакционноспособные карбоксильные соединения можно использовать или образовать их ίη Ши. Здесь особенно предпочтителен М8№Т в качестве сочетающего агента, так как он позволяет поддерживать высокую стереоспецифичность.

- 21 025546

Указанную реакцию можно вести, если возможно, в присутствии слабого основания (например Ν-метилморфолина, триалкиламина, например этилдиизопропиламина, ди(алкил)аминопиридина, такого как Ν,Ν-диметиламинопиридин, или т.п. (позаботясь о том, чтобы условия не оказались столь основными, чтобы позволить протекать гидролизу сложноэфирной группы, например указанной депсипептидной сложноэфирной группы, присутствующей в соединениях-предшественниках формулы I), где соответствует или требуется в присутствии соответствующего растворителя или смеси растворителей, например Ν.Ν-.циалкилформамида. такого как диметилформамид, галогенированного углеводорода, например дихлорметана, Ν-алкилпирролидонов, таких как Ν-метилпирролидон, нитрилов, например ацетонитрила, или других ароматических углеводородов, например толуола, или смеси двух или более их них, где, при условии избытка присутствующего сочетающего агента может также присутствовать вода. Температуры могут быть комнатными или ниже или выше комнатных температур, например в интервале от -20 до 50°С.

Аминокислоты формул IX, КА, XI, Х^, XIII, ХША, XV, ХУА, XVII, ХУЛА, XXVII (полученные, например, 8о1иИоп Рбаке синтезом), XVII*, XVIIА*, XV*, XVА*, XIII*, XIIIА*, XI*, XIА*, IX* и КА* известны или их можно синтезировать хорошо известными специалистам в данной области способами, они коммерчески доступны или их можно синтезировать аналогичными известным специалистам способами.

Кроме того, остальные исходные материалы, например указанные кислоты формулы XIX или VII, или дипептиды формул XXVII или XXVIIА, известны или их можно синтезировать, используя известные специалистам способы, они коммерчески доступны и/или их можно синтезировать по аналогии с известными специалистам способами.

Например, синтон формулы XIX можно получить способом из примера 1А(4) (который представляет собой специфический вариант настоящего изобретения) или аналогичным ему способом. Синтез промежуточного соединения 1 (схема 1) раскрыт в ТебабеФоп 61, 1459-1480 (2005).

В реакциях сочетания для получения дипептидов используют соответствующие карбоксильные группы аминокислот в свободной форме или в активированной форме.

Примеры.

Следующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение, не ограничивая его объем.

Сокращения:

Ац. - водный;

Вос/ВОС - трет-бутоксикарбонил;

Вппе - раствор хлорида натрия в воде (насыщенный при комнатной температуре);

Βζ1 - бензил;

СОМи - 1-циано-2-этокси-2-оксоэтилиденаминооксидиметиламиноморфолинокарбенийгексафторфосфат;

ЭСМ - дихлорметан;

ΌΡΕΆ - Ν,Ν-диизопропилэтиламин;

ΌΜΛΡ - 4-диметиламинопиридин;

ΌΜΡ (ДМФ) - Ν,Ν-диметилформамид;

Ртос/РМОС - 9-флуоренилметоксикарбонил;

ΕΙ - этил;

НАТИ - 2-(1Н-7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуронийгексафторфосфат метанаминий;

НИР - гексафторизопропанол;

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;

НК-М8 (НК-МС) - масс-спектроскопия высокого разрешения;

ША - изопропилацетат;

ШС - контроль в процессе получения;

ΣΚ (ИК) - инфракрасная спектроскопия;

РТ - внутренняя температура;

тест Кайзера - тест с использованием нингидрина для контроля за удалением защитных групп в 8РР8 (см. Е. Ка18ег, К. Ь. Со1е8сой, С. Ό. Воккшдег, Ρ. I. Соок, Апа1у11са1 ВюсйетШгу 1970, 34 595); если результат указан как ОК, это означает успешное удаление защитных групп;

те - метил;

М8 (МС) - масс-спектроскопия;

М8ЭТ - 1-(мезитилен-2-сульфонил)-3-нитро-1,2,4-триазол;

NМК (ЯМР) - спектроскопия ядерного магнитного резонанса;

РуВОР - бензотриазол-1-илокситрипирролидинофосфонийгексафторфосфат;

ВОР - бензотриазол-1-илокси-трис-(диметиламино)фосфонийгексафторфосфат;

КР - обращенная фаза;

КТ/й - комнатная температура;

8РР8 - твердофазный пептидный синтез;

ТВМЕ - трет-бутилметиловый эфир;

- 22 025546

ΤΡΑ - трифторуксусная кислота;

ΤΕΜΡΟ - 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси, свободный радикал;

ΡΒΡ - круглодонная колба.

Сокращения для аминокислот см. в приведенной выше таблице.

Названия соединений.

Названия олигопептидов с открытой цепью приведены в соответствии с рекомендациями ΙοίηΙ Сотш188юп οη ВюсЬетюа1 Ыотепс1а1иге (!ηΐ0ΓηαΙίοηα1 υηίοη Риге апб ЛррПсб СЬетМгу и 'ΊπΙοπιαΙίοιη-ιΙ υηίοη ο£ ВюсЬет181гу), опубликованными в Риге & Αρρί. СЬет. 1984, 56, 595-624. Ранее, для указанных соединений использовали конвенцию для наименований простых пептидов. Более ранние названия приводятся в скобках.

Пример 1. Синтез соединения А.

1А. Синтез синтона 1.

(ί) Альтернатива 1.

Схема реакции 1:

1А(1) Получение соединения 1.

(8)-бензил-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-5-гидроксипентаноат.

Соединение 1 получают способом, аналогичным способу, раскрытому К. К. ΟΡοη. К. Катакату, Т. Етегу, I. Огд. СЬет. 1984, 49, 3527. ВОС-С1и-ОВ/1 (50 г, 148,2 ммоль) растворяют в тетрагидрофуране: (800 мл) и добавляют триэтиламин (47,3 г, 467,4 ммоль). Полученный раствор охлаждают до внутренней температуры = -10°С. Медленно добавляют этилхлорформиат (51,8 г, 98% чистоты, 467,8 ммоль), поддерживая при этом внутреннюю температуру в интервале от -10 до -15°С. Полученную таким образом суспензию перемешивают еще в течение часа. Данные ГРС (ВЭЖХ) указывают на исчезновение исходного материала. Реакционную смесь оставляют нагреваться до 0°С и добавляют воду (800 мл) при 0-5°С в течение 25-30 мин. Становится видным разделение полученной смеси на две фазы. При интенсивном перемешивании добавляют 10 порциями боргидрид натрия (11,8 г, 299,4 ммоль) при температуре 0-5°С. Предпринимают предосторожности, так как во время добавления боргидрида натрия происходит выделение водорода. Полученную реакционную смесь перемешивают в течение дополнительных 5 мин при температуре 0-5°С, и затем температуру повышают до 20-25°С в течение 30 мин. Требуется осторожность, так как водород продолжает выделяться при повышении температуры. Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 15 мин при температуре 20-25°С перед окончательной обработкой.

Для окончательной обработки к. реакционной смеси добавляют воду (1250 мл), затем добавляют этилацетат (1250 мл). Образовавшиеся фазы разделяют, и водную фазу экстрагируют этилацетатом (600 мл). Органические слои объединяют и промывают солевым раствором (2x600 мл). Органический слой сушат над безводным сульфатом магния, растворитель выпаривают при пониженном давлении и 40-45°С, получая 50,8 г сырого продукта. Степень чистоты по данным: ВЭЖХ: 94 а%. Полученный сы- 23 025546 рой продукт очищают, используя флэш-хроматографию на силикагеле, смесь фракция гексана/этилацетат (с 7:3 до 1:1) в качестве подвижной фазы.

Выход: 40,85 г (85,2%). Степень чистоты: 98% (ВЭЖХ). Данные МС и ЯМР подтверждают предполагаемую структуру.

1Ά(2) Получение соединения 2.

(8)-бензил-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-5-((трет-бутилдифенилсилил)окси)пентаноат.

Спирт (соединение 1), полученный на предшествующей стадии, (40,3 г, 124,6 ммоль) растворяют в диметилформамиде (200 мл) и добавляют имидазол (12,8 г, 99,5% степень чистоты, 186,9 ммоль). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре, до тех пор, пока не образуется раствор (5-10 мин). Трет-бутил-дифенилсилилхлорид (41,9 г, 98% степень чистоты, 14 9,5 ммоль) добавляют по каплям в течение 10 мин, и перемешивание продолжают в течение еще 15 мин при комнатной температуре. ГРС (ВЭЖХ) свидетельствует об исчезновении исходного материала (спирта). Для окончательной обработки к реакционной смеси добавляют изопропилацетат (400 мл), с последующим медленным добавлением полунасыщенного водного раствора бикарбоната натрия (400 мл). Добавление осуществляют осторожно, так как добавление процесс экзотермический и сопровождается выделением газа. Образовавшиеся фазы разделяют, и водную фазу экстрагируют изопропилацетатом (400 мл). Органические слои объединяют и экстрагируют водой (400 мл). Органический слой сушат над сульфатом магния, и растворитель выпаривают при температуре 40-45°С при пониженном давлении. Остаток сушат в течение ночи в вакууме при температуре 25°С, получая 83,25 г сырого продукта в виде бесцветного масла. Данные ВЭЖХ свидетельствуют о присутствии 81 а% нужного продукта и 18,6 а% соответствующего силанола. Полученный сырой продукт используют без дополнительной очистки на следующей стадии. Данные ЯМР и НК-МС очищенного образца подтверждают предполагаемую структуру. НК-МС: Рассчитано для С₃₃Н₄₃ЫО₅§1: [М+Н]+: 562,29833; [Μ+ΝΗ₄]+: 579,32488; [М+Ыа]⁺: 584,28027. Найдено: [М+Н]+: 562,29848; [Μ+ΝΗ₄]+: 579,32489; [М+№]+: 584,27995.

1Ά(3) Получение соединения 4.

(8)-бензил-2-((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-5-((третбутилдифенилсилил)окси)пентаноат.

83,25 г сырого продукта с предшествующей стадии (соответствует 70 г теоретического выхода соединения 2, 124,6 ммоль) растворяют в дихлорметане (650 мл) и по каплям добавляют трифторуксусную кислоту (358,8 г, 99% степень чистоты, 3115 ммоль) к интенсивно перемешиваемому раствору. ГРС (по данным ВЭЖХ) через 30 мин свидетельствует о полном удалении ВОС-защитной группы. Полученную реакционную смесь (прозрачный раствор) переносят в 6-л 4-горлую колбу с механической мешалкой и разбавляют 1000 мл дихлорметана. Полунасыщенный водный раствор карбоната натрия (1800 мл) медленно добавляют к интенсивно перемешиваемому раствору. Предпринимают предосторожности, так как во время добавления карбоната натрия наблюдается интенсивное выделение газа. рН водной фазы после завершения добавления: 9-10. Полученную реакционную смесь перемешивают в течение дополнительных 15 мин, и образовавшиеся фазы разделяют. Водную фазу экстрагируют дихлорметаном (1000 мл), и органические слои объединяют, получая раствор продукта в дихлорметане. Полученный раствор концентрируют при температуре 40-45°С при пониженном давлении до конечного объема приблизительно 650 мл для следующей стадии. По данным ВЭЖХ в растворе присутствует 80,5% соединения 3 и 19,5 а% силанола.

Для РМОС-илирования насыщенный водный раствор бикарбоната натрия (650 мл) медленно добавляют к интенсивно перемешиваемому раствору соединения 3, затем добавляют РМОС-хлорид (36,55 г, 97% степень чистоты, 137 ммоль). Предпринимают предосторожности, так как во время добавления РМОС-С1 происходит выделение газа. Перемешивание продолжают в течение 15 мин при комнатной температуре. ЮС (ВЭЖХ) органического слоя свидетельствует об исчезновении промежуточного соединения 3 и полном превращении в соединение 4. Для окончательной обработки слои разделяют, и водную фазу экстрагируют дихлорметаном (650 мл). Органические слои объединяют и экстрагируют водой (650 мл). Органический слой сушат над безводным сульфатом магния, и растворитель удаляют при температуре 40-45°С при пониженном давлении, получая 112,6 г сырого продукта.

Полученный сырой продукт суспендируют в смеси этанол/изопропанол/вода (89:5:6; 2400 мл), и порученную суспензию нагревают до внутренней температуры 50°С, получая раствор. Полученный раствор охлаждают до 45°С, добавляют затравочные кристаллы, и температуру продолжают снижать до 20-25°С в течение 1 ч. Кристаллизация начинается при приблизительно 40°С. Полученную суспензию перемешивают при 20-25°С в течение ночи, затем охлаждают до внутренней температуры 0-5°С в течение 30 мин, и перемешивание продолжают в течение дополнительно 2 ч при температуре 0-5°С. Полученный продукт выделяют фильтрованием, фильтровальную лепешку промывают смесью этанол/изопропанол/вода (89:5:6; 240 мл) и сушат при пониженном давлении, получая чистое соединение 4 (100 а% степень чистоты по данным ВЭЖХ). Выход: 66г (77,4%). Полученный продукт полностью охарактеризован по данным МС и ЯМР НК-МС: Рассчитано для Χ₃Η₄₅ΝΟ₅δί: [М+Н]+: 684,31398; ^Να^^: 701,34053; [М+№]+: 706,29592. Найдено: [М+Н]+: 684,31392; №+N^4 701,34021; [М+№]+: 706,29539. Маточный раствор дает (по данным ВЭЖХ) 30,6 г пены, включающей 30 а% продукта и 29

- 24 025546 а% силанола.

1А(4) Получение синтона 1 из соединения 4.

(8)-2-((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-5-((трет-бутилдифенилсилил)окси)пентановая кислота.

Соединение 4 (66 г, 96,6 ммоль) суспендируют в смеси этанол/изопропиловый спирт/вода (89:5:6; 3000 мл), и полученную суспензию нагревают до внутренней температуры 45°С, получая раствор. Полученный раствор охлаждают до внутренней температуры 30°С. После обработки аргоном палладиевый катализатор (10% на сульфате бария; 6,6 г) добавляют к полученному раствору в потоке аргона. Полученный продукт затем гидрируют при давлении водорода несколько выше атмосферного давления и при температуре 30-35°С. Гидрирование завершается через 1,5 ч по данным ВЭЖХ. Полученную реакционную смесь фильтруют через целлюлозный фильтр (Се11йоск 40; фильтр на основе целлюлозы), и фильтр промывают смесью этанол/изопропанол/вода (89:5:6; 600 мл). После выпаривания растворителя при пониженном давлении при 45-50°С получают 59,58 г пены в виде сырого продукта. Полученный сырой продукт очищают, используя хроматографию на силикагеле, двумя порциями (2x1 кг силикагеля 60), используя дихлорметан/метанол 95:5 до 80:20 в качестве подвижной фазы. Выход: 52 г (90,6%). Полученный продукт полностью охарактеризован по данным МС и ЯМР. НК-МС: Рассчитано для С₃₆Н₃<^О₅Зк [М+Н]+: 594,26703; [Μ+ΝΗ₄]+: 611,29358; [М+Ыа]⁺: 616,24897; Найдено: [М+Н]+: 594,26743; [Μ+ΝΗ₄]+: 611,29385; [М+№]+: 616,24900.

(ΐΐ) Альтернатива 2.

Схема реакции 2:

1А(5) Получение соединения 4 из Ршос-С1н-ОВ/1 через соединение 5 в одном реакторе. Ртос-С1и-ОВ/1 (5 г, 10,88 ммоль) растворяют в тетрагидрофуране (80 мл) и добавляют триэтиламин (3,3 г, 32,6 ммоль). Полученный раствор охлаждают до -15°С, и к полученному раствору добавляют этилхлорформиат (7,3 г, 67,27 ммоль) в течение 30 мин при температуре -12°С. Полученную таким образом суспензию перемешивают еще в течение часа при температуре от -10 до -15°С, и температуру повышают до 0°С. К реакционной смеси по каплям добавляют воду (80 мл), поддерживая температуру при 0°С. Тремя порциями добавляют боргидрид натрия (всего 0,805 г, 21,27 ммоль) (по 1 порции каждые 10 мин) при 0°С, и полученную реакционную смесь перемешивают в течение дополнительно 1 ч при 0°С. Предпринимают предосторожности, так как происходит выделение водорода. Полученную реакционную смесь разбавляют водой (100 мл) и экстрагируют изопропилацетатом (150 мл), после чего слои разделяют. Водную фазу снова экстрагируют изопропилацетатом (100 мл), и органические слои объединяют. Объединенную органическую фазу промывают полунасыщенным раствором хлорида натрия (2x50 мл), и полученный раствор концентрируют при пониженном давлении до конечного объема приблизительно 50 мл. Концентрированный раствор тщательно фильтруют, и остаток на фильтре промывают изопропилацетатом (20 мл). Полученный таким образом раствор соединения 5 переносят в круглодонную колбу и добавляют имидазол (1,49 г, 21,89 ммоль). Полученную смесь перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре и добавляют трет-бутилдифенилсилилхлорид (4,45 г, 16,19 ммоль), Полученную

- 25 025546 реакционную смесь перемешивают в течение 15 ч при комнатной температуре. Для окончательной обработки полученную суспензию разбавляют изопропилацетатом (20 мл) и экстрагируют водой (3x50 мл). Органический слой отделяют, и растворитель выпаривают при пониженном давлении, получая 9,95 г сырого продукта. Полученный сырой продукт очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле и смесь изопропилацетат/гексан (2:8) в качестве подвижной фазы, получая 6,5 г твердого вещества, которое суспендируют в гексане и перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок выделяют фильтрованием и сушат при 50°С при пониженном давлении, получая 5,6 г соединения 4. Выход: 75% за две стадии. НК-МС: Рассчитано для СдзН^ЫО^г [М+Н]+: 684,31398; [Μ+ΝΗ₄]+: 701,34053; [М+№]+: 706,29592. Найдено: [М+Н]+: 684,31430; [Μ+ΝΗ₄]+: 701,34073; [М+№]+: 706,29577.

1А(6) Альтернативное получение в одном реакторе соединения 4 из Ртос-ΟΙυ-ΟΒζΙ через соединение 5, используя изопропилхлорформиат вместо этилхлорформиата.

Ртос-ΟΙπ-ΟΒζΙ (60 г, 130,579 ммоль) растворяют в тетрагидрофуране (550 мл) и добавляют триэтиламин (40,8 г, 403,202 ммоль). Получают мутный раствор с некоторым количеством осадка. Полученную смесь мутный раствор/суспензия переносят в капельную воронку и добавляют к предварительно охлажденному раствору изобутилхлорформиата (54,96 г, 402,41 ммоль) в тетрагидрофуране (300 мл) в 4,5-л реакторе при температуре от -35 до -30°С, поддерживая указанную температуру вс время добавления. Остатки в капельной воронке промывают дополнительным количеством тетрагидрофурана (50 мл), и полученную реакционную смесь перемешивают при температуре от -35 до -30°С в течение дополнительно двух часов. К реакционной смеси добавляют воду (960 мл) в течение 45 мин, позволяя температуре повыситься до 0°С. Образуется суспензия. Боргидрид натрия (14,4 г, 380,625 ммоль) добавляют 20 порциями в течение 1 ч при температуре 0°С, и полученную реакционную смесь перемешивают еще в течение часа при 0°С. Предпринимают предосторожности, так как происходит выделение водорода. Полученную суспензию выливают в трет-бутилметиловый эфир (600 мл), и реакционную колбу промывают водой (600 мл), которую добавляют к смеси полученных продуктов (2 фазы). Образовавшиеся фазы разделяют, водную фазу экстрагируют трет-бутилметиловым эфиром (600 мл), и органические фазы объединяют. Органическую фазу промывают водой (2x600 мл), сушат над безводным сульфатом магния (200 г), и растворитель удаляют при пониженном давлении до конечного объема 1 л. Полученный раствор разбавляют диметилформамидом (600 г), и растворитель выпаривают при пониженном давлении до конечного объема 400 мл. Полученный таким образом раствор соединения 5 переносят в круглодонную колбу. Имидазол добавляют (14,4 г, 211,524 ммоль) к раствору соединения 5 в ОМР. и полученную смесь перемешивают в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем по каплям добавляют ΤΒΌΡδ-Ο (39,6 г, 144,07 ммоль) в течение 20 мин при температуре 20-25°С, и полученную реакционную смесь перемешивают еще в течение часа при указанной температуре.

Полученную реакционную смесь выливают в этилацетат (1200 мл), и полученную смесь экстрагируют водой (700 мл). Слои разделяют, и органический слой промывают водой (3x300 мл). В результате выпаривания растворителя при пониженном давлении получают 106 г сырого продукта.

Полученный сырой продукт (106 г) растворяют в смеси этанол/изопропанол/вода (89:5:6; 1200 мл) при температуре 40-50°С и добавляют затравочные кристаллы (0,5 г соединения 4). Полученную смесь оставляют охлаждаться до комнатной температуры и перемешивают в течение 17 ч при комнатной температуре. Полученную суспензию охлаждают до -20°С и перемешивают в течение 2 ч при -20°С. Полученный продукт Е.ыделяют фильтрованием, фильтровальную лепешку промывают смесью растворителей этанол/изопропанол/вода (89:5:6; 3x200 мл) и сушат при 40°С при пониженном давлении, получая

66,5 г соединения 4 (74,6% выход за 2 стадии). По данным ВЭЖХ степень чистоты полученного продукта >99 а%.

Дополнительное количество продукта можно выделить из маточного раствора (34 г после выпаривания растворителя), который содержит приблизительно 30 а% соединения 4 по данным ВЭЖХ.

1В Синтез пептида-предшественника 1 с использованием δΡΡδ.

Пептид-предшественник 1: изобутирил-О1п(Тп)-ТЬт(Пе-Туг(1Ви)Ме-Пе-синтон 1-Н)-Ьеи-ОН

- 26 025546

Пептид-предшественник 1

Пептид-предшественник 1 получают, используя 2 различных твердых носителя.

Оборудование.

Реактор твердофазного синтеза с фильтрующей тканью или пластиной пористого стеклянного фильтра на дне. Азотный коллектор позволяет отводить содержимое реактора через фильтрующую ткань или пластину пористого стеклянного фильтра и нижний клапан.

1В(1) Присоединение тритил-линкера к твердому носителю.

200 г аминометилполистирольной смолы (сшитой 1% дивинилбензолом, содержание аминометильных групп 1 ммоль/г) (поставщик: 8еии СЬеписай АО, 01ейбогГ/8\\тЮег1апб) перемешивают поочередно с несколькими порциями диметилформамида (1600 мл) и изопропанола (1600 мл). После двух конечных промывок диметилформамидом смолу обрабатывают приготовленным заранее раствором 4-гидроксидифенилметилбензойной кислоты (91,3 г, 300 ммоль), моногидратом 1-гидроксибензотриазола (45,9 г, 300 ммоль) и диизопропилкарбодиимидом (75,7 г, 600 ммоль) в диметилформамиде (1600 мл). Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 1,5 ч, и проводят нингидриновый тест. Результаты теста все еще свидетельствуют о наличии свободных аминогрупп, и поэтому добавляют диизопропилкарбодиимид (7,6 г, 60 ммоль), и реакционную смесь перемешивают в течение ночи. Следующий нингидриновый тест утром оказывается отрицательным, и полученную реакционную смесь отфильтровывают. Полученную смолу поочередно промывают диметилформамидом и изопропанолом. Смолу сушат в вакууме, получая в результате 257 г сухой линкер-смолы. Полученный материал используют на следующей стадии синтеза без дальнейших анализов.

1В(2) Присоединение Ртос-Ьеи-ОН.

Получение Ртос-Ьеи-линкер-смолы.

Осуществляют набухание линкер-смолы (190 г, 147,8 ммоль), перемешивая ее в толуоле (1400 мл). Растворитель отфильтровывают и заменяют раствором толуола (1400 мл) и ацетилхлорида (53 мл, 1478 ммоль). Полученную смесь перемешивают в течение 2 ч, отфильтровывают, заменяют идентичной смесью и перемешивают в течение еще 2 ч перед тем, как отфильтровывают. Хлорированную смолу дважды промывают толуолом и трижды дихлорметаном.

В круглодонной колбе приготавливают раствор Ртос-Ьеи-ОН (104,8 г, 296 ммоль) и Ν-метилморфолина (49 мл, 444 ммоль) в дихлорметане (600 мл). Полученный раствор добавляют к смоле и перемешивают в течение ночи. Утром полученный раствор отфильтровывают, и смолу промывают поочередно дихлорметаном и изопропанолом. Полученную смолу сушат в вакууме и получают в результате 234,7 г сухой Ртос-Ьеи-линкер-смолы. Содержание Ртос-групп определяют как 0,787 ммоль/г, что приводит к выходу 185 ммоль (125% от теоретического). Аминокислотный анализ на выходе подтверждает наличие <0,1% Ό-Ьеи энантиомера.

1В(3) Присоединение Ртос-ТЬг-ОН.

Получение Ртос-ТЬг-Ьеи-линкер-смолы.

Осуществляют набухание Ртос-Ьеи-линкер-смолы (140 г, 109 ммоль) путем перемешивания в двух последовательных порциях диметилформамида (1100 мл) в течение 30 мин в каждой.

Ртос защитную группу удаляют в результате двух последовательных промывок 20% пиперидином в диметилформамиде в течение 5 мин и 15 мин соответственно. Полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок диметилформамидом и изопропанолом. Добавляют фенолфталеин и воду к образцу раствора конечной промывки. Отсутствие розовой окраски подтверждает успешное удаление пиперидина.

Полученную смолу трижды промывают тетрагидрофураном (1200 мл) для подготовки к следующей стадии сочетания.

В круглодонной колбе получают раствор Ртос-ТЬг-ОН (112,1 г, 328 ммоль), моногидрата гидроксибензотриазола (51,25 г, 334 ммоль) и диизопропилкарбодиимида (51 мл, 655 ммоль) в тетрагидрофуране (600 мл). Полученный раствор добавляют к смоле и сразу проверяют значение рН (рН=6,5). Полученную

- 27 025546 реакционную смесь перемешивают в течение 1,5 ч, пока нингидриновый тест не свидетельствует о завершении реакции. Полученный раствор отфильтровывают, и полученную смолу промывают поочередно диметилформамидом и изопропанолом. Небольшой образец полученной смолы сушат и отправляют на аминокислотный анализ (0,13% Ό-Ьеи, <0,1% Ό-ТЬт, <0,1% Ь-аПо-ТЪг, <0,1% Ό-аПо-ТЬт), остальной материал отправляют на следующую стадию без дополнительной сушки.

1В(4) Присоединение Ртос-О1п(Тй)-ОН.

Получение Ртос-О1п(Т г1)-ТЪг-Ьеи-линкер-смолы.

Осуществляют набухание Ртос-ТЬг-Ьеи-линкер-смолы с предшествующей стадии путем перемешивания в двух последовательных порциях диметилформамида (1100 мл) по 30 мин каждое.

Ртос защитную группу удаляют в результате: двух последовательных промывок 20% пиперидином в диметилформамиде в течение 5 мин и 15 мин соответственно. Полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок диметилформамидом и изопропанолом. Фенолфталеин и воду добавляют к образцу конечного промывочного раствора. Отсутствие розовой окраски доказывает успешное удаление пиперидина.

Полученную смолу трижды промывают диметилформамидом (1100 мл) для подготовки к следующей стадии сочетания.

В круглодонной колбе приготавливают раствор Ртос-О1п(Тй)-ОН (138,6 г, 226 ммоль), НАТИ (86,2 г, 226 ммоль) и этилдиизопропиламина (58,4 г, 452 ммоль) в диметилформамиде (400 мл).

Полученный раствор добавляют к смоле и немедленно проверяют рН (рН=10). Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 3 ч до тех пор, пока нингидриновый тест не свидетельствует о завершении реакции. Полученный раствор отфильтровывают, и полученную смолу поочередно промывают диметилформамидом и изопропанолом.

Полученную смолу сушат в вакууме и получают в результате 170 г сухой Ртос-О1п (Тп)-ТЬг-Ьеилинкер-смолы. Содержание Ртос-групп определяют как 0,60 ммоль/г, что соответствует выходу 102 ммоль (94% от теоретического в расчете на последние две стадии). Аминокислотный анализ на выходе дает следующие значения: (0,13% Ό-Ьеи, <0,1% Ό-ТЬт, <0,1% Ь-аПо-ТЪт, <:0,1% Ό-аПо-ТЬт, <0,8% ϋ-Ο1η).

1В(5) Присоединение изомасляной кислоты.

Получение изобутирил-О1п(Тп)-ТЬт-Ьеи-линкер-смолы.

Осуществляют набухание Ртос-О1п(Тп)-ТЬт-Ьеи-линкер-смолы (169 г, 101 ммоль) путем перемешивания в двух последовательных порциях диметилформамида (1300 мл) в течение 30 мин каждое.

Ртос защитную группу удаляют, используя две последовательные промывки 20% пиперидином в диметилформамиде (1300 мл) в течение 5 мин и 15 мин соответственно. Полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок диметилформамидом и изопропанолом. Фенолфталеин и воду добавляют к образцу конечного промывочного раствора. Отсутствие розовой окраски доказывает успешное удаление пиперидина.

Полученную смолу трижды промывают диметилформамидом (1100 мл) для подготовки к следующей стадии присоединения.

В круглодонной колбе приготавливают раствор изомасляной кислоты (17,9 г, 203 ммоль), РуВОР (105,5 г, 203 ммоль) и этилдиизопропиламина (52,4 г, 406 ммоль) в диметилформамиде (550 мл).

Полученный раствор добавляют к смоле и немедленно контролируют рН (рН=9,5). Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 2,5 ч до тех пор, пока нингидриновый тест не свидетельствует о завершении реакции. Полученный раствор отфильтровывают, и полученную смолу промывают диметилформамидом и изопропанолом.

Полученный продукт непосредственно передают на следующую стадию без дополнительной сушки и дополнительных анализов.

1В(6) Присоединение Ртос-Пе-ОН (получение сложного эфира).

Получение изобутирил-О1п(Тп)-ТЬт(Пе-Ртос)-Ьеи-линкер-смолы.

Осуществляют набухание изобутирил-С1п (Тп)-ТЬг-Ьеи-линкер-смолы (влажной с предшествующей стадии, 101 ммоль) путем перемешивания в трех последующих порциях дихлорметана (1200 мл) в течение 20 мин каждое. Растворитель отфильтровывают и М§ЫТ (88 г, 297 ммоль) и Ртос-Пе-ОН (105 г, 297 ммоль) добавляют в твердом виде. Дихлорметан (500 мл) добавляют также как раствор Ν-метилимидазола (18,2 г, 223 ммоль) и этилдиизопропиламина (51,2 г, 396 ммоль) в дихлорметане (100 мл). Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч до тех пор, пока по данным ВЭЖХ реакция не завершается. Полученный раствор отфильтровывают, и полученную смолу промывают последовательно тремя порциями дихлорметана, тремя порциями диметилформамида и тремя порциями изопропанола. Полученную смолу сушат в вакууме, и в результате получают 172 г сухой изобутирилО1п(Тп)-ТЬт(Пе-Ртос)-Ьеи-линкер-смолы. Количество Ртос определяют как 0,418 ммоль/г, что дает вывод в 72 ммоль (71% за последние две стадии).

1В(7) Присоединение Ртос-^метил-Тут(1Вц)-ОН.

Получение изобутирил-О1п(Тп)-ТЬг(Пе-Туг(1Ви)Ме-Ртос)-Ьеи-линкер-смолы (Предыдущее название: изобутирил-О1п(Тп)-ТЬг(Пе-^те-Туг(1Ви)-Ртос)-Ьеи-линкер-смола).

- 28 025546

Осуществляют набухание изобутирил-О1п(Тг1)-ТЬг(Пе-Ртос)-Ьеи-линкер-смолы (172 г, 72 ммоль) путем перемешивания в двух последовательных порциях диметилформамида (1300 мл) в течение 30 мин каждое. Ртос защитную группу удаляют, используя две последовательные промывки 20% пиперидином в диметилформамиде (1400 мл) в течение 5 мин и 15 мин соответственно. Полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок диметилформамидом и изопропанолом. Фенолфталеин и воду добавляют к образцу конечного промывочного раствора. Отсутствие розовой окраски подтверждает успешное удаление пиперидина.

Полученную смолу трижды промывают диметилформамидом (1100 мл) для подготовки в следующей стадии присоединения.

Приготавливают раствор Ртос-И-метил-Туг(1Ви)-ОН (68,7 г, 144 ммоль) и НАТИ (55,1 г, 144 ммоль) в диметилформамиде (700 мл) и добавляют к пептид-смоле, затем добавляют раствор этилдиизопропиламина (37,5 г, 289 ммоль) в диметилформамиде (100 мл) при перемешивании. рН контролируют немедленно после добавления сочетающего раствора и после 1 ч реакции получают тот же самый результат (рН 10). Полученный раствор перемешивают в течение 2 ч до тех пор, пока нингидриновый тест не свидетельствует о завершении реакции. Полученный раствор отфильтровывают, и полученную смолу промывают поочередно диметилформамидом и изопропанолом.

Полученный продукт непосредственно передают на следующую стадию реакции без сушки и дополнительных анализов.

1В(8) Присоединение Ртос-Пе-ОН.

Получение изобутирил-О1п(Тг1)-ТЪг(Пе-Туг(1Ви)Ме-Пе-Ртос)-Ьеи-линкер-смолы. (Использовавшееся ранее название: изобутирил-О1п(Тг1)-ТЪг(ие-Н-те-Туг(1Ви)-Пе-Ртос)-Ьеи-линкер-смола).

Осуществляют набухание влажной изобутирил-О1п(Тг1)-ТЪг(Пе-Туг(1Ви)Ме-Ртос)-Ьеи-линкерсмолы (72 ммоль) путем перемешивания в двух последовательных порциях диметилформамида (1200 мл и 1300 мл) в течение 30 мин каждое. Ртос защитную группу удаляют, используя две последовательные промывки 20% пиперидином в диметилформамиде (1400 мл) в течение 5 мин и 15 мин соответственно. Полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок диметилформамидом и изопропанолом. Фенолфталеин и воду добавляют к образцу конечного промывочного раствора. Отсутствие розовой окраски свидетельствует об успешном удалении пиперидина.

Полученную смолу трижды промывают диметилформам:идом (1100 мл) для подготовки к следующей стадии сочетания.

В круглодонной колбе приготавливают раствор Ртос-Пе-ОН (103,9 г, 294 ммоль), СОМИ (125,9 г, 294 ммоль) и этилдиизопропиламина (76 г, 588 ммоль) в дихлорметане (440 мл) и диметилформамиде (440 мл).

Полученный раствор добавляют к смоле, и полученную реакционную смесь перемешивают в течение 20 ч. После этого времени проводят нингидриновый тест, который свидетельствует о завершении реакции. Полученный раствор отфильтровывают, и полученную смолу промывают поочередно диметилформамидом и изопропанолом.

Полученную смолу сушат в вакууме, получая 185,5 г сухой изобутирил-О1п(Тг1)-ТЬг(Пе-Туг(1Ви)МеНе-Ртос)-Ьеи-линкер-смолы. Содержание Ртос групп определяют как 0,40 ммоль/г. Таким образом получают количественный выход 74 ммоль.

1В (9) Присоединение синтона 1 и окончательное удаление Ртос защитных групп.

Получение изобутирил-О1п(Тг1)-ТЬг(Ие-Туг(1Ви)Ме-Ие-синтон 1-Н)-Ьеи-линкер-смолы.

(Использовавшееся раньше название: изобутирил-О1п(Тг1)-ТЬг(Ие-И-те-Туг-Ие-синтон 1-Н)-Ьеилинкер-смола).

Осуществляют набухание изобутирил-О1п(Тп)-ТЬг(Пе-Туг(1Ви)Ме-Пе-Ртос)-линкер-смолы (30 г, 12 ммоль) путем перемешивания в двух последовательных порциях диметилформамида (240 мл и 250 мл) в течение 30 мин каждое.

Ртос защитную группу удаляют, используя две последовательные промывки 20% пиперидином в диметилформамиде (250 мл) в течение 5 мин и 15 мин соответственно. Полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок диметилформамидом и изопропанолом. Фенолфталеин и воду добавляют к образцу конечного промывочного раствора. Отсутствие розовой окраски свидетельствует об успешном удалении пиперидина.

Полученную смолу трижды промывают диметилформамидом (250 мл) для подготовки к следующей стадии сочетания.

В круглодонной колбе приготавливают раствор синтона 1 (14,6 г, 24,6 ммоль), РуВОР (12,85 г,

24,6 ммоль) и этилдиизопропиламина (6,4 г, 49,2 ммоль) в диметилформамиде (120 мл).

Полученный раствор добавляют к смоле, и полученную реакционную смесь перемешивают в течение 3 ч. К этому времени нингидриновый тест подтверждает завершение реакции. Полученный раствор отфильтровывают, и полученную смолу промывают поочередно диметилформамидом и изопропанолом.

Осуществляют набухание полученного продукта пептид-смола путем перемешивания в двух последовательных порциях диметилформамида (250 мл) в течение 30 мин каждое.

Ртос защитную группу удаляют, используя две последовательные промывки 20% пиперидином в

- 29 025546 диметилформамиде (250 мл) в течение 5 мин и 15 мин соответственно. Полученную пептид-смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок диметилформамидом и изопропанолом.

И наконец, пептид-смолу трижды промывают дихлорметаном (250 мл), подготавливая к отщеплению пептида.

1В(10) Отщепление пептида-предшественника 1 от твердого носителя.

Получение изобутирил-О1п(Тп)-ТЬг(Пе-Туг(Ши)Ме-Пе-синтон 1-Н)-Ьеи-ОН (=пептидпредшественник 1).

(Используемое раньше название: изобутирил-С1п(Тп)-ТЪг(Пе-П-те-Туг(1Ви)-Пе-синтон 1-Н)-ЬеиОН).

К влажной изобутирил-О1п(Тп)-ТЬг(Пе-Туг(Ши)Ме-Пе-синтон 1-Н)-Ьеи-линкер-смоле добавляют смесь уксусной кислоты (125 мл) и дихлорметана (125 мл), и полученную суспензию перемешивают в течение 2 ч. Полученную суспензию фильтруют, и полученный фильтрат собирают в круглодонную колбу (фильтрат 1). Полученную смолу дважды промывают дихлорметаном (250 мл), и полученные промывки объединяют с фильтратом 1.

Полученную смолу обрабатывают свежей порцией уксусной кислоты (125 мл) и дихлорметана (125 мл) в течение последующих 2 ч. Полученную суспензию фильтруют, и полученный фильтрат собирают в круглодонную колбу (фильтрат 2). Полученную смолу дважды промывают дихлорметаном (250 мл), и полученные промывки объединяют с фильтратом 2.

К смоле добавляют уксусную кислоту (200 мл) и дихлорметан (50 мл), и полученную суспензию перемешивают в течение ночи. Полученную суспензию фильтруют, и полученный фильтрат собирают как фильтрат 3.

Все три фильтрата обрабатывают отдельно для оценки эффективности способа отщепления. Полученные фильтраты концентрируют в роторном испарителе, и остатки уксусной кислоты удаляют, используя азеотропную перегонку с тремя порциями толуола (100 мл). Затем маслянистые остатки сушат в высоком вакууме, используя лиофилизатор. Выход: фильтрат 1: 12,5 г, фильтрат 2: 2,1 г, фильтрат 3: 0,3 г.

Сырой материал пептид-предшественника 1, очищают, используя КР-хроматографию, фракции концентрируют в роторном испарителе, и полученный концентрат сушат вымораживанием. Степень чистоты: 98,8% Выход: 8,5 г (48% для последних двух стадий). Полученный продукт характеризуют, используя ¹Н-ЯМР, ¹³С-ЯМР и НК-МС Полученные спектры подтверждают предполагаемую структуру. ЯМР-спектры свидетельствуют о присутствии нескольких конформаций.

НК-МС: рассчитано для С₈₅Н_11бЫ₈О₁₃81: [М+Н]+: 1485,85039. Найдено: [М+Н]+;: 1485,84929.

Второй 8РР8-синтез пептид-предшественника 1 с использованием хлорированной смолы

1В(11) Иммобилизация первой аминокислоты (Ртос-Ьеи-ОН).

Осуществляют набухание 2-хлортритилхлоридной смолы (30 г, Ь=1,2 ммоль/г; Мегск ЫоуаЬюсйет 855017), используя 240 мл сухого ЭСМ, в течение 10 мин, и затем растворитель сливают, твердофазный реакт, в круглодонной колбе смешивают Ртос-Ьеи-ОН (42,6 г, 120,8 ммоль) и 100 мл сухого 1,4-диоксана. Растворитель выпаривают в вакууме при 45°С, затем добавляют вторую порцию 1,4-диоксана. Растворитель снова выпаривают в вакууме при 45°С до тех пор, пока не получают бесцветный маслянистый остаток. К полученному маслянистому остатку затем добавляют последовательно сухой ЭСМ (155 мл) и ΌΣΡΕΆ (40,4 мл), полученный раствор добавляют одной порцией к предварительно набухшей смоле и затем через 5 мин добавляют вторую порцию ΌΓΡΕΆ (16,5 мл). Полученную суспензию перемешивают в течение 2 ч, и реакционную среду сливают. Для погашения потенциально непрореагировавшего хлорида добавляют 240 мл гасящего раствора ЭСМ/МеОИ/ЭРЕЛ (70/15/15, об/об) и полученную смесь перемешивают в течение 10 мин. Измеряют загрузку 0,95 ммоль/г.

Общая схема удаления Ртос.

К предварительно набухшей смоле добавляют 240 мл раствора 25% пиперидина в ПМР, полученную суспензию перемешивают в течение 5 мин, и затем полученную реакционную смесь удаляют фильтрованием. Затем добавляют вторую порцию того же самого раствора пиперидина, полученную суспензию перемешивают в течение 15 мин, и затем растворитель удаляют фильтрованием. Смолу промывают и высушивают.

Полученную смолу промывают следующим образом:

250 мл ЭМР (6x2 мин);

250 мл РА (3x2 мин);

250 мл ТВМЕ (6x2 мин).

Полученную смолу сушат в течение ночи в вакууме при 40°С, получая 35,7 г Н-Ьеи-смолы.

1В(12): 8РР8-синтез Н-ТЬг-Ьеи-смолы.

Осуществляют набухание Н-Ьеи-смолы (30 г) с предшествующей стадии, используя 270 мл ПМР, в течение 30 мин, затем растворитель сливают.

В круглодонной колбе (КВР) смешивают Ртос-ТЬг-ОН (25,0 г, 73,2 ммоль), ВОР (40,4 г, 91,5 ммоль) и ПМР (250 мл). Полученную смесь перемешивают в течение 2 мин и затем добавляют Ό!- 30 025546

РЕА (18,9 г, 14б,4 ммоль). Полученную таким образом смесь добавляют одной порцией к предварительно набухшей пептид-смоле, и полученную реакционную смесь перемешивают в течение 2,5 ч. Тест Кайзера оказывается положительным, и поэтому осуществляют второе присоединение в соответствии с раскрытыми выше условиями. Через 1,0 час тест Кайзера оказывается отрицательным, и поэтому считают, что реакция прошла полностью, и реакционную среду удаляют фильтрацией.

250 мл ΌΜΡ (4x2 мин);

250 мл ТА (3x2 мин);

250 мл ТВМЕ (5x2 мин).

Полученную смолу сушат в течение ночи в вакууме при 40°С, получая 52,2 г Ртос-ТЬт-Ьеи-смолы, подготовленной для удаления Ртос.

Удаление Ртос.

Полученную смолу (52,2 г) суспендируют в 272 мл ΌΜΡ и перемешивают в течение 1,0 ч, затем растворитель удаляют фильтрованием.

Ртос защитную группу удаляют тем же способом, что раскрыт для 1В(11), и полученную пептидсмолу промывают следующим образом:

250 мл ΌΜΡ (6x2 мин);

250 мл ТА (3x2 мин);

250 мл ТВМЕ (6x2 мин).

Полученную смолу сушат в течение ночи в вакууме при 40°С, получая 39,9 г Н-ТЬт-Ьеи-смолы.

1В(13): 8РР8-синтез Н-О1п(Тп)-ТЬг-Ьеи-смолы.

Осуществляют набухание Н-ТЬт-Ьеи-смолы с предшествующей стадии (39,9 г), используя 270 мл ΌΜΡ, в течение 30 мин, затем растворитель сливают.

В КВР смешивают Ртос-О1п(Тй)-ОН (44,7 г, 73,2 ммоль), ВОР (40,4 г, 91,5 ммоль) и 250 мл ΌΜΡ. Полученную смесь перемешивают в течение 2 мин и затем добавляют ΌΤΕΛ [18,9 г, 14 6,4 ммоль). Полученную смесь добавляют одной порцией к предварительно набухшей Н-ТЬт-Ьеи-смоле, и полученную реакционную смесь перемешивают в течение 2,5 ч, тест Кайзера оказывается отрицательным, поэтому считают, что реакция завершилась, и реакционную среду удаляют фильтрованием. Полученную смолу промывают следующим образом:

250 мл ΌΜΡ (4x2 мин);

250 мл ТА (3x2 мин);

250 мл ΌΜΡ (4x2 мин).

Влажную пептид-смолу используют для стадии удаления Ртос без каких-либо дополнительных манипуляций.

Удаление Ртос.

Ртос защитную группу удаляют в соответствии со способом:, раскрытым для стадии 1В(11). Затем полученную смолу промывают следующим образом:

250 мл ΌΜΡ (4x2 мин);

250 мл ТА (3x2 мин);

250 мл ТВМЕ (5x2 мин).

Полученную смолу сушат в течение ночи в вакууме при 40°С, получая 54,4 г Н-О1п(Тт1)-ТЬг-Ьеисмолы.

1В(14): 8РР8-синтез изобутирил-О1п(Тп)-ТЬт-Ьеи-смолы.

Осуществляют набухание пептид-смолы с предшествующей стадии (54,4 г), используя 270 мл ΌΜΡ, в течение 30 мин, затем растворитель сливают.

В КВР смешивают изомасляную кислоту (6,4 г, 7 3,2 ммоль), РуВор (38,1 г, 73,2 ммоль) и 230 мл ΌΜΡ. Полученную смесь перемешивают в течение 2 мин и затем добавляют ОТЕА (28,3 г, 219,6 ммоль). Полученный раствор добавляют одной порцией к предварительно набухшей пептид-смоле, и полученную реакционную смесь перемешивают в течение 1,5 ч. Тест Кайзера оказывается отрицательным, поэтому реакцию считают завершенной, и реакционную среду удаляют фильтрованием. Полученную смолу промывают следующим образом:

250 мл ΌΜΕ (4x2 мин);

250 мл ТА (3x2 мин);

250 мл ТВМЕ (5x2 мин).

Полученную смолу сушат в течение ночи в вакууме при 40°С, получая 55,8 г изобутирил-С1п(Тт!-)ТЬт-Ьеи-смолы.

1В(15): 8РР8-синтез изобутирил-О1п(Тп)-ТЬг(Пе-Н)-Ьеи-смолы.

Пептид-смолу с предшествующей стадии (55,8 г) суспендируют в 250 мл сухого Όί'.'Μ в течение 1,0 ч. Затем растворитель удаляют фильтрованием, и влажную пептид-смолу хранят в умеренном потоке азота при температуре 0-5°С.

В КВР смешивают Ртос-Пе-ОН (51,7 г, 146,4 ммоль) и 150 мл сухого диоксана. Растворитель выпа- 31 025546 ривают в вакууме при 45°С до тех пор, пока не образуется маслянистый остаток. Процесс дистилляции повторяют, и затем к остатку добавляют 150 мл сухого ЭСМ, полученный раствор охлаждают до -10°С и добавляют ΜδΝΤ (43,3 г, 146,4 ммоль), полученную суспензию перемешивают в течение 3 мин и затем добавляют Ν-метилимидазол (14,2 г, 173 ммоль). Полученную смесь перемешивают в течение 2 мин, и полученный раствор добавляют по каплям за 10 мин к полученной ранее пептид-смоле. После завершения добавления полученную суспензию перемешивают в атмосфере азота в течение 2,0 ч.

250 мл ОМС (4x2 мин);

250 мл ΌΜΡ (3x2 мин).

Влажную пептид-смолу используют на стадии удаления Ρтοс без каких-либо дополнительных манипуляций.

Удаление Ρтοс.

Ρтοс защитную группу удаляют в соответствии со схемой, раскрытой для 1В(11).

После удаления Ρтοс полученную смолу промывают следующим образом:

250 мл ΌΜΡ (5x2 мин)

250 мл №Α (3x2 мин)

250 мл ТВМЕ (5x2 мин).

Полученную смолу сушат в течение ночи в вакууме при 40°С, получая 57,2 г изобутирил-ОШЦй)ТЬг(О-Не-Н)-Ьеи-смолу.

1В(16): δΡΡδ-синтез изобутирил-Ο1η(Τ^ι)-ΤЬ^(Ο-Πе-Τу^(ίΒи)ΜеN)-^еи-смолы.

Пептид-смолу с предшествующей стадии (57,2 г) суспендируют в 250 мл ΌΜΡ в течение 30 мин для набухания, затем растворитель удаляют фильтрованием.

В КВР смешивают Ρтοс-NΜеΤу^(ίΒи)-ОН (52,0 г, 109,8 ммоль), ΗΑΤυ (41,7 г, 109,8 ммоль) и 230 мл ΌΜΡ, и полученную смесь перемешивают в течение 2 мин. Затем добавляют ΌΓΡΕΑ (28,3 г,

219,6 ммоль) и полученный раствор перемешивают в течение 2,0 мин. Полученный раствор затем добавляют к предварительно набухшей пептид-смоле.

Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 1,0 ч и проводят тест Кайзера. Тест Кайзера оказывается отрицательным. Поэтому реакцию считают прошедшей полностью, и реакционную среду удаляют фильтрованием.

Полученную пептид-смолу промывают следующим образом:

250 мл ΌΜΡ (4x2 мин);

250 мл №Α (1x2 мин).

Удаление Ρтοс.

Ρтοс защитную группу удаляют в соответствии с общей схемой, которую используют для 1В(11).

250 мл ΌΜΡ (5x2 мин);

250 мл №Α (1x2 мин);

250 мл ΌΜΡ (5x2 мин).

Полученную изобутирил-Ο1η(Τ^ι)-ΤЬ^(Πе-Τу^(ίΒи)Μе-Η)-^еи-смолу используют на следующей стадии без сушки.

1В(17): δΡΡδ-синтез изобутирил-Ο1η(Τ^ι)-ΤЬ^(Πе-Τу^(ίΒи)Μе-Πе-Η)-^еи-смолы.

Осуществляют набухание изобутирил-ОШ (Τ^ι)-ΤЬ^(Πе-Τу^(ίΒи)Μе-Η)-^еи-смолы с предшествующей стадии, используя 270 мл ΌΜΡ в течение 30 мин, затем растворитель сливают.

В круглодонной колбе смешивают Ρтοс-I1е-ΟΗ (38,8 г, 109,8 ммоль), ΗΑΤυ (41,7 г, 109,8 ммоль) и ΌΜΡ (250 мл). Полученную смесь перемешивают в течение 2 мин и затем добавляют ΌΓΡΕΑ (28,3 г,

219,6 ммоль). Полученный раствор добавляют одной порцией к предварительно набухшей пептид-смоле, и полученную реакционную смесь перемешивают в течение 2,0 ч. Хлораниловый тест оказывается положительным, и затем осуществляют второе присоединение Ρтοс-I1е-ΟΗ. Через 3 ч после второй реакции сочетания продукт пептид-смолу выделяют фильтрованием.

Продукт пептид-смолу промывают следующим образом:

250 мл ΌΜΡ (4x2 мин);

250 мл №Α (3x2 мин);

250 мл ΌΜΡ (4x2 мин).

Удаление Ρтοс.

Ρтοс защитную группу удаляют тем же способом, что раскрыт для 1В(11) и пептид-смолу промывают следующим образом:

250 мл ΌΜΡ (5x2 мин);

- 32 025546

250 мл РА (3x2 мин);

250 мл ТВМЕ (4x2 мин).

Полученную пептид-смолу сушат в течение ночи в вакууме при 40°С, получая 67,0 г изобутирилО1п(Тг1)-ТЬг(Не-Туг(1Ви)Ме-Не-Н)-Ьеи-смолы.

1В(18): δРРδ-синтез изобутирил-О1п(Тг1)-ТЬг(Пе-Туг (1Ви) Ме-Пе-синтон 1-Н)-Ьеи-смолы.

Изобутирил-О1п(Тг1)-ТЬг(Пе-Туг(1Ви)Ме-Пе-Н)-Ьеи-смолу с предшествующей стадии (33,5 г) суспендируют в 150 мл ЭМЕ в течение 30 мин, затем растворитель сливают. В РВЕ смешивают Етоссинтон 1-ОН (34,3 г, 57,8 ммоль), РуВор (30,0 г, 57,7 ммоль) и 113 мл ОМЕ, Полученную смесь перемешивают в течение 2 мин и затем добавляют ЭРЕА (14,9 г, 115,2 ммоль). Полученный раствор добавляют одной порцией к предварительно набухшей пептид-смоле, и полученную реакционную смесь перемешивают в течение 2,0 ч. Реакционную среду удаляют фильтрованием. Полученную пептид-смолу промывают следующим образом:

150 мл ОМЕ (4x2 мин);

150 мл РА (3x2 мин);

150 мл ОМЕ (4x2 мин).

Влажную пептид-смолу используют на стадии удаления Етос без каких-либо дополнительных манипуляций.

Удаление Етос.

Етос защитные группы удаляют тем же способом, что и в 1В(11), но используя 150 мл пиперидинового раствора, и полученную пептид-смолу промывают следующим образом:

150 мл ОМЕ (5x2 мин);

150 мл РА (3x2 мин);

150 мл ТВМЕ (4x2 мин).

Полученную пептид-смолу сушат в течение ночи в вакууме при 40°С, получая 36,0 г изобутирилС1п(Т п)-ТЬг(Пе-Туг(1Ви)Ме-Пе-синтон 1 -Н)-Ьеи-смолы.

1В(19): Альтернативный δРРδ-синтез: отщепление пептида от твердого носителя.

Изобутирил-О1п(Тп)-ТЬг(Пе-Туг(1Ви)Ме-Пе-синтон 1-Н)-Ьеи-смолу с предшествующей стадии (29,75 г) обрабатывают 350 мл сухого ЭСМ в течение 1,0 ч, растворитель удаляют фильтрованием и затем добавляют 350 мл раствора 30% об/об НЕР в ЭСМ. Полученную смесь перемешивают в течение 10 мин, и затем растворитель удаляют фильтрованием и отставляют в сторону. К полученной влажной смоле добавляют вторую порцию того же самого НЕР раствора, и полученный раствор перемешивают в течение 10 мин, затем растворитель удаляют фильтрованием и объединяют с полученным ранее раствором. Полученную смолу трижды промывают ЭСМ (350 мл), и полученные промывки объединяют с растворами, использованными при отщеплении.

Объединенный раствор концентрируют в вакууме до образования маслянистого остатка и затем добавляют 200 мл толуола, растворитель выпаривают при пониженном давлении при 45°С до образования маслянистого остатка. Добавляют 350 мл гексана и полученную суспензию перемешивают в течение 2 ч. Растворитель удаляют фильтрованием, и фильтровальную лепешку промывают гексаном (50 мл), влажную фильтровальную лепешку сушат в течение ночи в вакууме при 35°С, получая 19,24 г сырого пептида-предшественника 1 (=изобутирил-О1п(Тг1)-ТЬг(Пе-Туг(1Би)Ме-Пе-синтон 1-Н)-Ьеи-ОН).

Часть сырого пептида-предшественника 1 (6,0 г) очищают, используя РР-хроматографию, фракции полученного продукта концентрируют в роторном испарителе, концентрат сушат вымораживанием, получая 2,2 г чистого пептида-предшественника 1 со степенью чистоты 99,3%а. Содержащие продукт побочные фракции обрабатывают аналогичным образом, получая дополнительно 1,25 г менее чистого пептида-предшественника со степенью чистоты 71,4%а. Если экстраполировать к полному количеству сырого пептида-предшественника 1 (19,24 г), это будет соответствовать 7,05 г чистого пептидапредшественника 1 из основной фракции и дополнительно 4,01 г пептида-предшественника 1 (со степенью чистоты 71,4%а) из побочных фракций.

1С Жидкофазный синтез соединения 8.

Схема реакции 3:

- 33 025546

1С(1) Синтез соединения 6.

(8)-У-((3§,6§,9§,12§,15§,18§,19К)-6-(4-(трет-бутокси)бензил)-3,9-ди((§)-втор-бутил)-12-(3-((третбутилдифенилсилил)окси)цропил)-15-изобутил-7,19-диметил-2,5,8,11,14,17-гексаоксо-1-окса4,7,10,13,16 -пентаазацикло нонадекан-18 -ил) -2 -изобутирамидо -Ν⁵ -тритилпентандиамид.

Мутный раствор/суспензию пептида-предшественника 1 (1,9 г, 1,28 ммоль) в ацетонитриле (120 мл) добавляют в течение 90 мин к перемешиваемой смеси НАТИ (972 мг, 2,56 ммоль) и ЭМАР (468,6 мг, 3,84 ммоль) в ацетонитриле (100 мл) при 35°С. Капельную воронку промывают ацетонитрилом (30 мл). Анализ ГРС (ВЭЖХ) после добавления полученной суспензии свидетельствует об отсутствии пептидапредшественника и о завершении циклизации. Для окончательной обработки растворитель выпаривают при пониженном давлении до конечного объема приблизительно 50 мл? и остаток разбавляют изопропилацетатом (250). Органическую фазу экстрагируют водой (2x100 мл) и растворитель выпаривают при пониженном давлении, получая 2,3 г сырого продукта. Полученный сырой продукт очищают, используя флэш-хроматографию на силикагеле и этилацетат в качестве подвижной фазы, получая 1,79 г (1,22 ммоль) соединения 6 в виде пены. Выход: 95%. Полученный продукт характеризуют, используя 'НЯМР, ¹³С-ЯМР и НК-МС. Полученные спектры подтверждают предполагаемую структуру. ЯМР-спектры свидетельствуют о присутствии нескольких конформаций.

НК-МС: Рассчитано для С^ЦмНА^г [М+Н]+: 1467,83983; ^+N^1+: 1484,86637; [М+№]+: 1489,82177. Найдено: [М+Н]+: 1467,83984; ^+N4^+: 1484,86555; [М+№]+: 1489,82073.

Второй пример синтеза соединения 6 (в масштабе 15 г).

Раствор пептида-предшественника 1 (15,0 г) в трет-бутилметиловом эфире (750 мл) медленно добавляют в течение 1,5 ч к предварительно охлажденному раствору ЭМАР (2,80 г) и НАТИ (5,87 г) в ацетонитриле (375 мл) при 0°С. Полученную реакционную смесь перемешивают в течение дополнительных 30 мин при комнатной температуре. Полученную реакционную смесь затем разбавляют третбутилметиловым эфиром (7 50 мл) и выливают в полунасыщенный водный раствор Ναίΐ (1500 мл). Образовавшиеся фазы разделяют, и органическую фазу снова экстрагируют полунасыщенным водным рас- 34 025546 твором Ναί'Ί (1500 мл). Органический слой отделяют, и растворитель частично выпаривают при пониженном давлении до конечного объема приблизительно 175 мл.

Полученный раствор фильтруют через силикагель (колонка с 225 г силикагеля), используя третбутилметиловый эфир в качестве подвижной фазы. В результате выпаривания растворителя: и сушки в вакууме при температуре 40-45°С получают соединение 6 со степенью чистоты 97,53% по данным ВЭЖХ. Выход: 14,19 г (95,7%).

1С(2) Синтез соединения 7.

(8)-^-((3§,6§,9§,12§,15§,18§,19К)-6-(4-(трет-бутокси)бензил)-3,9-ди((8)-втор-бутил)-12-(3гидроксипропил)-15-изобутил-7,19-диметил-2,5,8,11,14,17-гексаоксо-1-окса-4, 7, 10, 13,

16-пентаазациклононадекан-18-ил)-2-изобутирами,цо-^-тритилпентандиамид.

Соединение 6 (1,79 г, 1,22 ммоль) растворяют в тетрагидрофуране (60 мл) и добавляют Е1₃ЖНР)₃(6,62 г, 41,1 ммоль) при комнатной температуре. Полученную реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 8,5 ч, затем разбавляют изопропилацетатом (200 мл), и полученный раствор/суспензию медленно добавляют к интенсивно перемешиваемому насыщенному водному раствору NаНСОз. Органическую фазу выделяют и экстрагируют водой (100 мл). В результате выпаривания растворителя при пониженном давлении получают 1,86 г сырого продукта, который очищают, используя флэш-хроматографию на силикагеле и этилацетат/изопропанол (95:5) в качестве подвижной фазы, получая 1,24 г (1,00 ммоль) соединения 7. Выход: 82%.

Полученный продукт полностью охарактеризован по данным ИК, ЯМР и МС. Полученные спектры подтверждают предполагаемую структуру.

НК-МС: Рассчитано для С₆₉Н₉₆ЦА₂: [М+Н]+: 1229,72205; |\1·ΝΙΡ|': 1246,74860; |ΜΐΝα|': 1251,70399. Найдено: [М+Н]+: 1229,72128; [Μ+ΝΉ₄]+: 1246,74780; [М+№]+: 1251,70310.

Второй пример получения соединения 7 (в масштабе 14 г).

Соединение 6 (14,0 г, 9,537 ммоль) растворяют в тетрагидрофуране (220 мл) и добавляют третбутилметиловый эфир (116 мл). Полученный раствор обрабатывают Е1₃ЖНР)₃ (23,05 г) медленным добавлением в течение 10 мин. Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 24 ч при комнатной температуре. Для окончательной обработки полученную реакционную смесь разбавляют третбутилметиловым эфиром (570 мл), и полученную смесь выливают в полунасыщенный водный раствор NаНСОз (632 мл). Двухфазную смесь перемешивают в течение 30 мин, и образовавшиеся фазы разделяют. Органическую фазу экстрагируют водой (280 мл). Обе водные фазы экстрагируют третбутилметиловым эфиром (380 мл), и органические фазы объединяют. Органическую фазу сушат над безводным Мд§О₄ (8,0 г), и растворитель частично выпаривают при пониженном давлении до конечного объема приблизительно 100 мл. Добавляют толуол (140 мл), и растворитель снова выпаривают до конечного объема 80 мл. Полученный раствор разбавляют трет-бутилметиловым: эфиром (70 мл), и полученный продукт осаждают, медленно добавляя гептаны (140 мл) в течение 30 мин. Образовавшуюся суспензию нагревают до 50-55°С и перемешивают в течение 30 мин при указанной температуре. Полученную суспензию затем охлаждают до 0°С в течение 30 мин, перемешивают при 0°С в течение 2 ч, и полученный продукт выделяют фильтрованием. Полученный продукт, осадок белого цвета, сушат в вакууме, получая 11,08 г соединения 7. (94,5% выход). ВЭЖХ продукта свидетельствует о степени чистоты 97 а%.

1С(3) Синтез соединения 8 (см. структуру на схеме реакции 4).

(8)-^-((3§,6§,9§,12§,15§,18§,19К)-6-(4-(трет-бутокси)бензил)-3,9-ди((8)-втор-бутил)-15-изобутил7,19-диметил-2,5,8,11,14,17-гексаоксо-12-(3-оксопропил)-1-окса-4,7,10,13,16-пентаазациклононадекан18 -ил) -2 -изобутирамидо -Ν⁵ -тритилпентандиамид.

Соединение 7 (1,2 г, 0,98 ммоль) растворяют в смеси тетрагидрофурана (190 мл) и диметилсульфоксида (62 мл). Добавляют 1-гидрокси-1,2-бензиодоксол-3(1Н)-он 1-оксид (IΒX) (2,42 г, 45% г/г, 3,9 ммоль), и полученный раствор перемешивают в течение приблизительно 4,5 ч, после указанного времени по данным ВЭЖХ регистрируется исчезновение исходного материала (соединение 7). Полученную реакционную смесь затем выливают в насыщенный водный раствор NаНСОз (300 мл) и экстрагируют дихлорметаном (2x300 мл). Органические слои объединяют и промывают водой (2x300 мл). В результате выпаривания растворителя при пониженном давлении получают 2,31 г сырого продукта в виде пены. Полученный сырой продукт очищают, используя флэш-хроматографию на силикагеле и этилацетат/изопропанол в качестве подвижной фазы (95:5), получая 1,16 г смеси продуктов, включающую по меньшей мере 2 продукта с необходимыми массами по данным ЖХ-МС. Полученную смесь продуктов используют, как она есть, на следующей стадии.

НК-МС (основной изомер): Рассчитано для С₆₉Н₉₄^О1: [М+Н]+: 1227,70640; [Μ+ΝΉ₄]+: 1244,73295; [М+№]+: 1249,68834. Найдено: [М+Н]+: 1227,70599; [М+ΝΉ^: 1244,73200; [М+№]+: 1249,68733.

НК-МС (неосновной изомер): Рассчитано для +

С₆₉Н₉₄НА₂: [М+Н]+: 1227,70640; [М+ΝΉγ

1244,73295; [М+№]+: 1249,68834. Найдено: [М+Н]+: 1227,70598; [М+ΝΉζ,Π: 1244,73198; [М+№]+: 1249,68751.

Второй пример синтеза соединения 8 (в масштабе 10 г).

Соединение 7 (10,0 г, 8,13 ммоль) растворяют в тетрагидрофуране (127 мл) и диметилсульфоксиде (42 мл). К полученному раствору добавляют 1-гидрокси-1,2-бензиодоксол-3(1Н)-он 1-оксид (©X) (15,18

- 35 025546 г, 45% г/г, 24,4 ммоль) при интенсивном перемешивании при комнатной температуре. Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 16 ч при комнатной температуре. Затем реакционную смесь выливают в водный раствор NаΗСΟ₃ (500 мл) и добавляют этилацетат (250 мл). Полученную двухфазную смесь перемешивают в течение 30 мин, и слои разделяют. Органическую фазу промывают полунасыщенным водным раствором ΝαΟ (250 мл), и образовавшиеся слои разделяют. Водные слои экстрагируют этилацетатом (250 мл), и органические фазы объединяют. Объединенные органические фазы сушат над безводным сульфатом магния, и растворитель частично выпаривают, получая приблизительно 50 г раствора. Полученный раствор обрабатывают, используя флэш-хроматографию на колонке с силикагелем (100 г силикагеля), используя этилацетат/метанол (98:2 об/об) в качестве подвижной фазы. Полученный таким образом раствор продукта (537,4 г) обрабатывают толуолом (135 мл), и полученный раствор концентрируют до 112 г конечной массы путем частичного выпаривания растворителя при 45°С при пониженном давлении. Полученный раствор охлаждают до 0°С и добавляют гептаны (135 мл) в течение 30 мин. Полученную таким образом суспензию перемешивают в течение 1 ч при 0°С, полученный продукт выделяют фильтрованием и промывают гептанами (2x30 мл). В конце полученный продукт сушат в вакууме при температуре 45°С в течение ночи, получая 8,824 г смеси соединения 8 и его гемиаминальных изомеров. Выход: 88,4%.

1Ό Синтез соединения А.

(8)-4-((2§,5§,8§,11К,12§,15§,18§,21К)-2,8-ди-(§)-втор-бутил-21-гидрокси-5-(4-гидроксибензил)15-изобутил-4,11-диметил-3,6,9,13,16,22-гексаоксо-10-окса-1,4,7,14,17-пентаазабицикло[16.3.1]докозан12-ил)-2-изобутирамидопентандиамид.

Схема реакции 4:

- 36 025546

Соединения 8 (2,0 г) растворяют в дихлорметане (400 мл) и полученный раствор охлаждают до 0°С. Трифторуксусную кислоту (115,9 г) добавляют к перемешиваемому раствору при 0°С и полученную реакционную смесь перемешивают в течение 4 ч при 0°С. Дихлорметан (400 мл) добавляют при указанной температуре, затем добавляют воду (20 г). Полученную реакционную смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры, и перемешивание продолжают в течение дополнительно 5 ч при комнатной температуре. Для окончательной обработки полученную реакционную смесь выливают в перемешиваемый раствор ацетата натрия (165,1 г) в воде (800 мл) и добавляют этилацетат (400 мл) для получения раствора. Верхний слой (водную фазу) удаляют, и нижнюю органическую фазу (дихлорметановую фазу) промывают водой (2x200 мл). Водные слои экстрагируют этилацетатом (200 мл) и органические слои объединяют. Растворитель удаляют при пониженном давлении, получая сырое соединение А в виде смеси 5-и 6-кольцевых изомеров (см. схему реакции 5), в сопровождении тритилового спирта и других побочных продуктов указанной реакции.

Полученный сырой продукт очищают, используя хроматографию с обращенной фазой на силикагеле марки δίΐίοα КготакП 100-10-С8, используя градиентное элюирование смесью ацетонитрил/вода, в качестве подвижной фазы. Фракции, содержащие полученный продукт выпаривают для удаления ацетонитрила, осадок растворяют в этилацетате, и растворитель удаляют при пониженном давлении, получая 0,895 г соединения А; выход: 59,1%. Полученный продукт полностью охарактеризован по данным ЯМР и МС, и спектры продукта оказываются идентичными спектрам соединения А, полученным ферментацией.

НК-МС: Рассчитано для С₄₆Н₇₂О₁₂^: [М+Н]+: 929,53425; [М+ИН₄]+: 946,56080; |М-\а|': 951,51619. Найдено: [М+Н]+: 929,53445; [М+ИН₄]+: 946,56129; [М+№]+: 951,51624.

Ή-ЯМР (600 МГц, й₆-ДМСО) 5_Н: -0,11 (3Н, Д, 1=6,2 Гц), 0,64 (4Н, м), 0,77 (3Н, д, 1=6,2 Гц), 0,81 (3Н, т, 1=7,3 Гц), 0,84 (3Н, д, 1=7,0 Гц), 0,88 (3Н, д, 1=6, 6 Гц), 1,02 (3Н, д, 1=6,7 Гц), 1,02 (1Н, м), 1,03 (3Н, д, 1=6,7 Гц), 1,09 (1Н, м), 1,20 (3Н, д, 1=6,2 Гц), 1,24 (1Н, м), 1,39 (1Н, м), 1,51 (1Н, м), 1,75 (6Н, м), 1,83 (1Н, м), 1,92 (1Н, м), 2,12 (2Н, м), 2,47 (1Н, м), 2,58 (1Н, м), 2,67 (1Н, м), 2,71 (3Н, с), 3,16 (1Н, д, 1=14,2 Гц), 4,30 (1Н, м), 4,34 (1Н, м), 4,42 (1Н, д, 1=10,6 Гц), 4,45 (1Н, м), 4,61 (1Н, д, 1=9,2 Гц), 4,71 (1Н, дд, 1=9,5, 5,5 Гц), 4,93 (1Н, с), 5,05 (1Н, дд, 1=11,4, 2,6 Гц), 5,48 (1Н, м), 6,07 (1Н, д, 1=2,6 Гц), 6,64 (2Н, д, 1=8,4 Гц), 6,73 (1Н, с), 6,99 (2Н, д, 1=8,4 Гц), 7,25 (1Н, с), 7,35 (1Н, д, 1=9,2 Гц), 7,64 (1Н, д, 1=9,5 Гц), 7,73 (1Н, д, 1=9,2 Гц), 8,01 (1Н, д, 1=7,7 Гц), 8,42 (1Н, д, 1=8,8 Гц), 9,17 (1Н, с).

¹³С-ЯМР (150 МГц, й-ДМСО) 5_С: 10,35, СН₃; 11,21, СН₃; 13,85, СН₃; 16,00, СН₃; 17,68, СН₃; 24,21, СН; 19,52, 2хСН₃; 20,89, СН₃; 21,75, СН₂; 23,30, СН₃; 23,74, СН₂; 24,21, СН; 24,48, СН₂; 27,35, СН₂; 29,78, СН₂; 30,08, СН₃; 31,49, СН₂; 33,18, СН; 33,24, СН₂; 33,76, СН, 37,41, СН; 39,23, СН₂; 48,84, СН; 50,69, СН; 52,11, СН; 54,17, СН; 54,70, СН; 55,31, СН; 60,66, СН; 71,89, СН; 73,97, СН; 115,32, 2хСН; 127,34, Сд; 130,37, 2хСН; 156,27, Сд; 169,12, Сд; 169,29, Сд; 169,37, Сд; 169,79, Сд; 170,65, Сд; 172,40, Сд; 172,53, Сд; 173,87, Сд; 176,38 Сер

Второй пример синтеза соединения А (в масштабе 8,5 г) Соединение 8 (8,5 г, 6,924 ммоль) растворяют в дихлорметане (595 мл), и полученный раствор охлаждают до 0°С. К холодному раствору добавляют раствор трифторуксусной кислоты (127,5 мл) в дихлорметане (127,5 мл), поддерживая температуру при 0-5°С. Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 5,5 ч при 0°С и разбавляют дихлорметаном (850 мл) с последующим добавлением воды (42,5 мл). Полученную реакционную смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры и перемешивают в течение 17,5 ч при комнатной температуре. Для окончательной обработки полученную реакционную смесь выливают в перемешиваемую двухфазную смесь водного ацетата натрия (169 г ацетата натрия в 722 г воды) и этилацетата (700 мл). Образовавшиеся фазы разделяют, и органическую фазу снова промывают водным раствором ацетата натрия (169 г ацетата натрия в 722 г воды). Образовавшиеся слои разделяют, и органическую фазу промывают водой (2x850 мл). Индивидуальные водные фазы экстрагируют этилацетатом (700 мл), и органические слои объединяют. Органический слой сушат над безводным сульфатом магния, и растворитель частично выпаривают при 40-45°С при пониженном давлении, получая 187 г жидкой суспензии. В течение 15 мин добавляют гептан (187 г) и образовавшуюся суспензию охлаждают до 0°С. Полученную суспензию перемешивают в течение 1 ч при 0°С, и полученный продукт выделяют фильтрованием. Полученный сырой продукт сушат в вакууме при температуре 40°С, получая 5,65 г сырого соединения А. Выход (сырой продукт): 87,8%.

0,96 г полученного сырого продукта очищают, используя хроматографию с обращенной фазой на силикагеле марки δίΐίοα КготакП 100-10-С8, используя градиент смеси ацетонитрил/вода в качестве подвижной фазы. Фракции, содержащие полученный продукт, выпаривают для удаления ацетонитрила, осадок растворяют в этилацетате, и растворитель частично удаляют при пониженном давлении, получая 40 г раствора. К перемешиваемому раствору добавляют гептан (40 г) в течение 30 мин при комнатной температуре, и полученную суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение дополнительно 2 ч. Полученный продукт выделяют фильтрованием и промывают смесью этилацетат/гептан (1:1, 2x10 мл). Полученный продукт сушат в вакууме при температуре 40-45°С в течение 16 ч, получая 0,702 г соединения А. Выход после ΚΡ-хроматографии и осаждения: 64%.

- 37 025546

Пример 2.

Синтез соединения В (Ностопептин ΒΝ920) (З^-ацетамидо-И¹((18,2§,5§,8§,11К,12§,15§,18§,21К)-2-бензил-21-гидрокси-5-(4-гидроксибензил)-15-изобутил-8изопропил-4,11-диметил-3, 6, 9,13,16, 22-гексаоксо-10-окса-1,4,7,14,17-пентаазабицикло[16.3.1]докозан12-ил)пентандиамид.

Реакционная схема 5:

2А Синтез пептида-предшественника 2 с помощью 8РР8: Ас-О1п(Тг1)-ТНг(Уа1-Туг(1Ви)Ме-РНесинтон 1-Н)-Ьеи-ОН.

Оборудование: пептидный синтезатор, снабженный 250 мл стеклянным реактором с фриттой и устройством для автоматической доставки растворителя, встряхивания и отсоса реагентов.

2А(1) Синтез Ртос-ТЬг-Ьеи-Тг1-Теп!аде1-8.

Осуществляют набухание Ртос-Ьеи-Тг1-Теп1аде1-8-смолы (18,7 г загрузка 0,37 ммоль/г (поставщик Карр Ро1утеге ОтВН, ТиЫпдеп/Оегтапу)) в ΌΜΡ путем встряхивания в течение 30 мин.

Ртос защитную группу удаляют, используя две последовательные обработки 20% пиперидинолом в ΌΜΡ в течение 5 мин и 15 мин соответственно. После промывки смолы с использованием нескольких чередующихся промывок ΌΜΡ и изопропанолом полное удаление оснований проверяют по отсутствию розовой окраски после добавления фенолфталеина и воды на последней стадии промывки.

4,7 г Ртос-ТЬг-ОН, 5,26 г НАТИ и 1,8 г ΌΡΕΆ растворяют в 50 мл ΌΜΡ. После 5 мин перемешивания дополнительно добавляют 1,8 г ОГРЕА. После проверки величины рН (>11) полученную смесь добавляют к смоле с удаленными защитными группами и встряхивают в течение 2 ч. Данные проведенного теста Кайзера оказываются ОК, и полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся

- 38 025546 промывок ЭМР и изопропанолом. После сушки масса полученной смолы равна 19,01 г. Отделяют небольшой образец и исследуют с помощью ВЭЖХ. Единственный основной пик свидетельствует об успешном превращении.

2А(2) Синтез Ртос-О1п(Тг1)-ТЬг-Ьеи-Тг1-Теп1аде1-8.

19,01 г Ртос-ТЬг-Ьеи-Тг1-Теп1аде1-8-смолы (6,6 ммоль) предварительно набухает в ЭМР, и Ртос защитную группу удаляют, используя две последовательные обработки 20% пиперидином в ЭМР в течение 5 мин и 15 мин соответственно. После промывки смолы с использованием нескольких чередующихся промывок ЭМР и изопропанолом полное удаление оснований контролируют по отсутствию розовой окраски после добавления фенолфталеина и воды на последней стадии промывки.

8,07 г Ртос-О1п(Тй)-ОН, 5,01 г НАТИ и 3,4 г ЭРЕА растворяют в 50 мл ЭМР. После проверки значения рН (>11) полученную смесь добавляют к смоле, у которой удалены защитные группы, и встряхивают в течение 1,5 ч. Проведенный тест Кайзера оказался ОК, и полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок ЭМР и изопропанолом. Полученную смолу используют непосредственно на следующей стадии, представленной далее, только небольшой образец отбирают и анализируют, используя ВЭЖХ. Единственный основной пик свидетельствует об успешном превращении.

2А(3) Синтез Ас-О1п(Тг1)-ТЬг-Реи-Тг1-Теп1аде1-8 Снова осуществляют набухание смолы РтосО1п(Тг1)-ТЬг-Реи-Тг1-Теп1аде1-8 из полученной выше в ЭМР путем встряхивания в ЭМР в течение 10 мин. Ртос защитную группу удаляют, используя две последовательные обработки 20% пиперидином в ЭМР в течение 5 мин и 15 мин соответственно. Полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок ЭМР и изопропанолом. К образцу конечного промывочного раствора добавляют фенолфталеин и воду. Отсутствие розовой окраски свидетельствует об успешном удалении пиперидина.

0,774 г уксусной кислоты, 6,707 г РуВОР и 3,33 г ЭРЕА растворяют в 50 мл ЭМР. После проверки рН (>11) полученную смесь добавляют к смоле, у которой удалены защитные группы, и встряхивают в течение 2,5 ч. Проведенный тест Кайзера оказывается ОК, и полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок ЭМР и изопропанолом. Полученную смолу используют непосредственно на следующей стадии, представленной далее, и только небольшой образец отбирают и проверяют, используя ВЭЖХ. Единственный основной пик демонстрирует успешное превращение.

2А(4) Синтез Ас-О1п (Т^ι)-ТЬ^(Vа1-Ртοс)-^еи-Т^ι-Тепΐаде1-8 (использовавшееся ранее название: АсΟ1п(Т^ι)-ТЬ^(Vа1-Ртοс)-^еи-Т^ι-Тепιаде1-8) (превращение в сложный эфир боковой цепи).

Снова осуществляют набухание полученной выше Ас-О1п(Тг1)-ТЬг-Реи-Тг1-Теп1аде1-8 смолы в ЭМР путем встряхивания в ЭМР в течение 10 мин.

8,7 г Ртοс-Vа1-ОН и 8,3 г ЭРЕА растворяют в 25 мл ЭСМ. Параллельно 2,76 г М8ЭТ растворяют в других 25 мл ЭСМ. Оба раствора объединяют, и после 3 мин предварительной активации переносят к пептидной смоле и встряхивают в течение 2 ч. Полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок ЭМР и изопропанолом. Полученную смолу используют непосредственно на следующей стадии, представленной далее, и только небольшой образец отбирают и проверяют, используя ВЭЖХ. Единственный основной пик подтверждает успешное превращение.

2А(5) Синтез Ас-Ο1η(Т^ι)-ТЬ^(Vа1-Ту^(ιΒи)Ме-Ртοс)-^еи-Т^ι-Теηΐаде1-8 (использовавшееся ранее название: Ас-Ο1п(Т^ι)-ТЬ^(Vа1-N-те-Ту^(ιΒи)-Ртοс)-^еи-Т^ι-Тепΐаде1-8).

Осуществляют повторное набухание полученной выше Ас-Ο1η(Т^ι)-ТЬ^(Vа1-Ртοс)-^еи-Т^ι-Теηΐаде18 смолы в ЭМР путем встряхивания в ЭМР в течение 10 мин.

Ртос защитную группу удаляют, используя две последовательные обработки 20% пиперидином в ЭМР в течение 5 мин и 15 мин соответственно. Полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок ЭМР и изопропанолом. К образцу конечного промывочного раствора добавляют фенолфталеин и воду. Отсутствие розовой окраски доказывает успешное удаление пиперидина.

6,1 г Ртос^-Ме-Туг(1Ви)-ОН, 4,8 г НАТИ и 3,3 г ЭРЕА растворяют в 50 мл ЭМР. После проверки значения рН (>11) полученную смесь добавляют к смоле, у которой удалены защитные группы, и встряхивают в течение 2,5 ч. Проведенный тест Кайзера оказывается ОК, и полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок ЭМР и изопропанолом. Полученную смолу используют непосредственно на следующей стадии, представленной далее, и только небольшой образец отбирают и анализируют, используя ВЭЖХ. Единственный основной пик свидетельствует об успешном превращении.

2А(6) Синтез Λс-Ο1η(Т^ι)-ТЬ^(Vа1-Ту^(ιΒи)Ме-Ρбе-Ртοс)-^еи-Т^ι-Теηΐаде1-8 (использовавшееся ранее название: Λс-Ο1п(Т^ι)-ТЬ^(Vа1-N-те-Ту^(ιΒи)-Ρбе-Ртοс)-^еи-Т^ι-Тепΐаде1-8).

Осуществляют повторное набухание полученной выше Λс-Ο1η(Т^ι)-ТЬ^(Vа1-Ту^(ίΒи)Ме-Ртοс)-^еиТг1-Теп1аде1-8 смолы в ЭМР путем встряхивания в ЭМР в течение 10 мин.

Ртос защитную группу удаляют, используя две последовательные обработки 20% пиперидином в ЭМР в течение 5 мин и 15 мин соответственно. Полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок ЭМР и изопропанолом. К образцу конечного промывочного раствора добавляют фенолфталеин и воду. Отсутствие розовой окраски свидетельствует об успешном удалении пиперидина.

9,66 г Ртос-Рбе-ОН, 9,48 г НАТИ и 6,4 г ЭРЕА растворяют в 100 мл ЭМР. После проверки значе- 39 025546 ния рН (>11) полученную смесь добавляют к смоле, у которой удалены защитные группы, и встряхивают в течение 2 ч. Проведенный тест Кайзера дает ОК, и полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок ЭМР и изопропанолом. Полученную смолу непосредственно используют на следующей стадии, представленной далее, и только небольшой образец отбирают и проверяют, используя ВЭЖХ. Единственный основной пик свидетельствует об успешном превращении.

2А(7) Синтез Ас-С1п(Тг1)-Т11г(Уа1-Туг(1Ви)Ме-Р11е-синтон 1-Н)-Ьеи-ОН (использовавшееся ранее название: Ас-С1п(Тг1)-Т11г(Уа1Х-те-Туг(1Ви)-Р11е-синтон 1-Н)-Ьеи-ОН) (=пептид-предшественник 2).

Осуществляют повторное набухание полученной выше Ас-С1п(Тг1)-Т11г(Уа1-Туг(1Ви)Ме-Р11е-Ртос)Ьеи-Тг1-Теп1аде1-8 смолы в ЭМР путем встряхивания в ЭМР в течение 10 мин.

6,77 г синтона 1, 5,9 г РуВОР и 2,95 г ИЮЕА растворяют в 100 мл ЭМР. После проверки значения рН (>11) полученную смесь добавляют к смоле, у которой удалены защитные группы, и встряхивают в течение 2 ч. Проводят тест Кайзера, который дает ОК, и полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок ЭМР и изопропанолом. После того, как отбирают небольшой образец для анализа с помощью ВЭЖХ, Ртос защитную группу удаляют, используя две последовательные обработки 20% пиперидином в ЭМР в течение 5 мин и 15 мин соответственно. Полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок ЭМР и изопропанолом. В конце полученную смолу дважды промывают ОСМ. Отщепление синтезированного пептида от полученной смолы осуществляют путем встряхивания в смеси 80% уксусной кислоты в ОСМ в течение ночи. Полученный пептидный раствор отфильтровывают, и полученную смолу дважды промывают ОСМ. Объединенные фильтраты выпаривают и окончательно очищают, используя КР-хроматографию, используя систему градиентного элюирования. Собранные фракции анализируют, используя ВЭЖХ, и чистые фракции объединяют, выпаривают и в конце лиофилизируют.

Выход: 3,54 г (42%) пептида-предшественника 2.

НК-МС: Рассчитано для С₈₅Н₁₀₈ХО₁₃8г [М+Н]+=1477, 78779; Найдено: [М+Н]+=1477,78691.

2В Синтез соединения В.

(8)-2-ацетамидо-Х-((18,28,58,88,11К,128,158,188,21К)-2-бензил-21-гидрокси-5-(4гидроксибензил)-15-изобутил-8-изопропил-4,11-диметил-3,6,9,13,16,22-гексаоксо-10-окса-1,4,7,14,17пентаазабицикло[16.3.1]докозан-12-ил)пентандиамид.

2В(0) Синтез соединения 9.

(8)-2-ацетамидо-Х-((38, 6δ, 98,128,158, 188, 19К)-9-бензил-6-(4-(трет-бутокси)бензил)-12-(3((трет-бутилдифенилсилил)окси)пропил)-15-изобутил-3-изопропил-7,19-диметил-2,5,8,11,14,17гексаоксо-1-окса-4,7,10,13,16-пентаазациклононадекан- 18-ил)-Х-тритилпентандиамид.

Лактамизацию пептида-предшественника 2 до получения соединения В осуществляют в условиях, аналогичных условиям, раскрытым для получения соединения 6. Полученный продукт, соединение 9, полностью охарактеризован по данным ИК, ЯМР и МС. Полученные спектры подтверждают предполагаемую структуру.

НК-МС: Рассчитано для С₈₅Н₁₀₆ХО₁₂8г [М+Н]+: 1459,77723; [М+ΝΚ,Γ: 1476,80377. Найдено: [М+Н]+: 1459,77719; [М+:^]⁺: 1476,80291.

2В(1) Синтез соединения 10.

(8)-2-ацетамидо-М-((38,68,98,128,158,188,19К)-9-бензил-6-(4-(трет-бутокси)бензил)-12-(3гидроксипропил)-15-изобутил-3-изопропил-7,19-диметил-2,5,8,11,14,17-гексаоксо-1-окса-4,7,10,13,16пентаазациклононадекан- 18-ил)-Х-тритилпентандиамид.

Реакцию десилилирования для получения соединения 10 осуществляют в условиях, аналогичных условиям, раскрытым для получения соединения 7. Полученный продукт полностью охарактеризован по данным ИК, ЯМР и МС. Полученные спектры подтверждают предполагаемую структуру.

НК-МС: Рассчитано для С₆₉Н₈₈ХО₁₂: [М+Н]+: 1221,65945; ^Ν^Χ 1238,6860; [М+№]⁺: 1243,64139. Найдено: [М+Н]+: 1221,65894; [М+1МН₄]⁺: 1238,68518; [М+№]⁺: 1243,64001.

2В(2) Синтез соединения 11 (альдегид).

(8)-2-ацетамидо-Х-((38,68,98,128,158,188,19К)-9-бензил-6-(4-(трет-бутокси)бензил)-15-изобутил3-изопропил-7,19-диметил-2,5,8,11,14,17-гексаоксо-12-(3-оксопропил)-1-окса-4,7,10,13,16пентаазациклононадекан- 18-ил)-Х-тритилпентандиамид.

Окисление соединения 10 с получением соединения 11 осуществляют в условиях, аналогичных условиям, раскрытым для получения соединения 8. ЖХ-МС анализ демонстрирует несколько пиков с искомыми массами, что указывает на присутствие смеси альдегида, 5-кольцевого-гемиаминала и 6-кольцевого-гемиаминала. Полученную смесь используют, как она есть, на следующей стадии. НК-МС (основной пик): Рассчитано для С₆₉Н₈₍Ц₈О₁₂ [М+Н]+: 1219,64380; [М+ΝΚ,Γ: 1236,67035; [М+№]⁺: 1241,62574. Найдено: [М+Н]+: 1219,64404; [М+ΝΚ,Γ: 1236,67053; [М+№]⁺: 1241,62524.

- 40 025546

2В(3) Синтез соединения В (Ностопептина ΒΝ920) из соединения 11.

(8)-2-ацетамидо-4-((1§,2§,5§,8§,11К,12§,15§,18§,21К)-2-бензил-21-гидрокси-5-(4гидроксибензил)-15-изобутил-8-изопропил-4,11-диметил-3, 6, 9,13,16, 22-гексаоксо-10-окса-1,4,7,14,17пентаазабицикло[16.3.1]докозан-12-ил)пентандиамид.

Соединение (соединения) 11 (1,0 г, 0,82 ммоль) растворяют в дихлорметане (200 мл). Добавляют трифторуксусную кислоту (57,8 г) при температуре от 15 до 25°С в течение 10 мин и полученную реакционную смесь перемешивают в течение 45 ч при комнатной температуре. Полученную реакционную смесь затем разбавляют дихлорметаном (200 мл) и добавляют воду (10 мл). Перемешивание продолжают в течение дополнительных 24 ч при комнатной температуре. Полученную реакционную смесь выливают в насыщенный водный раствор NаΗСΟ₃ (7 00 мл) в течение 20 мин и добавляют последовательно дихлорметан (500 мл), изопропанол (50 мл) и воду (500 мл). Образовавшиеся слои разделяют, и водный слой экстрагируют раствором изопропанола (50 мл) в дихлорметане (500 мл). Образовавшиеся слои снова разделяют, и водный слой экстрагируют несколько раз дихлорметаном (5x300 мл). Органические слои объединяют, и растворитель выпаривают при пониженном давлении, получая сырую смесь продуктов (1,0 г), включающую искомый Ностопептин ΒΝ920 наряду с тритиловым спиртом и другими побочными продуктами реакции. Полученный сырой продукт счищают, используя хроматографическую обработку на силикагеле и дихлорметан/изопропанол в качестве подвижной фазы, получая чистый Ностопептин ΒΝ920 (212 мг, 97% (А) степень чистоты). Сбор менее чистых фракций дает дополнительно 402 мг продукта степени чистоты 90% (А). Выход из всех фракций: 614 мг (81%). Полученный продукт полностью охарактеризован по данным ИК, ЯМР и МС. Полученные спектры подтверждают предполагаемую структуру.

НК-МС: Рассчитано для С₄₆Н₆₄НА₂: [М+Н]+: 921,47165; [М+ЯН₄]+: 938,49820; [М+№]+: 943,45359. Найдено: [М+Н]+: 921,47167; [М+ЯН₄]⁺: 938,49861; |М+№|': 943,45337.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения циклического депсипептидного соединения формулы I где Α₁ представляет собой двухвалентный фрагмент аминокислоты с концевой карбоксильной или карбамоильной группой и связан с правой стороны в формуле I через карбонил с остальной частью молекулы или представляет собой Ц_-8-алканоил или фосфорилированный гидрокси-С1_-8-алканоил;

X связан через N фрагмента А₁ и представляет собой ацил, выбранный из ацетила или изобутирила, или отсутствует, если А₁ представляет собой С1_-8-алканоил или фосфорилированный гидрокси-С1_-8алканоил;

К₂ представляет собой С_!-8-алкил;

К₃ представляет собой боковую цепь лейцина, изолейцина или валина;

К₅ представляет собой боковую цепь фенилаланина или изолейцина;

К₆ представляет собой боковую цепь гидроксиаминокислоты;

К₇ представляет собой боковую цепь изолейцина или валина;

Υ представляет собой водород или С_!-8-алкил; или его соли;

причем указанный способ включает селективное удаление защитных групп из соединения формулы II

- 41 025546 где Рго! представляет собой силильную защитную группу, Υ имеет значения, указанные для соединения формулы I, и X*, А₁*, К₂*, К_з*, К₅*, К₆* и К₇* соответствуют значениям X, А!, К₂, К_з, К₅, К₆ и К₇ в формуле I соответственно, но при условии, что реакционноспособные функциональные группы у указанных фрагментов присутствуют в защищенной форме, по меньшей мере, если они могут принимать участие в нежелательных побочных реакциях, с получением в результате соединения формулы III где X*, Άι*, К₂*, К_з*, К₅*, К₆* и К₇* имеют указанные выше значения;

взаимодействие свободной гидроксильной группы в условиях окисления с получением соединения формулы IV и удаление оставшихся защитных групп с получением соединения формулы I, или его соли.
2. Способ по п.1, где свободное основание соединения формулы I превращают в соль соединения формулы I, или соль соединения формулы I превращают в другую соль соединения формулы I, или соль соединения формулы I превращают в свободное основание соединения формулы I.
3. Способ по п.1 или 2, где соединение формулы II получают взаимодействием соединения формулы VI

- 42 025546 где Рго! представляет собой силильную защитную группу, Υ имеет значения, указанные для соединения формулы I, и К₂*, К₃*, К₅*, К₆* и К₇* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, с кислотой формулы VII или ее реакционноспособным производным, представляющим собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры кислоты формулы VII;

где X** представляет собой аминозащитную группу или представляет собой X* и где X* и Ά₁* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и, если X** представляет собой аминозащитную группу, осуществляют удаление указанной аминозащитной группы Х** для получения Н вместо X* и осуществляют реакцию сочетания полученной аминогруппы с группой ацила X*, используя соответствующую кислоту Х*-ОН, где X* имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или ее реакционноспособным производным, представляющим собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры кислоты Х*-ОН.
4. Способ по п.3, где соединение формулы VI получают циклизацией в условиях лактамизации линейного пептида-предшественника соединения формулы VIII где Рго!* представляет собой защитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, и которая остается стабильной на стадиях удаления защитных групп во время синтеза указанного линейного пептида-предшественника, и К₂*, К₃*, К₅*, К₆* и К₇* имеют значения, указанные для соединения формулы VI в п.3, с последующим удалением ш 81!и указанной защитной группы Рго!* и получением соединения формулы VI;

где Рго!* выбирают из группы, состоящей из С₃-С₈-алк-2-енилоксикарбонильных групп.
5. Способ по п.4, где указанный линейный пептид-предшественник формулы VIII синтезируют из соответствующих аминокислот, используя твердофазный пептидный синтез и последующее отщепление полученного пептида от используемого твердого носителя.
6. Способ по п.5, где соединение формулы VIII получают в варианте а) сочетанием аминокислоты формулы IX где К₃* имеет значения, указанные выше для соединения формулы II в п.1, и Рго!** представляет собой аминозащитную группу, которую можно удалить на смоле без разрушения других связей или ре- 43 025546 акционноспособного производного указанной аминокислоты, через кислород с отщепляемым линкером Ь, который связан с твердой смолой КЕ8;

удалением указанной защитной группы Рго!**;

сочетанием полученной аминокислоты, связанной со смолой и представленной формулой X где КЕ8 и К₃* имеют значения, указанные для соединения формулы IX, п представляет собой натуральное число и Ь представляет собой отщепляемый линкер, с аминокислотой формулы XI где Рго!* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.4, К₂* имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты, осуществляя реакцию сочетания связанного со смолой дипептида, представленного формулой

XII где Рго!* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.4, К₂* и К₃* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и п, Ь и КЕ8 имеют значения, указанные для соединения формулы X, через свободную гидроксигруппу с аминокислотой формулы XIII где Рго!** имеет значения, указанные для соединения формулы IX, К₇* имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или реакционноспособным производным указанной аминокислоты, и удаление указанной защитной группы Рго!**;

или, в варианте Ь), сочетанием дипептида формулы XXVII где К₃* и Рго!** имеют значения, указанные для соединения формулы IX, и Рго!* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.4, или реакционноспособного производного указанного дипептида, с аминоацильным фрагментом, связанным через кислород, с отщепляемым линкером Ь, который связан с твердой смолой КЕ8, формулы X

- 44 025546 который получают, как раскрыто в варианте а), где КЕ8 и К₃* имеют значения, указанные для соединения формулы IX, и удаление указанной защитной группы Ργοϊ**;

после осуществления реакции по варианту а) или по варианту Ь) осуществляют реакцию сочетания получаемого соединения формулы XIV где К₂*, К₃* и К₇* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, Ργοϊ* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.5, и п, Ь и КЕ8 имеют значения, указанные для соединения фюрмулы X, с аминокислотой формулы XV где К_б* и Υ имеют значения, указанные для соединения формулы II по п.1, и Ργοϊ** имеет значения, указанные для соединения формулы IX, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты, и удаление указанной защитной группы Ργοϊ**;

осуществляют реакцию сочетания получаемого соединения формулы XVI где Υ, К₂*, К₃*, К₇* и К_б* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, Ργοϊ* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.4, и п, Ь и КЕ8 имеют значения, указанные для соединения формулы X, с аминокислотой формулы XVII где К₅* имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и Ργοϊ** имеет значения, указанные для соединения формулы IX, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты, и удаление указанной защитной группы Ργοϊ**;

осуществляют реакцию сочетания полученного соединения формулы XVIII

- 45 025546 где Υ, К₂*, К₃*, К₇*, К_б* и К₅* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, Рго1* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.4, и п, Ь и КЕ8 имеют значения, указанные для соединения формулы X, с синтоном формулы XIX где Рго1 имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и Рго1** имеет значения, указанные для соединения формулы IX, или с активированным производным указанного синтона, и удаление защитной группы Рго1** с получением соединения формулы XX где Рго1, Υ, К₂*, К₃*, К₇*, К_б* и К₅* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, Рго1* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.4, и п, Ь и КЕ8 имеют значения, указанные для соединения формулы X;

отщепляют связанный с твердой фазой пептид формулы XX от указанной твердой фазы Ь-КЕ8 с получением соответствующего соединения формулы VIII;

где реакционноспособные производные аминокислот IX, XI, XIII, XXVII, XV, XVII и XIX представляют собой независимо их хлорангидриды, фторангидриды, ангидриды или нитрофениловые эфиры;

где Рго1 представляет собой силильную защитную группу, Рго1* выбирают из группы, состоящей из С₃-С₈-алк-2-енилоксикарбонильных групп, и Рго1** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9илметоксикарбонила (Ртос); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'нитрофенил)этоксикарбонила.
7. Способ по п.1 или 2, где соединение формулы II получают циклизацией в условиях лактамизации линейного пептида-предшественника соединения формулы XXV

- 4б 025546 где X*, А₁*, К₂*, К₃*, К₅*, К₆*, К₇* и Рго! имеют значения, указанные для соединения формулы II в

п.1.
8. Способ по п.7, где соединение формулы XXV получают расщеплением соединения формулы XXIV где X*, А!*, К₂*_; К₃*, К₅*, К₆*, К₇* и Рго! имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, Ь представляет собой отщепляемый линкер, КЕ§ представляет собой твердую смолу, п представляет собой натуральное число и Рго!** представляет собой аминозащитную группу, которую можно удалить без одновременного удаления указанной защитной группы Рго!, причем продукт остается на смоле, и удаляют защитную группу Рго!**, перед отщеплением, одновременно с ним или после него, с получением указанного соединения формулы XXV;

где Рго! представляет собой силильную защитную группу и Рго!** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Ртос); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'нитрофенил)этоксикарбонила.
9. Способ по п.8, где соединение формулы XXIV получают сочетанием аминокислоты формулы

XIX где Рго! имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и Рго!** имеет значения, указанные для соединения формулы XXIV в п.8, или активированного производного указанной аминокислоты, которое представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XIX, с соединением формулы XXIII где X*, А!*, К₂*, К₃*, К₅*, К₆* и К₇* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, Ь представляет собой отщепляемый линкер, КЕ§ представляет собой твердую смолу, п представляет собой натуральное число.
10. Способ по п.9, где соединение формулы XXIII получают сочетанием аминокислоты формулы XVII* где К₅* имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и Рго!*** представляет собой аминозащитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие

- 47 025546 защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле, или реакционноспособного производного указанной аминокислоты с соединением формулы XXII где X*, Αι*, К₂*, К_з*, Кб* и К₇* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, Ь представляет собой отщепляемый линкер, КЕ§ представляет собой твердую смолу, п представляет собой натуральное число, и удаление указанной защитной группы Рго!***;

где реакционноспособное производное аминокислоты XVII* представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XVII*;

где Рго!*** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Ртос); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.
11. Способ по п.10, где соединение формулы XXII получают сочетанием аминокислоты формулы

XV*

XV* где Кб* и Υ имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и Рго!*** представляет собой аминозащитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты с соединением формулы XXI где X*, Άι*, К₂*, К_з* и К₇* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, Ь представляет собой отщепляемый линкер, КЕ§ представляет собой твердую смолу, п представляет собой натуральное число, и удаление указанной защитной группы Рго!***;

где реакционноспособное производное аминокислоты XV* представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XV*;

где Рго!*** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Ртос); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.
12. Способ по п.11, где соединение формулы XXI получают осуществлением взаимодействия аминокислоты формулы XIII* где Рго!*** представляет собой аминозащитную группу, которую можно селективно удалить, не за- 48 025546 трагивая остальные присутствующие защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле, и К₇* имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или реакционноспособного производного указанной аминокислоты с гидроксильной группой соединения формулы XXVI где X, А!*, К₂* и К₃* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, Ь представляет собой отщепляемый линкер, КЕ§ представляет собой твердую смолу, п представляет собой натуральное число;

удаляют указанные защитные группы Рго!***;

где реакционноспособное производное аминокислоты XIII* представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XIII*;

где Рго!*** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Ртос); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.
13. Способ по п.12, где соединение формулы XXVI получают сочетанием связанного со смолой дипептида, представленного формулой XII* он

КЕ5

XII* где Рго!**** представляет собой защитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные защитные группы, присутствующие в соединении формулы II, как определено в п.1, причем продукт остается при этом на смоле, К₂* и К₃* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, Ь представляет собой отщепляемый линкер, КЕ§ представляет собой твердую смолу, п представляет собой натуральное число, после удаления указанной защитной группы Рго!**** через полученную таким образом свободную аминогруппу, с кислотой формулы VII где X** представляет собой аминозащитную группу или представляет собой X*, где X* и А₁* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или с реакционноспособным производным указанной кислоты; и если X** представляет собой аминозащитную группу, удаление указанной аминозащитной группы X** до получения Н вместо X* и осуществление реакции сочетания полученной аминогруппы с ацильной группой X*, используя соответствующую кислоту Х*-ОН, где X* имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или реакционноспособное производное указанной кислоты;

где реакционноспособное производное аминокислот VII* или Х*-ОН представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты VII* или Х*-ОН соответственно;

где Рго!**** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Ртос); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.
14. Способ по п.13, где соединение формулы XII получают сочетанием связанной со смолой аминокислоты, представленной формулой X

- 49 025546 где К₃* имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, Ь представляет собой отщепляемый линкер, КЕ8 представляет собой твердую смолу, п представляет собой натуральное число, с аминокислотой формулы XI* где Рго!**** представляет собой защитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле, и К2* имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты;

где реакционноспособное производное аминокислоты XI* представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XI*;

где Рго!**** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Ртос); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.
15. Способ по п.14, где связанную со смолой аминокислоту формулы X получают сочетанием аминокислоты формулы IX* где К₃* имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и Рго!*** представляет собой аминозащитную группу, которую можно удалить селективно, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле, или реакционноспособного производного указанной аминокислоты формулы IX, с гидроксигруппой, связанной через отщепляемый линкер Ь, который связан с твердой смолой КЕ8, и удаление указанной защитной группы Рго!***;

где реакционноспособное производное аминокислоты IX* представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты IX*;

где Рго!*** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Ртос); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.
16. Способ по любому из пп.1-15, где указанные символы А_ь К₂, К₃, К₅, К₆, К₇ X и Υ или соответствующие незащищенные или защищенные фрагменты К₂*, К₃*, К₅*, Кб*, К₇*, X* и Υ₃ выбирают таким образом, что в полученном соединении формулы I или в его соли

А₁ представляет собой двухвалентный радикал Ь-глутамина, связанный через карбонил его α-карбоксигруппы с аминогруппой справа от А₁ в формуле I и через его α-аминогруппу с X, или представляет собой 28-(2-гидрокси-3-фосфоноокси)пропионил;

К₂ представляет собой метил;

К₃ представляет собой изобутил;

К₅ представляет собой втор-бутил или бензил;

К6 представляет собой 4-гидроксибензил;

К7 представляет собой изопропил или втор-бутил;

X представляет собой ацетил или изобутирил или отсутствует, если А₁ представляет собой 28-(2гидрокси-3 -фосфоноокси)пропионил;

Υ представляет собой метил.
17. Соединение формулы 6

- 50 025546
18. Соединение формулы 7