KR20130098203A

KR20130098203A - 연자심 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌신경세포 보호용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20130098203A
Application number: KR1020130005907A
Authority: KR
Inventors: 김은실; 마충제; 오경희
Original assignee: 대한민국(환경부 국립생물자원관장)
Priority date: 2012-02-27
Filing date: 2013-01-18
Publication date: 2013-09-04
Also published as: CN104144694A; US20140370131A1; KR101669143B1; KR20140103239A; WO2013129772A1; KR101680045B1

Abstract

본 발명은 연자심 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌신경세포 보호용 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 상기 조성물이 활성 산소종(reactive oxygen species; ROS) 소거 활성을 가지거나 상기 조성물이 항산화 활성을 가지는 것을 특징으로 한다. 보다 상세하게는 상기 항산화 활성은 DPPH(2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl) 라디칼 소거 활성을 가지거나 과산화수소(H₂O₂) 소거 활성을 가지는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 천연물로부터 추출되어 인체에 있어서 안전성을 가지며, 천연물-유래 물질을 이용하는 식품, 제약 분야에 있어서 기초적인 자료를 제공한다.

Description

연자심 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌신경세포 보호용 약학적 조성물{Pharmaceutical compositions containing the extracts of Nelumbo nucifera semen for protection of brain neuronal cells}

본 발명은 연자심 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌신경세포 보호용 약학적 조성물에 관한 것이다.

연과의 연은 그 모든 부분이 한방적으로 매우 뛰어난 효능, 효과를 가지고 있는 것으로 로에메린(roemerine), 누씨페린(nuciferine)은 진통작용, 진정작용 등에 매우 뛰어나며 또 민간에서는 폐렴, 기관지천식, 임질, 강장, 소화불량 뿐만 아니라 뱀과 독벌레에 물렸을 때 사용하는 것으로 정력강장제, 피로회복제, 정신안정에 도움을 주는 효과를 가지고 있어 이를 장기간 섭취할 경우 건강이 증진되는 것으로 보고되고 있다. 연자육은 연의 씨로서 종피를 벗겨 말린 약재를 말하며, 일본에서는 같은 식물을 연육(蓮肉)이라 부르고, 중국에서는 같은 식물의 씨앗을 연자(蓮子), 성숙한 씨앗 안의 건조된 어린잎과 어린 뿌리를 연자심(蓮子心)이라 부른다. 연자육은 냄새가 거의 없으며 맛은 달아 한약이나 식품 등에 포함시 거부감이 덜할 수 있다. 상기 연자육의 생김새는 타원형이나 공 모양을 이루며 한쪽 끝이 둥글게 조금 두드러져 있다. 바깥 면은 엷은 황갈색 또는 적갈색이고 회백색의 가루가 있고 가는 세로무늬와 비교적 확실한 맥상의 무늬가 있다. 씨앗 껍질은 얇고 황갈색이며 쉽게 벗겨지지 않는다. 씨앗껍질 안에는 떡잎이 2개 있으며 황백색으로 두껍게 되어 있고 가운데 빈틈에는 녹색의 연자심이 들어 있다.

최근 생활수준이 향상됨에 따라 평균수명이 연장 됨에 따라, 노년인구가 차지하는 비중이 높아지고 있다. 한국인의 사망 원인을 살펴보면 뇌졸중, 치매, 정신장애 및 행동장애와 같은 뇌 질환이 암 및 순환기질환 다음으로 높은 사망원인을 차지하며, 단일 장기의 질환으로 볼 때 가장 높은 사망원인이다(한국통계연감, 성 연령계층별 사인별 사망자수, 1996). 대표적인 뇌 질환으로는 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 다발성 경화증(Multiple sclerosis), 파킨슨병(Parkinson's disease), 뇌졸중(stroke), 허혈장애(ischemia) 등이 있는데, 특히 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중 등을 비롯한 노인성 뇌 질환은 뇌세포 내에서의 라디칼 형성을 수반하는 산화적 스트레스가 주요한 병인에 해당한다(Smith, M.A., J. Neurochem., 1997, Supp. Sl, 69, 19).

산화적 스트레스는 세포나 조직이 독성 자유 라디칼(toxic free radical)에 의해 손상되는 것을 의미하는 것으로 산화적 스트레스에 의한 신경 세포 손상(neuronal damage)은 정상적인 노화 과정 중에 발생하는 뇌세포의 손상과 알츠하이머병, 파킨슨병, 루게릭병, 치매 등 뇌신경조직의 퇴행성 질환 (neurodegenerative disease)에 관련하는 것으로 알려져 있다. 특히, 뇌조직은 자유 라디칼 공격에 대해서 민감한 것으로 알려져 있는데, 이러한 이유는 뇌 신경세포에는 방어 메커니즘이 충분하지 못하며 산화되기 쉬운 다가불포화지방산(long chain unsaturated fatty acids)이 고농도로 존재하고, 라디칼 형성시 촉매로 이용되는 금속이온(Fe² ⁺, Cu² ⁺) 등이 존재하기 때문이다. 퇴행성 뇌신경 질환의 주된 원인이 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS) 축적에 의한 산화적 스트레스에 기인한다는 것으로 보고되었으며(Olney, J. W. et al., Brain Res, 1974, 77, 507-512), 글루타메이트(glutamate)는 아미노산으로, 중추신경계에서 주요한 흥분성 신경전달물질로 과도한 글루타메이트(glutamate)의 농도는 N-아세틸 시스테인(N-acetyl cystein) 흡수를 억제하여 산화적 스트레스를 유발시킨다.

현재까지 세포 내에서 생성되는 산소 라디칼에 대한 항산화 보호측면에서 여러 가지 천연 항산화제의 효과가 보고되었는데 주로 한약재나 식품성분의 항산화 기능에 관한 것으로, 간 조직에 관한 연구가 대부분이며(Park, J.C. et al., J. Korean Soc. Food Nutr., 1996, 25, 588-592; Kim, M.R. et al., J. Food. Sci. Nutr., 1997, 2, 207; Kim, Mee Ree, et al., Food Res. Intl., 1999, 31(5), 389-394), 생물자원을 이용한 뇌 보호 목적으로 수행 된 연구는 미비한 실정이다.

한편, 출원번호 10-2009-0077620호에는 연자육을 포함하는 것을 특징으로 하는 스트레스 및 공황장애의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 개시하였고, 한국등록특허 10-0751047호는 연근 또는 연자심이 포함된 숙취예방 및 해소를 위한 식품조성물을 개시하고 있으며, 한국등록특허 10-0949926호는 연자육 추출물 등 한약재 복합 추출물을 포함하는 항염, 항산화 및 미백, 항균효과를 지닌 기능성 화장료 조성물을 개시하고 있다. 그러나 연자심 추출물이 뇌신경세포 보호활성을 갖는다는 언급은 없다.

이에, 본 발명자는 연자심 추출물이 뇌신경세포 보호 활성을 가지며, 활성 산소종(reactive oxygen species; ROS) 소거 활성 및 항산화 활성을 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 연자심 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌신경세포 보호용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 연자심 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌신경세포 보호용 식품조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 연자심에 유기용매를 첨가하여 연자심 분획물을 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌신경세포 보호용 조성물 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 제1의 양태는 연자심 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌신경세포 보호용 약학적 조성물을 제공한다. 상세하게는 상기 조성물이 활성 산소종(reactive oxygen species; ROS) 소거 활성을 가지거나 상기 조성물이 항산화 활성을 가지는 것을 특징으로 한다. 보다 상세하게는 상기 항산화 활성은 DPPH(2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl) 라디칼 소거 활성을 가지거나 과산화수소(H₂O₂) 소거 활성을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 명세서에서 용어 “항산화”란 산화를 억제시키는 작용 또는 효능을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 우수한 항산화 활성을 가진다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 활성 산소종(reactive oxygen species; ROS) 소거 활성, DPPH(2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl)의 라디칼 소거 활성, 과산화수소(H₂O₂) 소거 활성을 가진다.

발명의 명세서에서 용어 “산화”는 어떤 원자, 분자, 이온이 전자를 잃어버리거나 어떤 물질이 산소와 결합하거나 수소가 떨어져 나가는 화학반응을 의미한다. 산화가 발생하는 경우 자유 라디칼이 발생하며, 발생된 자유 라디칼은 세포에 손상을 일으키는 체인 반응을 유도한다. 용어 “항산화”는 자유 라디칼을 제거하여 체인 반응을 중지시킴으로써 산화반응을 억제시키는 효과 또는 효능을 의미한다.

본 명세서에서 연자심 추출물을 언급하면서 사용되는 용어 '추출물'은 연자심에 추출용매를 처리하여 얻은 추출 결과물을 포함한다.

본 명세서에서 용어 “약학적 유효량”은 상기 연자심 추출물의 항산화 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 연자심 추출물을 0.001% ~ 99.999% 함유하는 것이 바람직하고, 0.1% 내지 90% 함유하는 것이 더욱 바람직하다. 그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 조성물이 약학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 제2의 양태는 연자심 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌신경세포 보호용 식품조성물을 제공한다. 상세하게는 상기 조성물이 활성 산소종(reactive oxygen species; ROS) 소거 활성을 가지거나 항산화 활성을 가지는 것을 특징으로 한다. 보다 상세하게는 상기 항산화 활성은 DPPH(2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl) 라디칼 소거 활성을 가지거나 과산화수소(H₂O₂) 소거 활성을 가지는 것을 특징으로 한다.

보다 바람직하게는, 본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 상기 연자심 추출물 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명에서의 연자심 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 제3의 태양은 연자심에 유기용매를 첨가하여 연자심 분획물을 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌신경세포 보호용 조성물 생산방법을 제공한다.

본 발명에 뇌신경세포 보호용 조성물 생산방법은 다음의 단계를 포함한다. (a) 연자심을 준비하는 단계; (b) 상기 연자심에 유기용매를 첨가하여 유기용매 추출하는 단계.

본 발명에서 이용되는 유기용매는 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (ⅰ) 물, (ⅱ) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (ⅲ) 아세트산, (ⅳ) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (ⅴ) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함한다.

보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 추출 유기용매는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산 및 (j) 디에틸에테르를 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 추출 유기 용매는 에틸아세테이트이다.

본 발명에서 사용되는 용어 '분획물'은 추출 유기용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다.

보다 더 바람직하게, 본 발명에 따른 퇴신경세포 보호용 조성물 생산방법은 (a) 연자심을 준비하는 단계; (b) 메탄올을 첨가하는 단계; (c) 초음파 처리하는 단계; (d) 메탄올 분획을 분리 정제하는 단계; (e) 상기 분리 정제된 메탄올 분획에 에틸아세테이트를 첨가하는 단계; 및 (f) 에틸아세테이트 분획을 분리 정제하는 단계를 포함한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 천연물, 특히 연자심 추출물로서 우수한 뇌신경세포보호 활성을 가진다.

(ⅱ) 본 발명은 우수한 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 소거 활성 및 항산화 활성을 가진다.

(ⅲ) 본 발명은 천연물로부터 추출되어 인체에 있어서 안전성을 가진다.

(ⅳ) 또한, 본 발명은 우수한 뇌신경세포보호 효능을 가짐에 따라, 천연물-유래 물질을 이용하는 식품, 제약 분야에 있어서 기초적인 자료를 제공한다.

도 1은 연꽃 각 부위별 뇌신경세포 보호 활성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 연자심 분획층별 뇌신경세포 보호 활성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 뇌신경세포 보호 활성시험에서의 HT22 세포의 상태를 나타낸다. A: 대조군, B: 글루타메이트만 처리한 세포, C: 양성대조군, D: 연자심 에틸아세테이트(EtOAc) 추출물로 처리한 세포
도 4는 HT22 세포 라인(line)의 배양 및 세포 양상을 나타낸 결과이다.
도 5는 연자심 에틸아세테이트(EtOAc) 추출물의 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 소거활성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6는 연자심 에틸아세테이트(EtOAc) 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과이다.
도 7은 연자심 에틸아세테이트(EtoAc) 추출물의 과산화수소(H₂O₂) 소거활성을 측정한 결과이다.
도 8은 수컷 ICR의 경구투여 및 개체별 표시를 나타낸 것이다.
도 9는 Morris Water Maze 실험 모습을 나타낸 것이다.
도 10는 기억력 테스트 평균이동시간 결과를 나타낸 그래프이다. a. 비교군, b. 대조군, C. 양성대조군, d. 연자심 추출물 3mg/kg, e. 10mg/kg, f. 30mg/kg, h. 200mg/kg.
도 11은 기억력 테스트 평균이동거리를 나타낸 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 연꽃 분획층의 추출방법

연꽃의 부위 중 연밥, 종피, 연자심, 자엽에 대한 초음파 추출을 실시하였다. 추출 용매는 80% 메탄올을 사용하였으며 용매의 량은 시료 100g 당 용매 1 L 첨가를 첨가하였다. 추출 시간은 시료당 1회 90분씩, 총 3회 추출하였으며, 초음파 Frequency는 42 kHz 였다. 각 부위의 추출 수율은 연밥은 4.15 %, 종피는 9.25 %, 연자심은 44.06 %, 자엽은 19.76 %를 나타내었다.

연자심은 용매의 극성이 낮은 순에서 높은 순으로, hexane, CHCl₃, EtOAc, n-BuOH의 용매를 이용하여 분획을 실시하였다. 각 분획의 량은 hexane층은 0.76 g, CHCl₃층은 1.00 g, EtOAc층은 0.41g, n-BuOH층은 2.65 g을 얻었다.

실시예 2: 연꽃 각 부위별 뇌신경세포보호 활성

뇌신경세포보호 활성은 마우스 해마 기원 세포주인 HT22 세포에서 측정되었다. HT22 세포의 생존율은 MTT assay을 통해 측정되었다. MTT assay를 위해 HT22 세포를 48 well plate에 3×10⁴ cell/well을 seeding한 후 37℃ 에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 글루타메이트(glutamate) 처리 전 각 농도별로 시료를 첨가하였고 1시간 배양 후, 글루타메이트(glutamate)를 처리하였다. 24시간 37℃ 에서 배양 후 MTT용액을 첨가하였고, 3시간 후 DMSO로 용해한 후, 엘라이저(enzyme linked immunosorbent assay; ELISA) 리더(reader)를 사용하여 570 nm에서 흡광도 측정을 하였다. 그 결과 연꽃 각 부위별 뇌신경세포보호 활성 측정에 있어서 연자심 부위의 100ug/ml에서 90.84%의 세포보호활성을 나타내었다(도 1).

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실시예 3: 연자심 분획층별 뇌신경세포보호 활성

연꽃 부위별 뇌신경세포보호 활성 측정에서 활성이 가장 높았던 연자심을 분획하였고, 분획층별 세포보호 활성을 측정하였다. 측정결과 연자심 에틸아세테이트(EtoAc)층 100ug/ml에서 131.82%로 세포보호활성이 가장 높았다(도 2, 도 3).

실시예 4: HT22 세포 배양 및 MTT 분석

연자심 분획물의 항치매 활성 평가를 위하여 80% 메탄올로 추출한 추출물을 감압농축 그리고 동결건조 한 후에 실험에 이용하였다. 마우스 해마유래 세포주인 HT22 세포 배양은 10% 우아혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 첨가된 둘베코 변형 이글스 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM) 배지를 사용하여 37℃ 배양기에서 공기 (95%)와 CO₂ (5%)의 혼합기체를 계속 공급하면서 수행하였다. 세포가 일정정도 자라면 0.25% 트립신을 이용하여 계대 배양하여 유지하였으며, HT22 세포의 생존율은 MTT 분석을 통해 측정되었다. MTT 분석을 위해 HT22 세포를 48 웰 플레이트에 3×10⁴ 세포/웰을 시딩한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 글루타메이트(glutamate) 처리 전 농도별로 시료를 첨가하였고 1시간 배양 후, 글루타메이트(glutamate)를 처리하였다. 24시간 37℃에서 배양 후 MTT용액을 첨가하였고, 3시간 후 DMSO로 용해, 엘라이저(enzyme linked immunosorbent assay; ELISA) 리더를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였고, 양성대조약물로는 토코페롤 유도체인 트롤록스(Trolox)를 사용하였다. 또한, 모든 실험치는 대조군에 대한 세포 보호율을 평균치로 표시하였으며, 각각 3회 반복 실험치를 이용하여 계산하였다(도 4).

실시예 5: 활성산소종 ( reactive oxygen species ; ROS ) 측정

HT22 세포에서 글루타메이트(glutamate)에 의한 세포사멸의 한 기전으로 산화적 스트레스에 의한 세포사멸이 있으며 활성 산소종(ROS)을 발생시킨다. HT22 세포에서 글루타메이트(glutamate)에 의한 세포사멸의 한 기전으로 산화적 스트레스에 의한 세포사멸이 있으며 활성 산소종(ROS)를 발생시킨다. HT22 세포의 생존율 측정을 통해 활성을 지닌 연자심 에틸아세테이트(EtOAc) 추출물을 대상으로 활성 산소종(ROS) 소거 능력을 측정하여 HT22 세포를 보호 작용에 관련된 작용 기전을 연구하였다.

HT22 세포에 시료와 트롤록스(trolox), 글루타메이트(glutamate)를 처리 후 37℃에서 8시간 배양하였다. 배양 후, 10 uM의 2,7-디클로로플루오레신 디아세테이트(dichlorofluorescin diacetate; DCF-DA)를 첨가하고 1시간 동안 배양하였다. DCF-DA와 반응 한 후, 배지를 제거하고 PBS에 녹인 1.0% 트리톤(Triton) X-100으로 37℃에 10분간 녹였다. 형광도는 490nm에서 여기 파장(excitation wavelength)와 525 nm의 방출 파장(emission wavelength)에서 기록한다.

연자심 에틸아세테이트(EtOAc) 층의 ROS 소거활성을 측정한 결과, 100ug/ml 과 1000ug/ml에서 각각 59.19% 와 45.55%를 나타내었다. 연자심 에틸아세테이트(EtOAc)의 뇌세포보호 활성 관련은 ROS 소거 활성과 관련 있는 것으로 보인다(도 5).

실시예 6: DPPH (2,2- diphenyl -1- picrylhydrazyl ) 라디칼 소거활성 측정

시료의 무게를 잰 후, 메탄올(methanol) 이나 에탄올(ethanol)에 잘 녹인 후, 0.45 ㎛ 필터를 이용해 여과한다. 제조한 시료를 단계적으로 희석하였다. 96-well micro plate에 150μl씩 농도별로 주입한 후 DPPH를 주입한다. 96-well micro plate를 암실에 넣고 30분간 넣고 기다린다. 517 nm 범위에서 흡광도를 측정한다. 측정결과, 연자심 에틸아세테이트(EtOAc)의 IC₅₀ 값은 90.89 ug/ml이었고 양성대조군(positive control)으로 사용한 비타민 C(ascorbic acid; Vit C) 는 27.73 ug/ml 이었다.

세포보호 활성도가 높은 연자심의 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물의 DPPH 자유 라디칼 소거능을 측정한 결과 IC50 90ug/ml를 보였다(도 6). 이는 뇌신경세포 보호율에 비해 다소 저조한 활성도로, 페놀성 화합물의 함량이 낮은 까닭이라고 유추할 수 있겠다.

실시예 7: 과산화수소( H2O2 ) 소거 활성 측정

과산화수소(Hydrogen peroxide) 소거 활성은 뮐러(Muller)의 방법인 2,2-아지노비스(3-에틸벤즈티아졸린)-6-설포니카시드-퍼록시다제(2,2-azinobis(3-ethylbenzthiazolin)-6-sulfonicacid(ABTS)-peroxidase) 시스템에서 과산화수소(H₂O₂) 소거활성을 측정하였다. 각 시료를 농도별로 희석하였다. 96 well plate에서 시료용액 80 μL, 10 mM H₂O₂ 20 μL, 포스페이트 완충액(phosphate buffer) (pH 5.0, 0.1 M) 100 μL를 넣어 37 ℃ 에서 5분간 반응시켰다. 1.25 mM ABTS 30 μL와 1 U/mL 퍼옥시다제(peroxidase) 30 μL를 넣고 혼합한 다음, 37 ℃에서 10분간 반응시키고 엘라이저(enzyme linked immunosorbent assay; ELISA) 리더(reader)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정결과, 연자심 에틸아세테이트(EtOAc)층의 IC₅₀ 값은 639.67 ug/ml이었고 양성대조군(positive control)으로 사용한 BHA (Butylated Hydroxy Anisole) 는 160.58 ug/ml 이었다(도 7).

연꽃 부위 중 연자심의 뇌신경세포보호 활성이 가장 높았고, 연자심의 분획층 중에서 에틸아세테이트(EtOAc) 층의 활성이 가장 높게 나타났다. 연자심 에틸아세테이트(EtOAc) 층의 뇌신경세포보호 활성에 대한 작용 기전의 연구로 ROS 소거 활성 및 항산화 활성(DPPH 라디칼과 과산화수소 소거활성)을 측정한 결과, 글루타메이트(glutamate)에 의해 세포사멸이 일어난 HT22 세포에서의 연자심 에틸아세테이트(EtOAc) 층의 뇌신경세포보호 활성은 산화적 스트레스를 방지하는 항산화 활성에 의해 일어나는 것으로 판단된다.

실시예 8: 수중 미로 실험( Morris Water Maze Test )

연자심 추출물의 세포 보호 효과 및 인지능력 개선에 대한 생체내 실험을

수중미로실험(Morris Water Maze Test)를 통하여 관찰하고자, 평균체중 약 30g의

수컷 국제 암 연구소(International Cancer Research; ICR)계 생쥐를 구입하여, 1주일 동안 실험실 환경에서 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물 사육실의 조건은 전통적인 시스템으로 실온 22±2℃을 유지하였고, 1일 중 12시간은 200∼300 럭스로 조명하고, 12시간은 모든 빛을 차단하였다. 사료는 고형사료(조단백질 22.1% 이상, 조지방 8.0% 이하, 칼슘 0.6% 이상, 인 0.4% 이상, 삼양사, 한국)와 물을 충분히 공급하였다. 실험동물은 스코폴라민(scopolamine; Sigma Aldrich)을 투여하지 않고 동량의 주사용 식염수를 투여한 시험군(control)과 스코폴라민 투여군으로 나누었으며 스코폴라민 투여군은 연자심 80% 메탄올 추출물을 3mg, 10mg, 30mg, 100mg, 200mg/kg의 농도로 나누어 사용하였다. 양성대조군(positive control)은 식약청 허가약제로 콜린에스테라제 억제제 계열의 알츠하이머 형태의 경등도, 증등도 내지는 중증 치매증상을 치료하는데 사용되는 약물로 혈관성 치매(뇌혈관질환을 동반한 치매) 증상을 개선하는 목적으로 이용되는 도네페질(donepezil)을 사용하였다.

양성대조군은 시험약제 및 양성대조약제는 각각 주사용 멸균수에 현탁시켜 조제하였으며 1회 투여액량은 모두 10ml/kg을 기준으로 하였다. 스코폴라민 (1mg/kg)은 4일간 매일 복강 투여하였으며 시험약제 및 양성대조 약제(positive control)는 경구 투여하였다(도 8).

수중미로실험은 추출물 투여 전날 학습훈련(learning trial)을 거친 후 기억력 시험(memory acquisition test)을 4일간 반복 실시하였다. 학습훈련은 수조(water pool : Ø 200 cm)의 지정된 4개 릴리즈 포이트(release point) 중 한 곳에서 실험동물을 수조 속으로 넣고 60초 동안 자유 수영을 통하여 플랫포옴(Ø 200 cm)을 찾도록 하였다. 실험동물이 플랫포옴을 찾은 후에는 약 10초 동안 플랫포옴 위에서 쉬도록 하였으며, 60초 이내에 플랫포옴을 찾지 못할 경우에도 플랫포옴 위에서 10초 동안 쉬게 하였다. 모든 실험 동물이 한차례씩 학습 훈련(learning trial)을 마친 후 다시 동일한 방법으로 1일 2회씩 학습훈련(learning trial)을 4일간 반복 실시하였으며, 릴리즈 포인트는 겹치지 않도록 매일 다르게 하였다.

기억력 테스트 시험 기간 중에는 스코폴라민을 1mg/kg당 1일 1회 4일간 연자심 추출물 투여 60분 후에 복강투여 하였으며 스코폴라민 투여 30분 후부터 기억력 테스트를 실시하였다. 인지기능 개선 효능은 실험동물이 플랫포옴을 찾기까지 소요된 평균이동 시간(sec)을 측정하여 평가지표로 활용하였다(도 9)

1일간의 학습 후 scopolamine을 투여하여 인지기능(기억력) 손상을 유발시킨 후 수중미로 시험(Morris Water Maze Test)를 실시하여 인지기능 개선효능을 검토하였다. 4일에 걸쳐 실시 된 기억력 테스트(memory acquisition test)시험에서 플랫포옴을 찾는데 소요된 평균이동시간(swimming time)과 평균이동거리(swimming distance)가 각각 감소하는 정도를 지표로 하여 인지기능의 개선효과를 평가하였다. 시험기간 중 실험동물에서 연자심 추출물 투여로 인한 사망 사례 및 체중변화의 이상 사례는 관찰되지 않았다.

4일간의 기억력 테스트 시험 결과, 시험약제 및 스코폴라민을 투여하지 않은 비교군(control)의 경우 실험동물들이 플랫포옴을 찾는데 소요된 평균이동시간(swimming time) 및 평균이동거리(swimming distance)가 모두 현저하게 단축된 반면 스코폴라민을 투여한 대조군(negative control)의 경우 개체별로 차이를 보였으나 대체적으로 시간 및 거리가 전혀 단축되지 않고 오히려 증가함을 관할 할 수 있었다(도 10, 11)

이와 같은 결과는 실험동물로 사용한 생쥐들에게 스코폴라민의 투여로 인한 인지기능(기억력) 손상이 잘 유도되고 있음을 시사하고 있다.

스코폴라민e 투여 1시간 30분전에 투여한 추출물 투여군 3mg, 10mg, 30mg,100mg, 200mg/kg 및 양성대조약물인 donepezil의 경우는 시험 약제를 투여하지 않은 대조군에 비하여 platform을 찾는데 소요된 평균이동시간(swimming time) 및 평균이동거리(swimming distance)가 점차적으로 감소하는 모습을 나타내었다. 특히 농도의존적으로 나타나는 다른 천연물들과 다르게 저농도(3mg/kg)에서 다른 고농도 추출물에 견줄 수 있는 결과가 나타남을 확인할 수 있었다.

연구결과를 종합하여 볼 때 실험동물로 사용한 생쥐의 경우 연자심 추출물을 경구 투여한 결과 scopolamine 투여로 유발된 인지기능(기억력) 손상이 효과적으로 개선되고 있음을 시사하고 있다. 또한 연자심 추출물이 세포 단위의 치매 효과 개선뿐만이 아니라, 세포 외(in vivo test)에서 또한 치매 관련으로 유의적인 효과가 있음을 알 수 있었다.

Claims

연자심 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌신경세포 보호용 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물이 활성 산소종(reactive oxygen species; ROS) 소거 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 뇌신경세포 보호용 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물이 항산화 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 뇌신경세포 보호용 약학적 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 항산화 활성은 DPPH(2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl) 라디칼 소거 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 뇌신경세포 보호용 약학적 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 항산화 활성은 과산화수소(H₂O₂) 소거 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 뇌신경세포 보호용 약학적 조성물.
연자심 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌신경세포 보호용 식품조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 조성물이 활성 산소종(reactive oxygen species; ROS) 소거 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 뇌신경세포 보호용 식품조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 조성물이 항산화 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 뇌신경세포 보호용 식품조성물.
제 8 항에 있어서, 상기 항산화 활성은 DPPH(2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl) 라디칼 소거 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 뇌신경세포 보호용 식품조성물.
제 8 항에 있어서, 상기 항산화 활성은 과산화수소(H₂O₂) 소거 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 뇌신경세포 보호용 식품조성물.
(a) 연자심을 준비하는 단계; 및
(b) 상기 연자심에 유기용매를 첨가하여 유기용매 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌신경세포 보호용 조성물 생산방법.
제 11 항에 있어서,
상기 유기용매는 헥산, CHCl₃, 에틸아세테이트, n-BuOH로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 유기용매인 것을 특징으로 하는 뇌신경세포 보호용 조성물 생산방법.
제 11 항에 있어서,
상기 유기용매는 에틸아세테이트인 것을 특징으로 하는 뇌신경세포 보호용 조성물 생산방법.
(a) 연자심을 준비하는 단계;
(b) 메탄올을 첨가하는 단계;
(c) 초음파 처리하는 단계;
(d) 메탄올 분획을 분리 정제하는 단계;
(e) 상기 분리 정제된 메탄올 분획에 에틸아세테이트를 첨가하는 단계; 및
(f) 에틸아세테이트 분획을 분리 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌신경세포 보호용 조성물 생산방법.