KR20130041914A - 부착 세포를 처리하기 위한 방법 및 전극 조립체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 특히 부착 세포에 적어도 하나의 전기장을 인가하기 위한 전극 조립체(20)로서, 다른 전극(21)의 대응하는 표면(32)에 대향되게 배치되는 적어도 하나의 표면(32)을 각각 구비하는 적어도 2개의 전극(21)을 포함하고, 여기에서 전기 절연 재료(26)가 전극(21)의 표면(32) 사이에 적어도 부분적으로 배치되는 전극 조립체(20)에 관한 것이다. 본 발명에 따른 해법은 전압 펄스 또는 이것에 의해 생성된 전류가 대부분이 전해질 내의 미사용 세포 위로 떨어져 흐르는 일 없이 세포를 통해 흐르도록 처리될 세포의 영역에 집중되도록 허용한다. 본 발명은 또한 부착 세포에 적어도 하나의 전기장을 인가하기 위한 방법으로서, 전기장은 적어도 2개의 전극에 전압을 인가함으로써 생성되고, 전기장은 세포를 향하는 전극측에 집중되고 그리고/또는 세포와 세포를 향하는 전극측 사이의 공간으로 제한되는 방법에 관한 것이다.

Description

부착 세포를 처리하기 위한 방법 및 전극 조립체{METHOD AND ELECTRODE ASSEMBLY FOR TREATING ADHERENT CELLS}
본 발명은 특히 부착 세포에 적어도 하나의 전기장을 인가하기 위한 전극 장치로서, 각각의 다른 전극의 대응하는 영역과 대면하여 배치되는 적어도 하나의 영역을 각각 포함하는 적어도 2개의 전극을 포함하는 전극 장치에 관한 것이다. 본 발명은 또한 부착 세포에 적어도 하나의 전기장을 인가하기 위한 방법으로서, 전기장은 적어도 2개의 전극에 전압을 인가함으로써 생성되는 방법에 관한 것이다.
살아있는 세포에 대한 전기장 또는 전압 펄스의 인가, 이른바 전기 천공(electroporation) 또는 전기 트랜스펙션(electrotransfection)이 수년간 다양한 상태로 세포에 실시된다. 완충 용액 내의 현탁되는 단일 세포로서, 배양 용기 내에, 보통은 플라스틱 용기의 기저부에 부착 상태로, 그리고 세포가 보통 세포외 기질의 조직 집합체 내에 매립되는 생체 내에서. 원칙적으로, 전기 천공에서, 단기 전류 흐름을 인가함으로써, 세포에 맞추어진 완충 용액 또는 세포 배양 배지로부터 세포 내로 이물 분자가 도입되어, 전압 펄스 또는 이에 의해 생성된 전기장 및 전류 흐름의 작용으로 인해 세포막이 이물 분자를 투과시킬 수 있게 된다. 세포 현탁액은 흔히 좁고 개방된 용기인 이른바 큐벳(cuvette) 내에 배치되며, 이러한 샘플 챔버는 전압을 인가하는 역할을 하는 2개의 평행한 반대 전극을 측벽 내에 구비한다. 세포막 내의 일시적으로 생겨난 "세공(pore)"에 의해, 생물학적 활성 분자가 우선 세포질에 도달하여, 그곳에서 분자가 아마도 이미 관심 있는 그 기능을 수행할 수 있으며, 이어서 소정 조건 하에서 또한 세포핵에 도달한다. 강한 전기장의 단기 인가, 즉 높은 전류 밀도의 단기 전압 펄스로 인해, 또한 세포, 세포 유도체, 아세포 입자(subcellular particle) 및/또는 소포가 또한 융합될 수 있다. 이른바 전기 융합(electrofusion)에서, 예를 들어, 세포가 우선 불균질한 교번하는 전기장에 의해 막이 밀착 접촉된다. 전기장 펄스의 후속 인가에 의해, 막 부분의 상호 작용이 일어나고, 이는 최종적으로 융합을 유발한다. 이에 의해, 전기 융합에 대해 전기 천공에 대해서와 유사한 기구 장치가 적용가능하다. 또한, 살아있는 세포가 심지어 그 특성을 변화시키는 방식으로도 전기장에 의해 자극될 수 있다.
예를 들어 WO 2005/056778 A1으로부터, 2개의 평행 배치된 전극 표면 사이에 위치되는 미소공성 막 상에서 세포가 성장하는 전기 천공을 위한 방법이 공지되어 있다.
US-A-5 134 070은 전극의 역할을 하는 전기 전도성 표면상에서 성장하는 세포의 전기 천공을 위한 응용 및 장치를 기술한다. 배양 용기는 위로부터 플레이트형 상대 전극으로 덮이며, 이에 의해 그것을 가로질러 전기 방전이 가능한 갭이 형성된다.
또한, WO 2008/104086 A1으로부터, 세포가 동일 평면상의 전극 표면상에서 성장하는 장치가 공지되어 있다. 전극 사이의 전기 접촉은 세포 위의 세포 배양 배지에 의해 확립되고, 두 전극 영역은 절연 장벽에 의해 분리되지만, 그럼에도 불구하고 전극 사이의 전해질 브리지(electrolyte bridge)를 허용한다. 그것은 예를 들어 투명 반도체로서 세포의 현미경 분석을 허용하는 인듐 주석 산화물로 구성될 수 있다.
WO 2009/131972 A1으로부터, 둥근 디스크형 플레이트 상에 부착되어 성장하는 세포의 전기 천공을 위한 장치가 공지되어 있다. 장치는 서로 평행하게 배치되는 2개의 전극을 보이며, 하나의 전극은 외부 실린더의 오목한 표면상에 위치되고, 다른 하나의 전극은 내부 실린더의 볼록한 표면상에 위치된다.
또한, US 2009/0305380 A1으로부터, 고체 영역에 고정되는 세포의 전기 천공을 위한 장치가 공지되어 있다. 세포에 인가되는 전기장은 고체 영역 위의 표면상에 서로 근접하게 옆에 놓여 위치되는 전극 쌍의 배열에 의해 생성된다. 전극은 표면상에 도금되는 전기 레일에 의해 형성된다. 하나의 전극 쌍의 양쪽 전극은 많아야 하나의 단일 세포가 양쪽 전극 사이의 최소 거리 내에 위치될 수 있도록 서로 근접하게 배치된다.
회사 비티엑스(BTX)는 배양 용기 내의 부착 성장 세포 상에 수직으로 적용될 수 있는 동일 평면상의 교번 분극 전극 플레이트의 장치를 PetriPulser?로서 보급한다. 이에 대하여, 전극은 배양 상청액 내로 침지되며, 이에 의해 개별 전극 플레이트 사이의 공간이 배양 배지로 채워진다. 이 장치의 중요한 단점은 전류의 대부분이 세포 위의 무세포 배양 배지에서 누설되는 것이다. 그러나, 이러한 전기장은 단지 세포가 위치되는 용기의 기저부 상의 경계 영역에서 효과적일 뿐이어서, 불필요한 높은 전류가 제공되어야 한다. 또한, pH-값 변화 및 높은 전류로 인해 높은 폐사율이 가정되어야 한다. 또한, 장기 전압 펄스를 위한 전력 공급이 그들 높은 전류와 따라서 전하 및 전력을 제공하기에 충분히 강하여야 한다. 또한, 전기 천공에 적합한 그리고 충분히 높은 농도로 트랜스펙션될 기질을 포함하는 큰 용적부가 제공되어야 하며, 이에 의해 기질의 양이 또한 상응하게 더욱 많다.
본 발명의 목적은 너무 높은 전류 밀도를 필요로 하지 않고서 전기장에 의한 부착 세포의 효율적인 처리를 허용하는 전극 장치 및 방법을 제공하는 것이다.
상기한 과제는 전기 절연 재료가 전극의 영역 사이에 적어도 부분적으로 배치되는, 서두에 언급된 바와 같은 전극 장치의 유형에 의해 본 발명에 따라 해소된다. 본 발명에 따른 해법의 사용에 의해, 전기장이 처리될 세포의 영역에 집중될 수 있어, 전압 펄스 또는 이에 의해 생성된 전류가 그 대부분이 세포 위의 전해질에서 미사용 상태로 누설되지 않고서 세포를 통과하는 것이 달성된다. 이에 의해, 한편으로는 펄스 생성을 위한 장치가 경제적으로 치수지어질 수 있고, 다른 한편으로는 그렇지 않을 경우 전해질로 인한 높은 통과 전하 체적에 기인할 pH 값의 현저한 변화가 회피될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 장치는 배양 영역에 걸쳐 공간적으로 골고루 분산된 전기적 처리가 수행되고, 처리되지 않은 세포를 가진 영역이 최소화되는 것을 보장한다. 이에 의해, 성공적으로 처리된(예를 들어 트랜스펙션된) 세포의 백분율 및 생존율과 DNA 또는 mRNA를 사용한 세포당 발현 레벨은 현탁액 내의 세포의 전기 천공으로부터의 대응하는 값과 유사하다. 따라서, 본 발명의 전극 장치에 의해 전기장에 의한 부착 세포의 효율적인 처리가 허용된다.
본 발명에 따른 전극 장치의 유리한 실시 형태에서, 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 4개 또는 5개, 특히 6개 내지 12개의 전극이 제공되는 것이 의도된다.
전극이 플레이트 또는 핀 같이 형성되면, 최대한 많은 전극이 한정된 공간 내에 배치될 수 있어, 특히 균질한 전기장이 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 대안적인 실시 형태에서, 플레이트 전극이 금속 핀의 열에 의해 대체될 수 있다. 이러한 전기적으로 연결된 핀의 열이 충분히 근접하게 배치되면, 그것들은 생성된 전기장에 관하여 연속 플레이트 전극을 대체할 수 있다. 이와 관련하여 "충분히 근접한"이란 동일 극성을 갖는 인접 핀 사이의 거리가 반대 극성을 갖는 핀의 열 사이의 거리 미만이거나 최대 그것과 동일한 것을 의미한다. 이들 장치의 적용이 특히 유리한데, 왜냐하면 금속 핀 또는 와이어 또는 와이어의 각각의 단편을 사출 성형 공구 내로 삽입한 다음에 예를 들어 열가소성 중합체로 봉지함으로써 전극 장치를 제조하는 것이 보편적이며, 따라서 제조 공정이 많은 생산자에 의해 쉽게 제어될 수 있기 때문이다.
본 발명의 전극 장치에 따른 다른 유리한 실시 형태에서, 영역이 동일 평면상에 배치되는 전극 플레이트의 측방향 표면인 것이 의도된다.
바람직하게는, 영역은 절연 재료에 의해 서로 완전히 분리될 수 있다. 이는 유리한 방식으로, 바람직하게는 전극의 영역에 의해 규정되는 전극 사이의 공간이 완전히 절연 재료로 채워진다는 점에서 달성된다.
본 발명의 유리한 실시 형태에서, 절연 재료는 열가소성 중합체, 바람직하게는 폴리비닐클로라이드, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 및/또는 폴리카보네이트이다. 전극은 바람직하게는 금속 및/또는 전기 전도성 합성 재료로 제조된다.
본 발명에 따른 전극 장치의 유리한 실시 형태에서, 전극 장치가 세포를 향하는 적어도 일측에서 적어도 하나의 스페이서를 포함하는 것이 의도되며, 이는 전극이 세포와 직접 접촉하는 것을 방지한다. 하나 이상의 스페이서는 전극과 세포 사이의 최소 거리가 유지되고 그리고/또는 전극과 세포 사이의 규정된 거리가 조절될 수 있는 것을 보장한다.
본 발명에 따른 전극 장치의 특히 유리한 실시 형태에서, 전극 장치가 액체로 적어도 부분적으로 채워지는 적어도 하나의 용기, 바람직하게는 살아있는 세포가 그것에 부착되는 기저부 영역을 갖춘 용기 내로 삽입되도록 제공되고, 절연 재료가 용기 내로의 삽입시 액체의 적어도 일부를 배출시키는 것이 의도된다. 이에 의해, 전극을 처리될 세포에 근접하게 위치시키는 것과 세포 위에 위치되는 액체를 최소화시키는 것이 가능하다.
전극은 바람직하게는 캐리어의 저면에 적어도 부분적으로 배치된다. 이 캐리어는 예를 들어 전극이 반응조의 내부 공간에 노출되도록 캐리어가 반응조 내로 삽입되거나 그것 상에 배치될 수 있도록 설계될 수 있다. 반응조는 예를 들어 단일 큐벳(cuvette) 또는 세포 배양 접시 또는 바람직하게는 멀티웰(multi-well) 플레이트의 일부일 수 있다. 본 발명에 따른 전극 장치는 바람직하게는 적어도 하나의 침지 전극 장치의 형태로, 바람직하게는 부착 세포에 적어도 하나의 전기장을 인가하기 위해, 특히 부착 세포의 전기 천공을 위해 사용된다. 본 발명에 따른 침지 전극 장치 형태의 전극 장치는 유리한 방식으로 부착 성장 세포의 트랜스펙션을 허용하며, 이에 의해 전극 장치는 트랜스펙션 전과 후에 배지로부터 제거가능하다. 이에 의해, 사용되는 세포 배양 시스템에 따라 쉽게 최대의 융통성, 특히 최대한 많은 배양 시스템과의 적합성이 보장될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 목적은 전기장이 세포를 향하는 전극측에 집속되고 그리고/또는 세포와 세포를 향하는 전극측 사이의 공간으로 제한되는, 서두에 언급된 바와 같은 방법에 의해 달성된다. 이러한 본 발명의 해법에 의해, 전압 펄스 또는 이에 의해 생성된 전류가 그 대부분이 세포 위의 전해질에서 미사용 상태로 누설되지 않고서 세포를 통과하는 것이 달성된다. 이에 의해, 한편으로는 펄스 생성을 위한 장치가 경제적으로 치수지어질 수 있고, 다른 한편으로는 그렇지 않을 경우 전해질로 인한 높은 통과 전하 체적에 기인할 pH 값의 현저한 변화가 회피될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 장치는 배양 영역에 걸쳐 공간적으로 골고루 분산된 트랜스펙션이 수행되고, 트랜스펙션되지 않은 세포를 가진 영역이 최소화되는 것을 보장한다. 이에 의해, 성공적으로 트랜스펙션된 세포의 백분율 및 생존율과 DNA, mRNA, siRNA 또는 다른 발현가능한 핵산을 사용하는 경우에, 세포당 발현에 영향을 미치는 정도가 현탁액 내의 세포의 전기 천공으로부터의 대응하는 값과 유사하다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 전기장에 의한 부착 세포의 효율적인 처리가 허용된다.
본 발명에 따른 방법의 유리한 실시 형태에서, 전기장이 세포와 전극의 노출된 전면 사이의 공간으로 제한되는 것이 의도된다. 전기장의 집속 및/또는 제한은 바람직하게는 전기 절연 재료가 전극 사이에 배치된다는 점에서 달성된다.
본 발명에 따른 방법의 유리한 실시 형태에서, 전극의 노출된 전면이 세포가 그것에 부착되는 기저부 영역을 갖춘 적어도 하나의 용기 내로 삽입되는 것이 또한 의도된다.
본 발명에 따른 방법의 특히 유리한 실시 형태에서, 세포에 대한 전기장의 영향이 세포와 전극 사이의 거리를 조절함으로써 최적화되는 것이 의도된다. 이 방식으로, 처리될 세포 위에 충분히 강하고 균질한 전기장이 형성되며, 이는 처리 효율에 긍정적인 영향을 미친다. 따라서, 예를 들어, 세포의 전기 트랜스펙션에서 트랜스펙션 효율이 전극과 세포 사이의 거리를 조절함으로써 최적화될 수 있다.
이하에서는 본 발명이 도면을 참조하여 상세히 예시적으로 설명된다.
본 발명에 의하면, 너무 높은 전류 밀도를 필요로 하지 않고서 전기장에 의한 부착 세포의 효율적인 처리를 허용하는 전극 장치 및 방법이 제공된다.
도 1은 (a) 종래 기술에 따른 전극 장치의 개략적인 측면도와, (b) 본 발명에 따른 전극 장치의 예시적인 개략적인 측면도와, (c) 본 발명에 따른 전극 장치의 다른 예시적인 실시 형태의 개략적인 평면도를 도시한다.
도 2는 (a) 첫째로 종래 기술에 따른 전극 장치로 처리된 그리고 (b) 둘째로 본 발명에 따른 전극 장치에 의해 처리된 헬라 세포(HeLa-cell) 내의 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현의 형광 현미경 이미지를 도시한다.
도 3은 종래 기술에 따른 전극 장치(종래 기술)와 본 발명에 따른 전극 장치(본 발명에 따른 장치) 사이의 비교의 바 다이어그램을 도시하며, (a) 한편으로는 트랜스펙션된 세포의 부분과 (b) 다른 한편으로는 세포의 생존율이 각각 퍼센트 단위로 도시된다[AD-035 = 부착 세포에 대한 전기적 파리미터의 수, Nucleofector?, 론차(Lonza)].
도 4는 본 발명에 따른 전극 장치의 예시적인 실시 형태의 저면의 사시도를 도시한다.
도 5는 도 4에 따른 전극 장치의 다른 사시도를 도시하며, 이 예시에서 전극의 내부 부분과 접촉 요소를 볼 수 있다.
도 6은 도 4에 따른 전극 장치의 상면의 사시도를 도시한다.
도 7은 도 4 내지 도 6에 따른 전극 장치를 통한 종단면도를 도시한다.
도 8은 3개의 상이한 높은 전압 펄스에서 본 발명에 따른 전극 장치 내의 전극과 배양 영역에 부착된 세포 사이의 거리의 함수로서 트랜스펙션 효율의 바 다이어그램을 도시한다(x축: 거리[mm], y축: 트랜스펙션 효율[%], A-5 = 약한 전압 펄스, K-19 = 중간 전압 펄스, AX-19 = 높은 전압 펄스).
도 1은 (a) 노출된 전극(2)을 갖춘 종래 기술에 따른 전극 장치(1)의 개략적인 측면도와 (b) 전극(12) 사이에 전기 절연 재료(11)를 갖춘 본 발명에 따른 전극 장치(10)의 예시적인 개략도를 도시한다. 대체로 비티엑스(BTX)의 PetriPulser?에 대응하는 종래 기술에 따른 전극 장치(1)는 용기(4)의 내부 공간(3) 내로 돌출되는 그리고 용기(4)의 기저부 영역(5) 상에 놓이는 동일 평면상에 배치된 3개의 전극(2)으로 구성된다(도 1a). 기저부 영역(5) 상에, 살아있는 세포가 부착되어 성장하도록 허용된다(부착 세포). 내부 공간(3)은 액체, 예를 들어 세포 배양 배지 또는 세포에 맞추어진 다른 용액으로 채워지며, 상기 용액은 또한 전극(2) 사이의 자유 공간(6)을 채운다. 따라서, 각각의 전극(2)은 완전히 액체에 의해 둘러싸인다. 액체가 전기 전도성이기 때문에, 전극(2)에 전압을 인가하는 경우에, 전극(2) 사이의 액체에서 전류의 대부분이 누설되어(화살표 참조), 예를 들어 커패시터 방전에 의한 것을 의미하는, 비영구적 전압원의 적용의 경우에, 전압이 급속히 저하되며, 따라서 시간이 흐르면서 전기장이 약화된다. 단지 전류의 일부만이 기저부 영역(5)을 통과하여, 전류 흐름의 생물학적 효과가 좋지 못하다.
본 발명에 따른 전극 장치(10)는 용기(14)의 내부 공간(13) 내로 돌출되는 동일 평면상에 배치된 3개의 전극(12)을 포함한다(도 1b). 용기(14)는 살아있는 세포가 부착되어 성장하도록 허용하는 기저부 영역(15)을 포함한다(부착 세포). 내부 공간(13)은 액체, 예를 들어 세포 배양 배지 또는 세포에 맞추어진 다른 액체로 채워진다. 전극(12) 사이의 공간은 완전히 전기 절연 재료(11)로 채워지며, 따라서 전극(12)에 전압을 인가하는 경우에, 전극(12) 사이의 공간에서 어떠한 전류도 누설되도록 허용되지 않는다. 전체 전류가 전극(12)과 기저부 영역(15) 사이의 공간을 통과하며, 따라서 비영구적 전압원(예컨대, 커패시터)을 적용하는 경우에, 전압 강하에 시간이 보다 오래 소요되어, 시간이 흐르면서 세포의 처리를 위한 전기장 강도가 증가된다. 이에 의해, 한편으로는 펄스 생성을 위한 장치가 경제적으로 치수지어질 수 있고, 다른 한편으로는 그렇지 않을 경우 전해질로 인해 흐르는 높은 전압 값에 기인할, 액체 내의 pH 값의 현저한 변화가 회피될 수 있다.
본 발명에 따르면, 예를 들어, 동일 평면상의 전극(12)은 절연 재료(11)에 의해 분리될 수 있으며, 따라서 전극(12)의 전기 전도성 표면은 단지 하향으로[기저부 영역(15) 또는 이것에 부착된 세포를 향해] 노출되고 분위기(environment)와 전기 접촉한다. 동일 평면상의 전극(12)의 각각의 대향 배치된 영역(16) 사이의 영역에서, 또는 전극이 평행선을 나타내는 경우, 적어도 전극(12) 사이의 액체에 노출된 영역에서 절연 재료(11)의 완전 연장으로 인해, 전기장이 집속될 수 있거나, 또는 전류가 관심 있는 작용 반경으로 제한될 수 있다. 또한, 전극(12)과 기저부 영역(15) 사이의 표적 영역에 일정하고 더욱 안정된 전기장 강도 및 전류 밀도를 제공하는 동일 평면상의 전극(12)의 사용에 의해 표적 세포의 영역으로의 전기장의 집속 또는 작용 반경으로의 전류의 제한이 지금부터 가능한 것이 특별한 이점이다. 따라서, 적합한 절연 재료는 예를 들어 폴리비닐 클로라이드, 폴리스티롤, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 또는 폴리카보네이트와 같은 일반적인, 바람직하게는 열가소성 합성 재료로 제조되는 플레이트 또는 사출 성형 물품이다. 본 발명에 따른 장치에 의해, 전극(12)의 동일 평면상의 부분의 각각의 대향 영역(16)을 통한 전류 누설이 회피될 수 있어, 일정한 전류의 전압 펄스가 생성된다. 따라서, 본 발명에 따른 장치는 방전마다 필요한 전력을 제한하기 위해 낮은 에너지/전류의 하나 이상의 연속적인 펄스 방전으로, 예를 들어 처리될 세포의 배양 플로어(culture floor)의 면적에 따라 반응마다 적용될 수 있다.
예를 들어, 전극-절연체-샌드위치가 사용될 수 있으며, 여기에서 전극은 교번하여 분극된다. 이러한 장치에서, 활성 전극 아래의 영역에서 전기장은 사실상 존재하지 않으며, 따라서 활성 전극 아래의 영역에 위치된 세포에 영향을 미치지 않는다. 이들 영역은 전기 전도체(전극)에 근접하며, 따라서 감지할 수 있는 전기장의 밖에 있다. 따라서, 전극은 최대한 얇아야 하며(예를 들어 50 pm), 대략적으로 전극 장치의 세포로 덮인 전체 기저부 영역은 전극-절연체 조합의 활성 영역으로 덮여야 한다. 활성 영역은 반대 극의 전극 사이의 절연 재료 아래의 영역이다. 이에 대하여, 특히 전극 장치의 단면에서 ANSI-SBS-표준(미국 표준 협회 - 생체 분자 과학 학회)을 따르는 일반적인 세포 배양 용기 내에 설치될 치수를 갖는 둥근 기하학적 구조가 유리하다.
도 1c는 핀형 전극(18)을 갖춘 본 발명의 전극 장치(17)의 다른 예시적인 실시 형태의 저면의 개략적인 평면도를 도시한다. 전극(18) 각각이 둥근 단면을 갖기 때문에, 그것들의 실제로 각각의 전체 원주 영역은 다른 전극(18)의 대응하는 영역에 대향되게 배치되는 영역을 포함한다. 이 실시 형태에서, 핀형 전극(18) 사이의 공간이 따라서 완전히 전기 절연 재료(19)로 채워지며, 따라서 저면의 전극(18)의 면 표면이 노출되고 분위기와 접촉한다. 따라서, 모든 전극(18) 각각은 그 전체 원주 영역에서 서로 전기적으로 절연되며, 따라서 어떠한 전류도 전극(18) 사이의 공간을 가로질러 누설되도록 허용되지 않는다. 본 발명에 따른 전극 장치(17)에서, 이번에도 모든 전류가 전극(18)과 세포(이 도면에서는 보이지 않음) 사이의 공간을 통과하며, 따라서 비영구적 전압원(예컨대, 커패시터)의 적용에 의해, 전압 강하에 시간이 보다 오래 소요되어, 시간이 흐르면서 세포의 처리를 위한 전기장 강도가 매우 높다.
실험적 목적을 위해, 본 발명에 따른 장치 또는 전극 장치가 알루미늄 필름의 교번하는 층과 2 mm 절연 재료로 설계되었다. 접합된 장치가 배양 용기(6-웰, 12-웰, 24-웰)의 둥근 기하학적 구조에 맞추기 위해 폴리싱되었고, 하나 걸러 하나의 전극의 전기 접촉부에 의해 상부 단부에서 두 전기 접속부와 연결되었다. 이어서, 장치가 수평 선형 트랙에 부착되거나 내부에서 부착 세포[여기에서 헬라 세포(HeLa-cell)]가 성장하는 배양 웰 내로 직접 수동으로 도입되었다. 이 경우에, 상황을 간단하게 하기 위해, 실험 장치가 배양 플로어 상에 놓였으며, 따라서 세포와 전극 장치 사이의 1 mm 미만의 거리가 가정될 수 있다. 사전에, 용기 내의 배양 배지가 플라스미드 DNA[pmaxGFP?, 론차(Lonza), 2 ㎍/100 ㎕]를 함유한 용액(Nucleofector? Cell Line Solution R, 론차)의 1　ml의 혼합물에 의해 대체되었다. 이어서, 교번하여 연결된 전극 필름에 론차의 Nucleofector?에 의해 상이한 시험 펄스를 인가하였으며, 이 값은 100 ㎕ 체적의 큐벳에 의한 응용에 사용되는 바와 같은 범위 내였다. 이어서, 장치가 다시 한번 배양 웰로부터 제거되었고, 세포의 추가의 배양을 허용하기 위해 전해질이 다시 한번 배지에 의해 대체되었다. 상황을 간단하게 하기 위해, 용액-DNA 혼합물이 상이한 웰에 재사용되었다. 전극 사이의 누락된 절연체 때문에 동일한 충전 레벨을 달성하기 위해 2 ml의 동일한 용액-DNA 혼합물이 채워진 것을 제외하고는 유사한 접근법이 비티엑스(BTX)의 PetriPulser?로 취해졌다. 하루 후에, 세포가 유세포 분석에 의해 분석되었다. 대략 동일한 전극 거리를 갖는, 따라서 전기장의 생성을 위한 동일한 전제 조건을 갖는 비티엑스의 PetriPulser?의 적용에 의해, 단지 매우 가끔 트랜스펙션된 세포만이 검출가능하다(도 21). 또한, 이 경우에, 과전류 차단에 관한 오류 보고(error report)가 관찰되었으며, 이는 전극 플레이트 사이의 개방된 중간 공간으로 인한 제한되지 않은 전류 흐름으로 인해, PetriPulser?가 충분한 높은 전기장의 생성에 적합하지 않은 것을 지시한다. 비교하여 보면, 본 발명의 장치의 적용에 의해, 세포의 30% 내지 45%가 트랜스펙션될 수 있다(GFP 발현, 도 2b). 따라서, 본 발명의 장치가 또한 부착 세포를 효율적으로 트랜스펙션할 수 있는 것이 명백하다.
이어서, 세포가 생존, 형태 및 도입된 유전 정보의 발현에 대해 분석되었다. 도 3은 한편으로는 도 2b에 관하여 기술된 본 발명의 장치로 또는 다른 한편으로는 도 2b에 관하여 비티엑스의 PetriPulser?에 의한 기술된 방법으로 트랜스펙션된 세포의 비교를 도시한다. 본 발명의 전극 장치에 의해 세포가 높은 생존 능력 및 형태적 완전성을 유지시킴으로써 높은 효율로 트랜스펙션되는 것이 밝혀졌다(도 3a 및 도 3b). 결과는 현탁액 내에서 트랜스펙션된 세포에 대한 기존 프로토콜의 비교 데이터와 동일한 범위의 스케일을 제공하였다. PetriPulser?로 처리 후, 실제로 보다 높은 생존율이 결정되었지만, 어떠한 현저한 트랜스펙션도 없었다(도 3a 및 도 3b).
도 4는 본 발명에 따른 전극 장치(20)의 예시적인 실시 형태의 저면의 개략도를 도시한다. 전극 장치(20)는 이하에서 도 5 및 도 7을 참조하여 상세히 설명되는 7개의 전극(21)을 포함한다. 전극(21)은 본질적으로 실린더형으로 형성되는 캐리어(22) 내에 배치된다. 캐리어(22)는 본체(23) 및 본체(23)의 상부 단부에 있는 경계 영역(24)을 포함하며, 경계 영역(24)의 외경은 본체(23)의 외경보다 커서, 경계 영역(24)은 본체(23)의 외향으로 돌출된다. 전극(21)은 대부분 본체(23) 내에 배치되고, 캐리어(22)의 저면(25)에 있는 그 하부 면 표면(33)이 노출되어, 그것들은 분위기와 접촉한다. 단일 전극(21) 각각은 절연 재료(26)에 의해 전기적으로 서로 분리되며, 이 실시 형태에서 단일 전극 사이의 공간(26)은 절연 재료(26)로 완전히 채워진다. 전극(21)의 대향 영역 사이의 절연 재료(26)는 전극이 전기 전도성 액체 내에 침지되는 경우, 전압을 전극에 인가할 때 어떠한 전류도 전극(21) 사이의 공간을 가로질러 누설되도록 허용되지 않는 것을 보장한다. 절연 재료는 오히려 전압을 전극(21)에 인가할 때 전류가 전극(21)의 면 표면(33)을 통해 흐르고 전기장이 캐리어(22)의 저면(25) 아래에 생성되도록 한다. 전극(21) 사이의 공간을 가로질러 어떠한 현저한 전류 누설도 없기 때문에, 커패시터 또는 다른 비영구적 전압원의 방전 중 전압 강하에 시간이 보다 오래 소요되어, 시간이 흐르면서 일정하고 더욱 안정된 전류가 흐르며, 이는 대부분의 생물학적 방법, 예를 들어 트랜스펙션(transfection)에 대해 방전 시간에 걸쳐 충분히 강한 전기장을 생성한다. 전극 장치(20)는 특히 적어도 부분적으로 액체로 채워진 용기, 예를 들어 반응조, 세포 배양 트레이 또는 멀티웰-플레이트(multiwell-plate)의 "웰(well)" 내로 삽입되도록 제공되며, 상기 용기는 살아있는 세포가 그것 상에 부착되도록 허용되는 기저부 영역을 제공한다. 용기의 기저부 영역 상의 부착 세포는 보통 적합한 액체, 예를 들어 세포 배양 배지 또는 원하는 전기적 처리에 맞추어진 용액으로 덮이며, 전극 장치(20)는 용기 내로의 삽입 중 상기 액체의 적어도 일부분을 배출시킨다. 따라서, 면 표면(33)을 갖춘 전극(21)은 용기의 기저부 영역 상에, 따라서 세포 상에 직접 놓이지 않으며, 캐리어(22)의 저면(25)은 전극(21)과 용기의 기저부 영역 사이의 충분한 거리를 보장하는 4개의 스페이서(27)를 제공한다.
도 5는 도 4에 따른 전극 장치(20)의 사시도를 도시하며, 이 도면에는 전극(21)의 내부 부분이 가시적으로 도시된다. 이 도면으로부터 전극(21)이 특히 플레이트형으로 형성되고, 전극 플레이트의 두께가 캐리어(22)의 저면(25)을 향해 감소하는 것이 명백하다. 따라서, 용기 내의 액체와 접촉하는 전극(21)의 노출된 면 표면(33)은 본체(23) 내에 배치된 전극(21)의 부분과 같이 본질적으로 보다 얇다. 이의 이점은 너무 약한 전기장으로 인해 세포의 효과적인 전기적 처리가 가능하지 않은 각각의 전극(21) 아래의 영역이 최소화되는 것이다. 반면에, 대향 단부에서, 전극(21)은 이것들이 충분한 전기 접촉을 확립하기 위해 여기에서 효율적으로 접촉되어야 하기 때문에 증가된 두께를 보여야 한다. 사용된 전압원 각각의 전기 접촉은 본 실시 형태의 경우 전극(21)의 두꺼워진 영역(29) 내로 삽입되는 핀형 접촉 요소(28)에 의해 확립된다. 접촉 요소(28)는 각각 영역(29)에 대향되는 그 단부에서 적합한 접촉 장치에 의해 전압원과 전기적으로 연결된다. 전압원은 예를 들어 전압 펄스의 제어식 방출을 허용하는 하나 이상의 커패시터일 수도 있다. 생성된 전압 펄스는 접촉 요소(28)를 가로질러 전극(21)으로 전달되며, 따라서 전극(21)의 저면에, 즉 캐리어(22)의 저면(25) 아래에 전기장이 확립되며, 이는 전극 사이의 절연 재료(26)로 인해 세포와 전극(21)의 세포 지향측 사이의 공간으로 제한되거나 그것에 집속된다.
본 발명에 따른 전극 장치(20)는 바람직하게는 사출 성형 공정에 의해 제조된다. 이에 의해, 우선 접촉 요소(28)가 적합한 사출 성형 공구 내로 삽입된 다음에 전기 절연 중합체로 봉지된다. 제2 단계에서, 전극(21)을 형성하는 전기 전도성 중합체가 사출된다. 대안적으로, 전극은 금속, 바람직하게는 알루미늄으로 제조될 수 있다. 이 실시 형태에서는, 우선 금속 전극이 사출 성형 공구 내로 삽입된 다음에 전기 절연 중합체로 봉지된다. 이 실시 형태에서, 금속 전극은 바람직하게는 전극을 전기적으로 접촉시키기에 적합한 상향으로 돌출되는 부속물을 제공한다.
도 6은 도 4와 관련된 본 발명에 따른 전극 장치(20)의 상면(30)의 사시도를 도시한다. 접촉 요소(28)가 본체(23)로부터 상향으로 돌출되는 것이 명백하다. 따라서, 접촉 요소(28)는 노출된 단부(31)를 제외하고는 본체의 전기 절연 재료로 완전히 둘러싸인다. 이들 노출된 단부(31)를 사용하여, 접촉 요소(28)는 적합한 장치에 의해 전압원에 전기적으로 접촉될 수 있다.
도 7은 도 4 내지 도 6과 관련된 전극 장치(20)를 가로지른 종단면도를 도시한다. 이 도면으로부터, 전극(21)의 직경이 본체(23)의 저면(25)을 향해 테이퍼져서, 불충분한 전기장이 확립되는 전극(21) 아래의 영역이 최소화되는 것이 명백하다. 전극(21)의 대향 단부에 증가된 두께를 갖는 영역(29)이 있으며, 여기에서 접촉 요소(28)는 각각 삽입되거나 주입된다. 이러한 특정한 유리한 실시 형태는 전극 요소(28)와 전극(21) 사이의 충분한 전기 접촉을 보장하며, 따라서 전압원으로부터 전극(21)까지 전압 펄스의 효과적인 전달이 보장된다. 그 기저부 영역 상에 살아있는 세포가 부착되는, 액체로 채워진 용기 내로 전극 장치(20)가 삽입되면, 스페이서(27)는 전극(21)의 저면과 처리될 세포 사이의 최적 거리가 설정되는 것을 보장한다. 전극(21)의 각각의 대향 배치된 영역(32) 사이의 공간이 완전히 절연 재료(26)로 채워지기 때문에, 액체가 전극(21)의 영역(32) 사이로 유입되지 않아, 전류가 전극(21)의 영역(32) 사이의 영역을 통해 누설되도록 허용되지 않는다. 이 방식으로, 전극(21)에 대한 전압의 인가를 통해, 전기장이 전극의 세포 지향측에 집중되고, 세포와 전극(21) 사이의 공간으로 제한되거나 그것에 집속된다. 이 방식으로, 세포는 매우 효과적으로 그리고 비교적 낮은 전력 수요를 갖고서 처리될 수 있다. 본 발명의 다른 이점은 전극(21) 사이의 중간 공간이 없기 때문에, 전극 장치(20)가 용기 내로의 삽입 중 액체의 일부분을 배출시키는 것이다. 이러한 이유로 인해, 용기는 단지 소량의 액체로 채워져야 하며, 이에 의해 처리에 필요한 용액 및 물질이 절약될 수 있어, 비용이 절감될 수 있다.
도 8은 각각 전압 펄스의 크기가 변화함에 따라 처리될 세포 사이의 전극의 거리에 대한 트랜스펙션 효율의 의존성을 도시한다. 본 명세서에서 트랜스펙션은 전압 펄스에 의한 살아있는 세포 내로의 핵산 분자(여기에서 DNA)의 도입을 의미한다. 비교적 높은 전압(AX-19)에서는 전극과 세포 사이의 거리에 대한 트랜스펙션 효율의 단지 좋지 못한 의존성이 있는 반면, 낮은 전압(A-5)에서는 전극과 세포 사이의 거리가 감소함에 따라 트랜스펙션 효율이 증가하는 것을 볼 수 있다. 반면에, 중간 전압 펄스(K-19)는 중간 크기의 거리에서 최적 결과를 보인다. 그것은 전극과 세포 사이의 거리가 전압 펄스의 강도에 따라 트랜스펙션 효율에 대체로 큰 영향을 미치는 것을 실증한다.
1: 전극 장치 2: 전극
3: 내부 공간 4: 용기
5: 기저부 영역 6: 공간
10: 전극 장치 11: 절연 재료
12: 전극 13: 내부 공간
14: 용기 15: 기저부 영역
16: 영역 17: 전극 장치
18: 전극 19: 절연 재료
20: 전극 장치 21: 전극
22: 캐리어 23: 본체
24: 경계 영역 25: 저면
26: 절연 재료 27: 스페이서
28: 접촉 요소 29: 영역
30: 상면 31: 단부
32: 영역 33: 면 표면

Claims (19)

  1. 특히 부착 세포에 적어도 하나의 전기장을 인가하기 위한 전극 장치(10, 17, 20)로서,
    각각의 다른 전극(12, 18, 21)의 대응하는 영역(16, 32)과 대면하여 배치되는 적어도 하나의 영역(16, 32)을 각각 포함하는 적어도 2개의 전극(12, 18, 21)을 포함하는 전극 장치(10, 17, 20)에 있어서,
    전기 절연 재료(11, 19, 26)가 전극(12, 18, 21)의 영역(16, 32) 사이에 적어도 부분적으로 배치되는 것을 특징으로 하는 전극 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    적어도 3개, 바람직하게는 적어도 4개 또는 5개, 특히 6개 내지 12개의 전극(12, 18, 21)이 제공되는 것을 특징으로 하는 전극 장치.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    전극(12, 18, 21)은 플레이트 또는 핀 같이 형성되는 것을 특징으로 하는 전극 장치.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    영역(16, 32)은 동일 평면상에 배치되는 전극 플레이트의 측방향 표면인 것을 특징으로 하는 전극 장치.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    영역(16, 32)은 절연 재료(11, 19, 26)에 의해 서로 완전히 분리되는 것을 특징으로 하는 전극 장치.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    전극(12, 18, 21)의 영역(16, 32)에 의해 규정되는 전극(12, 18, 21) 사이의 공간은 완전히 절연 재료(11, 19, 26)로 채워지는 것을 특징으로 하는 전극 장치.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    절연 재료(11, 19, 26)는 열가소성 중합체, 바람직하게는 폴리비닐클로라이드, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 및/또는 폴리카보네이트인 것을 특징으로 하는 전극 장치.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    전극(12, 18, 21)은 금속 및/또는 전기 전도성 합성 재료로 제조되는 것을 특징으로 하는 전극 장치.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    전극 장치(10, 17, 20)는 세포를 향하는 적어도 일측에서 적어도 하나의 스페이서(27)를 포함하는 것을 특징으로 하는 전극 장치.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    전극 장치(10, 17, 20)는 액체로 적어도 부분적으로 채워지는 적어도 하나의 용기(14), 바람직하게는 살아있는 세포가 그것에 부착되는 기저부 영역(15)을 갖춘 용기(14) 내로 삽입되도록 제공되고, 절연 재료(11, 19, 26)는 용기(14) 내로의 삽입시 액체의 적어도 일부를 배출시키는 것을 특징으로 하는 전극 장치.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    전극(12, 18, 21)은 캐리어(22)의 저면(25)에 적어도 부분적으로 배치되는 것을 특징으로 하는 전극 장치.
  12. 제11항에 있어서,
    캐리어(22)는 전극(12, 18, 21)이 반응조의 내부 공간에 노출되도록 캐리어가 반응조 내로 삽입되거나 그것 상에 배치될 수 있도록 설계되는 것을 특징으로 하는 전극 장치.
  13. 제12항에 있어서,
    반응조는 멀티웰 플레이트의 일부인 것을 특징으로 하는 전극 장치.
  14. 바람직하게는 적어도 하나의 침지 전극 장치의 형태로, 부착 세포에 적어도 하나의 전기장을 인가하기 위한, 특히 부착 세포의 전기 천공을 위한 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 전극 장치의 이용.
  15. 부착 세포에 적어도 하나의 전기장을 인가하기 위한 방법으로서,
    전기장은 적어도 2개의 전극(12, 18, 21)에 전압을 인가함으로써 생성되는 방법에 있어서,
    전기장은 세포를 향하는 전극(12, 18, 21)측에 집속되고 그리고/또는 세포와 세포를 향하는 전극(12, 18, 21)측 사이의 공간으로 제한되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    전기장은 세포와 전극(12, 18, 21)의 노출된 전면 사이의 공간으로 제한되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    전기장을 집속 및/또는 제한하기 위해 전기 절연 재료(11, 19, 26)가 전극(12, 18, 21) 사이에 배치되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    전극(12, 18, 21)의 노출된 전면은 세포가 그것에 부착되는 기저부 영역(15)을 갖춘 적어도 하나의 용기(14) 내로 삽입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포에 대한 전기장의 영향은 세포와 전극(12, 18, 21) 사이의 거리를 조절함으로써 최적화되는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020137001479A 2010-06-22 2011-06-21 부착 세포를 처리하기 위한 방법 및 전극 조립체 KR101853514B1 (ko)

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