JP2013529462A - 接着細胞を処理するための方法及び電極アセンブリ - Google Patents
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Abstract
本発明は、他方の電極２１の対応する領域３２と向かい合って配置された少なくとも１つの領域３２をそれぞれ有する少なくとも２つの電極２１を備えた、特に少なくとも１つの電圧を接着細胞に印加するための電極配列体２０であって、電気的絶縁材料２６が、電極２１の領域３２間に少なくとも部分的に配置される電極配列体に関する。本発明の解決法により、処理すべき細胞の領域に電界を集中させることができるため、電圧パルス及びこれによって生じる電流が細胞を通って流れ、電流の大部分が使用されずに細胞上方の電解液中に流れ出ることがない。本発明は更に、電圧を少なくとも２つの電極に印加することにより電界を発生させる、少なくとも１つの電界を接着細胞に印加するための方法であって、電界が電極の細胞側の面に集中し、及び／又は細胞と電極の細胞側の面との間の空間に限定される方法に関する。
【選択図】 図１
【選択図】 図１
Description
本発明は、他方の電極の対応する領域と向かい合って配置された少なくとも１つの領域をそれぞれ有する少なくとも２つの電極を備えた、特に少なくとも１つの電界を接着細胞に印加するための電極配列体に関する。本発明は更に、電圧を少なくとも２つの電極に印加することにより電界を発生させる、少なくとも１つの電界を接着細胞に印加するための方法に関する。
電界又は電圧パルスを生細胞に印加すること、いわゆる電気穿孔又はエレクトロトランスフェクションが、長年にわたって種々の状態の細胞に対して行われている。培養容器内における接着状態で緩衝液に懸濁されている単一細胞は、通常、プラスチック容器の底部にあり、細胞が通常は細胞外基質の組織集合に埋め込まれる生体内状態にある。原則として、電気穿孔では、短期の電流フローを印加することにより、外来分子が、細胞に適合した緩衝液又は細胞培地から細胞に導入され、電圧パルス又はそれによって生じる電界及び電流フローの作用によって、細胞膜を外来分子が透過できるようにする。細胞懸濁液を、電圧印加用の２つの対向する平行電極を側壁に備える試料チャンバを有するいわゆるキュベット、すなわち、細い開放容器に入れることがよくある。細胞膜に一時的に「孔」が生じることにより、生物活性分子はまず細胞質に到達し、ここで対象とする機能を果たすことができ、その後ある一定の条件下で細胞の核にも到達する。高電流密度の短い電圧パルスである強い電界を短期間印加することにより、細胞、細胞誘導体、細胞内粒子、及び／又は小胞を融合させることが更に可能である。このいわゆる電気融合では、例えば、細胞を、不均一な交流電界によって、まず密接に膜接触させる。次いで、電界パルスを印加すると、膜の一部が相互作用し、最終的に融合に至る。電気融合のために、電気穿孔のための装置を適用可能である。更に、生細胞を電界によって刺激して性質を変化させるようにすることもある。
国際公開第２００５／０５６７７８号パンフレットから、例えば、２つの平行に配置された電極面間に位置する多孔膜上で細胞が増殖する電気穿孔のための方法が公知である。
米国特許第５１３４０７０号は、電極として機能する導電面上で増殖する細胞の電気穿孔のための適用及び装置について記載している。培養容器を上から板状の対電極で覆うことにより、放電が可能となる間隙を形成する。
更に、国際公開第２００８／１０４０８６号パンフレットから、細胞が同一平面の電極面上で増殖する装置が公知である。電極間の電気接触が、細胞上方の細胞培地により確立されるため、２つの電極領域が絶縁バリアにより分離されるにもかかわらず、電極間の電解液ブリッジが可能となる。これは、例えば、透明半導体として細胞の顕微分析が可能となるインジウムスズ酸化物から構成することができる。
国際公開第２００９／１３１９７２号パンフレットから、円板状のプレートに接着して増殖する細胞の電気穿孔のための装置が公知である。この装置は、互いに平行に配置された２つの電極を呈するため、一方の電極が外側シリンダの凹面に位置し、他方の電極が内側シリンダの凸面に位置する。
更に米国特許出願公開第２００９／０３０５３８０号から、固体領域に固定された細胞の電気穿孔のための装置が公知である。細胞に印加される電界は、固体領域上方の面に互いに近接して配置された電極対の構成により発生する。電極は、表面をめっきした電気レールにより形成される。１つの電極対の両電極が互いに近接して配置され、複数の単一細胞を両電極間の最短距離内に配置することができないようになっている。
ＢＴＸ社は、ペトリパルサー（ＰｅｔｒｉＰｕｌｓｅｒ）（登録商標）として、培養容器内の接着増殖細胞に垂直方向に印加可能な、交互の極を有する同一平面電極板の配列体を販売している。これにより、電極が培養上清に浸漬されるため、個々の電極板間の空間が培地で満たされる。この配列体の重要な欠点は、電流の大部分が、細胞上方の細胞のない培地に漏れることである。しかし、この電界は、細胞が配置される容器の底部の境界領域でのみ有効であり、不要な高電流を供給しなければならない。更に、ｐＨ値の変化及び高電流による死亡率が高いことも想定しなければならない。更に、長期電圧パルス用の電源は、このような高電流並びにそれによる電荷及び電力を供給するのに十分な強さのあるものでなければならない。更に、電気穿孔に適した、十分に高い濃度でトランスフェクトすべき基質を含む体積の大きなものとしなければならないため、基質の量も対応して大きくなる。
本発明の目的は、高すぎる電流密度を必要とすることなく、電界を使用する接着細胞の効率的な処理を可能にする電極配列体及び方法を提供することである。
電気的絶縁材料が電極の領域間に少なくとも部分的に配置される、初めに述べた電極配列体によって、問題が本発明により解決される。本発明による解決法を使用して、処理すべき細胞の領域に電界を集中させることができるため、電圧パルス又はこれによって生じる電流が細胞を通って流れ、電流の大部分が使用されずに細胞上方の電解液中に漏れることがない。これにより一方では、パルスを発生させるための装置を経済的な大きさにすることができ、他方では、電気分解により生じる高電荷量から生じ得るｐＨ値の大きな変化を避けることができる。更に、本発明の装置により、培養領域にわたって空間的に十分に分配された電気的処理が確実に行われ、処理されていない細胞を含む領域が最小限になる。これにより、順調に処理された（例えばトランスフェクトされた）細胞の割合及び生存率、並びにＤＮＡ又はｍＲＮＡを使用する場合には細胞ごとの発現量が、懸濁液中の細胞の電気穿孔による対応値に相当する。本発明の電極配列体により、電界を使用する接着細胞の効率的な処理が可能になる。
本発明の電極配列体の有利な実施形態では、少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ又は５つ、特に６〜１２個の電極が設けられる。
電極が平板状又はピン状に形成される場合、できるだけ多くの電極を限定空間に配置することができるため、特に均一な電界を発生させることができる。したがって、本発明の代替形態では、平板電極を金属ピンの列で置き換えることができる。このような電気接続されたピンの列は、十分に近接して配置されている場合、発生する電界に関して連続平板電極の代わりとなる。「十分に近接して」とは、この文脈では、同一の極を有する隣接したピン間の距離が、反対の極を有するピンの列間の距離よりも小さいか、又は等しいことを意味する。この構成の適用は特に有利である。その理由は、金属ピン又はワイヤを射出成型具に挿入した後に、例えば熱可塑性ポリマーでカプセル化することによる電極配列体の製造が一般的になっているため、製造プロセスを多くの製造者が容易に制御できるからである。
本発明の電極配列体の更に有利な実施形態では、領域が、同一平面に配置された電極板の側面である。
好ましくは、領域は、絶縁材料により互いに完全に分離される。これは好ましい方法で達成され、好ましくは、電極の領域により画定された電極間の空間が、絶縁材料により完全に満たされる。
本発明の有利な実施形態では、絶縁材料が熱可塑性ポリマーであり、好ましくはポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、及び／又はポリカーボネートである。電極は、好ましくは、金属及び／又は導電性の合成材料から形成される。
本発明の電極配列体の有利な実施形態では、電極配列体が、少なくとも１つの細胞側の面に少なくとも１つのスペーサを備えて、電極が細胞に直接接触するのを避ける。１又は複数のスペーサにより、電極と細胞との間の最短距離が確実に維持され、及び／又は電極と細胞との間の画定された距離を確実に調整することができる。
本発明の電極配列体の特に有利な実施形態では、電極配列体が、少なくとも部分的に液体で満たされた少なくとも１つの容器、好ましくは生細胞が底部領域に接着する容器に挿入するために設けられ、容器への挿入時に、絶縁材料が液体の少なくとも一部を変位させる。これにより、処理すべき細胞に電極を近接させて、細胞上方に位置する液体を最小限にすることができる。
電極は、好ましくは、少なくとも部分的にキャリアの下側に配置される。このキャリアは、例えば、電極が反応槽の内部空間に晒されるように、反応槽に挿入可能又は反応槽上に配置可能に設計される。反応槽は、例えば、単一のキュベット又は細胞培養皿又は好ましくはマルチウェルプレートの一部とすることができる。本発明の電極配列体は、好ましくは、少なくとも１つの電界を接着細胞に印加するため、特に接着細胞の電気穿孔のために、好ましくは少なくとも１つの浸漬電極装置の形で使用される。本発明の浸漬電極装置の形の電極配列体により、好ましい方法で接着増殖細胞のトランスフェクションが可能になり、電極装置はトランスフェクションの前後に培地から除去される。これにより、使用する細胞培養システムによる最大の柔軟性、特にできるだけ多くの培養システムとの適合性が容易に確保される。
更に、本発明の目的は、初めに述べた方法により達成される。すなわち、電界が、電極の細胞側の面に集中し、及び／又は細胞と電極の細胞側の面との間の空間に限定される。本発明の解決法により、電圧パルス又はこれによって生じる電流が細胞を通って流れ、電流の大部分が使用されずに細胞上方の電解液中に漏れることがない。これにより一方では、パルスを発生させるための装置を経済的な大きさにすることができ、他方では、電気分解により生じる高電荷量から生じ得るｐＨ値の大きな変化を避けることができる。更に、本発明の装置により、培養領域にわたって空間的に十分に分配されたトランスフェクションが確実に行われ、トランスフェクトされていない細胞を含む領域が最小限になる。これにより、順調にトランスフェクトされた細胞の割合及び生存率、並びにＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又は他の発現可能な核酸を使用する場合には、細胞ごとの発現への影響度が、懸濁液中の細胞の電気穿孔による対応値に相当する。本発明の方法により、電界を使用する接着細胞の効率的な処理が可能になる。
本発明の方法の有利な実施形態では、電界が、細胞と電極の露出した前面との間の空間に限定される。電界の集中及び／又は限定は、好ましくは、電気的絶縁材料を電極間に配置することにより達成される。
本発明の方法の有利な実施形態では、更に、電極の露出した前面が、細胞が底部領域に接着する少なくとも１つの容器に挿入される。
本発明の方法の特に有利な実施形態では、細胞と電極との間の距離を調節することにより、細胞に対する電界の効果が最適化される。このようにして、処理すべき細胞上方に十分な強度の均一な電界が生じるため、処理効率に対して良好な効果がある。したがって、細胞と電極との間の距離を調節することにより、例えば、細胞のエレクトロトランスフェクションにおけるトランスフェクション効率を最適化することができる。
以下で、図面を参照しながら本発明について詳細に例示的に説明する。
図１は、（ａ）露出された電極２を有する、先行技術の電極配列体１の概略側面図、（ｂ）電極１２間に電気的絶縁材料１１を有する、本発明の電極配列体１０の例示的な概略図である。先行技術の電極配列体１は、主にＢＴＸ社のペトリパルサー（ＰｅｔｒｉＰｕｌｓｅｒ）（登録商標）に対応しており、容器４の内部空間３に突出し、容器４の底部領域５に配置される、３つの同一平面に配置された電極２から構成される（図１ａ）。底部領域５に生細胞が接着し増殖することができる（接着細胞）。内部空間３は液体、例えば細胞培地又は細胞に適合させた別の溶液で満たされ、この液体は電極２間の自由空間６も満たす。したがって、各電極２が液体によって完全に囲まれる。液体が導電性であるため、電極２に電圧を印加した場合、電流の大部分が電極２間の液体中に漏れる（矢印参照）。このため、非永久電圧源を、例えばキャパシタ放電により印加する場合、電圧が急に遮断されるため、電界が時間とともに弱まる。電流の一部のみが底部領域５を通るため、電流フローの生物学的効果は少ない。
本発明の電極配列体１０は、容器１４の内部空間１３に突出する、３つの同一平面に配置された電極１２を備える（図１ｂ）。容器１４は、生細胞が接着し増殖することができる（接着細胞）底部領域１５を備える。内部空間１３は液体、例えば細胞培地又は細胞に適合させた別の液体で満たされる。電極１２間の空間は電気的絶縁材料１１で完全に満たされるため、電極１２に電圧を印加した場合に、電極１２間の空間に電流が漏れることがない。全電流が電極１２と底部領域１５との間の空間を通るため、非永久電圧源（例えばキャパシタ）を印加する場合、電圧降下に長い時間がかかることによって、時間とともに細胞処理のための電界強度が増加する。これにより、一方では、パルスを発生させるための装置を経済的な大きさにすることができ、他方では、電気分解により生じる高電圧値から生じ得る液体中のｐＨ値の大きな変化を避けることができる。
本発明によれば、例えば、同一平面電極１２が絶縁材料１１により互いに分離されて、電極１２の導電面が下方（底部領域１５又は底部領域１５に接着する細胞側）にのみ露出され、周囲環境と電気接触する。平行線で示される、同一平面電極１２の対向配置された領域１６間の領域、又は少なくとも電極１２間で液体に晒される領域に、絶縁材料１１が完全に延びているため、電界を集中させることができ、又は電流を対象の作用半径に限定することができる。更に、目標細胞の領域に電界を集中させること、又は電流を作用半径に限定することは、同一平面電極１２の使用により可能となり、電極１２と底部領域１５との間の目標領域で、一定のより安定した電界強度及び電流密度が提供されることは特に有利である。したがって、適切な絶縁材料は、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリスチロール、ポリプロピレン、ポリエチレン、又はポリカーボネート等の一般的な、好ましくは熱可塑性合成材料から形成された板、又は射出成形物である。本発明の構成により、電極１２の同一平面部分の各対向領域１６を通る電流の漏れを避けることができるため、一定の電流の電圧パルスが発生する。したがって、例えば、放電に従って必要な電力を制限する低エネルギー／電流の１又は複数の連続したパルス放電により、処理すべき細胞の培養床の面積に応じた反応に従って、本発明の構成を適用することができる。
例えば、電極の極を交互にした、電極と絶縁体とのサンドイッチ構造を使用してもよい。このような構成では、活性電極下の領域の電界は実際には存在しないため、活性電極下の領域に位置する細胞には何の影響もない。このような領域は、導電体（電極）、及びしたがって相当な電界の外側に近接している。したがって、電極をできるだけ薄く（例えば５０ｐｍ）すべきであり、電極配列体の、細胞で覆われた底部領域の略全体を、電極と絶縁体との組合せの活性領域によって覆うべきである。活性領域は、反対の極を有する電極間の絶縁材料下の領域である。これにより、特に電極配列体の横断面が円形形状であることが有利であり、その寸法は、ＡＮＳＩ−ＳＢＳ規格（米国規格協会、生体分子科学学会）に従う一般的な細胞培養容器に適合したものである。
図１ｃは、ピン状電極１８を有する本発明の電極配列体１７の更なる例示的な実施形態の下側の概略上面図である。電極１８がそれぞれ円形横断面を有するため、実際に各円周領域全体が、他の電極１８の対応領域に対向して配置された領域を有する。したがって、本実施形態では、ピン状電極１８間の空間が電気的絶縁材料１９により完全に満たされているため、下側の電極１８の表面が、周囲環境に晒されて周囲環境と接触している。これにより、すべての電極１８が、円周領域全体でそれぞれ互いに電気的に絶縁されるため、電極１８間の空間にわたって電流が漏れることがない。本発明の電極配列体１７では、再びすべての電流が電極１８と（この図にはない）細胞との間の空間を通るため、非永久電圧源（例えばキャパシタ）を印加することにより、電圧降下により長い時間がかかり、これにより時間とともに細胞処理のための電界強度が非常に高くなる。
実験の目的で、本発明の装置又は電気構成は、アルミニウム膜と２ｍｍの絶縁材料との交互の層から設計された。接合された装置は、培養容器（６ウェル、１２ウェル、２４ウェル）の円形形状に適合させるように研磨され、上端部で、２つの電気接続を有する１つおきの電極の電気接点により接合された。次に、装置が水平線形トラックに取り付けられるか、又は接着細胞（ここではＨｅＬａ細胞）が増殖する培養ウェルに直接手で導入された。この場合、簡単にするために、実験装置が培養床に置かれたため、細胞と電極配列体との間の距離を１ｍｍ未満と推定することができる。予め容器中の培地を、プラスミドＤＮＡ（Ｌｏｎｚａ社のｐｍａｘＧＦＰ（登録商標）、２μｇ／１００μｌ）を含む溶液（Ｌｏｎｚａ社のヌクレオフェクター（登録商標）細胞株溶液Ｒ）の混合物１ｍｌに置き換えた。その後、交互に接続された電極膜に、Ｌｏｎｚａ社のヌクレオフェクター（登録商標）によって異なる試験パルスを印加した。試験パルスの値は、１００μｌ容量のキュベットによる適用の際に使用する範囲とした。続いて、装置を再び培養ウェルから除去し、培地を再び電解液で置き換えて、細胞の更なる培養を可能にした。簡単にするために、溶液ＤＮＡ混合物を異なるウェルで再利用した。電極間に絶縁体がないために同一の溶液ＤＮＡ混合物２ｍｌを充填して同一の充填レベルを達成する場合を除いて、ＢＴＸ社のペトリパルサー（登録商標）を使用する類似の手法を用いた。１日後、フローサイトメトリーにより細胞を分析した。略同一の電極距離を有するＢＴＸ社のペトリパルサー（登録商標）の適用、したがって電界を発生させるための同一の前提条件によって、非常にまれにトランスフェクトされた細胞のみが検出可能である（図２１）。更に、この場合、過電流の停止に関する誤報告が観察された。この報告は、電極板間の空いた中間空間により電流フローが限定されないため、ペトリパルサー（登録商標）が十分に高い電界を発生させるのに適していないことを示す。これと比較して、本発明の装置の適用により、細胞の３０％〜４５％をトランスフェクトすることができる（ＧＦＰ発現、図２ｂ）。したがって、本発明の構成は、接着細胞を効率的にトランスフェクトすることができることが明らかである。
続いて、導入された遺伝情報の生存、形態、及び発現について、細胞を分析した。図３は、一方では図２ｂに関して説明した本発明の装置により、他方では図２ｂに関するＢＴＸ社のペトリパルサー（登録商標）による前述した方法によりトランスフェクトされた細胞の比較を示す。本発明の電極配列体により、高い生存率と形態完全性を維持することによって、細胞が高効率でトランスフェクトされたことがわかった（図３ａ及び３ｂ）。この結果により、懸濁液中でトランスフェクトされた細胞のための既存の実験計画の比較データと同一範囲のスケールが提供される。ペトリパルサー（登録商標）による処理後、実際に、高い生存率が判定されたが、大きなトランスフェクションはなかった（図３ａ及び３ｂ）。
図４は、本発明による電極配列体２０の例示的な実施形態の下側の概略図である。電極配列体２０は、図５、７を参照しながら詳細に後述する７つの電極２１を備える。電極２１は、基本的に円筒形に形成されたキャリア２２内に配置される。キャリア２２は、基部本体２３と、基部本体２３の上端部の境界領域２４とを備える。境界領域２４の外径が基部本体２３の外径よりも大きいため、境界領域２４が基部本体２３の外側に突出する。電極２１は、大部分が基部本体２３内に配置され、キャリア２２の下側２５の下部表面３３で露出されて周囲環境に接触している。単一電極２１は、それぞれ絶縁材料２６により互いに電気的に分離され、本実施形態では、単一電極２６間の空間が絶縁材料２６で完全に満たされている。電極２１の対向領域間に絶縁材料２６があることにより、電極に電圧を印加したときに、電極が導電液体に浸漬されていても電極２１間の空間に電流が漏れることが確実になくなる。むしろ、絶縁材料によって、電極２１に電圧を印加したときに、電流が電極２１の表面３３を通って流れ、キャリア２２の下側２５の下方で電界が発生する。電極２１間の空間に大量の電流が漏れることがないため、キャパシタ又は別の非永久電圧源の放電中の電圧降下に長い時間がかかり、時間とともに一定のより安定した電流が流れ、生物学的方法の大部分、例えばトランスフェクションについて、十分な強度の電界を放電時間にわたって発生させる。電極配列体２０は、特に少なくとも部分的に液体で満たされた容器、例えば反応槽、細胞培養トレイ又はマルチウェルプレートの「ウェル」に挿入されるように設けられ、前記容器は、生細胞が接着可能な底部領域を提供する。容器の底部領域の接着細胞は、通常、適切な液体、例えば、細胞培地又は所望の電気的処理に適合させた溶液により覆われ、電極配列体２０は、容器への挿入中に前記液体の少なくとも一部を変位させる。このため、表面３３を有する電極２１は、容器の底部領域に直接配置されず、したがって細胞上に配置されない。キャリア２２の下側２５が４つのスペーサ２７を提供し、電極２１と容器の底部領域との間に十分な距離を確保する。
図５は、図４による電極配列体２０の斜視図であり、電極２１の内部が見えるようになっている。この図から、電極２１が特に板状に形成され、電極板の厚さがキャリア２２の下側２５に向かって減少することが明らかである。したがって、容器内の液体に接触する、電極２１の露出した表面３３は、基部本体２３内に配置された電極２１の一部として基本的に薄くなっている。この利点は、電界が非常に弱いために細胞の効果的な電気的処理が不可能な各電極２１下の領域が最小になることである。逆に両端部では、十分な電気接触を確立するために電極２１を効率的に接触させる必要があるため、電極２１の厚さを大きくしなければならない。本実施形態の場合には、電極２１の肉厚領域２９に挿入されるピン状接触要素２８により、使用する電圧源のそれぞれに対する電気接触が確立される。接触要素２８は、適切な接触装置により、領域２９と反対側の端部で電圧源に電気接続される。電圧源は、例えば、電圧パルスを制御して放射可能な１又は複数のキャパシタとすることができる。発生した電圧パルスは、接触要素２８を渡って電極２１へ送られ、これにより電極２１の下側で、すなわち、キャリア２２の下側２５の下方で、電極間の絶縁材料２６が、細胞と電極２１の細胞側との間の空間に限定又は集中するため、電界が確立される。
本発明の電極配列体２０は、好ましくは射出成形プロセスにより製造される。これにより、接触要素２８がまず適切な射出成形具に挿入されて、絶縁ポリマーでカプセル化される。その後第２のステップで、導電ポリマーが射出されて、電極２１を形成する。或いは、電極を金属、好ましくはアルミニウムから形成してもよい。本実施形態では、金属電極をまず射出成形具に挿入した後に、絶縁ポリマーでカプセル化する。本実施形態では、金属電極が、好ましくは、電極に電気接触するのに適した、上方に突出した付属物を提供する。
図６は、図４に関連した本発明の電極配列体２０の上側３０の斜視図である。接触要素２８が基部本体２３から上方に突出していることが明らかである。これにより、接触要素２８は、露出した端部３１を除いて、基部本体の絶縁材料で完全に囲まれている。このような露出した端部３１を使用して、接触要素２８を適切な装置により電圧源に電気接触させることができる。
図７は、図４〜６に関連する電極配列体２０の縦断面図である。この図から、電極２１の直径が基部本体２３の下側２５に向かって小さくなっているため、不十分な電界が確立される電極２１下の領域が最小になることが明らかである。電極２１の反対側端部には、接触要素２８がそれぞれ挿入又は射出される肉厚な領域２９がある。この特に有利な実施形態により、接触要素２８と電極２１との間の十分な電気接触が確保されるため、電極２１が確保されるまでに電圧源から電圧パルスが効果的に送られる。電極配列体２０を、液体で満たされた、生細胞が底部領域に接着する容器に挿入する場合、スペーサ２７により、電極２１の下側と処理すべき細胞との間の最適な距離が確実に設定される。電極２１の対向配置領域３２間の空間が絶縁材料２６で完全に満たされているため、電極２１の領域３２間に液体が入らず、電極２１の領域３２間を通って電流が漏れることがない。このようにして、電圧を電極２１に印加することにより、電界が電極の細胞側に集中し、細胞と電極２１との間の空間に限定又は集中する。このようにして、細胞を非常に効果的に、かつ比較的低い電力需要で処理することができる。本発明の更なる利点は、電極２１間の中間空間がないため、電極配列体２０が、容器へ挿入中の液体の一部を変位させることである。この理由により、容器を少量の液体のみで満たす必要があり、処理に必要な溶液及び物質を節約することによりコストを減らすことができる。
図８は、電圧パルスの大きさの変化に応じた、処理すべき細胞間の電極の距離に対するトランスフェクション効率の依存を示す。この文脈において、トランスフェクションとは、電圧パルスにより核酸分子（ここではＤＮＡ）を生細胞に導入することを意味する。比較的高電圧（ＡＸ−１９）では、電極と細胞との間の距離に対するトランスフェクション効率の依存は少ないが、低電圧（Ａ−５）では、電極と細胞との間の距離が小さくなるとトランスフェクション効率が増加することがわかる。逆に、中電圧パルス（Ｋ−１９）は、中距離で最適であることを示す。電圧パルスの強度に応じて、電極と細胞との間の距離が、トランスフェクション効率に大きな影響を与えることが示される。
１ 電極配列体
２ 電極
３ 内部空間
４ 容器
５ 底部領域
６ 空間
１０ 電極配列体
１１ 絶縁材料
１２ 電極
１３ 内部空間
１４ 容器
１５ 底部領域
１６ 領域
１７ 電極配列体
１８ 電極
１９ 絶縁材料
２０ 電極配列体
２１ 電極
２２ キャリア
２３ 基部本体
２４ 境界領域
２５ 下側
２６ 絶縁材料
２７ スペーサ
２８ 接触要素
２９ 領域
３０ 上側
３１ 端部
３２ 領域
３３ 表面
２ 電極
３ 内部空間
４ 容器
５ 底部領域
６ 空間
１０ 電極配列体
１１ 絶縁材料
１２ 電極
１３ 内部空間
１４ 容器
１５ 底部領域
１６ 領域
１７ 電極配列体
１８ 電極
１９ 絶縁材料
２０ 電極配列体
２１ 電極
２２ キャリア
２３ 基部本体
２４ 境界領域
２５ 下側
２６ 絶縁材料
２７ スペーサ
２８ 接触要素
２９ 領域
３０ 上側
３１ 端部
３２ 領域
３３ 表面
Claims (19)
- 特に少なくとも１つの電界を接着細胞に与えるための電極配列体（１０、１７、２０）であって、
少なくとも２つの電極（１２、１８、２１）を備え、それぞれが他の電極（１２、１８、２１）の対応する領域（１６、３２）と向かい合って配置された少なくとも１つの領域（１６、３２）を有する、電極配列体において、
電気的絶縁材料（１１、１９、２６）が、前記電極（１２、１８、２１）の前記領域（１６、３２）間に少なくとも部分的に配置されていることを特徴とする、電極配列体。 - 少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ又は５つ、特に６〜１２個の電極（１２、１８、２１）が設けられていることを特徴とする、請求項１に記載の電極配列体。
- 前記電極（１２、１８、２１）が平板状又はピン状に形成されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の電極配列体。
- 前記領域（１６、３２）が、同一平面に配置された電極板の側面であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の電極配列体。
- 前記領域（１６、３２）が、前記絶縁材料（１１、１９、２６）により互いに完全に分離されていることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の電極配列体。
- 前記電極（１２、１８、２１）の前記領域（１６、３２）により画定された前記電極（１２、１８、２１）間の空間が、前記絶縁材料（１１、１９、２６）により完全に満たされていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の電極配列体。
- 前記絶縁材料（１１、１９、２６）が熱可塑性ポリマーであり、好ましくはポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、及び／又はポリカーボネートであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の電極配列体。
- 前記電極（１２、１８、２１）が金属及び／又は導電性の合成材料から形成されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の電極配列体。
- 前記電極配列体（１０、１７、２０）が、少なくとも１つの細胞側の面に、少なくとも１つのスペーサ（２７）を備えることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の電極配列体。
- 前記電極配列体（１０、１７、２０）が、少なくとも部分的に液体で満たされた少なくとも１つの容器（１４）に、好ましくは生細胞が底部領域（１５）に接着する容器（１４）に挿入するために設けられ、前記容器（１４）への挿入時に、前記絶縁材料（１１、１９、２６）が前記液体の少なくとも一部を変位させることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の電極配列体。
- 前記電極（１２、１８、２１）が、少なくとも部分的にキャリア（２２）の下側（２５）に配置されていることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の電極配列体。
- 前記キャリア（２２）が、前記電極（１２、１８、２１）が反応槽の内部空間に晒されるように、前記反応槽に挿入可能又は前記反応槽上に配置可能に設計されていることを特徴とする、請求項１１に記載の電極配列体。
- 前記反応槽がマルチウェルプレートの一部であることを特徴とする、請求項１２に記載の電極配列体。
- 少なくとも１つの電界を接着細胞に与えるための、特に接着細胞の電気穿孔のための、好ましくは少なくとも１つの浸漬電極装置の形での、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の電極配列体の使用。
- 電圧を少なくとも２つの電極（１２、１８、２１）に印加することにより電界を発生させる、少なくとも１つの電界を接着細胞に与えるための方法において、
前記電界が、前記電極（１２、１８、２１）の細胞側の面に集中し、及び／又は前記細胞と前記電極（１２、１８、２１）の細胞側の面との間の空間に限定されることを特徴とする、方法。 - 前記電界が、前記細胞と前記電極（１２、１８、２１）の露出した前面との間の空間に限定されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
- 前記電界の集中及び／又は限定のために、電気的絶縁材料（１１、１９、２６）が前記電極（１２、１８、２１）間に配置されることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の方法。
- 前記電極（１２、１８、２１）の露出した前面が、前記細胞が底部領域（１５）に接着する少なくとも１つの容器（１４）に挿入されることを特徴とする、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞と前記電極（１２、１８、２１）との間の距離を調節することにより、前記細胞に対する前記電界の効果が最適化されることを特徴とする、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
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