KR101853515B1 - 부착 세포를 균일하게 처리하기 위한 방법 및 장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 부착 세포에 적어도 하나의 전기장을 인가하기 위한 방법으로서, 전기장은 적어도 2개의 활성 전극(63)에 전압을 인가함으로써 생성되고, 적어도 3개의 전극(63, 64)이 제공되며, 제1 전기장을 생성하기 위해 전압이 인가될 때 적어도 2개의 전극(63, 64)은 활성 전극(63)이고, 적어도 하나의 제2 전기장이 생성되며, 전압이 인가될 때 2개의 이전의 활성 전극(63) 중 적어도 하나는 무전위(potential-free) 전극(64)인 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 적어도 하나의 스위칭 장치(59, 60, 61, 62)에 의해 적어도 하나의 전압원에 연결되는 적어도 3개의 전극(63, 64)을 포함하는 장치(58)로서, 적어도 5개의 전극(63, 64)이 4개의 스위칭 장치(59, 60, 61, 62)에 의해 적어도 하나의 전압원에 연결되고, 적어도 2개의 전극(63, 64)이 공통 스위칭 장치(59, 60, 61, 62)에 의해 전압원에 연결되는 장치에 관한 것이다. 전술된 방법과 함께, 본 발명에 따른 장치는 전기장을 사용한 부착 세포의 효율적이고 균일한 처리를 허용하며, 여기에서 활성 전극과 무전위 전극 사이의 전환은 보다 적은 수의 스위칭 장치를 사용하여 신속하고 안전하게 수행될 수 있다.

Description

부착 세포를 균일하게 처리하기 위한 방법 및 장치{METHOD AND DEVICE FOR UNIFORMLY TREATING ADHERENT CELLS}

본 발명은 부착 세포에 적어도 하나의 전기장을 인가하기 위한 방법으로서, 전기장은 적어도 2개의 활성 전극(active electrode)에 전압을 인가함으로써 생성되고, 적어도 3개의 전극이 제공되는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 적어도 하나의 스위칭 장치를 통해 적어도 하나의 전압원에 연결되는 적어도 3개의 전극을 포함하는 장치에 관한 것이다. 본 발명은 또한 각각 적어도 2개의 전극을 포함하는 적어도 2개의 전극 장치를 접촉시키기 위한 장치로서, 적어도 2개의 전극 장치는 상이한 치수를 갖고, 장치는 전극 장치의 전극에 전기 접촉이 일어날 수 있도록 하는 접촉 요소를 포함하는 장치에 관한 것이다.

살아있는 세포에 대한 전기장 또는 전압 펄스의 인가, 이른바 전기 천공(electroporation) 또는 전기 트랜스펙션(electrotransfection)이 수년간 다양한 상태로 세포에 실시된다. 완충 용액 내의 현탁되는 단일 세포로서, 배양 용기 내에, 보통은 플라스틱 용기의 기저부에 부착 상태로, 그리고 세포가 보통 세포외 기질의 조직 집합체 내에 매립되는 생체 내에서. 원칙적으로, 전기 천공에서, 단기 전류 흐름을 인가함으로써, 세포에 맞추어진 완충 용액 또는 세포 배양 배지로부터 세포 내로 이물 분자가 도입되어, 전압 펄스 또는 이에 의해 생성된 전기장 및 전류 흐름의 작용으로 인해 세포막이 이물 분자를 투과시킬 수 있게 된다. 세포 현탁액은 흔히 좁고 개방된 용기인 이른바 큐벳(cuvette) 내에 배치되며, 이러한 샘플 챔버는 전압을 인가하는 역할을 하는 2개의 평행한 반대 전극을 측벽 내에 구비한다. 세포막 내의 일시적으로 생겨난 "세공(pore)"에 의해, 생물학적 활성 분자가 우선 세포질에 도달하여, 그곳에서 분자가 아마도 이미 관심 있는 그 기능을 수행할 수 있으며, 이어서 소정 조건 하에서 또한 세포핵에 도달한다. 강한 전기장의 단기 인가, 즉 높은 전류 밀도의 단기 전압 펄스로 인해, 또한 세포, 세포 유도체, 아세포 입자(subcellular particle) 및/또는 소포가 또한 융합될 수 있다. 이른바 전기 융합(electrofusion)에서, 예를 들어, 세포가 우선 불균질한 교번하는 전기장에 의해 막이 밀착 접촉된다. 전기장 펄스의 후속 인가에 의해, 막 부분의 상호 작용이 일어나고, 이는 최종적으로 융합을 유발한다. 이에 의해, 전기 융합에 대해 전기 천공에 대해서와 유사한 기구 장치가 적용가능하다. 또한, 살아있는 세포가 심지어 그 특성을 변화시키는 방식으로도 전기장에 의해 자극될 수 있다.

예를 들어 WO 2005/056788 A1으로부터, 2개의 평행 배치된 전극 표면 사이에 위치되는 미소공성 막 상에서 세포가 성장하는 전기 천공을 위한 방법이 공지되어 있다.

US-A-5 134 070은 전극의 역할을 하는 전기 전도성 표면상에서 성장하는 세포의 전기 천공을 위한 응용 및 장치를 기술한다. 배양 용기는 위로부터 플레이트형 상대 전극으로 덮이며, 이에 의해 그것을 가로질러 전기 방전이 가능한 갭이 형성된다.

또한, WO 2008/104086 A1으로부터, 세포가 동일 평면상의 전극 표면상에서 성장하는 장치가 공지되어 있다. 전극 사이의 전기 접촉은 세포 위의 세포 배양 배지에 의해 확립되고, 두 전극 영역은 절연 장벽에 의해 분리되지만, 그럼에도 불구하고 전극 사이의 전해질 브리지(electrolyte bridge)를 허용한다. 그것은 예를 들어 투명 반도체로서 세포의 현미경 분석을 허용하는 인듐 주석 산화물로 구성될 수 있다.

WO 2009/131972 A1으로부터, 둥근 디스크형 플레이트 상에 부착되어 성장하는 세포의 전기 천공을 위한 장치가 공지되어 있다. 장치는 서로 평행하게 배치되는 2개의 전극을 보이며, 하나의 전극은 외부 실린더의 오목한 표면상에 위치되고, 다른 하나의 전극은 내부 실린더의 볼록한 표면상에 위치된다.

또한, US 2009/0305380 A1으로부터, 고체 영역에 고정되는 세포의 전기 천공을 위한 장치가 공지되어 있다. 세포에 인가되는 전기장은 고체 영역 위의 표면상에 서로 근접하게 옆에 놓여 위치되는 전극 쌍의 배열에 의해 생성된다. 전극은 표면상에 도금되는 전기 레일에 의해 형성된다. 하나의 전극 쌍의 양쪽 전극은 많아야 하나의 단일 세포가 양쪽 전극 사이의 최소 거리 내에 위치될 수 있도록 서로 근접하게 배치된다.

회사 비티엑스(BTX)는 배양 용기 내의 부착 성장 세포 상에 수직으로 적용될 수 있는 동일 평면상의 교번 분극 전극 플레이트의 장치를 PetriPulser^®로서 보급한다. 이에 대하여, 전극은 배양 상청액 내로 침지되며, 이에 의해 개별 전극 플레이트 사이의 공간이 배양 배지로 채워진다. 이 장치의 중요한 단점은 전류의 대부분이 세포 위의 무세포 배양 배지에서 누설되는 것이다. 그러나, 이러한 전기장은 단지 세포가 위치되는 용기의 기저부 상의 경계 영역에서 효과적일 뿐이어서, 불필요한 높은 전류가 제공되어야 한다. 또한, pH-값 변화 및 높은 전류로 인해 높은 폐사율이 가정되어야 한다. 또한, 장기 전압 펄스를 위한 전력 공급이 그들 높은 전류와 따라서 전하 및 전력을 제공하기에 충분히 강하여야 한다. 또한, 전기 천공에 적합한 그리고 충분히 높은 농도로 트랜스펙션될 기질을 포함하는 큰 용적부가 제공되어야 하며, 이에 의해 기질의 양이 또한 상응하게 더욱 많다. 전기장이 자유 전극 팁 아래에 직교하게 위치되는 영역 내에서 최소 강도를 갖는 것이 이러한 공지된 장치의 중요한 단점이다. 결과적으로, 이 영역에 존재하는 세포가 실제로 트랜스펙션되거나 융합되지 않아, 이러한 공지된 장치에 의해 채용된 공정의 효율이 전체적으로 낮다.

본 발명의 목적은 전기장을 사용하여 부착 세포의 효율적이고 균일한 처리를 가능하게 하는 방법 및 장치를 제공하는 것이다.

본 발명에 따르면, 상기한 목적은 제1 전기장을 생성하기 위해 전압이 인가될 때 적어도 2개의 전극이 활성 전극이고, 적어도 제2 전기장이 생성되며, 전압이 인가될 때 2개의 이전의 활성 전극 중 적어도 하나가 부유 전극(floating electrode)인, 서두에 언급된 유형의 방법에 의해 달성된다. 예를 들어 제1 전극이 활성이면, 즉 양극이거나 음극이면, 전압 펄스가 세포에 인가될 때, 이 전극 아래의 전기장은 이 전극 아래에 직교하게 위치되는 세포가 충분히 전기적으로 처리되지 않도록 최소 강도를 갖는다. 결과적으로, 본 발명에 따르면, 제2 전기장이 생성되며, 여기에서 상기 제1 전극은 이제 부유성[비활성(passive)]이다. 즉, 전기장은 적어도 2개의 상이한 전극에 전압을 인가함으로써 생성된다. 따라서, 제2 전압 펄스 중 전기장이 이제 상기 제1 전극 아래의 영역에도 또한 인가되는 것이 달성된다. 그 결과, 본 발명에 따른 방법은 제1 전압 펄스 중 전기장에 노출되지 않았던 세포도 또한 충분히 전기적으로 처리되는 것을 보장한다. 본 발명에 따른 방법에 의해, 전기장이 낮은 영역의 수가 효율적으로 최소화될 수 있어, 각각의 공정, 예컨대 전기 트랜스펙션 또는 전기 융합의 효율이 최적화될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 유리하게는 전기장에 의한 부착 세포의 효율적이고 균일한 처리를 보장하기에 적합하다.

바람직하게는, 제1 전기장이 생성되었을 때 활성이었던 모든 전극으로 적어도 한번 부유 전극을 만들기 위해 추가 전기장의 생성 중 필요한 만큼 많은 전기장이 생성된다. 이 방식으로, 전기장에 노출되지 않은 영역이 전극 아래에 존재하지 않는 것이 보장된다. 따라서, 이러한 최적의 경우에, 모든 세포가 전기장에 의해 균일하게 처리되어, 각각의 공정, 예컨대 전기 트랜스펙션 또는 전기 융합에서 최대 효율이 보장될 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 실시 형태에서, 각각의 전기장이 각각 적어도 하나의 전압 펄스, 바람직하게는 적어도 2개의 전압 펄스에 의해 생성되는 것이 제공된다. 본 발명에 따르면, 전기장 각각은 단일 전압 펄스 또는 적어도 2개의 또는 많은 짧게 계속되거나 병합되는 (서브) 전압 펄스에 의해 생성될 수 있다. 이에 대하여, 서브-펄스는 하나 이상의 전하 저장소(들), 바람직하게는 하나의 커패시터 또는 적어도 2개의 커패시터를 방전시킴으로써 생성될 수 있다. 바람직하게는, 전기장을 생성하는 각각의 전압 펄스는 짧은 높은 전압 펄스 및 상대적으로 낮은 전압의 보다 긴 펄스로 구성되는 이중 펄스이다. 이러한 이중 펄스는 예를 들어 2개의 커패시터를 하나를 다른 하나 직후에 연속하여 방전시킴으로써 생성될 수 있으며, 여기에서 양쪽 서브-펄스는 중단없이 병합될 수 있다. 예를 들어, 제1 전하 저장 유닛은 적어도 10 ㎌, 바람직하게는 적어도 50 ㎌, 특히 적어도 100 ㎌의 정전 용량을 가질 수 있고, 그리고/또는 10 내지 1500 V, 바람직하게는 20 내지 1200 V, 특히 50 내지 1000 V의 초기 전압에서 2 ㎲ 내지 40 ㎳, 바람직하게는 5 ㎲ 내지 20 ㎳, 특히 10 ㎲ 내지 10 ㎳의 펄스 길이를 갖고서 방전될 수 있다. 제1 전하 저장 유닛의 방전 종료 직전에, 그것과 동시에 또는 그것 직후에, 예를 들어 적어도 100 ㎌, 바람직하게는 적어도 500 ㎌, 특히 적어도 1000 ㎌의 정전 용량을 갖는 제2 전하 저장 유닛이 예컨대 10 내지 240 V, 바람직하게는 20 내지 200 V, 특히 50 내지 150 V의 초기 전압에서 예컨대 1 ms 내지 500 ms, 바람직하게는 2 ms 내지 350 ms, 특히 4 ms 내지 250 ms의 펄스 길이를 갖고서 방전될 수 있다.

부수적으로 또는 대안적으로, 적어도 2개의 전기장은 각각 적어도 하나의 전압 펄스에 의해 생성될 수 있으며, 여기에서 전압 펄스 사이의 시간차(time gap)는 적어도 500 ms, 바람직하게는 적어도 1 s, 특히 1 내지 10 s이다. 놀랍게도, 본 발명에 의해 규정되는 바와 같은 전기장을 각각 생성하는 전압 펄스(서브-펄스가 아님!) 사이의 시간차는 세포의 생존율을 안정되게 유지시키기 위해 그리고/또는 공정의 높은 효율을 보장하기 위해 비교적 커야 한다. 이에 의해, 전술된 바와 같이, 각각의 단일 전압 펄스는 다수의, 즉 적어도 2개의 서브-펄스로 구성될 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 실시 형태에서, 내부에서 전기장이 각각 부착 세포에 인가되는 수개의 반응 공간이 제공되며, 여기에서 하나의 반응 공간 내에 2개의 전기장을 생성하기 위한 두 전압 펄스 사이의 시간차는 적어도 하나의 다른 반응 공간 내에 적어도 하나의 전기장을 생성하기 위해 사용되는 것이 제공된다. 본 발명의 이 실시 형태는 많은 샘플이 매우 짧은 시간 내에 처리되어야 하는 경우에, 즉 특히 고 처리율 공정에서 특히 유리하다. 이미 전술된 바와 같이, 각각의 반응 공간 내에 전기장을 생성하기 위한 단일 전압 펄스는 서로에 대한 비교적 긴 시간적 거리(temporal distance)를 가질 수 있다. 많은 샘플이 처리되면, 이는 매우 긴 공정 지속 시간을 초래할 것이다. 본 발명에 따르면, 따라서 단일 전압 펄스는 처리될 상이한 반응 공간에 대해 바람직하게는 중첩된 방식으로 생성되어, 하나의 반응 공간 내에서의 두 전기장의 생성 사이의 대기 시간(dead time)이 적어도 하나의 다른 반응 공간 내에 적어도 하나의 전기장을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이 방식으로, 예컨대 "24-웰" 세포 배양 플레이트의 모든 반응 공간을 처리하는데 총 공정 지속 시간이 현저히 감소될 수 있다. 또한, 이러한 접근법에 의해, 처리 전 및/또는 처리 후 상이한 배양 시간으로 인한 상이한 반응 공간 내의 샘플 사이의 차이의 발생 위험이 감소된다. 예를 들어, "24-웰" 플레이트의 단일 반응 공간 내의 세포가 보다 긴 시간에 걸쳐 연속하여 처리된다면, 제1 반응 공간 내의 샘플은 처리 후 비교적 긴 배양 시간을 소모할 것인 반면, 마지막으로 처리된 샘플은 처리 전 보다 긴 배양 시간을 소모하여야 할 것이다. 이는 단일 반응 공간 내에서의 처리의 효율에 영향을 미칠 수 있고, 최종적으로는 단일 샘플로 상이한 결과를 초래할 수 있다. 반면에, 상이한 반응 공간의 중첩된 처리는 상이한 배양 시간의 최소화로 인해 각각 더욱 일관되고 따라서 더욱 재현가능한 결과 및 효율을 형성한다.

본 발명의 특히 바람직한 실시 형태에서, 전극과 부착 세포가 서로 분리되고, 세포와 전극 사이의 거리가 실험적으로 결정된 값으로 조절되는 것이 또한 제공된다. 바람직하게는, 거리는 활성 전극 사이의 그리고 부유 전극 아래의 전기장의 강도가 각각 최적화되도록 조절된다. 거리가 증가할 때 전기력선의 밀도가 감소하여, 거리가 증가할 때 용기의 기저부 영역 상의 유효 전기장이 감소하는 것으로 입증되었다. 기술적으로, 이러한 효과는 인가 전압을 증가시킴으로써, 즉 전류 밀도를 증가시킴으로써 보상될 수도 있다. 그러나, 이는 기술적 노력 및 뇌방전(lightning discharge)의 위험을 증가시킬 것이다. 너무 작은 거리는 심지어 기저부 표면의 근소한 비평탄함도 전기장의 불균질 및 따라서 재현가능하지 않은 결과를 초래할 것이기 때문에 또한 타당하지 않다. 이와 관련하여, 거리가 증가할 때 활성 전극 사이의 전기장 강도가 감소하는 반면, 부유 전극 아래의 전기장 강도가 중간 거리에서 최대값에 도달하는, 즉 거리가 감소하거나 증가할 때 이 최대값에 기초하여 감소하는 것이 또한 고려되어야 한다. 따라서, 공정의 조건에 따라, 부유 전극 아래의 전기장 강도가 거의 최대값에 도달하는 동시에 활성 전극 사이의 최대한 높은 값에 도달하도록 세포까지의 전극의 거리가 조절되어야 한다. 이러한 최적 거리는 반응 공간의 기하학적 구조, 사용되는 완충 용액의 유형, 전극의 형상 및 크기, 및 전기적 파라미터와 같은 상이한 조건에 대해 실험적으로 결정되어야 한다.

본 발명에 따르면, 상기한 목적은 또한 적어도 5개의 전극이 4개의 스위칭 장치를 통해 적어도 하나의 전압원에 연결되고, 적어도 2개의 전극이 공유 스위칭 장치를 통해 전압원에 연결되는, 서두에 언급된 유형의 장치, 특히 본 발명에 따른 방법을 달성하기 위한 장치에 의해 달성된다. 이러한 특히 유리한 구성으로 인해, 모든 전극이 활성 또는 비활성(부유) 전극으로서 작동될 수 있다. 본 발명에 따른 장치에서 전극을 그룹화시키고 스위칭 장치의 수를 제한함으로써, 간섭을 덜 받는 비용-효율적인 장치를 제공하도록 기술적 및 구성 노력이 최소화된다. 전술된 방법과 함께, 본 발명에 따른 장치는 전기장에 의한 부착 세포의 효율적이고 균일한 처리를 허용하며, 여기에서 활성 전극과 부유 전극 사이의 전환은 적은 수의 스위칭 장치를 사용하여 신속하고 안정되게 달성될 수 있다.

본 발명에 따른 장치의 특히 유리한 실시 형태에서, 각각 2개의 공유 스위칭 장치를 통해 전압원에 연결되는 2개의 군의 전극이 제공되는 것이 제공된다. 이에 의해, 비교적 많은 수의 전극이 단지 4개의 스위칭 장치에 의해 제어될 수 있으며, 즉 전극의 두 군 각각은 활성 또는 비활성(부유)으로서 작동될 수 있다.

이에 의해, 각각의 군은 바람직하게는 적어도 2개의 전극, 바람직하게는 적어도 3개의 전극, 특히 바람직하게는 적어도 4개의 전극을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시 형태에서, 모두 합해서 적어도 7개, 바람직하게는 9-21개의 전극이 제공된다. 예를 들어, 본 발명에 따르면, 제1 군이 8개의 전극을 포함하고 제2 군이 9개의 전극을 포함하는 구성이 사용될 수도 있다.

본 발명에 따른 장치의 유리한 실시 형태에서, 전극이 적어도 하나의 반응 공간 내로 삽입되도록 제공되는 것, 즉 전극이 예를 들어 이것들이 해당되는 경우 위로부터 세포 배양 용기 내로 삽입되고 내부에 위치된 세포 배양 배지 내로 침지될 수 있도록 유닛으로서 배치되고 설계될 수 있는 것이 제공된다. 전극은 반응 공간의 기저부에 부착되는 세포 위에 유리한 방식으로 배치될 수 있다. 바람직하게는, 반응 공간은 복수의 샘플이 유사한 조건 하에서 본 발명에 따른 장치에 의해 처리될 수 있도록 멀티웰 플레이트의 일부이다.

스위칭 장치는 예를 들어 전력 반도체, 바람직하게는 IGBT 또는 MOSFET, 또는 전기 기계 장치, 바람직하게는 릴레이일 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기한 목적은 또한 적어도 하나의 접촉 요소가 상이한 전극 장치의 전극이 그것에 의해 각각 접촉될 수 있도록 배치되는, 적어도 2개의 전극 장치를 접촉시키기 위한 서두에 언급된 유형의 장치에 의해 달성된다. 이에 대하여, 접촉 요소/접촉 요소들의 배치는 이것이 상이한 치수를 갖는 적어도 2개의 전극 장치의 전극과 접촉할 수 있는 위치를 차지하도록 유리한 방식으로 수행된다. 따라서, 예컨대 상이한 크기를 갖는 세포 배양 플레이트, 예를 들어 "6-웰" 및 "24-웰" 플레이트 및/또는 "12-웰" 및 "48-웰" 플레이트를 위한 전극 장치가 현저히 더 적은 수의 접촉 요소에 의해 접촉될 수 있어, 장치의 부분에서 구성 노력이 감소된다. 어느 경우든, 본 발명에 따른 장치를 사용하여, 재료가 절약되고, 구성 노력이 전체적으로 최소화된다.

본 발명에 따른 장치의 특히 유리한 실시 형태에서, 접촉 요소의 적어도 일부가 상이한 전극 장치의 전극의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 특히 적어도 70%가 그것에 의해 각각 접촉될 수 있도록 배치되는 것이 제공된다. 최적의 경우에, 전극의 배열은 상이한 플레이트 치수에 대해 동일하다. 그러나, 이것이 전극 장치의 기하학적 구조로 인해 가능하지 않다 하더라도, 본 발명에 따른 장치에 의해, 상이한 전극 장치의 전극의 적어도 절반이 각각 공유 접촉 요소에 의해 접촉될 수 있다. 따라서, 장치의 부분에 필요한 접촉 요소의 수가 전체적으로 현저히 감소될 수 있다.

바람직하게는, 접촉 요소 및/또는 전극은 평면내에 배치되고, 각각의 반응 공간 및/또는 대응하는 전극 장치에 적합한 접촉 요소의 배열을 이 배열을 예컨대 180°만큼 회전시킴으로써 정확한 위치로 이동시키도록 하나의 축을 중심으로 선회가능하다.

본 발명은 또한 부착 세포에 적어도 하나의 전기장을 인가하기 위한, 특히 부착 세포의 전기 천공 및 전기 융합을 위한 본 발명에 따른 장치의 이용에 관한 것이다.

본 발명은 도면을 참조하여 추가로 예시적으로 상세히 기술된다.

본 발명에 의하면, 전기장을 사용하여 부착 세포의 효율적이고 균일한 처리를 가능하게 하는 방법 및 장치가 제공된다.

도 1은 3개의 전극을 갖춘 본 발명에 따른 예시적인 장치의 전극 장치의 개략적인 측면도를 도시한다.
도 2는 4개의 전극을 갖춘 본 발명에 따른 예시적인 장치의 대안적인 전극 장치의 개략적인 측면도를 도시한다.
도 3은 본 발명에 따른 장치를 위한 예시적인 전극 장치의 예시적인 실시 형태의 저면의 사시도를 도시한다.
도 4는 도 3에 따른 전극 장치의 다른 사시도를 도시하며, 이 예시에서 전극의 내부 부분과 접촉 요소를 볼 수 있다.
도 5는 도 3에 따른 전극 장치의 상면의 사시도를 도시한다.
도 6은 도 3 내지 도 5에 따른 전극 장치를 통한 종단면도를 도시한다.
도 7은 3개의 상이한 높은 전압 펄스에서 본 발명에 따른 전극 장치 내의 전극과 배양 영역에 부착된 세포 사이의 거리의 함수로서 트랜스펙션 효율의 바 다이어그램을 도시한다(x축: 거리[mm], y축: 트랜스펙션 효율[%], A-5 = 약한 전압 펄스, K-19 = 중간 전압 펄스, AX-19 = 높은 전압 펄스).
도 8은 500 ㎛의 거리에서의 전기장에 기초하여 용기의 기저부까지의 전극의 거리의 함수로서 상대 전기장 강도의 다이어그램을 도시한다(x축: 거리[㎛], y축: 상대 트랜스펙션 효율[%]). 여기에서, 활성 전극 사이의 상대 전기장 강도(회색 마름모꼴)와 부유(비활성) 전극 아래의 상대 전기장 강도(흑색 정사각형)가 도시된다.
도 9는 단지 활성 전극만을 갖춘(A) 그리고 활성 전극 및 부유 전극을 갖춘(B) 세포 배양 용기 내의 전기장의 시뮬레이션을 도시한다.
도 10은 형광 단백질 MAXGFP^®[론차(Lonza)]를 위한 플라스미드 코딩으로 트랜스펙션된 세포의 형광 현미경 사진을 도시한다[론차(Lonza)의 Nucleofector^®를 사용한 전기 천공]. 상부: A) 모든 전극은 전기 트랜스펙션 중 활성이었다. 중간: B) 위와 동일한 조건이지만, 전극의 단지 절반만이 트랜스펙션 중 활성이었던 반면, 나머지 절반은 부유성이었다. 하부: C) 동일한 세포가 다시 한번 제2 전기장(전압 펄스)에 노출되었지만, 활성 전극 및 비활성 전극이 제2 펄스에서 교환되었으며, 즉 제1 펄스에서 활성이었던 모든 전극은 제2 펄스에서 부유성이었던 반면, 이전에 비활성이었던 전극은 제2 펄스에서 활성이었다.
도 11은 본 발명에 따른 방법을 사용하여 형광 단백질 MAXGFP^®(론차)를 위한 플라스미드 코딩으로 트랜스펙션된 세포의 형광 현미경 사진을 도시한다(론차의 Nucleofector^®를 사용한 전기 천공). 상부: A) 두 전압 펄스 사이의 시간차는 < 0.5 s이다. 하부: B) 두 전압 펄스 사이의 시간차는 2.0 s이다.
도 12는 17개의 전극을 갖춘 전극 장치의 전기적 상호 연결의 개략도를 도시하며, 여기에서 좌측 (A)에 도시된 도면에서 활성 전극인 전극이 우측 B)에 도시된 도면에서는 부유성(비활성)이다. 투명 전극: 부유성(비활성). 대시 기호로 이루어진 전극: 활성(고전압). 흑색 전극: 활성(접지).
도 13은 4개의 스위칭을 갖춘 본 발명에 따른 예시적인 장치의 전극의 전기적 상호 연결의 개략도를 도시한다. 투명 전극: 부유성(비활성). 대시 기호로 이루어진 전극: 활성(고전압). 흑색 전극: 활성(접지).
도 14는 접점을 갖춘 전극 장치의 개략도의 평면도를 도시한다. 전극 장치는 3개의 보다 큰 반응 공간("6-웰" 크기) 및 12개의 보다 작은 반응 공간("24-웰" 크기)을 갖춘 세포 배양 플레이트를 위한 상이한 치수를 갖는다.
도 15는 접점을 갖춘 전극 장치의 개략도의 평면도를 도시한다. 전극 장치 아래의 참조 번호 1 내지 17은 각각 전극이 내부에 각각 배치되는 전극 패턴의 라인을 지칭한다. A) 적어도 하나의 보다 큰 반응 공간 및 적어도 4개의 보다 작은 반응 공간을 포함하는 세포 배양 플레이트를 위한 상이한 치수를 갖는 전극 장치에 대한 접점의 예시적인 그리고 바람직한 배열. B) 적어도 하나의 보다 큰 반응 공간 및 적어도 4개의 보다 작은 반응 공간을 포함하는 세포 배양 플레이트를 위한 상이한 치수를 갖는 전극 장치에 대한 접점의 다른 예시적인 그리고 바람직한 배열이며, 여기에서 접점 및 따라서 접촉 요소의 배열은 제조 공정에 관하여 최적화된다.
도 16은 3개의 보다 큰 반응 공간("6-웰" 크기) 및 12개의 보다 작은 반응 공간("24-웰" 크기)을 포함하는 세포 배양 플레이트를 위한 상이한 치수를 갖는 전극 장치에 대한 접점의 다른 예시적인 그리고 바람직한 배열의 개략도의 평면도를 도시하며, 여기에서 접촉 요소는 축을 중심으로 회전될 수 있다.

도 1은 용기(7)의 내부 공간(6)으로 연장되는 동일 평면상의 3개의 전극(2, 3, 4)을 포함하는 본 발명에 따른 전극 장치(1)를 도시한다. 용기(7)는 살아있는 세포가 그것 상에 부착되어 성장할 수 있는(부착 세포) 기저부 영역(8)을 포함한다. 내부 공간(6)은 보통 액체, 예컨대 세포 배양 배지 또는 세포에 맞추어진 다른 용액으로 채워진다. 전극(2, 3, 4) 사이의 공간은 전극(2, 3, 4)에 전압이 인가되는 경우 전극(2, 3, 4) 사이에 위치된 공간을 통해 어떠한 전류도 흐를 수 없도록 절연 재료(5)로 완전히 채워진다. 본 발명에 따른 장치에서, 전체 전류는 비영구적 전압원(예컨대, 커패시터)이 사용되는 경우 전압이 보다 느린 속도로 떨어지고 따라서 세포를 처리하기 위한 전기장 강도(field strength)가 시간이 흐르면서 더욱 높도록 전극(2, 3, 4)과 기저부 영역(8) 사이의 공간을 통해 흐른다. 그 결과, 한편으로는 펄스를 생성하기 위한 장치가 경제적으로 치수지어질 수 있고, 다른 한편으로는 그렇지 않을 경우 전기 분해에 기인하는 많은 양의 전하 흐름에 의해 유발될, 액체 내의 pH 값의 보다 큰 변화가 회피될 수 있다.

여기에 도시된 예시적인 실시 형태에서, 동일 평면상의 전극(2, 3, 4)은 전극(2, 3, 4)의 전기 전도성 표면이 단지 하향으로[기저부 영역(15) 또는 이것에 부착된 세포를 향해] 노출되고 분위기(environment)와 전기 접촉하도록 절연 재료(5)에 의해 서로 분리된다. 동일 평면상의 전극(2, 3, 4)의 각각의 대향 배치된 영역(9) 사이의 영역에서, 또는 전극이 평행선을 나타내는 경우, 적어도 전극 사이의 액체에 노출된 영역에서 절연 재료(5)의 완전 연장으로 인해, 전기장이 집속될 수 있거나, 또는 전류가 관심 있는 작용 반경으로 제한될 수 있다. 또한, 전극(2, 3, 4)과 기저부 영역(8) 사이의 표적 영역에 일정하고 더욱 안정된 전기장 강도 및 전류 밀도를 제공하는 동일 평면상의 전극(2, 3, 4)의 사용에 의해 표적 세포의 영역으로의 전기장의 집속 또는 작용 반경으로의 전류의 제한이 지금부터 가능한 것이 특별한 이점이다. 따라서, 적합한 절연 재료는 예를 들어 폴리비닐 클로라이드, 폴리스티롤, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 또는 폴리카보네이트와 같은 일반적인, 바람직하게는 열가소성 합성 재료로 제조되는 플레이트 또는 사출 성형 물품이다. 본 발명에 따른 장치에 의해, 전극(2, 3, 4)의 동일 평면상의 부분의 각각의 대향 영역(9)을 통한 전류 누설이 회피될 수 있어, 일정한 전류의 전압 펄스가 생성된다. 따라서, 본 발명에 따른 장치는 방전마다 필요한 전력을 제한하기 위해 낮은 에너지/전류의 하나 이상의 연속적인 펄스 방전으로, 예를 들어 처리될 세포의 배양 플로어(culture floor)의 면적에 따라 반응마다 적용될 수 있다.

예를 들어, 전극-절연체-샌드위치가 사용될 수 있으며, 여기에서 전극은 교번하여 분극된다. 이러한 장치에서, 활성 전극 아래의 영역에서 전기장은 사실상 존재하지 않으며, 따라서 활성 전극 아래의 영역에 위치된 세포에 영향을 미치지 않는다. 이들 영역은 전기 전도체(전극)에 근접하며, 따라서 상당한 전기장의 밖에 있다. 활성 영역, 즉 충분한 전기장을 갖는 영역은 단지 반대 극을 갖는 전극 사이에 위치된 영역이다. 전기장에 노출되지 않는 전극 아래의 영역을 최소화시키기 위해, 전극은 예를 들어 세포로 덮인 기저부 영역의 보다 큰 영역이 전극/절연체 조합의 활성 영역을 갖춘 전극 장치에 의해 덮이도록 최대한 얇게(예컨대, 50 ㎛) 설계될 수 있다. 그러나, 전극의 두께를 감소시키는 것은 흔히 합당하지도 않고 기술적으로 실현가능하지도 않아, 그러한 수단의 효과가 제한된다.

따라서, 본 발명에 따르면, 제1 전압 펄스 후에, 적어도 하나의 추가 전기장이 적어도 하나의 추가 전압 펄스에 의해 전극(2, 3, 4)과 기저부 영역(8) 사이의 공간에 생성된다. 본 발명에 따르면, 이 경우에 이전에 활성이었던 전극 중 적어도 하나가 부유성(floating)이어서, 추가의, 따라서 제2의 전기장이 이제는 비활성(passive)인 전극 아래의 영역 내의 세포에도 작용할 수 있다. 따라서, 도 1에 도시된 예시적인 실시 형태에서, 예를 들어 중간의 전극(3)이 제1 전압 펄스 중 활성이었으면, 즉 전압(+) 또는 접지(-)에 연결되었으면, 이 전극(3)은 제2 전압 펄스 중 부유성(비활성)일 수 있어, 제2 전압 펄스 중 활성인 전극(2, 4) 사이에 동시에 위치되는 전극(3) 아래의 영역도 충분한 전기장에 노출될 수 있다. 이 방식으로, 기저부 영역(8)이 더욱 균일하게 노출될 수 있어, 보다 많은 수의 세포가 효과적으로 전기적으로 처리될 수 있다.

도 2는 4개의 전극(11, 12, 13, 14)을 갖춘 본 발명에 따른 예시적인 장치의 대안적인 전극 장치(10)를 도시한다. 전극 장치(10)는 이것이 용기(17)의 내부 공간(16)으로 연장되는 동일 평면상의 4개의 전극(11, 12, 13, 14)을 포함하는 것을 제외하고는 실질적으로 도 1에 따른 전극 장치(1)에 상응한다. 용기(17)는 또한 살아있는 세포가 그것 상에 부착되어 성장할 수 있는(부착 세포) 기저부 영역(18)을 포함한다. 전극(11, 12, 13, 14) 사이의 공간 각각은 전극(11, 12, 13, 14)에 전압이 인가되는 경우 전극(11, 12, 13, 14) 사이에 위치된 공간을 통해 어떠한 전류도 흐를 수 없도록 전기 절연 재료(15)로 완전히 채워진다. 본 발명에 따르면, 전극(11, 12, 13, 14)은 예를 들어 제1 전압 펄스가 인가된 때 전극(11, 13)은 활성인 반면 전극(12, 14)은 부유성이도록 작동될 수 있다. 후속 전압 펄스 중, 이전에 활성이었던 전극(11, 13)은 부유성인 반면, 전극(12, 14)은 활성이다. 이러한 유리한 접근법으로 인해, 외부 전극(11, 14) 사이의 전체 영역, 특히 또한 내부 전극(12, 13) 각각의 아래의 영역이 충분한 전기장에 노출된다. 그 결과, 전체 기저부 영역(18) 및 따라서 이것에 부착된 세포가 전기적으로 균일하게 처리된다(또한 도 10 및 도 11 참조).

도 3은 본 발명에 따른 전극 장치(20)의 예시적인 실시 형태의 저면의 개략도를 도시한다. 전극 장치(20)는 이하에서 도 5 및 도 7을 참조하여 상세히 설명되는 7개의 전극(21)을 포함한다. 전극(21)은 본질적으로 실린더형으로 형성되는 캐리어(22) 내에 배치된다. 캐리어(22)는 본체(23) 및 본체(23)의 상부 단부에 있는 경계 영역(24)을 포함하며, 경계 영역(24)의 외경은 본체(23)의 외경보다 커서, 경계 영역(24)은 본체(23)의 외향으로 돌출된다. 전극(21)은 대부분 본체(23) 내에 배치되고, 캐리어(22)의 저면(25)에 있는 그 하부 면 표면(33)이 노출되어, 그것들은 분위기와 접촉한다. 단일 전극(21) 각각은 절연 재료(26)에 의해 전기적으로 서로 분리되며, 이 실시 형태에서 단일 전극 사이의 공간(26)은 절연 재료(26)로 완전히 채워진다. 전극(21)의 대향 영역 사이의 절연 재료(26)는 전극이 전기 전도성 액체 내에 침지되는 경우, 전압을 전극에 인가할 때 어떠한 전류도 전극(21) 사이의 공간을 가로질러 누설되도록 허용되지 않는 것을 보장한다. 절연 재료는 오히려 전압을 전극(21)에 인가할 때 전류가 전극(21)의 면 표면(33)을 통해 흐르고 전기장이 캐리어(22)의 저면(25) 아래에 생성되도록 한다. 전극(21) 사이의 공간을 가로질러 어떠한 현저한 전류 누설도 없기 때문에, 커패시터 또는 다른 비영구적 전압원의 방전 중 전압 강하에 시간이 보다 오래 소요되어, 시간이 흐르면서 일정하고 더욱 안정된 전류가 흐르며, 이는 대부분의 생물학적 방법, 예를 들어 트랜스펙션(transfection)에 대해 방전 시간에 걸쳐 충분히 강한 전기장을 생성한다. 전극 장치(20)는 특히 적어도 부분적으로 액체로 채워진 용기, 예를 들어 반응조, 세포 배양 트레이 또는 멀티웰-플레이트(multiwell-plate)의 "웰(well)" 내로 삽입되도록 제공되며, 상기 용기는 살아있는 세포가 그것 상에 부착되도록 허용되는 기저부 영역을 제공한다.

용기의 기저부 영역 상의 부착 세포는 보통 적합한 액체, 예를 들어 세포 배양 배지 또는 원하는 전기적 처리에 맞추어진 용액으로 덮이며, 전극 장치(20)는 용기 내로의 삽입 중 상기 액체의 적어도 일부분을 배출시킨다. 따라서, 면 표면(33)을 갖춘 전극(21)은 용기의 기저부 영역 상에, 따라서 세포 상에 직접 놓이지 않으며, 캐리어(22)의 저면(25)은 전극(21)과 용기의 기저부 영역 사이의 충분한 거리를 보장하는 4개의 스페이서(27)를 제공한다. 이 거리를 실험적으로 결정된 값으로 조절함으로써, 본 발명에 따른 방법의 효율이 최적화될 수 있다(도 7 및 도 8 참조).

도 4는 도 3에 따른 전극 장치(20)의 사시도를 도시하며, 이 도면에는 전극(21)의 내부 부분이 가시적으로 도시된다. 이 도면으로부터 전극(21)이 특히 플레이트형으로 형성되고, 전극 플레이트의 두께가 캐리어(22)의 저면(25)을 향해 감소하는 것이 명백하다. 따라서, 용기 내의 액체와 접촉하는 전극(21)의 노출된 면 표면(33)은 본체(23) 내에 배치된 전극(21)의 부분과 같이 본질적으로 보다 얇다. 이의 이점은 너무 약한 전기장으로 인해 세포의 효과적인 전기적 처리가 가능하지 않은 각각의 전극(21) 아래의 영역이 최소화되는 것이다. 반면에, 대향 단부에서, 전극(21)은 이것들이 충분한 전기 접촉을 확립하기 위해 여기에서 효율적으로 접촉되어야 하기 때문에 증가된 두께를 보여야 한다. 사용된 전압원 각각의 전기 접촉은 본 실시 형태의 경우 전극(21)의 두꺼워진 영역(29) 내로 삽입되는 핀형 접촉 요소(28)에 의해 확립된다. 접촉 요소(28)는 각각 영역(29)에 대향되는 그 단부에서 적합한 접촉 장치에 의해 전압원과 전기적으로 연결된다. 전압원은 예를 들어 전압 펄스의 제어식 방출을 허용하는 하나 이상의 커패시터일 수도 있다. 생성된 전압 펄스는 접촉 요소(28)를 가로질러 전극(21)으로 전달되며, 따라서 전극(21)의 저면에, 즉 캐리어(22)의 저면(25) 아래에 전기장이 확립되며, 이는 전극 사이의 절연 재료(26)로 인해 세포와 전극(21)의 세포 지향측 사이의 공간으로 제한되거나 그것에 집속된다.

본 발명에 따른 전극 장치(20)는 바람직하게는 사출 성형 공정에 의해 제조된다. 이에 의해, 우선 접촉 요소(28)가 적합한 사출 성형 공구 내로 삽입된 다음에 전기 절연 중합체로 봉지된다. 제2 단계에서, 전극(21)을 형성하는 전기 전도성 중합체가 사출된다. 대안적으로, 전극은 금속, 바람직하게는 알루미늄으로 제조될 수 있다. 이 실시 형태에서는, 우선 금속 전극이 사출 성형 공구 내로 삽입된 다음에 전기 절연 중합체로 봉지된다. 이 실시 형태에서, 금속 전극은 바람직하게는 전극을 전기적으로 접촉시키기에 적합한 상향으로 돌출되는 부속물을 제공한다.

도 5는 도 3과 관련된 본 발명에 따른 전극 장치(20)의 상면(30)의 사시도를 도시한다. 접촉 요소(28)가 본체(23)로부터 상향으로 돌출되는 것이 명백하다. 따라서, 접촉 요소(28)는 노출된 단부(31)를 제외하고는 본체의 전기 절연 재료로 완전히 둘러싸인다. 이들 노출된 단부(31)를 사용하여, 접촉 요소(28)는 적합한 장치에 의해 전압원에 전기적으로 접촉될 수 있다.

도 6은 도 3 내지 도 5와 관련된 전극 장치(20)를 가로지른 종단면도를 도시한다. 이 도면으로부터, 전극(21)의 직경이 본체(23)의 저면(25)을 향해 테이퍼져서, 불충분한 전기장이 확립되는 전극(21) 아래의 영역이 최소화되는 것이 명백하다. 전극(21)의 대향 단부에 증가된 두께를 갖는 영역(29)이 있으며, 여기에서 접촉 요소(28)는 각각 삽입되거나 주입된다. 이러한 특정한 유리한 실시 형태는 전극 요소(28)와 전극(21) 사이의 충분한 전기 접촉을 보장하며, 따라서 전압원으로부터 전극(21)까지 전압 펄스의 효과적인 전달이 보장된다. 그 기저부 영역 상에 살아있는 세포가 부착되는, 액체로 채워진 용기 내로 전극 장치(20)가 삽입되면, 스페이서(27)는 전극(21)의 저면과 처리될 세포 사이의 최적 거리가 설정되는 것을 보장한다. 전극(21)의 각각의 대향 배치된 영역(32) 사이의 공간이 완전히 절연 재료(26)로 채워지기 때문에, 액체가 전극(21)의 영역(32) 사이로 유입되지 않아, 전류가 전극(21)의 영역(32) 사이의 영역을 통해 누설되도록 허용되지 않는다. 이 방식으로, 전극(21)에 대한 전압의 인가를 통해, 전기장이 전극의 세포 지향측에 집중되고, 세포와 전극(21) 사이의 공간으로 제한되거나 그것에 집속된다. 이 방식으로, 세포는 매우 효과적으로 그리고 비교적 낮은 전력 수요를 갖고서 처리될 수 있다. 본 발명의 다른 이점은 전극(21) 사이의 중간 공간이 없기 때문에, 전극 장치(20)가 용기 내로의 삽입 중 액체의 일부분을 배출시키는 것이다. 이러한 이유로 인해, 용기는 단지 소량의 액체로 채워져야 하며, 이에 의해 처리에 필요한 용액 및 물질이 절약될 수 있어, 비용이 절감될 수 있다.

도 7은 각각 전압 펄스의 크기가 변화함에 따라 처리될 세포 사이의 전극의 거리에 대한 트랜스펙션 효율의 의존성을 도시한다. 본 명세서에서 트랜스펙션은 전압 펄스에 의한 살아있는 세포 내로의 핵산 분자(여기에서 DNA)의 도입을 의미한다. 비교적 높은 전압(AX-19)에서는 전극과 세포 사이의 거리에 대한 트랜스펙션 효율의 단지 좋지 못한 의존성이 있는 반면, 낮은 전압(A-5)에서는 전극과 세포 사이의 거리가 감소함에 따라 트랜스펙션 효율이 증가하는 것을 볼 수 있다. 반면에, 중간 전압 펄스(K-19)는 중간 크기의 거리에서 최적 결과를 보인다. 그것은 전극과 세포 사이의 거리가 전압 펄스의 강도에 따라 트랜스펙션 효율에 대체로 큰 영향을 미치는 것을 실증한다. 따라서, 트랜스펙션 효율을 최적화시키기 위해서, 거리는 예컨대 도 3 내지 도 6에 따른 전극 장치(20)의 스페이서(27)를 각각 크기지음으로써 본 발명에 따른 실험적으로 결정된 값으로 조절된다.

도 8은 용기의 기저부까지의 전극의 거리의 함수로서 전극과 용기의 기저부 사이의 영역 내의 상대 전기장 강도를 도시한다. 이에 대하여, 전기장 강도는 각각 500 ㎛의 거리에서의 전기장 강도에 기초하며, 즉 이 거리에 대해 양쪽 그래프의 전기장 강도는 100%로 설정되었다. 활성 전극 사이의 전기장 강도 및 비활성 전극(passive electrode) 아래의 전기장 강도는 반대로 작용하며, 즉 활성 전극 사이의 전기장 강도는 거리가 감소하면 증가하는 반면, 비활성 전극 아래의 전기장 강도는 거의 0에 도달한다. 활성 전극 사이의 전기장 강도는 거리가 증가하면 감소하는 반면, 수동 전극 아래의 전기장 강도는 더욱 증가한다. 일반적으로, 활성 전극 사이의 전기장 강도는 거리가 증가하면 감소하는 반면, 부유 전극 아래의 전기장 강도는 중간 거리에서 최대값에 도달하며, 따라서 거리가 감소하거나 증가하면 이 최대값에 기초하여 감소한다. 따라서, 본 발명에 따르면, 세포까지의 전극의 거리는 부유 전극 아래의 전기장 강도가 최대값에 근접하고 또한 활성 전극 사이에서 최대한 높은 값에 도달하도록 공정의 조건의 함수로서 조절된다.

도 9는 전용 활성 전극(상부)과 활성 및 부유 전극(하부)에서 세포 배양 용기 내의 전기장의 시뮬레이션을 도시한다. 전기장의 생성을 위한 일반적인 방법 및 장치는 활성 전극 아래에서 직교하는 전기장이 최소이어서 이 영역에서의 세포의 전기적 처리가 불충분한 단점을 갖지만, 본 발명에 따른 방법에 부유(수동) 전극을 포함함으로써, 세포의 더욱 균일한, 따라서 더욱 효율적인 처리가 허용되는 것이 명백해진다. 여기에 도시된 예시적인 전극 장치(40)는 전극(41, 42, 43, 44)과 세포 배양 용기의 기저부 영역(46) 사이의 공간(45) 내에 전압을 인가함으로써 전기장을 생성하는 4개의 전극(41, 42, 43, 44)을 포함한다. 이 도면에서 전기장의 강도는 전기력선(field line)의 밀도에 의해 모사된다. 이에 대하여, 보다 어두운 영역은 보다 높은 전기장 강도를 나타내고, 보다 밝은 영역은 보다 낮은 전기장 강도를 나타낸다. 예시 A)에서, 모든 전극(41, 42, 43, 44)은 활성이다. 이 경우에, 전기장 강도는 단지 전극(41, 42, 43, 44) 사이와 그 노출된 단부에서(어두운 영역) 높다. 반면에, 전극(41, 42, 43, 44) 아래의 영역에서 공간(45) 내의 전기장 강도는 낮으며, 따라서 기저부 영역(46) 상의 처리될 세포는 단지 불규칙하게 충분한 전기장에 노출된다. 따라서, 본 발명에 따르면, 예시 B에 도시된 바와 같이, 이 실시 형태에서, 우선 전압이 단지 두 전극(41, 43)에만 인가되는 반면, 다른 두 전극(42, 44)은 부유성(비활성)이다. 이는 비활성 전극(42, 44) 아래의 영역에서, 보다 강한, 비활성 전극(42, 44)으로 인해 단지 근소하게 약화된 전기장이 기저부 영역(46) 상에 부착된 세포에 영향을 미치는 결과를 산출한다. 이제 전압 펄스가 이전의 비활성 전극(42, 44)에 인가되고, 이전의 활성 전극(41, 43)이 부유성이면, 보다 강한 전기장이 전극(41, 43) 아래의 영역에도 생성된다. 따라서, 기저부 영역(46) 상에 부착된 세포가 본 발명에 따른 방법에 의해 충분한 전기장으로 균일하게 처리되도록 허용된다.

도 10은 종래 기술에 따라 트랜스펙션된(A) 그리고 본 발명에 따른 방법에 의해 트랜스펙션된(B 및 C) 형광 마킹된 세포의 현미경 이미지를 도시한다. 예시 A)에 도시된 세포의 전기 트랜스펙션에서, 모든 전극은 활성이었으며, 이는 모든 전극이 높은 전압 또는 접지와 연결되었음을 의미한다. 플라스미드로 성공적으로 트랜스펙션된 세포는 형광을 발하며, 따라서 명확하게 식별된다. 예시 A는 활성 전극 아래의 영역에 대응하는, 트랜스펙션된 세포의 론(lawn) 내에서 갭["섀도우(shadow)"]을 보인다. 이 영역에서, 전기장은 세포를 성공적으로 트랜스펙션하기에 충분히 강하지 않았다. 예시 B)에 도시된 세포의 전기 트랜스펙션에서, 단지 전극의 절반만이 활성이었던 반면, 다른 절반은 부유성이었다. 예시 A)에 따른 트랜스펙션과 비교하면, 이 경우에 모두 합하여 보다 적은 세포가 성공적으로 트랜스펙션되었지만, 보다 적은 갭이 또한 존재하거나, 또는 매우 낮은 트랜스펙션 효율의 영역 사이의 거리가 더욱 크다. 여기에서 트랜스펙션 효율은 초기에 활성 전극 사이의 증가된 거리로 인해 전체 배양 영역을 가로지른 총 전기장이 보다 약하기 때문에 감소된다. 본 발명의 방법에 따르면, 동일한 세포가 이어서 다시 한번 제2 전기장(전압 펄스)에 노출되었고, 이에 의해 상기 제2 펄스 중 활성 및 비활성 전극이 역전되었으며, 이는 제1 펄스 중의 모든 활성 전극이 제2 펄스 중 부유성이었던 반면, 이전의 비활성 전극은 제2 펄스 중 활성이었음을 의미한다. 이제, 더 이상의 갭이 검출가능하지 않으며, 이는 전극 아래의 영역을 비롯한 모든 영역이 높은 트랜스펙션 비율을 보임을 의미한다(예시 C). 따라서, 본 발명에 따른 방법은 전체 배양 영역에 걸쳐 세포의 매우 균일하고 균질한 처리를 허용한다. 특히, 예시 A)(종래 기술) 및 C)(본 발명에 따른 방법)의 비교는 일반적인 방법에 비한 본 발명에 따른 방법의 현저한 이점을 보여준다.

도 11은 두 전압 펄스 사이의 거리가 변화된, 본 발명에 따른 방법에 의해 트랜스펙션된 형광 세포의 현미경 이미지를 도시한다. 매우 작은 거리(A: < 0.5초)에서는, 트랜스펙션 효율의 원하지 않는 악화가 일어난다. 이러한 영향은 전압 펄스 사이의 거리의 증가로 상쇄된다(B: 2.0초). 전체 공정을 불필요하게 연장시키지 않기 위해서, 거리가 최적화되어야 하며, 이는 공정 조건 또는 전기적 파라미터, 샘플 체적, 완충 용액 또는 배양 배지, 온도 및/또는 세포 유형에 맞추어져야 함을 의미한다. 바람직하게는, 두 전압 펄스 사이의 시간 지연이 제1 다수의 샘플을 차례로 제1 전압 펄스에 노출시킨 다음에 이들 샘플을 차례로 제2 전압 펄스에 노출시키기 위해 사용된다. 전압 펄스의 이들 특히 유리한 시간-인터리빙(time-interleaving)으로 인해, 다수의 샘플의 처리의 경우 공정 지속 시간이 최소화되도록 허용된다.

본 발명에 따른 방법을 수행하기 위해, 전극은 도 12에 도시된 바와 같이 개별적으로 또는 도 13에 도시된 바와 같이 군을 이루어 작동되어야 한다. 이는 바람직하게는 개방된 또는 폐쇄된 상태에 있을 수 있는 스위칭 장치, 예를 들어 IGBT, MOSFET 또는 릴레이에 의해 수행된다. 개방된 상태에서, 스위칭 장치는 전류를 공급하지 않으며, 따라서 연결된 전극은 전기적으로 절연되어 부유성이다. 폐쇄된 상태에서, 스위칭 장치는 전류를 공급하며, 따라서 전류는 연결된 전극을 통과하도록 허용된다. 전극은 전위(양전위 또는 음전위)를 갖고, 양극 또는 음극으로서의 역할을 한다. 그것들은 활성 전극으로서 나타내어진다.

도 12는 17개의 전극(48, 49, 56, 57)을 갖춘 본 발명의 방법을 수행하기 위한 스위칭 장치(47)를 도시한다. 동일 평면상에 배치된 전극(48, 49, 56, 57) 각각은 스위칭 장치(50, 51, 54, 55)를 통해 전압원(52) 또는 접지(53)와 연결된다. 예시 A)는 제1 전기장의 형성 중 스위칭 장치(47)의 상태를 도시한다. 개방된 스위칭 장치(50)와 연결되는 전극(48, 49)의 부분은 이 경우에 제1 부유 전극(49)이다. 폐쇄된 스위칭 장치(51)와 연결되는 전극(48, 49)의 부분은 최종적으로 세포의 처리를 위한 제1 전기장을 생성하는 활성 전극(48)이다. 활성 전극(48) 아래에서 직교하는 전기장은 최소이며, 따라서 세포는 이 영역에서 충분히 처리되지 않는다. 예시 B)는 제2 전기장의 형성 중 스위칭 장치(47)의 상태를 도시한다. 제1 전기장의 형성 중 개방되었던 스위칭 장치(47)는 이 경우에 폐쇄되는 반면, 제1 전기장의 형성 중 폐쇄되었던 스위칭 장치(55)는 이제 개방된다. 결과는 제1 전기장 중 부유성이었던 전극(45)이 제2 전기장의 형성 중, 제2 전기장을 생성하는 활성 전극이라는 것이다. 제1 전기장의 형성 중 활성이었던 전극(57)은 제2 전기장의 형성 중 부유성이다. 제1 전기장의 형성 중 모든 활성 전극(56)이 두 부유 전극(57) 사이에 배치되기 때문에, 활성 전극(56) 아래의 영역은 활성 전극(56)에 의해 생성되는 제2 전기장에 노출된다. 따라서, 제2 전기장에 의해, 제1 전기장 중 충분히 처리되지 않았던 세포가 또한 전기적으로 처리되며, 따라서 모두 합해서 모든 세포가 균일하게 처리된다.

도 13은 4개의 스위칭 장치(59, 60, 61, 62)를 갖춘 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 본 발명에 따른 예시적인 장치(58)를 도시한다. 스위칭 장치(59, 60)는 전압원과 연결되는 반면, 스위칭 장치(61, 62)는 접지에 연결된다. 장치(58)의 전극[활성 전극(63): 대시 기호로 이루어지거나 흑색, 부유 전극(64): 투명]은 2개의 군으로 분할되며, 하나의 군은 스위칭 장치(59, 61)에 전기적으로 연결되고, 다른 하나의 군은 스위칭 장치(60, 62)와 연결된다. 따라서, 여기에 도시된 실시 형태에서, 17개의 전극(63, 64)이 단지 4개의 스위칭 장치(59, 60, 61, 62)를 통해 전압원과 연결된다. 여기에 도시된 상태에서, 활성 전극(63)(제1 군)은 폐쇄된 스위칭 장치(59, 61)를 통해 전압원 또는 접지와 연결되며, 따라서 전압을 활성 전극(63)에 인가하는 경우에, 활성 전극 사이의 제1 전기장이 형성된다. 스위칭 장치(60, 62)가 개방되어 있기 때문에, 이에 연결된 전극(64)(제2 군)은 이 상태에서 부유성 또는 비활성으로 유지된다. 기술된 상태에서 단지 최소의 전기장에 노출되었던, 활성 전극(63) 아래의 영역에서 세포에 충분한 처리를 제공하기 위해서, 제2 전기장의 형성을 위해 본 발명에 따라 스위칭 장치(59, 61)가 개방되고 스위칭 장치(60, 62)가 폐쇄된다. 이러한 간단한 스위칭으로 인해, 기술된 상태에서 활성 전극(63)이었던 제1 군의 전극이 부유 전극이 되는 반면, 기술된 상태에서 부유 전극(64)이었던 제2 군의 전극이 활성화되고 제2 전기장을 생성한다. 이러한 제2 전기장은 제1 군의 전극(63) 아래의 영역에도 충분한 처리가 적용되는 것을 보장하며, 따라서 전체적으로 세포의 균일하고 효율적인 처리가 보장된다. 본 발명에 따른 장치(58)는 이것이 4개의 스위칭 장치로 기능하고 스위칭 장치의 스위칭으로 인해 양쪽 군의 전극 사이에서 신속히 스위칭할 수 있는 이점을 수반한다. 전극의 각각의 군은 활성 또는 비활성으로 스위칭될 수 있으며, 이에 의해 하나의 군의 모든 전극은 동시에 동일하게 스위칭된다(활성 또는 부유성). 전극(63, 64)의 이러한 배열로 인해, 본 발명에 따른 장치(58)는 예를 들어 도 12의 스위칭 장치(47)와 비교시, 현저히 더 적은 양의 스위칭 장치를 구비하며, 이는 필요한 장비 및 장치(58)의 민감성을 감소시킨다.

도 14는 3개의 보다 큰 배양 웰["6-웰" 크기 전극 장치(65)] 및 12개의 보다 작은 배양 웰["24-웰" 크기 전극 장치(66)]을 갖춘 세포 배양 플레이트를 위한 상이한 치수를 갖는 전극 장치(65, 66)의 개략도를 도시한다. 재료를 절약하고 구성 노력을 감소시키기 위해서, 본 발명에 따르면, 상이한 크기로 전극 장치를 위한 조인트 접점이 선택된다. 이에 의해, 유리하게는 전극의 전기 접촉을 위한 장치에 관하여 필요한 접촉 요소를 현저히 감소시키는 것이 허용된다. 세포 배양 플레이트의 도시된 수용 영역(67)은 3개의 보다 큰 배양 웰의 섹션 및 12개의 보다 작은 배양 웰을 위한 섹션을 구비한다. 보다 큰 배양 웰은 내부에 배치된 세포의 전기적 처리를 위해 각각 17개의 전극(68)을 포함하는, 예를 들어 침지 전극의 형태인 적절한 크기의 전극 장치(65)를 구비한다. 보다 작은 배양 웰은 내부에 배치된 세포의 전기적 처리를 위해 각각 7개의 전극(69)을 포함하는, 예를 들어 침지 전극을 갖춘 적절한 크기의 전극 장치(66)를 구비한다. 전극 장치는 예를 들어 세포 배양 플레이트의 커버 내에 통합되거나 대응하는 접촉 장치의 캐리어 유닛에 고정될 수 있다. 이러한 접촉 장치는 전극의 접점에 대응하게, 아래에서 설명되는 바와 같이, 수용 영역의 각각의 섹션 내에 배치되는 접촉 요소를 또한 포함한다. 각각의 전극(68, 69)에 접점(70)이 각각 할당되고, 이러한 접점에 각각의 전극(68, 69)이 접촉 요소에 의해 접촉되도록 허용되며, 따라서 전압원, 예를 들어 커패시터에 대한 전기적 접촉이 확립될 수 있다. 따라서, 이러한 "혼합식(mixed)" 세포 배양 플레이트(67)를 접촉시키기 위한 장치는 3 x 17 + 12 x 7 = 135개의 접촉 요소를 필요로 한다. 2가지 상이한 포맷의 세포 배양 플레이트, 예를 들어 "6-웰" 크기(각각 17개의 전극을 갖춘 전극 장치를 위한 6개의 배양 공간) 및 "24-웰" 크기(각각 7개의 전극을 갖춘 24개의 배양 공간)의 접촉을 위한 장치는 심지어 6 x 17 + 24 x 7 = 270개의 접촉 요소를 필요로 할 것이다.

예컨대 스프링 적용식 접촉 요소에 의해 충분한 전기 접촉의 형성을 위해서, 제조 공차를 또한 보상하는 소정 접촉 압력이 필요하기 때문에, 접점 또는 대응하는 접촉 요소의 양이 최대한 적어야 한다. 따라서, 표준 스프링의 접촉 압력은 대략 0.4 N이며, 이는 270개 접촉 요소의 경우에 대략 108 N(대략 10 Kg)의 기계적 힘을 유발할 수 있다. 따라서, 기술적인 그리고 장치 관련 노력을 감소시키기 위해 접촉 요소의 양을 최소화시키는 것이 바람직하다.

도 15는 적어도 하나의 보다 큰 반응 웰[전극 장치(74)] 및 적어도 4개의 보다 작은 반응 웰[전극 장치(75)]을 갖춘 세포 배양 플레이트를 위한 상이한 치수를 갖는 전극 장치(74, 75)에 대한 접점(71, 72, 73)의 예시적인 그리고 바람직한 배열을 도시한다. 대부분의 접점(71, 72, 73)은 본 발명에 따라 배치될 수 있으며, 그것들은 다양한 포맷에 대해 동일하여, 보다 큰 전극 장치(74)의 전극 및 보다 작은 전극 장치(75)의 전극 둘 모두를 위한 접점의 역할을 할 수 있다. 여기에 예시적으로 제시된 포맷에서는, 단지 보다 큰 전극 장치(74)의 중간 전극(그리드 번호 8-10) 및 외부 전극(그리드 번호 1 및 17)만이 각각 위치를 가지며, 이는 보다 작은 전극 장치(75)의 전극의 대응하는 위치와 일치시키는 것이 가능하지 않다. 나머지 접점(그리드 번호 2-7 및 11-16) 각각은 양쪽 포맷의 전극 장치의 대응하는 전극을 위한 접점으로서 사용되도록 허용된다(예시 A). 보다 작은 전극 장치(75)의 인식되지 않은 전극 각각에 대해, 자체의 접점이 할당되어야 한다. 또한 제조 공정에 관하여 최적화된 본 발명에 따른 접점(72, 73)의 배열이 예시 B)에 도시된다. 17개의 흑색 접점(72)은 보다 큰 전극 장치(74)(예컨대, "6-웰 크기")의 모든 전극 및 보다 작은 전극 장치(75)(예컨대, "24-웰 크기")의 일부 전극이 접촉되도록 허용되는 점을 나타낸다. 16개의 해칭된 접점(73)은 전적으로 보다 작은 전극 장치(75)의 나머지 전극이 접촉되도록 허용되는 점을 나타낸다. 총합하여, 접촉 요소의 대응하는 배열을 갖는 양쪽 포맷을 접촉시키기에 적절한 장치는 세포 배양 플레이트의 수용 영역 내에 6 x (17 + 16) = 198개의 접촉 요소를 구비한다. 이는 도 14(270개의 접촉 요소)에 도시된 실시예와 비교할 때, 현저히 감소된 양의 접촉 요소이며, 이는 장치 관련 노력을 상당히 감소시킨다.

도 16은 3개의 보다 큰 반응 공간("6-웰" 크기) 및 12개의 보다 작은 반응 공간("24-웰" 크기)을 갖춘 세포 배양 플레이트를 위한 상이한 치수를 갖는 전극 장치에 대한 접점의 다른 예시적인 그리고 바람직한 배열을 도시한다. 이 특히 유리한 실시 형태에서, 전극 및/또는 접점을 접촉시키기 위한 대응하는 접촉 요소는 축, 바람직하게는 세포 배양 플레이트의 평면에 수직하게 배치되는 축을 중심으로 선회가능하다. 이에 의해, 장치의 부분에 필요한 접촉 요소의 수가 유리한 방식으로 3 x (17 + 16) = 99개의 접촉 요소로 더욱 감소될 수 있다. 또한, 이 실시 형태는 다른 치수, 예를 들어 "12-웰 및 48-웰" 크기를 갖는 세포 배양 플레이트의 추가적인 처리를 허용한다. 여기에 도시된 실시 형태에서, 예를 들어 전극 장치(77, 78)를 접촉시키기 위한 장치의 일부일 수 있는, 세포 배양 플레이트를 위한 수용 영역(76)이 제공된다. 이 장치는 전극 장치(77, 78)의 전극과 전기 접촉을 형성할 수 있는, 여기에 도시되지 않은 접촉 요소를 구비한다. 수용 영역(76)은 접촉 요소가 전극 장치(77, 78)의 접점(81, 82)에 대응하는 배열로 각각 그것 내에 제공되는 두 섹션(79, 80)을 포함한다. 흑색 접점(81)은 보다 큰 전극 장치(77)("6-웰 크기")의 모든 전극과 보다 작은 전극 장치(78)("24-웰 크기")의 일부 전극이 접촉될 수 있는 위치를 나타낸다. 대시 기호로 이루어진 접점(82)은 단지 보다 작은 전극 장치(78)의 나머지 전극만이 접촉될 수 있는 위치를 나타낸다. 수용 영역(76)의 제1 섹션(79)은 전극 장치(77, 78) 및 따라서 상응하게 치수지어지는 세포 배양 공간("웰")을 위해 제공되며, 이 실시 형태에서 보다 큰 전극 장치(77)("6-웰" 크기) 및 보다 작은 전극 장치(78)("24-웰" 크기)가 전기적으로 접촉될 수 있다. 결과적으로, 6개 또는 24개의 배양 공간을 갖춘 세포 배양 플레이트 또는 3개의 보다 큰 배양 공간 및 12개의 보다 작은 배양 공간을 갖춘 혼합식 플레이트가 수용 영역(76) 내에 배치되면, 우선 각각의 전극 장치의 절반이 제1 섹션(79)에서 전기적으로 접촉될 수 있다. 배양 공간에서 세포의 처리 후, 플레이트는 배양 공간의 나머지 절반이 제1 섹션(79) 내에 배치되고 전기적으로 접촉될 수 있도록 180°만큼 수평으로 회전된다. 대안적으로, 접촉 요소를 포함하는 유닛이 플레이트의 각각의 나머지 절반을 처리하기 위해 플레이트 대신에 회전될 수 있다. 수용 영역(76)의 제2 섹션(80)은 자유로운 미사용 상태로 남겨지거나, 다른 치수를 갖는 전극 장치 및 따라서 상응하게 치수지어지는 세포 배양 공간("웰"), 예를 들어 "12-웰" 크기의 보다 큰 전극 장치 및 "48-웰" 크기의 보다 작은 전극 장치를 위해 제공된다. 따라서, 적어도 2개의 전극 장치를 접촉시키기 위한 본 발명에 따른 장치에 의해, 적어도 2가지, 바람직하게는 4가지 상이한 플레이트 크기가 유리한 방식으로 전기적으로 접촉될 수 있다.

1: 전극 장치 2: 전극
3: 전극 4: 전극
5: 절연 재료 6: 내부 공간
7: 용기 8: 기저부 영역
9: 영역 10: 전극 장치
11: 전극 12: 전극
13: 전극 14: 전극
15: 절연 재료 16: 내부 공간
17: 용기 18: 기저부 영역
20: 전극 장치 21: 전극
22: 캐리어 23: 본체
24: 경계 영역 25: 저면
26: 절연 재료 27: 스페이서
28: 접촉 요소 29: 영역
30: 상면 31: 단부
32: 영역 33: 면 표면
40: 전극 장치 41: 전극
42: 전극 43: 전극
44: 전극 45: 공간
46: 기저부 영역 47: 전극 장치
48: 활성 전극 49: 부유 전극
50: 개방된 스위칭 장치 51: 폐쇄된 스위칭 장치
52: 고전압 53: 접지
54: 폐쇄된 스위칭 장치 55: 개방된 스위칭 장치
56: 활성 전극 57: 부유 전극
58: 장치 59: 스위칭 장치
60: 스위칭 장치 61: 스위칭 장치
62: 스위칭 장치 63: 활성 전극
64: 부유 전극 65: 전극 장치
66: 전극 장치 67: 수용 영역
68: 전극 69: 전극
70: 접점 71: 접점
72: 접점 73: 접점
74: 전극 장치 75: 전극 장치
76: 수용 영역 77: 전극 장치
78: 전극 장치 79: 섹션
80: 섹션 81: 접점
82: 접점

Claims (15)

1. 부착 세포에 적어도 하나의 전기장을 인가하기 위한 방법으로서,
   전기장은 적어도 2개의 전극에 전압을 인가함으로써 생성되고, 적어도 3개의 전극이 제공되는 방법에 있어서, 상기 방법은:
   (a) 제1 전기장을 생성하기 위해 전압이 적어도 2개의 전극에 인가되도록 상기 적어도 3개의 전극 중에서 적어도 2개의 전극을 활성화하는 단계,
   (b) 제2 전기장을 위한 전압이 인가될 때 단계 (a)에서 활성화된 전극들 중에서 적어도 하나가 부유성인 동안에, 적어도 제2 전기장을 생성하는 단계, 및
   (c) 제3 또는 그 이상의 전기장을 위한 전압이 인가되었을 때 단계 (a)에서 활성화되었던 모든 전극들이 적어도 한번 부유성이 될 때까지 제3 또는 그 이상의 전기장을 생성하는 단계
   를 포함하는 것을 특징으로 하는, 부착 세포에 적어도 하나의 전기장을 인가하기 위한 방법.
2. 제1항에 있어서,
   각각의 전기장이 각각 적어도 하나의 전압 펄스에 의해 생성되거나 적어도 2개의 전기장이 각각 적어도 하나의 전압 펄스에 의해 생성되거나 둘 중 적어도 하나이며, 전압 펄스 사이의 시간차는 적어도 500 ms인 것을 특징으로 하는, 부착 세포에 적어도 하나의 전기장을 인가하기 위한 방법.
3. 제1항에 있어서,
   내부에서 전기장이 각각 부착 세포에 인가되는 수개의 반응 공간이 제공되고, 하나의 반응 공간 내에 2개의 전기장을 생성하기 위한 두 전압 펄스 사이의 시간차는 적어도 하나의 다른 반응 공간 내에 적어도 하나의 전기장을 생성하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는, 부착 세포에 적어도 하나의 전기장을 인가하기 위한 방법.
4. 제1항에 있어서,
   전극과 부착 세포는 서로 분리되고, 세포와 전극 사이의 거리는 미리 결정된 값으로 조절되는 것을 특징으로 하는, 부착 세포에 적어도 하나의 전기장을 인가하기 위한 방법.
5. 제1항에 따른 방법을 달성하기 위한 장치(58)로서,
   적어도 하나의 스위칭 장치(59, 60, 61, 62)를 통해 적어도 하나의 전압원에 연결되는 적어도 3개의 전극(63, 64)을 포함하는 장치(58)에 있어서,
   적어도 5개의 전극(63, 64)이 4개의 스위칭 장치(59, 60, 61, 62)를 통해 적어도 하나의 전압원에 연결되고, 적어도 2개의 전극(63, 64)이 상기 적어도 2개의 전극에 의해 공유되는 스위칭 장치(59, 60, 61, 62)를 통해 전압원에 연결되는 것을 특징으로 하는 장치.
6. 제5항에 있어서,
   각각 2개의 공유 스위칭 장치(59, 60, 61, 62)를 통해 전압원에 연결되는, 2개의 군의 전극(63, 64)이 제공되는 것을 특징으로 하는 장치.
7. 제6항에 있어서,
   각각의 군은 적어도 2개의 전극(63, 64)을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
8. 제5항에 있어서,
   총 적어도 7개의 전극(63, 64)이 제공되는 것을 특징으로 하는 장치.
9. 제5항에 있어서,
   전극(63, 64)은 적어도 하나의 반응 공간 내로 삽입되도록 제공되는 것을 특징으로 하는 장치.
10. 제9항에 있어서,
    반응 공간은 멀티웰 플레이트의 일부인 것을 특징으로 하는 장치.
11. 제5항에 따른 장치를 이용하여, 부착 세포에 적어도 하나의 전기장을 인가하는 방법.
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