KR20130002534A - 헬리코박터 파이로리의 생육을 저해하는 타락 유래 젖산균 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 헬리코박터 파이로리를 억제하는 젖산균에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 타락으로부터 분리되며, 헬리코박터 파이로리의 생육을 저해하는 새로운 젖산균에 관한 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 젖산균은 헬리코박터 파이로리로 인한 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방 및 치료에도 효과적이라 기대된다.

Description

헬리코박터 파이로리의 생육을 저해하는 타락 유래 젖산균{LACTIC ACID BACTERIA GROUP HINDERING GROWTH OF HELICOBACTOR PYLOLI}
본 발명은 헬리코박터 파이로리의 생육을 저해하는 타락 유래 젖산균에 관한 것이다.
헬리코박터 파이로리(Helicibacter pylori)는 만성 위십이지장 질병과 밀접한 관련이 있으며, 위점막 상피세포간 접합부에서 서식하여 만성위염, 위궤양, 소화성궤양, 위암 등의 원인균으로 알려져 있다[Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP, chang Y, Vogelman JH, Drentreich N, Sibley RK. 1991. Helicibacter pyroli infection and the risk of gastric carcinoma. N Engl J Med 325:1127-1131.; 조명제, 이광호. 1996 Helicibacter pyroli 감염에 의한 위암의 원인론. Medical Postgraduates. 3(24):16-157.; Cover. T. L. and M. J. Blaser.1995. Helicibacter pyroli: Abacterial cause of gastritis, pepticulcer disease, and gastric cancer. ASMMews 61:21-26.; Lee, A., J. Fox, and S. Hazell. 1993. Pathogenicity of Helicibacter pyroli: Apersprctive. Infect. Immun. 61:1601-1610.; Marshall, B.J. 1994. Helicibacter pyroli . Am . J. Gastroenterol . 89:S116-S128.; World Health Organisation. 1994. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Human. 61: 177-240.]. 헬리코박터 파이로리의 특징적 성상은 위벽 상피세포의 군락을 형성하고, 강한 우레아제(urease) 활성을 이용하여 위점막의 혈장 삼출액이나 조직액 내에 존재하는 요소를 암모니아와 중탄산염으로 분해하여 균주 주위를 알칼리화 함으로써 위 내의 강한 산성조건에서도 살아갈 수 있다[Mobely HL, Island MD, Hansinger RP. 1995. Molecular biology of mirobial. J Microbiol Rev 59:169-182.]. 또한, 단극성 편모는 헬리코박터 파이로리를 신속하게 점질층으로 이동할 수 있게 하기 때문에 산성 위 내에서 오랫동안의 노출을 피할 수 있게 한다. 그런데 이러한 헬리코박터 파이로리는 3가지 또는 그 이상의 약물 투여로 제균이 80% 정도에서 이루어지나, 문제는 항생제 사용 증가에 따른 내성균의 출현, 헬리코박터 파이로리 제균을 하여도 위암의 발생을 현저히 줄이지 못하고 또한 제균 후에도 위염증이 지속된다. 그리고 어떤 환자에게서 제균을 해야만 하는가에 대한 권고지침이 명확치 않다는 점 등의 이유에서 최근에는 약물에 의한 제균 치료 이외에 식품이나 추출물, 백신 등의 개발에 관심이 증가되고 있으며, 또 다른 분야에서는 장기간 투여할 수 있는 식품이나 프로바이오틱스(probiotics) 등을 이용한 치료에 비중이 증가되고 있다[Kim, N. Y. 2006. The effect of antibiotic resistance on the eradication of Helicibacterpyroli. Kor , J, Gastroenterol . 47:82-86.]. 특히, 락토바실러스 속(Lactobacillus spp.)에 속하는 젖산균의 배양액을 사람이나 실험용 동물에게 음용시켰을 때 헬리코박터 파이로리를 억제하는 효과가 있다고 발표되었다[Serin, A. L. 2001. Antagonistic activity against Helicobacter pylori infection by the lactic acid bacteria. J. Kor . Public Health . assoc. 27:5-12.]. 락토바실러스 속(Lactobacillus spp.)은 대사 과정 중에서 상당한 젖산을 생성을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 헬리코박터 파이로리는 수소이온 농도가 낮은 위에서 살고 있으므로 젖산 pKa의 낮아 젖산이 비해리 상태로 존재하여 헬리코박터 파이로리에 작용하여 저해 작용을 할 수 있으리라 사료된다. 그러나 이와 더불어 젖산균이 항균 물질을 분비하며 이러한 물질에 의한 헬리코박터 파이로리의 생육 억제 작용을 더 용이하게 할 수 있으리라 사료된다.
현재 국내에서는 헬리코박터 파이로리 억제능을 갖는 젖산균을 이용한 발효유가 개발되어 판매되고 있으나, 젖산균 박테리오신은 아직 연구가 부족한 실정이다.
박테리오신은 여러 박테리아들이 생산하는 단백질 또는 펩타이드계 항균 물질로서 특정 생육 환경에서 박테리오신 생산균과 다르거나 혹은 비슷한 미생물들의 생육을 저해할 목적으로 분비되는 것으로 알려져 있다[Klaenhammer TR.1988. Bacteriocin of lactic acid bacteria Biochimie 70: 337-349.]. 또한, 박테리오신은 인체에 무해하고 잔류성이 없으며 플라스미드나 크로모솜(choromosome)으로부터 직접 생합성되어 유전자조작 등에 의한 생물공학적 응용이 쉽다는 장점이 있다. 특히, 식품 발효에 널리 이용되는 여러 젖산균들은 다양한 박테리오신들을 생산하는데. 이 중 니신(nisin)은 상업적으로 활용되고 있고 가장 잘 알려져 있다[Oh SJ, Lee JH, Kim GT, Shin JG, baek YJ. 2003. Anti-carcinogenic activity of a bacteriocin produced by Lactococcus sp. HY449. Food Sci Biotechnol 12:9-12.]. 젖산균 또는 젖산균이 생산하는 박테리오신은 여러 그램 양성균들을 저해하기 때문에 화학 보존제를 대체하는 식품보존제로서 개발 가능성은 매우 높다[Choi YO, Ahn C. 1997. Plasmid-associated bacteriocin production y Leuconostoc sp. LAB145-3 Aisolated from Kimchi. J Ind Microbiol 2:319-322.].
본 발명은 타락으로부터 우수한 헬리코박터 파이로리 억제능을 갖는 젖산균을 분리, 동정하고, 이 분리 젖산균이 분비하는 헬리코박터 파이로리 성장 억제 물질을 확인하여 헬리코박터 파이로리와 관련된 위장 질환 예방 및 치료에 이용될 수 있는 기능성 식품 소재로의 활용하고자 하였다.
따라서, 본 발명은 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)의 생육을 저해하는 스트렙토코커스 써머필러스(Streptococcus thermophilus ) LAB kw15 균주[KACC91649P]를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 하는 헬리코박터 파이로리 억제용 조성물을 제공하는데 다른 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 정장제, 생균제, 식품첨가제 또는 위염, 위궤양 또는 십이지장궤양 예방 및 치료용 약제를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)의 생육을 저해하는 스트렙토코커스 써머필러스(Streptococcus thermophilus ) LAB kw15 균주[KACC91649P]를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 하는 헬리코박터 파이로리 억제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 정장제, 생균제, 식품첨가제 또는 위염, 위궤양 또는 십이지장궤양 예방 및 치료용 약제를 제공한다.
본 발명의 신규한 젖산균인 스트렙토코커스 써머필러스(Streptococcus thermophilus) LAB kw15 균주는 헬리코박터 파이로리의 생육을 억제하는 활성이 있고 항균력이 우수한 특징이 있다. 따라서 본 발명의 유산균은 정장제, 생균제, 항균제, 사료첨가제, 식품첨가제의 제조에 다양하게 이용될 수 있다. 특히, 헬리코박터 파이로리로 인한 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방 및 치료에 효과적이다.
도 1(A)는 루코노스톡 메센트로이드(Leuconostoc mesenteroides) LAB kw5 균주에 의한 헬리코박터 파이로리의 생육 억제환(halo)을 확인한 것이고, (B)는 스트렙토코커스 써머필러스(Streptococcus thermophilus ) LAB kw15 균주에 의한 헬리코박터 파이로리 생육 억제환을 확인한 것이다.
도 2는 김치로부터 분리된 루코노스톡 메센트로이드(Leuconostoc mesenteroides) LAB kw5 균주와 스트렙토코커스 써머필러스(Streptococcus thermophilus) LAB kw15 균주의 16s rRNA 유전자 증폭 결과를 나타낸 것이다[Lane 1: L. mesenteroides KCTC 3105, Lane 2: L. mesenteroides LAB kw5, Lane 3: S. thermophilus LAB kw15, M: 100 bp DNA ladder].
도 3은 16s rRNA 서열를 기초로 한 S. thermophilus LAB kw15와 다른 LAB와의 계통발생 관계를 나타낸 것이다.
도 4는 L. mesenteroides LAB kw5와 S. thermophilus LAB kw15의 배양 상등액을 pH 7.0으로 조정 후, H. pylori 배양액에 첨가하여 시간에 따라 H. pylori의 생육에 미치는 영향을 분석한 결과이다[(A) H. pylori KCTC12083, (B) H. pylori 52].
도 5는 L. mesenteroides LAB kw5와 S. thermophilus LAB kw15를 H. pylori와 혼합 배양하여 배양시간에 따른 생육 저해력 변화를 확인한 것이다[Lac5: L. mesenteroides LAB kw5; Lac15: S. thermophilus LAB kw15; kctc: H. pylori KCTC12083, L5: L. mesenteroides LAB kw5; L15: S. thermophilus LAB kw15; 52: H. pylori 52].
도 6은 본 발명의 L. mesenteroides LAB kw5 균주와 공지 균주 L. gasseri 250의 H. pylori 항균 활성을 나타낸 것이다[(A) H. pylori KCTC12083 + L. gasseri 250; (B) H. pylori KCTC12083 + S. thermophilus LAB kw15].
본 발명의 스트렙토코커스 써머필러스 LAB kw15는 헬리코박터 파이로리의 생육을 억제하고 항균 활성을 가지는 특징이 있다. 특히, 타락에서 분리한 본 발명의 스트렙토코커스 써머필러스 LAB kw15는 헬리코박터 파이로리의 생육을 억제하는 활성이 있으며, L. gasseri 250 보다 우수한 항균 활성을 가지는 특징이 있다.
상기와 같은 헬리코박터 파이로리의 생육을 억제하고 항균력이 우수한 특징을 모두 가지고 있는 스트렙토코커스 써머필러스 LAB kw15 균주는 본 발명에서 처음으로 제공되는 것이다.
따라서, 본 발명의 젖산균은 헬리코박터 파이로리 억제용 조성물, 인간 및 동물의 건강 증진을 위한 용도, 즉 정장제, 생균제, 식품첨가제로 사용될 수 있다.
상기 조성물은 본 발명의 스트렙토코커스 써머필러스 LAB kw15의 파쇄된 세포벽 분획, 생균, 사균, 건조균 또는 배양물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 배양물은 액체 배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액)등을 포함한다. 조성물 내 스트렙토코커스 써머필러스 LAB kw15의 함량은 조성물의 용도 및 제형에 따라 달라질 수 있다. 본 발명에 따른 정장용, 항균용 또는 생균제 조성물은 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 스트렙토코커스 써머필러스 LAB kw15 또는 이의 배양물을 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체 및 향료와 혼합하여 정제(tablet), 트로키(troche), 캡슐(capsule), 엘릭실(elixir), 시럽(syrup), 산제(powder), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조 및 투여될 수 있다. 상기 담체로는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제 등을 사용할 수 있다. 투여 방식은 경구, 비경구 또는 도포법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 경구 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 투여용량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 스트렙토코커스 써머필러스 LAB kw15 또는 이의 배양물은 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방 및 치료제로 사용될 수 있다.
상기 헬리코박터 파이로리(H. pylori)균은 만성위염, 위궤양, 십이지장궤양, 위염 발생과 소화성궤양의 원인균으로서 1982년 와렌(Warren)과 마샬(Marshall)에 의해 처음으로 보고되었고, 항생물질, 천연물 및 유산균을 이용하여 헬리코박터 파이로리의 생육을 억제한다면 이로 인한 질병을 예방 및 치료할 수 있다고 알려진 바 있다[Midole et al., J. of Applied bacteriology, 79, 475-479, 1995; Bhatia et al., J. of Clinical Microbiology, Oct., 2328-2330, 1989].
본 발명에서는 본 발명의 스트렙토코커스 써머필러스 LAB kw15가 헬리코박터 파이로리의 생육을 억제하는 활성이 있음을 성장 억제환 실험을 통해 확인하였다(도 1 참조). 따라서 상기와 같은 헬리코박터 파이로리의 생육을 억제하는 활성이 있는 본 발명의 스트렙토코커스 써머필러스 LAB kw15 또는 이의 배양물은 헬리코박터 파이로리의 감염으로 인한 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방 및 치료제로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 스트렙토코커스 써머필러스 LAB kw15 또는 이의 배양물은 김치, 음료, 이유식, 유제품 등의 식품에 대한 식품첨가제로 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 다음 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명하나, 본 발명이 아래 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
참조예 :. 사용 균주 및 배지
본 실험에 사용된 균주는 Helicobacter pylori KCTC 12083을 생물자원센터에서 분양받았으며, 야생형의 H. pylori 52는 경상대학교 의과대학에서 분양받았다.
L. mesenteroides 및 젖산균의 배양은 0.05% L-시스테인을 첨가하여 만든 Lactobacilli MRS broth 또는 MRS agar(Difco Laboratory, Detroit, MI, US)에서 37℃, 48 내지 72시간 배양하였으며, H. pylori는 10% horse serum이 첨가된 Brucella broth 또는 Brucella agar(Difco Laboratory, Detroit, MI, US)에 접종 후 37℃에서 microaerobic chamber(Ruskin Technologies, Jouan, France)나 10% CO2 항온배양기(Sanyo, Osaka, Japan)에서 48시간 배양하였다.
실시예 1: 분리 및 동정
1) 젖산균 분리
김치로부터 젖산균을 분리하기 위해 재래시장 및 백화점 등에서 직접 제조하여 판매하는 김치를 30종을 수집하였고 안동지역의 고유한 전통식품인 타락 5종을 수집하였다.
타락은 우유에 막걸리 종균을 사용한 한국 일부지역의 젖산 발효음료이다. 이들 시료 25 g을 225 mL의 0.1% peptone water에 혼합 후 stomacher를 이용하여 균질화한 후 10진 희석을 하여 MRS 아가에 도말 후 37℃에서 48 내지 72시간 배양하였다. 그리고 배양된 집락들 중 형태학적으로 상이한 것을 선택하여 MRS 아가에 평판 획선하여 배양하여 순수 분리하였다. 그 후 분리된 젖산균 의심 균주들을 대상으로 현미경을 통한 형태학적 특성 확인, Gram test, catalase test를 수행 후 API kit 50CHL(Biomerieux Co., France)을 이용하여 당자화성 등의 생화학적 특성을 분석하였다.
2) 16s rDNA 서열분석을 통한 동정
분리된 젖산균을 API kit 50CHL을 이용해 당자화성 특성 및 1차적으로 동정 후 최종적인 동정을 위해 16s rRNA 서열 분석을 수행하였다. 서열 분석을 위해 분리된 젖산균을 Lactobacilli MRS broth에 배양하고 배양액 1.5 mL를 취해 원심 분리한 후 0.8% 멸균생리식염수로 수세하였다. 그리고 genomic DNA kit를 사용하여 chromosomal DNA를 추출하여 PCR을 위한 주형 DNA로 사용하였으며, 세균의 16s rRNA에 대한 universal primer인 F-341(CCTACGGGAGGCAGCAG) 및 786-R(GACTACCAGGGTATCTAATC)을 사용하였다. PCR 수행 후 PCR 산물을 전기영동을 통해 450 bp의 증폭 산물을 확인하고 QIAquick PCR purification kit(QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용하여 정제하였다. 염기서열은 Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(Biosystems, CA, USA)와 ABI 3700 sequencer(Biosystems, CA, USA)에 의해 수행하였으며, 프라이머는 위와 동일하게 사용하였다. 16S rRNA 서열의 상동성 분석은 National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/)의 BLAST 서치 프로그램을 이용하여 DNA 데이타베이스와 비교하였다. 그리고 계통학적 분석은 Clustal X, BioEdit, MEGA 4(www.megasoftware.net/)를 이용하여 염기서열 간의 유전적 거리와 phylogenic tree를 확인하였다.
3) 결과
전통적인 우유 발효유인 타락 5시료와 시장에서 구입한 김치류 30개 시료로부터 젖산균을 분리하였다. Lactobacilli MRS 아가에서 배양된 집락의 형태학적인 특성에 따라 분리한 후 그램 시험, 카탈라아제 시험, 현미경 관찰을 통한 형태학적 특성 확인 등을 통해 젖산균으로 의심되는 균을 선발하였다. 그리고 API 50 CHL kit를 이용하여 당 발효특성 등의 생화학적 특성을 확인하고 그 결과를 동정 프로그램을 통해 확인하였으며, 동정 결과(%)가 90% 이상인 균주 15주를 선발하였다.
이 균주는 Lactobacillus curvatus 5주, Leuconotoc mesenteroides 2주, Lactococcus lactis 2주, Weissella confusa 3주, Lactobacillus fermentum 1주, Streptcoccus thermophilus 1주, Lactobacillus plantarum 1주를 분리, 동정하였다. 이 분리 균주의 배양액을 중성으로 조정한 후 희석하여 희석 배양액을 표준 균주와 분리 균주인 H. pyroli를 lawn으로 한 한천 배지에 도말하였다. 이때, H. pyroli를 저해하는 halo를 형성하는 균주를 각각의 시료에서 5개, 9개 분리하였다. Spot on the lawn 방법, disk diffusion, well diffusion 방법으로 수행하여 선명한 억제환(halo)을 확인하였다(도면 미제시). 최종적으로 억제환 형성 균주 중 가장 큰 억제환을 형성하는 균주를 각각의 시료로 부터 한 균주씩 선택하였다.
분리된 젖산균 배양액의 pH이외의 물질에 의한 H. pylori의 생육 저해 효과를 확인하기 위해 젖산균의 배양상등액을 pH 7.0으로 조정하여 H. pylori에 대한 생육 저해능을 확인하였다. 김치와 타락으로부터 분리된 젖산균에 의한 H. pylori의 생육 억제를 확인한 결과 배양상등액을 pH 7.0으로 조정했을 때와 그렇지 않은 경우 모두 H. pylori의 생육 억제환을 확인할 수 있었다[도 1]. 젖산균에 따라 H. pylori 저해 활성능이 다르다는 것을 알 수 있었으며, 특히 Leuconostoc mesenteroides LAB kw5과 Streptococcus thermophilus ) LAB kw15의 H. pylori 저해력이 가장 큰 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과로부터 H. pylori의 생육 저해는 젖산균이 생성해 내는 항균 물질과 젖산 등에 의한 낮은 pH에 의한 복합적인 작용인 것으로 알려져 있다[Serin, A. L. 2001. Antagonistic activity against Helicobacter pylori infection by the lactic acid bacteria. J. Kor . Public Health . assoc. 27:5-12.; Lee. H. S., S. H. Park, H. K. Chung, and T.B. Choe. 1993. Antitumor effect of cell wall component purified from Lactobacillus plantarum KK. J. Gen . Eng. 5:22-28.]. 본 실험에서 pH 7.0으로 조정 후에도 H. pylori에 대한 항균 활성을 나타낸 것으로 나타났고 Jung 등[Jung HK, Kim ER, Juhn SL. 2001. Selection of Lactic Acid Bacteria Specifically Inhibiting the Growth of Helicibacter pyroli.37:152-153.]은 H. pylori 균주에 대한 생육 억제능이 가장 강한 균주는 다량의 젖산을 생성하지 않은 것으로 보고하여 분리된 젖산균은 H. pylori의 생육을 억제하는 항균 물질을 생산해 내는 것으로 사료된다.
최종 선발한 분리균주의 당자화성[표 1]과 16s rRNA 염기서열 분석결과 김치에서 분리한 LAB kw5는 Leuconostoc mesenteroides[서열번호 1], 타락에서 분리한 LAB kw15는 Streptococcus thermophilus[서열번호 2]로 동정되었다[도 2, 3].
상기 분리된 Leuconostoc mesenteroides LAB kw5 균주와 Streptococcus thermophilus LAB kw15는 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2011년 4월 5일자로 각각 KACC91648P, KACC91649P로 수탁번호를 부여받았다.
Figure pat00001
실시예 2: 분리된 젖산균의 H. pylori 에 대한 생육 저해
표준 균주인 H. pylori KCTC12083과 야생형인 H. pylori 52를 각각 horse serum이 첨가된 Brucella agar에서 48시간 배양하고, 이를 horse serum이 첨가된 1 ㎖의 Brucella broth에 3McFaland unit으로 현탁한 후 도말하였다. 그리고 MRS broth에서 배양된 젖산균을 원심분리(10,000×g, 5 min)하고 상등액을 1N NaOH를 이용하여 pH 7.0으로 조정한 후 0.22 ㎛Syringe filter(Millipore, Billerica, MA)를 이용하여 제균하였다. 이 제균액을 H. pylori가 배양된 배지에 10 ㎕씩 첨가하여 각각 spot on the lawn 방법, disk diffusion, well diffusion 방법으로 수행하고, 배양 후 억제환을 확인하여 생육 저해 효과를 확인하였다.
분리된 L. mesenteroides LAB kw5와 S. thermophilus LAB kw15의 배양 상등액을 pH 7.0으로 조정한 다음 H. pylori 배양액에 첨가하여 시간에 따라 H. pylori의 생육에 미치는 영향을 확인 분석하였다[도 4]. H. pylori에 배양 상등액을 첨가했을 배양하였을 경우 배양 상등액이 첨가되어 있지 않았을 때와 비교하여 표준 균주와 야생형 H. pyroli 모두에서 생육을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. L. mesenteroides LAB kw5이 H. pylori KCTC12083만 배양한 구간에 비하여 약 30% 이상, H. pylori 52는 배양한 구간에 비하여 약 25% 이상의 높은 생육 활성 억제력을 나타났고, S. thermophilus LAB kw15가 H. pylori KCTC12083은 배양한 구간에 비하여 약 30%정도, H. pylori 52만 배양한 구간에 비하여 약 20% 이상의 높은 생육활성 억제력을 나타냈다. H. pylori의 야생형 보다 표준 균주에서 생육 억제가 더 크게 작용하였고, S. thermophilus LAB kw15 보다 L. mesenteroides LAB kw5가 더 높은 H. pylori 활성 억제력을 확인할 수 있었다. 그러나, L. mesenteroides LAB kw5와 S. thermophilus LAB kw15의 항균 물질 생산 분비 능력의 차이는 크지 않은 것으로 사료된다.
실시예 3: 젖산균 배양액의 항 H. pylori 의 효과와 혼합 배양
H. pylori에 항균 효과를 갖는 젖산균 배양액이 H. pylori에 생육에 미치는 영향을 확인하기 위해, 상기와 동일한 방법으로 만들어진 H. pylori 배양 현탁액과 pH가 7.0으로 보정된 젖산균 배양 상등액 동량을 넣고 마이크로플레이트 리더를 이용하여 시간에 따른 H. pylori의 생육을 비교하였다. Tissue culture test plate(SPL LIFE SCIENCES, Namyangju, Korea)에 H. pylori와 젖산균 배양 상등액을 첨가하여 CO2 항온배양기에서 37℃에서 36시간 동안 배양하면서 3시간 간격으로 660 ㎚에서 배양액의 흡광도를 측정하였다. 젖산균과 H. pylori의 혼합 배양은 50 ㎖ Brucella 액체 배지에 H. pylori의 single colony를 현탁하고, CO2 항온배양기에서 37℃에서 36시간 동안 정치 배양하였다. 그 후에 H. pylori가 배양된 액체 배지에 일정한 비율로 희석된 젖산균을 넣어 같이 배양하면서 시간에 따른 H. pylori와 젖산균의 수를 측정하고 H. pylori 저해 여부를 알아보았다.
분리한 각 젖산균들과 H. pyroli를 혼합 배양하여 배양 시간에 따른 생육 저해력의 변화를 측정하였다. 그러나, 젖산균은 24~36시간, H. pylori은 48~72시간으로 각 생육 시간대가 다르기 때문에 H. pylori가 액체 배양이 36시간일 때, 젖산균을 103 CFU/ml로 맞춰서 접종한 후 혼합 배양을 하였다. 젖산균은 배양한 지 6시간 만에 급격히 증가되었고, 24시간이 되어서 최고점에 달았다. 18시간 전에는 LAB kw15, 18시간 후로는 L. mesenteroides LAB kw5의 배양속도가 더 빨랐다. H. pylori에 따라 약간의 차이가 있지만 젖산균은 배양 후 0~6시간부터 저해물질을 분비하기 시작하고 특히, L. mesenteroides LAB kw5의 경우 약 6~12시간에는 최대의 저해력을 나타내면서 계속 유지되었다. 그러나, S. thermophilus LAB kw15는 12시간 경과할 때에 약 20~30% 정도로 저해력이 약해짐을 알 수 있었다. 이것은 H. pylori을 억제하기 보다 생육 속도를 낮추는 것으로 추측된다. 흥미롭게도 이 분리 젖산균들이 항균 물질을 생산하는 능력은 유사하지만 혼합 배양 시에 H. pyroli를 저해하는 형태가 아주 다르게 나타났다.
실시예 4: S. thermophilus LAB kw15 와 L. gasseri 250의 H. pylori 항균 활성 결과
1) 사용 균주의 배양
본 실험에 사용된 균주는 Helicobacter pylori KCTC 12083을 생물자원센터에서 분양받았다. S. thermophilus LAB kw15와 L. gasseri 250의 배양은 0.05% L-시스테인을 첨가하여 만든 Lactobacilli MRS broth 또는 MRS agar(Difco Laboratory, Detroit, MI, US)에서 37℃, 48~72시간 배양하였으며, H. pylori는 10% horse serum이 첨가된 Brucella broth 또는 Brucella agar(Difco Laboratory, Detroit, MI, US)에 접종 후 37℃에서 microaerobic chamber(Ruskin Technologies, Jouan, France)나 10% CO2 항온배양기(Sanyo, Osaka, Japan)에서 48시간 동안 정치 배양하였다.
2) H. pylori 에 대한 항균 효과 측정
표준 균주인 H. pylori KCTC12083을 각각 horse serum이 첨가된 Brucella agar에서 48시간 배양하고, 이를 horse serum이 첨가된 1 ㎖의 Brucella broth에 3McFaland unit으로 현탁한 후 도말하였다. 그리고 MRS broth에서 배양된 L. gasseri 250와 S. thermophilus LAB kw15를 원심분리(10,000×g, 5 min)하고 상등액을 1N NaOH를 이용하여 pH 7.0으로 조정한 후 0.22 ㎛ Syringe filter(Millipore, Billerica, MA)를 이용하여 제균하였다. 이 제균액을 H. pylori가 배양된 배지에 10 ㎕씩 첨가하여 각각 spot on the lawn 방법, disk diffusion, well diffusion 방법으로 수행하고, 배양 후 억제환을 확인하여 생육 저해 효과를 확인하였다.
그 결과, 기존에 H. pylori에 대한 항균 효과를 가진 젖산균으로 잘 알려진 L. gasseri 250와 비교하여 S. thermophilus LAB kw15가 더욱 우수한 항균 활성을 나타내었다[도 6].
그러므로 S. thermophilus LAB kw15는 H. pylori를 제어하는 좋은 기능성을 가진 젖산균으로 보인다.
구분 S. thermophilus
LAB kw15		 L. gasseri 250
H. pylori KCTC
12083		 disk 2 mm 3 mm
well 17 mm 15 mm
spot 17 mm 14 mm
국립농업과학원 농업유전자원센터(국내) KACC91648P 20110405 국립농업과학원 농업유전자원센터(국내) KACC91649P 20110405
<110> BKBIO.CO.,Ltd. Kyungwon University-Industry Collaboration Foundation <120> LACTIC ACID BACTERIA GROUP HINDERING GROWTH OF HELICOBACTOR PYLOLI <130> a <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 844 <212> DNA <213> Leuconostoc mesenteroides LAB kw5 <400> 1 nngaaggctt tcgggtcgta aagcactgtt gtatgggaag aacagctaga ataggaaatg 60 attttagttt gacggtacca taccagaaag ggacggctaa atacgtgcca gcagccgcgg 120 taatacgtat gtcccgagcg ttatccggat ttattgggcg taaagcgagc gcagacggtt 180 tattaagtct gatgtgaaag cccggagctc aactccggaa tggcattgga aactggttaa 240 cttgagtgca gtagaggtaa gtggaactca tgtgtagcgg tggaatgcgt agatatatgg 300 aagaacacca gtggcgaagg cggcttactg gactgcaact gacgttgagg ctcgaaagtg 360 tgggtagcaa acaggattag accgggggga tatctccatc aaacttgagc aaaagcttat 420 ggaaccatcc gcgagggaaa aagccttgga ctgaagcatg tgttgcaaga aatttgaaag 480 gaagatattg gggggagggt ctaatggggg gcaattcggc gccccggatc aatttaaact 540 ttggatagag agaagtgcca agttaaaata attgaatcga ttccccgatg acggaacggt 600 attgagtcct gattagggat cggttgcgtg gggggctaaa ttggaaaact tgaaggggtt 660 tttgaaataa caaaattaag ccaaaatttg ggtaaaaaag atgatccccg ggtataaatt 720 ttcaatcatg actgcggtca tctcaatctt cacaagccgc tatacgatac actacccccc 780 aatctaacag tcccttctct tagcattttt caggctgata ggcacccttc cttaactgcg 840 tcat 844 <210> 2 <211> 849 <212> DNA <213> Streptococcus thermophilus LAB kw15 <400> 2 nnnnnnaagg ntttcggatc gtaaagctct gttgtaagtc aagaacgggt gtgagagtgg 60 aaagttcaca ctgtgacggt agcttaccag aaagggacgg ctaactacgt gccagcagcc 120 gcggtaatac gtaggtcccg agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc 180 ggtttgataa gtctgaagtt aaaggctgtg gctcaaccat agttcgcttt ggaaactgtc 240 aaacttgagt gcagaagggg agagtggaat tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat 300 atggaggaac accggtggcg aaagcggctc tctggtctgt aactgacgct gaggctcgaa 360 agcgtgggga gcgaacagga ttagtccttg gtggtagtca gcgatttcat tgcggctgcc 420 ccccggtagg ggaagcccgg attaaaaagg tttttcgaat cgtaaagctt ttttgtagtt 480 cagaaagggg tttgagaatt ggaaagtttc ccctgtgacg gtgcttacca aaaggggaag 540 gcaaatacgt gccgcacccg ggtaatccct agggtcgggc tgttcccgga tttttggggg 600 aataaaggag ggcggggggn ntagtattat ttaaaatttt aagggggtgg gacaacacag 660 attttcttgt ggaaccggtc aatattgggt gcaaaagggg gaaaagggga aagtccgtgg 720 ttagccttaa aagtggcgta tattttnggg agagaacccg gtggggaagg cgctcttttg 780 gattatttac ttgatcttaa gggtgaaagg cgggggggca caaaagaaat gattccccgg 840 gtataaaaa 849

Claims (6)

  1. 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)의 생육을 저해하는 스트렙토코커스 써머필러스(Streptococcus thermophilus ) LAB kw15 균주[KACC91649P].
  2. 스트렙토코커스 써머필러스(Streptococcus thermophilus ) LAB kw15 균주[KACC91649P] 또는 이의 배양물을 유효성분으로 하는 헬리코박터 파이로리 억제용 조성물.
  3. 스트렙토코커스 써머필러스(Streptococcus thermophilus ) LAB kw15 균주[KACC91649P] 또는 이의 배양액을 포함하는 정장제.
  4. 스트렙토코커스 써머필러스(Streptococcus thermophilus ) LAB kw15 균주[KACC91649P] 또는 이의 배양물을 포함하는 생균제.
  5. 스트렙토코커스 써머필러스(Streptococcus thermophilus ) LAB kw15 균주[KACC91649P] 또는 이의 배양물을 포함하는 식품첨가제.
  6. 스트렙토코커스 써머필러스(Streptococcus thermophilus ) LAB kw15 균주[KACC91649P] 또는 이의 배양물을 포함하는 위염, 위궤양 또는 십이지장궤양 예방 및 치료용 약제.
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