KR20140090854A - 항균활성을 갖는 신규한 락토코쿠스 락티스 kr-w.w-2 균주 및 이의 용도 - Google Patents

항균활성을 갖는 신규한 락토코쿠스 락티스 kr-w.w-2 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 항균활성을 갖는 균주인 기탁번호 KCTC 12237BP의 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2 균주, 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물 및 프로바이오틱스 조성물, 상기 항균 조성물 또는 프로바이오틱스 조성물을 유효성분으로 포함하는 어류 양식용 사료 첨가제, 상기 사료 첨가제를 포함하는 어류 양식용 사료, 상기 사료를 양식중인 어류에 급이하는 단계를 포함하는 양식 어류의 병원균에 의한 질병을 예방하는 방법 및 상기 항균 조성물을 어류 양식장에 살포하는 단계를 포함하는 양식 어류의 병원균에 의한 감염을 예방하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 항균활성을 갖는 신규 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2 균주는 어류 세균성 병원균인 스트렙토코커스 이니애, 비브리오 앙구일라룸 및 비브리오 불니피쿠스에 대한 우수한 항균활성을 나타내며, 우수한 내산성 및 내담즙성을 가지므로 사료첨가제로 적합한 균주이므로, 사료에 첨가하여 급이함으로써 어류 세균성 병원균에 의한 양식어류의 질병을 예방할 수 있다. 또한 상기 균주 및 이의 배양물은 자체로서 어류 세균성 병원균에 대한 항균활성을 나타내므로 양식장에 살포하여 양식어류의 어류 세균성 병원균에 의한 감염을 예방할 수 있다.

Description

항균활성을 갖는 신규한 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2 균주 및 이의 용도{Lactococcus lactis KR-W.W-2 as a novel strain with antibacterial activity and use thereof}
본 발명은 신규한 항균활성을 갖는 균주인 기탁번호 KCTC 12237BP의 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) KR-W.W-2 균주, 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물 및 프로바이오틱스 조성물, 상기 항균 조성물 또는 프로바이오틱스 조성물을 유효성분으로 포함하는 어류 양식용 사료 첨가제, 상기 사료 첨가제를 포함하는 어류 양식용 사료, 상기 사료를 양식중인 어류에 급이하는 단계를 포함하는 양식 어류의 병원균에 의한 질병을 예방하는 방법 및 상기 항균 조성물을 어류 양식장에 살포하는 단계를 포함하는 양식 어류의 병원균에 의한 감염을 예방하는 방법에 관한 것이다.
해수양식은 대량, 고밀도로 사육이 행해지므로 이들 양식어류는 많은 스트레스 및 세균성 병원균의 감염에 노출되어 있다. 이에 우리나라에서는 1980년대 이후 어류양식이 성행하면서 폐사로 이어질 수 있는 양식어의 질병예방 및 치료를 위하여 각종 항생제가 사용되어 왔으며, 장기간에 걸친 항생제의 사용으로 인하여 어류 세균성 질병을 유발하는 해양세균에서 항생제 내성균 발생이 우려되고 있다. 세균의 항생제 내성을 결정하는 인자들은 플라스미드 전이에 의해 쉽게 다른 균체에 전달되는데 이러한 인자가 사람의 질병을 유발하는 세균에 전이될 수 있으며, 이때, 양식어류가 이러한 세균에 의한 인간의 감염에 대한 매개체 역할을 할 수도 있다는 것이 보고된 바 있다. 따라서, 항생제 내성 문제를 해결하기 위하여 이를 대체할 수 있는 천연소재를 활용하고자 많은 시도를 하고 있다. 예로부터 한약재 추출물이나 식물정유는 식용 또는 약용으로 이용되어 왔으며 최근에는 이러한 자원을 이용하여 항균, 항진균 및 항암효과를 갖는 물질에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 식품에 존재하여 사람에게 해를 입히는 세균에 대한 항균효과에 대해서는 많은 보고가 되고 있지만, 양식어류의 질병을 일으키는 원인 세균에 대한 천연물의 항균효과에 대한 연구는 시작단계에 있다. 현재 양식장에서 발생하는 세균성 질병에 대한 구체적인 효능, 즉 항균효과에 대해서 천연자원 추출물을 이용하여 어류 질병을 유발하는 세균에 대한 효능을 규명하고 실제적으로 연쇄구균에 사용되는 항생제를 대체할 항균 조성물을 개발하는 것이 시급하다.
연쇄구균증의 원인균인 스트렙토코커스(Streptococcus sp.)는 한국을 포함한 미국, 이스라엘, 오스트레일리아, 일본 등지의 담수 및 해수 양식에 막대한 경제적 손실을 일으킨다. 스트렙토코커스는 박테리아의 한 속으로서 본 속의 다양한 종들은 사람을 비롯한 많은 동물에서 질병을 유발한다. 대부분의 어류에 질병을 일으키는 박테리아는 그람염색 시 핑크색이 나타나는 그람음성균인 반면, 상기 스트렙토코커스 종은 그람염색 시 자주색이 나타나는 그람양성균이다. 스트렙토코커스에 의한 어류 질병은 그리 흔하지는 않으나, 일단 발병되면 많은 손실을 수반한다. 수생 스트렙토코커스 균은 많지는 않으나, 허약한 사람에게는 질병을 유발할 수 있다. 스트렙토코커스 이외에도 락토코쿠스, 엔테로코쿠스(Enterococcus) 및 바고코쿠스(Vagococcus)와 같은 종들도 스트렙토코커스와 유사한 질병을 유발한다. 어류에서 포도상 구균병은 1957년 일본의 양식 송어에서 최초로 발견되었다. 이후 연어, 숭어, 골든 샤이너(golden shiner), 핀피쉬(pinfish), 뱀장어, 해산송어, 틸라피아, 철갑상어 및 농어 등이 포도상 구균병에 쉽게 감염된다는 것이 보고되었다. 현재 어류에 질병을 일으키는 스트렙토코커스 속 종들의 예로는 이스라엘에서 발견된 S. 디피실리스(S. difficilis), 비단잉어의 신장에서 발견된 S. 밀레리(S. milleri), 북부 스페인의 터봇(turbot)에서 발견된 S. 파라우베리스(S. parauberis), 어류와 포유류에서 모두 발견된 S. 이니애(S. iniae) 등이 있다. 또한 그람양성 박테리아로서 포도상 구균과 매우 흡사하며 어류에 질병을 일으키는 종들로서는 일본의 뱀장어와 방어에서 발견된 락토코쿠스 가르비애(L. garvieae)와 무지개송어에서 발견된 L. 피슘(L. piscium) 및 바고코쿠스 살모니나룸(Vagococcus salmoninarum) 등을 들 수 있다.
일반적으로 연쇄구균증에 감염된 어류는 채색이 검어지고 안구의 백탁 및 돌출 증상을 보이고, 눈 가장자리 및 지느러미가 붉어진다. 감염어류를 해부해보면 간장의 충혈, 비대 및 축소 장관의 염증 및 출혈, 뇌출혈 그리고 아가미 뚜껑 내부에 농창 형성이 관찰된다. 또한 감염 어류는 감염초기 식욕감퇴로 인해 사료 섭이량이 급격히 감소하므로 약제 감수성 시험에서는 여러 약제가 효과적인 것으로 나타나지만, 실제 양식장에서 사용할 경우 효과적이지 못한 경우가 많다. 따라서, 기존의 약물에 의한 치료위주의 방역대책에서 양식어류의 연쇄구군에 의한 피해 예방을 위해 보다 근본적이면서 새로운 개념의 어류 질병 예방제제의 현장도입이 요구된다.
현재까지 알려진 연쇄구균증에 유효한 약제로는 플로르페니콜(Florfenicol), 암피실린(Ampicillin), 독시사이클린(Doxycyclin), 스피라마이신(Spiramycin) 등이 있다. 이들은 모두 수산용으로 증상에 따라 투여하면 치유되는 경우도 있지만, 거의 대부분의 병원균은 이들에 대해 항생제 내성을 가지거나 그렇지 않더라도 이들 약물이 뚜렷한 효과를 나타내지 못하는 경우가 많다.
프로바이오틱스(생균제; Probiotics)는 여러 종류의 정상 장내 세균총에서 세균성 병원균에 대해 증식을 억제하는 항균력이 있는 것으로 알려져 있고, 정상 장내 세균총의 균형을 유지하고 세균성 병원균의 증식을 억제하는데 중요한 역할을 한다(Fuller, R. J., Appl. Bacteriol., 1989, 66, 365-378; Shahani, K. M., Am. J. Clin. Nutr., 1980, 33, 2448-2457). 사람 및 가축에 사용되는 프로바이오틱스는 최적 발육온도가 37℃로, 15 내지 25℃에서 생육하는 양식어에는 부적합하며, 특히 해수 양식어의 경우 높은 염농도에도 견딜 수 있는 프로바이오틱스가 필수적이다. 날로 급증해가는 어류 수산물의 양식에 따라 수질 환경은 점차 악화되고 어병을 일으키는 빈도가 증가하므로, 항생제를 대체할 수 있는 프로바이오틱스의 발굴이 필수적이다. 국내에서 사용되고 있는 어류 전용 프로바이오틱스 제품은 대부분 외국에서 수입되는 균주로서, 국내의 어류 생육환경에 잘 적응하지 못하고 있는 실정이며 제품 또한 다양하지 못하다. 또한 수입에서 국내 유통까지 시간적인 차이로 인한 안정성의 결핍으로 균체의 집락형성도(Colony forming unit)가 낮다는 점도 상당한 문제점으로 제시되고 있다.
일반적으로 프로바이오틱스에 사용하는 유산균은 그람양성간균, 비운동성, 비포자성 및 카탈라제(catalase) 음성인 세균으로서 자연계에 널리 분포하고 있을 뿐만 아니라 동물의 장이나 발효식품 등에서도 발견된다(Ringo, E., Aquaculture, 1998, 160: 177-203). 이들 유산균들이 항균활성 등에 의해 장내균총을 개선시키는 중요한 미생물이라는 것이 알려져 있으며, 이러한 유산균의 항균활성 인자는 유기산과 과산화수소 및 박테리오신(bacteriocin)(Piard, J. C., Lait., 1992, 72: 113-142) 등에 의한다. 또한 유산균은 장내 상피세포에 부착하여 정착함으로써 병원균의 감염과 성장을 억제하게 된다. 유산균의 병원성 세균에 대한 항균활성에 대한 연구로는 리스테리아 모노사이토진스(Listeria monocytogenes), 대장균(Escherichia coli), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 비브리오 앙구일라룸(Vibrio anguillarum) 등의 미생물에 대한 항균활성이 있다고 보고되어 있다. 그러나, 대부분의 어병세균 및 병원성 세균이 그람음성인데 반하여 프로바이오틱스로서 유산균은 그 항균활성이 계통적으로 유사한 그람양성세균에 대해서만 항균활성을 나타낸다는 한계점이 있다(Suma, K., Int. J. Food Microbiol., 1998, 40: 17-25). 따라서, 프로바이오틱스 균주로서 산업적으로 응용하기 위해, 분리된 균주는 그람양성세균 뿐만 아니라 그람음성세균의 성장까지도 저해할 수 있는 넓은 항균 스펙트럼을 가져야 한다. 또한, 프로바이오틱스의 지속적인 항균작용과 유익한 효과를 나타내기 위해서는 pH가 낮은 위장과 담즙 및 여러 소화효소 등이 존재하는 장내 환경 조건에서도 생존하여야 한다. 즉, 프로바이오틱스 균주가 갖추어야할 또 다른 중요한 조건은 내산성 및 내담즙성 그리고 항생제에 대한 적절한 내성을 갖추는 것이다(Verschuere, L., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2000, 64: 655-656).
이에 본 발명자들은, 천연자원 가운데 어류 세균성 병원균에 대한 항균활성을 나타내며 내산성 및 내담즙성 등이 우수하여 어류용 바이오틱스로 사용될 수 있는 신규한 균주를 발굴하고자 예의 연구 노력한 결과, 발효식품으로부터 분리한 락토코쿠스 락티스의 신규한 균주들 중 뛰어난 내산성 및 내담즙성을 나타내는 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2 균주 및 이의 배양물이 대표적인 어류 세균성 병원균인 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae), 비브리오 앙구일라룸(Vibrio anguillarum) 및 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)에 대한 우수한 항균활성과 내산성, 내담즙성 등을 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 기탁번호 KCTC 12237BP의 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항균 조성물 또는 프로바이오틱스 조성물을 유효성분으로 포함하는 어류 양식용 사료 첨가제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 사료 첨가제를 포함하는 어류 양식용 사료를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 사료를 양식중인 어류에 급이하는 단계를 포함하는 양식 어류의 병원균에 의한 질병을 예방하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항균 조성물을 어류 양식장에 살포하는 단계를 포함하는 양식 어류의 병원균에 의한 감염을 예방하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 기탁번호 KCTC 12237BP의 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2 균주를 제공한다.
본 발명의 용어 "락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2 균주"는 자연계 즉, 각종 김치 및 젓갈 등과 같은 발효식품으로부터 본 발명자들에 의해 새롭게 분리 동정된 신규한 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2 균주로서, "KR-W.W-2 균주" 또는 "KR-W.W-2"과 혼용하여 사용할 수 있다. 상기 균주는 특성분석을 통해 어류 세균성 병원균에 대한 항균활성을 갖는 균주임을 확인하였다. 단세포는 단축 0.7 내지 1.0 μm 및 장축 0.7 내지 1.6 μm의 크기를 갖는 구균타입(cocci type; 도 1)으로, 균총은 MRS 아가 배지에서 원형의 집락(circular colony)을 형성하며 연한 크림색을 띤다.
상기 신규한 균주의 16S rRNA유전자 서열을 서열번호 1에 기재하였으며, 상기 유전자 서열을 분석하여 비교한 결과 락토코쿠스 락티스(L. lactis)와 높은 상동성을 나타내어, 새로운 락토코쿠스 락티스 균주로 확인되어 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2로 명명하였다.
락토코쿠스 속 균주는 다양한 종류가 있으며, 본 발명자들은 어류 세균성 병원균에 대한 뛰어난 항균활성을 나타내면서 동시에 높은 내산성 및 내담즙성을 나타내는 균주를 선별하였다. 본 발명자들에 의해 동정된 KR-W.W-2 균주가 다른 락토코쿠스 속 균주에 비하여 항균활성 및 위산 및 담즙 등에 대한 저항성이 높은 것을 확인하였다.
구체적으로 본 발명자들은 강원도 속초에서 채집된 가자미식혜 시료로부터 분리된 균주를 대상으로 MRS 한천(LB-agar) 배지를 이용하여 선별한 6개 균주 중에서 가장 뛰어난 열안정성 및 다수의 항생제에 내성을 보인 본 발명의 KR-W.W-2 균주가 내산성 및 내담즙성이 우수하여 산성 조건 및 높은 비율의 담즙 조건 하에서도 생존 가능함을 확인하였다. 이와 같은 결과는 본 발명에서 새롭게 동정한 균주가 기존의 락토코쿠스 속 균주에 비해 우수한 항균활성을 나타내므로 양식어류에 대한 어류 세균병을 예방하기 위한 조성물로 사용 가능하며, 또한 내산성 및 내담즙성이 뛰어나므로 사료 첨가제로 사료에 혼합하여 급이함으로써 어류 세균병을 예방할 수 있음을 시사한다.
본 발명자들은 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2로 명명한 본 발명의 균주를 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 2012년 7월 6일자로 기탁하고, 수탁번호 KCTC 12237BP를 부여받았다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 기탁번호 KCTC 12237BP의 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 균주를 포함하는 프로바이오틱스 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "배양물"은 본 발명의 KR-W.W-2 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 배양된 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미하며, 균주 배양 후 균주를 제거한 배양액도 포함한다. 상기 KR-W.W-2 균주는 항균활성, 특히 어류 세균성 병원균에 대한 항균활성을 가지는 균주이므로, 상기 KR-W.W-2 균주 또는 이의 배양물은 항균 조성물로 이용될 수 있다. 바람직하게는 어류 세균성 병원균에 대한 항균 조성물로 이용될 수 있다.
본 발명의 용어 "프로바이오틱스(probiotics)"는 건강에 도움이 되는 장내 세균총 즉, 숙주의 건강에 이로움을 제공하는 살아있는 미생물 즉 생균류를 의미한다. 일반적으로 프로바이오틱스는 요거트 등의 발효식품의 일부 또는 식이보충제로서 소비된다. 프로바이오틱스로 알려진 미생물에는 락트산 박테리아(lactic acid bacteria; LAB), 비피도박테리아(bifidobacteria), 일부 효모(yeast) 및 바실러스 등이 있다.
따라서, 본 발명의 KR-W.W-2 균주는 비피도박테리아와 더불어 잘 알려진 프로바이오틱스인 락트산 박테리아의 일종인 락토코쿠스 락티스의 균주로 동정되었으며, 자체로서 항균활성을 나타내므로 어류용 프로바이오틱스 즉 생균제일 수 있다.
바람직하게, 상기 어류 세균성 병원균은 스트렙토코커스(Streptococcus) 또는 비브리오(Vibrio)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 스트렙토코커스 이니애, 비브리오 앙구일라룸 또는 비브리오 불니피쿠스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, KR-W.W-2 균주는 스트렙토코커스 이니애에 대해 우수한 항균활성을 나타낼 뿐만 아니라(표 6 및 도 3 내지 5), 내산성 및 내담즙성이 우수하여 위 또는 장을 지나면서도 높은 비율로 생존하여 활성을 나타내므로(표 4 및 5), 어류 세균성 병원균에 대한 항균제로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 어류용 생균제로서도 매우 적절한 균주임을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 신규 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2 균주 및 이의 배양물은 어류 세균성 병원균에 대한 항균활성을 나타내는 조성물 및 어류용 프로바이오틱스 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 약학적, 식품학적 또는 사료용으로 허용되는 공지의 담체 또는 첨가제를 포함할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 항균 조성물 또는 프로바이오틱스 조성물을 유효성분으로 포함하는 어류 양식용 사료 첨가제를 제공한다. 본 발명의 사료 첨가제는 상기 유효성분 이외에 약학적, 식품학적 또는 사료용으로 허용되는 공지의 담체 또는 안정제 등의 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타 첨가제 등을 포함할 수 있다. 이때, 그 형태는 분체, 과립, 펠렛, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다.
본 발명의 항균 조성물을 사료 첨가제로 사료에 포함시키는 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 사료 성분과 함께 혼합하여 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다, 유효성분의 혼합량은 사용목적에 따라 적합하게 결정될 수 있으며, 본 발명의 조성물은 균주로부터 유래하여 친환경적이며 안정성 면에서 별다른 문제가 없기 때문에 혼합량에 큰 제한은 없다.
본 발명의 대상이 되는 어류는 도미, 넙치, 우럭, 참돔, 민어, 숭어, 능성어 등의 해산어류 및 뱀장어, 은어, 산천어, 송어, 쏘가리 등의 육상어류인 것이 바람직하며, 넙치, 우럭, 참돔인 것이 보다 바람직하나, 특별히 이에 한정되는 것은 아니다. 그러나 본 발명의 사료 첨가제는 상기한 어류에 이용이 제한되는 것이 아니며, 양식 어류에 모두 사용될 수 있으며, 바람직하게는 스트렙토코커스 이니애, 비브리오 앙구일라룸 또는 비브리오 불니피쿠스에 감염가능성이 있는 양식 어류에 사용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 사료 첨가제를 포함하는 어류 양식용 사료를 제공한다. 본 발명의 사료의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니며, 분말사료, 고형사료, 습윤 팰렛사료, 건조 팰렛사료, EP(extruder pellet) 사료, 날먹이 등 어떠한 사료라도 무방하다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 사료를 양식중인 어류에 급이하는 단계를 포함하는 양식 어류의 병원균에 의한 질병을 예방하는 방법을 제공한다. 이때, 상기 사료는 통상의 사료와 동일한 양 및 급이 간격으로 공급되는 것이 바람직하다. 본 발명의 사료로 예방할 수 있는 병원균은 바람직하게는 스트렙토코커스 이니애, 비브리오 앙구일라룸 또는 비브리오 불니피쿠스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 항균 조성물을 어류 양식장에 살포하는 단계를 포함하는 양식 어류의 병원균에 의한 감염을 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 KR-W.W-2 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물은 어류 세균성 병원균에 대한 항균활성을 나타내므로, 양식장에 살포하여 상기 세균성 병원균의 활성을 억제함으로써, 양식 어류의 상기 병원균에 의한 감염을 예방할 수 있다. 본 발명의 항균 조성물을 양식장에 살포함으로써 감염을 예방할 수 있는 병원균은 바람직하게는 스트렙토코커스 이니애, 비브리오 앙구일라룸 또는 비브리오 불니피쿠스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항균활성을 갖는 신규 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2 균주는 어류 세균성 병원균인 스트렙토코커스 이니애, 비브리오 앙구일라룸 및 비브리오 불니피쿠스에 대한 우수한 항균활성을 나타내며, 우수한 내산성 및 내담즙성을 가지므로 사료첨가제로 적합한 균주이므로, 사료에 첨가하여 급이함으로써 어류 세균성 병원균에 의한 양식어류의 질병을 예방할 수 있다. 또한 상기 균주 및 이의 배양물은 자체로서 어류 세균성 병원균에 대한 항균활성을 나타내므로 양식장에 살포하여 양식어류의 어류 세균성 병원균에 의한 감염을 예방할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 항균활성을 갖는 신규 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2 균주의 형태를 나타내는 전자현미경 이미지이다.
도 2는 본 발명에 따른 신규 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2 균주의 16S rRNA 유전자 서열을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 신규 바실러스 속 KR-OF1 균주 배양액의 어류 세균성 병원균인 스트렙토코커스 이니애에 대한 항균활성을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 신규 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2 균주 배양액의 어류 세균성 병원균인 비브리오 불니피쿠스에 대한 항균활성을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 신규 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2 균주 배양액의 어류 세균성 병원균인 비브리오 앙구일라룸에 대한 항균활성을 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 젖산균 균주의 분리 및 선별
자연계로부터 젖산균 균주를 분리하기 위한 시료로써 강원도 속초에서 가자미식혜 시료를 수집하였다. 채취한 시료에 멸균수를 혼합하여 희석한 후 30℃에서 30분간 진탕한 후, 한천평판희석법(agar plate dilution method)으로 104배까지 희석하여 희석액 0.1 ml를 MRS-Agar 배지(표 1)에 분주하여 배지 전면에 고르게 도말하였다. 이를 30℃ 항온기에서 3 내지 5일간 배양한 후 나타난 단일 집락(single colony)의 형태학적 분석을 통해 젖산균 균주만을 순수하게 분리하여 다시 MRS-Agar 사면 배지에 배양한 후 20% 글리세롤에 현탁시킨 후 -70℃ 냉동고에 보관하여 사용하였다. 각각의 집락은 열안정성 실험 및 다양한 항생제에 대한 내성검사를 통하여 고온에서 생존률이 우수하고 다양한 항생제에 대해 내성을 갖는 균주를 최종적으로 선별하였다(표 2).
상기 선별된 균주의 전자현미경 상으로 관찰한 단세포는 단축 0.7 내지 1.0 μm 및 장축 0.7 내지 1.6 μm의 크기를 갖는 구균타입(cocci type; 도 1)으로, 균총은 MRS 아가 배지에서 원형의 집락(circular colony)을 형성하며 연한 크림색을 띠는 것을 확인하였다.
배지 성분 농도(g/l)
프로테오스 펩톤(Proteose Peptone) 10.0
소고기추출물(Beef Extract) 10.0
효모추출물(Yeast Extract) 5.0
글루코스(Glucose) 20.0
폴리솔베이트 80(polysorbate 80) 1.0
구연산암모늄(Ammonium Citrate) 2.0
아세트산나트륨(Sodium Acetate) 5.0
황산마그네슘(Magnesium Sulfate) 0.1
황산망간(Manganese Sulfate) 0.05
인산이칼륨(Dipotassium Phosphate) 2.0
한천(Agar) 15.0
번호 선발균주 열안정성(60℃) 항생제 내성물질 비고
1 W.W-2 0.29% 생존 Gentamicin, Cephalexin, Colistin, Zincbacitracin ◎
2 Lac-6 0.3×10-7% 생존 Cephalexin, Oxytetracycline, Zincbacitracin △
3 Lac-7 - Zincbacitracin ×
4 Lac-8 0.5×10-6% 생존 Colistin, Zincbacitracin △
5 Lac-9 0.9×10-6% 생존 Erythromycin, Zincbacitracin △
6 Lac-10 0.4×10-6% 생존 Gentamicin, Erythromycin, Zincbacitracin △
실시예 2: 선별한 균주의 동정
선별한 균주의 계통분류학적인 위치를 확인하기 위하여 16S 리보솜 RNA 유전자(16S ribosomal RNA gene)의 내부 전사 간격자(internal transcribed spacer) 1, 5.8S 리보솜 RNA 유전자 및 내부 전사 간격자 2를 포함하는 571 bp의 염기서열을 분석하였다. 선별한 균주로부터 16S rDNA 분절 5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'(서열번호 2)을 프라이머 세트로 PCR을 수행하여 증폭시킨 후, 증폭산물을 정제하여 자동염기서열 분석장치(Applied Biosystems model 373A automatic sequencer)와 분석키트(BigDye Terminator Cycle Sequencing kit, Perkin-Elmer Applied Biosystems)를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 최종 선별한 균주의 16S rDNA를 유전자은행의 블라스트 프로그램을 이용하여 상동성을 분석한 결과 표준균주인 락토코쿠스 락티스와 높은 상동성을 나타내는 것을 확인하였다(서열번호 1; 도 2). 또한, 다양한 생화학적 방법을 이용하여 분리된 젖산을 분석한 결과, 표준균주인 락토코쿠스 락티스와 높은 유사성을 갖는 것을 확인할 수 있었다(표 3). 따라서, 본 발명의 균주는 락토코쿠스 락티스와 높은 상동성을 갖는 것으로 최종 확인되었으며, 본 발명의 젖산균 균주를 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2로 동정 및 명명하였으며, 이를 대전광역시 유성구 과학로 125에 위치한 한국생명공학연구원 생명자원센터(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 2012년 7월 6일자로 기탁하고, 수탁번호 KCTC 12237BP를 부여받았다.
Figure pat00001
실시예 3: 내산성 시험
상기 실시예 1에서 분리하여 선별한 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2 균주를 멸균된 MRS 액체배지에 접종하였다. 30℃에서 24시간 동안 배양 후 9000 rpm에서 25분간 원심분리하여 균주를 회수하였다. 이후, HCl로 pH를 3.0으로 조절한 MRS 액체배지에 회수한 분리 균주를 1.4×109 CFU/ml 농도로 접종하여 30℃에서 90분간 배양하였다. KR-W.W-2 균주 접종 후 90분간 배양하면서 30분마다 각각의 시료를 회수하여 멸균 생리 식염수에 희석하고 MRS 평판배지에 도말한 다음 30℃에서 48시간 동안 배양한 후 평판배지 위의 집락 수를 계수하여 생존 생균 수를 측정하였다(표 4).
Figure pat00002
실시예 4: 내담즙성 시험
상기 실시예 1에서 분리하여 선별한 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2 균주의 내담즙성을 시험하기 위하여, 황소담즙(oxgall)을 각각 1, 2, 3 및 4% 포함하는 MRS 배지를 제조하여 인공 담즙액으로 사용하였다. 담즙은 소장의 상부에서 분비되어 섭취된 지질식품의 소화, 흡수를 촉진하고, 미생물에 대해 세제와 유사한 작용을 함으로써 지방과 지방산으로 구성되어있는 미생물의 세포막에 영향을 주어 미생물 살균작용을 하는 물질이다. 따라서, 담즙산에 대한 내성은 위에서의 산성조건에 대한 저항성과 더불어 프로바이오틱스 미생물이 갖추어야 할 기본적인 특성 중 하나이다.
본 발명의 분리된 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2 균주를 30℃에서 24시간 동안 배양한 후 9000 rpm에서 25분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체를 0.01M의 인산완충염용액(phosphate buffered saline; PBS)로 2회 세척하여 상등액과 동량으로 1 내지 4% 황소담즙을 포함하는 MRS 액체배지를 첨가하여 30℃에서 3시간 동안 배양하였고, 이후 0.85% 염완충액으로 단계적으로 희석하여 MRS 한천 평판배지에 도말하고 생육하는 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2 균주의 집락 수를 측정하여 생존율을 산출하였다. 그 결과, 담즙액을 처리한 후 초기 접종균수에 비해 생균 수가 감소하는 경향을 보이기는 하나 내담즙성을 소유한 것으로 판단되었다(표 5).
Figure pat00003
실시예 5: 락토코쿠스 락티스 KR -W.W-2 균주의 배양
본 발명에 사용한 젖산균 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2 균주는 1차적으로 MRS 액체배지를 사용하여 배양하였고, 2차 본 배양은 탈지우유를 6 내지 8% 포함하는 배지에 1% 농도로 접종한 후 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 이후 실험에서 사용된 배양액은 상기 균주의 배양물을 10,000 rpm으로 원심분리하여 상등액을 회수한 후 0.45 μm 필터로 여과하여 수득하였다.
실험예 1: 어류 세균성 병원균에 대한 항균활성
상기 실시예를 통해 분리, 선별 및 동정한 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2 균주의 어류 세균성 병원균에 대한 항균활성을 확인하기 위하여, 대표적인 어류 세균성 병원균인 스트렙토코커스 이니애, 비브리오 불니피쿠스 및 비브리오 앙구일라룸에 대한 항균활성을 측정하였다. 상기 분리한 균주를 MRS 액체배지에 48시간 동안 진탕배양하고 10,000 rpm으로 원심분리하여 상등액을 회수한 후, BHI+1% NaCl agar, NB+0.5% NaCl agar, Marine agar에 1.4×109 ml/CFU의 상기 어류병원균 균주를 0.5% 접종하여 배지와 균일하게 혼합한 후 페트리접시에 굳혔다. 그리고 페이퍼 디스크에 배양이 끝난 본 발명의 분리균주의 상등액을 100 μl 분주한 후 수분을 건조시켜 미리 병원균주가 분주된 배지에 올려주고 4℃에서 1시간 동안 성분이 배지에 흡습되도록 방치한 후 25℃에서 배양하여 페이퍼 디스크 주위에 병원균의 활성 저해로 생성되는 환의 크기를 측정하였다. 그 결과, 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2 균주의 배양액이 스트렙토코커스 이니애, 비브리오 불니피쿠스 및 비브리오 앙구일라룸에 대한 뛰어난 항균활성을 나타내는 것을 확인하였다(표 6, 도 3 내지 5).
따라서, 본 발명의 KR-W.W-2 균주 및 이의 배양액은 어류 세균성 병원균에 대한 항균활성을 나타내므로 이에 대한 항균용 조성물로 활용가능하며, 특히 내산성 및 내담즙성이 뛰어난 균주를 선별하였으므로, 사료 첨가제로 사료에 혼합하여 양식 어류에 급이할 수 있음을 확인하였다.
Figure pat00004
한국생명공학연구원 생물자원센터 KCTC12237BP 20120706
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Lactococcus lactis KR-W.W-2 as a novel strain with antibacterial activity and use thereof <130> PA121116/KR <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 494 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactococcus sp. KR-W.W-2 <400> 1 gctggcggcg tgcctaatac atgcaagttg agcgctgaag gttggtactt gtaccgactg 60 gatgagcagc gaacgggtga gtaacgcgtg gggaatctgc ctttgagcgg gggacaacat 120 ttggaaacga atgctaatac cgcataaaaa ctttaaacac aagttttaag tttgaaagat 180 gcaattgcat cactcaaaga tgatcccgcg ttgtattagc tagttggtga ggtaaaggct 240 caccaaggcg atgatacata gccgacctga gagggtgatc ggccacattg ggactgagac 300 accggcccaa actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tcggcaatgg acgaaagtct 360 gaccgagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg ttttcggatc gtaaaactct gttggtagag 420 aagaacgttg gtgagagtgg aaagctcatc aagtgacggt aactacccag aaagggacgg 480 ctaactacgt gcca 494 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s rRNA fragment <400> 2 tccgtaggtg aacctgcgg 19

Claims (8)

  1. 기탁번호 KCTC 12237BP의 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) KR-W.W-2 균주.
  2. 기탁번호 KCTC 12237BP의 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물.
  3. 기탁번호 KCTC 12237BP의 락토코쿠스 락티스 KR-W.W-2 균주를 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 조성물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 조성물은 스트렙토코커스(Streptococcus) 또는 비브리오(Vibrio)에 대해 항균활성을 갖는 것인 조성물.
  5. 제2항의 항균 조성물 또는 제3항의 프로바이오틱스 조성물을 유효성분으로 포함하는 어류 양식용 사료 첨가제.
  6. 제5항의 사료 첨가제를 포함하는 어류 양식용 사료.
  7. 제6항의 사료를 양식중인 어류에 급이하는 단계를 포함하는 양식 어류의 병원균에 의한 질병을 예방하는 방법.
  8. 제2항의 항균 조성물을 어류 양식장에 살포하는 단계를 포함하는 양식 어류의 병원균에 의한 감염을 예방하는 방법.
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