KR20120125359A - 항알레르기용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 상승적으로 항알레르기 효과(화분증 등의 알레르기 증상을 억제하는 효과)를 가진 유산균 유래의 조성물, 이 조성물을 함유하는 식품이나 애완동물 사료에 관한 것으로, 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주, KT-23주 또는 KT-25주의 균체와, 락토바실러스속, 비피도박테리움속, 류코노스톡속, 엔테로코커스속 및 페디오코커스속 등에 속하는 다른 유산균의 생균, 사균 또는 그 균체 처리물을 균체량 환산으로 99:1 ~ 50:50, 바람직하게는 99:1 ~ 75:25의 비율로 함유하는 항알레르기 작용을 가진 조성물을 조제할 수 있다.

Description

항알레르기용 조성물{ANTI-ALLERGIC COMPOSITION}
본 발명은 2종 이상의 특정 유산균을 이용한 상승적으로 항알레르기 작용을 가진 조성물과 그 제조 방법, 상기 조성물을 함유하는 의약품, 식품, 영양보조식품, 사료 등에 관한 것이다．
B세포나 T세포 등의 증식이나 활동을 조절하는 사이토카인을 생산하고, 면역 시스템을 제어하는 T세포는 헬퍼 T세포(Th)라 하고, 그 사이토카인의 생산 패턴에서 1형 헬퍼 T세포(Th1세포)와 2형 헬퍼 T세포(Th2세포)의 2종류로 분류되며, Th1세포는 IFN-γ, IL-2 등을 생산하여 세포성 면역을 활성화하고, Th2세포는 IL-4, IL-5 등을 생산하고, 액성 면역을 활성화하는 것이 알려져 있다. 소위 면역 밸런스란 일반적으로 이 Th1세포와 Th2세포 간의 밸런스를 가리키며, 예를 들면 환자의 알레르기 상태를 나타내는 지표 등으로 널리 이용되어 있다.
알레르기란 Th1/Th2 밸런스가 깨져서 Th2측으로 비정상적으로 기울면, 본래 무해한 외래 항원에 대해 면역계가 과잉 반응함으로써, 화분증이나 비염, 피부염 등의 알레르기 제증상이 발증하는 질환으로, 반응 기제의 차이에 따라 I형부터 IV형의 4개의 형으로 분류된다. 일본에서는 진드기, 먼지 등의 집먼지에 의한 통년성 알레르기성 비염과 삼나무 꽃가루 등에 의한 계절성 알레르기성 비염으로 대표되는 I형 알레르기 환자수가 현저히 증가하고 있으며, 앞으로도 추가적인 환자의 증가가 우려되고 있다.
I형 알레르기는 주로 항원과 결합한 IgE에 의해 비만세포가 자극되고, 히스타민 등의 화학전달물질(chemical mediator)을 방출함으로써 발증되는 알레르기이다. 체내에 침입한 꽃가루나 집먼지는 항원으로 인식되고, 그것들에 대한 특이적 IgE 항체가 생산된다. 특이적 IgE 항체는 비만세포나 혈중의 호염기구 표면의 Fc리셉터에 결합하여 감작된 상태가 된다. 그 후, 항원이 다시 체내에 침입하면, 항원은 IgE 항체와 결합하고, 항원-항체 복합체가 형성되어 탈과립을 일으키며, 과립 중의 히스타민이나 로이코트리엔 등의 화학전달물질이 방출되고, 이러한 작용이 알레르기 증상이 되어 나타난다.
이러한 알레르기 증상에 대하여 이용되는 약품으로는 항히스타민제, 로이코트리엔 길항약, 트론보키산 길항약, Th2 사이토카인 저해약, 메디에이터 유리 억제제, 스테로이드약 등이 있다. 그러나, 예를 들면 항히스타민제는 부작용으로 졸음이나 갈증이 나는 경우가 있고, 로이코트리엔 길항약의 부작용으로는 혈구 감소나 위장장해, 메디에이터 유리 억제제의 부작용으로는 위장장해나 방광염 증상 등이 알려져 있는 등, 이들 약품은 반드시 안전하다고는 할 수 없다.
이러한 배경 하에 최근에는 면역 밸런스를 조절하고, 항알레르기 작용을 가진 유산균이 안전성이 높은 항알레르기 소재로 주목 받고 있다. 예를 들면 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스(L. brevis), 락토바실러스 부치네리(L. buchneri), 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 델브루에키이(L. delbrueckii), 락토바실러스 퍼멘툼(L. fermentum), 락토바실러스 헬베티커스(L. helveticus), 락토바실러스 케피어(L. kefir), 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus), 락토바실러스 살리바리우스(L. salivarius), 스트렙토코커스 서모필러스(Streptococcus Thermophillus), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 락토코커스 플란타룸(L. plantarum), 락토코커스 라피노락티스(L. raffinolactis), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 류코노스톡 메센테로이데스(L. mesenteroides), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) 또는 엔테로코커스 페시움(E. faecium)에서 선택되는 유산균의 균체를 유효 성분으로 하는 IgE 항체 생산 억제제(특허문헌 1 참조)나, 인간 유래의 비피더스균, 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 브레브(B. breve), 비피도박테리움 롱검(B. longum), 비피도박테리움 비피덤(B. bifidum)을 유효 성분으로 하는 항알레르기제(특허문헌 2 참조)나, 인간의 장내 세균군으로부터 분리된 유산균, 엔테로코커스 페칼리스(E. faecalis)(AD101주), 락토바실러스 루테리(L. reuteri)(AD0002주)의 균체를 유효 성분으로 하는, 히스타민 유리 억제 효과를 가진 I형 알레르기 억제제(특허문헌 3 참조)나, 락토바실러스 파라카제이를 유효 성분으로 함유하는 항알레르기 기능을 가진 음식물(특허문헌 4 참조)이 보고되었다.
또한, 락토바실러스 델브루에키이(L. delbrueckii), 락토바실러스 아시도필루스(L. acidophilus), 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 퍼멘툼, 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 람노서스, 락토코커스 락티스 및 스트렙토코커스 서모필러스(S. Thermophilus)로 이루어지는 군에서 선택되는 3 ~ 8종의 유산균과 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)와의 혼합 배양물 또는 이 혼합 배양물에 유래하는 혼합 균체 또는 배양 상청액을 함유하는 면역 촉진용 조성물(특허문헌 5 참조)이나, 장관면역 또는 1형 헬퍼 T세포를 부활(賦活)시키는 유산균 엔테로코커스 페시움을 포함하여 이루어지는 항음식물 알레르기제(특허문헌 6, 특허문헌 7 참조)나, 유포자 유산균인 바실러스 코아규란스(Bacillus coagulans)를 유효 성분으로 하는 항알레르기제(특허문헌 8 참조)나, 식물 유래의 락토바실러스속에 속하는 유산균, 식물 유래의 류코노스톡속에 속하는 유산균 및 식물 유래의 페디오코커스속에 속하는 유산균 중 적어도 하나 이상의 유산균의 생균, 사균 또는 그 균체 처리물을 유효 성분으로 하는 항알레르기제(특허문헌 9 참조)나, 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 플란타룸, 락토코커스 락티스 서브스피시스 락티스(L. lactis subsp. lactis), 및 락토코커스 락티스 서브스피시스 크레모리스(L. lactis subsp. cremoris)로 이루어지는 여러 종류의 유산균의 균체 또는 균체 성분을 함유하여 이루어지는 인터페론 감마 발현 유도 작용을 가진 발효유(특허문헌 10 참조)나, 락토바실러스 플란타룸의 배양물을 유효 성분으로 하는 항알레르기제(특허문헌 11 참조)가 보고되었다.
그리고, 면역 부활 작용 및/또는 알레르기 억제 작용을 갖고, 또한 위액 내성을 가진 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) (특허문헌 12 참조)나, 면역 조절 작용을 가지는 것을 특징으로 하는 스트렙토코커스 서모필러스 유산균(특허문헌 13 참조)이나, 면역 부활 작용, 항알레르기 작용을 가진 락토바실러스 파라카제이, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 가세리(L. gasseri) 및 락토바실러스 살리바리우스에서 선택되는 유산균(특허문헌 14 참조)이나, 면역 세포를 자극하여 항알레르기의 사이토카인 농도를 분비하는 락토바실러스 아시도필루스 PM-A0002, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 살리바리우스, 락토바실러스 조니소니(L. johnsonii), 락토바실러스 아시도필루스 PM-A0013(특허문헌 15 참조)이나, 높은 IgE 항체 생산 억제 작용을 갖고, 항알레르기 작용을 가진 류코노스톡 메센테로이데스에 속하는 유산균을 유효 성분으로 함유하는 항알레르기제(특허문헌 16 참조)나, 락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus), 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 아시도필루스 또는 그 세포 표층 또는 조(粗)펩티도글리칸으로 이루어지는 꽃가루 알레르기 증상의 개선제(특허문헌 17 참조)나, 락토바실러스 파라카제이의 균체와 비피도박테리움 비피덤의 균체를 함유하는 면역 밸런스 조절용 조성물(특허문헌 18 참조)이나, 면역 부활 작용 및/또는 알레르기 억제 작용을 갖고, 또한 위액 내성을 가진 락토바실러스 브레비스(특허문헌 19 참조)나, 락토바실러스 델브루에키이, 엔테로코커스 듀란스(E. durans), 류코노스톡 메센테로이데스(L. mesenteroides)를 함유하는 항알레르기용 조성물(특허문헌 20 참조)이나, 락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus)를 함유하는 항알레르기용 조성물(특허문헌 21 참조)이 보고되었다.
특허문헌 1: 일본 특허 공개 평성 9-2959호 공보 특허문헌 2: 일본 특허 공개 평성 10-309178호 공보 특허문헌 3: 일본 특허 공개 2000-95697호 공보 특허문헌 4: 일본 특허 공개 2005-137357호 공보 특허문헌 5: 일본 특허 공개 2005-68092호 공보 특허문헌 6: 일본 특허 공개 2006-67881호 공보 특허문헌 7: 일본 특허 공개 2006-104107호 공보 특허문헌 8: 일본 특허 공개 2007-55986호 공보 특허문헌 9: 일본 특허 공개 2007-70249호 공보 특허문헌 10: 일본 특허 공개 2007-117031호 공보 특허문헌 11: 일본 특허 공개 2007-126365호 공보 특허문헌 12: 일본 특허 공개 2008-54556호 공보 특허문헌 13: 일본 특허 공개 2008-61512호 공보 특허문헌 14: 일본 특허 공개 2008-99632호 공보 특허문헌 15: 일본 특허 공개 2008-169198호 공보 특허문헌 16: 일본 특허 공개 2008-231094호 공보 특허문헌 17: 일본 특허 공개 2008-255084호 공보 특허문헌 18: 일본 특허 공개 2009-57346호 공보 특허문헌 19: 일본 특허 공개 2009-112232호 공보 특허문헌 20: 일본 특허 공개 2009-142266호 공보 특허문헌 21: 일본 특허 공개 2009-209132호 공보
본 발명의 과제는 상승적으로 항알레르기 효과(화분증 등의 알레르기 증상을 억제하는 효과)를 가진 유산균 유래의 조성물, 이 조성물을 함유하는 식품과 애완동물 사료 등을 제공하는 것에 있다.
알레르기 증상을 억제하기 위해서는, 면역 밸런스를 Th1형 우위로 유도하는 것이 효과적이며, 일반적으로 유산균은 Th1형 우위로 유도하는 활성을 가진다고 한다. 본 발명자들이 알아낸 Th1형 우위로 유도하는 활성을 가진 유산균 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus) KT-11주(FERM BP-11332)에 있어서의 상기 활성을 보다 우수하게 하기 위해서 열심히 연구한 결과, 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주의 균체와, 락토바실러스(Lactobacillus)속, 비피도박테리움(Bifidobacteriumu)속, 류코노스톡(Leuconostoc)속, 엔테로코커스(Enterococcus)속 및 페디오코커스(Pediococcus)속 등에 속하는 다른 유산균의 생균, 사균 또는 그 균체 처리물을 특정 비율로 사용함으로써, Th1형 세포 혹은 Th1형 세포로부터 분비되는 사이토카인의 양이 상승적으로 증가하는 것을 알아내어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉 본 발명은, (1) 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus) KT-11주(FERM BP-11332), 락토바실러스 크리스파투스 KT-23주(FERM BP-11333) 및 락토바실러스 크리스파투스 KT-25주(FERM BP-11334)에서 선택되는 1 또는 2 이상의 균주의 생균, 사균 또는 그 균체 처리물과, 다른 유산균의 생균, 사균 또는 그 균체 처리물을 균체량 환산으로 99:1 ~ 50:50의 비율로 함유하는 것을 특징으로 하는 항알레르기 작용을 가진 조성물과, (2) 균체량 환산으로 99:1 ~ 75:25의 비율로 함유하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 기재의 조성물과, (3) 다른 유산균이 락토바실러스(Lactobacillus)속, 비피도박테리움(Bifidobacterium)속, 류코노스톡(Leuconostoc)속, 엔테로코커스(Enterococcus)속 및 페디오코커스(Pediococcus)속의 유산균으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 유산균인 것을 특징으로 하는 상기 (1) 또는 (2) 기재의 조성물과, (4) 락토바실러스속의 유산균이 락토바실러스 파라카제이(L.paracasei), 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 브레비스(L. brevis), 락토바실러스 불가리쿠스(L.bulgaricus), 락토바실러스 람노서스(L.rhamnosus), 락토바실러스 플란타룸(L.plantrum)으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 유산균인 것을 특징으로 하는 상기 (3) 기재의 조성물과, (5) 사균이 완충액 중에서 가열처리된 균체인 것을 특징으로 하는 상기 (1) ~ (4) 기재의 조성물과, (6) 균체 처리물이 유산균 유래의 펩티도글리칸인 것을 특징으로 하는 상기 (1) ~ (4) 기재의 조성물과, (7) 항알레르기 작용이 인터페론-감마(IFN-γ) 생산능을 촉진하는 작용인 것을 특징으로 하는 상기 (1) ~ (6) 기재의 조성물과, (8) 항알레르기 작용이 IL-12p70 생산능을 촉진하는 작용인 것을 특징으로 하는 상기 (1) ~ (7) 기재의 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 (9) 상기 (1) ~ (8) 기재의 항알레르기 작용을 가진 조성물을 함유하는 의약품과, (10) 상기 (1) ~ (8) 기재의 항알레르기 작용을 가진 조성물을 함유하는 음식물 또는 영양보조식품과, (11) 상기 (1) ~ (8) 기재의 항알레르기 작용을 가진 조성물을 함유하는 애완동물 사료 또는 애완동물용 영양보조식품과, (12) 상기 (1) ~ (8) 기재의 항알레르기 작용을 가진 조성물을 함유하는 사료와, (13) 공정 (a) ~ (c): (a) 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주(FERM BP-11332), 락토바실러스 크리스파투스 KT-23주(FERM BP-11333) 및 락토바실러스 크리스파투스 KT-25주(FERM BP-11334)에서 선택되는 1 또는 2 이상의 균주의 생균, 사균 또는 그 균체 처리물을 조제하는 공정; (b) 다른 유산균의 생균, 사균 또는 그 균체 처리물을 조제하는 공정; (c) 공정(a)에서 조제된 생균, 사균 또는 그 균체 처리물과, 공정(b)에서 조제된 생균, 사균 또는 그 균체 처리물을 균체량 환산으로 99:1 ~ 50:50의 비율로 배합하는 공정; 을 구비한 항알레르기 작용을 가진 조성물의 제조 방법과, (14) 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주(FERM BP-11332), 락토바실러스 크리스파투스 KT-23주(FERM BP-11333) 및 락토바실러스 크리스파투스 KT-25주(FERM BP-11334)에서 선택되는 1 또는 2 이상의 균주의 생균, 사균 또는 그 균체 처리물과, 다른 유산균의 생균, 사균 또는 그 균체 처리물을 균체량 환산으로 99:1 ~ 50:50의 비율로 함유하는 조성물을 항알레르기제의 조제에 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 상승적으로 항알레르기 효과를 가진 유산균 유래의 조성물, 이 조성물을 함유하는 의약품, 식품이나 영양보조식품, 애완동물 사료나 애완동물용 영양보조식품이나 사료를 제공할 수 있다.
도 1은, 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주의 첨가량을 검증한 실험 결과를 나타내는 도면이다. KT-11주 1% + 락토바실러스 플란타룸 99%의 비율에서도 항알레르기의 상승 효과가 인정되며, KT-11주를 75 ~ 99% 첨가했을 때에 상승 효과가 현저히 인정된다.
도 2는, 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주와 여러 가지 유산균에 의한 상승 효과를 검증한 실험 결과를 나타내는 도면이다. 몇 종류의 유산균을 각각 단독 첨가한 경우와 KT-11주와 병용한 경우를 비교하고, KT-11주가 다른 유산균의 항알레르기 효과를 상승적으로 높이는(Th1형 세포수가 상승적으로 증가한다) 것을 검증하였다.
도 3은, 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주와 유산균 균체 처리물(펩티도글리칸)의 병용효과를 검증한 실험 결과를 나타내는 도면이다. KT-11주의 사균체와, 락토바실러스 아시도필루스 유래의 펩티도글리칸을 병용한 경우도 항알레르기 효과가 상승적으로 높아지는 것을 검증하였다.
본 발명의 항알레르기 작용을 가진 조성물(항알레르기용 조성물)로는, 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주(FERM BP-11332: 평성 19년 12월 4일부터 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1초메 1반치 1 추오 제 6(우편번호 305-8566)의 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 기탁), 락토바실러스 크리스파투스 KT-23주(FERM BP-11333: 평성 19년 12월 4일부터 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1초메 1반치 1 추오 제 6(우편번호 305-8566)의 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 기탁) 및 락토바실러스 크리스파투스 KT-25주(FERM BP-11334: 평성 19년 12월 4일부터 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1초메 1반치 1 추오 제 6(우편번호 305-8566)의 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 기탁)에서 선택되는 1 또는 2 이상의 균주의 생균, 사균 또는 그 균체 처리물과, 다른 유산균의 생균, 사균 또는 그 균체 처리물을 균체량 환산으로 99:1 ~ 50:50의 비율로 함유하는 조성물이면 특별히 제한되지 않고, 또한 본 발명의 항알레르기 작용을 가진 조성물의 제조 방법으로는, (a) 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주(FERM BP-11332), 락토바실러스 크리스파투스 KT-23주(FERM BP-11333) 및 락토바실러스 크리스파투스 KT-25주(FERM BP-11334)에서 선택되는 1 또는 2 이상의 균주의 생균, 사균 또는 그 균체 처리물을 조제하는 공정; (b) 다른 유산균의 생균, 사균 또는 그 균체 처리물을 조제하는 공정; (c) 공정(a)에서 조제된 생균, 사균 또는 그 균체 처리물과, 공정(b)에서 조제된 생균, 사균 또는 그 균체 처리물을 균체량 환산으로 99:1 ~ 50:50의 비율로 배합하는 공정;을 구비한 방법이면 특별히 제한되지 않고, 또한 본 발명의 사용 방법으로는, 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주(FERM BP-11332), 락토바실러스 크리스파투스 KT-23주(FERM BP-11333) 및 락토바실러스 크리스파투스 KT-25주(FERM BP-11334)에서 선택되는 1 또는 2 이상의 균주의 생균, 사균 또는 그 균체 처리물과, 다른 유산균의 생균, 사균 또는 그 균체 처리물을 균체량 환산으로 99:1 ~ 50:50의 비율로 함유하는 조성물을 항알레르기제의 조제에 사용하는 방법이면 특별히 제한되지 않지만, 균체량 환산으로 99:1 ~ 75:25의 비율, 그 중에서도 75:25의 비율로 함유하는 조성물이 특히 우수한 항알레르기 작용에서의 상승 효과를 나타내는 점에서 바람직하다. 여기서, 균체량 환산이란, 유산균 배양액의 원심분리 후의 습균체 질량이나, 그 습균체를 건조시킨 건조균체 질량당으로 환산하는 것을 의미한다.
상기 항알레르기 작용으로는 인터페론-감마(IFN-γ) 생산능을 촉진하는 작용, IL-12p70 생산능을 촉진하는 작용, 인터로이킨4(IL-4) 생산능을 억제하는 작용, 면역 글로블린 E(IgE) 생산능을 억제하는 작용 등을 들 수 있고, 알레르기로는 화분증, 아토피성 피부염, 알레르기성 기관지 천식, 알레르기성 비염, 음식물 알레르기, 알레르기성 결막염, 알레르기성 두드러기 등의 알레르기 질환을 들 수 있다.
상기 다른 유산균으로는 락토바실러스속, 비피도박테리움속, 류코노스톡속, 엔테로코커스속, 페디오코커스속, 락토코커스속, 스트렙토코커스속 등에 속하는 유산균을 바람직하게 예시할 수 있고, 이들 유산균은 1종 또는 2종 이상 이용할 수 있다. 상기 락토바실러스속에 속하는 유산균으로는 락토바실러스 파라카제이, 락토바실러스 크리스파투스(단, KT-11주, KT-23주, KT-25주는 제외), 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 델브루에키이, 락토바실러스 퍼멘툼, 락토바실러스 살리바리우스, 락토바실러스 조니소니, 락토바실러스 헬베티커스, 락토바실러스 케피어 등을 예시할 수 있다. 상기 비피도박테리움속에 속하는 유산균으로는 비피도박테리움 인판티스, 비피도박테리움 브레브, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 비피덤 등을 예시할 수 있다. 상기 류코노스톡속에 속하는 유산균으로는 류코노스톡 락티스, 류코노스톡 메센테로이데스 등을 예시할 수 있다. 상기 엔테로코커스속에 속하는 유산균으로는 엔테로코커스 페칼리스, 엔테로코커스 듀란스, 엔테로코커스 페시움 등을 예시할 수 있다. 상기 페디오코커스속에 속하는 유산균으로는 페디오코커스 펜토사세우스 등을 예시할 수 있다. 상기 락토코커스속에 속하는 유산균으로는 락토코커스 락티스, 락토코커스 플란타룸, 락토코커스 라피노락티스 등을 예시할 수 있다. 상기 스트렙토코커스속에 속하는 유산균으로는 스트렙토코커스 서모필러스 등을 예시할 수 있다.
본 발명에 있어서의 유산균은 생균, 사균 또는 그 균체 처리물의 형태로 사용할 수 있다. 상기 생균, 사균 또는 그 균체 처리물로는 유산균 배양액이나, 유산균 배양액의 원심분리 후의 습균체나 그 세정물이나 그 동결건조분말, 가열 사균체, 건조 사균체, 균체벽 등의 균체 파쇄물이나 균체 용해물 등을 예시할 수 있고, 완충액 중에서 가열 처리한 사균체나, 균체를 동결건조 처리한 후에 완충액 중에서 가열 처리한 사균체나, 유산균 유래의 펩티도글리칸을 보다 적합하게 예시할 수 있다.
상기 본 발명의 항알레르기 작용을 가진 조성물은 의약품, 음식물 또는 영양보조식품, 애완동물 사료 또는 애완동물용 영양보조식품, 사료 등에 유리하게 이용할 수 있다. 본 발명의 항알레르기용 조성물을 알레르기 질환의 예방/치료용 의약품이나 영양보조식품으로 이용할 경우, 약학적으로 허용되는 일반적인 담체, 결합제, 안정화제, 부형제, 희석제, pH 완충제, 붕괴제, 가용화제, 용해 보조제, 등장제 등의 각종 조제용 배합 성분을 첨가할 수 있다. 또한, 이에 더하여, 공지된 항알레르기제와 병용할 수 있다. 이들 예방/치료약 등의 의약품은 경구적 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 즉 일반적으로 이용되는 투여 형태, 예를 들면 분말, 과립, 캅셀제, 시럽제, 현탁액 등의 제형으로 경구적으로 투여할 수 있고, 또는 예를 들면 용액, 유제, 현탁액 등의 제형화한 것을 주사 형태로 비경구 투여할 수 있는 것 외에, 스프레이제의 형태로 비공(鼻孔) 내 투여할 수도 있는데, 경구적으로 투여하는 것이 바람직하다. 투여량은 예방 혹은 치료라는 투여 목적, 뼈 질환의 종류나 중독도(重篤度), 환자의 연령 등에 따라 적절히 선정할 수 있다.
또한, 본 발명의 항알레르기용 조성물을 첨가한 알레르기 예방/치료에 이용되는 식품이나 식품 소재의 종류는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 요구르트, 드링크 요구르트, 주스, 우유, 두유, 주류, 커피, 홍차, 엽차, 우롱차, 스포츠 음료 등의 각종 음료나, 푸딩, 쿠키, 빵, 케이크, 젤리, 센베이 등의 구운 과자, 양갱 등의 화과자, 빙과, 추잉껌 등의 빵/과자류나, 우동, 메밀국수 등의 국수류나, 어묵, 햄, 어육 소세지 등의 어육 가공식품이나, 된장, 간장, 드레싱, 마요네즈, 감미료 등의 조미류나, 치즈, 버터 등의 유제품이나, 두부, 곤약, 기타 해산물조림, 만두, 크로켓, 샐러드 등의 각종 반찬을 들 수 있다. 이들 식품이나 식품 소재에는 공지된 항알레르기제를 병용해도 된다.
또한, 본 발명의 항알레르기용 조성물을 배합한 사료로는, 돼지, 소, 닭 등의 가축/가금이나, 개, 고양이 등의 애완동물, 양식 어개류의 사육 등에 유리하게 이용할 수 있고, 이러한 사료에는 공지된 항알레르기제를 병용해도 된다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 설명하는데, 본 발명의 기술적 범위는 실시예의 기재 내용에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1
(첨가 비율의 차이에 따른 항알레르기 효과의 상승작용)
첨가 비율의 차이에 따른 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주(FERM BP-11332)의 항알레르기 효과의 상승작용에 대해 이하에 나타낸다.
[균체 시료액의 조제]
락토바실러스 크리스파투스 KT-11주 또는 락토바실러스 플란타룸 JCM1149T를 MRS 액체 배지에 각각 접종하고, 37℃, 24시간 배양하였다. 배양 후, 원심분리 (2,000rpm, 10분간)로 균체를 회수하고, 증류수로 3번 세정하였다. 세정한 균체는 동결건조 처리후, 멸균 0.15M 염화나트륨-0.01M 인산완충액(PBS, pH 7.2)에 현탁하여 열처리(65℃, 30분간)한 것을 균체 시료액으로 하였다.
[파이어 판 세포 현탁액의 조제와 배양]
6주령 수컷 C3H/HeN계 마우스로부터 장관 파이어 판을 적출하고, 5% 소태아혈청(FBS), 100 U/mL 페니실린 G나트륨 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 황산염을 포함하는 RPMI-1640 배지 중에서 세포를 현탁하였다. 상기 배지에서 2번 원심세정(4℃, 1,300rpm, 15분간)한 후, 생세포수가 1.0 × 106 개/mL가 되도록 파이어 판 세포 현탁액을 조제하였다.
상기에서 조제한 파이어 판 세포 현탁액 1 mL를 각 구멍에 나누어 넣은 48구멍 평저(平底) 마이크로플레이트에, 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주와 락토바실러스 플란타룸 JCM1149T의 최종 첨가 농도가 합계 10 ㎍/mL가 되도록 배합 비율을 변경하여 조제한 균체 시료액 100 ㎕를 각 구멍에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 존재 하에 48시간 배양하였다.
[IFN-γ 생산 헬퍼 T세포수의 변화]
배양한 파이어 판 세포 현탁액을 1mMEDTA, 5% FBS를 포함하는 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)으로 원심세정(4℃, 12,000rpm, 3초간)하였다. 세정한 파이어 판 세포 1.0 × 106 개를 활성화 배지(10% FBS를 포함하는 RPMI-1640 배지에 브레펠딘 A 20 ㎍/mL, 이오노마이신 2 ㎍/mL 및 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 20 ng/mL를 포함) 1 mL에 현탁하고, 37℃, 5% CO2 존재 하에 4시간 배양하고, 세포 내에 사이토카인을 생산 및 축적시켰다.
배양한 파이어 판 세포를 HBSS로 원심세정(4℃, 12,000rpm, 3초간)한 후, 비오틴 표식 항마우스 CD4 항체를 1 ㎕ 첨가하고, 4℃에서 15분간 반응시켰다. 또한, 스트렙타아비딘-PE/Cy5를 1 ㎕ 첨가하여 4℃, 차광 하에 15분간 방치하였다. 반응액을 HBSS로 세정(4℃, 1,2000rpm, 3초간) 후, IntraPrep Reagent 1을 100 ㎕ 가하고, 실온 차광 하에 15분간 방치하여 세포를 고정화하였다. HBSS로 세정(4℃, 12,000rpm, 3초간) 후, IntraPrep Reagent 2을 100 ㎕ 가하고, 실온 차광 하에 15분간 반응시켜 막투과 처리를 수행하였다. 이어서, Th1 사이토카인의 하나인 IFN-γ을 측정하기 위해, 피코에리트린(PE) 표식 항마우스 IFN-γ항체를 1 ㎕ 가하고, 실온 차광 하에 15분간 방치한 후, 다시 HBSS로 원심세정(4℃, 12,000rpm, 3초간)하였다. 세정 후, Guava Personal Cell Function Analyzer(Guava PCA)를 이용하여 파이어 판 세포 중의 IFN-γ 생산 헬퍼 T세포수(IFN-γ + CD4 + 세포수)의 측정을 수행하였다.
도 1은, 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주와 락토바실러스 플란타룸 JCM1149T를 각 비율로 첨가했을 때의 파이어 판 세포 중에서의 IFN-γ 생산 헬퍼 T세포수의 상대값을 나타낸 것이다. 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주:락토바실러스 플란타룸 JCM1149T의 비가 0:100 일 때의 IFN-γ 생산 헬퍼 T세포수를 100%로 하였다. 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주:락토바실러스 플란타룸 JCM1149T의 비가 0:100 또는 100:0일 때의 IFN-γ 생산 헬퍼 T세포수 상대값과 비교하여, 그 비가 99:1, 90:10, 75:25일 때에 IFN-γ 생산 헬퍼 T세포수 상대값은 현저히 높아졌다. 이 점에서, 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주와 락토바실러스 플란타룸 JCM1149T를 99:1 ~ 50:50, 특히 99:1 ~ 75:25의 비율로 첨가하면, 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주의 항알레르기 작용의 상승 효과를 얻을 수 있을 것으로 생각된다.
실시예 2
(항알레르기 효과의 상승작용의 우위성)
락토바실러스 크리스파투스 KT-11주의 항알레르기 효과의 상승작용에 대해 이하에 나타낸다.
[균체 시료액의 조제]
표 1에 나타내는 공시균을 실시예 1과 같은 방법으로 각각 조제하고, 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주와 각 공시균을 75:25의 비율로 혼합하여 균체 시료액으로 하였다.
[표 1]
Figure pct00001
[파이어 판 세포 현탁액의 조제와 배양 및 IFN-γ 생산 헬퍼 T세포수의 변화]
파이어 판 세포 현탁액의 조제와 배양은 실시예 1과 같은 방법으로 조제 후, 파이어 판 세포 현탁액 1 mL를 각 구멍에 나누어 넣은 48구멍 평저 마이크로플레이트에, 각 농도로 조제한 균체 시료액 100 ㎕을 각 구멍에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 존재 하에 48시간 배양하였다. IFN-γ 생산 헬퍼 T세포수의 변화를 실시예 1과 같은 방법으로 측정하였다.
도 2는, 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주와 각 공시균을 첨가했을 때의 파이어 판 세포 중에서의 IFN-γ 생산 헬퍼 T세포수를 상대값으로 나타낸 것이다. 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주를 7.5 ㎍/mL만 첨가했을 때의 IFN-γ 생산 헬퍼 T세포수를 100%로 하였다. IFN-γ 생산 헬퍼 T세포수 상대값은 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주만 혹은 공시균주만을 첨가한 경우와 비교하여, 락토바실러스 크리스파투스 KT-11과 공시균을 모두 첨가한 경우에 있어서, 모두 현저히 높았다. 이 점에서 락토바실러스 크리스파투스 KT-11은 종래의 유산균보다 항알레르기 효과가 높은 것이 나타났다.
실시예 3
[균체 시료액의 조제]
표 1에 나타내는 공시균을 실시예 1과 같은 방법으로 각각 조제하고, 균체 시료액으로 하였다.
[대식세포 유사세포의 배양]
대식세포 유사세포인 J 774.1 세포는 5% FBS, 100 U/mL 페니실린 G나트륨 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 황산염을 포함하는 RPMI-1640 배지에 현탁 후, 멸균 플라스틱 샬레 내에서 37℃, 5% CO2 존재 하에서 융합 상태까지 배양한 것을 이용하였다. 1 × 106 개/mL로 조제한 J 774.1 세포 현탁액 1 mL를 나누어 넣은 48 구멍 평저 마이크로플레이트에, 최종 농도가 0 또는 1 ㎍/mL로 조제한 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주의 균체 시료액과 PBS에 용해시킨 시판하는 락토바실러스 아시도필루스 유래의 펩티도글리칸 용액(와코쥰야쿠공업주식회사 제조의 "펩티도글리칸 타입II")을 각각 100 ㎕씩 각 구멍에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 존재 하에 48시간 배양하였다. 배양 후, 4℃, 2000rpm으로 15분간 원심분리를 수행하고, 배양 상청액을 회수하였다.
[IL-12p70 생산량]
배양 상청액 중의 IL-12p70량은 효소면역측정법(ELISA)을 이용하여 측정하였다. 즉, 100 ㎍/mL의 항마우스 IL-12p70 항체와 4% 소혈청알부민(BSA)을 포함하는 0.1M 탄산완충액(pH 9.6) 100 ㎕를 96구멍 마이크로플레이트의 각 구멍에 나누어 넣고, 4℃에서 하룻밤 정치하였다. 0.05% Tween20을 포함하는 PBS(PBS-T)로 세정한 후, 0.4% BSA를 포함하는 0.1M 탄산완충액 300 ㎕을 가하고, 25℃에서 120분간 정치하였다. 다시 PBS-T로 세정한 후, 0.4% BSA와 2% 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 포함하는 PBS-T에서 최적 배율로 희석한 배양 상청액 100 ㎕을 각 구멍에 나누어 넣고, 25℃에서 120분간 반응시켰다. 또한, PBS-T로 세정한 후, 2% PVP을 포함하는 PBS-T에서 최적 배율로 희석한 비오틴 표식 항마우스 IL-12p70 항체 용액 100 ㎕를 각 웰에 나누어 넣고, 25℃에서 60분간 반응시켰다. 이어서, PBS-T로 세정한 후, 2% PVP를 포함하는 PBS-T에서 최적 배율로 희석한 겨자무과산화효소(HRP) 표식 스트렙타아비딘 용액 100 ㎕을 각 구멍에 나누어 넣고, 25℃에서 30분간 반응시켰다. TMB 용액 100 ㎕를 각 구멍에 나누어 넣고, 완전히 차광하여 25℃에서 30분간 반응시킨 후, 4N 황산 100 ㎕를 각 구멍에 나누어 넣어 반응을 정지시키고, 즉시 Bio-Rad 모델550 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 또, IL-12p70량은 기지(旣知) 농도의 IL-12p70에서 얻은 스탠다드 곡선으로부터 산출하였다.
도 3은, 시판 유산균 펩티도글리칸을 첨가하여 배양한 J 774.1 세포의 배양액 상청액 중의 Th1 사이토카인인 IL-12p70량을 나타낸 것이다. 결과의 유의성은, 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주를 첨가하지 않았을 때의 IL-12p70량을 기준으로 하여, 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주를 첨가한 경우를 스튜던트의 T검정으로 판정하였다. 시판 유산균 펩티도글리칸을 10 및 100 ㎍/mL를 첨가하여 배양한 J 774.1 세포의 배양액 상청액 중의 IL-12p70량은 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주를 첨가하지 않은 경우와 비교하여, 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주를 첨가했을 때에 상당히 증가하였다. 이 점에서, 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주는 유산균의 주요 세포벽 성분인 펩티도글리칸의 항알레르기 작용을 상승적으로 높이는 것으로 나타났다.
독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERMBP-11332 20071204 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERMBP-11333 20071204 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERMBP-11334 20071204

Claims (14)

  1. 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus) KT-11주(FERM BP-11332), 락토바실러스 크리스파투스 KT-23주(FERM BP-11333) 및 락토바실러스 크리스파투스 KT-25주(FERM BP-11334)에서 선택되는 1 또는 2 이상의 균주의 생균, 사균 또는 그 균체 처리물과, 다른 유산균의 생균, 사균 또는 그 균체 처리물을 균체량 환산으로 99:1 ~ 50:50의 비율로 함유하는 것을 특징으로 하는 항알레르기 작용을 가진 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    균체량 환산으로 99:1 ~ 75:25의 비율로 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    다른 유산균이 락토바실러스(Lactobacillus)속, 비피도박테리움(Bifidobacterium)속, 류코노스톡(Leuconostoc)속, 엔테로코커스(Enterococcus)속 및 페디오코커스(Pediococcus)속의 유산균으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 유산균인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    락토바실러스속의 유산균이 락토바실러스 파라카제이(L.paracasei), 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 브레비스(L. brevis), 락토바실러스 불가리쿠스(L.bulgaricus), 락토바실러스 람노서스(L.rhamnosus), 락토바실러스 플란타룸(L.plantrum)으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 유산균인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항에 있어서,
    사균이 완충액 중에서 가열 처리한 균체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항에 있어서,
    균체 처리물이 유산균 유래의 펩티도글리칸인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항에 있어서,
    항알레르기 작용이 인터페론-감마(IFN-γ) 생산능을 촉진하는 작용인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항에 있어서,
    항알레르기 작용이 IL-12p70 생산능을 촉진하는 작용인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항에 기재한 항알레르기 작용을 가진 조성물을 함유하는 의약품.
  10. 제 1 항 내지 제 8항에 기재한 항알레르기 작용을 가진 조성물을 함유하는 음식물 또는 영양보조식품.
  11. 제 1 항 내지 제 8항에 기재한 항알레르기 작용을 가진 조성물을 함유하는 애완동물 사료 또는 애완동물용 영양보조식품.
  12. 제 1 항 내지 제 8항에 기재한 항알레르기 작용을 가진 조성물을 함유하는 사료.
  13. 이하의 공정 (a) ~ (c)를 구비한 항알레르기 작용을 가진 조성물의 제조 방법.
    (a) 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주(FERM BP-11332), 락토바실러스 크리스파투스 KT-23주(FERM BP-11333) 및 락토바실러스 크리스파투스 KT-25주(FERM BP-11334)에서 선택되는 1 또는 2 이상의 균주의 생균, 사균 또는 그 균체 처리물을 조제하는 공정;
    (b) 다른 유산균의 생균, 사균 또는 그 균체 처리물을 조제하는 공정;
    (c) 공정(a)에서 조제된 생균, 사균 또는 그 균체 처리물과, 공정(b)에서 조제된 생균, 사균 또는 그 균체 처리물을 균체량 환산으로 99:1 ~ 50:50의 비율로 배합하는 공정;
  14. 락토바실러스 크리스파투스 KT-11주(FERM BP-11332), 락토바실러스 크리스파투스 KT-23주(FERM BP-11333) 및 락토바실러스 크리스파투스 KT-25주(FERM BP-11334)에서 선택되는 1 또는 2 이상의 균주의 생균, 사균 또는 그 균체 처리물과, 다른 유산균의 생균, 사균 또는 그 균체 처리물을 균체량 환산으로 99:1 ~ 50:50의 비율로 함유하는 조성물을 항알레르기제의 조제에 사용하는 방법.
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