KR20120050840A - 고 올레인산 땅콩 판별용 분자 마커 개발 - Google Patents

고 올레인산 땅콩 판별용 분자 마커 개발 Download PDF

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KR20120050840A
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양기웅
배석복
박장환
정찬식
심강보
황정동
하태정
이명희
신상욱
이병원
이영훈
박금룡
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대한민국(관리부서:농촌진흥청장)
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Abstract

본 발명은 고 올레인산 땅콩(Arachis hypogaea L.)을 판별할 수 있는 분자 마커, 상기 분자 마커를 이용하여 고 올레인산 땅콩을 판별하는 방법 및 상기 분자 마커를 포함하는 고 올레인산 땅콩 판별용 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍; 및 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머쌍을 포함하는 고 올레인산 땅콩 판별용 분자 마커, 이를 이용한 판별 방법 및 판별용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 분자 마커를 이용하는 경우, 고 올레인산 함유 땅콩의 품종을 정확하게 판별할 수 있으며, 교배 육종 과정에서 쉽게 고 올레인산 땅콩을 판별할 수 있어 효율성이 향상되며, 품종을 개량하는데 있어서 육성세대를 단축하는 효과를 제공할 수 있다.

Description

고 올레인산 땅콩 판별용 분자 마커 개발 {DEVELOPMENT OF MOLECULAR MARKERS TO SELECT HIGH OLEATE PEANUT(Arachis hypogaea L.)}
본 발명은 고 올레인산 땅콩(Arachis hypogaea L.)을 판별할 수 있는 분자 마커, 상기 분자 마커를 이용하여 고 올레인산 땅콩을 판별하는 방법 및 상기 분자 마커를 포함하는 고 올레인산 땅콩 판별용 키트에 관한 것이다.
콩과에 속하는 땅콩은 간식용, 조리용 기름, 제과 제빵 및 아이스크림용 부재료 등에 이용되는 작물로 국내에서는 1969 년부터 기호성, 식품 가공 특성 및 영양적 특성 등의 향상을 목적으로 품종개량 연구가 시작되어 지금까지 약 40여 품종이 개발되었다.
땅콩은 세계에서 4번째로 큰 유지작물로 열대지역과 아열대지역에서 많이 재배하고 있다. 땅콩에서 주가 되는 지방산 함량을 살펴보면 팔미트산 10 %, 올레인산 36 ~ 67 %, 리놀레익산 15 ~ 43 %를 함유하고 있다. Norden et al.(1987) 논문에 기재된 F435라는 땅콩은 올레인산을 80 % 정도 함유하고 있으며, 리놀레익산은 2 %로 매우 적게 함유하고 있다고 보고되었다. 이러한 결과는 F435가 고 올레인산을 함유하고 있다는 것을 나타낸다.
Figure pat00001
F435는 올레인산이 리놀레익산으로 변환될 때 작용하는 올레일 피씨 디새튜라아제(oleoyl-PC(phosphatidyl choline) desaturase) 유전자의 염기서열 이상으로 인하여 보다 많은 올레인산을 생성한다. 땅콩에서 올레일 피씨 디새튜라아제 유전자는 2가지가 있는데 AhFAD2A형과 AhFAD2B형이다. 그 중, AhFAD2A형의 염기서열은 일반 땅콩과 같은 염기서열을 나타내는 반면, AhFAD2B형의 염기서열은 아데닌(A)이 추가로 삽입되어져 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 AhFAD2B형의 염기서열이 삽입된 F435는 고 올레인산을 함유하고 있지만 아직까지 이를 이용하여 분자표지마커를 작성한 예가 없어, 고 올레인산 땅콩의 정확한 판별이 어렵다는 문제점이 있었다.
따라서 고 올레인산 땅콩의 정확한 판별 및 품종 개량적인 측면에 있어서 고 올레인산 땅콩을 쉽게 판별할 수 있는 분자표지마커의 개발이 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 정확하면서도 간편하게 고 올레인산 땅콩을 판별할 수 있는 분자 마커를 개발하고자 연구, 노력한 결과, 포인트 뮤테이션(point mutation)의 결과로 나타나는 고 올레인산 땅콩의 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)에 의한 염기서열차이(아데닌)를 이용하여 고 올레인산 땅콩을 판별할 수 있는 분자 마커를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 고 올레인산 땅콩 판별용 분자 마커를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한 본 발명은 상기 분자 마커를 이용한 DNA 증폭을 통해 고 올레인산 땅콩을 판별하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
마지막으로 본 발명은 상기 분자 마커를 이용한 고 올레인산 땅콩을 판별용 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은
서열번호 3 및 4의 프라이머쌍; 및
서열번호 5 및 6의 프라이머쌍
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머쌍을 포함하는 고 올레인산 땅콩 판별용 분자 마커을 제공한다.
또한 본 발명은 (1) 판별하고자 하는 땅콩 시료의 DNA를 추출하는 단계; (2) 상기 추출된 DNA를 주형으로 하고, 상기 분자 마커를 프라이머로 이용하여 DNA를 증폭하는 단계; 및 (3) 상기 증폭된 산물을 전기영동에 의해 분석하는 단계를 포함하는 고 올레인산 땅콩 판별 방법을 제공한다.
마지막으로 본 발명은 상기 분자 마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 고 올레인산 땅콩 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 분자 마커를 이용하는 경우, 고 올레인산 함유 땅콩의 품종을 정확하게 판별할 수 있으며, 식물 자체에서 고 올레인산 땅콩을 판별할 수 있기 때문에 식물이 종자를 맺은 후 확인하는 것보다 빠르게 선발할 수 있고, 교배 육종 과정에서 쉽게 고 올레인산 땅콩을 판별할 수 있기 때문에 이를 이용하여 세대를 더욱 빠르게 진전시켜 품종화하는 시간을 단축시킬 수 있어 효율성이 향상되며, 품종을 개량하는데 있어서 세대 단축 및 비용 절감의 효과를 제공할 수 있다.
도 1은 아라치스 하이포가에아(Arachis hypogaea) 델타 12 디새튜라아제 유전자의 전체 길이와 포지티프 컨트롤(positive control)로 사용된 영역 및 고 올레인산 특이 염기서열 부위를 이용한 SNP 분자 마커 작성 부위에 관한 모식도이다.
도 2는 고 올레인산 관련 땅콩 SNP 마커 작성에 관한 모식도이다.
도 3은 농촌진흥청 식량과학원 기능성작물부에서 보유하고 있는 땅콩 품종 중에서 고 올레인산 품종의 특이 유전자 부위를 확인할 수 있는 마커인지 확인한 그림으로 1: 참평, 2: 신광, 3: 미광, 4: 다광, 5: 풍광, 6: 고광, 7: 조평, 8: 풍산, 9: 선안, 10: F435를 나타낸다.
도 4는 조평 X F435(고 올레인산)의 F2 41 계통에서 고 올레인산 계통 판별을 나타낸 것으로, 위에서부터 포지티프 컨트롤(서열번호 1 및 2), 조평(일반 땅콩) 관련 분자 마커(서열번호 3 및 4) 및 F435(고 올레인산) 관련 분자 마커(서열번호 5 및 6)를 사용했을 때의 분리양상을 나타낸 사진이다.
도 5는 조평 X F435(고 올레인산)의 F2 41 계통에서 분자 마커와 NIR 분석 결과를 비교하여 판별 마커와의 일치성을 그래프로 도식화한 결과이다.
도 6은 조평 X F435(고 올레인산)의 F2 41계통에서 분자 마커와 가스크로마토그래피 분석의 일치성을 그래프로 도식화한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 고 올레인산 땅콩 F435의 올레일 피씨 디새튜라아제 유전자에 아데닌(A) 염기가 추가적으로 삽입되어 있다는 점을 이용한 고 올레인산 땅콩 품종 판별용 분자 마커를 제공한다. 구체적으로는 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍; 및 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머쌍을 포함하는 고 올레인산 땅콩 판별용 분자 마커를 제공한다.
특성(표지이름) 프라이머 염기서열(5’-3’)
Positive control (PC) 정방향, 서열번호 1
역방향, 서열번호 2		 5'-GGTGTCTATTGTGTTAGG-3'
5'-CCCTGGTGGATTGTTC-3'
Normal type
(AhFADSNP)		 정방향, 서열번호 3
역방향, 서열번호 4		 5'-ACACTTCGTCGCGGTG-3'
5'-TGCTTTGAACGTTCTCTTT-3'
F435 type
(AhFADSNPmut)		 정방향, 서열번호 5
역방향, 서열번호 6		 5'-CCAACACAGGTTCCCTAA-3'
5'-TTCCCTGTTAGAGTATATGG-3'
상기 서열번호 1과 2의 프라이머쌍은 포지티브 컨트롤로 DNA 추출 결과에 대한 정보를 제공한다. 즉, 상기 서열번호 1과 2는 올레일 피씨 디새튜라아제(Oleoyl-PC desaturase) 유전자의 염기서열에서 F435를 포함한 모든 종류의 땅콩에서 확인되는 염기서열을 이용하여 DNA 추출의 이상 유무를 확인할 수 있게 해주는 프라이머쌍이다.
상기 서열번호 3과 4, 또는 서열번호 5와 6은 고 올레인산인 F435를 판별할 수 있는 프라이머쌍이며, 상기 프라이머쌍을 이용하여 나타난 결과를 조합하면 보다 정확하게 고 올레인산 땅콩의 품종을 판별할 수 있다. 상기 서열번호 3과 4는 일반 땅콩 품종에서만 밴드가 나타나며, 고 올레인산 땅콩인 F435에서는 밴드가 나타나지 않는다. 또한 서열번호 5와 6은 일반 땅콩 품종에서는 밴드가 나타나지 않고, 고 올레인산 땅콩인 F435에서만 밴드가 나타나므로, 이를 이용하여 고 올레인산 땅콩을 쉽게 판별할 수 있다.
본 발명은 또한 땅콩의 올레일 피씨 디새튜라아제 유전자의 염기서열에서 고 올레인산 땅콩인 F435를 판별하기 위해, (1) 판별하고자 하는 땅콩 시료의 DNA를 추출하는 단계; (2) 상기 추출된 DNA를 주형으로 하고, 상기한 분자 마커를 프라이머로 이용하여 DNA를 증폭하는 단계; 및 (3) 상기 증폭된 산물을 전기영동에 의해 분석하는 단계를 포함하는 고 올레인산 땅콩 판별 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 고 올레인산 땅콩 판별 방법에서, 상기 땅콩 시료로부터 DNA를 추출하는 단계는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행할 수 있다. 예를 들면, 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 등을 이용하거나 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 고 올레인산 땅콩 판별 방법에서, 상기 분자 마커인 프라이머는 서열번호 3과 4 또는 서열번호 5와 6이 사용될 수 있고, 상기 프라이머쌍을 사용하여 나타난 결과를 조합하면 보다 정확하게 고 올레인산 땅콩의 품종을 판별할 수 있다.
본 발명에 따른 고 올레인산 땅콩 판별 방법에서, 상기 DNA의 증폭은 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, PCR(Polymerase Chain Reaction), 리가아제 체인 반응, 중합효소 리가아제 체인 반응, Gap-LCR, 리페어체인 반응, 3SR, NASBA 등을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 PCR을 이용한다.
상기 PCR을 이용하여 증폭하는 경우, 당업계에서 PCR 반응에 필요한 것으로 공지된 성분들을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액은 땅콩에서 추출된 DNA와 본 발명에 따른 분자 마커, DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물 등을 포함하고, 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl2, KCl 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 고 올레인산 땅콩 판별 방법은 상기 증폭된 DNA 산물을 전기영동에 의해 분석하는 단계를 포함한다. 상기 전기영동에 의한 분석 단계에서 증폭된 DNA 산물을 아가로오스 겔 또는 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하고, EtBr 등으로 염색한 후 밴드를 확인할 수 있다. 증폭된 DNA 산물을 확인하기 위한 전기영동 및 밴드의 확인은 당업계에서 공지된 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 고 올레인산 땅콩 판별 방법은 상기 전기영동에 의해 분석된 결과를 NIR(Near Infrared Spectroscopy) 분석 결과 또는 가스크로마토그래피 분석 결과와 비교하여 판별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 분자 마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 고 올레인산 땅콩 판별용 키트를 제공하며, 상기 키트는 DNA 중합효소 및 PCR 반응용 완충용액을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 고 올레인산 땅콩 판별용 키트에서 상기 분자 마커는 서열번호 3과 4 또는 서열번호 5와 6이 사용될 수 있고, 상기 프라이머쌍을 이용하여 나타난 결과를 조합하면 보다 정확하게 고 올레인산 땅콩의 품종을 판별할 수 있다.
본 발명에 따른 고 올레인산 땅콩 판별용 키트에서 DNA 중합효소는 예를 들어, Taq DNA 중합효소와 같은 열안정성 DNA 중합효소가 사용될 수 있으며, 상기 PCR 반응용 완충용액은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 공지된 조성을 가지며, 예를 들어, Tris-HCl, MgCl2, KCl 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 고 올레인산 땅콩 판별용 키트는 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동에 필요한 성분들을 더 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 고 올레인산 땅콩인 F435 관련 분자 마커의 제조
올레일 피씨 디새튜라아제 유전자에서 F435 관련 특이 염기서열(AF248739.1) 상의 SNP 부위를 PCR 증폭하는 프라이머쌍을 제작하였다(도 1, 도 2 및 표 2 참조). 고 올레인산 땅콩 F435는 올레일 피씨 디새튜라아제 유전자 염기서열 중 2,823 bp 부위에 A(아데닌)이 삽입되어 있음을 염기서열 확인으로 알 수 있었다. 제작된 PC, AhFADSNP 및 AhFADSNPmut 프라이머쌍은 올레일 피씨 디새튜라아제 유전자에서 각각 964 bp, 344 bp 및 229 bp의 PCR 산물을 증폭하도록 제작하였다.
올레일 피씨 디새튜라아제 유전자 염기서열에서 고 올레인산 땅콩 F435 특이 분자 마커의 확인을 위해 제작된 프라이머쌍
특성(표지이름) 프라이머 염기서열(5’-3’) 생산물 크기 (bp)
Positive control(PC) 정방향, 서열번호 1
역방향, 서열번호 2		 5'-GGTGTCTATTGTGTTAGG-3'
5'-CCCTGGTGGATTGTTC-3'		 (751-1715)
964
Normal type
(AhFADSNP)		 정방향, 서열번호 3
역방향, 서열번호 4		 5'-ACACTTCGTCGCGGTG-3'
5'-TGCTTTGAACGTTCTCTTT-3'		 344
F435 type
(AhFADSNPmut)		 정방향, 서열번호 5
역방향, 서열번호 6		 5'-CCAACACAGGTTCCCTAA-3'
5'-TTCCCTGTTAGAGTATATGG-3'		 229
< 실시예 2> 프라이머쌍의 특이성 검증
상기 실시예 1에서 제작한 프라이머쌍이 F435의 유전형질을 분석 가능한지 검증하기 위하여 PCR을 수행하였다.
(1) 식물재료
본 발명에 사용된 분자 마커가 고 올레인산 종자인 F435에만 나타나는 특이 분자 마커인지 확인하기 위해 농촌진흥청 국립식량과학원 기능성작물부에서 보유하고 있는 땅콩 품종 중 1: 참평, 2: 신광, 3: 미광, 4: 다광, 5: 풍광, 6: 고광, 7: 조평, 8: 풍산, 9: 선안, 10: F435를 이용하였다.
또한 조평 X F435의 교배에서 육성한 F2 41 계통을 이용하여 특이 분자 마커로 판별하였다. 2009 년 포장에서 재배한 개체에서 수확한 종자를 가지고 실험하였다.
(2) DNA 추출
실험에 사용될 땅콩의 DNA를 추출하기 위하여, 상기한 땅콩 품종의 어린 땅콩 잎 0.5 g을 막자사발에 넣고 액체질소를 이용하여 파쇄한 후 퀵프랩 버퍼(200 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS) 1.5 mL과 함께 튜브에 넣은 후, 60 ℃에 1시간 반응시켰다. 10,000 X g에서 10 분간 원심분리하여 얻어진 상층액 400 ㎕를 새 튜브에 넣고, 이소프로판올(isopropanol) 300 ㎕를 첨가하여 잘 섞은 후 -80 ℃에서 30 분간 반응시켰다. 반응 후 20,000 X g에서 10 분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 70 % 에탄올(ethanol)을 넣고 가볍게 씻어준 후 30 분간 건조하였다. 이후 DNA 추출 버퍼(10 mM NH4OAC, 0.25 mM EDTA) 150 ㎕를 첨가한 후 잘 섞어 주었다. 이를 60 ℃에서 1 시간 반응 후 10,000 X g에서 10 분간 원심분리하여 땅콩 DNA인 상층액 100 ㎕을 얻었다.
(3) SNP 분석을 위한 PCR
분자 마커를 이용하여 PCR 증폭을 실시하였다. 상기에서 얻어진 땅콩 DNA 시료는 각 100 ng을 사용하였으며, 포지티브 컨트롤(PC; 서열번호 1, 2), 일반 땅콩(AhFADSNP; 서열번호 3, 4)과 고 올레인산(AhFADSNPmut; 서열번호 5, 6)에 관련된 프라이머쌍을 각각 20 pmol 씩 사용하였다. PCR 증폭을 위해 중합효소(polymerase) 및 PCR 반응용 완충용액이 혼합되어 있는 (주)제넷바이오 premix(Cat. No. G2002)를 사용하여 PCR을 수행하였다.
상기 PCR 증폭 조건으로는 먼저 아라치스 하이포가에아 델타-12 디새튜라아제 유전자에서 일반 땅콩에 나타나는 밴드를 확인하기 위해 서열번호 3과 4를 이용하여 94 ℃에서 3 분 반응 후, 94 ℃에서 30 초, 53 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 30 초간 반응하는 사이클을 34 번 반복하였고, 마지막으로 72 ℃에서 5 분간 반응하였다. 이후 아라치스 하이포가에아 델타-12 디새튜라아제 유전자에 F435 종자 특이 밴드를 확인하기 위해 서열번호 5와 6를 이용하여 상기와 동일한 조건으로 반응을 수행하였다. PCR 증폭이 끝난 생산물을 1.2% 아가로스 겔(agarose gel) 상에서 전기영동하여 밴드를 확인하였다(EtBr 0.5 ㎍/ml, UV 상에서 확인). 품종에 따른 상기 밴드 분석 결과를 하기 표 3 및 도 3에 나타내었으며, 밴드 분석을 통한 조평 X F435 F2 41 계통의 유전자형 확인 결과를 하기 표 4 및 도 4에 나타내었다.
1
참평		 2
신광		 3
미광		 4
다광		 5
풍광		 6
고광		 7
조평		 8
풍산		 9
선안		 10
F435
PC + + + + + + + + + +
AhFADSNP + + + + + + + + + -
AhFADSNP
mut		 - - - - - - - - - +
+ : 밴드가 나타난 경우 - : 밴드가 나타나지 않은 경우
조평 X F435 F2 41 계통
계통명 type 계통명 type
1 cho type 22 Heterotype
2 cho type 23 cho type
3 cho type 24 F435 type
4 cho type 25 cho type
5 cho type 26 cho type
6 cho type 27 cho type
7 F435 type 28 cho type
8 cho type 29 F435 type
9 cho type 30 cho type
10 cho type 31 cho type
11 Heterotype 32 Heterotype
12 cho type 33 Heterotype
13 cho type 34 Heterotype
14 cho type 35 Heterotype
15 cho type 36 F435 type
16 cho type 37 Heterotype
17 cho type 38 F435 type
18 Heterotype 39 Heterotype
19 F435 type 40 cho type
20 cho type 41 cho type
21 cho type
상기 표 3 및 도 3의 결과에서 볼 수 있듯이, F435는 9 개의 다른 일반 땅콩 품종과는 다른 밴드 양상을 나타내어 본 발명의 프라이머쌍이 F435에 특이한 분자 마커임을 확인할 수 있었다.
또한 상기 표 4 및 도 4에 나타난 조평 X F435의 교배조합 41 계통을 이용한 분리양상을 확인한 결과, 고 올레인산 함유 계통 판별을 표현형으로 관측하지 않고도 상기 나타난 밴드만으로 쉽게 판별할 수 있었으며, 특히, 헤테로 형질을 나타내는 계통도 판별할 수 있었다. 41 계통에서 유전자형을 확인하여 본 결과 조평 type은 26 계통, 헤테로 type은 9 계통 그리고 F435 type은 6 계통으로 나타났다.
< 실시예 3> 고 올레인산 분자표지와 NIRs 및 가스크로마토그래피 분석결과와의 일치성 확인
상기 실시예 2에서 실시한 고 올레인산 분자 마커에 의한 품종 판별이 지방산 수준에서 정확히 일치하는지 확인하기 위하여 본 실시예 3에서 NIR 및 가스크로마토그래피 분석을 실시한 후 상기 실시예 2의 판별 결과와 비교하는 실험을 수행하였다.
NIR 이용 땅콩 지방산 감량선 작성 실험에 사용된 종자 샘플 41 점의 분쇄한 시료에 대하여 반은 지방추출 및 지방산 조성, 분쇄시료 NIR scanning에 이용하였고, 나머지 반은 NIR 검량선 작성 및 실측치 확인용으로 사용하였다. 조지방은 Auto-soxlet법(Buchi B-811)에 의해 추출하였고, 지방산 분석은 GLC-FID를 이용하였다. 검량선을 위한 NIR spectrum은 가시광선 및 근적외선 대역인 400 - 2,500 nm에서 NIR system model 6500(Silver spring, MD)을 사용하였다.
가스크로마토그래피를 이용한 측정은 시료를 마쇄한 후 60 ℃ 드라이 오븐(dry oven)에서 2 시간 동안 건조시켜 분석 시료로 이용하였으며 Soxhlet 지방 추출기를 이용하여 8 시간 동안 에스테르로 추출한 다음 에테르만을 증발시키고 잔량을 정량하여 조지방 함량을 측정하였고, 지방산 조성의 분석은 지방을 조사한 기름에서 0.5 ml을 채취하여 Na-methyate를 촉매로 하는 methaolysis법으로 에스터(ester)화한 다음 가스크로마토그래피를 분석하는 과정으로 수행하였다.
본 실험에서 추출된 지방산(Fatty acid)으로는 Palmitic(16:0), Stearic(18:0), Oleic(18:1), Linoleic(18:2), Arachidic(20:0), Eicosenoic(20:1), Behenic(22:0) 등이 있으며, 상기 지방산의 함량 및 수분함량, 지방함량 등을 측정하였다. 또한, 조평 X F435 교배조합 41계통에서 NIR 및 가스크로마토그래피 분석 결과가 분자표지마커를 통한 분석 결과와 일치하는지 확인하였다. 측정 결과를 하기 표 5, 6 및 도 5, 6에 나타내었다.
조평 X F435(고 올레인산)의 F2 41계통에서 분자 마커와 NIR 분석 결과를 비교하여
판별마커와의 일치성을 표로 나타낸 결과
계통명 Pal 16:0 Ste 18:0 ole
18:1		 lin
18:2		 ara
20:0		 eic
20:1		 beh
22:0		 수분함량 지방함량 type
1 9.50 3.01 57.63 29.09 1.78 1.31 3.83 4.48 46.26 cho type
2 9.92 3.00 55.50 31.82 1.85 1.22 3.54 4.24 48.16 cho type
3 10.33 2.19 56.35 31.19 1.39 1.33 3.38 4.58 46.94 cho type
4 10.78 2.78 54.24 32.64 1.81 1.18 3.57 4.52 45.94 cho type
5 11.38 2.61 49.77 36.30 1.65 1.30 3.85 4.80 42.96 cho type
6 10.28 3.35 53.04 32.52 2.07 1.34 3.88 4.58 45.02 cho type
7 6.23 3.16 83.99 5.86 1.93 1.54 3.75 4.51 43.74 F435 type
8 11.09 2.51 52.01 33.70 1.68 1.41 3.92 4.71 44.71 cho type
9 12.83 2.27 48.46 36.83 1.50 1.56 4.19 5.12 41.22 cho type
10 10.38 2.67 54.94 31.23 1.66 1.28 3.69 4.76 43.22 cho type
11 9.40 2.28 69.81 18.57 1.49 1.57 3.67 4.94 42.18 Heterotype
12 10.64 3.04 53.63 32.38 1.82 1.18 3.56 4.66 44.35 cho type
13 10.85 2.24 52.14 34.04 1.63 1.66 4.24 4.79 44.55 cho type
14 10.88 2.51 55.73 30.97 1.70 1.32 3.85 4.65 44.52 cho type
15 11.38 2.44 48.13 37.88 1.69 1.46 4.14 4.81 43.93 cho type
16 11.93 2.67 47.09 37.16 1.87 1.35 4.02 4.88 42.63 cho type
17 10.22 2.61 54.77 32.14 1.75 1.32 3.69 4.61 44.16 cho type
18 9.40 2.79 63.06 24.64 1.72 1.29 3.39 4.45 46.37 Heterotype
19 7.45 2.65 82.01 8.03 1.61 1.66 3.68 4.84 41.78 F435 type
20 10.85 3.11 50.93 34.26 1.76 1.13 3.58 4.52 46.62 cho type
21 11.56 2.38 50.86 35.12 1.54 1.24 3.48 4.78 43.92 cho type
22 11.28 2.33 60.20 26.87 1.32 1.37 3.93 5.12 39.86 Heterotype
23 10.87 2.70 54.65 32.19 1.71 1.29 3.63 4.56 45.59 cho type
24 8.15 2.89 79.35 9.97 1.62 1.56 3.74 4.80 43.12 F435 type
25 10.59 2.81 53.80 31.37 1.69 1.22 3.50 4.42 47.41 cho type
26 11.63 2.52 49.65 36.64 1.61 1.31 3.68 4.76 43.82 cho type
27 9.67 2.43 54.40 32.10 1.67 1.39 3.74 4.52 45.62 cho type
28 10.48 2.65 53.50 32.59 1.78 1.42 3.60 4.50 46.35 cho type
29 7.49 3.11 85.05 6.42 1.87 1.49 3.75 4.63 43.14 F435 type
30 11.44 2.30 53.04 34.66 1.47 1.24 3.60 4.71 44.50 cho type
31 10.35 2.91 54.79 31.97 1.73 1.09 3.32 4.49 45.97 cho type
32 10.15 2.39 58.25 28.13 1.77 1.49 3.80 4.64 44.80 Heterotype
33 9.75 2.76 61.92 24.70 1.73 1.32 3.53 4.63 44.97 Heterotype
34 9.52 2.33 64.69 23.32 1.67 1.50 3.71 4.58 44.47 Heterotype
35 10.79 2.00 57.48 29.17 1.48 1.51 3.97 4.82 42.18 Heterotype
36 7.33 2.79 81.36 9.26 1.64 1.61 3.73 4.44 44.99 F435 type
37 9.30 2.54 70.75 17.75 1.74 1.58 3.76 4.66 43.64 Heterotype
38 6.85 2.94 85.23 4.66 1.93 1.62 3.63 4.52 43.63 F435 type
39 8.15 2.66 71.80 16.51 1.78 1.49 3.63 4.30 47.08 Heterotype
40 9.49 2.59 62.43 24.69 1.67 1.39 3.57 4.61 44.13 cho type
41 10.03 2.53 55.38 31.98 1.65 1.22 3.47 4.39 46.66 cho type
조평 X F435(고 올레인산)의 F2 41계통에서 분자 마커와 가스크로마토그래피 결과를 비교하여 판별마커와의 일치성을 표로 나타낸 결과
계통명 Pal 16:0 Ste 18:0 ole
18:1		 lin
18:2		 ara
20:0		 eic
20:1		 beh
22:0		 지방함량 type
1 9.3 2.8 51.8 29.4 1.5 1.3 3.9 46.26 cho type
2 9.5 2.8 48.1 33.1 1.4 1.3 3.7 48.16 cho type
3 9.6 3.1 50.4 32.2 1.4 0.9 2.4 46.94 cho type
4 9.1 3.4 48.4 33.8 1.5 0.9 2.9 45.94 cho type
5 10.3 2.6 45.2 35.8 1.4 1.3 3.4 42.96 cho type
6 10.2 3.1 47.9 32.4 1.4 1.1 3.9 45.02 cho type
7 5.5 3.4 79.9 4.9 1.4 1.8 3.1 43.74 F435 type
8 9.7 2.9 46.7 34.3 1.5 1.4 3.4 44.71 cho type
9 10.2 2.3 45.0 35.1 1.6 1.6 4.1 41.22 cho type
10 9.1 2.8 51.7 30.3 1.4 1.4 3.3 43.22 cho type
11 7.6 2.0 68.6 16.2 1.2 1.6 2.8 42.18 Heterotype
12 10.3 3.0 46.2 33.0 2.1 2.0 3.4 44.35 cho type
13 9.0 2.5 48.2 32.9 1.4 1.7 4.3 44.55 cho type
14 9.6 3.5 48.0 32.5 1.6 1.3 3.6 44.52 cho type
15 9.5 3.2 43.6 37.2 1.6 1.2 3.8 43.93 cho type
16 9.7 2.8 44.2 36.2 1.5 1.4 4.1 42.63 cho type
17 9.6 3.1 48.1 32.9 1.8 1.1 3.5 44.16 cho type
18 9.1 2.6 57.0 25.6 1.6 1.5 2.6 46.37 Heterotype
19 5.9 2.5 81.5 5.0 1.1 1.8 2.3 41.78 F435 type
20 11.2 3.5 44.9 34.7 1.6 1.0 3.1 46.62 cho type
21 9.8 2.8 45.6 35.8 1.4 1.4 3.2 43.92 cho type
22 8.6 2.1 58.9 23.7 1.6 1.6 3.5 39.86 Heterotype
23 10.9 2.7 48.4 33.0 1.2 1.1 2.7 45.59 cho type
24 5.8 3.4 78.2 7.4 1.5 1.3 2.4 43.12 F435 type
25 9.4 4.2 47.3 32.7 1.8 1.1 3.4 47.41 cho type
26 9.5 3.0 43.6 37.7 1.4 1.3 3.5 43.82 cho type
27 10.3 3.0 48.5 32.9 1.4 1.1 2.8 45.62 cho type
28 9.4 2.8 48.1 33.3 1.4 1.3 3.6 46.35 cho type
29 5.4 3.3 81.3 4.6 1.4 1.5 2.5 43.14 F435 type
30 9.8 2.9 45.8 36.2 1.3 1.1 2.9 44.50 cho type
31 10.3 2.6 48.0 33.4 1.2 1.3 3.3 45.97 cho type
32 9.1 3.1 53.4 28.3 1.5 1.3 3.3 44.80 Heterotype
33 9.6 2.4 57.1 25.0 1.4 1.5 3.2 44.97 Heterotype
34 8.0 2.4 60.8 22.6 1.5 1.6 3.2 44.47 Heterotype
35 8.4 3.1 55.3 27.5 1.5 1.2 3.0 42.18 Heterotype
36 5.6 2.3 77.8 7.9 1.2 2.2 2.9 44.99 F435 type
37 7.1 2.8 68.2 16.0 1.4 1.6 2.9 43.64 Heterotype
38 5.5 3.1 81.0 4.1 1.4 1.9 2.9 43.63 F435 type
39 7.2 3.6 66.2 17.4 1.4 1.5 2.7 47.08 Heterotype
40 8.8 2.7 57.4 25.2 1.3 1.5 3.1 44.13 cho type
41 10.2 2.9 49.0 33.1 1.4 1.0 2.5 46.66 cho type
상기 실험에서 본 발명의 분자 마커를 통한 품종 판별 결과가 지방산 수준에서 일치하는지 확인하기 위해 NIR(Near Infrared Spectroscopy) 및 가스크로마토그래피 분석 결과를 확인해 보았다. 그 결과, 고 올레인산 관련 분자표지마커를 통한 판별 결과(실시예 2)는 NIR 및 가스크로마토그래피를 이용한 판별 결과(실시예 3)와 정확하게 일치하였으며, 이러한 결과를 통해 교배 조합에서 분자 마커를 이용하는 경우 고 올레인산 함유 계통을 쉽게 판별할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> DEVELOPMENT OF MOLECULAR MARKERS TO SELECT HIGH OLEATE PEANUT(Arachis hypogaea L.)) <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC Primer - Forward <400> 1 ggtgtctatt gtgttagg 18 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC Primer - Reverse <400> 2 ccctggtgga ttgttc 16 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AhFADSNP Primer - Forward <400> 3 acacttcgtc gcggtg 16 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AhFADSNP Primer - Reverse <400> 4 tgctttgaac gttctcttt 19 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AhFADSNPmut Primer - Forward <400> 5 ccaacacagg ttccctaa 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AhFADSNPmut Primer - Reverse <400> 6 ttccctgtta gagtatatgg 20

Claims (7)

  1. 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍; 및
    서열번호 5 및 6의 프라이머쌍
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머쌍을 포함하는 고 올레인산 땅콩 판별용 분자 마커.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 고 올레인산 땅콩은 F435인 것을 특징으로 하는 분자 마커.
  3. (1) 판별하고자 하는 땅콩 시료의 DNA를 추출하는 단계;
    (2) 상기 추출된 DNA를 주형으로 하고, 제 1 항의 분자 마커를 프라이머로 이용하여 DNA를 증폭하는 단계; 및
    (3) 상기 증폭된 산물을 전기영동에 의해 분석하는 단계
    를 포함하는 고 올레인산 땅콩 판별 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 전기영동에 의해 분석된 결과를 NIR 분석 결과와 비교하여 판별하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 고 올레인산 땅콩 판별 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 전기영동에 의해 분석된 결과를 가스크로마토그래피 분석 결과와 비교하여 판별하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 고 올레인산 땅콩 판별 방법.
  6. 청구항 제 1 항의 분자 마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 고 올레인산 땅콩 판별용 키트.
  7. 제 6 항에 있어서, DNA 중합효소 및 PCR 반응용 완충용액을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 고 올레인산 땅콩 판별용 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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