KR20120034984A

KR20120034984A - 인체 위해성 유발 환경 유해 화학 물질군인 다환 방향족 탄화수소류, 잔류성 유기 오염 물질류 및 휘발성 유기 화합물류를 판별할 수 있는 클래스헤즈켐 어레이

Info

Publication number: KR20120034984A
Application number: KR1020100096415A
Authority: KR
Inventors: 류재천; 김연정; 송미; 송미경; 최한샘; 이지나
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2010-10-04
Filing date: 2010-10-04
Publication date: 2012-04-13
Also published as: KR101187256B1

Abstract

본 발명은 인체에 위해성을 나타내는 특정 환경 유해 화학 물질군을 판별 할 수 있는 유전자 군(클레시파이어)이 집적된 칩으로, 더욱 상세하게는 유기물의 불완전 연소에 의해 발생하는 다환 방향족 탄화 수소류와 자연환경에서 분해되지 않고 먹이사슬을 통해 동식물 체내에 축적되는 잔류성 유기 오염 물질류, 마지막으로 상온, 상압에서 액체나 고체상으로 존재하지만, 대기 중에서는 가스상으로 존재하며 인간에서 암을 유발 할 수 있는 휘발성 유기 화합물류에 의해 특이적인 발현 양상을 나타내는 유전자 군에 관한 것이다. 본 발명의 유전자 군들이 집적된 칩은 인체에 위해성을 나타내는 이들 세 가지 유형군의 환경 유해 화학 물질들을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 각 환경 유해 화학 물질들의 위해성을 일으키는 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.

Description

인체 위해성 유발 환경 유해 화학 물질군인 다환 방향족 탄화수소류, 잔류성 유기 오염 물질류 및 휘발성 유기 화합물류를 판별할 수 있는 클래스헤즈켐 어레이{Classhazchem Array for discriminating of environmental hazardous substances，PAHs，POPs and VOCs，in Human cells}

본 발명은 인체 위해성 유발 환경 유해 화학 물질의 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩에 관한 것이다.

전 세계적으로 10만 여종의 화학물질이 개발되었으며 실제로 상용화된 물질이 만종을 넘고 있기 때문에 이들 화학물질의 체계적인 관리와 위해성에 대한 체계적이며 대규모적인 연구가 요구되고 있다. 따라서 화학물질이 인체에 미치는 영향에 대한 독성 유전체 연구를 통해 위해성 모니터링 및 예측 평가 기술의 구축이 필요하다.

과거 수십 년간 수행되어 오던 고전적인 위해성 평가 기법은 장기간, 고비용과 숙련된 인력이 필요하고 많은 실험동물을 사용하게 되며, 실험동물 개체간의 차이 등의 많은 문제점을 내포하고 있다. 또한 최근에 동물의 권익보호를 위한 동물 보호론자들의 주장이 활발히 전개되고 있어 동물을 이용한 연구에 심각한 제약이 따르고 있어 동물실험을 대체하거나 최소의 동물수를 이용한 실험법이 요구되고 있다. 현재 다량의 환경 유해 화학 물질에 대한 위해성을 과거의 실험기법으로는 검색하기에 무리가 따르기 때문에 간편하면서 단시간 내에 위해성을 알아볼 수 있는 시험법의 확립이 요구되고 있다.

최근 환경에 대한 관심이 높아지고 있음에 따라 인체에 위해성을 나타내는 환경 유해 화학 물질에 대한 위해성 평가 방법이 유전체학의 급진적인 발전과 함께 새로운 패러다임으로 빠르게 도입되고 있다. 다환 방향족 탄화 수소류는 여러 개의 벤젠고리를 지닌 방향족 탄화수소로서 유기물이 불완전 연소 시 발생하며 미량으로도 암을 유발시킬 수 있는 발암물질이거나 돌연변이원성을 가진 물질이며, 잔류성 유기 오염 물질류는 분해되기 어렵고 반감기가 긴 오염물질로서 먹이사슬을 통해 생물체에 축적되어 환경 및 인체에 위해성을 나타내는 물질들이다. 마지막으로 휘발성 유기 화합물류는 증기압이 높아 대기중으로 쉽게 증발되고, 대기중에서 질소 산화물과 공존시 태양광의 작용을 받아 광화학반응을 일으켜 오존을 파괴하는 등의 환경적인 영향 뿐만이 아니라, 인간에게 다양한 암을 유발할 수 있는 유해 물질이다. 따라서 독성 유전체 기술은 환경 유해 화학 물질에 대한 위해성을 분석하고 평가하기 위해 절대적으로 필요하며, 이를 이용하여 표적이 되는 위해성 물질의 안전성 및 효율적인 초고속(high throughput)의 스크리닝이 가능하다. 그러므로 DNA 마이크로어레이를 기반으로 하는 독성 유전체 기술을 이용하는 방법은 고전적인 독성평가 방법의 문제점을 충족시켜 줄 수 있는 유일한 대안 중의 하나라고 할 수 있다.

포유류 6종, 미생물 292종 등 여러 종의 게놈(genome) 염기서열 프로젝트가 완성되어 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 보고 되었다. 이렇게 얻어진 막대한 양의 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드 익스프레션(genome-wide expression) 연구가 이루어지고 있다. 한번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여 DNA 분석을 수행한다(Schena, M., et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93: 10614-10619, 1996).

마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20-25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 에질런트(Agilent), 제노믹 솔루션(Genomic Solutions) 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적로 고정화 하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer, K and Belbin, T.J., J. Am. Acad. Dermatol. 51: 681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 애피메트릭스(Affymetrix)사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성 방법에 의해 만들고 있으며, 에질런트(Agillent)사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K. et. al., Am. Acad. Dermatol. 51: 681-692, 2004).

유전자의 발현 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 RNA를 얻어 DNA 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화하며, cDNA로 전환시킨다. 올리고 마이크로어레이는 주로 두개의 다른 형광(예: Cy3과 Cy5)으로 대조군과 실험군을 각각 표지화하여 같은 칩 상에서 동시에 교잡 반응을 수행한 후 광학적으로 이미지를 스캔하여 형광의 세기를 얻고 그 결과를 분석한다. 두 개의 형광 세기의 비율에 따라 유전자의 발현 여부를 결정한다(Somasundaram, K., et al ., Genomics Proteomics I: 1-10, 2002).

최근 DNA 마크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 약물 및 환경 유해 화학 물질은 물론 모든 화학 물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 환경 유해 화학 물질의 위해성과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 환경 유해 화학 물질의 작용 및 위해성에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 세 가지 환경 유해 화학 물질군인, 다환 방향족 탄화 수소류(Persistent Organic Pollutants; POPs), 잔류성 유기 오염 물질류(Persistent Organic Pollutants; POPs), 휘발성 유기 화합물류(Volatile organic compounds; VOCs)의 유형군에 속하는 물질의 검색 및 진단이 가능하게 될 것이다.

이에, 본 발명자들은 인간 유전자 4만 4천 개가 집적된 올리고 마이크로어레이를 이용하여 인체 위해성 유발 환경 유해 화학 물질인 세 가지 유형군, 즉, 다환 방향족 탄화수소류, 잔류성 유기 오염 물질류 및 휘발성 유기 화합물류에 의한 유전자 발현 프로파일을 인간 세포주에서 관찰 및 분석함으로써 각 환경 유해 화학 물질군을 판별 할 수 있는 유전자 군(클레시파이어)을 발굴하여 칩으로 집적함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 인체에 위해성을 나타내는 환경 유해 화학 물질인 다환 방향족 탄화 수소류(Poly-cyclic Aromatic Hydrocarbons; PAHs), 잔류성 유기 오염 물질류(Persistent Organic Pollutants; POPs) 및 휘발성 유기 화합물류(Volatile organic compounds; VOCs)에 의해 특이적으로 발현 양상이 변화하여 세 가지 유형군을 판별할 수 있는 유전자 군(클레시파이어) 및 상기 클레시파이어를 이용한 이들 세 가지 환경 유해 화학 물질군의 탐색 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인체 위해성 유발 환경 유해 화학 물질인 다환 방향족 탄화 수소류(Poly-cyclic Aromatic Hydrocarbons; PAHs), 잔류성 유기 오염 물질류(Persistent Organic Pollutants; POPs) 및 휘발성 유기 화합물류(Volatile organic compounds; VOCs)를 판별 할 수 있는 특이적으로 발현 양상이 변화하는 유전자군에 포함된 유전자의 핵산서열의 전부 또는 18 내지 30개의 핵산 서열로 구성되는 상기 유전자의 단편인 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 상기의 세 가지 인체 위해성 유발 환경 유해 화학 물질군의 탐색용 DNA 칩을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 시료에 포함된 다환 방향족 탄화수소류, 잔류성 유기 오염 물질류 및 휘발성 유기 화합물류로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 인체 위해성 환경 유해 화학 물질을 분류(classify)하는 방법을 제공한다:

1) 다환 방향족 탄화수소류, 잔류성 유기 오염 물질류 및 휘발성 유기 화합물류로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 인체 위해성 환경 유해 화학 물질의 함유가 의심되는 시료를 포유동물 유래의 세포에 처리하는 단계;

2) 상기 처리된 세포(실험군) 및 처리하지 않은 대조군로부터 RNA를 분리하는 단계;

3) 상기 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;

4) 단계 3)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;

5) 단계 4)의 반응한 DNA 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계;

6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하는 단계; 및,

7) 단계 6)에서 비교한 데이터를 통계처리하는 단계.

아울러, 본 발명은 본 발명에 따른 DNA 마이크로 어레이칩에 포함된 유전자의 프로브 세트 또는 상기 유전자를 증폭시키는 프라이머 쌍을 포함하는, 다환 방향족 탄화수소류, 잔류성 유기 오염 물질류 및 휘발성 유기 화합물류로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 인체 위해성 환경 유해 화학 물질에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.

본 발명은 인체 위해성 유발 환경 유해 화학 물질인 다환 방향족 탄화수소류(Poly-cyclic Aromatic Hydrocarbons; PAHs), 잔류성 유기 오염 물질류(Persistent Organic Pollutants; POPs) 및 휘발성 유기 화합물류(Volatile organic compounds; VOCs)를 판별할 수 있는 유전자 그룹을 선별하여 집적시킨 DNA 마이크로어레이 칩 및, 이를 사용하여, 세포에 미지의 화합물을 처리하는 경우 세포의 유전자 발현 양상을 관찰하여 그 화합물이 위의 세 가지 환경 유해 화학 물질군 중 어느 물질군에 속하는지를 탐색하는 방법에 관한 것으로서, 종래에는 피검 물질을 처리하여 발현이 변화되는 유전자를 이용하여 피검 물질이 특정 위해성을 유발하는지 탐색하는 방법의 경우에는 다른 위해성을 유발하는 물질을 처리하는 경우에도 상기 유전자의 발현이 변화할 수 있음이 배제되지 않아 처리된 물질에 의해 반드시 위해성이 유발되는 것으로 판단할 수 없는 한계를 가지고 있었는데, 본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩은 이를 극복한 발명이다.

도 1은 데이터를 바탕으로 샘 분석법을 통해 선별된 다환 방향족 탄화수소류(Poly-cyclic Aromatic Hydrocarbons; PAHs)에 대한 계층적 군집법(Hierachical Clustering) 이미지를 수행한 결과를 나타내는 그림이다.
도 2는 데이터를 바탕으로 샘 분석법을 통해 선별된, 잔류성 유기 오염 물질류(Persistent Organic Pollutants; POPs)에 대한 계층적 군집법 이미지를 수행한 결과를 나타내는 그림이다.
도 3은 데이터를 바탕으로 샘 분석법을 통해 선별된 휘발성 유기 화합물류(Volatile organic compounds; VOCs)에 대한 계층적 군집법 이미지를 수행한 결과를 나타내는 그림이다.
도 4는 샘 분석법을 통해 선별된 유전자들을 밴 다이어그램을 이용하여 세 가지 환경 유해 화학 물질(다환 방향족 탄화 수소류, 잔류성 유기 오염 물질류, 휘발성 유기 화합물)에 각각 특이적으로 발현이 변화하는 유전자만을 선별하는 모식도를 나타낸 그림이다.
도 5는 도 4가 보여주는 과정을 통해 선별된 유전자들에 대한 계층적 군집법 이미지를 수행한 결과를 나타내는 그림이다.
도 6은 아노바 분석법을 통해 세 가지 환경 유해 화학 물질 유형군을 특이적으로 판별 할 수있는 유전자들에 대한 계층적 군집법 이미지를 수행한 결과를 나타내는 그림이다.
도 7은 샘 분석법과 아노바 분석법을 통해 선별된 유전자 군중 공통적인 유전자만을 세 가지 환경 유해 화학 물질 유형군을 특이적으로 판별 할 수 있는 유전자 군(클레시파이어)으로 선별하는 과정을 나타내는 그림이다.
도 8은 PCA분석법을 이용해 세 가지 환경 유해 환경 물질들을 그룹화한 그림이다.
도 9는 세 가지 환경 유해 환경 물질을 판별 할 수 있는 선별된 유전자을 각 위해성 유형군별 구분을 위해, 계층적 군집법 이미지를 수행한 결과를 나타내는 그림이다.
도 10은 선별된 클레시파이어들로 구성된 DNA 마이크로어레이 칩 모식도를 나타낸 그림이다.
도 11은 클레시파이어를 집적하여 제작한 DNA 마이크로어레이 칩에 실제피검시료를 이용한 실험에서 어느 군에 속하는지 예측한 표이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 다환 방향족 탄화수소류(Poly-cyclic Aromatic Hydrocarbons; PAHs), 잔류성 유기 오염 물질류(Persistent Organic Pollutants; POPs) 및 휘발성 유기 화합물류(Volatile organic compounds; VOCs)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 인체 위해성 환경 유해 화학 물질의 노출에 의해 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는, 하기 유전자군에 포함된 유전자로 이루어진 인체 위해성 환경 유해 화학 물질의 노출 여부 확인용 바이오마커 유전자군을 제공한다:

유전자등록번호(GeneBank) NM_198468(chromosome 6 open reading frame 167), 유전자등록번호(GeneBank) THC2432288(Q15694(Q15694) Protein immuno-reactive with anti-PTH polyclonal antibodies(Fragment), partial(59%) [THC2432288]), 유전자등록번호(GeneBank) NM_022145(centromere protein K), 유전자등록번호(GeneBank) AW291149(Transcribed locus), 유전자등록번호(GeneBank) BX647769(ankyrin repeat domain 36), 유전자등록번호(GeneBank) NM_020675(SPC25, NDC80 kinetochore complex component, homolog(S. cerevisiae)), 유전자등록번호(GeneBank) NM_003368(ubiquitin specific peptidase 1), 유전자등록번호(GeneBank) NM_018353(chromosome 14 open reading frame 106), 유전자등록번호(GeneBank) XM_930499(Homo sapiens, clone IMAGE:5167446, mRNA. [BC031698]), 유전자등록번호(GeneBank) NM_004419(dual specificity phosphatase 5), 유전자등록번호(GeneBank) NM_002658(plasminogen activator, urokinase), 유전자등록번호(GeneBank) NM_199357(Rho GTPase activating protein 11A), 유전자등록번호(GeneBank) NM_003516(histone cluster 2, H2aa3), 유전자등록번호(GeneBank) NM_001172(arginase, type II), 유전자등록번호(GeneBank) NM_080388(S100 calcium binding protein A16), 유전자등록번호(GeneBank) NM_020937(Fanconi anemia, complementation group M), 유전자등록번호(GeneBank) NM_182522(family with sequence similarity 19(chemokine(C-C motif)-like), member A4), 유전자등록번호(GeneBank) NM_004925(aquaporin 3(Gill blood group)), 유전자등록번호(GeneBank) NM_005463(Homo sapiens heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D-like(HNRPDL), transcript variant 1, mRNA [NM_005463]), 유전자등록번호(GeneBank) NM_002305(lectin, galactoside-binding, soluble, 1(galectin 1)), 유전자등록번호(GeneBank) NM_005271(glutamate dehydrogenase 1), 유전자등록번호(GeneBank) NM_006399(basic leucine zipper transcription factor, ATF-like), 유전자등록번호(GeneBank) NM_004695(solute carrier family 16, member 5(monocarboxylic acid transporter 6)), 유전자등록번호(GeneBank) NM_002867(RAB3B, member RAS oncogene family), 유전자등록번호(GeneBank) NM_203401(stathmin 1/oncoprotein 18), 유전자등록번호(GeneBank) NM_001493(GDP dissociation inhibitor 1), 유전자등록번호(GeneBank) NM_002129(high-mobility group box 2), 유전자등록번호(GeneBank) NM_003897(immediate early response 3), 유전자등록번호(GeneBank) NM_007075(WD repeat domain 45), 유전자등록번호(GeneBank) AK092644(Homo sapiens cDNA FLJ35325 fis, clone PROST2012542.), 유전자등록번호(GeneBank) NM_003355(uncoupling protein 2(mitochondrial, proton carrier)), 유전자등록번호(GeneBank) NM_020918(glycerol-3-phosphate acyltransferase, mitochondrial), 유전자등록번호(GeneBank) NM_004073(polo-like kinase 3(Drosophila)), 유전자등록번호(GeneBank) XM_497271(Homo sapiens similar to High mobility group protein 1(HMG-1)(Amphoterin)(Heparin-binding protein p30)(LOC441593), mRNA), 유전자등록번호(GeneBank) NM_004523(kinesin family member 11), 유전자등록번호(GeneBank) NM_203500(kelch-like ECH-associated protein 1), 유전자등록번호(GeneBank) NM_001034840(Homo sapiens similar to RIKEN cDNA 4933434I20(LOC152586), mRNA [NM_001034840]), 유전자등록번호(GeneBank) NM_001948(dUTP pyrophosphatase), 유전자등록번호(GeneBank) NM_004864(growth differentiation factor 15), 유전자등록번호(GeneBank) NM_000713(biliverdin reductase B(flavin reductase(NADPH))), 유전자등록번호(GeneBank) NM_004221(Homo sapiens interleukin 32(IL32), transcript variant 2, mRNA), 유전자등록번호(GeneBank) NM_003254(TIMP metallopeptidase inhibitor 1), 유전자등록번호(GeneBank) NM_005953(metallothionein 2A), 유전자등록번호(GeneBank) NM_002754(mitogen-activated protein kinase 13), 유전자등록번호(GeneBank) NM_001547(interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2), 유전자등록번호(GeneBank) NM_013282(ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1), 유전자등록번호(GeneBank) A_23_P123234(Unknown), 유전자등록번호(GeneBank) A_24_P306614(Unknown), 유전자등록번호(GeneBank) NM_000436(3-oxoacid CoA transferase 1), 유전자등록번호(GeneBank) NM_175744(ras homolog gene family, member C), 유전자등록번호(GeneBank) NM_015853(SAPK substrate protein 1).

상기 바이오마커 유전자군은 다환 방향족 탄화수소류, 잔류성 유기 오염 물질류 및 휘발성 유기 화합물류로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 인체 위해성 환경 유해 화학 물질을 인간 간암 세포 및 인간 백혈병 세포에 세포 독성을 나타내는 농도로 처리하였을 때, 샘 분석법(SAM analysis)에서 2배 이상 발현량이 변화한 유전자 및 아노바 분석법(ANOVA analysis)에서 특이적으로 발현 양상이 변화한 유전자에서 공통되는 유전자 군(클래시파이어)이다.

본 발명자들은 인체 위해성 유발 세 가지 유형군의 환경 유해 화학 물질 탐색용 클레시파이어를 발굴하기 위하여, 다환 방향족 탄화 수소류, 잔류성 유기 오염 물질류 및 휘발성 유기 화합물류를 인간 세포주에 처리하여 세포 독성을 확인하였다. 그 결과, 이들 물질은 인간 세포주에 독성을 가짐이 확인되었고(표 1 참조), 상기 실험을 바탕으로 세포독성을 나타내는 각 물질의 처리를 위한 농도를 결정하였다. 이후 상기 결정된 농도로 각 물질을 인간 세포주에 처리하고, 상기 물질을 처리한 세포주에서 mRNA를 분리하여 cDNA를 합성하면서 Cy5 형광물질로 표지하였으며, 물질을 처리하지 않은 대조군의 경우 Cy3 형광물질로 표지하였다. 상기 형광표지된 cDNA를 인간 유전체 전체 올리고 마이크로어레이와 혼성화하였고(표 3 참조), 형광 이미지를 스캔하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다. 분석시 Cy5/Cy3 비율이 2.0배 이상인 경우 발현 증가된 유전자로 분류하였고, 0.5배 이하인 경우 발현 감소된 유전자로 분류하였다.

상기 유전자들은 본 발명에서 사용한 18종의 물질을 처리했을 때, 인간 세포주에서 위해성과 관련이 있다는 보고는 없다.

또한, 본 발명은 상기 바이오마커 유전자군에 포함된 유전자의 핵산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 올리고뉴클레오티드가 집적된, 다환 방향족 탄화수소류, 잔류성 유기 오염 물질류 및 휘발성 유기 화합물류로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 인체 위해성 환경 유해 화학 물질의 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.

상기 유전자 군은 SAM 분석법 또는 아노바 분석법에 의해 선별된 것이 바람직하나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 따른 DNA 마이크로어레이 칩은 하기 유전자군에 포함된 유전자의 핵산서열의 전부 또는 18 내지 30개의 핵산 서열로 구성되는 상기 유전자의 단편인 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 것으로 제작된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

상기 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 상기 본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 18 내지 30개의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 20 내지 25개의 핵산을 포함한다.

상기 다환 방향족 탄화 수소류는 벤조에이파이렌[Benzo(a)pyrene], 다이벤토에이에이취안트라센[Dibenzo(a,h)anthracene], 크라이센(Chrycene), 페난트렌(Phenanthrene), 나프탈렌(Naphthalene), 3-메틸콜란트렌(3-methylcholanthrene), 벤조에이안트라센[Benzo(a)anthracene], 벤조케이플루오란텐[Benzo(k)fluoranthene] 및 인데노(1,2,3-cd)파이렌[Indeno(1,2,3-cd)pyrene]로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나이고,

상기 잔류성 유기 오염 물질류는 톡사펜(Toxaphene), 마이렉스(Mirex), 클로르덴(Chlorodane)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나이며,

상기 휘발성 유기 화합물류는 벤젠(Benzene), 톨루엔(Toluene), o-자일렌(o-xylene), 에틸 벤젠(Ethyl benzene), 트리클로로에틸렌(Trichloroethylene) 및 디클로로메탄(Dichloromethane)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 DNA 마이크로어레이 칩은 다환 방향족 탄화 수소류, 잔류성 유기 오염 물질류 또는 휘발성 유기 화합물류에서 특이적으로 발현양상이 변화하는 유전자 군을 선별하여, 이 유전자 군을 하나의 칩에 집적시켜 제작하는 것이다.

기존의 특정 위해성 유발 화학 물질을 처리하여 발현이 변화되는 유전자를 이용하여 피검 물질이 위해성을 유발하는지 탐색하는 선행기술의 경우에는, 다른 위해성을 유발하는 물질을 처리하는 경우에도 상기 유전자의 발현이 변화될 수 있음을 배제하지 않은 것으로서, 상기 유전자들이 특정 물질에 의해 발현이 변화했다고 반드시 처리된 물질이 특정 위해성을 유발하는지를 판단할 수 없는 한계를 가지고 있는 반면에, 본 발명의 경우에는 각각의 화학 물질 유형군에 특이적으로 발현양상이 변화하는 유전자 군(클레시파이어)들을 하나의 칩에 집적시킴으로써 상기 칩에 특정 화합물을 처리하는 경우 어느 유전자의 발현 패턴을 분석하여 그 화합물의 유형군을 탐색할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 유전자를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 마이크로어레이 칩의 기판 상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 핀 형태의 스폿터인 마이크로어레이를 이용하였다. 상기 본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.

5) 단계 4)의 반응한 DNA 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계;

7) 단계 6)에서 비교한 데이터를 통계처리하는 단계.

상기 다환 방향족 탄화 수소류는 벤조에이파이렌, 다이벤토에이에이취안트라센, 크라이센, 페난트렌, 나프탈렌, 3-메틸콜란트렌, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-cd)파이렌으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나이고,

상기 잔류성 유기 오염 물질류는 톡사펜, 마이렉스, 클로르덴으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나이며,

상기 휘발성 유기 화합물류는 벤젠, 톨루엔, o-자일렌, 에틸 벤젠, 트리클로로에틸렌 및 디클로로메탄으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 시료는 토양, 하천, 해수, 빗물 및 대기로부터 채취한 환경시료인 것이 바람직하며, 상기 포유동물 유래의 세포는 간, 간암, 혈액 또는 혈액암 세포인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 혈액암 세포는 바람직하게는 백혈병 세포이며, 더욱 바람직하게는 HL-60 세포이나 이에 한정되는 것은 아니며 인간의 간, 간암, 혈액 또는 혈액암 유래의 세포라면 모두 사용 가능하다.

또한, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.

상기 방법에 있어서, 단계 4)의 혼성화는 40℃ 내지 50℃에서 10 내지 20시간 동안 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 방법에 있어서, 단계 5)의 DNA 마이크로어레이 칩은 Whole HuMan Genome Oligo Microarray(Agilent, 미국)을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정하는 것은 아니며, 인간 게놈 중 본 발명에서 상기 공통적으로 과발현 또는 저발현 유전자(표 2 및 표 3 참조)가 탑재된 DNA 마이크로어레이 칩이라면 모두 사용 가능하다.

상기 방법에 있어서, 단계 5)의 분석은 혼성화된 마이크로어레이 칩을 세척 및 염색한 후 스캔하여 이미지 프로세싱을 수행한 다음 샘 분석법 또는 아노바 분석법을 수행하는 것이 바람직하다. 상기 염색 및 세척은 Fluidics Station 450을 이용하고, 스캔은 GeneChip scanner3000을 이용하며, 이미지 프로세싱은 Affymetrix GeneChip Operating System(GCOS)을 이용하며, 모든 절차는 Affymetrix사의 프로토콜에 따라 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 샘 분석법 및 아노바 분석법은 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon InstrμMents, 미국)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어라면 모두 사용 가능하다.

상기 방법에 있어서, 단계 7)의 통계처리는 단계 5)에서 수행한 SAM 및 아노바 분석 결과를 바탕으로, 분석도구의 군별 예측(class prediction)을 통하여 상기 SAM 및 아노바 분석법의 정확도를 예측하는 것을 특징으로 하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 통계처리 방법을 이용하여 분석할 수 있다.

상기 인체 위해성 환경 유해 화학 물질에 대한 노출 여부 확인용 키트에 있어서, 간, 간암, 혈액 또는 혈액암 세포와 같은 포유동물 유래의 세포를 추가로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 혈액암 세포는 바람직하게는 백혈병 세포이며, 더욱 바람직하게는 HL-60 세포이나 이에 한정되는 것은 아니며 인간의 간, 간암, 혈액 또는 혈액암 유래의 세포라면 모두 사용 가능하다.

상기 휘발성 유기 화합물류는 벤젠, 톨루엔, o-자일렌, 에틸 벤젠, 트리클로로에틸렌 및 디클로로메탄으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 인체 위해성 환경 유해 화학 물질에 대한 노출 여부 확인용 키트에 있어서, 프로브 세트는 본 발명에 따른 마이크로어레이 칩을 이용한 마이크로어레이에 사용되는 것이 바람직하며, 상기 프라미어 쌍은 실시간 RT-PCR에 사용되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 키트에 추가로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙타비딘-알칼리 탈인산화효소 접합물질(streptavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemifluorescent agent) 및 화학발광물질(chemiluminescent agent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 키트에 추가로 반응 시약을 포함할 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표시 시약 및 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

세포 배양 및 화학물질 처리

<1-1> 세포배양

인간 간암 세포주인 HepG-2 세포(한국세포주은행, 한국)는 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지(Gibro-BRL, 미국)를 이용하여 디쉬의 80% 정도 채워질 때까지 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 또한, 인간 골수성 백혈병 세포주인 HL-60 세포(ATCC, 미국)는 10% FBS가 첨가된 RPMI-1640 배지(Gibro-BRL, 미국)를 이용하여 T75 플라스크에서 5 ×10⁶ 세포/㎖이 되도록 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 본 발명자들은 기존의 연구와 보고를 통해 인체 위해성 환경 화학 물질 중 대표적으로 다환 방향족 탄화 수소류에 속하는 벤조에이파이렌, 다이벤조에이에이취안트라센, 크라이센, 페난트렌, 나프탈렌, 3-메틸콜란트렌, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-cd)파이렌의 9종을 선정하였고, 잔류성 유기 오염 물질류로서 톡사펜, 마이렉스 및 클로르덴의 3종을 선정하였으며, 마지막으로 휘발성 유기 화합물류로서 벤젠, 톨루엔, o-자일렌, 에틸 벤젠, 트라이클로로에틸렌 및 다이클로로메텐의 6종을 선정하여 총 18종의 약물을 선정하였으며, DMSO에 용해시켜 하기 실험에 사용하였다[Naphthalene(Sigma-aldrich, USA), Benzo[k]fluoranthene(ACROS ORGANICS,, USA), 1,2-Benzanthracene(ACROS ORGANICS, USA), Benzo[a]pyrene(Sigma , USA), Crysene(Riedel-deha, GERMANY), 3-Methylcholanthrene(ALDRICH, USA), Dibenz[a,h]anthracene(TCI, JAPAN), Phenanthrene(TCI, JAPAN), Indeno(WAKO , JAPAN), Benzene(SIGMA-ALDRICH, USA), Trichloroethylene(SIGMA-ALDRICH, USA), Ethylbenzene(SIGMA-ALDRICH, USA), Toluene(SIGMA-ALDRICH, USA), Dichloromethane(SIGMA-ALDRICH, USA), O-Xylene,Chloroform(SIGMA-ALDRICH, USA), Toxaphene(SUPELCO, USA), Mirex(SUPELCO, USA), Chlorodane(SUPELCO, USA)]. 매질(vehicle) 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하였다.

<1-2> 세포 독성 실험(MTT assay) 및 화학 물질 처리

Mossman 등(J. Immunol. Methods, 65, 55-63, 1983)의 방법으로 HepG-2 및 HL-60 세포주를 이용한 MTT 실험을 수행하였다. 세포는 24-웰 플레이트에 적정 세포수(표 2)로 각 세포주의 배양배지에서 상기 실시예 1-1의 약물을 각각 처리하고 48시간 후에 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra zoliμM bromide] 5 ㎎/㎖을 각 웰에 첨가한 뒤 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 500 ㎕의 DMSO에 용해한 다음, 96-웰 플레이트에 분주(aliquot)하여 옮긴 다음 흡광도 540 nm에서 O.D.값을 측정하였다. 18종의 각각의 약물의 각 세포주에 대한 세포독성을 표 1에 나타내었다. 표 1에 나타난 각 약물에 대한 각 세포주의 IC₂₀농도로 결정하여 실험을 수행하였다.

독성물질	세포주 및 세포수	약물	처리시간	세포독성	농도
다환 방향족 탄화수소류 (Poly-cyclic Aromatic Hydrocarbons; PAHs)	HepG-2 ;40×10⁴/웰 세포수	벤조에이파이렌	48 시간	IC₂₀	8.35 μM
		다이벤조에이에이취안트라센
					3.79 μM
		크라이센
					34.97 μM
		페난트렌
					500 μM
		나프탈렌
					1772.23 μM
		3-메틸콜란트렌
					2.14 μM
		벤조 에이 안트라센
					36.09 μM
		벤조케이플루오란텐
					22.56 μM
		인데노(1,2,3-cd)파이렌
					227.66 μM
잔류성 유기 오염 물질류 (Persistent Organic Pollutants; POPs)	HepG-2 ;40×10⁴/웰 세포수	톡사펜	48 시간	IC₂₀	238.33 μM
		마이렉스			41.23 μM
		클로르덴			158.2 μM
휘발성 유기 화합물류 (Volatile organic compounds; VOCs)	HL-60 ;1×10⁶/15ml 튜브	벤젠	3 시간	IC₂₀	4.22 mM
		톨루엔
					0.72 mM
		o-자일렌
					0.32 mM
		에틸 벤젠
					0.3633 mM
		트리클로로에틸렌
					1.777 mM
		디클로로메탄
					16.54 mM

실험

<2-1> 표적 RNA의 분리

상기 실시예 1-2에서 결정된 바와 같이 Hep-G2 세포를 100 mm 디쉬에 분주하고 HL-60 세포를 T75 플라스크에 분주한 후, 각 약물을 각각 48시간 동안 처리하였다(표 1). 이후, 상기 처리한 세포에서 트리졸(trizol) 시약(Invitrogen life technologies, 미국)을 사용하여 제조사의 방법대로 전체 RNA를 분리하고, RNeasy mini kit(Qiagen, 미국)를 사용하여 정제하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase set(Qiagen, 미국)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 양은 분광광도계로 측정하였고, 순도는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, 미국)으로 확인하였다.

<2-2> 형광 물질로 표지된 cDNA 제조

올리고 분석을 위하여 상기 실시예<2-1>에서 수득한 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 상기 수득한 전체 RNA 30 ㎍과 올리고(dT) 프라이머 2 ㎍(1 ㎍/㎕)과 혼합하고 65℃에서 10분간 반응시킨 후 바로 얼음에 넣어 어닐링(annealing)시켰다. 상기 어닐링된 RNA의 역전사(Reverse Transcript) 반응을 위해 표 2과 같이 시약을 혼합하였다.

구성	부피(㎕)
5X first strand buffer	6
dNTPs	0.6
0.1 M DDT	3
SuperScript II enzyme	3
Cy-3 or Cy-5 dUTP	2

대조군인 세포주에서 분리한 전체 RNA는 Cy3-dUTP(녹색)으로 표지화하였고, 각 약물을 처리한 세포주로부터 분리한 RNA는 Cy5-dUTP(적색)를 표지화하였다. 이때 두 시료는 Microcon YM-30 컬럼(Millipore, 미국)을 사용하여 혼합 및 정제되었다.

<2-3> 혼성화 반응

혼성화 및 세척 과정은 지노첵(주)의 지시방법에 따라 수행되었다. 혼성화는 12시간 동안 62℃ 오븐에서 수행되었다. DNA 마이크로어레이 칩으로는 각 위해성 유형별 하기 표 3에 명시된 마이크로어레이를 이용하였다.

독성 물질	마이크로어레이 종류
다환 방향족 탄화 수소	44 k Whole HuMan Genome 올리고 마이크로어레이(Agilent, 미국)
잔류성 유기 오염 물질	44 k Whole HuMan Genome 올리고 마이크로어레이(Agilent, 미국)
휘발성 유기 화합물	벤젠, 톨루엔, o-자일렌:44 k Whole HuMan Genome 올리고 마이크로어레이(Agilent, 미국)
휘발성 유기 화합물	에틸 벤젠, 트리클로로에틸렌, 디클로로메탄: 35 k Whole HuMan Genome 마이크로어레이(Operon, 독일)

슬라이드를 세척(2분간 2×SSC/0.1% SDS에 세척, 3분간 1×SSC 및 2분간 0.2×SSC에 세척) 후 3분간 800 rpm으로 원심분리하여 건조하였다.

<2-4> 형광 이미지 획득

슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Genepix 4000B(Axon InstruMents, 미국)로 스캔하였다. 결합하지 않은 유전자를 세척한 칩은 레이저 광 스캐너(laser fluorescence scanner)를 사용하여 형광 이미지를 획득하였다. 이때, 녹색 형광 이미지는 대조군에서, 적색 형광 이미지는 실험군에서만 특이하게 발현되는 유전자의 활성정도를 나타내게 되며, 노란색 형광 이미지는 녹색과 적색의 보색으로 두 군의 발현이 큰 차이가 없음을 의미한다. 스캔한 이미지들은 유전자 발현 비율을 얻기 위하여 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon InstruMents, 미국)로 분석하였다.

<2-5> Genespring 7.3 소프트웨어를 이용한 클레시파이어 획득

마이크로어레이 데이터로부터 샘 분석법(Tusher, V. G., R. Tibshirani, et al. National Academy of Sciences 98(9): 51165121, 2001)을 이용하였다. 샘 분석법은 서로 다른 두 실험조건에서 어떠한 유전자들이 차이가 있는지를 알아보기 위한 통계학적인 기술로서 유전자 발현과 반응 변수 사이의 관계의 정도를 측정하는 방법으로 t-검증에서 분산이 작은 경우에 t-통계량의 값이 커지는 것을 막기 위하여 보완인자(fudge factor)를 구분하여 분모에 더하여 통계량 d를 하기 수학식 1과 같이 계산한다.

여기서

는 처리 군에서 (i)번째 유전자에 대한 평균 수준으로,

는 대조군에서의 각 유전자 (i)별 평균 수준으로 정의되며, s(i)는 하기 수학식 2로 정의되는데 여기서,

과

은 각각 처리 군과 대조군에서의 발현 척도의 총합이며, 또한 a는 하기 수학식 3으로 계산되고, 이때, n₁과 n₂는 각각 처리군과 대조군에서의 발현 척도들의 수를 나타낸다.

p개 유전자 각각에 대하여 d(i)값들을 다시 크기 순으로 나열하여 둔다. i번째 데이터의 치환(permutation)을 통해 구한 d 통계량, d(i)로 하여 값을 구해 크기 순으로 나열하면, d_j(i)는 치환 i에 대한 d의 i번째 순서통계량의 값인데, 총 n번의 치환을 하여 얻은 d 통계량들의 평균을 하기 수학식 4로 나타내면,

가 된다.

각 유전자 i에 대해 정해진 △를 이용하여

이면 그 유전자는 유의하다고 할 수 있다. 이러한 샘 분석 방법을 이용하여 다환 방향족 탄화 수소류, 잔류성 유기 오염 물질류, 휘발성 유기 화합물류의 세 가지 위해성 화학 물질 유형군으로 각각 분류하였을 때, 다환 방향족 탄화 수소류 관련 유전자 483종, 잔류성 유기 오염 물질류 관련 유전자 64종, 휘발성 유기 화합물류 관련 유전자 84종을 선별하였다(q≤0.05). 분산분석(Analysis of variance, ANOVA, 변량분석)은 통계학에서 두 개 이상 다수의 집단을 비교하고자 할 때 집단 내의 분산, 총 평균과 각 집단의 평균의 차이에 의해 생긴 집단 간 분산의 비교를 통해 만들어진 F분포를 이용하여 가설검정을 하는 방법이며, F분포는 분산의 비교를 통해 얻어진 분포비율이다. 이 비율을 이용하여 각 집단의 모집단분산이 차이가 있는지에 대한 검정과 모집단평균이 차이가 있는지 검정하는 방법으로 사용되며, 다음과 같은 수식으로 각 그룹간의 차이를 계산하게 된다.

여기서 N_i는 각 그룹의 누락되지 않은 데이터의 수이고,

는 각 그룹간 차이의 평균이며,

는 각 그룹 내의 평균의 제곱이다. 이 평균 제곱의 분포비율에 의해서 유전자가 선별되게 된다. 또한 FDR 값을 설정해 주게 되는데 이 FDR 값은 유의한 차이를 보이는 검정 결과 중에서 잘못된 결과가 포함될 비율을 조절하는 것이다. 이 분석 방법에 의해 세 가지 환경 유해 화학 물질에 특이적으로 발현양상이 변화하는 254종의 유전자를 선별하였다(FDR≤0.00000001). 이 두 가지 분석법에 의해 선별된 유전자 군 중에서 공통적으로 발현하는 51종의 유전자 군을 클레시파이어로 선별하였다(표 4).

유전자등록번호 (GenBank)	유전자 명칭
NM_198468	chromosome 6 open reading frame 167),
THC2432288	Q15694(Q15694) Protein immuno-reactive with anti-PTH polyclonal antibodies(Fragment), partial(59%) [THC2432288]),
NM_022145	centromere protein K),
AW291149	Transcribed locus),
BX647769	ankyrin repeat domain 36),
NM_020675	PC25, NDC80 kinetochore complex component, homolog(S. cerevisiae)
NM_003368	ubiquitin specific peptidase 1
NM_018353	chromosome 14 open reading frame 106
XM_930499	Homo sapiens, clone IMAGE:5167446, mRNA. [BC031698]
NM_004419	dual specificity phosphatase 5
NM_002658	plasminogen activator, urokinase
NM_199357	Rho GTPase activating protein 11A
NM_003516	histone cluster 2, H2aa3
NM_001172	arginase, type II
NM_080388	S100 calcium binding protein A16
NM_020937	Fanconi anemia, complementation group M
NM_182522	family with sequence similarity 19(chemokine(C-C motif)-like), member A4
NM_004925	aquaporin 3(Gill blood group)
NM_005463	Homo sapiens heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D-like(HNRPDL), transcript variant 1, mRNA [NM_005463]
NM_002305	lectin, galactoside-binding, soluble, 1(galectin 1)
NM_005271	glutamate dehydrogenase 1
NM_006399	basic leucine zipper transcription factor, ATF-like
NM_004695	solute carrier family 16, member 5(monocarboxylic acid transporter 6)
NM_002867	RAB3B, member RAS oncogene family
NM_203401	stathmin 1/oncoprotein 18
NM_001493	GDP dissociation inhibitor 1
NM_002129	high-mobility group box 2
NM_003897	immediate early response 3
NM_007075	WD repeat domain 45
AK092644	Homo sapiens cDNA FLJ35325 fis, clone PROST2012542.
NM_003355	uncoupling protein 2(mitochondrial, proton carrier)
NM_020918	glycerol-3-phosphate acyltransferase, mitochondrial
NM_004073	polo-like kinase 3(Drosophila)
XM_497271	Homo sapiens similar to High mobility group protein 1(HMG-1)(Amphoterin)(Heparin-binding protein p30)(LOC441593), mRNA
NM_004523	kinesin family member 11
NM_203500	kelch-like ECH-associated protein 1
NM_001034840	Homo sapiens similar to RIKEN cDNA 4933434I20(LOC152586), mRNA [NM_001034840]
NM_001948	dUTP pyrophosphatase
NM_004864	growth differentiation factor 15
NM_000713	biliverdin reductase B(flavin reductase(NADPH))
NM_004221	Homo sapiens interleukin 32(IL32), transcript variant 2, mRNA
NM_003254	TIMP metallopeptidase inhibitor 1
NM_005953	metallothionein 2A
NM_002754	mitogen-activated protein kinase 13
NM_001547	interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2
NM_013282	ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1
A_23_P123234	Unknown
A_24_P306614	Unknown
NM_000436	3-oxoacid CoA transferase 1
NM_175744	ras homolog gene family, member C
NM_015853	SAPK substrate protein 1

<2-6> 획득한 클레시파이어의 DNA 마이크로어레이 칩 제작

본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 유전자를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 마이크로어레이 칩의 기판 상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 핀 형태의 스폿터인 마이크로어레이를 이용하였다. 상기 본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.

실제 예측

<3-1> 실제 피검시료를 이용한 DNA 마이크로어레이 칩 실험

본 발명에서 사용한 실제 피검 시료는 상기 실시예 1,2에서 수행바와 같이 실시하였다. 단, 검증에 사용한 화합물은 3-메틸콜란트렌, 벤젠, 클로르데인이며, 수득한 RNA를 이용하여 제조한 cDNA를 본 발명에서 제작한 DNA 마이크로어레이 칩에 혼성화하여 형광 이미지를 획득하여 분석하였다.

<3-2> Genespring 7.3 소프트웨어를 이용한 클레시파이어 예측

마이크로어레이 데이터로부터 실제피검시료의 판별군 예측을 위하여 Genespring 7.3 소프트웨어의 분석도구 중 Class prediction을 이용하여 검증하였다. Class prediction 분석방법은 실시예 1,2를 통해 얻은 클레시파이어의 유전자들을 기본으로 하여 본 발명에서 제작한 마이크로어레이 칩에서의 실제 피검 시료의 데이터를 통계방법 k-nearest neighbor 알고리즘을 이용하여 어느 화학물질 군에 속하는지 알아보는 방법이다. k-nearest neighbor 알고리즘은 예측하고자 하는 유전자(피검시료) 주위의 가장 가까운 유전자의 발현패턴을 클레시파이어 유전자의 발현 패턴과 비교하여 예측하는 방법이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 다환 방향족 탄화 수소류(PAHs), 잔류성 유기 오염 물질류(POPs), 휘발성 유기 화합물류(VOCs)를 판별할 수 있는 유전자 그룹을 선별하여 집적시킨 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여, 세포에 미지의 화합물을 처리하는 경우 세포의 유전자 발현 양상을 관찰하여 그 화합물이 위의 세 가지 환경 유해 화학 물질군 중 어느 물질군에 속하는지를 판별하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

하기 유전자군에 포함된 유전자의 핵산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 올리고뉴클레오티드가 집적된, 다환 방향족 탄화수소류(Poly-cyclic Aromatic Hydrocarbons; PAHs), 잔류성 유기 오염 물질류(Persistent Organic Pollutants; POPs) 및 휘발성 유기 화합물류(Volatile Organic Compounds; VOCs)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 인체 위해성 환경 유해 화학 물질의 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩:
유전자등록번호(GeneBank) NM_198468(chromosome 6 open reading frame 167), 유전자등록번호(GeneBank) THC2432288(Q15694(Q15694) Protein immuno-reactive with anti-PTH polyclonal antibodies(Fragment), partial(59%) [THC2432288]), 유전자등록번호(GeneBank) NM_022145(centromere protein K), 유전자등록번호(GeneBank) AW291149(Transcribed locus), 유전자등록번호(GeneBank) BX647769(ankyrin repeat domain 36), 유전자등록번호(GeneBank) NM_020675(SPC25, NDC80 kinetochore complex component, homolog(S. cerevisiae)), 유전자등록번호(GeneBank) NM_003368(ubiquitin specific peptidase 1), 유전자등록번호(GeneBank) NM_018353(chromosome 14 open reading frame 106), 유전자등록번호(GeneBank) XM_930499(Homo sapiens, clone IMAGE:5167446, mRNA. [BC031698]), 유전자등록번호(GeneBank) NM_004419(dual specificity phosphatase 5), 유전자등록번호(GeneBank) NM_002658(plasminogen activator, urokinase), 유전자등록번호(GeneBank) NM_199357(Rho GTPase activating protein 11A), 유전자등록번호(GeneBank) NM_003516(histone cluster 2, H2aa3), 유전자등록번호(GeneBank) NM_001172(arginase, type II), 유전자등록번호(GeneBank) NM_080388(S100 calcium binding protein A16), 유전자등록번호(GeneBank) NM_020937(Fanconi anemia, complementation group M), 유전자등록번호(GeneBank) NM_182522(family with sequence similarity 19(chemokine(C-C motif)-like), member A4), 유전자등록번호(GeneBank) NM_004925(aquaporin 3(Gill blood group)), 유전자등록번호(GeneBank) NM_005463(Homo sapiens heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D-like(HNRPDL), transcript variant 1, mRNA [NM_005463]), 유전자등록번호(GeneBank) NM_002305(lectin, galactoside-binding, soluble, 1(galectin 1)), 유전자등록번호(GeneBank) NM_005271(glutamate dehydrogenase 1), 유전자등록번호(GeneBank) NM_006399(basic leucine zipper transcription factor, ATF-like), 유전자등록번호(GeneBank) NM_004695(solute carrier family 16, member 5(monocarboxylic acid transporter 6)), 유전자등록번호(GeneBank) NM_002867(RAB3B, member RAS oncogene family), 유전자등록번호(GeneBank) NM_203401(stathmin 1/oncoprotein 18), 유전자등록번호(GeneBank) NM_001493(GDP dissociation inhibitor 1), 유전자등록번호(GeneBank) NM_002129(high-mobility group box 2), 유전자등록번호(GeneBank) NM_003897(immediate early response 3), 유전자등록번호(GeneBank) NM_007075(WD repeat domain 45), 유전자등록번호(GeneBank) AK092644(Homo sapiens cDNA FLJ35325 fis, clone PROST2012542.), 유전자등록번호(GeneBank) NM_003355(uncoupling protein 2(mitochondrial, proton carrier)), 유전자등록번호(GeneBank) NM_020918(glycerol-3-phosphate acyltransferase, mitochondrial), 유전자등록번호(GeneBank) NM_004073(polo-like kinase 3(Drosophila)), 유전자등록번호(GeneBank) XM_497271(Homo sapiens similar to High mobility group protein 1(HMG-1)(Amphoterin)(Heparin-binding protein p30)(LOC441593), mRNA), 유전자등록번호(GeneBank) NM_004523(kinesin family member 11), 유전자등록번호(GeneBank) NM_203500(kelch-like ECH-associated protein 1), 유전자등록번호(GeneBank) NM_001034840(Homo sapiens similar to RIKEN cDNA 4933434I20(LOC152586), mRNA [NM_001034840]), 유전자등록번호(GeneBank) NM_001948(dUTP pyrophosphatase), 유전자등록번호(GeneBank) NM_004864(growth differentiation factor 15), 유전자등록번호(GeneBank) NM_000713(biliverdin reductase B(flavin reductase(NADPH))), 유전자등록번호(GeneBank) NM_004221(Homo sapiens interleukin 32(IL32), transcript variant 2, mRNA), 유전자등록번호(GeneBank) NM_003254(TIMP metallopeptidase inhibitor 1), 유전자등록번호(GeneBank) NM_005953(metallothionein 2A), 유전자등록번호(GeneBank) NM_002754(mitogen-activated protein kinase 13), 유전자등록번호(GeneBank) NM_001547(interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2), 유전자등록번호(GeneBank) NM_013282(ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1), 유전자등록번호(GeneBank) A_23_P123234(Unknown), 유전자등록번호(GeneBank) A_24_P306614(Unknown), 유전자등록번호(GeneBank) NM_000436(3-oxoacid CoA transferase 1), 유전자등록번호(GeneBank) NM_175744(ras homolog gene family, member C), 유전자등록번호(GeneBank) NM_015853(SAPK substrate protein 1).
제 1항에 있어서, 상기 유전자 군은 SAM 분석법 또는 아노바 분석법에 의해 선별된 것을 특징으로 하는 DNA 마이크로어레이 칩.
제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 올리고뉴클레오티드는 18 내지 30개의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 마이크로어레이 칩.
제 1항에 있어서, 상기 다환 방향족 탄화 수소류는 벤조에이파이렌[Benzo(a)pyrene], 다이벤토에이에이취안트라센[Dibenzo(a,h)anthracene], 크라이센(Chrycene), 페난트렌(Phenanthrene), 나프탈렌(Naphthalene), 3-메틸콜란트렌(3-methylcholanthrene), 벤조에이안트라센[Benzo(a)anthracene], 벤조케이플루오란텐[Benzo(k)fluoranthene] 및 인데노(1,2,3-cd)파이렌[Indeno(1,2,3-cd)pyrene]로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나이고;
상기 잔류성 유기 오염 물질류는 톡사펜(Toxaphene), 마이렉스(Mirex), 클로르덴(Chlorodane)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나이며; 및,
상기 휘발성 유기 화합물류는 벤젠(Benzene), 톨루엔(Toluene), o-자일렌(o-xylene), 에틸 벤젠(Ethyl benzene), 트리클로로에틸렌(Trichloroethylene) 및 디클로로메탄(Dichloromethane)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 것을 특징으로 하는 DNA 마이크로어레이 칩.
1) 다환 방향족 탄화수소류, 잔류성 유기 오염 물질류 및 휘발성 유기 화합물류로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 인체 위해성 환경 유해 화학 물질의 함유가 의심되는 시료를 포유동물 유래의 세포에 처리하는 단계;
2) 상기 처리된 세포(실험군) 및 처리하지 않은 대조군로부터 RNA를 분리하는 단계;
3) 상기 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
4) 단계 3)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
5) 단계 4)의 반응한 DNA 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계;
6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하는 단계; 및,
7) 단계 6)에서 비교한 데이터를 통계처리하는 단계를 포함하는,
시료에 포함된 다환 방향족 탄화수소류, 잔류성 유기 오염 물질류 및 휘발성 유기 화합물류로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 인체 위해성 환경 유해 화학 물질을 분류(classify)하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 시료는 토양, 하천, 해수, 빗물 및 대기로부터 채취한 환경시료인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 다환 방향족 탄화 수소류는 벤조에이파이렌, 다이벤토에이에이취안트라센, 크라이센, 페난트렌, 나프탈렌, 3-메틸콜란트렌, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-cd)파이렌으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나이고;
상기 잔류성 유기 오염 물질류는 톡사펜, 마이렉스, 클로르덴으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나이며; 및,
상기 휘발성 유기 화합물류는 벤젠, 톨루엔, o-자일렌, 에틸 벤젠, 트리클로로에틸렌 및 디클로로메탄으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 확인 방법.
제 5항에 있어서, 상기 단계 5)의 분석은 SAM 분석법 또는 아노바 분석법을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 단계 7)의 통계처리는 단계 5)에서 수행한 SAM 및 아노바 분석결과를 바탕으로, 상기 SAM 및 아노바 분석법의 정확도를 예측하는 것을 특징으로 하는 방법.
하기 유전자군에 포함된 유전자의 프로브 세트 또는 상기 유전자를 증폭시키는 프라이머 쌍을 포함하는, 다환 방향족 탄화수소류, 잔류성 유기 오염 물질류 및 휘발성 유기 화합물류로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 인체 위해성 환경 유해 화학 물질에 대한 노출 여부 확인용 키트:
유전자등록번호(GeneBank) NM_198468(chromosome 6 open reading frame 167), 유전자등록번호(GeneBank) THC2432288(Q15694(Q15694) Protein immuno-reactive with anti-PTH polyclonal antibodies(Fragment), partial(59%) [THC2432288]), 유전자등록번호(GeneBank) NM_022145(centromere protein K), 유전자등록번호(GeneBank) AW291149(Transcribed locus), 유전자등록번호(GeneBank) BX647769(ankyrin repeat domain 36), 유전자등록번호(GeneBank) NM_020675(SPC25, NDC80 kinetochore complex component, homolog(S. cerevisiae)), 유전자등록번호(GeneBank) NM_003368(ubiquitin specific peptidase 1), 유전자등록번호(GeneBank) NM_018353(chromosome 14 open reading frame 106), 유전자등록번호(GeneBank) XM_930499(Homo sapiens, clone IMAGE:5167446, mRNA. [BC031698]), 유전자등록번호(GeneBank) NM_004419(dual specificity phosphatase 5), 유전자등록번호(GeneBank) NM_002658(plasminogen activator, urokinase), 유전자등록번호(GeneBank) NM_199357(Rho GTPase activating protein 11A), 유전자등록번호(GeneBank) NM_003516(histone cluster 2, H2aa3), 유전자등록번호(GeneBank) NM_001172(arginase, type II), 유전자등록번호(GeneBank) NM_080388(S100 calcium binding protein A16), 유전자등록번호(GeneBank) NM_020937(Fanconi anemia, complementation group M), 유전자등록번호(GeneBank) NM_182522(family with sequence similarity 19(chemokine(C-C motif)-like), member A4), 유전자등록번호(GeneBank) NM_004925(aquaporin 3(Gill blood group)), 유전자등록번호(GeneBank) NM_005463(Homo sapiens heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D-like(HNRPDL), transcript variant 1, mRNA [NM_005463]), 유전자등록번호(GeneBank) NM_002305(lectin, galactoside-binding, soluble, 1(galectin 1)), 유전자등록번호(GeneBank) NM_005271(glutamate dehydrogenase 1), 유전자등록번호(GeneBank) NM_006399(basic leucine zipper transcription factor, ATF-like), 유전자등록번호(GeneBank) NM_004695(solute carrier family 16, member 5(monocarboxylic acid transporter 6)), 유전자등록번호(GeneBank) NM_002867(RAB3B, member RAS oncogene family), 유전자등록번호(GeneBank) NM_203401(stathmin 1/oncoprotein 18), 유전자등록번호(GeneBank) NM_001493(GDP dissociation inhibitor 1), 유전자등록번호(GeneBank) NM_002129(high-mobility group box 2), 유전자등록번호(GeneBank) NM_003897(immediate early response 3), 유전자등록번호(GeneBank) NM_007075(WD repeat domain 45), 유전자등록번호(GeneBank) AK092644(Homo sapiens cDNA FLJ35325 fis, clone PROST2012542.), 유전자등록번호(GeneBank) NM_003355(uncoupling protein 2(mitochondrial, proton carrier)), 유전자등록번호(GeneBank) NM_020918(glycerol-3-phosphate acyltransferase, mitochondrial), 유전자등록번호(GeneBank) NM_004073(polo-like kinase 3(Drosophila)), 유전자등록번호(GeneBank) XM_497271(Homo sapiens similar to High mobility group protein 1(HMG-1)(Amphoterin)(Heparin-binding protein p30)(LOC441593), mRNA), 유전자등록번호(GeneBank) NM_004523(kinesin family member 11), 유전자등록번호(GeneBank) NM_203500(kelch-like ECH-associated protein 1), 유전자등록번호(GeneBank) NM_001034840(Homo sapiens similar to RIKEN cDNA 4933434I20(LOC152586), mRNA [NM_001034840]), 유전자등록번호(GeneBank) NM_001948(dUTP pyrophosphatase), 유전자등록번호(GeneBank) NM_004864(growth differentiation factor 15), 유전자등록번호(GeneBank) NM_000713(biliverdin reductase B(flavin reductase(NADPH))), 유전자등록번호(GeneBank) NM_004221(Homo sapiens interleukin 32(IL32), transcript variant 2, mRNA), 유전자등록번호(GeneBank) NM_003254(TIMP metallopeptidase inhibitor 1), 유전자등록번호(GeneBank) NM_005953(metallothionein 2A), 유전자등록번호(GeneBank) NM_002754(mitogen-activated protein kinase 13), 유전자등록번호(GeneBank) NM_001547(interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2), 유전자등록번호(GeneBank) NM_013282(ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1), 유전자등록번호(GeneBank) A_23_P123234(Unknown), 유전자등록번호(GeneBank) A_24_P306614(Unknown), 유전자등록번호(GeneBank) NM_000436(3-oxoacid CoA transferase 1), 유전자등록번호(GeneBank) NM_175744(ras homolog gene family, member C), 유전자등록번호(GeneBank) NM_015853(SAPK substrate protein 1).
제 11항에 있어서, 포유동물 유래의 세포를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 11항에 있어서, 상기 다환 방향족 탄화 수소류는 벤조에이파이렌, 다이벤토에이에이취안트라센, 크라이센, 페난트렌, 나프탈렌, 3-메틸콜란트렌, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-cd)파이렌으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나이고;
상기 잔류성 유기 오염 물질류는 톡사펜, 마이렉스, 클로르덴으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나이며; 및,
상기 휘발성 유기 화합물류는 벤젠, 톨루엔, o-자일렌, 에틸 벤젠, 트리클로로에틸렌 및 디클로로메탄으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 것을 특징으로 하는 키트.
제 11항에 있어서, 상기 프로브 세트는 제 1항의 마이크로어레이 칩을 이용한 마이크로어레이에 사용되는 것을 특징으로 하는 키트.
제 11항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 실시간 RT-PCR에 사용되는 것을 특징으로 하는 키트.