KR20110076908A - 당단백질중의 바이러스 제거 및 불활성화 방법 - Google Patents

당단백질중의 바이러스 제거 및 불활성화 방법 Download PDF

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KR20110076908A
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Abstract

본 발명에서는 당단백질 중의 바이러스 제거 및/또는 불활성화 방법을 제공하였는바, 상기 방법은 (a)당단백질의 유기용액처리 단계; (b)당단백질의 미공성막 여과 단계; (c)당단백질의 이온교환크로마틱그래피 단계중의 한단계 혹은 여러단계에서 선택되고 또한 상기 단계의 순서를 임의로 교체할 수 있고 상기 유기용액처리는 침전형성 및/또는 현탁액교반처리중에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

Description

당단백질중의 바이러스 제거 및 불활성화 방법 {A METHOD FOR REMOVING/INACTIVATING VIRUS IN GLYCOPROTEIN}
본 발명은 생물의약분야에 관한 것이고, 특히 불임증을 치료하는 글리코실화 단백질의 바이러스를 제거 및 불활성화하는 방법에 관한 것이다.
불임증을 치료하는 당단백질은 한 종류의 구조가 비슷한 물질이며, 여기에는 인간 융모성 성선자극호르몬(HCG), 인간 폐경성 선자극호르몬(HMG), 난포자극호르몬(FSH), 황체형성호르몬(LH)이 포함된다. 그중, 인간 폐경성 선자극호르몬은 난포자극호르몬과 황체형성호르몬을 함유하며, 또한 이들이 일정한 비율(1:0.1-1)로 구성된 혼합물이다.
HCG, FSH, LH에 있어서, α사슬과 β 사슬 두개의 소단위는 비공유결합의 형식으로 결합되었다. 그중 이들의 α 소단위는 완전히 같으며, 92개 아미노산을 가지고 있고 분자량은 약 14500D이다. 52번과 78번 위치의 아스파라긴(asparagine)은 N-글루코실화의 아미노산이다. HCG의 β 소단위는 145 내지 147개의 아미노산을 갖고 있으며, 분자량은 22200-39000D이고, 그중 제13, 제30위치 상의 아스파라긴 및 121, 127, 132, 145번 위치는 글리코실화가 발생하는 부분이다. 그러나, LH의 β소단위는 121개의 아미노산으로 구성되었으며, 분자량은 약 14800D이다.
임상에서, HCG,HMG,FSH,LH는 주로 불임치료 및 체외의 보조적 생식에 사용된다. 이들은 특정된 여성(임신기간 또는 폐경 후)의 뇨에서 분리할 수 있으며, DNA재조합 기술을 통해 제조할 수도 있다.
현존의 혈액제제약물의 방법과정에는 일반적으로 특정된 바이러스의 제거 및 불활성화의 여러 단계의 조합이 있다. 예를 들어 열처리, 저pH처리, 계면활성제처리 등이 있다. 그러나 이러한 단계는 상기 글리코실화 단백질 약물에 전혀 적합하지 않다. 이러한 글리코실화 단백질 약물은 열과 저pH에 대한 내구성이 약해, 쉽게 활성을 잃을 수 있기때문이다.
ICH Q5A 생물제제 바이러스 안전성평가 규정에 따르면, 제조과정에서 두단계 혹은 두단계 이상의 과정을 조합해야 하고, 또한 적어도 한단계의 바이러스 제거 및 불활성화 비율이 104 보다 커야만 비로소 안전하고 효율적인 바이러스 제거 및 불활성화방법이라고 인정할 수 있다.
그러므로，본 분야에서는 불임증 치료에 적합한 글리코실화 단백질의 바이러스 제거 및 불활성화 방법을 개발할 것을 절실히 필요로 함으로써 안전하고 효율적인 약물을 얻고자 한다.
본 발명은 당단백질 중의 바이러스 제거 및/또는 불활성화하는 방법을 제공하는데 목적이 있다.
본 발명의 첫번째 방면에 따르면, 바이러스를 포함하지 않는 당단백질을 제공한다.
다른 바람직한 예 중에서, 상기 당단백질 중 HIV의 함량은 PCR법에 의해 1mg/mL의 농도 하에서 음성으로 검출된다.
다른 바람직한 예 중에서, 상기 당단백질 중 HBV의 함량은 PCR법에 의해 1mg/mL의 농도 하에서 음성으로 검출된다.
다른 바람직한 예 중에서, 상기 당단백질 중HCV의 함량은 PCR법에 의해 1mg/mL의 농도 하에서 음성으로 검출된다.
상기 형광정량법(QF-PCR)은 용해액과 추출액을 통해 시료중의 핵산(DNA 혹은 RNA)을 추출한 다음 핵산중합효소연쇄반응을 이용하여 특이성 바이러스의 핵산서열을 증폭시키고, 형광에 의한 강도을 통하여 바이러스의 적정량을 측정하는 방법이다. 본 분야의 통상적인 기구와 시약을 사용하여 PCR검출을 실행할수 있다. 하지만, 예를 들어 항주대화열자기전자유한회사(
Figure pct00001
)의 형광정량검사시스템, 심천필기생물공정유한회사（
Figure pct00002
)의 HBV, HCV, HIV 핵산증가형광정량검사 키트를 사용할 수 있는데, 이에만 한하지는 아니한다.
다른 바람직한 예 중에서, 상기 당단백질은 융모성 성선자극호르몬, 난포자극호르몬, 황체형성호르몬, 폐경성선자극호르몬 혹은 그 혼합물 중에서 선택된다.
다른 바람직한 예 중에서, 상기 융모성 성선자극호르몬은 인간 융모성 성선자극호르몬 혹은 그 변이체이고 인뇨에서 유래된 및/또는 재조합된 인간 융모성 성선자극호르몬 혹은 그 변이체에서 선택되고, 상기 폐경성선자극호르몬은 인간폐경성선자극호르몬 혹은 그 변이체이고, 인뇨에서 유래된 및/또는 재조합된 인간폐경성선자극호르몬 혹은 그 변이체에서 선택되며, 상기 난포자극호르몬은 인간 난포자극호르몬 혹은 그 변이체이고, 인뇨에서 유래된 및/또는 재조합된 인간 난포자극호르몬 혹은 그 변이체에서 선택되고, 상기 황체형성호르몬은 인간 황체형성호르몬 혹은 그 변이체이고, 인뇨에서 유래된 및/또는 재조합된 인간 황체형성호르몬 혹은 그 변이체에서 선택된다.
본 발명의 두번째 방면에 따르면, 당단백질 호르몬중의 바이러스 제거 및/또는 불활성화 하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a)당단백질의 유기용액처리 단계; (b)당단백질의 미공성막 여과 단계; (c)당단백질의 이온교환 크로마틱그래피 단계중의 한가지 혹은 여러가지에서 선택되고, 또한 상기 단계의 순서를 임의로 교환할 수 있으며, 상기 유기용액처리는 침전형성 및/혹은 현탁액교반 처리 중에서 선택됨을 특징으로 한다.
다른 바람직한 예 중에서, 상기 당단백질호르몬은 융모성 성선자극호르몬, 난포자극호르몬, 황체형성호르몬, 폐경성선자극호르몬 혹은 그 혼합물 중에서 선택된다.
다른 바람직한 예 중에서, 상기 융모성 성선자극호르몬은 인간 융모성 성선자극호르몬 혹은 그 변이체이고, 인뇨에서 유래된 및/또는 재조합된 인간 융모성 성선자극호르몬 혹은 그 변이체중에서 선택되고, 상기 폐경성선자극호르몬은 인간폐경성선자극호르몬 혹은 그 변이체이고, 인뇨에서 유래된 및/또는 재조합된 인간폐경성선자극호르몬 혹은 그 변이체에서 선택되며, 상기 난포자극호르몬은 인간 난포자극호르몬 혹은 그 변이체이고 인뇨에서 유래된 및/또는 재조합된 인간 난포자극호르몬 혹은 그 변이체에서 선택되고, 상기 황체형성호르몬은 인간 황체형성호르몬 혹은 그 변이체이고, 인뇨에서 유래된 및/또는 재조합된 인간 황체형성호르몬 혹은 그 변이체에서 선택된다.
다른 바람직한 예 중에서, 상기 단계(a)중에서 상기 유기용액은 30 내지 100v/v%의 유기용매/수용액이다.
다른 바람직한 예 중에서, 상기 유기용액은 70 내지 100v/v%의 유기용매/수용액이다.
다른 바람직한 예 중에서, 상기 유기용매는 에틸알코올, 메틸알코올, 아세톤, 혹은 에틸에테르에서 선택된다.
다른 바람직한 예 중에서, 상기 유기용매는 에틸알코올 혹은 아세톤에서 선택된다.
다른 바람직한 예 중에서, 상기 단계(a)중에서 상기 당단백질과 유기용액의 중량체적비는 0.5 내지 2 그램:15 내지 60 밀리리터이다.
다른 바람직한 예 중에서, 상기 당단백질과 유기용액의 중량체적비는 0.7 내지 1.5 그램:20 내지 40 밀리리터이다.
다른 바람직한 예 중에서, 상기 단계(a)중에서 영하 30℃ 내지 30℃에서 당단백질의 유기용액처리를 0.5 분 내지 6 시간 진행한다.
다른 바람직한 예 중에서, 상기 단계(a)중에서 영하 20℃ 내지 20℃에서 당단백질의 유기용액처리를 1 분 내지 4시간 진행한다.
다른 바람직한 예 중에서, 상기 단계(b)중에서 상기 미공성막은 공경이 1000달톤 이상에 달하는 한외여과막, 공경이 1 내지 100nm인 바이러스제거막 혹은 공경이 0.1 내지 1㎛인 세균여과막에서 선택된다.
다른 바람직한 예 중에서, 상기 단계(b)중에서 상기 미공성막은 공경이 100000달톤 이상에 달하는 한외여과막, 공경이 10 내지 80nm인 바이러스제거막 혹은 공경이 0.2 내지 0.8㎛인 세균여과막에서 선택된다.
다른 바람직한 예 중에서, 상기 단계(c)중에서 상기 이온교환크로마틱그래피는 pH가 5 내지 10인 조건하에서 진행된다.
다른 바람직한 예 중에서, 상기 단계(c)중에서 상기 이온교환크로마틱그래피는 pH가 6 내지 8인 조건하에서 진행된다.
본 발명의 세번째 방면에 따르면, 일종의 약물조성물을 제공한다. 상기 조성물은 본 발명에서 제공되는 바이러스를 불포함한 당단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
따라서，본 발명은 불임증치료에 적합한 글리코실화 단백질의 바이러스 제거/불활성화 방법을 제공하여 안전하고 효율적인 약물을 얻는다.
현존 기술중에 단백질중의 바이러스 제거 및/또는 불활성화 하는 방법이 존재하지만, 동일한 방법은 부동한 단백질에 대해 예측할 수 없는 결과를 초래하며 어떤 경우에는 심지어 바라는 것과 정반대인 결과를 초래할 수도 있다, 어떤 방법은 모종 단백질에 응용할 수 있지만, 그 구체적인 응용조건에 있어서 다른 단백질과 큰 차이가 존재할 수 있다. 이를 감안하여 발명인은 광범위하고 깊은 연구를 거쳐 놀랍게도 유기용액처리, 미공성막여과 및 이온교환크로마틱그래피의 방법 중의 한 단계 혹은 모든 단계의 임의의 조합을 통하여 글리코실화 단백질 중의 바이러스 제거/불활성화의 목적에 도달할 수 있다는 것을 발견하였으며, 이로써 온화한 조건하에서 바이러스를 제거/불활성화 하였으며, 또한 대상물인 글리코실화 단백질의 활성을 보류하였다. 이 기초상에서 발명인은 본 발명을 완성하였다.
연구과정에서, 발명인은 에틸알코올 혹은 아세톤 등 유기용매의 처리에 의하여 바이러스 불활성화 작용을 일으키나, HCG, HMG, FSH, LH의 활성에는 아무런 영향이 없다는 점에 주의를 돌렸다. 본 발명인은 적합한 미공성막 여과기술을 이용할 경우, 바이러스 입자는 여과막에 남겨지나 대상물은 막에서 여과되어 대상물과 바이러스를 분리하는 목적에 도달할수 있음을 발견하였다. 그밖에, 발명인은 시험과정에서 적합한 조건하에서 이온 크로마토그래피를 통과시키는 경우, 바이러스는 이온수지상에 흡착되지만 대상물은 흡착되지 않음을 의외로 발견하였으며, 이로써 대상물 중의 바이러스를 제거하는 목적에 도달할 수 있었다.
상기 세 단계 중의 한 단계 혹은 여러 단계의 임의의 조합을 통해 효율적으로 바이러스를 제거/불활성화 할수 있기에 안전적이고 신뢰성 있는 제품을 얻을 수 있었다.
정의
원문에서 사용되는 바와같이, "당단백질" 및 "글리코실화 단백질"은 서로 교환하여 사용할수 있으며, 모두 융모성 성선자극호르몬(chorionic gonadotropin, CG), 난포자극호르몬(follicule-stimulating hormone, FSH), 황체형성호르몬(luteotropic hormone, LH), 인간 폐경성선자극호르몬(human menopausal gonadotropin, HMG)중의 한가지 혹은 여러가지를 혼합한 중에서 선택된다.
전문용어인 "난포자극호르몬"과 "FSH"는 서로 교환사용 가능하고 모두 정자 혹은 난포 생성을 촉진하는데 쓰이며, 난소발육을 촉진하는 일종의 호르몬 혹은 그 변이체를 가리킨다. 또한 자연적인 상황하에서 뇌하수체 전엽으로 부터 분비되며, 폐경기간에 있는 부녀의 뇨에서 추출되거나 혹은 재조합기술을 통해서 얻을수 있다. 본 발명중의 FSH는 본 분야에서 통상적으로 사용되는 임의의 방식으로도 얻을수 있는데, 예를 들어 천연적으로 생성되거나, 재조합기술을 통해 얻거나 합성하며, 그중의 불순물로는 LH 혹은 CG가 포함된다. 본 발명의 한가지 실시방식 중에서 상기 난포자극호르몬는 인간 난포자극호르몬 혹은 그 변이체이며, 바람직하게는, 인뇨에서 유래된 난포자극호르몬 혹은 재조합된 인간 난포자극호르몬이다.
본 발명에 쓰일수 있는 FSH를 함유한 동시에 불순물인 LH 및/또는 CG를 포함한 원료로는 다음과 같다: 아무런 예비 정제단계를 거치지 않은 원료, 예비 정제단계를 거쳐 부분적인 불순물이 제거된 원료, 혹은 예비정제단계를 거쳐 주로 FSH와 불순물인 LH 및/또는 CG만 포함하는 원료.
본 발명의 방법을 채용하여 FSH 정제를 진행하기 전에 본 분야의 통상적인 방법으로 원료FSH에 대해 초보적인 정제를 함으로써 LH혹은 CG 외의 기타 불순물을 분리시키는 것이 바람직하다.
원문에서 사용되는 바와같이, 전문용어인 "황체형성호르몬"과 "LH"는 서로 교환사용 가능하고 FSH를 함유한 원료제조 및 획득과정에서 그중에 혼합되는 천연LH와 같거나 비슷한 구조와 기능을 가진 호르몬을 가리킨다.
이와같이, 전문용어인 "인간 융모성 성선자극호르몬"과 "CG"는 서로 교환사용 가능하고 FSH를 함유한 원료제조 혹은 획득 과정에서, 그중에 혼합되는 천연CG와 같거나 비슷한 구조와 기능을 가진 호르몬을 가리킨다.
본 발명에서 제공되는 단백질 중 바이러스 제거 및/또는 불활성화 방법은 당단백질에 응용될뿐만 아니라 당단백질 조성물에도 응용되며, 상기 당단백질 조성물은 당단백질과 약학적/식품학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
원문에서 사용되는 바와같이, 전문용어인 "약학적으로 허용가능한" 혹은 "식품학적으로 허용가능한"의 성분은, 사람 및/또는 동물에 적용할수 있으며 과도한 부작용(예를 들어 독성, 자극과 이상반응)이 없는 즉 합리한 효익/위험비율을 갖는 물질이다.
원문에서 사용되는 바와같이, 전문용어인 "약학적으로 허용가능한 담체"는 치료제투약을 위한 담체를 가리키며, 여기에는 각종 부형제와 희석제가 포함된다. 이 전문용어는 아래와 같은 약제담체를 가리킨다.그들 자체는 필요한 활성성분이 아니며 사용 후 과도한 독성이 없다. 적합한 담체는 본 분야의 통상의 지식을 가진자에게 잘 알려져있는 담체이다. <레밍턴 약물과학>(Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Pub. Co.，N.J. 1991)중에서 약학적으로 허용가능한 부형제에 관한 충분한 토론을 찾아볼 수가 있다.
상기 "약학적으로 허용가능한 담체"는 액체를 함유할 수 있는데, 예하면 물, 염수, 글리세린 및 에틸알코올이다. 이밖에, 이러한 담체 중에는 보조적인 물질이 존재할수 있는데, 예하면 충전제, 붕해제, 윤활제, 유동화제, 기포제, 습윤제 혹은 유화제, 방취제, pH완충물질 등이다. 일반적으로 이러한 물질은 무독하고 불활성적인 약학적으로 허용가능한 수성담체에 배합할수 있는데, 그중 pH는 일반적으로 약5 내지 8이고 더욱 바람직하게 약 6 내지 8이다.
방법
본 발명이 제공하는 당단백질 중의 바이러스 제거 및/또는 불활성화 방법은 한가지 혹은 여러가지 단계를 포함하며 여러가지 단계의 순서는 임의로 조합될수 있다.
상기 단계는 유기용액 처리, 미공성막 처리, 및 이온교환 크로마틱그래피 처리이다.
상기 유기용액 처리는 당단백질과 유기용액을 혼합하여 침전시키거나 혼합교반하여 현탁액을 형성시켜 바이러스가 활성을 잃게 한다. 혼합온도는 영하 30℃ 내지 30℃이고 더욱 바람직하게는 영하 20℃ 내지 20℃이며, 혼합 혹은 혼합교반 시간은 0.5분 내지 6시간이고 더욱 바람직하게는 1분 내지 4시간이며, 당단백질과 유기용액 혼합 시, 중량체적비는 0.5 내지 2그램:15내지 60밀리리터이고, 더욱 바람직하게는 0.7 내지 1.5 그램:20 내지 40밀리리터이며, 상기 유기용액은 30 내지 100v/v%의 유기용매/수용액이고, 더욱 바람직하게는 70 내지 100v/v%의 유기용매/수용액이며, 상기 유기용매는 에틸알코올, 메틸알코올, 아세톤 혹은 에틸에테르 중에서 선택되고, 더욱 바람직하게는 에틸알코올 혹은 아세톤 중에서 선택된다.
상기 미공성막 처리는, 당단백질 농도가 15 내지 60밀리그램/밀리리터(더욱 바람직하게는 20 내지 40 밀리그램/밀리리터임)의 용액을 사용하여 미공성막을 통하여 바이러스를 제거 및/또는 불활성화 시킨다. 상기 미공성막은 공경이 1000달톤 이상에 달하는 한외여과막, 공경이 1 내지 100nm인 바이러스제거막, 혹은 공경이 0.1 내지 1㎛인 세균여과막에서 선택된다. 더욱 바람직하게는, 상기 미공성막은 공경이 100000 달톤 이상에 달하는 한외여과막, 공경이 10 내지 80nm인 바이러스제거막 혹은 공경이 0.3 내지 0.8㎛인 세균여과막에서 선택된다. 상기 용액의 pH는 6 내지 10이고 더욱 바람직하게는 7 내지 9이며, 예하면, 인산염, 초산염 혹은 Tris 완충용액이다.
상기 이온교환크로마틱그래피 처리는, 당단백질농도가 15 내지 60 밀리그램/밀리리터(더욱 바람직하게는 20 내지 40 밀리그램/밀리리터임)의 용액을 이온교환수지에 통과시키는데 일반적인 바이러스는 수지상에 흡착되고 당단백질은 용리액에 따라 흘러나오게 함으로써 바이러스를 제거 및/또는 불활성화시킨다. 상기용액의 pH는 5 내지 10이고, 더욱 바람직하게는 6 내지 8이며 이를테면 인산염, 초산염 혹은 Tris완충용액이다. 본 분야의 통상적인 이온교환수지를 사용할 수 있다. 예하면 약음이온교환수지를 사용할 수 있지만 이에 한하지는 않고, 더욱 바람직하게는 DEAE Sephadex이다.
본 발명의 방법을 이용하여 제거 및/또는 불활성화 시키는 바이러스는 본 기술분야에 잘 알려져 있는 바이러스이다. 예하면 HIV, HAV, HBV, HCV, 돼지 파보바이러스이지만 이에 한하지는 않는다.
본 발명에서 제공되는 상기 특징 혹은 실시예에서 제공되는 특징은 임의로 조합할수 있다. 본발명의 명세서에서 게시되는 모든 특징은 어떠한 조성물형식과도 병용할 수 있으며, 명세서에서 게시되는 각각의 특징은 같거나 균등하거나 비슷한 목적을 제공할수 있는 어떠한 대체성 특징으로 교체할수 있다. 때문에 특별한 설명을 제외하고 게시되는 특징은 균등하거나 비슷한 특징의 일반적인 예일뿐이다.
본 발명의 주요한 우점은 아래와 같다:
1.본 발명에서 제공되는 방법은 안전하고 고 효율적이다.
2.본 발명에서 제공되는 방법은 조건이 온화하고 산업화생산에 적합하다.
이하 구체적인 실시예에 결합하여 본 발명에 대해 명백히 설명하고자 한다. 이해해야 할 것은 이러한 실시예는 본 발명을 설명하기 위한것이지 본 발명의 범위를 한정하기 위한것이 아니다. 하기의 실시예에서 구체적조건의 실험방법을 주석하지 아니 한 것은 일반적으로 통상적인 조건에 따라 예를 들어 Sambrook 등, 분자클론:실험실수첩(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)중에 기재된 조건 혹은 제조업자가 건의하는 조건에 따라 진행된다. 별도의 설명이 아니고서는 모든 백분비는 중량에 따라 계산된다.
별도로 정의를 내리지 않은 것은 원문에서 사용하는 모든 전업과 과학기술용어는 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 익숙히 알고있는 의미와 같다. 이밖에 기재된 내용과 비슷하거나 균등한 어떠한 방법 및 재료는 전부 본 발명의 방법에 응용된다. 원문에서 서술된 바람직한 실시방법과 재료는 시범용으로만 사용된다.
본 발명의 실시예에서 사용되는 검출용바이러스, 검출용세포계, 바이러스의 제조 및 세포독성검사의 방법은 아래와 같다:
검출용 바이러스
실험에 사용되는 지표바이러스를 검증한 바에 의하면, 상기 지표바이러스는 부동한 물리화학적 특성을 가지고 있으며 제품의 오염상황을 분석하는데 쓰일수 있다.
HIV-1는 일종의 레트로바이러스(구형)이고 레트로바이러스과(직경 80 내지 100nm)에 속한다. 이러한 지연성 바이러스는 열과 극단적 pH에 민감하며 지성용제와 세척제의 작용하에서 파괴된다. 상기 HIV-1는 HIV-2의 모델형 바이러스로 될수 있다. 감염세포중에서 합포체형성을 촉진하고 유도하는 특성에 의해 검출을 진행할 수 있다.
가성광견병바이러스는 일종의 지질피막형 DNA바이러스(구형)이고 헤르페스 바이러스과에 속한다. 이러한 바이러스는 저단백농도하에서 열에 민감하고 극단의 pH치와 지성용제에 민감하다. 이 바이러스가 허용세포중에서 합포체형성을 촉진하고 유도하는 특성에 의해 검출을 진행할 수 있다.
소바이러스성 설사 바이러스는 일종의 지질피막형 RNA바이러스(다구형)이고 플라비비리대과(직경 40 내지 60nm)에 속한다. 이러한 전염성 바이러스는 상대적으로 열에 견디지 못하고 유기용제에 민감하며 산에서 불안정 하지만 염기에서는 안정하다. 상기 소바이러스성 설사 바이러스는 HCV의 모델형 바이러스로 될수 있다. 이 바이러스가 허용세포중에서 세포병변을 촉진하고 유도하는 특성에 의해 검출을 진행할 수 있다.
돼지파보바이러스는 일종의 비지질피막형 DNA바이러스(20면체형)이고 파보바이러스과(직경 18-24nm)에 속한다. 이러한 파보바이러스는 극단적 고열에 견딜수 있고 지성용제에서 안정적이며 상대적으로 산성pH에 견딘다. 상기 돼지파보바이러스는 파보바이러스 B19의 모델형 바이러스로 될수 있다. 이 바이러스가 허용세포중에서 세포병변을 촉진하고 유도하는 특성에 의해 검출을 진행할 수 있다.
HAV는 일종의 비지질피막형 바이러스이고 피코르나바이러스과(직경 27nm)에 속한다. 이러한 바이러스는 상대적으로 열 안정성을 갖고 있고 유기용제와 비이온성 세척제에 견딜수 있으며 산성 pH조건하에서도 안정적이다. 이 바이러스가 허용세포 중에서 세포병변을 촉진하고 유도하는 특성에 의해 검출을 진행할 수 있다.
검출용 세포계
C8166（인간, CO4+성인 임파세포림프구）세포는, 페니실린(50iu/ml), 스트렙토마이신(50㎍/ml) 및 10%의 소태아혈청을 함유하고 있으며, 글루타민산염I（Glutamax I）을 추가함유한 RPMI 1640배지에서 배양된다. 바이러스 분석과정에서 세포도 상술한 바와같이 상기 배지중에 보존된다.
CRFK(고양이, 신장에서 유래, Felis catus)세포는 페니실린(50iu/ml), 스트렙토마이신(50㎍/ml), 1% 비필수아미노산 및 10% 소태아혈청을 함유하고 아미노산염I(Glutamax I）을 추가함유한 EMEM배지에서 배양된다. 바이러스 분석과정에서 세포도 상술한 바와 같이 상기 배지중에 보존된다.
NBL-1(소, 신장에서 유래, Bos taurus)세포는 페니실린(50iu/ml), 스트렙토마이신(50㎍/ml) 및 5%의 말혈청이 포함되며, 아미노산염I（Glutamax I）이 추가포함되는 EMEM배지중에서 배양된다. 바이러스분석과정에서 세포도 상술한 바와 같이 상기 배지중에 보존된다.
ST(돼지, 고환에서 유래)세포는 페니실린(50iu/ml), 스트렙토마이신(50㎍/ml) 및 10% 소태아혈청이 포함되고 아미노산염I(Glutamax I)이 추가포함된 DMEM 배지중에서 배양된다. 바이러스분석과정에서 세포도 상술한 바와 같이 상기 배지중에서 보존된다. 하지만 소태아혈청농도는 2%로 저하된다.
FRhK-4(레서스원숭이, 신장에서 유래, Macaca mulatta)세포는 페니실린(50iu/ml), 스트렙토마이신(50㎍/ml) 및 10% 소태아혈청이 포함되고 글루타민산염I（Glutamax I）이 추가포함되는 DMEM배지중에서 배양된다. 바이러스분석과정에서 세포도 상술한 바와 같이 상기 배지중에 보존된다. 하지만 소태아혈청농도는 2%로 저하된다.
바이러스의 제조
HIV-1는 C8166세포 감염을 통해 제조된다. 세포가 감염된 후 3 내지 5일 배양시켜 상층액을 얻는다.
가성광견병바이러스는 단층배양한 CRFK세포 감염을 통해 제조된다. 세포 감염 후 뚜렷한 세포병변 현상이 관찰될 때까지 배양시킨다. 감염된 세포는 무균조건하에서 동결융해, 분해, 원심분리등 단계를 거쳐 마지막에 상층액을 얻는다.
소바이러스성 설사 바이러스는 단층배양한 NBL-1세포 감염을 통해 제조된다. 세포 감염 후 뚜렷한 세포병변현상이 관찰될 때까지 배양시킨다. 감염된 세포는 무균조건 하에서 동결융해, 분해, 원심분리등 단계를 거쳐 마지막에 상층액을 얻는다.
돼지파보바이러스는 단층배양한 ST세포 감염을 통해 제조된다. 세포 감염 후 뚜렷한 세포병변 현상이 관찰될 때까지 배양시킨다. 감염된 세포는 무균조건하에서 동결융해, 분해, 원심분리등 단계를 거쳐 최후에 상층액을 얻는다.
HAV는 단층배양의 FRhK-4세포 감염을 통해 제조된다. 세포 감염 후 뚜렷한 세포병변 현상이 관찰될 때까지 배양시킨다. 감염된 세포는 무균조건하에서 동결융해, 분해, 원심분리등 단계를 거쳐 최종적으로 상층액을 얻는다.
HIV-1는 합포체생성측정을 통하여 적정량을 확정한다. 가성광견병바이러스, 소바이러스성 설사 바이러스, 돼지파보바이러스는 모두 TCID50측정을 통하여 적정량을 확정한다.
세포독성검사
바이러스 혼합 전 먼저 시료를 보존배지에 넣은 후,시료 세포계에 대한 독성을 검사한다. 검출용 세포계로는 C8166, CRFK, NBL-1, ST 및 FRhK-4세포이다.
보존배지를 이용하여 검사할 시료를 1배로부터 243배까지 3배비로 희석시킨다. 매 하나의 세포계는 모두 하나의 음성 대조군이 있으며 대조군은 보존배지만 포함하고 시료는 포함하지 않는다. CRFK, NBL-1, ST 및 FRhK-4세포계에 있어서, 검사할 시료과 음성 대조군을 검사용세포에 접종시킨 후 37℃, 5%의 CO2의 습윤한 환경 속에서 약 90분 동안 배양시킨 다음 접종물을 옮겨가고 인산완충용액으로 세포배양판을 세척하며 또한 매개 구멍에 보존배지를 분주한다. C8166세포계에 있어서, 검사할 시료과 음성 대조군을 부유세포에 접종시킨 후, 37℃, 5%의 CO2의 습윤한 환경속에서 배양시킨다.
이어서, 37℃, 5%의 CO2의 습윤한 환경속에서 적당한 시간동안 다시 세포를 배양시킨다. C8166세포는 11일간 배양시키고, CRFK세포는 생산단계(1)중의 시료를 검사할 경우, 13일간 배양시키며, 생산단계(3)중의 시료를 검사할 경우, 8일간 배양시킨다. NBL-1세포는 생산단계(1)중의 시료를 검사할 경우, 10일간 배양시키고 생산단계(3)중의 시료를 검사할 경우, 8일간 배양시킨다. ST세포는 8일간 배양시키고, FRhK-4세포는 생산단계(2)중의 시료를 검사할 경우, 18일간 배양시키고 생산단계(3)중의 시료를 검사할 경우,19일간 배양시킨다. 이 기간동안 현미경으로 세포병변현상을 관찰한다.
하기 실시예에서 단백질 생물학적 역가 혹은 생물활성의 측정방법은 중국 약전(2005년 판본)의 우로키아나제 항목내에서의 효소활성 검사방법 및 부록 XII M, XII N, XII E의 방법에 따라 검증된다.
실시예 1
1g의 HCG조제품(상해 천위생물제약유한회사
Figure pct00003
에서 구입)에 30ml, -20℃±2℃의 무수에틸알코올을 첨가시켜 균일하게 혼합하여 현탁액(초기시료로 간주)을 제조한 후, 현탁액의 체적을 측정하였다. 초기시료를 12℃±2℃에 유지시켜 교반하는 한편 각각 HIV-1, 가성광견병바이러스, 소바이러스성 설사 바이러스를 2ml씩 첨가시키며, 매 종류의 바이러스에 평균 두조(A와B)의 평행실험을 진행하였다. 혼합한 후 2ml의 시료를 취하여 세포를 감염시키며, 최초에 첨가한 바이러스 양(이시간을 0으로 함)을 측정하였다. 바이러스를 첨가한 후의 용액을 상술한 바와 같이 12℃±2℃에서 유지시키면서 지속적으로 3시간 교반하였다. 그다음 2ml의 시료를 취하여 세포를 감염시키고 바이러스 감염율을 측정하였다.
바이러스 불활성화 결과
바이러스 공백대조군 최초 바이러스 첨가량
（sfu50/ TCID50 log10）		 바이러스 저하량
（log10）
HIV-1 A：5.95 B：6.27 A：>5.17 B：>5.49
가성광견병바이러스 A：7.46 B：7.23 A：>6.88 B：>6.66
소바이러스성 설사바이러스 A：7.09 B：6.71 A：>6.89 B：>6.51
HCG생물학적 역가 결과
HCG 총 생물학적 역가 상대적 백분율
에틸알코올 처리 전 100 %
에틸알코올 처리 후 97.1 %
상기 결과에서 보다시피, 세가지 지질피막형 바이러스의 저하량는 모두 105 이상이며, 또한 HCG 생물학적 역가는 거의 손실이 없다. 이로써 이 단계가 HCG의 생산안전성을 보장하고 지질피막형 바이러스의 오염을 방지하는데 매우 중요한 작용을 일으킴을 알수 있다.
실시예 2
1g의 HMG조제품(상해 천위생물제약유한회사에서 구입)중에 30ml, -20℃±2℃의 무수에틸알코올을 첨가시켜 혼합한 후 현탁액(초기시료로 간주함)을 제조하며 그 체적을 측정한다. 최초의 시료를 12℃±2℃에서 유지시켜 교반하는 한편 HIV-1, 가성광견병바이러스, 소바이러스성 설사 바이러스를 각각 2ml씩 첨가함으로써 매 종류의 바이러스에 평균 두조(A와B)의 평행실험을 진행하였다. 혼합한 후 2ml의 시료를 취하여 세포를 감염시키고 최초에 첨가한 바이러스량(이 시기를 시간 0으로 간주)을 측정하였다. 바이러스를 첨가한 후의 용액을 상술한 바와 같이 12℃±2℃에서 유지시키면서 지속적으로 3시간 교반한다. 그다음 2ml의 시료를 취하여 세포를 감염시키고 바이러스 감염율을 측정하였다.
바이러스불활성화 결과
바이러스 공백 대조군 최초 바이러스 첨가량
（sfu50/ TCID50 log10）		 바이러스 저하량
（log10）
HIV-1 A：6.04 B：6.26 A：>5.26 B：>5.48
가성광견병바이러스 A：7.28 B：7.21 A：>6.71 B：>6.64
소바이러스성 설사 바이러스 A：6.91 B：7.26 A：>6.69 B：>7.05
HMG생물학적 역가 결과
HMG 총 생물학적 역가 상대적 백분율
에틸알코올 처리 전 100 %
에틸알코올 처리 후 103.8 %
결과에서 보다시피, 세가지 지질피막형 바이러스의 저하량는 모두 10- 5 이상이고 또한 HMG 생물학적 역가는 거의 손실이 없기에 이 단계가HMG의 생산안전성을 보장하고 지질피막형 바이러스의 오염을 방지하는데 매우 중요한 작용을 일으킴을 알수 있다.
대조예
1g의 우로키아나제조제품(상해 천위생물제약유한회사에서 구입)중에 30ml, -20℃±2℃의 무수에틸알코올을 첨가하고 혼합하여 현탁액(최초의 시료로 간주함)을 제조하며 또한 현탁액의 부피를 측량하였다. 시료를 12℃±2℃에서 유지시켜 지속적으로 3시간 동안 교반하였다. 그다음 시료를 취하여 우로키나아제의 활성변화를 측정한다.
우로키나아제 활성측정결과
우로키나아제 총 적정량 상대적 백분율
에틸알코올 처리 전 100 %
에틸알코올 처리 후 17 %
상기 결과에서 보다시피, 유사한 에틸알코올 처리방법은 우로키나아제 등 단백질에 대해 불활성화 작용이 있기에 적합하지 않다.
실시예 3
50ml, pH7.8±0.1의 인산완충용액을 12℃±2℃까지 냉각시킨 후, 1g의 DEAE Sephadex A-50에 첨가시켰다. 용액을 12℃±2℃에서 적어도 15시간동안 유지시켜 수지를 충분히 팽윤시켰다. 맨 마지막 층의 체적이 15ml로 되도록 팽윤시킨 수지 현탁액을 XK16컬럼에 넣었다. 연동펌프 관에 pH가 7.0±0.1인 초산나트륨 완충용액을 가득 채운 후, 컬럼에 연결시켰다. 상기 완충용액으로 적어도 5개 컬럼의 체적(75ml)을 평형시키고 유속을 0.17-0.18ml/min로 한다. 만약 컬럼의 출구에서 유속을 측정해야 할 경우, 펌프 속도를 조절하여 유속을 제어시킨다. 유출액의 pH가 입구 완충용액의 pH치와 같다고 확정될때까지 유출액을 수집하고 그의 pH를 측량한다. 시료를 컬럼에 투하하는 준비가 완료 될때에 연동펌프와 컬럼의 출구를 닫는다.
12℃±2℃, 20ml의 평형 완충용액(초산나트륨 완충용액, pH 7.0±0.1)에 600mg의 HCG조제품(상해 천위생물제약유한회사에서 제공됨)을 교반하면서 첨가시켰다. 시료는 12℃±2℃에서 지속적으로 적당한 시간동안 교반됨으로써 HCG의 충분한 용해를 확보한다. 그다음 용해된 이 시료의 pH와 전도율 측정하는데 만약 평형 완충용액과 일치하지 않을 경우 초산으로 조절할 수 있다. 이로써 초기시료의 체적을 측정하였다. 초기시료를 12℃±2℃에서 유지시키고 교반하면서 돼지파보바이러스, HAV를 각각 1ml씩 첨가하며 매 종류의 바이러스에 대해 평균 두조의 평행실험을 진행하였다. 혼합한 후 1ml의 시료를 취하여 최초 바이러스첨가량을 측정하였다.
흡입관을 시료액에 잠구어, 이 흡입관속에 액체를 가득 채운 후 연동펌프를 가동시킨다. 바이러스를 첨가한 시료는 0.17-0.18ml/min의 유속으로 컬럼속에 투입된다. 체적이 7ml일때 유출액을 수집하기 시작하였다. 시료를 컬럼에 투입완료 후 평형 완충용액으로 컬럼을 씻고 유속은 0.10-0.11ml/min로 제어시켰다. 43ml의 유출액을 수집한 경우, 이를 수집액으로 간주한다. 1ml의 시료를 취하여 바이러스 감염율을 측정한다.
바이러스제거 결과
바이러스 최초 바이러스 첨가량
（TCID50 log10）		 바이러스 저하량
（log10）
돼지파보바이러스 A：6.91 B：7.50 A：>6.74 B：>7.33
HAV A：6.69 B：6.31 A：3.28 B：2.90
결과에서 보다시피, 돼지파보바이러스의 저하량은 비교적 양호한바 106 보다 크다. HAV바이러스의 저하량은 각각 3.28 log10와 2.90 log10이다. 그리하여, 이 단계가 HCG생산안전성을 제고시키고 비지질피막형 바이러스의 오염을 방지하는데 일정한 작용을 일으켰다고 볼수 있다.
실시예 4
시료가 600mg의 HMG조제품(상해 천위생물제약유한회사에서 제공)인 것 외, 기타 단계는 실시예3과 일치하다.
바이러스제거 결과
바이러스 최초 바이러스 첨가량
（TCID50 log10）		 바이러스 저하량
（log10）
돼지파보바이러스 A：7.40 B：7.24 A：4.84 B：>7.23
HAV A：6.17 B：6.44 A：2.35 B：3.00
결과에서 보다시피, 돼지파보바이러스의 저하량은 비교적 양호한바 104 보다 크다. HAV바이러스의 저하량은 각각 2.35 log10와 3.00 log10이다. 이로써 이 단계가 HMG 생산안전성을 제고시키고 비지질피막형 바이러스의 오염을 방지하는데 일정한 작용을 일으켰다고 볼 수 있다.
대조예
평형액이 pH4.5±0.1인 초산나트륨 완충용액인 것 외,시료 및 단계는 모두 실시예3과 일치하다.
바이러스제거 결과
바이러스 최초 바이러스 첨가량
（TCID50 log10）		 바이러스 저하량
（log10）
돼지파보바이러스 A：6.25 B：7.02 A：0.21 B：1.37
HAV A：6.98 B：6.19 A：0.55 B：0.91
결과에서 보다시피, 돼지파보바이러스와 HAV에 있어서 바이러스 저하량은 1 log10 좌우 혹은 1 log10보다 낮다. 이로써 pH가 4.5±0.1인 평형액이 존재하는 조건하에서는, 이 단계가 HMG생산안전성을 제고시키고 비지질피막형 바이러스의 오염을 방지하는데 거의 효과가 없음을 알 수 있다.
실시예 5
Pall Ultipor VF DV20여과기를 준비한다. 20ml의 무균초정제수로 최대압력이 30psi인 조건하에서 여과기를 충분히 적신다. 20ml, pH7.0±0.1의 초산암모늄 용액중에서 교반시키면서 600mg의 HCG조제품(상해 천위생물제약유한회사에서 제공)을 용해시키고 또한 시료의 체적 측량하였다. 시료를 교반하면서 매 종류의 바이러스를 1ml씩 첨가한다. 매 종류의 바이러스에 대해 평균 두조의 평행실험을 진행하였다. 혼합 후 1ml의 시료를 취하여 최초 바이러스 첨가량을 측정하였다. 바이러스를 첨가한 후의 시료는 0.2㎛의 여과기를 거쳐 여과된다. 1ml의 시료를 취하여 바이러스 감염율을 측정하였다. 나머지 시료는 최고 압력이 30psi인 조건에서 이미 습윤해진 Pall VF DV 20여과기를 거쳐 여과되었다. 여과액을 다른 용기에 수집하였다. 최고압력이 30psi(2070mba)인 조건하에서 5ml, pH7.0±0.1의 초산암모늄 완충용액으로 여과기를 세척하였다. 여과액 체적을 측정하였으며, 1ml의 시료를 취하여 바이러스 감염율을 측정하였다.
바이러스제거 결과
바이러스 여과기에 첨가된 바이러스의 양
（sfu50/ TCID50 log10）		 바이러스 저하량
（log10）
HIV-1 A：4.91 B：4.76 A：>4.88 B：>4.73
가성광견병바이러스 A：5.78 B：5.64 A：>5.73 B：>5.61
소바이러스성 설사 바이러스 A：5.74 B：5.67 A：>5.69 B：>5.63
돼지파보바이러스 A：7.03 B：6.66 A：6.04 B：5.55
HAV A：5.77 B：6.29 A：>5.74 B：>6.26
결과에서 보다시피, 5가지 종류의 바이러스의 저하량은 모두 104 이상이다.이로써 이 단계가 HCG의 생산안전성을 보장하고 지질피막형 바이러스와 비지질피막형 바이러스의 오염을 방지하는데 매우 중요한 작용을 일으킴을 알 수 있다.
실시예 6
시료가 400mg의 HMG조제품(상해 천위생물제약유한회사에서 제공)인 것 외, 기타 단계는 실시예 5와 일치하다.
바이러스제거 결과
바이러스 여과기에 첨가되는 바이러스량
（sfu50/ TCID50 log10）		 바이러스 저하량
（log10）
HIV-1 A：5.18 B：4.99 A：>4.92 B：>4.73
가성광견병바이러스 A：6.02 B：5.47 A：>6.00 B：>5.46
소바이러스성 설사 바이러스 A：5.70 B：5.47 A：>5.69 B：>5.46
돼지파보바이러스 A：6.61 B：6.85 A：4.38 B：4.61
HAV A：6.51 B：6.39 A：>6.50 B：>6.36
결과에서 보다시피, 5가지 종류의 바이러스의 저하량은 모두 104 이상이다.이로써 이 단계가 HCG의 생산안전성을 보장하고 지질피막형 바이러스와 비지질피막형 바이러스의 오염을 방지하는데 매우 중요한 작용을 일으킴을 알 수있다.
실시예 7
HCG동결건조 주사제의 제조
10000병의 HCG동결건조 주사제를 제조하는데 사용되고 또한 매병에 1000 IU 를 함유한 HCG생산에 사용되는 전형적인 예는 다음과 같다.
실시예1,3,5와 같은 세개 단계처리를 거친 HCG정제품의 일정한 량을 계산하는데, 여기서 주의할 점은 이 매개 단계는 모두 별도의 바이러스를 첨가하지 않았다는 것이다. 일정한 량(생물학적 역가를 단위로 함)을 계산한 다음 100 mL의 파이로진프리 주사용수(pyrogen-free water)에 용해시켰다. 필요한 경우,HCl 혹은 NaOH로 pH 를 7.0±0.2로 조절한 다음 0.22 ㎛여과기로 무균여과를 시킨다.
300 g의 만니톨과 10.9 g의 NaH2PO4 ·H2O를 3 L의 파이로진프리 주사용수에 용해시키고 NaOH로 pH를 7.0±0.2로 조절한다. 0.22 ㎛여과기로 무균여과를 한 후, 상기 HCG용액에 첨가시키고 파이로진프리 주사용수로 7.0 L까지 일정한 체적으로 되게한 다음 고르게 혼합시켰다.
상기 용액을 매 병이 0.70 mL로 되게 항생제병에 분주 한 후, 동결건조를 시켰다.
얻어진 항생제병중에는 매병에 1000 IU의 HCG과 30 mg의 만니톨이 포함되어 있다.
실시예 8
HMG 동결건조 주사제의 제조
10000병의 HMG동결건조 주사제를 제조하는데 사용되고 또한 매병에 75 IU 를 함유하는 FSH와 75 IU를 함유한 LH생산에 사용되는 전형적인 예는 다음과 같다.
실시예2, 6와 같은 두 단계처리를 거친 HMG정제품의 일정한 량을 계산하는데, 여기서 주의할 점은 이 매개 단계는 모두 별도의 바이러스를 첨가하지 않았다는 것이다. 일정한 량(생물학적 역가를 단위로 함)을 계산한 다음 100 mL의 파이로진프리 주사용수에 용해시켰다. 필요한 경우, HCl 혹은 NaOH로 pH를 6.5±0.2로 조절한 다음 0.22 ㎛여과기로 무균여과를 시킨다.
100 g유당은 2 L의 파이로진프리 주사용수에 용해시키며,필요한 경우, HCl 혹은 NaOH로 pH를 6.5±0.2로 조절한다. 0.22 ㎛여과기로 무균여과 한 후, 상기 HMG용액에 용해시키고 파이로진프리 주사용수로 7.5 L까지 일정한 체적으로 되게한 다음 혼합시켰다.
상기 용액을 매병이 0.75 mL로 되게 항생제병에 분주한 후, 동결건조를 시켰다.
얻어진 항생제병중에는 매병에 75 IU의 FSH와 75IU의 LH 및 10 mg의 유당이 포함되어 있다.
실시예 9
FSH 동결건조 주사제의 제조
10000병의 FSH동결건조 주사제를 제조하는데 사용되고 또한 매병에 75 IU를 함유하는 FSH의 생산에 사용되는 전형적인 예는 다음과 같다:
실시예 2, 4, 6와 같은 세개 단계처리를 거친 FSH정제품의 일정한 량을 계산하는데, 여기서 주의할 점은 이 매개 단계는 모두 별도의 바이러스를 첨가하지 않았다는 것이다. 일정한 량(생물학적 역가를 단위로 함)을 계산한 다음 100 mL의 파이로진프리 주사용수에 용해시켰다.필요한 경우, HCl 혹은 NaOH로 pH를 6.5±0.2로 조절한다. 0.22 ㎛여과기로 무균여과를 시켰다.
100 g유당을 2 L의 파이로진프리 주사용수에 용해시켰다.필요한 경우, HCl 혹은 NaOH로 pH를 6.5±0.2로 조절한다. 0.22 ㎛여과기로 무균여과 후 상기 FSH용액에 용해시키고 파이로진프리 주사용수로 7.5 L까지 일정한 체적으로 되게한 다음 혼합시켰다.
상기 용액을 매 병이 0.75 mL로 되게 항생제병에 분주한 후 동결건조시켰다.
얻어진 항생제병중에는 매병에 75 IU의 FSH와 10 mg의 유당이 포함되어 있다.
본 발명에서 언급한 모든 문헌은 본 출원에서 참고로 인용되었는바, 각각의 문헌을 단독으로 인용하여 참조한 것과 같다. 그 밖에 본 발명의 상기 내용을 보고 당업자라면 본 발명의 요지를 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 변화나 변경이 가능할 할것이며 이러한 등가 형태의 변화 역시 본 발명의 청구 범위에 속하는 것임을 밝힌다.

Claims (20)

  1. 바이러스를 포함하지 않는 당단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 당단백질중 HIV의 함량이 PCR법에 의해 1 mg/mL의 농도하에서 음성으로 검출된 것을 특징으로 하는 당단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 당단백질중HBV의 함량이 PCR법에 의해 1 mg/mL의 농도하에서 음성으로 검출된 것을 특징으로 하는 당단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 당단백질중 HCV의 함량이 PCR법에 의해 1 mg/mL의 농도하에서 음성으로 검출된 것을 특징으로 하는 당단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 당단백질은 융모성 성선자극호르몬, 난포자극호르몬, 황체형성호르몬, 폐경성선자극호르몬 혹은 그 혼합물에서 선택됨을 특징으로 하는 당단백질.
  6. 제5항에 있어서, 상기 융모성 성선자극호르몬은 인간 융모성 성선자극호르몬 혹은 그 변이체이고 인뇨에서 유래된 및/또는 재조합된 인간 융모성 성선자극호르몬 혹은 그 변이체에서 선택되고, 상기 폐경성선자극호르몬은 인간폐경성선자극호르몬 혹은 그 변이체이고, 인뇨에서 유래된 및/또는 재조합된 인간폐경성선자극호르몬 혹은 그 변이체에서 선택되며, 상기 난포자극호르몬은 인간 난포자극호르몬 혹은 그 변이체이고, 인뇨에서 유래된 및/또는 재조합된 인간 난포자극호르몬 혹은 그 변이체에서 선택되고, 상기 황체형성호르몬은 인간 황체형성호르몬 혹은 그 변이체이고, 인뇨에서 유래된 및/또는 재조합된 인간 황체형성호르몬 혹은 그 변이체에서 선택됨을 특징으로 하는 당단백질.
  7. (a)당단백질의 유기용액 처리단계; (b)당단백질의 미공성막 여과 단계;(c)당단백질의 이온교환크로마틱그래피 단계중의 한단계 혹은 여러 단계에서 선택되고 또한 상기 단계의 순서를 임의로 교환할 수 있고 상기 유기용액처리는 침전형성 및/또는 현탁액교반처리중에서 선택됨을 특징으로 하는 당단백질 호르몬중의 바이러스 제거 및/또는 불활성화 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 단계(a)중의 유기용액은 30 내지 100v/v%의 유기용매/수용액인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 유기용액이 70-100v/v%의 유기용매/수용액인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 유기용매는 에틸알코올, 메틸알코올, 아세톤 혹은 에틸에테르중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 유기용매는 에틸알코올 혹은 아세톤중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제7항에 있어서, 상기 단계(a)중의 당단백질과 유기용액의 중량체적비는 0.5 내지 2그램:15 내지 60밀리리터인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 당단백질과 유기용액의 중량체적비는 0.7 내지 1.5그램:20 내지 40밀리리터인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제7항에 있어서, 상기 단계(a)에서 영하 30℃ 내지 30℃에서 당단백질의 유기용액처리를 0.5분 내지 6시간 진행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 단계(a)에서 영하 20℃ 내지 20℃에서 당단백질의 유기용액처리를 1분 내지 4시간 진행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제7항에 있어서, 상기 단계(b)에서 상기 미공성막은 공경이 1000달톤 이상에 달하는 한외여과막, 공경이 1 내지 100nm인 바이러스제거막 혹은 공경이 0.1 내지 1㎛인 세균여과막에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제7항에 있어서, 상기 단계(b)에서 상기 미공성막은 공경이 100000달톤 이상에 달하는 한외여과막, 공경이 10 내지 80nm인 바이러스제거막 혹은 공경이 0.2 내지 0.8 ㎛인 세균여과막에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제7항에 있어서, 상기 단계(c)에서 상기 이온교환크로마틱그래피는 pH가 5 내지 10인 조건에서 진행된 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제7항에 있어서, 상기 단계(c)중에서 상기 이온교환크로마틱그래피가 pH가 6 내지 8인 조건에서 진행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1항의 당단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물조성물.
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