CN100417663C - 高纯度尿卵泡刺激素的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
一种高纯度尿卵泡刺激素的纯化方法,它是将偶氮红色染料偶联到Sepharose 4B上用作亲和分离纯化尿卵泡刺激素的介质,在分离纯化尿卵泡刺激素时,采用包括染料亲和层析和QAE离子交换层析等工艺步骤从绝经尿促性腺素中纯化得到高纯度尿卵泡刺激素产品。采用本发明纯化方法生产的产品生物效价不低于200IU/mg,FSH/LH>100,色白易溶,各项指标都符合或超过《英国药典》98版相应指标,可直接用于注射针剂的生产之用。
Description
技术领域
本发明涉及到一种高纯度尿卵泡刺激素的纯化方法,特别是一种从人绝经促性腺素(HMG)粗品中纯化获得卵泡刺激素(FSH)产品的纯化方法。
背景技术
卵泡刺激素(Follicle Stimulating Hormone,FSH)也称为促卵泡激素,是由垂体嗜碱性细胞合成和分泌的糖蛋白。其分子量为33,000Dal,由两个非共价α、β亚基组成,α亚基含有92个氨基酸,与黄体生素(Luteinizing hormone,LH)及绒毛膜促性激素(Human Chorionicgonadotropin,HCG)的α亚基极其相似,β亚基由115个氨基酸组成,是决定其特异性的组成部分。由于FSH是一种糖蛋白类激素,而且其分子量、等电点等理化性质与LH、TSH(促甲状腺激素)等非常相似,因此采用经典的离子交换层析(例如DEAE树脂和SP-Sephadex)、凝胶层析(例如Sephadex G-100)等方法很难对其有效分离纯化。中国专利号88103966.7描述了采用针对FSH的单克隆抗体的免疫亲和层析和反相HPLC等步骤从绝经尿促性腺素中纯化获得人体FSH。该专利中将抗菌素FSH的单克隆抗体偶联到琼脂糖上,再经过上样和洗涤、洗脱等步骤,其中的洗脱液为1M的氨水溶液,洗脱4倍柱床体积,洗脱完成后用冰醋酸尽快将溶液的pH值调整到9.0,然后进行超滤浓缩,接着进行反相HPLC操作获得纯度较高的FSH。该专利中由于使用抗体进行亲和层析,而抗体与其对应的抗原FSH的亲和力非常高,洗脱必须用强碱条件下(氨水)将结合在琼脂糖上的FSH洗脱下来,在此条件下,FSH容易变性成为没有生物活性的蛋白,或者容易损失其中的糖基而成为对正常生理功能有强烈抑制作用的物质,因此该专利中所涉及的工艺不适合工业化生产。中国专利号99101376X描述了采用三嗪染料作为配体的亲和层析进行纯化FSH的简单又经济的工艺。该工艺中,HMG粗品先用80-90%(体积/体积)乙醇水溶液去除病毒,然后在DEAE阴离子交换树脂上进行离子交换层析,从而洗脱得到FSH组分,然后用该组分溶液上三嗪染料亲和层析上洗脱下来的溶液经过强碱性阴离子树脂DE53 Whatman层析柱,洗脱组分经过超滤脱盐和冷冻干燥后获得纯度比较高的FSH产品,该发明中报道的FSH的活性回收率达到56%。
发明内容
本发明的目的就是提供一种采用染料亲和层析工艺从HMG粗品中分离纯化获得高纯度FSH的纯化方法,该纯化方法能够在有效降低HMG中的LH污染的同时,保持FSH的生物活性,同时产品中FSH的活性回收率比较高,容易扩大到工业化生产规模。
本发明包括以下FSH的纯化步骤。首先将红色染料(偶氮类染料,例如Reactive Red 120)配成初如浓度为0.5~3.5%(W/V)溶液(初始的配基溶液),然后加入10~50%(W/V)Sepharose 4B凝胶,升温后加入助染剂,固定剂以及催化剂,在一定的条件下反应。在本发明中,染料亲和层介质的合成过程中所用的最佳的助染剂可以为NaCl,固定剂为Na2CO3,催化剂可以为DABCO。偶联后的凝胶反复用纯水洗净备用,装于通常用于亲和层析的层析柱,其中小试试验中亲和层析柱为2.5cm×10cm,中试试验中为20cm×80cm。
HMG粗品经过磺基水杨酸和聚乙二醇处理后,上硼砂(pH8.0)缓冲液平衡过的红色染料亲和层析柱,然后进行洗涤操作。其中洗涤的溶液最好是甘氨酸-NaOH缓冲液。然后进行洗脱操作,其中最好的洗脱溶液是含一种钾盐的甘氨酸-NaOH缓冲液,获得FSH组分。FSH和LH的生物活性可以用放射免疫的方法使用Serono FSH Maiclone检测试剂盒(目录号为13101)进行监测。蛋白浓度的检测采用Lowry试剂法进行,蛋白质标准为牛血清白蛋白(Pierce公司产品,目录号为2323)。
获得的具有FSH生物活性的组分上用磷酸盐缓冲液平衡的QAE离子交换层析柱尺寸(径×高)为2cm×18cm,中试用的QAE离子交换层析柱为5cm×30cm。依次经过洗涤和洗脱操作后,获得纯度比较高的FSH组分。
从QAE离子交换层析柱上洗脱下来的FSH组分经过通常的超滤、膜过滤以及冷冻等步骤,获得FSH产品。该产品在无菌条件下分装。同时进行热原、内毒素、HIV、HCV、HBV病毒的检测。
用本发明的方法能够得到纯度较高的FSH产品,平均生物学效价达到200IU/mg以上,FSH/LH>100,色白易溶,各项指标都符合或超过《英国药典》98版相应指标,可直接用于注射针剂的生产之用。而且工艺中FSH的活性回收率均高于目前以报道的方法,为60%以上。为工业化大规模生产时降低成本打下了基础。
附图说明
图1为红色染料亲和层纯化FSH的层析谱图。
图2为离子交换层析纯化FSH的层析谱图
具体实施方式
红色染料与Sepharose 4B的偶联:称取一定量红色染料(偶氮类染料,例如Reactive Red 120)配基加入到蒸馏水中,使初始的配基浓度为为0.5~3.5%(W/V)之间,搅拌溶解,然后加入10~50%(W/V)洗涤滤干的Sepharose 4B凝胶,置于恒温水浴摇床在1-10min内升到所需的反应温度(40-80℃),然后加入助染剂染色(例如NaCl),30分钟后再加入Na2CO3(终浓度为10-25g/L)固定15min,然后加入催化剂(例如DABCO),反应2-10小时。反应的pH控制在9~10之间。偶联后的凝胶反复用纯水洗净备用。
FSH的纯化步骤1-粗品的处理:HMG粗品中的FSH活性约为1IU/mg,LU的活性约为1IU/mg。由于HMG粗品中含有很多杂蛋白,以及高岭土等杂质,确定以下粗品处理的工艺;先用去离子水将粗品溶解为2%(W/V)的溶液,然后在缓慢搅拌的条件下用0.2mol/L碘基水杨酸溶液将粗品溶液的pH值调成3.5,操作条件4℃,过夜静置。离心收集上清液,上清液先用1mmol/L、pH8.0硼砂缓冲夜透析24小时后准备上亲和层析柱。
FSH的纯化步骤2-染料亲和层析:干燥后的染料亲和层析介质先用纯水于20℃左右过液溶胀,然后装柱。含有染料亲和层介质的染料亲和柱先用20mM的硼砂(pH8.0)缓冲液平衡,然后上样,其中,样品为经过预处理的HMG溶液,上样溶液的蛋白浓度为10mg/mL胶。用20mM的硼砂(pH8.0)缓冲液循环2-4柱床体积。先用50mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH10)洗涤5柱床体积,然后50mM甘氨酸-NaOH,0.2MKCl(pH9)缓冲液洗涤4柱床体积。
采用50mM甘氨酸-NaOH,0.2~3MKCl(pH9)进行梯度洗脱。用紫外检测仪监测蛋白质的洗脱峰,对FSH组分进行超滤除盐,并用pH7.3的缓冲液调整其pH值,同时取样检测FSH的活性。
红色染料亲和层析纯化FSH的层析谱图1所示。
FSH的纯化步骤3-QAE交换层析:
用pH7.3的10-50mM PB缓冲液平衡QAE离子交换柱。然后上样,上样溶液的蛋白质浓度约为10-100mg/mL胶。用pH7.3的10-50mM PB缓冲液洗涤5柱床体积。
用pH7.3的10-50mM PB,20-100mM NaCl缓冲液进行洗脱。用紫外检测仪监测蛋白质的洗脱峰,同时取样检测FSH的活性。
QAE离子交换层析纯化FSH的层析谱图如图2所示。
FSH组分经过通常的超滤、膜过滤和冷冻干燥等步骤,获得符合《英国药典》98版规格的FSH产品。
Claims (3)
1. 一种高纯度尿卵泡刺激素的纯化方法,其特征是工艺步骤如下:
A、首先将红色偶氮类染料配成浓度为0.5~3.5%(W/V)的溶液,然后加入10~50%(W/V)滤干的Sepharose 4B凝胶,升温后先后加入助染剂、固定剂以及催化剂,进行偶联反应,偶联后的凝胶反复用纯水洗净,装于亲和层析的层析柱;
B、将人绝经促性腺素粗品经过磺基水杨酸处理后,上硼砂缓冲平衡过的红色染料亲和层析柱,然后进行洗涤操作和洗脱操作;
C、获得的具有FSH生物活性的组份上用磷酸盐缓冲液平衡的离子交换层析柱,离子交换层析柱依次经过洗涤和洗脱操作后,获得纯度比较高的FSH组分;
D、从离子交换层析柱上洗脱下来的FSH组分经过通常的超滤、膜过滤以及冷冻、干燥得FSH产品,将该产品在无菌条件下分装,同时进行热原、内毒素、HIV、HCV、HBV病毒的检测。
2. 根据权利要求1所述的高纯度尿卵泡刺激素的纯化方法,其特征是染料亲和层析介质的合成过程中所用的助染剂为NaCl,固定剂为Na2CO3,催化剂为DABCO。
3. 根据权利要求1所述的高纯度尿卵泡刺激素的纯化方法,其特征B操作中的洗涤溶液是pH10的50mM甘氨酸-NaOH缓冲液和pH9的50mM甘氨酸-NaOH,0.2MKCl缓冲液,洗脱溶液是pH9的50mM甘氨酸-NaOH、0.2~3M KCl缓冲液;其特征C操作中的洗涤溶液是pH7.3的10-50mM PB缓冲液,洗脱液是pH7.3的20-100mM NaCl、10-50mM PB缓冲液。
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