CN103739692B - 一种制备β2微球蛋白粗制品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备β2微球蛋白粗制品的方法。UK粗品、UTI粗品、HMG粗品或HCG粗品，溶解，离心或板框过滤后，上平衡液平衡好的金属螯合层析柱，UK、UTI、HMG和HCG均不吸附，而β2-M则结合到该金属螯合层析柱上，从而实现其分离，收集β2微球蛋白洗脱峰，制备β2微球蛋白粗制品。收集上样和冲洗穿透，用于UK、UTI、HMG或HCG的制备与纯化。该方法通过β2微球蛋白与这些尿蛋白的联产，可从正常人尿液中规模化提取β2微球蛋白，实现了尿液的综合利用，并大幅度降低了β2微球蛋白生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白的纯化方法，更具体的说是涉及从正常人的尿液中制备β2-微球蛋白的方法。
背景技术
β2微球蛋白（β2-microglobulin，简称β2-M）是由瑞典科学家Berggard1968年首次从尿中分离纯化出来，分子量11800，等电点5.7，因电泳在β2区带而得名。β2-M是由99个AA组成的单链多肽，它广泛存在于血浆，尿液，脑脊髓，唾液以及初乳中，是构成主要组织相容性复合体（MHC）-I类分子的亚单位。β2-M在肾小管被重吸收，但当肾小管损伤时尿液中浓度会明显升高，临床上检测血液或尿中的β2-M浓度为临床肾功能测定、肾移植成活、糖尿病肾病、重金属镉、汞中毒以及某些恶性肿瘤的临床诊断提供早期、可靠和灵敏的指标。脑脊液中β2-M的检测对脑膜白血病的诊断也有特别的意义。
β2-M在临床和科研工作中的应用日益广泛，因此对β2-M纯品的需求也日益增加。目前，β2-M主要从肾脏病人（肾小管坏死、肾移植）、慢性镉中毒和多发现骨髓瘤患者尿液中提取。虽然肾病患者尿液中的β2-M含量很高，但是存在来源少，收集困难等缺点，为β2-M纯品的制备与获得增加了难度。为了满足市场对β2-M的需求，研发出了基因工程产品人重组β2-M。由于基因工程的蛋白质结构可能与天然的β2-M存在差别，免疫活性位点有所差别，从而影响检测的准确性。如果能从正常人的人尿制备β2-M，则可供应量可以大幅度提高，这就是本发明的目的。
1968年Berggard等首先从肾小管病变患者（包括慢性镉中毒和骨髓瘤）尿液中经过超滤浓缩，区带电泳，凝胶过滤G-100,弱阴离子交换层析DEAE柱以及硫酸乙基葡聚糖层析5个步骤提取、纯化得到β2-M，提取率为11%-13%。1981年施秉钧从肾移植病人排异期尿液中通过硫酸铵盐析，凝胶过滤G-100及离子交换梯度层析等步骤分离纯化β2-M。以上的研究在一定程度上为提取分离β2-M提供了一定的方法，但是这些方法中有些虽然能使产品的纯度达到较高的水平，但其可用的人尿为特殊人群的尿液，收集极其困难，且收集量很小，制备的规模严重受限，不适于工业化生产，制备成本较高。
尽管正常人尿液中的β2-M含量很低，只有约0.35mg/L，但如果能得到巨量的尿液，则其中的β2-M成为一个相当可观的数量。目前，全球每天有数千吨正常人尿利用硅胶吸附其中的尿蛋白制备尿激酶（Urokinase,简称UK)粗品，利用壳聚糖吸附其中的尿蛋白制备人尿胰蛋白酶抑制剂（Urinary trypsin inhibitor，简称UTI）粗品，利用高岭土吸附绝经妇女尿液制备人绝经期促性腺激素（Human menopausal gonadotropin，简称HMG）粗品，以及利用苯甲酸钠吸附孕妇尿液制备人绒毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotropin，简称HCG)，经过检测，上述四种尿蛋白粗制品中均含有一定量的β2-M。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种从UK粗品、UTI粗品、HMG粗品或HCG粗品中制备β2微球蛋白粗制品的方法，该方法可以从正常人尿液中大量提取到β2-M，原料来源丰富，可以工业化、规模化生产β2-M，β2-M与UK、UTI、HMG、HCG四种尿蛋白实行联产，实现了尿液的综合利用，降低了生产成本。
为实现上述目的，本发明制备β2-M粗制品的方法采用的技术方案是：一种制备β2微球蛋白粗制品的方法，UK粗品、UTI粗品、HMG粗品或HCG粗品，溶解，离心或板框过滤后，上已平衡好的金属螯合层析柱，β2微球蛋白结合到该金属螯合层析柱上，收集β2微球蛋白洗脱峰，制备β2微球蛋白粗制品。UK、UTI、HMG和HCG均不吸附，而β2-M则结合到该金属螯合层析柱上，从而实现其分离，收集β2-M洗脱峰，制备β2-M粗制品，收集上样和平衡液冲洗穿透，用于UK、UTI、HMG或HCG的制备与纯化，实现了β2-M与UK、UTI、HMG、HCG等尿蛋白的联产。
所述制备β2-M粗制品的方法包含以下步骤：
(1) 取UK粗品、UTI粗品、HMG粗品或HCG粗品溶解，离心或板框过滤，得澄清的样品溶液；
(2) 调节样品溶液的pH和电导，上已经平衡好的金属螯合层析柱，再用平衡液冲洗；
(3) 继续用洗脱溶液洗脱，收集洗脱峰；
(4) 在收集的洗脱峰中的加入硫酸铵粉末至饱和，静置2－10小时后，收集沉淀，得到β2微球蛋白粗制品。可采用离心或者板框过滤收集沉淀。
所述的金属螯合层析柱螯合的金属离子是Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+中任意一种。优选Cu2+。
步骤（2）中，金属螯合层析柱平衡液为0.1-0.5M NH4Cl，0.01-0.1M磷酸盐或0.01-0.1M Tris-HCl，pH6-8。优选0.2M NH4Cl，0.05M磷酸盐。
步骤（2）中，调节样品溶液pH为6-8，电导为0.2-4mS/cm。优选条件pH7.0，电导为0.78mS/cm。
在步骤（2）和步骤（3）之间，增加一个冲洗步骤，利用冲洗液冲洗金属螯合层析柱，冲洗液为0.01-0.1M甘氨酸，0.01-0.1M磷酸盐或0.01-0.1M Tris-HCl，pH7－9。
步骤（3）中，金属螯合层析柱洗脱溶液为0.05-0.5M甘氨酸，0.01-0.1M Tris-HCl，pH7－9。优选0.38M甘氨酸，0.05M Tris-HCl，pH8.3。
在步骤（2）中，收集上样和平衡液冲洗穿透，用于UK、UTI、HMG或HCG的制备与纯化。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1. β2-M一般都从肾脏病人（肾小管坏死、肾移植）、慢性镉中毒和多发现骨髓瘤患者尿液中提取，因为肾病患者尿液中β2-M的含量很高，但是这些尿液来源少，大量收集很困难，本发明的β2-M来源于从正常男性尿液所制得的UK粗品和UTI粗品以及从绝经妇女尿中所制得的HMG粗品和从孕妇尿液中所制得的HCG粗品中提取，原料来源丰富，克服了之前原料采集困难的问题。
2. 采用了金属螯合亲和层析工艺，有效的分离了β2-M和其它尿蛋白，为β2-M后续的纯化步骤降低难度。
3. 本发明的β2-M可以跟UK、UTI、HMG、HCG这四种尿蛋白的制备实行联产，不仅实现了尿液的综合利用，而且降低了成本，适合工业化生产，可以获得非常可观的经济效益，防止了对环境的污染，具有良好的经济和社会价值。
附图说明
图1本发明为实施工艺流程图。
图2为本发明获得的粗制品得到的β2-M纯品小分子电泳Tricine-SDS-PAGE图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
一种制备β2-M粗制品的方法包含以下步骤：
(1) 取UK粗品、UTI粗品、HMG粗品或HCG粗品溶解，离心或板框过滤，得澄清的样品溶液；
(2) 调节样品溶液的pH至6-8，电导0.2-4mS/cm，优选pH7.0，电导0.78mS/cm，上已平衡的金属螯合层析柱，再用平衡液冲洗。平衡液为0.1-0.5M NH4Cl，0.01-0.1M磷酸盐或0.01-0.1M Tris-HCl，pH6-8。优选0.2M NH4Cl，0.05M磷酸盐；
(3) 利用冲洗液冲洗金属螯合层析柱，冲洗液为0.01-0.1M甘氨酸，0.01-0.1M磷酸盐或0.01-0.1M Tris-HCl，pH7－9；
(4) 用洗脱溶液洗脱，收集洗脱峰，洗脱溶液为0.05-0.5M甘氨酸，0.01-0.1M Tris-HCl，pH7－9。优选0.38M甘氨酸，0.05M Tris-HCl，pH8.3；
(5) 在收集的洗脱峰中的加入硫酸铵粉末至饱和，静置2－10小时后，收集沉淀，得到β2-M粗制品。可采用离心或者板框过滤收集沉淀。
(6) 在步骤（2）中，收集上样和平衡液冲洗穿透，用于UK、UTI、HMG或HCG的制备与纯化。
实施例1
取100gUK粗品，加入1000ml的0.01MTris-HCl缓冲液（pH7.6）溶解，4000rpm离心10min，取上清液，用0.45μm的滤膜过滤，将滤液调节pH至7.6，电导1.06mS/cm，上已经平衡好的金属离子为Cu2+的金属螯合层析柱（Chelating sepharose FF）；再用平衡液（0.3M NH4Cl，0.01M Tris-HCl，pH7.6）冲洗金属螯合层析柱，收集上样穿透液和冲洗穿透液，用于UK的制备与纯化；用含有0.07M甘氨酸，0.01MTris-HCl，pH8.0来冲洗柱子；用0.5M甘氨酸，0.01MTris-HCl，pH8.0洗脱溶液来洗脱柱子；收集洗脱溶液。
将收集的洗脱溶液，加入硫酸铵粉末至饱和，边加边搅拌，静置4小时，加入硅藻10g离心收集和吹干沉淀，得到β2-M粗制品16g。
通过检测β2-M的收率约87%，活性集中在β2-M粗制品中。β2-M含量如下表所示：
β2-M粗制品每克含有0.36mg，比活0.06mg/A280。
实施例2
取100gUTI粗品，加入1000ml的0.1M磷酸盐缓冲液（pH6.0）溶解，经硅藻土板框过滤后再用0.45μm的滤膜过滤。将滤液调节pH至6.0，电导0.2mS/cm，上已经平衡好的金属离子为Zn2+的金属螯合层析柱（Chelating sepharose FF）；再用平衡液（平衡液配方：0.1MNH4Cl，0.1M磷酸盐，pH6.0）冲洗金属螯合层析柱，收集上样穿透液和冲洗穿透液，用于UTI的制备与纯化；用含有0.05M甘氨酸，0.1M磷酸盐，pH7.0冲洗液来冲洗柱子；用含有0.1M甘氨酸，0.02M Tris-HCl，pH7.0洗脱溶液来洗脱柱子；收集洗脱溶液。
将收集的洗脱溶液，加入硫酸铵粉末至饱和，边加边搅拌，静置4小时，加入硅藻土10g离心收集和吹干沉淀，得到β2-M粗制品18g。
通过检测β2-M的收率约94%，活性集中在β2-M粗制品中。β2-M含量如下表所示：
β2-M粗制品每克含有0.6mg，比活0.055mg/A280。
实施例3
取100gHMG粗品，加入1000ml的0.05M磷酸盐缓冲液（pH7.0）溶解，4000rpm离心10min，取上清，用0.45μm的滤膜过滤，得滤液。将滤液调节pH至7.0，电导0.78mS/cm，上已经平衡好的金属离子为Cu2+的金属螯合层析柱（Chelating sepharose FF）；再用平衡液（0.2MNH4Cl，0.05M磷酸盐，pH7.0）冲洗金属螯合层析柱，收集上样穿透液和冲洗穿透液，用于HMG的制备与纯化；用含有0.1M甘氨酸，0.05M磷酸盐，pH7.6来冲洗柱子；用含有0.38M甘氨酸，0.05M Tris-HCl，pH8.3洗脱溶液来洗脱柱子；收集洗脱溶液。
将收集的洗脱溶液，加入硫酸铵粉末至饱和，边加边搅拌，静置4小时，加入硅藻土10g离心收集和吹干沉淀，得到β2-M粗制品16g。
通过检测β2-M的收率约90%，活性集中在β2-M粗制品中。β2-M含量如下表所示：
β2-M粗制品每克含有0.55mg，比活0.08mg/A280。
实施例4
取100gHCG粗品，加入1000ml的0.1MTris-HCl缓冲液（pH8.0）溶解，4000rpm离心10min，取上清，用0.45μm的滤膜过滤，得滤液。将滤液调节pH至8.0，电导4mS/cm，上已经平衡好的金属离子为Ni2+的金属螯合层析柱（Chelating sepharose FF）；再用平衡液（0.5MNH4Cl，0.1MTris-HCl， pH8.0）冲洗金属螯合层析柱，收集上样穿透液和冲洗穿透液，用于HCG的制备与纯化；用含有0.01M甘氨酸，0.1MTris-HCl，pH9.0冲洗液来冲洗柱子；用含有0.05M甘氨酸，0.1MTris-HCl，pH9.0缓冲液来洗脱柱子；收集洗脱溶液。
将收集的洗脱溶液，加入硫酸铵粉末至饱和，边加边搅拌，静置4小时，加入硅藻土10g离心收集和吹干沉淀，得到β2-M粗制品15g。
通过检测β2-M的收率约88%，活性集中在β2-M粗制品中。β2-M含量如下表所示：
β2-M粗制品每克含有0.21mg，比活0.058mg/A280。
Claims (8)
1.一种制备β2微球蛋白粗制品的方法，其特征在于：尿激酶粗品、人尿胰蛋白酶抑制剂粗品、促性腺激素粗品或人绒毛膜促性腺激素粗品，溶解，离心或板框过滤后，上已平衡好的金属螯合层析柱，β2微球蛋白结合到该金属螯合层析柱上，收集β2微球蛋白洗脱峰，制备β2微球蛋白粗制品。
2.根据权利要求1所述的一种制备β2微球蛋白粗制品的方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)取尿激酶粗品、人尿胰蛋白酶抑制剂粗品、促性腺激素粗品或人绒毛膜促性腺激素粗品溶解，离心或板框过滤，得到澄清的样品溶液；
(2)调节样品溶液的pH和电导，上已平衡好的金属螯合层析柱，再用平衡液冲洗；
(3)用洗脱溶液洗脱，收集洗脱峰；
(4)在收集的洗脱峰中的加入硫酸铵粉末至饱和，静置2－10小时后，收集沉淀，得到β2微球蛋白粗制品。
3.根据权利要求1或2所述的一种制备β2微球蛋白粗制品的方法，其特征在于，所述的金属螯合层析柱螯合的金属离子是Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+中任意一种。
4.权利要求2所述的一种制备β2微球蛋白粗制品的方法，其特征在于，步骤(2)中，金属螯合层析柱平衡液为0.1-0.5M NH4Cl，0.01-0.1M磷酸盐或0.01-0.1M Tris-HCl，pH6-8。
5.根据权利要求2所述的一种制备β2微球蛋白粗制品的方法，其特征在于，步骤(2)中，调节样品溶液pH为6-8，电导为0.2-4mS/cm。
6.根据权利要求2所述的一种制备β2微球蛋白粗制品的方法，其特征在于，在步骤(2)和步骤(3)之间，增加一个冲洗步骤，利用冲洗液冲洗金属螯合层析柱，冲洗液为0.01-0.1M甘氨酸，0.01-0.1M磷酸盐或0.01-0.1M Tris-HCl，pH7－9。
7.根据权利要求2所述的一种制备β2微球蛋白粗制品的方法，其特征在于，步骤(3)中，金属螯合层析柱洗脱溶液为0.05-0.5M甘氨酸，0.01-0.1M Tris-HCl，pH7－9。
8.根据权利要求2所述的一种制备β2-微球蛋白粗制品的方法，其特征在于，在步骤(2)中，收集上样和平衡液冲洗穿透，用于制备与纯化尿激酶、人尿胰蛋白酶抑制剂、促性腺激素或人绒毛膜促性腺激素。
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