KR20100125290A - 유전적으로 코딩된 비천연 아미노산에 의한 면역 내성의 파괴 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하나 이상의 비천연 아미노산을 가진 표적 부분의 항원성 버젼(version)을 투여하고/하거나 천연 표적 부분에 대해 교차 반응성을 나타내는, 하나 이상의 비천연 아미노산을 가진 표적 부분의 버젼에 대한 항체를 투여하여 대상체에서 표적 부분, 예컨대, 질환 관련 부분에 대한 면역학적 반응을 일으키고/키거나 증강시키는 방법 및 조성물을 포함한다.

Description

유전적으로 코딩된 비천연 아미노산에 의한 면역 내성의 파괴{BREAKING IMMUNOLOGICAL TOLERANCE WITH A GENETICALLY ENCODED UNNATURAL AMINO ACID}

[연방 지원 연구 및 개발 하에 완성된 발명에 대한 권리에 관한 진술]

본 발명은 국립보건원(NIH)으로부터 허가 제HL-16411호 하에 정부 지원으로 완성되었다(5RO1GM62159). 미국 정부는 본 발명에 대한 일정 권리를 가진다.

[관련 출원에 대한 상호 참조]

본원은 2008년 2월 8일자로 출원된 미국 가출원 제61/065,148호; 2008년 2월 12일자로 출원된 미국 가출원 제61/065,515호; 2008년 7월 25일자로 출원된 미국 가출원 제61/135,947호; 2008년 7월 31일자로 출원된 미국 가출원 제61/137,676호; 2008년 12월 29일자로 출원된 미국 가출원 제61/203,948호; 2008년 2월 8일자로 출원된 미국 가출원 제61/065,147호; 2008년 2월 12일자로 출원된 미국 가출원 제61/065,590호; 2008년 7월 25일자로 출원된 미국 가출원 제61/135,969호; 2008년 7월 31일자로 출원된 미국 가출원 제61/137,635호; 및 2008년 12월 29일자로 출원된 미국 가출원 제61/203,947호에 대한 우선권 및 이익을 주장한다(상기 가출원들의 개시내용은 모든 목적을 위해 전체로서 본원에 도입됨).

[발명의 분야]

본 발명은 면역학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 하나 이상의 비천연 아미노산이 도입되어 있는 표적 부분(target moiety)(즉, 자가 부분 또는 외래 부분)에 상응하는 면역원을 투여함으로써 대상체(subject)에서 자가 항원, 예를 들어, TNFα, 또는 다수의 다른 자가 항원 중 임의의 자가 항원에 대한 면역학적 반응을 일으키거나, 대상체에서 외래(비자가) 항원에 대한 면역학적 반응을 일으키거나 증강시키는 조성물 및 방법을 제공한다.

현대 의약에서 주요 과제는 (예를 들어, 자가 항원에 대한 대상체의 면역 내성으로 인해) 대상체에 의한 항체의 생성을 일으키지 못하거나 강한/강건한 항체 반응을 일으키지 못하는 의학적 병태(예를 들어, 특정 박테리아/바이러스 감염)의 치료에 관한 것이다. 이러한 부류에 속하는 다수의 의학적 병태가 존재한다. 예를 들어, 대상체 고유의 자가 단백질로부터 발생되거나 대상체 고유의 자가 단백질을 수반하는 병태는 (크론병, 내독성 쇼크, 뇌 말라리아 등에 관여된/관련된) TNFα, (SLE에 관여된) IL 10 등과 같은 부분을 수반할 수 있다. 나아가, 대상체가 다양한 바이러스 감염 및 박테리아 감염, 예컨대, HIV, CMV, 결핵 및 스타필로코커스에 대한 강한 항체 반응을 일으키는 것이 어려울 수 있다.

이러한 면역학적 반응 문제들을 해결하기 위한 다수의 다양한 방법들이 제안되었다. 예를 들어, 몇몇 방법들은 개선된 보조제(adjuvant)/담체, 항원 내로의 강한 T 세포 에피토프(epitope)의 도입, 접합 백신 및 조합 백신을 고려하였다. 예를 들어, 문헌[Baldridge, et al., Vaccine Adjuvants: Immunological and Clinical Principles. C. J. Hackett, Ham, D. A. Jr., Eds. (Humana Press, Totowa, NJ, 2006), pp. 235-255]; 문헌[Makela, et al., Expert Rev. Vaccines, 1(3): 399-410 (2002)]; 문헌[Dalum, et al., Nat. Biotechnol. 17:666 (1999)]; 및 문헌[Restifo, Curr Opin Immunol 8:658 (1996)]을 참조한다. 다른 방법들은 비특이적으로 표지된 항원(즉, 디아조늄 유도체화된 항원)을 사용한 면역화를 시도하였다. 문헌[Weigle, J. Exp. Med. 121:289 (1965)]을 참조한다.

그러나, 특정 자가 단백질, 예를 들어, TNFα, 및/또는 다양한 병원체, 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 진균 및/또는 프리온 병원체로부터 유래된 특정 단백질에 대한 대상체의 면역학적 반응을 일으키거나 증강시키는, 보다 우수하고 보다 널리 적용가능한 방법 및 조성물이 계속 요구된다. 본 발명은 심사 시 자명해질 상기 이점들 및 다른 이점들을 제공한다.

자가 단백질에 대한 강한 면역 반응을 선별적으로 유도하는 능력 또는 외래 항원의 특정 에피토프의 면역원성을 증가시키는 능력은 암, 단백질 폴딩(folding) 질환 및 감염 질환(예를 들어, 박테리아 또는 바이러스 감염)을 포함하는 다수의 질환 상태에 대한 백신의 제조에 있어서 중요하다. 본 발명은 백신접종(vaccination)에서 사용되는 비천연 면역원을 제조하거나 수동 면역화에서 사용되는 항체를 제조하기 위해 단백질 내로의 비천연 아미노산의 도입을 이용한다. 본 발명에서, 비천연 아미노산이 부가되는 면역원은 백신접종될/면역화될 대상체 내의 표적 부분(예를 들어, 질환 관련 부분)에 상응하거나, 대상체 내에 존재할 수 있는 표적 부분(예를 들어, 질환 관련 부분)에 상응한다. 비천연 아미노산을 가진 면역원이 대상체에 투여되는 실시양태에서, 비천연 아미노산의 존재는 표적(예를 들어, 질환 관련) 부분에 대한 교차 반응성을 보이는 면역원에 대한 면역학적 반응을 일으킨다.

제1 양태에서, 본 발명은 대상체에서 대상체 내에 존재하거나 대상체 내에 존재할 수 있는 표적 부분, 예를 들어, 폴리펩티드, 탄수화물 또는 이들의 조합물에 대한 면역학적 반응, 예를 들어, B 세포 매개 반응 및/또는 T 세포 매개 반응을 일으키거나 증강시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 면역원을 제공하는 단계, 및 상기 비천연 면역원을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 대상체(예를 들어, 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 소, 닭, 관행 케이지 사육조(cage birds), 개방형 복지 케이지 사육조(aviary birds), 파충류 및/또는 양서류)는 표적 부분에 대한 교차 반응성을 보이는 (이로써 표적에 대한 면역학적 반응을 일으키거나 증강시키는), 비천연 면역원에 대한 하나 이상의 항체를 생성한다.

면역학적 반응을 일으키거나 증강시키기 위해 대상체에 투여되는 비천연 면역원은 대상체 내의 하나 이상의 표적 부분(또는 대상체 내에 존재할 수 있는 하나 이상의 부분)에 상응한다. 일부 실시양태에서, 표적 부분은 제1 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 비천연 면역원은 표적 부분의 서열의 하나 이상의 천연 아미노산이 면역원의 서열의 하나 이상의 비천연 아미노산으로 치환된 것을 제외하고 표적의 서열과 동일한 제2 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 표적 부분은 제1 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 비천연 면역원은 면역원의 서열이 하나 이상의 추가적인 비천연 아미노산을 추가로 포함하는 것을 제외하고 표적 부분의 서열과 동일한 제2 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 비천연 면역원은 이것의 기원이 되는 표적 부분과 실질적으로 유사한 구조를 포함할 수 있고/있거나, 또는 비천연 면역원의 기원이 되는 표적 부분과 실질적으로 유사한 3차 구조 및/또는 4차 구조를 포함할 수 있다.

비천연 면역원에 존재하는 하나 이상의 비천연 아미노산은 경우에 따라 항체의 접근이 가능한 것일 수 있다. 이 양태의 방법에서 제조된 하나 이상의 교차 반응성 항체는 경우에 따라 비천연 면역원 상의 상응하는 에피토프와 동일한 서열을 포함하는 표적 부분 상의 에피토프에 대한 특이성을 나타낼 수 있다. 그러나, 교차 반응성 항체는 경우에 따라 비천연 면역원 상의 상응하는 에피토프와 비교할 때 상이한 서열, 예를 들어, 경우에 따라 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 상이한 서열을 포함하는 표적 부분 상의 에피토프에 대한 특이성을 나타낼 수 있다.

본 양태에서, 표적 부분으로부터 유래된 비천연 면역원은 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 비천연 면역원은 오르토고날(orthogonal) 번역 시스템에서 제조된다. 그러나, 비천연 면역원은 경우에 따라 생체내 번역 시스템(예를 들어, 선별적 압력 도입을 통해); 시험관내 번역 시스템(예를 들어, 비천연 아미노산으로 화학적으로 아실화된 tRNA의 사용); 번역 후 수식(post-translational modification) 이외의 과정; 또는 면역원에 존재하는 20종의 자연 발생 정규(canonical) 아미노산 중 하나의 화학적 수식 이외의 과정에서 제조될 수 있다.

비천연 면역원 내로 도입될 수 있는 비천연 아미노산은 경우에 따라 20종의 정규 천연 아미노산 중 하나 이외의 임의의 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 도입될 수 있는 비천연 아미노산은 20종의 정규 아미노산 중 하나 이외의 임의의 아미노산도 포함할 수 있고, 이때 상기 비천연 아미노산은 하기 화학식 I, II, III 또는 IV의 구조를 포함한다:

화학식 I

화학식 II

화학식 III

화학식 IV

상기 식에서,

R은 20종의 정규 천연 아미노산 중 임의의 아미노산에서 사용되는 측쇄 이외의 임의의 치환기이고; R₁은 20종의 정규 천연 아미노산 중 하나에서 사용되는 임의의 치환기이고; R₂는 R₂-R₁이 함께 20종의 정규 천연 아미노산 중 임의의 천연 아미노산의 측쇄 이외의 것이 되도록 하는 임의의 치환기이고; Z는 OH, NH₂, SH, NH-R' 또는 S-R'이고, 이때 R'는 H 이외의 임의의 치환기이고; X 및 Y는 각각 S 또는 O이고, 이때 R은 R'가 H인 경우 L 입체구조를 갖는다. 일부 실시양태에서, 면역원 내로 도입될 수 있는 하나 이상의 비천연 아미노산은 경우에 따라 하기 아미노산들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: p-니트로페닐알라닌; o-니트로페닐알라닌; m-니트로페닐알라닌; p-보로닐 Phe; o-보로닐 Phe; m-보로닐 Phe; p-아미노 Phe; o-아미노 Phe; m-아미노 Phe; p-아실 Phe; o-아실 Phe; m-아실 Phe; p-OMe Phe; o-OMe Phe; m-OMe Phe; p-설포 Phe; o-설포 Phe; m-설포 Phe; 5-니트로 His; 3-니트로 Tyr; 2-니트로 Tyr; 니트로 치환된 Leu; 니트로 치환된 His; 니트로 치환된 Ile; 니트로 치환된 Trp; 2-니트로 Trp; 4-니트로 Trp; 5-니트로 Trp; 6-니트로 Trp; 7-니트로 Trp; 3-아미노티로신; 2-아미노티로신; O-설포티로신; 2-설포옥시페닐알라닌; 3-설포옥시옥시페닐알라닌 또는 p-카르복시페닐알라닌; o-카르복시페닐알라닌; 및 m-카르복시페닐알라닌.

일부 실시양태에서, 면역 반응이 일어나거나 증강되는 표적 부분은 비자가 부분, 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 진균, 마이코플라스마, 원생동물, 연충 또는 프리온으로부터 유래된 부분일 수 있다. 비자가 표적 부분은 경우에 따라 하기 항원들 중 하나 이상의 항원을 포함할 수 있다: 박테리아 항원, 바이러스 항원, 진균 항원, 마이코플라스마 항원, 원생동물 항원, 연충 항원, 프리온 항원, HIV 항원, HIV gp120, HIV gp41, HIV gag, HIV pol, HIV env, HIV tat, HIV nef, HIV rev, 칼리시바이러스(calicivirus) 캡시드 항원, B형 간염 코어 항원, B형 간염 표면 항원, 간염 델타 물질, 허피스 심플렉스 바이러스 당단백질, 수두 대상포진 바이러스 당단백질, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제, 인플루엔자 바이러스 핵단백질, HPV 캡시드 단백질, 파라인플루엔자(parainfluenza) 바이러스 헤마글루티닌/뉴라미니다제, 폴리오바이러스 캡시드 폴리펩티드, Hep A 항원, 백시니아 바이러스 폴리펩티드, 공수병 바이러스 당단백질 G, 비. 버그도페리(B. burgdorferi) OspA, 에이치. 인플루엔자(H. influenzae) 타입 b 외막 단백질, 마이코박테리움 리포아라비노만난, 마이코박테리움 mAPG, 에스. 파이오진스(S. pyogenes) M 단백질, 에스. 뉴모니아(S. pneumoniae) 캡슐형 폴리사카라이드, 와이. 페스티스(Y. pestis) F1, 와이. 페스티스 V 항원, 피. 팔시파룸 서컴스포로조이트(P. falciparum circumsporozoite)(PfCSP), 피. 팔시파룸 스포로조이트(P. falciparum sporozoite) 표면 단백질 2(PfSSP2), 간 상태(liver state) 항원 1의 피. 팔시파룸 카르복실 말단(PfLSA1 c-말단), 피. 팔시파룸 외수송 단백질 1(PfExp-1), Pfs 48/45, Pfs 28, Pfs 25 또는 Pfs 230.

표적 비자가 부분은 경우에 따라 하기 유기체 중 하나 이상의 유기체로부터 유래될(또는 비롯될) 수 있다: 박테리아, 바이러스, 진균, 마이코플라스마, 원생동물, 연충, 프리온, 액티노마이세스(Actinomyces), 바실러스(Bacillus), 박테로이드(Bacteroides), 보르데텔라(Bordetella), 바르토넬라(Bartonella), 보렐리아(Borrelia), 브루셀라(Brucella), 캠필로박터(Campylobacter), 캡노사이토파가(Capnocytophaga), 클라미디아(Chlamydia), 클로스트리듐(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 콕시엘라(Coxiella), 더마토필러스(Dermatophilus), 엔테로코커스(Enterococcus), 에를리히아(Ehrlichia), 에스케리키아(Escherichia), 프란시셀라(Francisella), 푸소박테리움(Fusobacterium), 해모바르토넬라(Haemobartonella), 해모필러스(Haemophilus), 헬리코박터(Helicobacter), 크렙시엘라(Klebsiella), L형 박테리아, 렙토스피라(Leptospira), 리스테리아(Listeria), 마이코박테리움, 마이코플라스마, 네이세리아(Neisseria), 네오릿케치아(Neorickettsia), 노카르디아(Nocardia), 파스투렐라(Pasteurella), 펩토코커스(Peptococcus), 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus), 뉴모코커스(Pneumococcus), 프로테우스(Proteus), 슈도모나스(Pseudomonas), 릿케치아(Rickettsia), 로칼리매아(Rochalimaea), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 트레포네마(Treponema), 여시니아(Yersinia), 아데노바이러스(adenovirus), 알파바이러스(alphavirus), 칼리시바이러스, 코로나바이러스(coronavirus), CMV, 디스템퍼(distemper) 바이러스, 에볼라(Ebola) 바이러스, 엔테로바이러스(enterovirus), EBV, 플라비바이러스(flavivirus), Hep C, 헤파드나바이러스(hepadnavirus), Hep B, 간염 델타 물질, Hep E 또는 F 바이러스, GBV-C, 허피스바이러스(herpesvirus), 허피스 심플렉스 바이러스, 수두 대상포진 바이러스, 면역결핍 바이러스, HIV, 감염성 복막염 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스, 백혈병 바이러스, 마버그(Marburg) 바이러스, 오르토믹소바이러스(orthomyxovirus), 파필로마(papilloma) 바이러스, HPV, 파라인플루엔자 바이러스, 파라믹소바이러스(paramyxovirus), RSV, 파보바이러스(parvovirus), 페스티바이러스(pestivirus), 피코나(picorna) 바이러스, 폴리오바이러스, 폭스(pox) 바이러스, 백시니아 바이러스, 공수병 바이러스, 레오바이러스(reovirus), 레트로바이러스(retrovirus), 로타바이러스(rotavirus), 압시디아(Absidia), 아크레모늄(Acremonium), 알터나리아(Alternaria), 아스퍼질러스(Aspergillus), 바시디오볼루스(Basidiobolus), 비폴라리스(Bipolaris), 블라스토마이세스(Blastomyces), 칸디다(Candida), 콕시디오이드(Coccidioides), 코니디오볼루스(Conidiobolus), 크립토코커스(Cryptococcus), 쿠르발라리아(Curvalaria), 에피더모파이톤(Epidermophyton), 엑소피알라(Exophiala), 지오트리쿰(Geotrichum), 히스토플라스마(Histoplasma), 마두렐라(Madurella), 말라스세지아(Malassezia), 마이크로스포룸(Microsporum), 모닐리엘라(Moniliella), 모르티에렐라(Mortierella), 뮤코(Mucor), 패실로마이세스(Paecilomyces), 페니실륨(Penicillium), 피알레모늄(Phialemonium), 피알로포라(Phialophora), 프로토테카(Prototheca), 슈달레스케리아(Pseudallescheria), 슈도마이크로도키움(Pseudomicrodochium), 파이티움(Pythium), 리노스포리듐(Rhinosporidium), 리조푸스(Rhizopus), 스콜레코바시듐(Scolecobasidium), 스포로트릭스(Sporothrix), 스템파일리움(Stemphylium), 트리코파이톤(Trichophyton), 트리코스포론(Trichosporon), 크실로하이파(Xylohypha), 바베시아(Babesia), 발란티듐(Balantidium), 베스노이티아(Besnoitia), 크립토스포리듐(Cryptosporidium), 에이메리아(Eimeria), 엔세팔리토조온(Encephalitozoon), 엔타모에바(Entamoeba), 기아르디아(Giardia), 함몬디아(Hammondia), 헤파토조온(Hepatozoon), 이소스포라(Isospora), 레이쉬마니아(Leishmania), 마이크로스포리디아(Microsporidia), 네오스포라(Neospora), 노세마(Nosema), 펜타트리코모나스(Pentatrichomonas), 플라스모듐(Plasmodium), 피. 팔시파룸, 뉴모시스티스(Pneumocystis), 사코시스티스(Sarcocystis), 스키스토소마(Schistosoma), 테일레리아(Theileria), 톡소플라스마(Toxoplasma), 트리파노소마(Trypanosoma), 아칸소케일로네마(Acanthocheilonema), 앨루로스트론길루스(Aelurostrongylus), 안실로스토마(Ancylostoma), 안지오스트론길루스(Angiostrongylus), 아스카리스(Ascaris), 브루기아(Brugia), 부노스토뭄(Bunostomum), 캐필라리아(Capillaria), 차베르티아(Chabertia), 코오페리아(Cooperia), 크레노소마(Crenosoma), 딕티오카울루스(Dictyocaulus), 디옥토파임(Dioctophyme), 디페탈로네마(Dipetalonema), 디파일로보스륨(Diphyllobothrium), 디플라이듐(Diplydium), 디로필라리아(Dirofilaria), 드라쿤쿨러스(Dracunculus), 엔테로비우스(Enterobius), 필라로이데스(Filaroides), 해몬쿠스(Haemonchus), 라고킬라스카리스(Lagochilascaris), 로아(Loa) 폴리펩티드, 만소넬라(Mansonella), 무엘레리우스(Muellerius), 나노파이에투스(Nanophyetus), 네카토르(Necator), 네마토디루스(Nematodirus), 오에소파고스토뭄(Oesophagostomum), 온코세르카(Onchocerca), 오피스토르키스(Opisthorchis), 오스터타기아(Ostertagia), 파라필라리아(Parafilaria), 파라고니무스(Paragonimus), 파라스카리스(Parascaris), 파이살로프테라(Physaloptera), 프로토스트론길루스(Protostrongylus), 세타리아(Setaria), 스피로세르카(Spirocerca), 스피로메트라(Spirometra), 스테파노필라리아(Stephanofilaria), 스트론길로이데스(Strongyloides), 스트론길루스(Strongylus), 텔라지아(Thelazia), 톡사스카리스(Toxascaris), 톡소카라(Toxocara), 트리키넬라(Trichinella), 트리코스트론길루스(Trichostrongylus), 트리쿠리스(Trichuris), 운시나리아(Uncinaria) 또는 우케레리아(Wuchereria).

본 발명의 다른 실시양태에서, 면역 반응이 일어나거나 증강하는 표적 부분은 경우에 따라 대상체의 자가 부분을 포함할 수 있다. 자가 부분은 경우에 따라 임의의 다양한 질환 관련 부분, 예를 들어, 자가면역 질환과 관련된 자가 항원, 종양 관련 항원, 알츠하이머병 관련 항원, 아밀로이드 베타40, 아밀로이드 베타42, 유방암 관련 항원, 난소암 관련 항원, 전립선암 관련 항원, MAGE, BAGE, RAGE, NY-ESO, 계통 특이적 종양 관련 항원, 멜라닌세포-흑색종 계통 항원, MART-1/Melan-A, 티로시나제 또는 티로시나제 관련 단백질, 티로시나제 관련 단백질 2, PSMA, PSA, 돌연변이 ras, 재배열 bcr/ab1, Her2/neu, 돌연변이 또는 야생형 p53, 사이토크롬 P450 1B1, N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제-V의 비정상적으로 발현된 인트론 서열, CA19-9, p53, OCAA, HOXB7, Ca125, PSA, PSMA, STEAP, PCTA-1, Ca15-3, EGF, EGFR, HER-1, CXCR4, G 단백질 커플링 수용체(GCPR) 또는 CA27-29를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 표적 자가 부분은 TNFα이고, 비천연 면역원은 비천연 TNFα이다. 예를 들어, 대상체가 마우스인 실시양태에서, 표적 부분은 mTNFα일 수 있고, 면역원은 비천연 mTNFα, 예를 들어, pNO₂Phe⁸⁶-mTNFα, pNO₂Phe¹¹-mTNFα, pNO₂Phe¹⁹-mTNFα, pNO₂Phe²¹-mTNFα, pNO₂Phe⁴²-mTNFα, pNO₂Phe⁴⁹-mTNFα, pNO₂Phe¹⁰⁴-mTNFα 및 pNO₂Phe¹¹³-mTNFα를 포함하는 비천연 TNFα일 수 있다.

유사하게, 대상체가 인간인 실시양태에서, 표적 자가 부분은 hTNFα일 수 있고, 면역원은 비천연 hTNFα, 예를 들어, pNO₂Phe¹¹-hTNFα, pNO₂Phe¹⁹-hTNFα, pNO₂Phe²¹-hTNFα, pNO₂Phe⁴²-hTNFα, pNO₂Phe⁴⁹-hTNFα, pNO₂Phe⁸⁷-hTNFα, pNO₂Phe¹⁰⁵-hTNFα 또는 pNO₂Phe¹¹⁴-hTNFα일 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 예를 들어, 대상체에서 B 세포 매개 반응 및/또는 T 세포 매개 반응을 일으킴으로써 상기 대상체에서 질환 상태를 예방적으로 또는 치유적으로 치료하는 방법을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 상기 질환 상태는 자가면역 질환, 암, 박테리아 감염, 바이러스 감염, 진균 감염, 마이코플라스마 감염, 프리온 감염, 원생동물 감염 또는 연충 감염 중 하나 이상일 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 상기 양태의 방법들 중 한 세트는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 면역원을 대상체, 예를 들어, 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 소, 닭, 관형 케이지 사육조, 개방형 복지 케이지 사육조, 파충류 또는 양서류에 투여하는 단계를 포함한다. 따라서, 비천연 면역원은 대상체에서 대상체 내의 하나 이상의 표적 부분, 예를 들어, 폴리펩티드 및/또는 탄수화물에 대한 교차 반응성, 또는 질환 상태와 관련된, 대상체 내에 존재할 수 있는 하나 이상의 표적 부분에 대한 교차 반응성을 보이는 항체의 생성을 자극한다. 이 양태의 방법의 제2 세트에서, 본 발명은 하나 이상의 표적 부분(예를 들어, 질환 상태/병태와 관련된 질환 관련 부분)에 대한 항체를 생성함으로써 대상체에서 질환 상태를 예방적으로 또는 치유적으로 치료하는 것을 제공한다. 이러한 항체의 생성은 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 면역원에 대한 항체의 생성을 포함하고, 이때 상기 항체는 표적 부분에 대한 교차 반응성을 보인다. 그 후, 상기 항체는 대상체에 투여된다.

이 양태의 방법에서 비천연 면역원은 전형적으로 대상체 내의 하나 이상의 표적 부분(또는 대상체 내에 존재할 수 있는 하나 이상의 표적 부분)에 상응한다. 다양한 실시양태에서, 표적 부분은 제1 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 비천연 면역원은 표적의 서열의 하나 이상의 천연 아미노산이 면역원의 하나 이상의 비천연 아미노산으로 치환된 것을 제외하고 표적 서열과 동일한 제2 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 표적 부분은 제1 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 비천연 면역원은 제2 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이때 면역원의 서열은 이 면역원의 서열이 하나 이상의 추가적인 비천연 아미노산을 추가로 포함하는 것을 제외하고 표적의 서열과 동일하다. 비천연 면역원은 이것의 기원이 되는 표적 부분과 실질적으로 유사한 구조를 포함할 수 있고/있거나, 또는 비천연 면역원은 이것의 기원이 되는 표적 부분과 실질적으로 유사한 3차 구조 및/또는 4차 구조를 포함할 수 있다.

상기 양태의 방법의 비천연 면역원에 존재하는 하나 이상의 비천연 아미노산은 경우에 따라 항체의 접근이 가능한 것일 수 있다. 하나 이상의 교차 반응성 항체는 경우에 따라 비천연 면역원 상의 상응하는 에피토프와 동일한 서열을 포함하는 표적 부분 상의 에피토프에 대한 특이성을 나타낼 수 있다. 그러나, 교차 반응성 항체는 경우에 따라 비천연 면역원 상의 상응하는 에피토프와 비교할 때 상이한 서열, 예를 들어, 경우에 따라 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 상이한 서열을 포함하는 표적 부분 상의 에피토프에 대한 특이성을 나타낼 수 있다.

이 양태의 다양한 실시양태에서, 대상체에 투여되는 면역원 또는 항체가 생성되게 하는 면역원은 상기 양태들 또는 본원의 임의의 부분에 기재된 방법들 중 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 비천연 면역원은 경우에 따라 임의의 비천연 아미노산, 예를 들어, 상기 양태들 또는 본원의 임의의 부분에 기재된 비천연 아미노산들 중 임의의 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 표적 부분은 예를 들어, 상기 양태들 또는 본원의 임의의 부분에 기재된 임의의 비자가 부분을 포함하는 비자가 부분, 또는 자가 부분, 예를 들어, 질환 관련 자가 부분, 예컨대, 상기 양태들 또는 본원의 임의의 부분에 기재된 질환 관련 자가 부분을 포함할 수 있다.

이 양태의 일부 실시양태에서, 표적 부분은 TNFα이고, 질환 상태를 예방적으로 또는 치유적으로 치료하는 방법은 경우에 따라 하기 질환 상태들 중 임의의 하나 이상을 치료하는 것을 포함할 수 있다: 내독성 쇼크, 뇌 말라리아, 자가면역 질환, 다발성 장기 부전, 다발성 경화증, 심장 기능장애, 아테롬성동맥경화증, 허혈-재관류 손상, 인슐린 내성, 류마티스 관절염, 크론병, 염증성 장 질환, 악액질, 패혈증 쇼크, AIDS, 이식편 대 숙주 질환, 살균 육아종(bactericidal granulomas), 성인 호흡 곤란 증후군 및 실리카 유발성 폐 섬유증.

대상체가 마우스인 일부 실시양태에서, 표적 부분은 mTNFα일 수 있고, 면역원은 비천연 mTNFα, 예를 들어, pNO₂Phe⁸⁶-mTNFα, pNO₂Phe¹¹-mTNFα, pNO₂Phe¹⁹-mTNFα, pNO₂Phe²¹-mTNFα, pNO₂Phe⁴²-mTNFα, pNO₂Phe⁴⁹-mTNFα, pNO₂Phe¹⁰⁴-mTNFα, 및 pNO₂Phe¹¹³-mTNFα를 포함하는 비천연 mTNFα일 수 있다. 대상체가 인간인 일부 실시양태에서, 자가 부분은 hTNFα이고, 면역원은 비천연 hTNFα, 예를 들어, pNO₂Phe¹¹-hTNFα, pNO₂Phe¹⁹-hTNFα, pNO₂Phe²¹-hTNFα, pNO₂Phe⁴²-hTNFα, pNO₂Phe⁴⁹-hTNFα, pNO₂Phe⁸⁷-hTNFα, pNO₂Phe¹⁰⁵-hTNFα 및 pNO₂Phe¹¹⁴-hTNFα일 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 백신의 제조 방법(및 이 방법에 의해 제조된 백신)을 제공하고, 상기 방법은 항체 요법을 위한, 비천연 아미노산을 포함하지 않는 표적 부분, 예를 들어, 폴리펩티드 및/또는 탄수화물을 동정하는 단계, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 면역원을 제공하는 단계, 및 상기 비천연 면역원을 하나 이상의 약학적으로 허용되는 보조제, 담체 또는 부형제와 혼합하여 백신을 제조하는 단계를 포함한다. 이 방법에서 제공되는 비천연 면역원은 예를 들어, 상기 양태 또는 본원의 임의의 부분에 기재된 바와 같이 대상체에 투여되는 경우 대상체가 표적 부분에 대한 교차 반응성을 보이는 비천연 면역원에 대한 항체를 생성하도록 표적 부분과 구조적으로 유사할 수 있다.

이 양태의 방법에서 비천연 면역원은 대상체 내의 하나 이상의 표적 부분(또는 대상체 내에 존재할 수 있는 하나 이상의 표적 부분)에 상응한다. 다양한 실시양태에서, 표적 부분은 제1 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 비천연 면역원은 표적의 서열의 하나 이상의 천연 아미노산이 면역원의 서열의 하나 이상의 비천연 아미노산으로 치환된 것을 제외하고 표적의 서열과 동일한 제2 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 표적 부분은 제1 아마노산 서열을 포함할 수 있고, 비천연 면역원은 제2 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이때 면역원의 서열은 이 면역원의 서열이 하나 이상의 추가적인 비천연 아미노산을 추가로 포함하는 것을 제외하고 표적의 서열과 동일하다. 비천연 면역원은 이것의 기원이 되는 표적 부분과 실질적으로 유사한 구조를 포함할 수 있고/있거나, 비천연 면역원은 이것의 기원이 되는 표적 부분과 실질적으로 유사한 3차 구조 및/또는 4차 구조를 포함할 수 있다.

비천연 면역원에 존재하는 비천연 아미노산은 경우에 따라 항체의 접근이 가능한 것일 수 있다. 하나 이상의 교차 반응성 항체는 경우에 따라 비천연 면역원 상의 상응하는 에피토프와 동일한 서열을 포함하는 표적 부분 상의 에피토프에 대한 특이성을 나타낼 수 있다. 그러나, 교차 반응성 항체는 경우에 따라 비천연 면역원 상의 상응하는 에피토프와 비교할 때 상이한 서열, 예를 들어, 경우에 따라 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 상이한 서열을 포함하는 표적 부분 상의 에피토프에 대한 특이성을 나타낼 수 있다.

다양한 실시양태에서, 백신을 제조하기 위해 제공되는 면역원은 그 자체가 상기 양태 또는 본원의 임의의 부분에 기재된 방법들 중 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 비천연 면역원은 경우에 따라 상기 양태 또는 본원의 임의의 부분에 기재된 비천연 아미노산 중 임의의 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 표적 부분은 예를 들어, 상기 양태 또는 본원의 임의의 부분에 기재된 임의의 비자가 항원 또는 부분을 포함하는 비자가 부분, 또는 자가 부분, 예를 들어, 질환 관련 자가 부분, 예컨대, 상기 양태 또는 본원의 임의의 부분에 기재된 임의의 질환 관련 자가 부분을 포함할 수 있다.

이 양태의 일부 실시양태에서, 표적 자가 부분은 TNFα일 수 있다. 예를 들어, 대상체가 마우스인 실시양태에서, 표적 자가 부분은 mTNFα일 수 있고, 면역원은 비천연 mTNFα, 예를 들어, pNO₂Phe⁸⁶-mTNFα, pNO₂Phe¹¹-mTNFα, pNO₂Phe¹⁹-mTNFα, pNO₂Phe²¹-mTNFα, pNO₂Phe⁴²-mTNFα, pNO₂Phe⁴⁹-mTNFα, pNO₂Phe¹⁰⁴-mTNFα, 및 pNO₂Phe¹¹³-mTNFα를 포함하는 비천연 mTNFα일 수 있다. 대상체가 인간인 실시양태에서, 표적 자가 부분은 hTNFα이고, 면역원은 비천연 hTNFα, 예를 들어, pNO₂Phe¹¹-hTNFα, pNO₂Phe¹⁹-hTNFα, pNO₂Phe²¹-hTNFα, pNO₂Phe⁴²-hTNFα, pNO₂Phe⁴⁹-hTNFα, pNO₂Phe⁸⁷-hTNFα, pNO₂Phe¹⁰⁵-hTNFα 및 pNO₂Phe¹¹⁴-hTNFα일 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 내에서 pNO₂Phe⁸⁶ TNFα를 포함하는 비천연 TNFα를 제조하는 방법도 제공한다. 상기 방법은 적절한 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 세포는 TNFα를 코딩하고 86번 아미노산 위치에서 하나 이상의 셀렉터 코돈(selector codon)을 포함하는 핵산을 포함할 수 있다. 상기 세포는 셀렉터 코돈을 인식하는 오르토고날-tRNA(O-tRNA), 및 O-tRNA를 pNO₂Phe으로 우선적으로 아미노아실화시키는 오르토고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)도 포함할 수 있다. 상기 방법은 O-RS가 O-tRNA를 pNO₂Phe으로 우선적으로 아미노아실화시키는 것을 허용하고 오르토고날 아미노아실-tRNA 합성효소가 셀렉터 코돈에 반응하여 pNO₂Phe을 아미노산 위치 86에 도입함으로써 비천연 TNFα를 생성하게 하는 pNO₂Phe을 제공하는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 다른 실시양태는 적절한 수식(예를 들어, 원하는 면역원에 대한 핵산, 원하는 위치에 존재하는 적절한 셀렉터 코돈, 원하는 비천연 아미노산의 존재 및 적절한 상응하는 오르토고날 기구 O-RS, O-tRNA 등)을 이용하는 유사한 방법을 통해 면역원 내의 임의의 원하는 위치에서 임의의 원하는 비천연 아미노산을 가진 임의의 다른 비천연 면역원을 제조하는 방법을 포함한다.

또한, 본 발명은 비천연 TNFα를 제공한다. 본 발명에 의해 제조된 비천연 mTNFα는 pNO₂Phe⁸⁶-mTNFα, pNO₂Phe¹¹-mTNFα, pNO₂Phe¹⁹-mTNFα, pNO₂Phe²¹-mTNFα, pNO₂Phe⁴²-mTNFα, pNO₂Phe⁴⁹-mTNFα, pNO₂Phe¹⁰⁴-mTNFα 및 pNO₂Phe¹¹³-mTNFα를 포함한다. 본 발명에 의해 제조된 비천연 hTNFα는 pNO₂Phe¹¹-hTNFα, pNO₂Phe¹⁹-hTNFα, pNO₂Phe²¹-hTNFα, pNO₂Phe⁴²-hTNFα, pNO₂Phe⁴⁹-hTNFα, pNO₂Phe⁸⁷-hTNFα, pNO₂Phe¹⁰⁵-hTNFα 및 pNO₂Phe¹¹⁴-hTNFα를 포함한다. 이 비천연 TNFα를 포함하는 조성물도 본원에 제공된다.

또한, 본 발명은 전술된 비천연 TNFα에 대한 항체 및 이 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 임의의 비천연 아미노산을 포함하지 않는 천연 TNFα 및 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 TNFα에 대한 교차 반응성을 보이는 항체, 및 이 항체를 포함하는 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 pNO₂Phe⁴³ mRBP4를 포함하는 비천연 mRBP4, 및 이러한 비천연 mRBP4를 포함하는 조성물을 제공한다. 추가로, 본 발명은 비천연 아미노산을 포함하지 않는 RBP4에 대한 교차 반응성을 보이는 비천연 mRBP4에 대한 항체, 및 이 항체를 포함하는 조성물을 제공한다.

본원에 기재된 다양한 양태에서, 비천연 면역원 내로 도입되는 하나 이상의 비천연 아미노산은 면역원의 합성 과정 동안 도입된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비천연 아미노산은 번역 후 수식 또는 합성 후 화학적 수식 이외의 과정을 통해 비천연 면역원 내로 도입된다. 따라서, 다양한 실시양태에서, 하나 이상의 비천연 아미노산은 오르토고날 번역; 시험관내 번역; 천연 화학적 결찰(native chemical ligation); 발현된 단백질 결찰; 또는 고체상 합성 중 하나 이상을 통해 비천연 면역원 내로 도입된다. 본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 비천연 면역원은 글리코실화, 니트로아릴 수식, 니트레이트화, 알킬화, 아세틸화, 산화, 설페이트화 또는 인산화된(예를 들어, 번역 후 수식 이외의 과정 또는 화학적 수식 이외의 과정에 의해 글리코실화, 니트로아릴 수식, 니트레이트화, 알킬화, 아세틸화, 산화, 설페이트화 또는 인산화) 20종의 정규 천연 아미노산 중 하나 이상의 아미노산을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 물질을 함유하는 키트 또는 제품을 제공한다. 이러한 키트는 경우에 따라 하나 이상의 용기, 표지 및 설명서뿐만 아니라, 항체 및/또는 비천연 면역원 및/또는 실제 항체 및/또는 비천연 면역원(예를 들어, 비천연 TNFα)의 구축을 위한 성분들을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 경우에 따라 하나 이상의 항체(예를 들어, 대상체 내의 천연 표적 부분에 대한 교차 반응성을 보이는, 비천연 면역원에 대한 항체) 및/또는 하나 이상의 비천연 면역원을 포함할 수 있을 뿐만 아니라 경우에 따라 다른 성분들(예를 들어, 다양한 항생제, 다양한 항진균제 등)도 포함할 수 있다. 이러한 비천연 면역원은 본 발명에 의해 제공되는 비천연 TNFα 중 임의의 하나 이상 또는 본원에 기재된 임의의 다른 비천연 면역원을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 키트는 경우에 따라 성분들을 저장하거나 성분들을 혼합/제조하기 위한 튜브 또는 다른 용기(예를 들어, 유리, 플라스틱, 나일론, 면, 폴리에스테르, 금속 등으로 만들어짐)뿐만 아니라 성분들을 대상체(예를 들어, 치료가 필요한 인간 등)에 투여하기 위한 하나 이상의 장치도 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 성분들을 대상체에 투여함에 있어서 사용되는 장치는 성분들이 저장되고/되거나 혼합/제조되는 용기를 포함한다.

또한, 키트는 경우에 따라 본 발명의 항체/비천연 면역원 성분들 이외에 추가적 성분들, 예를 들어, 완충제, 희석제, 필터, 드레싱, 붕대, 도포기, 거즈, 차단막, 반투과성 차단막, 설압자, 바늘 및 주사기 등을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 의학적 병태/질환 상태에 대해 대상체를 치료하기 위한 키트의 용도에 관한 설명서(예를 들어, 일반적으로 서면 설명서)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 사용자가 설명서 또는 추가적 설명서와 접촉할 수 있게 하기 위한 URL 주소 또는 전화번호 등을 포함한다. 키트는 단위 투여분, 벌크 포장물(예를 들어, 다회-투여분 포장물) 또는 하위 단위 투여분일 수 있다.

본 발명의 방법 및 조성물은 단독으로 또는 서로 조합되어 사용될 수 있음이 당업자에게 자명할 것이다.

본 발명의 이 특징들 및 다른 특징들은 첨부된 도면 및 특허청구범위와 함께 하기 상세한 설명을 읽을 때 더 완전히 자명해질 것이다.

정의

본 발명을 상세히 기술하기 전, 본 발명이 특정 장치 또는 생물학적 시스템으로 한정되지 않고 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어가 특정 실시양태만을 기술하기 위한 것이지 한정하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형은 문맥상 달리 명시되어 있지 않은 한 복수형의 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "표면"에 대한 언급은 "둘 이상의 표면들의 조합"을 포함하고; "박테리아"에 대한 언급은 "박테리아의 혼합물" 등을 포함한다.

달리 정의되어 있지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 용어 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 숙련된 기술을 가진 자에 의해 통상저으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다. 본원에 기재된 방법 및 재료와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 시험을 위한 실시에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에 기재되어 있다. 본 발명을 기술하고 특허청구하기 위해 하기 용어들이 하기 정의에 따라 사용될 것이다.

항체: 본원에서 사용된 바와 같이, "항체"는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자의 단편에 의해 실질적으로 또는 부분적으로 코딩된 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 의미한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자뿐만 아니라 다수의 면역글로불린 가변 영역 유전자들을 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로서 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로서 분류되고, 이들은 다시 각각 면역글로불린 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 정의된다. 전형적인 면역글로불린, 예를 들어, 항체, 구조 유니트는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 2쌍의 동일한 폴리펩티드 쇄로 구성되고, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kD) 및 하나의 "중쇄"(약 50 내지 70 kD)를 가진다. 각 쇄의 N-말단은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100 내지 100개 이상의 아미노산으로 구성된 가변 영역을 정의한다. 용어 가변 경쇄(V_L) 및 가변 중쇄(V_H)는 각각 이들 경쇄 및 중쇄를 의미한다.

항체는 온전한 면역글로불린으로서 존재할 수 있거나 다양한 펩티다제를 사용한 분해에 의해 생성된 다수의 잘 특징규명된 단편으로서 존재할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 펩신은 힌지 영역 내의 이황화 결합 아래에서 항체를 절단하여 그 자체가 이황화 결합에 의해 V_H-C_H1에 연결된 경쇄인 Fab의 이량체인 F(ab')₂를 생성한다. F(ab')₂를 온후한 조건 하에서 환원하여 힌지 영역 내의 이황화 결합을 분해함으로써 F(ab')₂ 이량체를 Fab' 단량체로 전환시킬 수 있다. Fab' 단량체는 본질적으로 힌지 영역의 일부를 가진 Fab이다(다른 항체 단편의 보다 상세한 설명을 위해서는 문헌[Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999)]을 참조함]. 다양한 항체 단편이 온전한 항체의 분해 면에서 정의되지만, 당업자는 이러한 Fab' 단편 등이 화학적으로 드 노보(de novo) 합성될 수 있거나 재조합 DNA 기술의 이용에 의해 합성될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본원에서 사용된 용어 항체는 전장 항체의 수식에 의해 제조되거나 재조합 DNA 기술의 이용에 의해 드 노보 합성된 항체 단편도 포함한다. 항체는 가변 중쇄와 가변 경쇄가 (직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해) 서로 연결되어 연속적인 폴리펩티드를 형성하는 단일쇄 Fv(sFv 또는 scFv) 항체를 포함하는 단일쇄 항체를 포함한다.

2종 이상의 상이한 부분과 "교차 반응하는" 항체는 예를 들어, ELISA, FACS 또는 당업자에게 공지된 다른 방법에 의해 확인될 때 다양한 부분의 각각에 결합할 수 있다. 예를 들어, 비천연 TNFα, 예컨대, 본원에 기재된 비천연 TNFα들 중 어느 하나, 예를 들어, pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα와 결합하고 (임의의 비천연 아미노산을 포함하지 않는) 본래의(또는 천연) TNFα와도 결합하는 항체는 2종의 부분과 교차 반응한다. 본원의 특정 실시양태에서, 비천연 단백질에 대한 항체는 동일한 단백질의 천연 버젼(version)(즉, 비천연 아미노산을 포함하지 않는 동일한 단백질)과 교차 반응한다. 다양한 실시양태에서, 비천연 분자와 결합하는 항체는 비천연 분자에 대한 상기 항체의 결합 능력의 약 1 내지 50% 또는 50 내지 100% 이상의 수준으로 동일한 분자의 천연 버젼과 교차 반응한다.

항원: 용어 "항원"은 이것으로 면역화된 대상체에서 항체 반응을 유도하는 분자 또는 물질을 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 항원은 단백질, 펩티드, 탄수화물, 핵산, 지질, 햅텐 또는 다른 자연 발생 또는 합성 화합물(또는 이들의 조합물)일 수 있다. 항원은 예를 들어, 천연(자가) 항원일 수 있거나 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 연충, 진균 등으로부터 유래될 수 있다. 상기 용어는 다양한 종양 항원, 자가면역 질환 관련 항원 등 중 임의의 항원을 의미한다.

동족체: 용어 "동족체"는 서로 작용하거나 서로에 대해 특이성의 일부 양태를 갖는 성분들, 예를 들어, 오르토고날 tRNA(O-tRNA)와 오르토고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 의미하는데, 이때 O-RS는 O-tRNA를 비천연 아미노산으로 특이적으로 아미노아실화한다.

∼ 로부터 유래된: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "∼로부터 유래된"은 특정 분자 또는 유기체로부터 단리된 또는 특정 분자 또는 유기체를 사용하여 제조한 성분, 또는 특정 분자 또는 유기체로부터의 서열 정보를 의미한다. 예를 들어, 제2 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드의 경우, 유래된 종은 예를 들어, 자연 발생 돌연변이유발, 인공 지정 돌연변이유발 또는 인공 무작위 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다. 폴리펩티드를 유도하기 위해 이용되는 돌연변이유발은 의도적 지정 돌연변이유발 또는 의도적 무작위 돌연변이유발, 또는 이들 둘 다의 혼합물일 수 있다. 제1 폴리펩티드로부터 유래된 상이한 폴리펩티드를 생성하기 위한 폴리펩티드의 돌연변이유발은 무작위 사건일 수 있고, 예를 들어, 중합효소 부정확성에 의해 야기될 수 있고, 유래된 폴리펩티드의 동정은 적절한 스크리닝 방법, 예를 들어, 본원에서 인용된 참고문헌에 논의된 스크리닝 방법에 의해 달성될 수 있다. 폴리펩티드의 돌연변이유발은 전형적으로 이 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 조작을 수반한다.

표적 부분 또는 표적 분자: "표적 부분", "표적 분자", "표적 단백질 부분", "표적 항원" 등은 본 발명의 이용을 통해 면역 반응을 일으키거나 증강시키는 것이 바람직할 수 있는 부분, 예를 들어, 단백질, 펩티드, 탄수화물, 지질, 핵산 또는 이들의 임의의 조합물을 의미한다. 따라서, 표적 부분은 천연(자가) 또는 외재(외래) 분자일 수 있다. 본원에서 특정 예, 예를 들어, TNFα의 언급은 한정을 위한 것으로 해석되어서는 안 되고 표적 부분(및 상기 표적 부분에 상응하는 비천연 면역원)이 면역 반응을 일으키고자 하는 임의의 분자일 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 표적 부분은 비천연 면역원이 설계되거나 디자인되는 부분, 비천연 면역원의 기원이 되는 부분, 비천연 면역원이 상응하는 부분 등이다. 하기에 더 설명된 바와 같이, 비천연 면역원은 이 비천연 면역원이 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 점(및 비천연 면역원이 예를 들어, 오르토고날 번역 시스템, 시험관내 번역 시스템 등, 및/또는 번역 후 수식 또는 화학적 수식 이외의 방법을 통해 생성되는 점)을 제외하고 표적 부분과 동일한 또는 거의 동일한 서열을 포함한다. 많은 실시양태에서, 표적 부분은 질환 관련 부분, 즉, 질환 상태(예를 들어, 암, 자가면역 질환, 또는 감염성 유기체, 예컨대, 박테리아, 바이러스, 프리온, 마이코플라스마, 진균, 연충 등으로부터 유래/야기되는 질환 상태)로 인해 대상체 내에서 발생되거나 존재하는 부분이다. 천연 표적 부분(즉, 비천연 아미노산을 포함하지 않는 표적 부분)은 항원성 및/또는 면역원성 부분일 수 있거나 항원성 및/또는 면역원성 부분이 아닐 수 있다(예를 들어, 천연 표적 부분은 약한 면역원성을 나타내는 부분일 수 있음). 구체적인 실시양태에서, 표적 부분의 비천연 버젼(예를 들어, 천연 표적 부분과 유사하나 표적 부분 내의 상응하는 천연 아미노산의 치환 및/또는 표적 부분의 아미노산에의 부가로 인해 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 부분)은 (천연 표적 부분이 항원성 및/또는 면역원성 부분이든 아니든) 항원성 및/또는 면역원성을 나타낸다. 이러한 비천연 표적 부분은 본원에서 "비천연 표적 부분", "비천연 항원" 또는 보다 종종 "비천연 면역원" 등으로서 기재된다. 따라서, 본원에서 "비천연" 면역원, 부분, 분자 등은 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 면역원, 부분, 분자 등이다. 일부 이러한 비천연 부분에서, 비천연 아미노산은 경우에 따라 항체에 전체적으로 또는 부분적으로 접근할 수 있다(예를 들어, 항체는 비천연 아미노산을 포함하는 부분의 영역에 결합할 수 있음).

유효량: 용어 "유효량"은 원하는 결과를 발생시키기에 충분한 투여량 또는 양을 의미한다. 원하는 결과는 상기 투여량 또는 양의 수용자에서의 객관적인 또는 주관적인 개선(예를 들어, 교차 반응성 항체의 생성, 장기간 생존, 종양 수 및/또는 크기의 감소, 질환 상태의 효과적인 예방 또는 부분적인 예방 등)을 포함할 수 있다.

코딩한다: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "코딩한다"는 중합체성 거대분자 또는 서열 스트링(string) 내의 정보가 제1 분자 또는 서열 스트링과 상이한 제2 분자 또는 서열 스트링의 생성 지시에 이용되는 임의의 과정을 의미한다. 상기 용어는 본원에서 넓게 사용되며, 다양하게 적용될 수 있다. 일부 양태에서, 용어 "코딩한다"는 반보존적 DNA 복제 과정을 기술하고, 이때 이중 가닥 DNA 분자의 한 가닥은 새로이 합성되는 상보적 시스터(sister) 가닥을 DNA 의존적 DNA 중합효소로 코딩하기 위한 주형으로서 사용된다. 또 다른 양태에서, 용어 "코딩한다"는 한 분자 내의 정보가 제1 분자와 상이한 화학적 성질을 가진 제2 분자의 생성 지시에 이용되는 임의의 과정을 의미한다. 예를 들어, DNA 분자는 예를 들어, DNA 의존적 RNA 중합효소를 도입하는 전사 과정을 통해 RNA 분자를 코딩할 수 있다. 또한, RNA 분자는 번역 과정에서와 같이 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 용어 "코딩한다"가 번역 과정을 기술함에 있어서 사용되는 경우 상기 용어는 아미노산을 코딩하는 삼중체 코돈에도 적용된다. 일부 양태에서, RNA 분자는 예를 들어, RNA 의존적 DNA 중합효소를 도입하는 역전사 과정을 통해 DNA 분자를 코딩할 수 있다. 또 다른 양태에서, DNA 분자는 폴리펩티드를 코딩할 수 있고, 이 경우 사용되는 "코딩한다"는 전사 과정 및 번역 과정 둘 다를 포함하는 것으로 이해된다.

면역원: 본원에서 사용된 바와 같이, "면역원"은 경우에 따라 대상체에 투여되어 면역 반응을 유도할 수 있는 부분을 의미한다. "비천연 면역원"은 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하고 대상체에 투여되어 면역 반응을 유도할 수 있는 부분, 예를 들어, 질환 관련 부분과 같은 표적 부분이다. 전술한 내용 또한 참조한다. 본 발명의 비천연 면역원의 경우, 이러한 면역 반응에 의해 생성된 혈청 항체, B 세포 및/또는 T 세포는 유리하게는 비천연 아미노산을 포함하지 않아 천연 표적 부분에 대한 면역 반응을 일으키는 상응하는 천연 표적 부분(예를 들어, 면역원의 기원이 되는 천연 표적 부분, 면역원이 설계/디자인되는 천연 표적 부분, 면역원이 상응하는 천연 표적 부분 등)에 대한 교차 반응성을 보인다. 따라서, 일부 실시양태에서, 비천연 면역원은 비천연 면역원의 기원이 되는 천연 표적 부분(또는 비천연 면역원이 상응하는 천연 표적 부분 등)과 관련된 질환으로부터 보호하는(또는 질환 상태의 치료를 위해 이용되는) 면역 반응을 유도할 수 있다.

면역원성 조성물: "면역원성 조성물"은 대상체에 투여되는 경우 상기 대상체에서 그 부분에 대한 체액성 면역 반응 및/또는 세포성 면역 반응을 발생시키는 하나 이상의 분자를 포함하는 조성물이다. 면역원성 조성물은 예컨대, 주사, 흡입, 경구, 비강내 및 점막(예를 들어, 직장내 또는 질내) 투여에 의해 수용 대상체 내로 직접 도입될 수 있다.

면역학적 반응 또는 면역 반응: 부분 또는 이의 조성물에 대한 "면역학적 반응" 또는 "면역 반응"은 대상체 내에서의 상기 부분에 대한 세포 및/또는 항체-매개 면역 반응의 발생이다. 통상적으로, 면역학적 반응은 하기 효과들 중 하나 이상의 효과를 포함하나 이들로 한정되지 않는다: 해당 부분의 하나 이상의 항원에 대해 특이적으로 유도된 (바람직하게는) 항체, B 세포, 헬퍼(helper) T 세포, 억제자(suppressor) T 세포 및/또는 세포독성 T 세포 및/또는 γδ T 세포의 생성. 다양한 실시양태에서, 대상체는 부분을 사용한 새로운 자극(challenge)에 대한 내성이 증강되고/되거나 상기 부분에 의해 야기된/상기 부분과 관련된 질환 상태의 임상적 심각도가 감소되도록 치유적 또는 예방적 면역학적 반응을 보일 것이다.

∼에 반응하여: 비천연 분자의 오르토고날 생성과 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "∼에 반응하여"는 O-tRNA가 셀렉터 코돈을 인식하여 성장하는 폴리펩티드 쇄 내로 tRNA에 커플링된 비천연 아미노산을 도입하는 것을 매개하는 과정을 의미한다.

오르토고날: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "오르토고날"은 세포 또는 번역 시스템에 내재하는 상응하는 분자에 비해 감소된 효능으로 세포의 내재 성분들과 작용하거나, 세포의 내재 성분들과 작용하지 못하는 분자, 예를 들어, 오르토고날 tRNA(O-tRNA) 및/또는 오르토고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 의미한다. tRNA 및 아미노아실-tRNA 합성효소의 내용에서, 오르토고날은 내재 tRNA 합성효소와 작용하는 내재 tRNA와 비교할 때 내재 tRNA 합성효소와 작용하는 오르토고날 tRNA, 또는 내재 tRNA와 작용하는 내재 tRNA 합성효소와 비교할 때 내재 tRNA와 작용하는 오르토고날 아미노아실-tRNA 합성효소의 불능 또는 감소된 효율, 예를 들어, 20% 미만의 효율, 10% 미만의 효율, 5% 미만의 효율 또는 1% 미만의 효율을 의미한다. 오르토고날 분자는 세포 내에서 기능적으로 정상적인 내재 상보적 분자를 결여하고 있다. 예를 들어, 세포 내의 오르토고날 tRNA는 내재 RS에 의한 내재 tRNA의 아미노아실화와 비교할 때 감소된 또는 심지어 제로 효율로 세포의 임의의 내재 RS에 의해 아미노아실화된다. 또 다른 예에서, 오르토고날 RS는 내재 RS에 의한 내재 tRNA의 아미노아실화와 비교할 때 감소된 또는 심지어 제로 효율로 관심있는 세포의 임의의 내재 tRNA를 아미노아실화한다. 제2 오르토고날 분자는 제1 오르토고날 분자와 작용하는 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 한 쌍의 오르토고날 tRNA/RS는 대조군, 예를 들어, 한 쌍의 상응하는 내재 tRNA/RS 또는 한 쌍의 활성 오르토고날과 비교할 때 일정한 효율, 예를 들어, 45% 효율, 50% 효율, 60% 효율, 70% 효율, 75% 효율, 80% 효율, 90% 효율, 95% 효율 또는 99% 이상의 효율로 세포 내에서 함께 작용하는 도입된 상보적 성분들을 포함한다.

오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소: 본원에서 사용된 바와 같이, 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS)는 관심있는 번역 시스템에서 O-tRNA를 아미노산으로 우선적으로 아미노아실화시키는 효소이다. O-RS가 O-tRNA 상에 적재하는 아미노산은 천연, 비천연 또는 인공 아미노산이든 관계없이 임의의 아미노산일 수 있고 본원에서 한정되지 않는다. 상기 합성효소는 경우에 따라 자연 발생 티로실 아미노산 합성효소와 동일하거나 상동하거나, 또는 O-RS로서 명명된 합성효소와 동일하거나 상동하다.

오르토고날 tRNA: 본원에서 사용된 바와 같이, 오르토고날 tRNA(O-tRNA)는 관심있는 번역 시스템에 대해 오르토고날한 tRNA이고, 이때 상기 tRNA는 예를 들어, (1) 자연 발생 tRNA와 동일하거나 실질적으로 유사하거나, (2) 천연 또는 인공 돌연변이유발에 의해 자연 발생 tRNA로부터 유래되거나, (3) 상기 (1) 또는 (2)의 야생형 또는 돌연변이체 tRNA 서열을 고려하는 임의의 과정에 의해 유도되거나, (4) 야생형 또는 돌연변이체 tRNA에 상동하거나, (5) 오르토고날 tRNA 합성효소에 대한 기질로서 지정된 임의의 예시적 tRNA에 상동하거나, (6) 오르토고날 tRNA 합성효소에 대한 기질로서 지정된 임의의 예시적 tRNA의 보존적 변이체이다. O-tRNA는 아미노산으로 충전된 상태로 존재할 수 있거나 비충전된 상태로 존재할 수 있다. "O-tRNA"가 경우에 따라 동족체 합성효소에 의해 비천연 아미노산으로 충전(아미노아실화)된다는 것도 이해해야 한다. 실제로, O-tRNA가 셀렉터 코돈에 반응하여 번역 과정 동안 본질적으로 임의의 비천연 아미노산을 성장하는 폴리펩티드 내로 삽입시킴에 있어서 유리하게 사용된다는 것을 인식할 것이다.

약학 조성물: 본원에서 용어 "약학 조성물"은 동물 또는 인간을 포함하는 대상체에서 약학적 용도로 사용되기에 적합하거나 상기 대상체에의 투여에 적합한 조성물을 의미한다. 약학 조성물은 일반적으로 유효량의 활성제, 예를 들어, 본 발명의 항체 및/또는 비천연 면역원, 및 약학적으로 허용되는 담체, 완충제, 보조제(또는 면역보강제) 등을 포함한다. "약학적으로 허용되는" 또는 "약리학적으로 허용되는" 물질은 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 물질이 아닌 물질이고, 즉 상기 물질은 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 일으키지 않거나(또는 거의 일으키지 않거나) 그 물질이 함유되어 있는 조성물의 성분들 중 임의의 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 제제 또는 조성물 중에 함유되어 개체에게 투여될 수 있다.

폴리펩티드: 폴리펩티드는 전형적으로(그러나, 반드시는 아님) 공유 펩티드 결합에 의해 연결된, 임의의 길이의 아미노산 잔기들(천연 아미노산 잔기 또는 비천연 아미노산 잔기, 또는 이들의 조합물)로 구성된 임의의 올리고머이다. 폴리펩티드는 임의의 공급원, 예를 들어, 자연 발생 폴리펩티드, 재조합 분자 유전학적 기법에 의해 제조된 폴리펩티드, 세포 또는 번역 시스템으로부터 제조된 폴리펩티드, 또는 세포 무함유 합성 수단에 의해 제조된 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 폴리펩티드는 그의 아미노산 서열, 예를 들어, 그의 성분인 아미노산 잔기들의 1차 구조를 특징으로 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드의 아미노산 서열은 전장 서열로 한정되지 않지만 부분적 또는 완전한 서열일 수 있다. 나아가, 폴리펩티드가 임의의 특정 생물학적 활성을 보유하거나 보유하지 않음에 의해 한정되는 것은 아니다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단백질"은 폴리펩티드와 동의어이다. 용어 "펩티드"는 작은 폴리펩티드, 예를 들어, 길이가 2 내지 25개의 아미노산인 폴리펩티드를 의미하지만 이들로 한정되지 않는다.

우선적으로 아미노아실화한다: 오르토고날 번역 시스템을 언급하면서 본원에서 사용되는 바와 같이, O-RS는 이 O-RS가 발현 시스템에서 임의의 내재 tRNA를 충전하는 것보다 더 효율적으로 O-tRNA를 아미노산으로 충전하는 경우 동족체 O-tRNA를 "우선적으로 아미노아실화한다". 즉, O-tRNA 및 임의의 주어진 내재 tRNA가 거의 동등한 몰 비율로 번역 시스템에 존재하는 경우, O-RS는 이것이 내재 tRNA를 충전하는 것보다 더 빈번히 O-tRNA를 충전할 것이다. 바람직하게는, O-RS에 의해 충전되는 내재 tRNA에 대한 O-RS에 의해 충전되는 O-tRNA의 상대적 비율이 높기 때문에, O-tRNA 및 내재 tRNA가 번역 시스템에서 동등한 몰 농도로 존재하는 경우 바람직하게는 O-RS는 O-tRNA를 독점적으로 또는 거의 독점적으로 충전한다. O-tRNA 및 O-RS가 동등한 몰 농도로 존재하는 경우, O-RS에 의해 충전되는 O-tRNA와 내재 tRNA의 상대적 비율은 1:1 초과, 바람직하게는 약 2:1 이상, 더 바람직하게는 5:1 이상, 훨씬 더 바람직하게는 10:1 이상, 훨씬 더 바람직하게는 20:1 이상, 더 바람직하게는 50:1 이상, 더 바람직하게는 75:1 이상, 더 바람직하게는 95:1, 98:1, 99:1, 100:1, 500:1, 1,000:1, 5,000:1 또는 그 이상이다.

O-RS는 (a) O-RS가 내재 tRNA에 비해 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 경우, 및 (b) 아미노아실화가 O-RS에 의한 임의의 천연 아미노산으로의 O-tRNA의 아미노아실화와 비교할 때 비천연 아미노산에 대해 특이성을 나타내는 경우 "O-tRNA를 비천연 아미노산으로 우선적으로 아미노아실화한다". 즉, 비천연 아미노산 및 천연 아미노산이 O-RS 및 O-tRNA를 포함하는 번역 시스템에서 동등한 몰 양으로 존재하는 경우, O-RS는 O-tRNA를 천연 아미노산보다 더 빈번히 비천연 아미노산으로 충전할 것이다. 바람직하게는, 천연 아미노산으로 충전되는 O-tRNA에 대한 비천연 아미노산으로 충전되는 O-tRNA의 상대적 비율은 높다. 더 바람직하게는, O-RS는 O-tRNA를 독점적으로 또는 거의 독점적으로 비천연 아미노산으로 충전한다. 천연 아미노산 및 비천연 아미노산이 번역 시스템에서 동등한 몰 농도로 존재하는 경우 O-tRNA가 비천연 아미노산으로 충전되는 것과 O-tRNA가 천연 아미노산으로 충전되는 것 사이의 상대적 비율은 1:1 초과, 바람직하게는 약 2:1 이상, 더 바람직하게는 5:1 이상, 훨씬 더 바람직하게는 10:1 이상, 훨씬 더 바람직하게는 20:1 이상, 더 바람직하게는 50:1 이상, 더 바람직하게는 75:1 이상, 더 바람직하게는 95:1, 98:1, 99:1, 100:1, 500:1, 1,000:1, 5,000:1 또는 그 이상이다.

예방적 치료: "예방적 치료"는 질환, 병태 또는 의학적 장애의 징후 또는 증상을 보이지 않거나, 또는 상기 질환, 병태 또는 의학적 장애의 초기 징후 또는 증상만을 보이는 대상체에 투여되는 치료로서, 이러한 치료는 질환, 병태 또는 의학적 장애의 위험을 경감하거나, 방지하거나 감소시키기 위한 목적으로 실시된다. 예방적 치료는 질환 또는 장애에 대한 방지적 치료로서 작용한다. "예방적 활성"은 병태, 질환 또는 장애의 징후 또는 증상을 보이지 않는 대상체(또는 상기 병태, 질환 또는 장애의 초기 징후 또는 증상만을 보이는 대상체)에 투여되는 경우 대상체가 상기 병태, 질환 또는 장애를 발달시킬 위험을 경감시키거나, 방지하거나 감소시키는 비천연 면역원 및/또는 항체와 같은 물질 또는 이들의 조성물의 활성이다. "예방적으로 유용한" 물질 또는 화합물(예를 들어, 본 발명의 비천연 면역원 및/또는 항체)은 병태, 질환 또는 장애의 발달을 경감시키거나, 방지하거나, 치료하거나 또는 감소시킴에 있어서 유용한 물질 또는 화합물을 의미한다.

셀렉터 코돈: 용어 "셀렉터 코돈"은 번역 과정에서 O-tRNA에 의해 인식되고 내재 tRNA에 의해서는 인식되지 않는 코돈을 의미한다. O-tRNA 안티코돈 루프는 mRNA 상의 셀렉터 코돈을 인식하여 그의 아미노산, 예를 들어, 비천연 아미노산을 폴리펩티드 내의 이 부위에 도입한다. 셀렉터 코돈은 예를 들어, 넌센스(nonsense) 코돈, 예컨대, 정지 코돈, 예를 들어, 앰버(amber), 오커(ochre) 및 오팔(opal) 코돈; 4개 이상의 염기로 구성된 코돈; 희귀 코돈; 천연 또는 비천연 염기쌍으로부터 유래된 코돈 및/또는 기타 등을 포함할 수 있다.

대상체: 본원에서 사용된 용어 "대상체"는 예를 들어, 인간, 인간이 아닌 영장류(예를 들어, 원숭이), 마우스, 돼지, 소, 염소, 토끼, 래트, 기니아 피그, 햄스터, 말, 원숭이, 양 또는 다른 인간이 아닌 포유동물을 포함하는 포유동물, 또는 예를 들어, 비포유동물 척추동물, 예컨대, 조류(예를 들어, 닭 또는 오리)를 포함하는 비포유동물을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 인간이 아닌 동물의 (예방적 및/또는 치유적) 치료에서 사용된다. 많은 상업적으로 중요한 동물은 예를 들어, 경우에 따라 본 발명으로 치료될 수 있는 다양한 암 또는 자가면역 질환 또는 다양한 감염(예를 들어, 바이러스/박테리아 등)에 민감하다.

치유적 치료: "치유적 치료"는 병태, 질환 또는 장애의 증상 또는 징후를 보이는 대상체에게 투여되는 치료로서, 이 치료는 예를 들어, 전형적으로 병태, 질환 또는 장애의 징후/증상을 야기하는 질환 상태를 경감시키고/시키거나 제거함으로써 상기 병태, 질환 또는 장애의 징후 또는 증상을 경감시키거나 제거하기 위한 목적으로 실시된다. "치유적 활성"은 병태, 질환 또는 장애의 징후 또는 증상으로부터 고통받는 대상체에게 투여되는 경우, 상기 징후 또는 증상을 제거하거나 경감시키는 물질, 예컨대, 단백질 및/또는 항체, 또는 이들의 조성물의 활성이다. "치유적으로 유용한" 물질 또는 화합물(예를 들어, 비천연 면역원 및/또는 항체)은 특정 물질 또는 화합물이 병태, 질환 또는 장애의 징후 또는 증상을 경감시키거나, 치료하거나 또는 제거함에 있어서 유용함을 의미한다.

번역 시스템: 용어 "번역 시스템"은 아미노산을 성장하는 폴리펩티드 쇄(단백질) 내로 도입하는 성분들을 의미한다. 번역 시스템의 성분들은 예를 들어, 리보좀, tRNA, 합성효소, mRNA 등을 포함할 수 있다.

치료: 본원에서 사용된 바와 같이, "치료"는 일반적으로 감염 또는 재감염의 방지, 증상의 감소 또는 제거, 및/또는 병원체 또는 질환 상태의 실질적인 또는 완전한 제거를 의미한다. 치료는 예를 들어, 감염 전, 질환 상태의 개시 전 또는 질환 상태의 주요 증상의 발생 전에 예방적으로 수행될 수 있거나, 또는 병원체에 의한 감염 후, 질환 상태의 개시 후, 또는 질환 상태의 주요 증상의 발생 후 치유적으로 수행될 수 있다.

비천연 아미노산: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비천연 아미노산"(UAA)은 20종의 정규 천연 아미노산 또는 희귀 자연 발생 아미노산, 예를 들어, 셀레노시스테인 또는 피롤라이신 중 하나가 아닌 임의의 아미노산, 수식된 아미노산 및/또는 아미노산 유사체를 의미한다. 예를 들어, 비천연 아미노산 p-니트로페닐알라닌(도 1a), p-설포티로신 및 p-카르복시페닐알라닌은 본원의 다양한 실시양태에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 비천연 아미노산은 하기 아미노산을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다: p-니트로페닐알라닌; o-니트로페닐알라닌; m-니트로페닐알라닌; p-보로닐 Phe; o-보로닐 Phe; m-보로닐 Phe; p-아미노 Phe; o-아미노 Phe; m-아미노 Phe; p-아실 Phe; o-아실 Phe; m-아실 Phe; p-OMe Phe; o-OMe Phe; m-OMe Phe; p-설포 Phe; o-설포 Phe; m-설포 Phe; 5-니트로 His; 3-니트로 Tyr; 2-니트로 Tyr; 니트로 치환된 Leu; 니트로 치환된 His; 니트로 치환된 Ile; 니트로 치환된 Trp; 2-니트로 Trp; 4-니트로 Trp; 5-니트로 Trp; 6-니트로 Trp; 7-니트로 Trp; 3-아미노티로신; 2-아미노티로신; O-설포티로신; 2-설포옥시페닐알라닌; 3-설포옥시옥시페닐알라닌 또는 p-카르복시페닐알라닌; o-카르복시페닐알라닌; 및 m-카르복시페닐알라닌. 또한, 본 발명은 특정 비천연 아미노산으로 한정되지 않음을 인식할 것이다. 비천연 아미노산에 대한 추가적 정보는 하기에 제시된다.

인식될 바와 같이, 상기 용어들뿐만 아니라 추가적 용어들은 하기에 더 상세히 기재/기술된다.

도 1은 pNO₂Phe의 화학적 구조, mTNFα 삼량체의 단백질 구조, 및 pNO₂Phe이 돌연변이체 mTNFα 단백질 내로 도입되는 효율 및 신뢰도를 측정하기 위해 수행된 실험의 결과를 보여준다.
도 2는 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα의 MALDI-TOF 질량 분광측정 분석의 결과를 보여준다.
도 3은 야생형(wt) mTNFα의 MALDI-TOF 질량 분광측정 분석의 결과를 보여준다.
도 4는 돌연변이체 mTNFα 단백질의 3차 구조에 대한 Tyr⁸⁶pNO₂Phe의 효과를 측정하기 위해 수행된 FPLC 실험의 결과를 보여준다.
도 5는 다양한 mTNFα 돌연변이체의 분석 NFκB-루시퍼라제 활성을 보여준다.
도 6은 (a) PBS, (b) wt mTNFα, (c) pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα 또는 (d) Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 C57BL/6 마우스에 대한 혈청 역가를 보여준다.
도 7은 wt mTNFα 또는 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 Bcl-2 마우스의 경우 wt mTNFα에 대한 혈청 역가 및 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα에 대한 혈청 역가를 보여준다.
도 8은 면역보강제의 부재 하에 wt mTNFα 또는 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 Bcl-2 마우스에 대한 혈청 역가를 측정하기 위해 수행된 wt mTNFα 또는 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα에 대한 ELISA의 결과를 보여준다.
도 9는 면역보강제의 존재 또는 부재 하에 Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 Bcl-2 마우스에 대한 wt mTNFα 및 Phe⁸⁶ mTNFα에 대한 혈청 역가를 보여준다.
도 10A는 pNO₂Phe⁴² mTNFα 또는 Phe⁴² mTNFα로 면역화된 C57BL/6 마우스의 경우 wt mTNFα, pNO₂Phe⁴² mTNFα 및 Phe⁴² mTNFα에 대한 혈청 역가를 보여준다. 도 10B는 pNO₂Phe¹¹ mTNFα 또는 Phe⁴² mTNFα로 면역화된 C57BL/6 마우스의 경우 wt mTNFα, PBS 및 pNO₂Phe¹¹ mTNFα에 대한 혈청 역가를 보여준다.
도 11은 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα를 사용한 면역화가 TNFα 의존적 중증 내독소 혈증 모델에서 마우스의 생존을 개선시키는지를 확인하기 위해 수행된 실험의 결과를 보여준다.
도 12는 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα의 트립신 분해 단편의 MS/MS 시퀀싱의 결과를 보여준다.
도 13은 His₆-Phe⁸⁶ mTNFα(wt) 또는 His₆-pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα 상의 N-말단 His₆ 태그의 존재가 후속 면역화 실험의 결과에 영향을 미치지 못함을 보여주기 위해 수행된 실험의 결과를 보여준다.
도 14는 혈청 역가 지속성을 측정하기 위해 수행된 실험의 결과를 보여준다.
도 15는 T 세포 증식 분석의 결과를 보여준다.
도 16은 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα 면역화가 wt mTNFα와의 유의한 교차 반응성을 보이고 마우스에서 40주 이상 동안 지속되는 IgG 반응으로의 클래스-전환을 촉진함을 보여준다.
도 17은 mTNFα 상의 4개의 표면 노출된 부위가 유의한 면역원성을 나타냄을 보여준다.
도 18은 리포폴리사카라이드(LPS) 자극 후 다양한 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα 돌연변이체로 면역화된 마우스의 경우 유의한 생존 이점이 있음을 보여준다.
도 19는 pNO₂Phe 자가 항원 mRBP4의 도입이 내성 mRBP4의 상실을 초래할 수 있는지를 확인하기 위해 수행된 실험의 결과를 보여준다.
도 20은 wt mTNFα가 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα에 의해 유도된 내성 상실을 지속할 수 없음을 보여준다.
도 21은 3종의 mTNFα 단편의 질량 분광측정 분석을 보여준다.
도 22는 항-mTNFα mAb와 3종의 mTNFα 단편의 결합을 보여준다.
도 23은 pNO₂Phe이 mTNFα의 표면 노출된 부위 내로 도입되는지를 확인하기 위해 수행된 실험의 결과를 보여준다.
도 24는 pNO₂Phe이 mRBP4의 표면 노출된 부위 내로 도입되는지를 확인하기 위해 수행된 실험의 결과를 보여준다.
도 25는 pNO₂Phe⁴³ mRBP4 및 pNO₂Phe¹⁰⁸ mRBP4의 트립신 분해 단편의 MS/MS 분석이 pNO₂Phe의 도입에 대한 패턴과 일치함을 보여준다.
도 26은 C57BL/6 마우스에서 pNO₂Phe⁴³ mRBP4의 면역원성을 측정하기 위해 수행된 실험의 결과를 보여준다.
도 27의 (A)는 pNO₂Phe⁴³ mRBP4의 pNO₂Phe 함유 트립신 분해 단편의 MS/MS 시퀀싱의 결과를 보여주고, 도 27의 (B)는 pNO₂Phe¹⁰⁸ mRBP4의 pNO₂Phe 함유 트립신 분해 단편의 MS/MS 시퀀싱의 결과를 보여준다.

개요

자가 단백질 또는 다른 자가 분자에 대한 강한 면역 반응을 선별적으로 유도하거나 외래 항원 내의 특정 에피토프의 면역원성을 증가시키는 능력은 암, 단백질 폴딩 질환 및 감염 질환(예를 들어, 박테리아, 바이러스 또는 다른 종류의 감염)을 포함하는 다수의 질환 상태에 대한 백신의 제조에 있어서 중요하다. 본 발명은 백신접종에 있어서 유리하게 사용될 수 있는 비천연 면역원을 제조하기 위해, 또는 수동 면역화를 위한 항체를 제조하기 위해 비천연 아미노산을 단백질 내로 직접 도입하는 것을 이용한다. 본 발명에서, 비천연 아미노산이 도입되는 단백질은 백신접종될/면역화될 대상체 내의 표적 부분(예를 들어, 질환 관련 부분)에 상응한다(또는 대상체 내에 존재할 수 있는 표적 부분에 상응함). 비천연 아미노산을 가진 면역원이 대상체에 투여되는 실시양태에서, 비천연 아미노산의 존재는 비천연 면역원에 대한 면역학적 반응을 일으킨다. 이러한 반응에 의해 생성된 항체는 유리하게는 면역원의 기원이 되는(또는 면역원이 상응하는) 천연 표적 부분에 대한 교차 반응성을 보임으로써 표적 부분에 대한 면역학적 반응을 일으킨다. 본 발명의 방법은 대상체 내에 존재하는(또는 존재할 수 있는) 비면역원성 또는 약한 면역원성 표적 부분에 대한 면역학적 반응을 일으킴에 있어서 특히 유용하다. 또한, 본 발명은 대상체가 대상체 내에 존재하는(또는 존재할 수 있는) 상응하는 천연 표적 부분(또한, 예를 들어, 질환 관련 부분)에 대한 교차 반응성을 보이는 비천연 면역원(즉, 비천연 아미노산을 가진 면역원)에 대해 생성된 항체를 투여받는 실시양태를 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 표적 부분이 천연 자가 단백질, 예를 들어, TNFα이든 아니면 외래-분자, 예를 들어, 박테리아 항원이든 관계없이 상기 표적 부분에 의한 자극에 대한 면역학적 보호를 증가시킨다.

일례에서, 본원에 기재된 본 발명은 TNFα의 활성과 관련된 병태의 치료 및/또는 예방에 있어서 유용할 수 있는 조성물 및 방법도 제공한다. 종양 괴사 인자 알파(TNFα)는 많은 만성 염증성 질환, 예를 들어, 패혈증 쇼크, 류마티스 관절염, 뇌 말레리아 및 크론병의 악화 및/또는 야기에 관여하는 다면발현성(pleiotropic) 시토킨이다. 본 발명은 비천연 TNFα, 예를 들어, 하나 이상의 면역원성의 항체 접근이 가능한 비천연 아미노산을 포함하는 TNFα의 제조 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 TNFα에 대한 면역 내성을 파괴하기 위해, 예를 들어, 면역 시스템이 체내의 내재 TNFα에 대한 면역 반응을 일으키거나 증가시키도록 유도하기 위해 비천연 TNFα를 사용하는 방법을 제공한다. 내재 TNFα를, 예를 들어, 비천연 TNFα에 대해 생성된 항체(이 항체는 TNFα 상의 에피토프와 교차 반응함)로 중화시키는 것은 예를 들어, 내독소 쇼크, 뇌 말레리아, 자가면역 질환, 다발성 장기 부전, 다발성 경화증, 심장 기능장애, 아테롬성동맥경화증, 허혈-재관류 손상, 인슐린 내성, 류마티스 관절염, 크론병, 염증성 장 질환, 악액질, 패혈증 쇼크, AIDS, 이식편 대 숙주 질환, 박테리아 육아종, 성인 호흡 곤란 증후군 및/또는 실리카 유발성 폐 섬유증과 같은 질환의 증상을 완화시키거나 개선할 수 있다.

TNFα를 포함하는 일부 실시양태에서, 고도의 면역원성 니트로페닐 부분을 포함하는 비천연 아미노산 p-니트로페닐알라닌은 mTNFα 단백질의 위치 86에서 티로신 잔기를 치환하여 유용한 치유적 및/또는 예방적 성질을 가진 비천연 TNFα 유도체를 생성한다. 대상체(예를 들어, 마우스)에서 치유적 및/또는 예방적 치료에서 사용될 수 있는 추가적인 비천연 TNFα 유도체는 pNO₂Phe¹¹-mTNFα, pNO₂Phe¹⁹-mTNFα, pNO₂Phe²¹-mTNFα, pNO₂Phe⁴²-mTNFα, pNO₂Phe⁴⁹-mTNFα, pNO₂Phe¹⁰⁴-mTNFα 또는 pNO₂Phe¹¹³-mTNFα를 포함한다. 대상체(예를 들어, 인간)에서 치유적 및/또는 예방적 치료에서 사용될 수 있는 추가적인 비천연 TNFα 유도체는 pNO₂Phe¹¹-hTNFα, pNO₂Phe¹⁹-hTNFα, pNO₂Phe²¹-hTNFα, pNO₂Phe⁴²-hTNFα, pNO₂Phe⁴⁹-hTNFα, pNO₂Phe⁸⁷-hTNFα, pNO₂Phe¹⁰⁵-hTNFα 또는 pNO₂Phe¹¹⁴-hTNFα를 포함한다.

또 다른 예에서, 본원에 기재된 본 발명은 레티놀 결합 단백질 4(RBP4)의 활성과 관련된 병태의 치료 및/또는 예방에 있어서 유용할 수 있는 조성물 및 방법도 제공한다. RBP4는 예를 들어, 매튜 우드 증후군(Matthew Wood Syndrome), 연령 관련 황반 퇴화(AMD) 및 스타르가르트병(Stargardt's disease) 등의 존재/발달과 관련되어 있다.

비천연 면역원을 사용한 면역 내성의 파괴

현대 의학 치료에 있어서 중요한 과제는 특이적 약면역원성 외래 항원의 면역원성을 증가시키는, 예를 들어, 중화 항체를 생성하는 강력한 방법, 또는 자가 항원에 대한 내성을 선별적으로 극복하는 강력한 방법의 개발이다. 자가와 비자가 사이의 면역학적 구별 과정에서 중요한 것은 포유동물의 면역 시스템이 자가면역 질환을 피하기 위해 주로 자가 반응성 B 세포 또는 T 세포의 부재 또는 불활성화로 인해 자가 단백질에 대한 내성을 갖는 자가 내성의 개념이다. 이 문제점을 해결하기 위해 개선된 보조제 및 담체의 개발, 항원 내로의 강한 T 세포 에피토프의 도입, 지질 접합 및 조합 백신 등을 포함하는 여러 방법이 수행되어 왔다. 예를 들어, 문헌[Dalum et al., Nat Biotechnol 17:666 (1999)]; 문헌[Makela, et al., Expert Rev Vaccines 1:399 (2002)]; 문헌[Restifo, Curr Opin Immunol 8:658 (1996)]; 문헌[Baldridge, et al., Vaccine Adjuvants: Immunological and Clinical Principles. C. J. Hackett, Harn, D. A. Jr., Eds. (Humana Press, Totowa, NJ, 2006), pp. 235-255]; 및 문헌[Zuany-Amorim, et al., (2004) "Induction of TNF-alpha autoantibody production by Auto Vac TNF106: a novel therapeutic approach for the treatment of allergic diseases" Int Arch Allergy Immunol 133: 154-163]을 참조한다. 디아조늄 유도체로 광범위하게 비특이적으로 표지된 토끼 티로글로불린을 사용한 토끼의 면역화는 천연 티로글로불린에 대한 교차 반응성 항체를 유도함이 입증되었다. 문헌[Weigle, J Exp Med 121:289 (1965)]을 참조한다. 그러나, 이러한 방법은 다른 항원 등을 처리하기에는 용이하게 수식/조절되지 않는다. 또한, 디니트로페닐 기를 사용한 자가 암세포의 비특이적 유도체화가 흑색종 환자에 있어서 백신으로서 활용되고 있다(문헌[Berd, D. (2004) "M-Vax: an autologous, hapten-modified vaccine for human cancer" Expert Rev Vaccines 3:521-527]). 추가적 참고문헌들이 명세서 전체에서 발견된다(예를 들어, 하기 실시예).

이전의 시도와 대조적으로, 본 발명은 비천연 면역원을 제조하기 위해 표적 부분(예를 들어, 질환 관련 부분)의 표적 에피토프 내의 하나 이상의 천연 아미노산을 (원하는 특정 위치에서) 하나 이상의 비천연 아미노산(UAA)으로 치환되게 한다. 대안적으로 또는 추가로, 하나 이상의 특이적 비천연 아미노산 잔기는 비천연 면역원을 제조하기 위해 표적 부분 내의 표적 에피토프에 부가될 수 있다. 이러한 비천연 아미노산 치환 및/또는 부가는 (예를 들어, 대상체에서) 야생형(wt) 천연 표적 단백질 내의 상응하는 영역에 대한 강한 면역 반응, 예를 들어, T 세포 반응 및/또는 B 세포 반응을 일으킬 수 있는, 면역원성 및 경우에 따라 구조적 보존성을 나타내는 하나 이상의 에피토프를 비천연 면역원 내에서 생성할 수 있다. 또한, 하기에 더 상세히 설명된 바와 같이, 비천연 면역원에 대해 생성된 교차 반응성 항체는 비천연 아미노산을 포함하지 않는 상응하는 천연 표적 분자의 영역에 대한 특이성도 나타낼 수 있다. 하기를 참조한다. 경우에 따라 본 발명은 빈번한 주사 및 대량의 단백질 요구로 인해 문제가 되는, 단일클론 항체 또는 키메라 약물을 사용하여 내성을 파괴하고자 하는 이전의 시도들보다 훨씬 더 우수할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 본 발명의 비천연 면역원의 사용을 통해 대상체에서 생성된 항체의 혈청 지속성은 치료 과정 동안 낮은 빈도의 부스터(booster) 면역화가 요구될 수 있게 할 수 있다.

B 세포는 BCR(B 세포 수용체) 또는 막 결합-면역글로불린을 통해 혈액 또는 림프 중의 자유(가용성) 항원(예를 들어, 비천연 면역원)을 인식한다. 항원의 인식 후, B 세포는 항원을 내부로 도입시켜 MHC와 결합된 상태로 그의 표면 상에 상기 항원의 단편을 표시할 것이다. B 세포는 일단 활성화되면 기억 B 세포로 발달할 수 있고, 기억 B 세포는 항원(비천연 면역원)의 기원이 되는(항원이 상응하는) 질환 관련 표적 부분의 중화와 같은 작용 및/또는 항체 접근이 가능한 감염성 표적 물질 상의 에피토프의 파괴에 있어서 보조할 수 있는 항체를 생성하고 분비한다.

항원(예를 들어, 비천연 면역원)에 대해 특이성을 나타내는 T 세포, 예를 들어, CD₄ ⁺ T 세포는 예를 들어, B 세포에 의해 표시된 MHC 결합된 펩티드 단편에 결합할 것이다. 그 후, T 세포는 증식할 수 있고 면역 세포 증식 및 분화를 자극하는 시토킨을 방출할 수 있다. 이 프라이밍된 T 세포 중 일부는 예를 들어, 비천연 면역원의 기원이 되는 표적 부분(예를 들어, 질환 관련 부분)에 대한 매개 보호, 및 보다 신속하고 효과적인 2차 면역 반응을 일으키는 능력을 부여하는 기억 세포로 발달한다. 이 활성은 T 림프구 증식 분석에서 정량될 수 있다(실시예 1 및 2 참조).

50여종 이상의 비천연 아미노산이 특정 넌센스 코돈 및 프레임쉬프트(frameshift) 코돈에 반응하여 박테리아, 효모 또는 포유동물 세포에서 유전적으로 코딩된다. 예를 들어, 문헌[Wang, et al., Science 292:498 (2001)]; 문헌[Chin, et al., Science 301:964 (2003)]; 문헌[Liu, et al., Nat Methods 4:239 (2007)]; 문헌[Anderson, et al., Proc Natl Acad Sci USA 101:7566 (2004)]; 및 문헌[Wang, et al., Angew Chem Int Ed Engl 44:34 (2004)], 및 본원에서 언급된 다른 참고문헌을 참조한다. 상기 아미노산은 금속 결합 및 번역 후 수식된 아미노산, 형광 및 산화환원 활성 아미노산, 및 광 반응성 및 화학적 반응성 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 페닐알라닌 유도체인 p-니트로페닐알라닌(pNO₂Phe, 도 1a)은 분광 거리 프로브로서 사용되기 위해 높은 신뢰도 및 우수한 효율로 앰버 넌센스 코돈에 반응하여 박테리아에서 단백질 내로 도입된다. 예를 들어, 문헌[Tsao, et al., J Am Chem Soc 128:4572 (2006)]을 참조한다. 본원의 실시예 및 설명이 pNO₂Phe의 사용을 논의할 수 있지만, 이것은 한정을 위한 것으로 간주되어서는 안 되고, 본 발명이 임의의 비천연 아미노산(예를 들어, 본원에 나열된 비천연 아미노산 및/또는 본원의 참고문헌에 기재된 비천연 아미노산을 포함하나 이들로 한정되지 않음)의 사용을 포괄함을 인식할 것이다. 본 발명의 다양한 실시양태에서 사용될 수 있는 비천연 아미노산에 대한 추가적 정보는 하기에 제시되어 있다.

비천연 면역원에 의한 면역 내성 파괴의 예

니트로아릴 기는 아마도 전자 결여 파이(pi) 시스템이 항체 결합 부위에 공통으로 존재하는 Tyr 및 Trp 측쇄와 상호작용하는 성향으로 인해 고도의 면역원성 햅텐(hapten)(문헌[Keinan, Ed., Catalytic Antibodies (Wiley-VCH, Weinheim, 2005), pages 1-28] 참조)으로서 역사적으로 사용되고 있다. 관심있는 표적 부분(예를 들어, 질환 관련 부분) 내의 Phe->pNO₂Phe 또는 Tyr->pNO₂Phe 돌연변이는 이 아미노산들이 구조적으로 매우 유사하기 때문에 면역원의 기원이 되는(면역원이 상응하는) 본래의 천연 표적 부분에 대한 교차 반응성을 보이는 강한 면역 반응을 일으키는 면역원을 생성할 수 있다.

따라서, 실시예에 나타낸 바와 같이, 예를 들어, 뮤린 종양 괴사 인자-α (mTNFα)의 Tyr⁸⁶->pNO₂Phe 돌연변이체를 사용한 마우스의 면역화는 리포폴리사카라이드(LPS) 접종에 대해 마우스를 효율적으로 보호하는 야생형 mTNFα(wt mTNFα)에 대한 고역가 항체 반응을 발생시킨다.

mTNFα는 감염, 염증 및 자가면역 현상의 조절에 관여하는 잘 특징규명된 시토킨이기 때문에 본 발명의 양태들을 설명하기 위한 표적 단백질로서 선택되었고(문헌[Vassalli, Annu Rev Immunol 10:411 (1992)] 참조), 그의 발현, 구조, 기능 및 신호전달 기작을 포함하는 mTNFα의 생물학적 성질은 광범위하게 연구되었다. 예를 들어, 상기 문헌[Vassalli, Annu Rev Immunol 10:411 (1992)]; 문헌[Baeyens, et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 55:772 (1999)]; 문헌[Pennica, et al., Proc Natl Acad Sci USA 82:6060 (1985)]; 문헌[Pasparakis, et al., J Exp Med 184: 1397 (1996)]; 문헌[Baeyens, H. L. et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53:329 (1997)]; 및 문헌[Aggarwal, Vilcek, J., Ed., Tumor necrosis factors: structure, function, and mechanism of action (Dekker, New York, 1992), pages 1-587]을 참조한다. 또한, mTNFα 넉아웃(knockout) 마우스는 생존가능하고 분명한 표현형적 이상을 보이지 않는데(상기 문헌[Pasparakis, et al., J Exp Med 184: 1397 (1996)] 참조), 이는 상기 마우스가 TNF에 대한 중화 면역 반응에서 생존하여 백신접종된 동물이 항-TNFα 항체 생성 및 생물학적 활성에 대해 분석될 수 있게 할 것임을 암시한다. 나아가, 항-TNFα 항체(문헌[Knight, et al., Mol Immunol 30:1443 (1993)]; 및 문헌[Present, et al., N Engl J Med 340:1398 (1999)]) 및 가용성 키메라 TNFα 수용체(문헌[Peppel, et al., J Exp Med 174: 1483 (1991)]; 및 문헌[Williams, et al., Immunology 84:433 (1995)])는 류마티스 관절염의 치료에 있어서 광범위하게 사용되었다. 따라서, 임상적으로 사용되기 위한 TNFα-특이적 백신이 바람직할 것이다(상기 달룸(Dalum)의 문헌; 문헌[Spohn, et al., J Immunol 178:7450 (2007)]; 문헌[Buanec, et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:19442 (2006)]; 및 문헌[Capini, et al., Vaccine 22:3144 (2004)]). 삼량체 mTNFα의 X-선 결정 구조(문헌[Baeyens, et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 55:772 (1999)]; 및 문헌[Baeyens, et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53:329 (1997)])에 기초하여, 본 발명의 설명을 위한 면역원으로서 단일 Tyr⁸⁶→pNO₂Phe 돌연변이체 mTNFα(pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα, 도 1b 참조)를 선택하였다. Tyr⁸⁶은 다양한 포유동물 TNF들 사이에서 고도로 보존되어 있고 이 부위에서의 돌연변이는 단백질 폴딩 또는 삼량체 형성에 영향을 미치지 않음이 확인되었다. 또한, Tyr⁸⁶에서의 돌연변이는 세포독성에서의 유의한 손실을 초래하여 백신접종용으로 유리하다. 예를 들어, 문헌[Van Ostade, et al., Protein Eng 7:5 (1994)]; 문헌[Loetscher, et al., J Biol Chem 268:26350 (1993)]; 및 문헌[Zhang, et al., J Biol Chem 267:24069 (1992)]을 참조한다.

실시예 2는 예를 들어, TNFα에 대한 다클론 IgG 항체 반응의 성질 및 지속성을 특징규명하고 야생형 레티놀 결합 단백질 4(mRBP4)에 대한 항체 반응의 생성을 보임으로써(이로써 면역 기능과 관련없는 자가 단백질을 사용하는 본 발명의 용도를 보여줌) 본 발명의 넓은 적용가능성의 추가적 설명을 제공한다. 흥미롭게도, 실시예 2는 자가 내성의 pNO₂Phe-유도된 파괴가 wt mTNFα 내의 다수의 에피토프(비천연 면역원 TNFα 내의 pNO₂Phe 잔기를 포함하는 영역에 상응하는 천연 TNFα 내의 영역을 반드시 포함하지는 않음)에 대한 항체 반응을 발생시킴을 보여준다. 따라서, 본 발명의 비천연 면역원을 사용한 면역화는 유리하게는 면역글로불린 에피토프가 넓게 분포되게 함으로써 유도 에피토프와 상이한 에피토프가 진행되는 면역 반응의 주요 표적이 되게 할 수 있다. 하기를 참조한다. 비천연 면역원의 기원이 되는 질환 관련 부분 전체에 걸친 에피토프에 대한 면역의 확장은 특히 백신 디자인에서 추구되는 현상이다. 질환 관련 부분 상의 다수의 표적을 공격하는 면역 시스템의 능력의 증강은 상기 부분에 대한 면역 반응의 효율 및/또는 강도를 증가시킬 수 있다.

하기 실시예에 기재된 설명은 본 발명의 TNFα 또는 RPB4 실시양태만이 아님을 인식할 것이다. 본원의 설명으로부터 자명한 바와 같이, 다양한 실시양태가 비천연 TNFα 및 RPB4 부분 내의 하나 이상의 ANY 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 나아가, 이러한 비천연 면역원에 존재하는 비천연 아미노산은 경우에 따라 상기 면역원 내의 임의의 위치에 존재할 수 있다. 천연 TNFα 및 RBP4에서 상응하는 천연 아미노산을 치환시키는 비천연 아미노산은 보존적 아미노산 치환일 수 있거나 비보존적 아미노산 치환일 수 있다. 또한, 비천연 면역원성 TNFα 및 RBP4는 다수의 방법들 중 임의의 방법으로 구축될 수 있다. 많은 실시양태가 비천연 아미노산의 직접적인 도입 경로로서 오르토고날 번역(하기 참조)을 이용하지만, 다른 직접적인 도입 방법(예를 들어, 시험관내 번역 시스템, 고체상 합성 등)도 경우에 따라 이용될 수 있다. 본원의 실시양태는 전형적으로 오르토고날 번역과 같은 직접적인 도입 방법과 함께 또는 더불어 이용하는 경우를 제외하고 상기 번역 후 또는 화학적 수식 방법을 이용하지는 않는다.

면역 반응을 강화/ 증강시키는 방법 및 조성물

본원의 실시예 및 설명으로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 비천연 면역원은 천연 표적 부분과 관련된 질환으로부터 보호하는 (또는 질환 상태의 치료에 사용될 수 있는), 상기 천연 표적 부분(예를 들어, 비천연 아미노산을 포함하지 않는 질환 관련 단백질)에 대한 강력한 교차 반응성 항체 반응을 일으킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 비천연 아미노산을 관심있는 표적 부분의 특정 에피토프, 예를 들어, 표면 노출된 에피토프 또는 질환 관련 부분 내의 T 세포 에피토프 내로 부위 특이적으로 도입함으로써 면역학적 자가 내성을 파괴할 수 있다. 예를 들어, 하기 단순화된 개략도에서, 표적 부분(예를 들어, 질환 관련 부분)은 에피토프 1, 2 및 3을 포함할 수 있다. 또한, 비천연 면역원은 상기 부분의 에피토프 1, 2 및 3으로부터 유래된 또는 상기 에피토프 1, 2 및 3에 상응하는(예를 들어, 동일한 서열을 가진) 에피토프 1, 2 및 3을 포함한다. 그러나, 비천연 면역원의 에피토프 2는 표적 부분 내의 상응하는 천연 아미노산을 치환시키는 (별모양으로 표시된) 비천연 아미노산을 포함한다. 비천연 면역원 내의 비천연 아미노산의 존재는 표적 부분의 다양한 에피토프(광범위한 에피토프 분포)를 인식할 수 있는 교차 반응성 항체의 생성을 유도할 수 있다. 예를 들어, 교차 반응성 항체는 에피토프 1 및 3(비천연 아미노산을 포함하는 비천연 면역원 내의 에피토프에 상응하지 않음)뿐만 아니라 에피토프 2(비천연 아미노산을 가진 비천연 면역원 내의 에피토프에 상응함)에 대해서도 생성될 수 있다.

비천연 아미노산을 관심있는 표적 부분의 특정 에피토프 내로 부위 특이적으로 도입시켜 비천연 면역원을 발생시킴으로써 면역학적 자가 내성을 파괴하는 것은 단백질 폴딩 질환 또는 암과 관련된 내재 부분(예를 들어, 각각 아밀로이드-베타 (1-42) 펩티드 또는 전립선 특이적 항원)을 포함하는 다수의 내재 부분(예를 들어, 단백질)에 적용될 수 있다. 또한, 이 방법은 약한 면역원성 에피토프에 대한 강한 항체 반응을 발생시켜 외래-표적 부분, 예를 들어, 바이러스, 진균, 프리온 또는 연충 감염으로부터 발생된 외래-표적에 대한 중화 항체를 생성할 수 있다.

본원의 다양한 실시양태는 대상체 내로 접종된 경우 비천연 아미노산을 포함하지 않고 대상체 내에 존재하거나 대상체 내에 존재할 수 있는 표적 부분, 예를 들어, 질환 관련 부분에 대한 교차 반응성을 보이는 항체, B 세포 및/또는 T 세포의 생성을 유도할 비천연 면역원(즉, 표적 부분에 상응하되 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 분자)의 투여를 이용함을 인식할 것이다. 다른 실시양태에서, 비천연 면역원을 사용하여 천연 표적 부분과 교차 반응하는 항체를 생성할 수 있고, 상기 항체는 대상체에 대한 예방적/치유적 치료 수단으로서 투여된다.

따라서, 본원의 일부 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 면역원을 대상체에 투여하여 상기 대상체 내의 표적 부분(예를 들어, 질환 관련 부분, 대상체의 자가 분자, 대상체 내의 병원체로부터 유래된 분자, 또는 대상체 내에 존재할 수 있는 병원체로부터 유래된 분자 등)에 대한 면역원성(또는 면역학적) 반응을 일으키는 방법을 포함한다. 비천연 아미노산을 포함하지 않는 표적 부분에 상응하는 면역원에 대한 항체는 대상체에 의해 생성되고, 상기 항체는 특정 표적 부분에 대한 교차 반응성을 보인다. 또한, 생성된 항체는 비천연 면역원 상의 비천연 아미노산을 가진 에피토프에 상응하는 표적 부분 상의 에피토프에 대한 특이성을 반드시 나타내지는 않는다는 것을 인식할 것이다. 본 발명의 방법은 표적(예를 들어, 질환 관련) 부분에 대한 대상체의 면역 내성을 파괴하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 오르토고날 번역 시스템 또는 다른 직접적인 도입 방법(하기 참조)을 통한 제조의 관점에서 본원에 기재되어 있지만, 면역원성 비천연 항원은 일단 생성되면 다른 방법(예를 들어, 화학적 수식 등)을 통해서도 수식될 수 있다. 이러한 간접적인 방법은 전형적으로 오르토고날 방법과 같은 직접적인 도입 방법과 함께 또는 더불어 이용된다.

하기에 더 상세히 설명된 바와 같이, 대상체에서 면역학적 반응을 일으키기 위해 사용하는 면역원은 전형적으로 대상체 내에 존재하는 표적 부분 또는 대상체 내에 존재할 수 있는 표적 부분(예를 들어, 대상체를 감염시킬 수 있는 박테리아로부터 유래된 부분, 대상체에서 발생할 수 있는 종양으로부터 유래된 부분 등)의 "비천연" 버젼을 포함한다. 다시 말해, 비천연 면역원은 경우에 따라 표적 부분 내의 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산으로 치환된 것을 제외하고 표적 부분과 동일한 아미노산 서열/구조를 포함한다(추가적 예시를 위해서는 하기 실시예 단락 참조). 대안적으로 또는 추가로, 비천연 면역원은 하나 이상의 추가적인 비천연 아미노산 잔기와 함께 표적 부분의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 치환 및/또는 부가적 비천연 아미노산은 원래의 표적 부분과 비교할 때 비천연 면역원의 입체구조를 변화시키지 않는다(또는 약간만 변화시킴). 따라서, 비천연 면역원 및 표적 부분의 3차 구조 및/또는 4차 구조는 동일할 수 있거나 서로 매우 유사할 수 있다. 비천연 면역원 내의 하나 이상의 비천연 아미노산의 배치는 경우에 따라, 예를 들어, 그 위치에의 배치가 면역원의 기원이 되는 표적 부분의 입체구조에 비해 면역원의 입체구조를 변화시킬지, 상기 위치가 비천연 아미노산으로 하여금 항체의 접근이 가능한 비천연 아미노산이 되게 할 수 있는지 등에 기초하여 선택된다. 비천연 면역원 내로 도입되는 비천연 아미노산은 (표적 부분 내의 상응하는 천연 아미노산과 비교할 때) 보존적 또는 비보존적 치환일 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태는 하나 이상의 비천연 면역원을 투여하고/하거나 상응하는 천연 표적 부분과 교차 반응하는, 상기 하나 이상의 비천연 면역원에 대한 항체를 투여함으로써 대상체를 예방적으로 및/또는 치유적으로 치료하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 치료(예를 들어, TNFα)에 대해 적어도 잠정적으로 민감한 표적 부분(예를 들어, 질환 관련 부분)을 동정함으로써 백신을 제조하는 방법을 포함하는 실시양태를 포함한다. 이러한 표적 부분은 전형적으로 "천연" 표적 부분이고 임의의 비천연 아미노산을 포함하지 않음을 인식할 것이다. 상기 방법은 하나 이상의 비천연 아미노산, 예를 들어, 치환 및/또는 부가적 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 면역원, 즉 표적 부분의 상응하는 "비천연" 버젼을 제공하는 단계도 포함한다. 또한, 면역원은 비천연 면역원을 대상체에 투여하는 것이 표적 부분에 대한 교차 반응성을 보이는 면역원에 대한 항체를 생성하도록 상기 표적 부분과 동일한 또는 거의 동일한 입체구조를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 이러한 방법에 의해 제조된 백신도 포함한다.

본원의 다양한 실시양태에서 천연 표적 부분은 면역학적 반응이 일어나는 경우 및/또는 예방적 치료를 제공받는 경우 대상체 내에 존재할 수 있거나 존재할 수 없다. 따라서, 본원에서 표적 부분이 대상체에 또는 대상체 내에 존재한다고 기재되는 경우, 이러한 기재는 표적 부분이 대상체 내에 존재할 수 있는 경우도 포함함을 인식해야 한다. 따라서, 표적 부분은 대상체에서 발생할 수 있는 종양, 대상체를 감염시킬 수 있는 감염성 물질 등으로부터 유래될 수 있다.

따라서, 본원 전체에서 설명되어 있는 바와 같이, 다양한 실시양태에서 표적 부분은 질환 관련 부분, 천연 부분, 외래 부분 등일 수 있다. 표적 부분은 그 자체로 비면역원성 부분일 수 있거나 부분적 또는 약한 면역원성 부분 등일 수 있다. 외래 부분인 표적 부분은 임의의 유기체(예를 들어, 박테리아, 바이러스 등)로부터 유래될 수 있다. 자가 항원인 표적 부분은 임의의 자가 항원(예를 들어, 종양 관련 항원 등)일 수 있다. 비천연 면역원 내로 도입되는 비천연 아미노산은 임의의 비천연 아미노산(하기 참조)일 수 있고 면역원 내의 임의의 위치에 존재할 수 있다. 표적 부분 내의 천연 아미노산과 비교할 때, 면역원 내의 치환 비천연 아미노산은 보존적 또는 비보존적 치환일 수 있다. 또한, 하기에 더 기재된 바와 같이, 비천연 면역원은 다수의 직접적인 도입 방법(예를 들어, 오르토고날 번역, 고체상 합성 등) 중 임의의 방법을 통해 생성될 수 있다. 본원의 전형적인 실시양태는 간접적인 도입 방법, 예컨대, 번역 후 수식 또는 화학적 수식(그러나, 이 간접적인 도입 방법은 경우에 따라 직접적인 도입 방법, 예컨대, 오르토고날 번역과 함께 또는 더불어 이용될 수 있거나 직접적인 도입 방법, 예컨대, 오르토고날 번역 후 이용될 수 있음)을 통해 비천연 면역원을 생성하지는 않는다.

질환 상태 및 질환 관련 표적 부분

본 발명의 방법 및 조성물은 매우 다양한 의학적 병태/질환 상태의 예방적 및/또는 치유적 치료를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 면역 장애의 치료에서 사용될 수 있다. 이러한 면역 장애는 하기 질환을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다: 자가면역 질환(예를 들어, 진성 당뇨병, 관절염, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 골관절염, 건선 관절염, 다발성 경화증(예를 들어, TRAIL, CD95/CD95 등과 같은 MS 관련 항원을 수반함), 뇌척수염, 중증근무력증, 전신 홍반성 루프스(SLE), 자가면역 갑상선염, 피부염, 아토피성 피부염, 습진 피부염, 건선, 쇼그렌 증후군, 크론병, 아프타 궤양, 홍채염, 결막염, 각막결막염, 궤양성 대장염, 천식, 알레르기성 천식, 피부 홍반성 루프스, 공피증, 질염, 직장염, 약물 발진, 나병 역전 반응, 나병 결절 홍반, 자가면역 포도막염, 알레르기성 뇌척수염, 급성 괴사 출혈 뇌병, 특발성 양측 진행성 감각신경 청각 상실, 재생불량 빈혈, 진정 적혈구계 빈혈, 특발성 저혈소판증, 다발연골염, 베게너 육아종증, 만성 활성 간염, 스티븐스-존슨 증후군, 특발성 스프루, 편평 태선, 그레이브병, 사르코이드증, 원발성 담즙성 간경변, 포도막염 전방 및 간질 폐 섬유증, 이식편 대 숙주 질환, 이식 및 알레르기(예를 들어, 알토피성 알레르기). 또한, 본 발명은 비자가면역/비감염성 병원체 유래의 질환 상태, 예컨대, 당뇨병/심혈관 질환(예를 들어, RBP4를 수반함), 또는 특발성 유래의 질환 상태, 예컨대, 알츠하이머병(예를 들어, 이때 질환 관련 부분은 예컨대, 아밀로이드 베타40, 아밀로이드 베타42 등을 포함할 수 있음)을 치료할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법 및 조성물의 다양한 실시양태는 TNFα 활성과 관련된 질환 상태, 예를 들어, 악액질, 패혈증 쇼크, 살균 육아종, 성인 호흡 곤란 증후군, 실리카 유발성 폐 섬유증, 자가면역 질환, 다발성 장기 부전, 다발성 경화증, 심장 기능장애, 아테롬성경화증, 허혈-재관류 손상, 인슐린 내성 및 염증성 장 질환 등의 예방적 및/또는 치유적 치료를 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 실시양태는 RBP4 활성과 관련된 질환 상태, 예를 들어, 매튜 우드 증후군, 연령 관련 황반 변성(AMD) 및 스타르가르트병 등의 예방적 및/또는 치유적 치료를 위해 사용될 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 다양한 암(예를 들어, 유방암, 전립선암, 난소암, 폐암, 피부암 등)의 예방적 및/또는 치유적 치료를 위해 사용될 수 있다. 이러한 치료는 종양 관련 항원이 존재하는 암의 치료를 포함할 수 있으나 이로 한정되지 않는다. 종양 관련 항원은 다수의 암, 예를 들어, 유방암, 전립선암, 난소암 등에 대해서도 공지되어 있다. 종양 관련 항원은 다음 항원들을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다: 결장 및 다른 암으로부터의 암배아 항원(CEA), MAGE, BAGE, RAGE 및 NY-ESO(고환의 면역 특별 격리 영역 및 다양한 종양 세포에서 발현되는 비돌연변이된 항원); 동일한 조직으로부터 유래된 정상 세포 및 신생물 세포에서 발현되는 항원인 계통 특이적 종양 항원, 예컨대, 멜라닌세포-흑색종 계통 항원 MART-1/Melan-A, gp100, gp75, mda-7, 티로시나제 및 티로시나제 관련 단백질, 또는 전립선 특이적 막 항원(PSMA) 및 전립선 특이적 항원(PSA); 종양 세포에서 돌연변이된 유전자 또는 정상 세포에 비해 종양에서 상이한 수준으로 전사되는 유전자, 예컨대, 돌연변이 ras, bcr/ab1 재배열, Her2/neu, 돌연변이 또는 야생형 p53, 사이토크롬 P450 1B1, 및 비정상적으로 발현된 인트론 서열, 예컨대, N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제-V로부터 유래된 에피토프 단백질/펩티드; 골수종 및 B 세포 림프종에서 독특한 이디오타입(idiotype)을 발생시키는 면역글로불린 유전자의 클론 재배열; 종양바이러스 과정으로부터 유래된 에피토프 단백질/펩티드, 예컨대, 인간 파필로마 바이러스 단백질 E6 및 E7; 및 종양 선별적 발현을 나타내는 비돌연변이된 종양태아성 단백질, 예컨대, 암배아 항원 및 알파-페토단백질.

특정 실시양태에서, 본 발명은 난소암의 치료에서 사용될 수 있고/있거나, 표적 질환 관련 부분은 예를 들어, 난소 종양 관련 항원, CA19-9, p53, OCAA, HOXB7, Ca125 등을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 전립선암의 치료에서 사용될 수 있고/있거나, 표적 질환 관련 부분은 예를 들어, 전립선 종양 관련 항원, PSA, PSMA, STEAP, PCTA-1 등을 포함할 수 있다. 본원의 다른 실시양태는 유방암의 치료를 포함하고/하거나 표적 질환 관련 부분은 예를 들어, CA15-3, CA27-29, Her2/neu 등을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 종양 관련 항원에 대한 추가적 정보는 예를 들어, 문헌["Tumor-Antigens Recognized By T-Lymphocytes," Boon, et al., Annual Review Of Immunology 12:337-365, 1994]; 및 문헌["A listing of human tumor antigens recognized by T cells," Renkvist, et al., Cancer Immunology Immunotherapy 50:(1) 3-15 MAR 2001]에서 찾을 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 자가 항원, 예컨대, EGF, EGFR, HER-1, CXCR4, 또는 임의의 G-단백질 커플링 수용체(이들로 한정되지 않음)를 수반하는 질환, 장애 등의 치료에서 사용될 수 있다. 당업자는 본 발명을 통해 해결할 수 있는 다수의 종양 관련 항원 및 상응하는 암, 및 자가 항원 및 면역 장애를 잘 알고 있을 것이다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 HIV 감염에 대한 치료를 포함하고, 이때 비천연 항원은 HIV/AIDS와 관련된 표적 질환 관련 부분, 예를 들어, gp120, gρ41, gp160 등에 상응할 수 있다. 다른 예시적 HTV 부분은 gag, pol, env, tat, nef 및 rev를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 바이러스 감염의 치료에 사용될 수 있고, 비천연 면역원은 바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스, 알파바이러스, 칼리시 바이러스(예를 들어, 칼리시바이러스 캡시드 항원), 코로나바이러스, CMV(예를 들어, pp65), 디스템퍼 바이러스, 에볼라 바이러스, 엔테로바이러스, EBV(예를 들어, gp340 또는 핵항원 3A), 플라비바이러스, 예컨대, Hep C(예를 들어, 코어 항원), 헤파드나바이러스, 예컨대, Hep B(예를 들어, B형 간염 코어 또는 표면 항원, HbsAg, 또는 외피 Ag pre S2 또는 pre S1 ag), 간염 델타 물질, Hep E 또는 F 바이러스, A형 간염 바이러스(예를 들어, VP1), GBV-C, 허피스바이러스(예를 들어, 허피스 심플렉스 바이러스 단백질, 예를 들어, 타입 I 당단백질 G 또는 gpD 또는 CP27, 또는 수두 대상포진 바이러스 당단백질, 예를 들어, IE62 또는 gp1 또는 외피 단백질), 면역결핍 바이러스, 예컨대, HIV(예를 들어, 외피 또는 단백질분해효소), 감염성 복막염 바이러스, 인플루엔자 바이러스(예를 들어, 인플루엔자 A 헤마글루티닌, 뉴라미니다제 또는 핵단백질), LCMV(예를 들어, 핵단백질), 백혈병 바이러스, 마버그 바이러스, 오르토믹소바이러스, 파필로마 바이러스, 예컨대, HPV(예를 들어, HPV 캡시드 단백질), 파라인플루엔자 바이러스(예를 들어, 헤마글루티닌/뉴라미니다제), 파라믹소바이러스, 예컨대, RSV(예를 들어, F 또는 G 단백질), 파보바이러스, 페스티바이러스, 피코나바이러스(예를 들어, 폴리오바이러스 캡시드 폴리펩티드, 예컨대, VP1, VP2 또는 VP3, 또는 Hep A 항원), 폭스 바이러스(예를 들어, 백시니아 바이러스 폴리펩티드, 예컨대, 외피 단백질), 공수병 바이러스(예를 들어, 공수병 바이러스 당단백질 G), 레오바이러스, 레트로바이러스, 리노바이러스(예를 들어, 인간 리노바이러스 캡시드), 루벨라 바이러스(예를 들어, 캡시드 단백질) 또는 로타바이러스와 관련된 표적 질환 관련 부분에 상응할 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 박테리아 또는 마이코박테리아 감염의 치료에서 사용될 수 있고, 비천연 면역원은 박테리아 또는 마이코박테리아, 예를 들어, 액티노마이세스, 바실러스, 박테로이드, 보르데텔라(예를 들어, 비. 퍼투시스 표면 단백질), 바르토넬라, 보렐리아(예를 들어, 비. 버그도페리 OspA), 브루셀라(예를 들어, 브루셀라 표면 단백질), 캠필로박터, 캡노사이토파가, 클라미디아(예를 들어, 씨. 트라코마티스 표면 단백질), 클로스트리듐, 코리네박테리움, 콕시엘라, 더마토필러스, 엔테로코커스, 에를리히아, 에스케리키아, 프란시셀라, 푸소박테리움, 해모바르토넬라, 해모필러스(예를 들어, 에이치. 인플루엔자 타입 b 외막 단백질), 헬리코박터, 클렙시엘라, L형 박테리아, 렙토스피라, 리스테리아(예를 들어, 표면 단백질), 마이코박테리아, 예컨대, 결핵(예를 들어, 마이코박테리아 리포아라비노만난, 마이코박테리아 mAPG, ESAT-6, Ag85B), 마이코플라스마, 네이세리아(예를 들어, 엔. 멘닌기티데스 클래스 1 외부 단백질), 네오릿케치아, 노카르디아, 파스투렐라, 펩토코커스, 펩토스트렙토코커스, 뉴모코커스, 프로테우스, 슈도모나스, 릿케치아, 로칼리매아, 살모넬라, 시겔라, 스타필로코커스(예를 들어, 스타필로코커스 GP-1), 스트렙토코커스(예를 들어, 에스. 파이오진스 M 단백질 또는 에스. 뉴모니아 캡슐형 폴리사카라이드 또는 스트렙토코커스 표면 단백질 Ag), 트레포네마, 비브리오(예를 들어, 비브리오 콜레라 TcpA 필린 서브유니트) 및 여시니아(예를 들어, 와이. 페스티스 F1 및 V 항원)와 관련된 표적 질환 관련 부분에 상응하도록 생성될 수 있다.

본원의 다른 실시양태는 진균 감염의 치료를 위한 방법 및 조성물 등을 포함할 수 있고, 생성된 비천연 면역원은 진균, 예를 들어, 압시디아, 아크레모늄, 알터나리아, 아스퍼질러스, 바시디오볼루스, 비폴라리스, 블라스토마이세스, 칸디다, 콕시디오이드, 코니디오볼루스, 크립토코커스, 쿠르발라리아, 에피더모파이톤, 엑소피알라, 지오트리쿰, 히스토플라스마, 마두렐라, 말라스세지아, 마이크로스포룸, 모닐리엘라, 모르티에렐라, 뮤코르, 패실로마이세스, 페니실륨, 피알레모늄, 피알로포라, 프로토테카, 슈달레스케리아, 슈도마이크로도키움, 파이티움, 리노스포리듐, 리조푸스, 스코레코바시듐, 스포로트릭스, 스템파일리움, 트리코파이톤, 트리코스포론 및 크실로하이파와 관련된 표적 질환 관련 부분에 상응할 수 있다.

본원의 일부 실시양태는 원생동물 감염의 치료를 위한 방법 및 조성물 등을 포함할 수 있고, 생성된 비천연 면역원은 원생동물 연충, 예를 들어, 바베시아, 발란티듐, 베스노이티아, 크립토스포리듐, 에이메리아, 엔세팔리토조온, 엔타모에바, 기아르디아, 함몬디아, 헵파토조안, 이소스포라, 레이쉬만니아(예를 들어, 레이쉬만니아 주요 표면 당단백질, 예컨대, gp63), 마이크로스포리디아, 네오스포라, 노세마, 펜타트리코모나스, 플라스모듐(예를 들어, 피. 팔시파룸 서컴스포로조이트(PfCSP), 스포로조이트 표면 단백질 2(PfSSP2), 간 상태 항원 1의 카르복실 말단(PfLSA1 c-말단), 배출되는 단백질 1(PfExp-1), Pfs 48/45, Pfs 28, Pfs 25, Pfs 230), 뉴모시스티스, 사코시스티스, 스키스토소마, 테일레리아, 톡소플라스마 및 트리파노소마와 관련된 표적 질환 관련 부분에 상응할 수 있다.

본원의 다른 실시양태는 연충 감염의 치료를 위한 방법 및 조성물 등을 포함할 수 있고, 생성된 비천연 면역원은 연충 기생충, 예를 들어, 아칸토케일로네마, 앨루로스트론길루스, 안실로스토마, 안지오스트론길루스, 아스카리스, 브루기아, 부노스토뭄, 카필라리아, 카베르티아, 코오페리아, 크레노소마, 딕티오카울루스, 디옥토파임, 디페탈로네마, 디파일로보트리움, 디플라이듐, 디로필라리아아, 드라쿤쿨러스, 엔테로비우스, 필라로이데스, 해몬쿠스, 라고킬라스카리스, 로아 폴리펩티드, 만소넬라, 무엘레리우스, 나노파이에투스, 네카토르, 네마토디루스, 오에소파고스토뭄, 온코세르카, 오피스토르키스, 오스터타기아, 파라필라리아, 파라고니무스, 파라스카리스, 파이살로프테라, 프로토스트론길루스, 세타리아, 스피로세르카, 스피로메트라, 스테파노필라리아, 스트론길로이데스, 스트론길루스, 텔라지아, 톡소스카리스, 톡소카라, 트리키넬라, 트리코스트론길루스, 트리쿠리스, 운시나리아 또는 우케레리아와 관련된 표적 질환 관련 부분에 상응할 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태는 외부기생충 감염의 치료를 위한 방법 및 조성물을 포함할 수 있고, 생성된 비천연 면역원은 외부기생충과 관련된 표적 질환 관련 부분에 상응할 수 있다. 이러한 외부기생충은 예를 들어, 벼룩; 경질 진드기 및 연질 진드기를 포함하는 진드기; 파리, 예컨대, 깔따구, 모기, 모래 파리, 흑파리, 말파리, 각질 파리, 사슴 파리, 체체 파리, 침파리, 구더기증-유발 파리 및 물어뜯는 각다귀; 개미; 거미, 이; 진드기; 및 진정 벌레, 예컨대, 침대 벌레 및 키싱 벌레를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 면역원은 화분 또는 알레르겐의 표적 부분에 상응할 수 있다.

비천연 아미노산

본원에서 사용된 바와 같이, 비천연 아미노산은 셀레노시스테인 및/또는 피롤라이신 및 하기 20종의 정규 유전적으로 코딩된 알파-아미노산 이외의 임의의 아미노산, 수식된 아미노산 또는 아미노산 유사체를 의미한다: 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 비천연 면역원 내로 도입되는 하나 이상의 비천연 아미노산은 임의의 비천연 아미노산일 수 있다. 따라서, 본원에서 특정 비천연 아미노산의 언급은 반드시 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 됨을 인식할 것이다. 예를 들어, 오르토고날 요소들을 포함하는 번역 시스템을 이용하여 생체 내에서 비천연 아미노산을 코딩함으로써 매우 다양한 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하였다. 검토를 위해서는 예를 들어, 문헌[Liu, et al., (2007) "Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells" Nat Methods 4:239-244]; 문헌[Wang, et al., (2006) "Expanding the genetic code" Annu Rev Biophys Biomol Struct 35:225-249]; 문헌[Xie & Schultz (2006) "A chemical toolkit for proteins-an expanded genetic code" Nat Rev Mol Cell Biol 7:775-782]; 문헌[Wang and Schultz "Expanding the Genetic Code," Angewandte Chemie Int. Ed, 44(1):34-66 (2005)]; 및 문헌[Chin, et al., (2003) "An expanded eukaryotic genetic code" Science 301:964-967]을 참조한다.

추가로, 본 발명의 다양한 실시양태에서 예를 들어, 억제자 tRNA가 원하는 비천연 아미노산으로 화학적으로 아실화되어 면역원 생합성을 지지할 수 있는 시험관내 추출물에 부가되는 생합성 방법을 이용하여 시험관내에서 비천연 아미노산을 면역원 내로 도입할 수 있다. 이러한 시험관내 합성 방법의 설명을 위해서는 예를 들어, 문헌[V. W. Cornish, D. Mendel and P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34:621 (1995)]; 문헌[CJ. Noren, S.J. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P.G. Schultz, "A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins," Science 244 182-188 (1989)]; 및 문헌[J.D. Bain, CG. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, "Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide," J. Am. Chem. Soc. 111 8013-8014 (1989)]을 참조한다. 비천연 아미노산은 이용가능한 합성 펩티드 화학기법(또는 천연 아미노산이 이 방법에 의해 비천연 아미노산으로 전환될 수 있음) 또는 번역 후 가공에 의해 천연적으로 또는 합성적으로 제조된 단백질에 부가될 수도 있다. 그러나, 또한, 이러한 번역 후 수식 및 화학적 수식은 전형적으로 분자의 합성 과정 동안 하나 이상의 비천연 아미노산의 도입(예를 들어, 오르토고날 번역, 고체상 합성 등과 같은 직접적인 도입)과 함께 또는 더불어 수행됨을 인식할 것이다. 따라서, 아미노산의 번역 후 부가 또는 화학적 수식은 반드시는 아니지만 전형적으로 분자의 합성 과정 동안 부가된 비천연 아미노산을 이미 가진 분자에 대해서만 수행된다. 면역원 내로의 비천연 아미노산의 비오르토고날 도입에 대한 추가적 정보는 하기에 제시되어 있다.

알파-아미노산의 유전적 구조는 하기 화학식 I로 표시된다:

화학식 I

비천연 아미노산은 전형적으로 화학식 I로 표시되는 임의의 구조이고, 이때 R 기는 20종의 천연 아미노산에서 사용되는 치환기 이외의 임의의 치환기이다. 20종의 천연 아미노산의 구조에 대해서는 예를 들어, 문헌[Biochemistry by L. Stryer, 3^rd ed. 1988, Freeman and Company, New York]을 참조한다. 예를 들어, 면역학적 반응의 증강을 위해 사용되는 본 발명의 비천연 아미노산은 상기 20종의 알파-아미노산 이외의 자연 발생 화합물일 수 있음을 주목한다.

본원에서 사용된 비천연 아미노산은 전형적으로 측쇄에서 천연 아미노산과 상이하기 때문에 비천연 아미노산은 자연 발생 단백질에서 아미드 결합을 형성하는 방식과 동일한 방식으로 다른 아미노산, 예를 들어, 천연 또는 비천연 아미노산과 아미드 결합을 형성한다. 그러나, 비천연 아미노산은 이들을 천연 아미노산과 구별시켜주는 측쇄 기를 가진다.

비천연 아미노산에서, 예를 들어, 화학식 I에서 R은 경우에 따라 알킬-, 아릴-, 아실-, 히드라진, 시아노-, 할로-, 히드라지드, 알케닐, 에테르, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 에논, 이민, 에스테르, 히드록실아민, 아민 등, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 관심있는 다른 비천연 아미노산은 광활성화가능한 가교-링커, 스핀 표지된 아미노산, 형광 아미노산, 금속 결합 아미노산, 금속 함유 아미노산, 방사성 아미노산, 신규 작용기를 가진 아미노산, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 아미노산, 광케이징된(photocaged) 및/또는 광이성질체화된 아미노산, 바이오틴 또는 바이오틴-유사체 함유 아미노산, 케토 함유 아미노산, 글리코실화된 아미노산, 아미노산 측쇄에 부착된 사카라이드 부분, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 중원자 치환된 아미노산, 화학적으로 절단 가능한 또는 광절단 가능한 아미노산, 천연 아미노산에 비해 연장된 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어, 폴리에테르, 또는, 예를 들어, 약 5개 초과 또는 약 10개 초과의 탄소를 가진 장쇄 탄화수소 등), 탄소-연결된 당 함유 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산, 하나 이상의 독성 부분을 함유하는 아미노산을 포함하는 아미노산을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 IV로 표시되는 일반 구조를 가진 비천연 아미노산을 이용할 수 있다:

화학식 IV

이 구조를 가진 비천연 아미노산은 전형적으로 임의의 구조이고, 이때 R₁은 20종의 천연 아미노산 중 하나(예를 들어, 티로신 또는 페닐알라닌)에서 사용된 치환기이고, R₂는 R₂-R₁이 함께 20종의 정규 천연 아미노산 중 임의의 아미노산의 측쇄 이외의 것이 되도록 하는 치환기이다. 따라서, 이러한 종류의 비천연 아미노산은 천연 아미노산 유도체로서 간주될 수 있다.

비천연 아미노산은 경우에 따라 수식된 골격 구조, 예를 들어, 하기 화학식 II 및 III의 구조로 표시되는 골격 구조를 포함할 수도 있다:

화학식 II

화학식 III

상기 식에서,

Z는 전형적으로 OH, NH₂, SH, NH-R' 또는 S-R'를 포함하고;

X 및 Y는 동일하거나 상이할 수 있고 전형적으로 S 또는 O를 포함하고;

R 및 R'는 경우에 따라 동일하거나 상이하고 전형적으로 H 이외의 임의의 치환기이다(이때, R은 R'가 H인 경우 L 입체구조를 가짐). 예를 들어, 본원에서 비천연 아미노산은 경우에 따라 화학식 II 및 III으로 표시되는 아미노 또는 카르복실 기에서 치환을 포함할 수 있다. 이러한 종류의 비천연 아미노산은 예를 들어, 20종의 정규 천연 아미노산에 상응하는 측쇄 또는 비천연 측쇄를 가진 α-히드록시산, α-티오산, α-아미노티오카르복실레이트를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 또한, α-탄소에서의 치환은 경우에 따라 L, D 또는 α-α-이치환된 아미노산, 예컨대, D-글루타메이트, D-알라닌, D-메틸-O-티로신, 아미노부티르산 등을 포함한다. 다른 구조적 대안물은 환형 아미노산, 예컨대, 프롤린 유사체뿐만 아니라, 3, 4, 6, 7, 8 및 9원의 고리 프롤린 유사체, β 및 γ 아미노산, 예컨대, 치환된 β-알라닌 및 γ-아미노 부티르산을 포함한다.

일부 양태에서, 본 발명은 L-입체구조의 비천연 아미노산을 사용한다. 그러나, 본 발명이 L-입체구조의 비천연 아미노산의 사용으로 한정되는 것은 아니다. 이 비천연 아미노산들의 D-거울상이성질체도 본 발명에서 사용될 수 있음이 고려된다.

본 발명의 다양한 실시양태는 파라-치환된 티로신, 오르토-치환된 티로신 및 메타-치환된 티로신을 포함하는 티로신 유사체도 포함할 수 있고, 이때 상기 치환된 티로신은 알키닐 기, 아세틸 기, 벤조일 기, 아미노 기, 히드라진, 히드록시아민, 티올 기, 카르복시 기, 이소프로필 기, 메틸 기, C₆-C₂₀ 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소, 포화된 또는 불포화된 탄화수소, O-메틸 기, 폴리에테르 기, 니트로 기 등을 포함한다. 또한, 다중 치환된 아릴 고리도 고려된다. 본 발명의 글루타민 유사체는 α-히드록시 유도체, γ-치환된 유도체, 환형 유도체 및 아미드 치환된 글루타민 유도체를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 예시적 페닐알라닌 유사체는 파라-치환된 페닐알라닌, 오르토-치환된 페닐알라닌 및 메타-치환된 페닐알라닌을 포함하나 이들로 한정되지 않고, 이때 치환기는 알키닐 기, 히드록시 기, 메톡시 기, 메틸 기, 알릴 기, 알데히드 기, 니트로 기, 티올 기 또는 케토 기 등을 포함한다. 비천연 아미노산의 구체적인 예는 p-에틸티오카르보닐-L-페닐알라닌, p-(3-옥소부타노일)-L-페닐알라닌, 1,5-단실-알라닌, 7-아미노-쿠마린 아미노산, 7-히드록시-쿠마린 아미노산, 니트로벤질-세린, O-(2-니트로벤질)-L-티로신, p-카르복시메틸-L-페닐알라닌, p-시아노-L-페닐알라닌, m-시아노-L-페닐알라닌, 비페닐알라닌, 3-아미노-L-티로신, 비피리딜 알라닌, p-(2-아미노-1-히드록시에틸)-L-페닐알라닌, p-이소프로필티오카르보닐-L-페닐알라닌, 3-니트로-L-티로신 및 p-니트로-L-페닐알라닌을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 또한, p-프로파르길옥시페닐알라닌, 3,4-디히드록시-L-페닐알라닌(DHP), 3,4,6-트리히드록시-L-페닐알라닌, 3,4,5-트리히드록시-L-페닐알라닌, 4-니트로-페닐알라닌, p-아세틸-L-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 3-니트로-티로신, 3-티올-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcβ-세린, L-도파, 플루오르화된 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-요도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 및 이소프로필-L-페닐알라닌 등도 포함된다. 본 발명의 다양한 실시양태에서 포함될 수 있는 다른 비천연 아미노산은 예를 들어, p-니트로페닐알라닌; o-니트로페닐알라닌; m-니트로페닐알라닌; p-보로닐 Phe; o-보로닐 Phe; m-보로닐 Phe; p-아미노 Phe; o-아미노 Phe; m-아미노 Phe; p-아실 Phe; o-아실 Phe; m-아실 Phe; p-OMe Phe; o-OMe Phe; m-OMe Phe; p-설포 Phe; o-설포 Phe; m-설포 Phe; 5-니트로 His; 3-니트로 Tyr; 2-니트로 Tyr; 니트로 치환된 Leu; 니트로 치환된 His; 니트로 치환된 Ile; 니트로 치환된 Trp; 2-니트로 Trp; 4-니트로 Trp; 5-니트로 Trp; 6-니트로 Trp; 7-니트로 Trp; 3-아미노티로신; 2-아미노티로신; O-설포티로신; 2-설포옥시페닐알라닌; 3-설포옥시옥시페닐알라닌 또는 p-카르복시페닐알라닌; o-카르복시페닐알라닌; 및 m-카르복시페닐알라닌을 포함한다. 다른 실시양태는 지방족, 아릴 또는 헤테로환 치환된 보론산, p-보로노페닐알라닌, o-보로노페닐알라닌 또는 m-보로노페닐알라닌과 같은 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 본원의 다양한 실시양태에서, 비천연 면역원은 글리코실화, 니트로아릴 수식, 니트레이트화, 알킬화, 아세틸화, 산화, 설페이트화 또는 인산화된(예를 들어, 번역 후 수식 이외의 과정 또는 화학적 수식 이외의 과정에 의해 글리코실화, 니트로아릴 수식, 니트레이트화, 알킬화, 아세틸화, 산화, 설페이트화 또는 인산화) 20종의 정규 천연 아미노산 중 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 오르토고날 번역 시스템을 이용하여 도입할 수 있는 다양한 비천연 아미노산의 구조는 공지되어 있다. 본원에 전체가 참고로 각각 도입되어 있는, 본원에서 인용된 참고문헌을 참조한다.

비천연 아미노산의 화학적 합성

상기 제공된 비천연 아미노산 중 다수의 비천연 아미노산이 예를 들어, 시그마(미국 소재) 또는 알드리치(미국 위스콘신주 밀워키 소재)로부터 시판되고 있다. 시판되지 않는 비천연 아미노산은 경우에 따라 다양한 간행물에 기재된 바와 같이 합성하거나 당업자에게 공지된 표준 방법을 이용하여 합성한다. 유기 합성 기법의 경우, 예를 들어, 문헌[Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.)]; 문헌[Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)]; 및 문헌[Advanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)]을 참조한다. 비천연 아미노산의 합성을 기술하는 추가적 간행물은 예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO 2002/085923호(발명의 명칭: "In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids"); 문헌[Matsoukas et al., (1995) J. Med. Chem., 38:4660-4669]; 문헌[King and Kidd, (1949) "A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates," J. Chem. Soc, 4:3315-3319]; 문헌[Friedman, and Chatterrji (1959) "Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents," J. Am. Chem. Soc. 81:3750-3752]; 문헌[Craig et al., (1988) "Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline (Chloroquine)," J. Org. Chem. 53:1167-1170]; 문헌[Azoulay, et al., (1991) "Glutamine analogues as Potential Antimalarials," Eur. J. Med. Chem. 26:201-5]; 문헌[Koskinen and Rapoport (1989) "Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues,". J. Org. Chem. 54:1859-1866]; 문헌[Christie and Rapoport (1985) "Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization," J. Org. Chem. 1989:1859-1866]; 문헌[Barton, et al., (1987) "Synthesis of Novel a-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-a-Amino-Adipic Acids, L-a-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives," Tetrahedron Lett. 43:4297-4308]; 및 문헌[Subasinghe, et al., (1992) "Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site," J. Med. Chem. 35:4602-7]을 포함한다. 2003년 12월 22일자로 출원된 국제특허출원 공개 제WO 2004/058946호(발명의 명칭: "PROTEIN ARRAYS")도 참조한다.

비천연 아미노산의 세포내 흡수

세포에 의한 비천연 아미노산 흡수는 예를 들어, 유전적 코딩 오르토고날 쌍(셀렉터 코돈을 인식하는 O-tRNA를 충전하는 O-RS)을 통해 면역원 내로 도입하기 위한 비천연 아미노산을 디자인하고 선택할 때 전형적으로 고려되는 문제이다. 예를 들어, α-아미노산의 높은 충전 밀도는 흡수를 제한할 수 있다. 천연 아미노산은 다양한 정도의 아미노산 특이성을 종종 나타내는 일군의 단백질 기초 수송 시스템을 통해 세포 내로 흡수된다. 어떤 비천연 아미노산이 세포에 의해 흡수되는지를 평가하는 신속한 스크린을 수행할 수 있다. 예를 들어, 2003년 12월 22일자로 출원된 국제특허출원 공개 제WO 2004/058946호(발명의 명칭: "PROTEIN ARRAYS"); 및 문헌[Liu and Schultz (1999) "Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code," PNAS 96:4780-4785]에 기재된 독성 분석을 참조한다. 흡수가 다양한 분석으로 용이하게 분석되더라도, 세포내 흡수 경로에 순응할 수 있는 비천연 아미노산을 설계하기 위한 대안은 생체내에서 아미노산을 생성하는 생합성 경로를 제공하는 것이다.

비천연 아미노산의 생합성

아미노산 및 다른 화합물의 제조를 위한 많은 생합성 경로가 세포 내에 이미 존재한다. 특정 비천연 아미노산을 위한 생합성 방법이 천연적으로, 예를 들어, 세포 내에 존재하지 않을 수 있지만, 본 발명의 다양한 실시양태는 이러한 방법을 제공한다. 예를 들어, 경우에 따라 신규 효소를 첨가하거나 기존 숙주 세포 경로를 변경함으로써 숙주 세포 내에서 비천연 아미노산을 위한 생합성 경로를 발생시킨다. 첨가되는 신규 효소는 경우에 따라 자연 발생 효소 또는 인공적으로 진화된 효소이다. 예를 들어, p-아미노페닐알라닌의 생합성(상기 국제특허출원 공개 제WO 2002/085923호에서 제공됨)은 다른 유기체로부터의 공지된 효소들의 조합의 첨가에 의존한다. 이 효소들에 대한 유전자는 세포를 유전자 포함 플라스미드로 형질전환시켜 세포 내로 도입할 수 있다. 유전자는 세포 내에서 발현되는 경우 원하는 화합물을 합성하는 효소 경로를 제공한다. 경우에 따라 첨가되는 효소의 종류의 예는 예를 들어, 유전자은행(Genbank)에서 찾을 수 있다. 인공적으로 진화된 효소도 경우에 따라 동일한 방식으로 세포 내로 첨가된다. 이 방식에서, 세포의 세포내 기구 및 자원은 비천연 아미노산을 생성하도록 개조된다.

실제로, 생합성 경로에서 사용하기 위한 신규 효소의 생성, 기존 경로의 진화, 또는 시험관내 또는 생체내 비천연 아미노산의 생성을 위해 임의의 다양한 방법이 이용될 수 있다. 많은 이용가능한 효소 진화 방법 및 다른 생합성 경로 성분들을 본 발명에 적용하여 비천연 아미노산을 제조할(또는 합성 효소가 신규 기질 특이성 또는 관심있는 다른 활성을 가지도록 합성효소를 진화시킬) 수 있다. 예를 들어, 경우에 따라 DNA 셔플링(shuffling)을 이용하여 시험관내 또는 생체내에서 비천연 아미노산의 생성(또는 신규 합성효소의 생성)을 위한 신규 효소 및/또는 이러한 효소의 경로를 개발한다. 예를 들어, 문헌[Stemmer (1994) "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling," Nature 370(4):389-391]; 및 문헌[Stemmer (1994) "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751]을 참조한다. 관련된 방법은 원하는 특징을 가진 효소를 신속히 진화시키도록 관련된(예를 들어, 상동성) 유전자의 패밀리를 셔플링한다. 이러한 "패밀리 유전자 셔플링" 방법의 일례는 문헌[Crameri, et al., (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution" Nature, 391(6664): 288-291]에서 발견된다. 또한, (생합성 경로 성분들이든 아니면 합성효소든 관계없이) 신규 효소를 예를 들어, 문헌[Ostermeier, et al., (1999) "A combinatorial approach to hybrid enzymes independent of DNA homology" Nature Biotech 17:1205]에 기재된 바와 같이 "하이브리드 효소의 생성을 위한 점진적 말단절단(incremental truncation for the creation of hybrid enzymes)"("ITCHY")으로서 공지된 DNA 재조합 방법을 이용하여 생성할 수 있다. 또한, 이 방법은 하나 이상의 시험관내 또는 생체내 재조합 방법을 위한 기질로서 사용될 수 있는 효소 또는 다른 경로 변이체의 라이브러리의 발생을 위해 사용될 수 있다. 문헌[Ostermeier, et al., (1999) "Combinatorial Protein Engineering by Incremental Truncation," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3562-67]; 및 문헌[Ostermeier, et al., (1999), "Incremental Truncation as a Strategy in the Engineering of Novel Biocatalysts," Biological and Medicinal Chemistry, 7: 2139-44] 또한 참조한다. 본원에서 경우에 따라 사용된 또 다른 방법은 예를 들어, 비천연 아미노산(또는 신규 합성효소)의 제조와 관련된 생합성 반응을 촉진하는 능력에 대해 선별된 효소 또는 다른 경로 변이체의 라이브러리를 발생시키기 위한 기하급수적 총체적 돌연변이유발을 이용한다. 이 방법에서, 관심있는 서열 내의 작은 잔기 군을 동시에 무작위화하여 기능성 단백질을 생성하는 아미노산을 각각의 변경된 위치에서 확인한다. 비천연 아미노산(또는 신규 합성효소)의 생성을 위한 신규 효소를 제조하기 위해 본 발명에 적용될 수 있는 이 방법의 예는 문헌[Delegrave and Youvan (1993) Biotechnology Research 11:1548-1552]에서 발견된다. 또 다른 방법에서, 효소 및/또는 경로 성분들 개조를 위한 도핑된(doped) 또는 축퇴 올리고뉴클레오티드를 사용하는 무작위 또는 반무작위 돌연변이유발은 예를 들어, 문헌[Arkin and Youvan (1992) "Optimizing nucleotide mixtures to encode specific subsets of amino acids for semi-random mutagenesis" Biotechnology 10:297-300]; 또는 문헌[Reidhaar-Olson, et al., (1991) "Random mutagenesis of protein sequences using oligonucleotide cassettes," Methods Enzymol. 208:564-86]의 일반적인 돌연변이유발 방법을 이용함으로써 사용할 수 있다. 또 다른 방법에서, 폴리뉴클레오티드 재조립 및 부위 포화 돌연변이유발을 이용하는, 종종 "비확률적" 돌연변이유발로 지칭되는 또 다른 방법을 이용하여 효소 및/또는 경로 성분들을 생성할 수 있고, 상기 효소 및/또는 경로 성분들은 (예를 들어, 생체내에서 비천연 아미노산의 제조를 위한) 하나 이상의 합성효소 또는 생합성 경로 기능을 수행하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO 00/46344호(발명의 명칭: Short "NON-STOCHASTIC GENERATION OF GENETIC VACCINES AND ENZYMES")를 참조한다.

이러한 돌연변이유발 방법에 대한 대안은 유기체의 전체 게놈을 재조합하는 단계, 및 생성된 자손을 특정 경로 기능에 대해 선별하는 단계(종종 "전체 게놈 셔플링"으로서 지칭됨)를 포함한다. 이 방법은 예를 들어, 게놈 재조합 및 비천연 아미노산(또는 이의 중간체)을 생성하는 능력에 대한 유기체(예를 들어, 이. 콜라이 또는 다른 세포)의 선별을 통해 본 발명의 다양한 실시양태에 적용될 수 있다. 예를 들어, 하기 간행물에서 교시된 방법들은 생체내에서 비천연 아미노산을 생성하는 세포 내의 기존 경로 및/또는 신규 경로의 진화를 위한 경로 디자인에 적용될 수 있다(문헌[Patnaik, et al., (2002) "Genome shuffling of lactobacillus for improved acid tolerance" Nature Biotechnology, 20(7):707-712]; 및 문헌[Zhang, et al., (2002) "Genome shuffling leads to rapid phenotypic improvement in bacteria" Nature, February 7, 415(6872):644-646]).

예를 들어, 원하는 화합물의 제조를 위한 유기체 및 대사 경로 개조의 다른 기법도 이용가능하고 비천연 아미노산의 제조에 적용될 수도 있다. 유용한 경로 개조 방법을 교시하는 간행물의 예는 하기 문헌을 포함한다: 문헌[Nakamura and White (2003) "Metabolic engineering for the microbial production of 1,3 propanediol" Curr. Opin. Biotechnol. 14(5):454-9]; 문헌[Berry, et al., (2002) "Application of Metabolic Engineering to improve both the production and use of Biotech Indigo" J. Industrial Microbiology and Biotechnology 28:127-133]; 문헌[Banta, et al., (2002) "Optimizing an artificial metabolic pathway: Engineering the cofactor specificity of Corynebacterium 2,5-diketo-D-gluconic acid reductase for use in vitamin C biosynthesis" Biochemistry, 41(20):6226-36]; 문헌[Selivonova, et al., (2001) "Rapid Evolution of Novel Traits in Microorganisms" Applied and Environmental Microbiology, 67:3645] 등.

사용된 방법과 관계없이, 개조된 생합성 경로를 이용하여 제조한 비천연 아미노산은 효율적인 단백질 생합성에 충분한 농도, 예를 들어, 다른 세포내 아미노산의 농도에 유의하게 영향을 미치거나 세포내 자원을 고갈시키는 정도는 아니지만 천연 세포내 양으로 제조된다. 이 방식으로 생체내에서 제조된 전형적인 농도는 약 10 mM 내지 약 0.05 mM이다. 일단 세포가 특정 경로를 위해 바람직한 효소를 생성하도록 개조되고 비천연 아미노산이 생성되면, 경우에 따라 생체내 선별을 이용하여 리보좀 단백질 합성 및 세포 생장을 위한 비천연 아미노산의 제조를 더 최적화한다.

비천연 면역원

대상체 내에서 면역학적 반응을 일으키기 위해 본원에서 사용된 비천연 면역원은 전형적으로 대상체 내의 표적(예를 들어, 질환 관련) 부분 또는 대상체 내에 존재할 수 있는 표적 부분(예를 들어, 대상체를 감염시킬 수 있는 박테리아로부터 유래된 부분, 대상체 내에서 발생할 수 있는 종양으로부터 유래된 부분 등)의 "비천연" 버젼을 포함한다. 즉, 비천연 면역원은 경우에 따라 표적 부분 내의 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산으로 치환된 점을 제외하고 표적 부분과 동일한 아미노산 서열/구조를 포함한다(이에 대한 설명은 하기 실시예 단락을 참조함). 대안적으로 또는 추가로, 비천연 면역원은 하나 이상의 추가적인 비천연 아미노산 잔기와 함께 표적 부분과 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 비천연 면역원은 예를 들어, 10개 이상의 비천연 아미노산, 5 내지 10개의 비천연 아미노산, 5개 이하의 비천연 아미노산 또는 2개 이하의 비천연 아미노산 등을 포함할 수 있다. 비천연 면역원은 총 아미노산과 비교할 때 예를 들어, 10% 이상, 5 내지 10%, 5% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하의 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 인식될 바와 같이, 본원의 비천연 면역원은 다수의 상이한 비천연 아미노산들 중 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함할 수 있다.

본 발명의 비천연 면역원 내의 하나 이상의 비천연 아미노산의 위치는 반드시 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 따라서, 예를 들어, 비천연 아미노산은 면역원의 C 또는 N 말단에 존재할 수 있거나, 또는 비천연 아미노산은 면역원의 1차 아미노산 서열 내부의 임의의 위치에 존재할 수 있다. 하기 실시예 단락을 참조한다. 비천연 아미노산의 배치(및 특정 비천연 아미노산의 선택)는 경우에 따라 다수의 고려사항에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 비천연 아미노산의 위치/선택은 경우에 따라 면역원의 기원이 되는(면역원이 상응하는) 천연 표적 단백질 부분에 비해 면역원의 입체구조를 유의하게 변경시키지 않을 수 있다. 따라서, 생성된 비천연 면역원의 입체구조는 경우에 따라 항체 교차 반응이 일어나도록 상응하는 천연 표적 부분의 입체구조와 여전히 잘 일치할 수 있다. 따라서, 본원의 일부 실시양태에서, 특정 비천연 아미노산 및 이의 면역원 내에서의 특정 위치는 천연 표적 부분에 비해 면역원에 대한 구조적(예를 들어, 3차/4차) 변화를 최소화하도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비천연 아미노산의 선택 및 그의 배치의 선택은 이러한 선택/배치가 감염성, 세포독성 등을 감소시킴에 있어서 도움이 될 것인지에 의해 영향을 받을 수도 있다. 면역원 내로 도입된 비천연 아미노산은 경우에 따라 이들이 치환시키는 천연 아미노산과 구조적으로 구별될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 특정 비천연 아미노산은 표적 부분 내의 천연 아미노산에 대한 비보존적 대안이다. 표적 부분 내의 Lys 잔기가 비천연 면역원 내의 pNO₂Phe으로 치환되어 있는 하기 실시예를 참조한다. 다른 실시양태에서, 비천연 아미노산은 천연 아미노산의 보존적 대안이다. 또한, 면역원 내의 비천연 아미노산의 위치는 항체 접근가능성 및/또는 혈청 항체, B 세포 및/또는 T 세포 반응을 발생시키는 그의 능력에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서, 본 발명의 다양한 비천연 면역원에서 비천연 아미노산은 항체의 접근이 가능할 수 있고, 예를 들어, 표면에 노출될 수 있다.

다양한 실시양태에서, 비천연 아미노산은 임의의 비천연 아미노산일 수 있다. 상기와 더불어, 비천연 아미노산이 20종의 단백질생성 알파-아미노산 이외의 자연 발생 화합물일 수 있지만, 본 발명에서 사용될 수 있는 비천연 아미노산은 이들을 천연 아미노산으로부터 구별시켜주는 측쇄 기를 가진다. 본 발명에서 사용될 수 있는 비천연 아미노산은 O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcb-세린, L-도파, 플루오르화된 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-요오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, 티로신 아미노산의 비천연 유사체; 글루타민 아미노산의 비천연 유사체; 페닐알라닌 아미노산의 비천연 유사체; 세린 아미노산의 비천연 유사체; 트레오닌 아미노산의 비천연 유사체; 알킬, 아릴, 아실, 아지도, 시아노, 할로, 히드라진, 히드라지드, 히드록실, 알케닐, 알키닐, 에테르, 티올, 설포닐, 셀레노, 에스테르, 티오산, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 헤테로환, 에논, 이민, 알데히드, 히드록실아민, 케토 또는 아미노 치환된 아미노산, 또는 이들의 임의의 조합물; 광활성화가능한 가교-링커를 가진 아미노산; 스핀 표지된 아미노산; 형광 아미노산; 신규 작용기를 가진 아미노산; 또 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 아미노산; 금속 결합 아미노산; 금속 함유 아미노산; 방사성 아미노산; 광케이징된 및/또는 광이성질체화가능한 아미노산; 바이오틴 또는 바이오틴-유사체 함유 아미노산; 글리코실화된 또는 탄수화물 수식된 아미노산; 케토 함유 아미노산; 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산; 중원자 치환된 아미노산; 화학적으로 절단 가능한 또는 광절단 가능한 아미노산; 연장된 측쇄를 가진 아미노산; 독성 기를 함유하는 아미노산; 당 치환된 아미노산, 예를 들어, 당 치환된 세린 등; 탄소 결합된 당 함유 아미노산; 산화환원 활성 아미노산; a-히드록시 함유 아미노산; 아미노 티오산 함유 아미노산; a,a-이치환된 아미노산; b-아미노산; 및 프롤린을 제외한 환형 아미노산을 포함할 수 있다.

다양한 실시양태에서, 본원의 비천연 면역원, 예를 들어, 비천연 TNFα는 하기 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다: p-니트로페닐알라닌; o-니트로페닐알라닌; m-니트로페닐알라닌; p-보로닐 Phe; o-보로닐 Phe; m-보로닐 Phe; p-아미노 Phe; o-아미노 Phe; m-아미노 Phe; p-아실 Phe; o-아실 Phe; m-아실 Phe; p-OMe Phe; o-OMe Phe; m-OMe Phe; p-설포 Phe; o-설포 Phe; m-설포 Phe; 5-니트로 His; 3-니트로 Tyr; 2-니트로 Tyr; 니트로 치환된 Leu; 니트로 치환된 His; 니트로 치환된 Ile; 니트로 치환된 Trp; 2-니트로 Trp; 4-니트로 Trp; 5-니트로 Trp; 6-니트로 Trp; 7-니트로 Trp; 3-아미노티로신; 2-아미노티로신; O-설포티로신; 2-설포옥시페닐알라닌; 3-설포옥시옥시페닐알라닌 또는 p-카르복시페닐알라닌; o-카르복시페닐알라닌; 및 m-카르복시페닐알라닌. 또한, 특정 비천연 아미노산의 언급은 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되고 다른 비천연 아미노산, 예를 들어, 여기서 언급된 비천연 아미노산도 본 발명에서 사용될 수 있음을 인식할 것이다.

당업자는 예를 들어, 단백질 결정학, NMR 등의 이용을 통해 단백질 형태/입체구조의 확인 및 특정 폴리펩티드 내로의 비천연 아미노산의 도입의 효과(존재하는 경우) 측정을 용이하게 알 것이다. 비천연 면역원의 생성 및 이러한 면역원의 입체구조 및 항체 접근가능성 측정의 예는 하기 실시예에 기재되어 있다. 이러한 측정은 경우에 따라 비천연 면역원 내의 특정 비천연 아미노산의 선택 및/또는 배치에 있어서 도움이 될 수 있다.

본 발명의 비천연 면역원은 다수의 표적 부분에 기초할 수 있고 폴리펩티드/단백질뿐만 아니라 탄수화물, 지질, 햅텐 및/또는 다른 비단백질성 분자와 관련된 폴리펩티드/단백질도 포함할 수 있다. 본 발명의 면역원은 본원에 기재된 표적(예를 들어, 질환 관련) 부분들 중 임의의 표적 부분을 포함할 수 있으나 이로 한정되지 않는다.

본원에 기재된 유용한 실시양태의 한 부류에서, 비천연 면역원은 비천연 TNFα를 포함하고 고도의 면역원성(E. Keinan, Ed. Catalytic Antibodies (Wiley-VCH, Weinheim, 2005) pp. 1-28), 구조적 보존성 및 항체 접근가능성을 가진 p-니트로페닐알라닌(pNO₂Phe, 도 1a), 예를 들어, pNO₂Phe⁸⁶-TNFα, pNO₂Phe¹¹-mTNFα, pNO₂Phe¹⁹-mTNFα, pNO₂Phe²¹-mTNFα, pNO₂Phe⁴²-mTNFα, pNO₂Phe⁴⁹-mTNFα, pNO₂Phe¹⁰⁴-mTNFα, 또는 pNO₂Phe¹¹³-mTNFα를 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 치환 돌연변이는 비천연 mTNFα가 천연 mTNFα의 3차 단백질 구조 및 4차 단백질 구조와 실질적으로 유사한 3차 단백질 구조 및 4차 단백질 구조를 유지할 수 있게 함으로써 비천연 mTNFα에 대해 생성된 중화 항체가 wt mTNFα 상의 상응하는 에피토프와 교차 반응할 수 있는 가능성을 증가시킨다. 본원의 임의의 부분에서 상세히 설명되어 있는 바와 같이, 비천연 아미노산의 치환 및/또는 부가는 경우에 따라 내재 mTNFα와 비교할 때 비천연 mTNFα의 입체구조를 변경(또는 유의하게 변경)시키지 않는다. 인간 대상체에서 치유적 및/또는 예방적 치료에서 사용될 수 있는 비천연 hTNFα는 pNO₂Phe¹¹-hTNFα, pNO₂Phe¹⁹-hTNFα, pNO₂Phe²¹-hTNFα, pNO₂Phe⁴²-hTNFα, pNO₂Phe⁴⁹-hTNFα, pNO₂Phe⁸⁷-hTNFα, pNO₂Phe¹⁰⁵-hTNFα, 또는 pNO₂Phe¹¹⁴-hTNFα를 포함한다.

일반적으로, TNFα의 상승된 혈청 농도는 다양한 질환 상태와 관련되어 있다. 그러나, 면역학적 반응이 일어나는 대상체 및/또는 예방적 치료를 받아야 하는 대상체 등은 질환 상태를 나타내는 혈청 TNFα 수준을 보이지 않을 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 및/또는 비천연 면역원이 TNFα 관련 질환을 나타내는 개체 및 나타내지 않는 개체 둘 다에게 투여될 수 있음을 인식해야 한다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 비천연 면역원은 예를 들어, RBP4 관련 질환 상태의 치료 및/또는 예방을 위해 비천연 RBP4를 포함할 수 있다. 임의의 천연 RBP4는 하나 이상의 비천연 아미노산으로 치환되어 비천연 RBP4를 생성할 수 있다. 인식될 바와 같이, TNFα 또는 임의의 다른 표적 부분의 경우, 치환은 천연 아미노산을 구조적 보존성을 나타내는 비천연 아미노산으로 치환시킬 필요는 없다(그러나, 치환시킬 수 있음). 대안적으로 또는 부가적으로, (RBP4의 천연 아미노산을 치환시키는 것보다는) 하나 이상의 추가적인 비천연 아미노산을 RBP4 폴리펩티드에 부가하여 비천연 RBP4를 생성할 수 있다. 비천연 TNFα 면역원에 대해 전술된 바와 같이, 본원의 임의의 다른 면역원 구축의 경우, 비천연 RBP4는 경우에 따라 천연 RBP4와 실질적으로 유사한 구조를 포함함으로써 비천연 RBP4에 대해 생성된 중화 항체가 천연 RBP4 상의 상응하는 에피토프(표적 RBP4 내의 상기 에피토프가 비천연 아미노산을 가진 비천연 RBP4 내의 에피토프에 상응하든지 아니면 상응하지 않든지 관계없이)와 교차 반응할 수 있는 가능성을 증가시킨다. 물론, 여기서도 표적 부분 내의 천연 아미노산의 치환을 위해 사용되는 비천연 면역원 내의 임의의 비천연 아미노산은 보존적 치환일 필요는 없다. 하기 실시예를 참조한다. 대상체에서 치유적 및/또는 예방적 치료에서 사용될 수 있는 비천연 RBP4는 pNO₂Phe⁴³ mRBP4 및 pNO₂Phe¹⁰⁸ mRBP4뿐만 아니라 이들의 상응하는 인간 대응물도 포함한다.

비천연 면역원의 제조

인식될 바와 같이, 본 발명의 비천연 면역원은 다양한 방법, 전형적으로 직접적인 도입 방법을 통해 구축될 수 있다. 따라서, 본원의 상세한 설명 및 실시예는 주로 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하기 위한 오르토고날 번역 시스템의 사용에 초점을 맞추지만, 경우에 따라 다른 방법을 이용하여, 예를 들어, 면역원이 상응하는 표적 부분에 대한 면역학적 반응의 발생을 위해 대상체에 투여되는 비천연 면역원을 제조할 수 있거나 대상체에 투여되어 예를 들어, 표적 부분을 중화시키는 교차 반응성 항체의 생성을 위해 사용되는 비천연 면역원을 제조할 수도 있다. 많은 실시양태에서, 비천연 아미노산은 분자가 합성된 후 분자 내의 천연 아미노산의 번역 후 수식 또는 화학적 수식(이러한 방법이 경우에 따라 직접적인 도입 방법과 함께 또는 더불어 이용될 수 있지만)을 통해 비천연 면역원에 부가되기 보다는 면역원의 구축 과정 동안 (예를 들어, 오르토고날 번역, 시험관내 합성 또는 화학적 합성 방법 등을 통한 면역원의 구축 과정 동안) 비천연 면역원에 부가된다. 따라서, 비천연 아미노산을 포함하는 분자를 구축하는 구체적인 방법, 예를 들어, 오르토고날 번역이 본원에 상세히 기재되어 있지만, 이 방법은 반드시 본 발명을 제한하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 비번역 후 수식 및 비화학적 수식을 포함하는, 비천연 아미노산을 가진 분자를 구축하는 다른 방법도 본원의 많은 실시양태에 포함된다.

일부 실시양태에서, (예를 들어, 본원에 기재되고 언급된 것들과 같은 오르토고날 번역 시스템을 통한) 면역원 내로의 비천연 아미노산의 유전적 도입이 고체상 펩티드 합성 또는 다른 유사한 시험관내 방법을 통한 비천연 면역원의 생성에 비해 이점을 제공할 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 생체내에서 면역원 내로의 비천연 아미노산의 유전적 도입은 비천연 면역원을 합성하기 위해 살아있는 세포의 생합성 기구를 이용한다. 이러한 생체내 제조는 본래의 (천연) 표적 부분과 유사하지만 비천연 아미노산을 통해 도입된 부가된 활성기/작용기를 가진 정확한 기능성 면역원(또는 임의의 다른 부분)을 제조할 수 있다. 따라서, 이것은 본래의 (천연) 표적 부분 또는 야생형 부분과 교차 반응하는 강력한 면역 반응의 발생을 돕는다. 나아가, 비천연 아미노산의 생체내 도입의 신규 생물공학적 수단의 사용은 낮은 비용에서 고수율로 적절한 천연 입체구조의(즉, 상응하는 표적 부분의 입체구조와 유사하거나 동일한) 면역원을 제조함에 있어서 도움이 될 수 있다. 일부 실시양태에서, 고체상 펩티드 합성과 같은 다른 시험관내 방법을 이용한, 비천연 아미노산을 가진 단백질의 총 합성은 보다 짧은 분자(예를 들어, 약 60 내지 100개 아미노산)에 대해 더 표적화될 수 있고 경우에 따라 서로 결찰될 수 있는 변성된 단백질을 보다 낮은 수율로 제조할 수 있다.

오르토고날 tRNA / 아미노아실 - tRNA 합성효소 기술

본원에서 설명되어 있는 바와 같이, 천연 표적 부분(대상체에 대한 자가 부분 또는 외래 부분)에 대한 면역학적 반응을 일으키기 위해 본 발명에서 사용되는 비천연 면역원은 전형적으로 오르토고날 tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 시스템을 통해 구축된다. 따라서, 본 발명의 신규 조성물 및 방법의 이해는 오르토고날 tRNA 및 오르토고날 아미노아실-tRNA 합성효소 쌍과 관련된 활성의 이해를 통해 더 발전된다. 일반적으로, 비천연 아미노산을 유전적 코드에 부가하기 위해, 숙주 번역 기구에서 효율적으로 기능할 수 있되 해당 번역 시스템에 대해 "오르토고날"한 아미노아실-tRNA 합성효소 및 적절한 tRNA를 포함하는 신규 오르토고날 쌍이 필요하다. 따라서, 오르토고날 부분은 번역 시스템에 대한 내재 합성효소 및 tRNA와 무관하게 작용한다. 오르토고날 쌍의 원하는 특징은 임의의 내재 tRNA에 의해 해독되지 않는 특정 코돈, 예컨대, 셀렉터 코돈, 예를 들어, 앰버 정지 코돈만을 해독하거나 인식하는 tRNA, 및 그의 동족체 tRNA를 하나의 특정 비천연 아미노산으로만 우선적으로 아미노아실화시키거나 "충전하는" 아미노아실-tRNA 합성효소를 포함한다. 또한, O-tRNA는 전형적으로 내재 합성효소에 의해 아미노아실화되지 않거나 약하게 아미노아실화, 즉 충전된다. 예를 들어, 이. 콜라이 숙주 시스템에서, 오르토고날 쌍은 이. 콜라이에 내재하는 40종의 내재 tRNA 중 임의의 tRNA와 교차 반응하지 않는 아미노아실-tRNA 합성효소, 및 이. 콜라이에 내재하는 21종의 내재 합성효소 중 임의의 합성효소에 의해 아미노아실화되지 않는 오르토고날 tRNA를 포함할 것이다.

본 발명에서 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질의 제조에 적합한 오르토고날 번역 시스템의 일반적 원리는 오르토고날 번역 시스템의 일반적 제조 방법이 있기 때문에 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO 2002/086075호(발명의 명칭: "METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS"); 제WO 2002/085923호(발명의 명칭: "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS"); 국제특허출원 공개 제WO 2004/094593호(발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE"); 국제특허출원 공개 제WO 2005/019415호(출원일: 2004년 7월 7일); 국제특허출원 공개 제WO 2005/007870호(출원일: 2004년 7월 7일); 제WO 2005/007624호(출원일: 2004년 7월 7일); 국제특허출원 공개 제WO 2006/110182호(출원일: 2005년 10월 27일; 발명의 명칭: "ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS"); 및 국제특허출원 공개 제WO 2007/103490호(출원일: 2007년 3월 7일; 발명의 명칭: "SYSTEMS FOR THE EXPRESSION OF ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS IN EUBACTERIAL HOST CELLS")를 참조한다. 또한, 예를 들어, 문헌[Liu, et al., (2007) "Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells" Nat Methods 4:239-244]; 국제특허출원 제PCT/US2008/081868호(출원일: 2008년 10월 30일; 발명의 명칭: "A Genetically Encoded Boronate Amino Acid"); 국제특허출원 공개 제WO 2007/047301호(출원일: 2006년 10월 11일; 발명의 명칭: "Selective Posttranslational Modification of Phage-Displayed Polypeptides"); 및 국제특허출원 공개 제WO 2006/110182호(출원일: 2005년 10월 27일; 발명의 명칭: "Orthogonal Translation Components for the In vivo Incorporation of Unnatural Amino Acids")를 참조한다. 이러한 출원들 각각은 전체가 본원에 참고로 도입된다. 비천연 아미노산을 도입하는 오르토고날 번역 시스템, 및 이의 제조 및 사용 방법에 대한 논의는 문헌[Wang and Schultz, (2005) "Expanding the Genetic Code" Angewandte Chemie Int Ed 44:34-66]; 문헌[Xie and Schultz, (2005) "An Expanding Genetic Code" Methods 36:227-238]; 문헌[Xie and Schultz, (2005) "Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire" Curr Opinion in Chemical Biology 9:548-554]; 문헌[Wang, et al., (2006) "Expanding the Genetic Code" Annu Rev Biophys Biomol Struct 35:225-249]; 문헌[Deiters, et al., (2005) "In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Escherichia coli" Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15:1521-1524]; 문헌[Chin, et al., (2002) "Addition of p-Azido-L-Phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli" J Am Chem Soc 124:9026-9027]; 및 국제특허출원 공개 제WO 2006/034332호(출원일: 2005년 9월 20일) 또한 참조한다. 이러한 문헌들 각각의 내용은 전체가 참고로 도입된다. 오르토고날 번역 시스템에 대한 추가적 상세한 설명은 미국 특허 제7,045,337호; 제7,083,970호; 제7,238,510호; 제7,129,333호; 제7,262,040호; 제7,183,082호; 제7,199,222호; 및 제7,217,809호에서 찾을 수 있다.

상기와 더불어, 본원에서 사용된 바와 같이, 비천연 아미노산(그러나 구축된)은 셀레노시스테인 및/또는 피롤라이신 및 20종의 유전적으로 코딩된 알파-아미노산을 제외한 임의의 아미노산, 수식된 아미노산 또는 아미노산 유사체를 의미한다. 상기 20종의 천연 아미노산의 구조에 대해서는 예를 들어, 문헌[Biochemistry by L. Stryer, 3rd ed. 1988, Freeman and Company, New York]을 참조한다. 다양한 실시양태에서, 비천연 아미노산은 임의의 면역원성 아미노산(예를 들어, 정규 아미노산의 면역원성 유사체)이다. 비천연 아미노산은 20종의 단백질생성 알파-아미노산 이외의 자연 발생 화합물일 수 있지만 본 발명의 비천연 아미노산은 이들을 천연 아민노산으로부터 구별시켜주는 측쇄 기를 가진다. 본 발명의 면역원에서 사용될 수 있는 비천연 아미노산의 비제한적 예는 O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcb-세린, L-도파, 플루오르화된 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-요오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, 티로신 아미노산의 비천연 유사체; 글루타민 아미노산의 비천연 유사체; 페닐알라닌 아미노산의 비천연 유사체; 세린 아미노산의 비천연 유사체; 트레오닌 아미노산의 비천연 유사체; 알킬, 아릴, 아실, 아지도, 시아노, 할로, 히드라진, 히드라지드, 히드록실, 알케닐, 알키닐, 에테르, 티올, 설포닐, 셀레노, 에스테르, 티오산, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 헤테로환, 에논, 이민, 알데히드, 히드록실아민, 케토 또는 아미노 치환된 아미노산, 또는 이들의 임의의 조합물; 광활성화가능한 가교-링커를 가진 아미노산; 스핀 표지된 아미노산; 형광 아미노산; 신규 작용기를 가진 아미노산; 또 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 아미노산; 금속 결합 아미노산; 금속 함유 아미노산; 방사성 아미노산; 광케이징된 및/또는 광이성질체화가능한 아미노산; 바이오틴 또는 바이오틴-유사체 함유 아미노산; 글리코실화된 또는 탄수화물 수식된 아미노산; 케토 함유 아미노산; 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산; 중원자 치환된 아미노산; 화학적으로 절단 가능한 또는 광절단 가능한 아미노산; 연장된 측쇄를 가진 아미노산; 독성 기를 함유하는 아미노산; 당 치환된 아미노산, 예를 들어, 당 치환된 세린 등; 탄소 결합된 당 함유 아미노산; 산화환원 활성 아미노산; a-히드록시 함유 아미노산; 아미노 티오산 함유 아미노산; a,a-이치환된 아미노산; b-아미노산; 및 프롤린을 제외한 환형 아미노산을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원의 비천연 면역원, 예컨대, 비천연 TNFα 또는 임의의 다른 비천연 면역원은 하기 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다: p-니트로페닐알라닌; o-니트로페닐알라닌; m-니트로페닐알라닌; p-보로닐 Phe; o-보로닐 Phe; m-보로닐 Phe; p-아미노 Phe; o-아미노 Phe; m-아미노 Phe; p-아실 Phe; o-아실 Phe; m-아실 Phe; p-OMe Phe; o-OMe Phe; m-OMe Phe; p-설포 Phe; o-설포 Phe; m-설포 Phe; 5-니트로 His; 3-니트로 Tyr; 2-니트로 Tyr; 니트로 치환된 Leu; 니트로 치환된 His; 니트로 치환된 Ile; 니트로 치환된 Trp; 2-니트로 Trp; 4-니트로 Trp; 5-니트로 Trp; 6-니트로 Trp; 7-니트로 Trp; 3-아미노티로신; 2-아미노티로신; O-설포티로신; 2-설포옥시페닐알라닌; 3-설포옥시옥시페닐알라닌 또는 p-카르복시페닐알라닌; o-카르복시페닐알라닌; 및 m-카르복시페닐알라닌. 또한, 특정 비천연 아미노산의 언급은 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되고 다른 비천연 아미노산(다른 면역원성 비천연 아미노산)도 본 발명에서 사용될 수 있음을 인식할 것이다.

오르토고날 번역 시스템

오르토고날 번역 시스템은 일반적으로 오르토고날 tRNA(O-tRNA), 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS) 및 비천연 아미노산, 예를 들어, 파라-니트로페닐알라닌(pNO₂Phe), 파라-카르복시페닐알라닌, 설포티로신 등(상기 참조)을 포함하는 세포, 예를 들어, 이. 콜라이와 같은 원핵 세포를 포함하고, 이때 상기 O-RS는 O-tRNA를 비천연 아미노산으로 아미노아실화한다. 오르토고날 쌍은 O-tRNA, 예를 들어, 억제자 tRNA, 프레임쉬프트(frameshift) tRNA 등, 및 동족체 O-RS를 포함할 수 있다. 전형적으로 O-tRNA/O-RS 쌍을 포함하는, 본원의 비천연 단백질의 제조에서 사용될 수 있는 오르토고날 시스템은 세포 또는 세포 무함유 환경을 포함할 수 있다.

일반적으로, 오르토고날 쌍이 셀렉터 코돈을 인식하고 셀렉터 코돈에 대해 반응하여 아미노산을 충전하는 경우, 상기 오르토고날 쌍은 상기 셀렉터 코돈을 "억제한다"고 기재된다. 즉, 번역 시스템, 예를 들어, 이. 콜라이 세포의 내재 기구에 의해 인식되지 않는 셀렉터 코돈은 통상적으로 충전되지 않고, 이는 핵산으로부터 번역될 폴리펩티드의 생성을 차단시킨다. 오르토고날 번역 시스템에서, O-RS는 O-tRNA를 특정 비천연 아미노산, 예를 들어, 본원의 실시예에서 사용된 바와 같은 파라-니트로페닐알라닌(pNO₂Phe)으로 아미노아실화한다. 충전된 O-tRNA는 셀렉터 코돈을 인식하고 셀렉터 코돈에 의해 야기된 번역 차단을 억제한다.

번역 시스템, 예를 들어, 이. 콜라이 세포는 관심있는 폴리펩티드(예컨대, 대상체 내에 존재하거나 대상체 내에 존재할 수 있는 표적 부분에 상응하는 비천연 면역원 등)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 통해 비천연 아미노산을 성장하는 폴리펩티드 쇄 내로 도입하기 위해 O-tRNA/O-RS 쌍을 사용하고, 이때 상기 폴리뉴클레오티드는 O-tRNA에 의해 인식되는 셀렉터 코돈을 포함한다. 일부 시스템에서, 상기 세포는 하나 이상의 추가적 O-tRNA/O-RS 쌍을 포함할 수 있고, 이때 추가적 O-tRNA는 추가적 O-RS에 의해 상이한 비천연 아미노산으로 충전된다. 예를 들어, O-tRNA 중 하나는 4-염기 코돈을 인식할 수 있고, 다른 O-tRNA는 정지 코돈을 인식할 수 있다. 대안적으로, 다수의 상이한 정지 코돈, 다수의 상이한 4-염기 코돈, 다수의 상이한 희귀 코돈 및/또는 다수의 상이한 비코딩 코돈이 동일한 코딩 핵산에서 사용될 수 있다. 따라서, 단일 폴리펩티드, 예를 들어, 비천연 면역원은 다수의 비천연 아미노산을 포함할 수 있고/있거나, 이 시스템에서 생성된 상이한 폴리펩티드는 상이한 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 이용가능한 O-RS/O-tRNA 동족체 쌍 및 이의 용도에 대한 추가적 세부설명은 예를 들어, 본원의 임의의 부분에서 언급된 참고문헌을 참조한다.

따라서, 일부 번역 시스템은 하나 초과의 비천연 아미노산이 폴리펩티드 내로 도입될 수 있게 하는 다수의 O-tRNA/O-RS 쌍을 포함할 수 있다. 예를 들어, 번역 시스템은 추가적 상이한 O-tRNA/O-RS 쌍 및 제2 비천연 아미노산을 추가로 포함할 수 있고, 이때 상기 추가적 O-tRNA는 제2 셀렉터 코돈을 인식하고, 상기 추가적 O-RS는 상기 O-tRNA를 상기 제2 비천연 아미노산으로 우선적으로 아미노아실화한다. 예를 들어, O-tRNA/O-RS 쌍을 포함하는 세포(이때, O-tRNA는 예를 들어, 앰버 셀렉터 코돈을 인식함)는 제2 오르토고날 쌍을 추가로 포함할 수 있고, 이때 제2 O-tRNA는 상이한 셀렉터 코돈, 예를 들어, 오팔 코돈, 오커 코돈, 4-염기 코돈, 희귀 코돈, 비코딩 코돈 등을 인식한다. 일부 실시양태에서, 상이한 오르토고날 쌍은 상이한 공급원으로부터 유래되고 상이한 셀렉터 코돈의 인식을 촉진할 수 있다.

일부 번역 시스템은 오르토고날 tRNA(O-tRNA), 오르토고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS), 비천연 아미노산, 및 관심있는 폴리펩티드, 예를 들어, 대상체의 자가 단백질 표적에 상응하는 비천연 면역원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 포함하는 세포, 예컨대, 이. 콜라이 세포를 포함할 수 있고, 이때 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 O-tRNA에 의해 인식되는 셀렉터 코돈을 포함한다. 오르토고날 번역 시스템이 배양된 세포를 사용하여 비천연 아미노산을 가진 단백질을 생성할 수 있지만, 본원에서 사용된 오르토고날 번역 시스템은 온전한 생존 세포를 필요로 하는 것은 아니다. 예를 들어, 오르토고날 번역 시스템은 세포 추출물의 존재 하에 세포 무함유 시스템을 사용할 수 있다. 실제로, 단백질 제조를 위한 세포 무함유 시험관내 전사/번역 시스템의 사용은 잘 확립된 기법이다. 이 시험관내 시스템을 적용하여, 본원에 기재된 오르토고날 번역 시스템 성분들을 사용하여 비천연 아미노산을 가진 단백질을 제조하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다.

O-tRNA 및/또는 O-RS는 천연적으로 발생된 것일 수 있거나, 또는, 예를 들어, 임의의 다양한 유기체로부터 유래된 자연 발생 tRNA 및/또는 RS의 돌연변이, 예를 들어, tRNA의 라이브러리 및/또는 RS의 라이브러리를 발생시키고/시키거나 임의의 다양한 이용가능한 돌연변이 기법을 사용함으로써 유도할 수 있다. 예를 들어, 오르토고날 tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 쌍의 제조를 위한 한 기법은 tRNA/합성효소 쌍이 사용될 번역 시스템 이외에 공급원 또는 다수의 공급원으로부터 유래된, 상기 오르토고날 tRNA/아미노아실-합성효소 쌍이 작용할 시스템에 대한 이종성을 나타내는 tRNA/합성효소 쌍을 이입하는 단계를 포함한다. 이종 합성효소 후보물질의 성질은 예를 들어, 상기 합성효소가 임의의 숙주 세포 tRNA를 충전하지 않는 성질을 포함하고, 이종 tRNA 후보물질의 성질은 예를 들어, 임의의 숙주 세포 합성효소에 의해 아미노아실화되지 않는 성질을 포함한다. 또한, 이종 tRNA는 모든 숙주 세포 합성효소에 대해 오르토고날하다. 오르토고날 쌍을 발생시키는 제2 기법은 O-tRNA 또는 O-RS의 스크리닝 및/또는 선별을 위해 사용되는 돌연변이체 라이브러리를 발생시키는 단계를 포함한다. 이러한 기법들은 조합될 수도 있다.

오르토고날 tRNA(O-tRNA)

오르토고날 tRNA(O-tRNA)는 바람직하게는, 예를 들어, 생체내 또는 시험관내에서 O-tRNA에 의해 인식되는 셀렉터 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드 내로의 비천연 아미노산의 도입을 매개한다.

따라서, O-tRNA를 포함하는 조성물은 오르토고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 추가로 포함할 수 있고, 이때 상기 O-RS는 O-tRNA를 비천연 아미노산으로 우선적으로 아미노아실화한다. O-tRNA를 포함하는 이러한 조성물은 번역 시스템, 예를 들어, 시험관내 또는 생체내 번역 시스템을 추가로 포함할 수 있다. 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산(이때, 상기 폴리뉴클레오티드는 O-tRNA에 의해 인식되는 셀렉터 코돈을 포함함) 또는 이들의 하나 이상의 조합물도 세포 내에 존재할 수 있다.

재조합 오르토고날 tRNA의 제조 방법, 및 셀렉터 코돈에 반응하여 비천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 도입하는 것에 대한 상기 tRNA의 효율을 스크리닝하는 방법은 예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO 2002/086075호(발명의 명칭: "METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS"); 국제특허출원 공개 제WO 2004/094593호(발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE"); 및 국제특허출원 공개 제WO 2005/019415호(출원일: 2004년 7월 7일)에서 찾을 수 있다. 또한, 문헌[Forster, et al., (2003) "Programming peptidomimetic synthetases by translating genetic codes designed de novo" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:6353-6357]; 및 문헌[Feng, et al., (2003) "Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:5676-5681]을 참조한다. 추가적 세부설명은 미국 특허 제7,045,337호, 제7,083,970호, 제7,238,510호, 제7,129,333호, 제7,262,040호, 제7,183,082호, 제7,199,222호 및 제7,217,809호에서 찾을 수 있다.

오르토고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)

본원에서 사용된 바와 같이 비천연 폴리펩티드의 제조에서 사용되는 시스템의 O-RS는 시험관내 또는 생체내에서 O-tRNA를 비천연 아미노산으로 우선적으로 아미노아실화한다. O-RS는 O-RS를 포함하는 폴리펩티드, 및/또는 O-RS 또는 이의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 번역 시스템, 예를 들어, 이. 콜라이 세포에 제공될 수 있다.

O-RS의 제조, O-RS의 아미노아실화 효율의 분석, 및/또는 O-RS의 기질 특이성의 변경에 대한 일반적인 세부설명은 국제특허출원 공개 제WO 2002/086075호(발명의 명칭: "METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS"); 및 국제특허출원 공개 제WO 2004/094593호(발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE")에서 찾을 수 있다. 또한, 문헌[Wang and Schultz "Expanding the Genetic Code," Angewandte Chemie Int Ed 44:34-66 (2005)]; 및 문헌[Hoben and Soll (1985) Methods Enzymol 113:55-59]도 참조한다(상기 문헌들의 내용은 전체가 본원에 참고로 도입됨). 이러한 시스템에 관한 추가적 세부설명은 미국 특허 제7,045,337호, 제7,083,970호, 제7,238,510호, 제7,129,333호, 제7,262,040호, 제7,183,082호, 제7,199,222호 및 제7,217,809호에서 찾을 수 있다.

공급원 및 숙주 유기체

경우에 따라 본 발명의 비천연 면역원의 제조에서 사용될 수 있는 오르토고날 번역 성분들(O-tRNA 및 O-RS)은 O-tRNA/O-RS 성분들 및 숙주 세포가 오르토고날 방식으로 작용하는 한 임의의 다른 종으로부터 유래된 숙주 번역 시스템에서 사용되기 위해 임의의 유기체 또는 유기체의 조합물로부터 유래될 수 있다. 오르토고날 쌍으로부터의 O-tRNA 및 O-RS가 동일한 유기체로부터 유래될 필요는 없다. 예를 들어, 유박테리아(eubacteria) 숙주 시스템에서 사용될 오르토고날 성분들은 아캐박테리아(archaebacteria) 유전자로부터 유래될 수 있다.

뿐만 아니라, 오르토고날 O-tRNA는 아캐박테리움, 예컨대, 메타노코커스 잔나스키이(Methanococcus jannaschii), 메타노박테리움 써모오토트로피쿰(Methanobacterium thermoautotrophicum), 할로박테리움(Halobacterium), 예컨대, 할로페락스 볼카니이(Haloferax volcanii) 및 할로박테리움 종 NRC-1, 아캐오 글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus), 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus), 피로코커스 호리코쉬이(Pyrococcus horikoshii), 애우로피룸 페르닉스(Aeuropyrum pernix), 메타노코커스 마리팔루디스(Methanococcus maripaludis), 메타노피루스 칸들레리(Methanopyrus kandleri), 메타노사르시나 마제이(Methanosarcina mazei)(Mm), 피로바쿨룸 애로필룸(Pyrobaculum aerophilum), 피로코커스 애비스시(Pyrococcus abyssi), 설폴로부스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)(Ss), 설폴로부스 토코다이이(Sulfolobus tokodaii), 써모플라스마 애시도필룸(Thermoplasma acidophilum), 써모플라스마 볼카니움(Thermoplasma volcanium) 등, 또는 유박테리움, 예컨대, 에스케리키아 콜라이, 써무스 써모필러스(Thermus thermophilus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 등으로부터 유래될 수 있지만, 오르토고날 O-RS는 유기체 또는 유기체의 조합물, 예를 들어, 아캐박테리움, 예컨대, 메타노코커스 잔나스키이, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 할로박테리움, 예컨대, 할로페락스 볼카니이 및 할로박테리움 종 NRC-1, 아캐오글로부스스 풀기두스, 피로코커스 푸리오수스, 피로코커스 호리코쉬이, 애우로피룸 페르닉스, 메타노코커스 마리팔루디스, 메타노피루스 칸들레리, 메타노사르시나 마제이, 피로바쿨룸 애로필룸, 피로코커스 애비스시, 설폴로부스 솔파타리쿠스, 설폴로부스 토코다이이, 써모플라스마 애시도필룸, 써모플라스마 볼카니움 등, 또는 유박테리움, 예컨대, 에스케리키아 콜라이, 써무스 써모필러스, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 스테아로써모필러스 등으로부터 유래될 수 있다. 다른 시스템에서, 진핵 공급원, 예를 들어, 식물, 조류, 원생동물, 진균, 효모, 동물, 예를 들어, 포유동물, 곤충, 절지동물 등도 O-tRNA 및 O-RS의 공급원으로서 사용될 수 있다. 나아가, O-tRNA/O-RS 쌍의 개개의 성분들은 동일한 유기체 또는 상이한 유기체로부터 유래될 수 있다.

O-tRNA, O-RS 또는 O-tRNA/O-RS 쌍은 생체내 또는 시험관내에서 선별되거나 스크리닝될 수 있고/있거나 세포, 예를 들어, 유박테리아 세포에서 비천연 아미노산을 가진 폴리펩티드의 제조에서 사용될 수 있다. 사용되는 유박테리아 세포는 제한되지 않고, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이, 써무스 써모필러스, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 스테아로써모필러스 등을 포함할 수 있다.

셀렉터 코돈

다양한 셀렉터 코돈이 단백질 생합성 기구의 유전적 코돈 프레임워크를 확장시킨다. 예를 들어, 셀렉터 코돈은 예컨대, 독특한 3-염기 코돈, 넌센스 코돈, 예를 들어, 정지 코돈, 예컨대, 앰버 코돈(UAG), 또는 오팔 코돈(UGA), 비천연 코돈, 적어도 4-염기 코돈, 희귀 코돈 등을 포함할 수 있다. 다수의, 예를 들어, 하나 이상, 둘 이상, 셋 이상 등의 셀렉터 코돈이 원하는 유전자 내로 도입될 수 있다. 보편적인 부위 지정 돌연변이유발을 이용하여, 관심있는 폴리펩티드(예컨대, 대상체의 자가 항원 등)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 내의 관심있는 부위에 셀렉터 코돈을 도입할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sayers, et al., (1988) "5',3' Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis" Nucl Acid Res 16:791-802]을 참조한다. 상이한 셀렉터 코돈들을 사용함으로써, 예컨대, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 다수의 비천연 아미노산의 동시적인 부위 특이적 도입을 가능하게 하는 다수의 오르토고날 tRNA/합성효소 쌍을 사용할 수 있다.

비천연 아미노산은 희귀 코돈으로 코딩될 수도 있다. 예를 들어, 시험관내 단백질 합성 반응에서 아르기닌 농도가 감소되는 경우, 희귀 코돈인 아르기닌 코돈 AGG는 알라닌으로 아실화된 합성 tRNA에 의한 Ala의 삽입을 위한 효율적인 코돈인 것이 입증되었다. 예를 들어, 문헌[Ma, et al., (1993) "In vitro protein engineering using synthetic tRNA^Ala with different anticodons" Biochemistry 32:7939-7945]을 참조한다. 이러한 경우, 합성 tRNA는 에스케리키아 콜라이에서 소수 종으로서 존재하는 자연 발생 tRNA^Arg와 경쟁한다. 또한, 일부 유기체는 모든 삼중체 코돈을 사용하지는 않는다. 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)에서 배정되지 않은 코돈인 AGA는 시험관내 전사/번역 추출물에서 아미노산의 삽입을 위해 사용되었다. 예를 들어, 문헌[Kowal and Oliver, (1997) "Exploiting unassigned codons in Micrococcus luteus for tRNA-based amino acid mutagenesis" Nucl Acid Res 25:4685-4689]을 참조한다.

셀렉터 코돈은 확장된 코돈, 예를 들어, 4개 이상의 염기로 구성된 코돈, 예컨대, 4-염기, 5-염기, 6-염기 또는 그 이상의 염기로 구성된 코돈을 포함할 수도 있다. 4-염기 코돈의 예는 예를 들어, AGGA, CUAG, UAGA, CCCU 등을 포함한다. 5-염기 코돈의 예는 예를 들어, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC 등을 포함한다. 비천연 아미노산을 단백질, 예를 들어, 비천연 면역원, 예컨대, 하기 기재된 임의의 비천연 TNFα 또는 사실상 임의의 관심있는 표적 부분 내로 도입하는 구체적인 방법은 프레임쉬프트 억제에 기초한 확장된 코돈을 사용하는 단계를 포함할 수 있다. 4개 이상의 염기로 구성된 코돈은 예를 들어, 하나 또는 다수의 비천연 아미노산을 동일한 단백질 내로 삽입할 수 있다. 다른 경우, 안티코돈 루프, 예를 들어, 적어도 4-염기 코돈, 적어도 5-염기 코돈 또는 적어도 6-염기 코돈 또는 그 이상의 염기로 구성된 코돈을 해독할 수 있다. 256개의 가능한 4-염기 코돈들이 존재하기 때문에, 다수의 비천연 아미노산은 4개 이상의 염기로 구성된 코돈을 사용하는 동일한 세포 내에서 코딩될 수 있다. 문헌[Anderson, et al., (2002) "Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size" Chemistry and Biology 9:237-244]; 문헌[Magliery, et al., (2001) "Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli" J Mol Biol 307:755-769]; 문헌[Ma, et al., (1993) "In vitro protein engineering using synthetic tRNA^Ala with different anticodons" Biochemistry 32:7939]; 문헌[Hohsaka, et al., (1999) "Efficient Incorporation of Nonnatural Amino Acids with Large Aromatic Groups into Streptavidin in In Vitro Protein Synthesizing Systems" J Am Chem Soc 121:34-40]; 및 문헌[Moore, et al., (2000) "Quadruplet Codons: Implications for Code Expansion and the Specification of Translation Step Size" J Mol Biol 298: 195-209] 또한 참조한다. 4-염기 코돈은 다양한 오르토고날 시스템에서 셀렉터 코돈으로서 사용되어 왔다. 예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO 2005/019415호; 국제특허출원 공개 제WO 2005/007870호; 및 국제특허출원 공개 제WO 2005/07624호를 참조한다. 또한, 문헌[Wang and Schultz, (2005) "Expanding the Genetic Code" Angewandte Chemie Int Ed 44:34-66]도 참조한다.

주어진 시스템의 경우, 셀렉터 코돈은 천연 3-염기 코돈 중 하나를 포함할 수도 있고, 이때 내재 시스템은 상기 천연 염기 코돈을 (거의 사용하지 않거나) 전혀 사용하지 않는다. 예를 들어, 이러한 시스템은 천연 3-염기 코돈을 인식하는 tRNA를 결여하고 있는 시스템, 및/또는 3-염기 코돈이 희귀 코돈인 시스템을 포함할 수 있다.

셀렉터 코돈은 경우에 따라 비천연 염기 쌍을 포함한다. 본원의 방법 및 조성물에서 사용되도록 개조될 수 있는 비천연 염기 쌍에 대한 설명은 예를 들어, 문헌[Hirao, et al., (2002) "An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein" Nature Biotechnology 20:177-182]을 포함한다. 문헌[Wu, et al., (2002) "Enzymatic Phosphorylation of Unnatural Nucleosides" J Am Chem Soc 124:14626-14630]도 참조한다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 다양한 실시양태에서, (대상체 내에서 면역 반응을 일으키거나 대상체에 투여될 수 있는 교차 반응성 항체를 생성하기 위해 사용할 수 있는) 비천연 면역원은 다양한 방식으로 구축될 수 있다. 예를 들어, 비천연 면역원은 전형적으로 직접적인 도입 방법, 예컨대, 오르토고날 번역 시스템 또는 시험관내 번역 시스템 또는 고체상 합성을 통해 구축될 수 있다. 그러나, 간접적인 도입 방법, 예컨대, 화학적 수식 및 번역 후 수식은 오르토고날 번역 시스템 방법 또는 시험관내 번역 시스템 방법과 함께(또는 더불어) 수행될 수 있거나, 또는 오르토고날 또는 시험관내 번역 시스템을 통해 부가된 아미노산(또는 이미 구축된 분자 내의 천연 아미노산)에 대한 추가적 수식으로서 수행될 수 있다. 본 발명의 다양한 실시양태는 다수의 이용가능한 방법을 통해 구축된 비천연 면역원을 포함할 수 있음을 인식할 것이다.

면역원 내로의 비천연 아미노산의 도입을 위한 비 오르토고날 방법

상기와 더불어, (예를 들어, 상기 오르토고날 방법과 함께) 다양한 비오르토고날 기법들을 이용하여 비천연 아미노산을 본원의 부분 내로 도입하여(또는 오르토고날 방법을 통해 표적 부분(예를 들어, 질환 관련 부분) 내로 도입된 비천연 아미노산을 수식하여) 비천연 면역원을 제조할 수 있다. 본원의 전형적인 실시양태에서, 비천연 아미노산은 면역원의 구축 과정 동안(예를 들어, 면역원이 번역되고, 생성되고/합성되는 때 등) 면역원 내로 도입되고 추후에 화학적 수식 또는 번역 후 수식을 통해 부가되지는 않는다. 따라서, 일부 실시양태에서, 반응성 측쇄를 가진 아미노산, 예컨대, Lys, Cys 및 Tyr의 유도체화, 예를 들어, N²-아세틸-라이신으로의 라이신의 전환은 오르토고날 방법 또는 다른 직접적인 도입 방법과 함께 및/또는 더불어 사용될 수 있다. 화학적 합성 또한 비천연 아미노산의 도입 방법을 제공할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Dawson, et al., Annu. Rev. Biochem., 69:923 (2000)]을 참조한다.

또 다른 예에서, 원하는 비천연 아미노산으로 화학적으로 아실화된 억제자 tRNA가 100개 초과의 비천연 아미노산을 사실상 임의의 크기의 다양한 단백질 내로 부위 특이적으로 도입하기 위해 사용하고 있는, 단백질 생합성을 지지할 수 있는 시험관내 추출물에 부가되는 일반적인 시험관내 생합성 방법은 본원의 비천연 면역원의 제조에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Cornish, et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34:621 (1995)]; 및 문헌[Noren, et al., Science 244, 182- 188 (1989)]; 및 문헌[Bain, et al., J. Am. Chem. Soc. 111, 8013-8014 (1989)]을 참조한다.

선별적 압력 도입으로 지칭되는 생체내 방법 또한 야생형 합성효소의 혼합을 활용하는 본원의 비천연 면역원의 제조에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Budisa, et al., FASEB J., 13:41 (1999)]을 참조한다. 영양요구성 균주에서, 세포에 특정 천연 아미노산을 공급하는 관련 대사 경로는 차단되어 있고, 상기 균주는 제한된 농도의 상기 천연 아미노산을 함유하는 최소 배지 중에서 생장되지만, 표적 유전자의 전사는 억제된다. 정상 생장기의 개시 시점에서, 천연 아미노산은 고갈되고 비천연 아미노산 유사체로 치환된다. 재조합 단백질의 발현 유도는 비천연 유사체를 함유하는 단백질의 축적을 야기한다. 예를 들어, 문헌[Minks, et al., Anal. Biochem., 284:29 (2000)]; 문헌[Duewel, et al., Biochemistry, 36:3404 (1997)]; 및 문헌[Tang, et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 40:1494 (2001)]을 참조한다. 추가적 예를 위해서는, 예를 들어, 문헌[Hendrickson, et al., EMBO J., 9:1665 (1990)]; 문헌[Boles, et al., Nat. Struct. Biol., 1:283 (1994)]; 문헌[Budisa, et al., Eur. J. Biochem., 230:788 (1995)]; 문헌[Budisa, et al., J. MoI. Biol., 270:616 (1997)]; 문헌[vanHest et al., FEBS Lett., 428:68 (1998)]; 문헌[van Hest, et al., J. Am. Chem. Soc. 122:1282 (2000)]; 및 문헌[Kiick et al., Tetrahedron, 56:9487 (2000)]을 참조한다.

본원에서 비천연 아미노산을 면역원 내로 도입하는 또 다른 임의적/추가적 기법은 프루프리딩(proofreading) 기작을 가진 합성효소를 수식하는 것이다. 이 합성효소는 아미노산을 구별할 수 없으므로 tRNA를 통상적으로 충전하는 동족체 천연 아미노산과 구조적으로 유사한 아미노산으로 tRNA를 충전한다. 이 오류는 tRNA로부터 잘못 충전된 아미노산을 탈아실화하여 단백질 번역의 신뢰도를 유지하는 합성효소의 분리된 부위에서 정정된다. 상기 합성효소의 프루프리딩 활성이 불능화되는 경우, tRNA를 통상적으로 충전하는 아미노산의 구조적 유사체로 충전된 tRNA는 편집 기능으로부터 벗어나 구조적 아미노산 유사체를 성장하는 폴리펩티드 쇄 내로 도입할 수 있다. 문헌[Doring, et al., Science, 292:501 (2001)]을 참조한다.

고체상 합성 및 반합성 방법도 본원에서 비천연 아미노산을 함유하는 면역원의 합성을 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 하기 문헌들 및 이 문헌들에서 인용된 참고문헌을 참조한다: 문헌[Crick, et al., Nature, 1227-1232 (1961)]; 문헌[Hofmann, et al., J. Am. Chem., 5914-5919 (1966)]; 문헌[Kaiser, et al., Acc. Chem. Res., 47-54 (1989)]; 문헌[Nakatsuka, et al., J. Am. Chem. Soc., 3808-3810 (1987)]; 문헌[Schnolzer, et al., Science, 221-225 (1992)]; 문헌[Chaiken, et al., CRC Crit Rev Biochem., 255-301 (1981)]; 문헌[Offord, Protein Eng., 151-157 (1987)]; 및 문헌[Jackson, et al., Science, 243 (1994)].

본원의 다양한 실시양태에서 화학적 수식을 이용하여, 보조인자, 스핀 표지 및 올리고뉴클레오티드를 포함하는 다양한 비천연 측쇄를 본 발명의 비천연 면역원 내로 도입할 수 있다. 또한, 다른 번역 후 수식과 함께 화학적 수식은 전형적으로 적어도 오르토고날 번역과 같은 직접적인 도입 방법의 보조 수단으로서 이용된다. 따라서, 화학적 수식은 경우에 따라 오르토고날 방법을 통해 도입된 비천연 아미노산을 수식하기 위해 오르토고날 방법 또는 상기 다른 방법과 함께 이용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Corey, et al., Science, 1401-1403 (1987)]; 문헌[Kaiser, et al., Rev Biochem, 565-595 (1985)]; 문헌[Kaiser, et al., Science, 505-511 (1984)]; 문헌[Neet, et al., J Biol. Chem, 6392-6401 (1968)]; 문헌[Polgar, et al., J. Am Chem Soc, 3153-3154 (1966)]; 및 문헌[Pollack, et al., Science, 1038-1040 (1988)]을 참조한다.

대안적으로, 여러 생체물리적 프로브를 시험관내에서 합성된 단백질 내로 도입하기 위해 사용하는 화학적으로 수식된 아미노아실-tRNA를 사용하는 생합성 방법이 본원의 비천연 면역원의 제조에서 이용될 수 있다. 하기 문헌 및 이 문헌에서 인용된 참고문헌을 참조한다: 문헌[Brunner, J., Annu. Rev Biochem, 483-514 (1993)]; 및 문헌[Krieg, et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 8604-8608 (1986)].

화학적으로 아미노아실화된 억제자 tRNA를 원하는 앰버 넌센스 돌연변이가 함유된 유전자로 프로그래밍된 단백질 합성 반응에 첨가하여 비천연 아미노산을 본 발명의 비천연 면역원 내로 부위 특이적으로 도입할 수도 있다. 이 방법을 이용하여 특정 아미노산에 대한 영양요구성 균주를 사용하여 20종의 정규 아미노산 중 다수의 아미노산을 유사한 구조의 상동체, 예를 들어, 페닐알라닌의 경우 플루오로페닐알라닌으로 치환시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[Noren, et al., Science, 244:182-188 (1989)]; 문헌[Nowak, et al., Science 268:439-42 (1995)]; 문헌[Bain, et al., J. Am. Chem. Soc., 111:8013-8014 (1989)]; 문헌[Budisa et al., FASEB J., 13:41-51 (1999)]; 문헌[Ellman et al., Methods in Enz., 301-336 (1992)]; 및 문헌[Mendel, et al., Annu Rev Biophys. Biomol Struct., 24, 435-62 (1995)]을 참조한다.

또한, 미세주입 기법을 이용하여 비천연 아미노산을 본 발명의 비천연 면역원 내로 도입할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Nowak, et al., Science, 268:439 (1995)]; 및 문헌[Dougherty, Curr. Opin. Chem. Biol., 4:645 (2000)]을 참조한다. 또한, 예를 들어, 문헌[Turcatti, et al., J. Biol. Chem., 271:19991 (1996)]; 문헌[Gallivan, et al., Chem. Biol., 4:739 (1997)]; 문헌[Miller, et al., Neuron, 20:619 (1998)]; 문헌[England, et al., Cell, 96:89 (1999)]; 및 문헌[Lu, et al., Nat. Neurosci., 4:239 (2001)]을 참조한다.

고체상 펩티드 합성은 비천연 아미노산을 포함하는 펩티드 및 소단백질의 화학적 합성에서 널리 이용되며(예를 들어, 문헌[Merrifield (1963) "Solid Phase Peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide." JACS 85:2149-2154)] 참조) 본 발명의 비천연 면역원의 제조에 적용될 수 있는 또 다른 방법이다. 이 기법은 전형적으로 하기 2 단계를 포함한다: SPPS의 제1 단계는 커플링-탈보호의 반복된 주기를 통해 중합체 지지체 상의 보호된 아미노산 유도체를 사용하여 펩티드 쇄를 조립하는 것을 포함할 수 있다. 그 다음, 고체상에 부착된 펩티드의 자유 N-말단 아민을 단일 N-보호된 아미노산 유니트에 커플링시킬 수 있다. 그 후, 상기 유니트는 탈보호되어, 추가적 아미노산이 부착될 수 있는 신규 N-말단 아민을 노출시킨다. SPPS의 제2 단계에서, 펩티드는 상기 지지체로부터 절단되고, 측쇄 보호기는 제거되어 펩티드, 예를 들어, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 펩티드를 생성한다. 고체상 펩티드 합성의 2종의 주로 사용되는 형태가 존재한다: 염기 불안정성 알파-아미노 보호기가 사용되는 Fmoc (Carpino, et al., (1972) "9-Fluorenylmethoxycarbonyl amino-protecting group." J. Org. Chem. 57:3404-3409), 및 산 불안정성 보호기가 사용되는 t-Boc. 각각의 방법은 상이한 수지 및 아미노산 측쇄 보호 및 후속 절단/탈보호 단계를 포함한다.

또한, 단백질 반합성을 이용하여 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입함으로써 본원의 비천연 면역원을 제조할 수 있다. 단백질 반합성은 그 자체가 절단되어 남아 있는 부분, 예를 들어, 엑스테인(extein)에 재부착됨으로써 스플라이싱(splicing) 생성물로 지칭되는 새로운 활성 단백질을 제공할 수 있는 단백질의 한 부분인 분할(split) 인테인(intein)을 종종 사용한다. 예를 들어, 비천연 아미노산을 포함하지 않는 한 단백질 도메인을 비천연 아미노산을 포함하는 제2 단백질 도메인과 함께 사용하여 비천연 면역원을 제조할 수 있다. 이 기법은 생체내 단백질 발현 시스템에서 발현시키기에 어려운 비천연 면역원의 제조에서 유리하게 사용될 수 있다.

또한, 예를 들어, 단백질 반합성 과정 동안 다양한 화학적 결찰 기법을 이용하여 비천연 아미노산을 본원의 단백질 내로 도입함으로써 비천연 면역원을 제조할 수 있다. 예를 들어, 천연 화학적 결찰(NCL) 반응에서, N-말단 시스테인을 포함하는 펩티드는 외재 티올 촉매의 존재 하에, 예를 들어, α-티오에스테르 기, 예를 들어, C-말단 티오에스테르를 포함하는 비천연 아미노산과 반응하여 결찰 부위에서 천연 펩티드 결합을 형성한다(문헌[Dawson, et al., (1994) "Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation" Science 266:776-779]). 발현된 단백질 결찰(EPL)은 재조합 및 합성 폴리펩티드가 화학선택적으로 및 위치선택적으로 서로 연결될 수 있게 하는 단백질 개조 방법이다. 이 방법은 대다수의 단백질의 1차 구조가 합성 유기 화학기법의 수단에 접근할 수 있게 함으로써, 단백질 내로 도입되는 임의의 다양한 비천연 아미노산의 부가가 비천연 면역원을 생성할 수 있게 한다. 이 단백질 화학적 결찰 기법 및 다른 단백질 화학적 결찰 기법에 대한 추가적 세부설명은 예를 들어, 문헌[Howl, ed. Peptide Synthesis and Its Applications, Humana Press: Totowa NJ, 2005] 등에서 찾을 수 있다.

기법에 관한 추가적 세부설명

RS 및 tRNA 돌연변이의 생성, 및 다양한 재조합 및 시험관내 핵산 개조 방법(클로닝, 발현, PCR 등을 포함함)에 대한 유용한 추가적 참고문헌은 문헌[Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger)]; 문헌[Kaufman, et al., (2003) Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine Second Edition Ceske (ed) CRC Press (Kaufman)]; 및 문헌[The Nucleic Acid Protocols Handbook Ralph Rapley (ed) (2000) Cold Spring Harbor, Humana Press Inc (Rapley); Chen, et al., (ed) PCR Cloning Protocols, Second Edition (Methods in Molecular Biology, volume 192) Humana Press; and in Viljoen, et al., (2005) Molecular Diagnostic PCR Handbook Springer, ISBN 1402034032]을 포함한다.

다양한 단백질 방법이 공지되어 있고, 예를 들어, 본 발명의 임의의 비천연 면역원을 발현하는 세포의 재조합 배양물로부터 본 발명에 따라 제조된 단백질의 단리, 검출, 개조 또는 취급에서 이용될 수 있다. 하기 문헌에 기재된 단백질 단리 및 검출 방법을 포함하는 다양한 단백질 단리 및 검출 방법이 당업계에 잘 공지되어 있다: 문헌[R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)]; 문헌[Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990)]; 문헌[Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.]; 문헌[Bollag, et al., (1996) Protein Methods, 2^nd Edition Wiley-Liss, NY]; 문헌[Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England]; 문헌[Harris and Angal Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England]; 문헌[Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3^rd Edition Springer Verlag, NY]; 문헌[Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principles. High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY]; 및 문헌[Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ], 및 상기 문헌들에서 인용된 참고문헌. 단백질 정제 및 검출 방법에 대한 추가적 세부설명은 문헌[Satinder Ahuja ed., Handbook of Bioseparations. Academic Press (2000)]에서 찾을 수 있다. 이 이용가능한 방법들은 예를 들어, 치료, 백신 또는 본 발명의 다른 양태에서 사용될 면역원의 제조를 위해 본원의 다양한 방법을 통해(예를 들어, 오르토고날 번역 방법을 통해) 제조된 비천연 면역원의 단리 및/또는 정제에서 (경우에 따라 다른 단백질 정제 방법과 함께) 이용될 수 있다.

항체 및 항체 제조

일부 실시양태에서, 본 발명은 면역원(즉, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 질환 관련 부분)에 대한 하나 이상의 항체로서 대상체에 투여될 수 있는 항체를 포함한다. 상세히 전술된 바와 같이, 이러한 항체는 전형적으로 대상체 내에 존재하거나 대상체 내에 존재할 수 있는 상응하는 표적 부분과 교차 반응하고, 상기 천연 표적 부분은 비천연 아미노산을 포함하지 않고 이 천연 표적 부분으로부터 "비천연" 면역원이 유래되거나 상기 면역원이 상기 천연 표적 부분에 상응한다.

전술된 바와 같이, 항체는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자의 단편에 의해 실질적으로 코딩된 하나 이상의 폴리펩티드로 구성된 단백질을 의미한다. 인식되어 있는 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자뿐만 아니라 다수의 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로서 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로서 분류되고, 상기 감마, 뮤, 알파, 델타 및 엡실론은 각각 면역글로불린 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 정의한다.

전형적인 면역글로불린(항체) 구조 유니트는 사량체를 포함하는 것으로 공지되어 있다. 각각의 사량체는 2쌍의 동일한 폴리펩티드 쇄로 구성되고, 상기 2쌍의 동일한 폴리펩티드 쇄는 각각 하나의 "경"쇄(약 25 kD) 및 하나의 "중"쇄(약 50 내지 70 kD)를 가진다. 각 쇄의 N-말단은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 100개 이상의 아미노산으로 구성된 가변 영역을 정의한다. 용어 "가변 경쇄(VL)" 및 "가변 중쇄(VH)"는 각각 이들 경쇄 및 중쇄를 의미한다.

본 발명의 항체는 온전한 면역글로불린으로서 존재할 수 있거나 다양한 펩티다제를 사용한 분해에 의해 생성된 다수의 잘 특징규명된 단편으로서 존재할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 펩신은 힌지 영역 내의 이황화 결합 아래에서 항체를 분해함으로써, 그 자체가 이황화 결합에 의해 VH-CH1에 연결되어 있는 경쇄인 Fab의 이량체인 F(ab)'₂를 생성한다. F(ab)'₂는 온화한 조건 하에서 환원되어 힌지 영역 내의 이황화 결합을 파괴함으로써 F(ab)'₂ 이량체를 Fab' 단량체로 전환시킬 수 있다. Fab' 단량체는 본질적으로 힌지 영역의 일부를 가진 Fab이다(다른 항체 단편에 대한 보다 상세한 설명을 위해서는 문헌[Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999)] 참조). 다양한 항체 단편이 온전한 항체의 분해 면에서 정의되지만, 당업자는 이러한 Fab' 단편을 화학적으로 드 노보 합성할 수 있거나 재조합 DNA 방법을 이용하여 합성할 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본원에서 사용된 용어 "항체"는 전장 항체의 수식에 의해 제조되거나 재조합 DNA 기법의 이용에 의해 드 노보로 합성된 항체 단편도 포함한다. 구체적인 항체는 가변 중쇄와 가변 경쇄가 (직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해) 서로 연결되어 연속적인 폴리펩티드를 형성하는 단일 쇄 항체(단일 폴리펩티드 쇄로서 존재하는 항체) 또는 단일 쇄 Fv 항체(sFv 또는 scFv)를 포함한다. 단일 쇄 Fv 항체는 직접적으로 연결되어 있거나 펩티드-코딩 링커에 의해 연결되어 있는 VH-코딩 서열 및 VL-코딩 서열을 포함하는 핵산으로부터 발현될 수 있는, 공유적으로 결합된 VH-VL 이종이량체이다. 문헌[Huston, et al., (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883]을 참조한다. VH와 VL이 단일 폴리펩티드 쇄로서 서로 연결되어 있지만, VH 도메인과 VL 도메인은 비공유적으로 결합한다. scFv 항체; 및 천연적으로 응집되어 있지만 화학적으로 분리된, 항체 V 영역으로부터의 경쇄 폴리펩티드 및 중쇄 폴리펩티드를 항원 결합 부위의 구조와 실질적으로 유사한 3차원적 구조로 폴딩되는 분자로 전환시키는 다수의 다른 구조체가 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,091,513호, 제5,132,405호 및 제4,956,778호 참조). 본 발명에서 유용한 항체는 다클론 항체 및 단클론 항체를 포함한다.

본 발명의 비천연 면역원 또는 이의 단편은 본 발명의 항체의 제조에서 사용될 수 있다. 다클론 항체, 인간화된 항체, 단클론 항체 또는 항체 단편은 본 발명의 비천연 면역원을 사용하여 제조할 수 있다. 항체를 표준 방법으로 정제하여 그의 반응성에 영향을 미칠 수 있는 원치 않는 오염물질, 예를 들어, 혈청 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 항체 제제를 제공할 수 있다. 다클론 항체의 경우, 선택된 포유동물(예를 들어, 마우스, 토끼, 염소, 말 등)을 본 발명의 비천연 면역원으로 면역화시킬 수 있다. 그 다음, 면역화된 동물로부터의 혈청을 모아 당업자에게 잘 공지된 절차에 따라 처리할 수 있다. 나아가, 다클론 항체를 당업자에게 잘 공지된 절차를 이용하여 면역친화성 크로마토그래피로 정제할 수 있다.

대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 비천연 면역원에 대한 단클론 항체를 생성할 수 있다. 하이브리도마 기술을 통한 단클론 항체의 제조는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 생성하는 불멸 세포주는 세포 융합 또는 다른 기법, 예를 들어, 종양유발성 DNA를 사용한 B 림프구의 직접적인 형질전환, 엡스테인-바(Epstein-Barr) 바이러스를 사용한 형질감염 등에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Schreier, et al., Hybridoma Techniques (1980)]; 문헌[Hammerling, et al., Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas (1981)]; 문헌[Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980)]; 미국 특허 제4,341,761호; 미국 특허 제4,399,121호; 미국 특허 제4,427,783호; 미국 특허 제4,444,887호; 미국 특허 제4,452,570호; 미국 특허 제4,466,917호; 미국 특허 제4,472,500호; 미국 특허 제4,491,632호; 및 미국 특허 제4,493,890호 등을 참조한다.

당업자는 항체(예를 들어, 단클론 항체, 다클론 항체, 인간화된 항체 등)의 디자인 및 제조를 안내하는 다른 다수의 잘 공지된 프로토콜이 존재함을 용이하게 인식한다. 또한, 항체는 다수의 상업적 서비스 중 임의의 서비스(예를 들어, 버켈리 안티보디 라보라토리스(Berkeley Antibody Laboratories), 베씰 라보라토리스(Bethyl Laboratories), 아나와(Anawa), 유로제네텍(Eurogenetec) 등)에 의해 제조될 수 있다.

항체의 접근이 가능한 p-니트로페닐알라닌을 포함하는 비천연 TNFα 면역원에 기초한 항- TNF α 면역요법

특정 실시양태에서, 하기 실시예에 더 상세히 기재된 바와 같이, 본 발명은 TNFα의 활성과 관련된 병태의 치료 및/또는 예방에서 유용할 수 있는 조성물 및 방법을 제공한다.

종양 괴사 인자 알파(TNFα)는 크론병, 내독성 쇼크, 뇌 말라리아, 류마티스 관절염 등을 포함하는 많은 만성 염증 질환의 발병기전에서 중요한 역할을 수행한다. 이 질환들의 치료 및/또는 예방에서의 주요 과제는 면역 시스템이 내재 TNFα에 대한 내성을 선별적으로 극복할 수 있게 하여 TNFα-중화 항체의 생성을 자극하는 방법의 개발이다.

중화 TNFα는 상기 질환들의 증상을 완화시킬 수 있다. 예를 들어, 항-TNFα 항혈청은 이의 치료적 잠재력을 결정하는 다수의 실험에서 사용되어 왔다(문헌[Veres, et al., (2007) "Infliximab therapy for pediatric Crohn's disease" Expert Opin Biol Ther 7:1869-1880]; 문헌[Ackermann, et al., (2007) "Tumor necrosis factor as a therapeutic target of rheumatologic disease" Expert Opin Ther Targets 8:2553-68]; 문헌[Knight, et al., (1993) "Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody" Mol Immunol 30:1443-1453]; 및 문헌[Present, et al., (1999) "Infliximab for the Treatment of Fistulas in Patients with Crohn's Disease" New Engl J Med 340:1398-1405]에서 검토됨). 관절염, 패혈증 쇼크 및 크론병과 관련된 증상의 최소화에 있어서 그의 효능에 대한 가용성 키메라 TNFα 수용체의 효능이 연구되어 왔다(문헌[Peppel, et al., (1991) "A tumor necrosis factor (TNF) receptor-IgG heavy chain chimeric protein as a bivalent antagonist of TNF activity." J Exp Med 174:1483-1489]; 문헌[Williams, et al., (1995) "Successful therapy of collagen-induced arthritis with TNF receptor-IgG fusion protein and combination with anti-CD4" Immunology 84:433-439]; 문헌[Hoy, et al., (2007) "Etanercept: A Review of its Use in the Management of Ankylosing Spondylitis and Psoriatic Arthritis" Drugs 67:2609-2633]; 문헌[Fisher, et al., (1996) "Treatment of Septic Shock with the Tumor Necrosis Factor Receptor:Fc Fusion Protein" New. Eng. J. Med. 334:1697-1702]; 및 문헌[Korzenik (2004) "Crohn's disease: future anti-tumor necrosis factor therapies beyond infliximab" Gastro Clin of North Am 33:285-301]). 자가 TNFα에 대한 대상체의 면역 내성의 파괴는 TNFα 관련 질환을 치료하고/하거나 예방할 수 있는 한 방법이다.

면역 내성의 파괴라는 과제는 본원의 임의의 부분에 기재되고 언급된 다수의 방법에 의해 시도되었다. 본 발명의 일부 실시양태는 비천연 TNFα, 즉 대상체에 투여될 경우 내재 TNFα, 예를 들어, 대상체 내에서 혈청 수준으로 및/또는 질환 상태를 나타내는 발현 수준으로 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있는 TNFα에 대한 면역학적 반응을 자극하거나 증강시키는 비천연 아미노산(UAA)을 포함하는 TNFα를 제공한다. 또한, 본원은 TNFα 관련 질환 상태와 관련된 증상을 약화시키거나 예방하기 위해 천연 TNFα와 교차 반응하는 항-비천연 TNFα 항체의 투여를 필요로 하는 질환 상태, 예를 들어, TNFα의 존재 또는 존재 수준과 관련된, 본원에 나열된 질환 상태에 대한 치료 및 백신을 제공한다.

일반적으로, TNFα의 증가된 혈청 수준은 다양한 질환 상태와 관련되어 있다. 그러나, 면역학적 반응이 일어나는 대상체 및/또는 예방적 치료를 받는 대상체 등이 질환 상태를 나타내는 혈청 TNFα 수준을 보이지 않을 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명의 항체 및/또는 비천연 면역원은 TNFα 관련 질환을 나타내는 개체뿐만 아니라 상기 질환을 나타내지 않는 개체에게도 투여될 수 있다.

임의의 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 TNFα, 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 비천연 TNFα의 제조 방법은 본원의 비천연 면역원 및 비천연 면역원 제조 단락 및 실시예 단락에 상세히 기재되어 있다. 하기 실시예에 기재된 비천연 TNFα가 오르토고날 번역 시스템의 이용을 통해 제조된다 하더라도, 화학적 수식 또는 번역 후 수식(예를 들어, 선별적 압력 도입, 고체상 합성, 단백질 반합성 등)이 아닌, 본원에 상세히 기재된 비오르토고날 방법들 중 임의의 하나 이상의 방법을 이용하여 비천연 TNFα를 제조할 수도 있음을 인식할 것이다.

본원에 기재된 한 실시양태에서, 비천연 TNFα는 86번 아미노산 위치에서 고도의 면역원성(E. Keinan, Ed. Catalytic Antibodies (Wiley-VCH, Weinheim, 2005) pp. 1-28), 구조적 보존성 및 항체 접근가능성을 가진 p-니트로페닐알라닌(pNO₂Phe, 도 1a) 잔기를 포함하는 비천연 TNFα, 예를 들어, pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα이다. 이 실시양태에서, 치환 돌연변이는 비천연 TNFα, 예를 들어, pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα가 자가 TNFα의 3차 단백질 구조 및 4차 단백질 구조와 실질적으로 유사한 3차 및 4차 단백질 구조를 유지하게 함으로써, 비천연 TNFα, 예를 들어, pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα에 대해 생성된 중화 항체가 천연 mTNFα, 예를 들어, 마우스 TNFα 상의 상응하는 에피토프와 교차 반응할 수 있는 가능성을 증가시킨다. 전술한 바와 같이, 비천연 아미노산의 치환 및/또는 부가는 경우에 따라 내재 천연 TNFα와 비교할 때 비천연 TNFα의 입체구조를 변화시키지(또는 유의하게 변화시키지) 않을 수 있다. 마우스 대상체에서 치유적 및/또는 예방적 치료에 있어서 사용될 수 있는 추가적인 비천연 mTNFα 유도체(예를 들어, 유전자은행 검색 번호 NP_038721의 비천연 mTNFα 유도체)는 pNO₂Phe¹¹-mTNFα, pNO₂Phe¹⁹-mTNFα, pNO₂Phe²¹-mTNFα, pNO₂Phe⁴²-mTNFα, pNO₂Phe⁴⁹-mTNFα, pNO₂Phe¹⁰⁴-mTNFα 또는 pNO₂Phe¹¹³-mTNFα를 포함한다. 인간 대상체에서 치유적 및/또는 예방적 치료에 있어서 사용될 수 있는 비천연 hTNFα 유도체(예를 들어, 유전자은행 검색 번호 AAA61200의 비천연 hTNFα 유도체)는 pNO₂Phe¹¹-hTNFα, pNO₂Phe¹⁹-hTNFα, pNO₂Phe²¹-hTNFα, pNO₂Phe⁴²-hTNFα, pNO₂Phe⁴⁹-hTNFα, pNO₂Phe⁸⁷-hTNFα, pNO₂Phe¹⁰⁵-hTNFα 또는 pNO₂Phe¹¹⁴-hTNFα를 포함한다.

일반적으로, TNFα의 증가된 혈청 농도는 다양한 질환 상태와 관련되어 있다. 그러나, 면역학적 반응이 일어나거나 예방적 치료를 받는 대상체 등이 질환 상태를 나타내는 혈청 TNFα 수준을 나타내지 않을 수 있다는 것도 인식될 것이다. 따라서, 본 발명의 백신, 항체 및/또는 비천연 면역원이 TNFα 관련 질환을 나타내는 개체 및 상기 질환을 나타내지 않는 개체 둘 다에 투여될 수 있음을 인식해야 한다.

항체의 접근이 가능한 p-니트로페닐알라닌을 포함하는 비천연 RBP 면역원에 기초한 항-RBP4 면역요법

실시예 2에 기재된 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 RBP4 관련 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 유래하게 사용될 수 있다.

저분자량 혈청 단백질인 RBP4는 간 및 지방 조직으로부터 분비되고 혈청 비타민 A의 90%의 주요 담체이다. 과도한 수준의 RBP4는 특히, 매튜 우드 증후군, 연령 관련 황반 변성(AMD) 및 스타르가트병과 같은 시각 질환에 기여한다. 뿐만 아니라, 혈청 RBP4의 증가된 수준은 인슐린 내성 및/또는 당뇨병의 발병에도 기여하는 것으로 공지되어 있다. 본 발명의 일부 실시양태는 예를 들어, 상응하는 천연 RBP4에 대한 항체, B 세포 또는 T 세포 반응을 자극함으로써 상기 질환들을 치료하고/하거나 예방하기 위해 대상체에 투여될 수 있는 비천연 RBP4, 즉 비천연 아미노산을 포함하는 RBP4를 제공한다. 그러나, 여기에서도 면역학적 반응이 일어나거나 예방적 치료를 받는 대상체 등이 질환 상태를 나타내는 혈청 RBP4 수준을 나타내지 않을 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명의 백신, 항체 및/또는 비천연 면역원은 RBP4 관련 질환을 나타내는 개체 및 상기 질환을 나타내지 않는 개체 둘 다에게 투여될 수 있음을 인식해야 한다.

본원에 상세히 기재된, 비천연 TNFα의 제조에서 이용될 수 있는 방법은 비천연 RBP4의 제조에도 이용될 수 있다. 비천연 RBP4는 번역 후 수식 또는 화학적 수식 이외의 방법으로 비천연 RBP4 내로 도입되는, 본원에 기재된 임의의 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 임의의 천연 RBP4는 임의의 비천연 아미노산으로 치환되어 비천연 RBP4를 제조할 수 있다. 상기 치환은 천연 아미노산을 구조저으로 보존된 비천연 아미노산으로 치환시키는 것을 필요로 하지 않는다. 대안적으로 또는 추가로, 하나 이상의 추가적인 비천연 아미노산을 RBP4 폴리펩티드에 부가하여 비천연 RBP4를 제조할 수 있다. 비천연 RBP4는 경우에 따라 천연 RBP4와 실질적으로 유사한 구조를 포함함으로써, 비천연 RBP4에 대해 생성된 중화 항체가 천연 RBP4 상의 상응하는 에피토프와 교차 반응할 수 있는 가능성을 증가시킬 수 있다. 대상체에서 치유적 및/또는 예방적 치료를 위해 사용될 수 있는 비천연 RBP4는 pNO₂Phe⁴³ mRBP4 및 pNO₂Phe¹⁰⁸ mRBP4뿐만 아니라 상응하는 인간 구축물 등을 포함한다.

투여 및 제제화

항체 및/또는 면역원 제제화

표적 부분, 예를 들어, TNFα, 또는 본원에서 인식되는 임의의 다른 많은 가능한 표적에 대한 면역학적 반응을 일으키거나 증강시키기 위해, 본 발명의 치료 방법은 면역원, 예를 들어, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 표적 부분의 유도체에 대한 항체를 사용할 수 있고/있거나, 면역원 자체, 예를 들어, 비천연 TNFα를 사용할 수 있다. 전형적으로, 이러한 항체 및/또는 면역원은 사용된 투여량에서 수용자(예를 들어, 대상체)에 대한 무독성을 나타내는 생리학적으로 허용되는 보조제, 부형제 및/또는 안정화제와 함께 존재한다. 그러나, 본 발명이 항체 및/또는 면역원 제제의 특정 제형에 의해 반드시 제한되지는 않음을 인식할 것이다.

항체 및/또는 면역원(즉, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 표적 부분의 유도체)의 제형화는 생리학적으로 허용되는 보조제, 부형제 및/또는 안정화제를 포함할 수 있다. 당업계에 공지된 부형제는 예를 들어, 식물성 및 동물성 오일 및 지방을 포함한다. 안정화제, 습윤화제 및 유화제, 삼투압을 변경시키기 위한 염, 바람직한 pH를 유지하기 위한 완충제 및/또는 피부 침투 증강제가 다양한 제형에서 보조제(즉, 부형제)로서 사용될 수 있다. 다양한 통상적인 제형의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 자명할 것이다(예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21^st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, 2005)] 참조). 제형은 하나 이상의 보조제, 예컨대, 백금, 완전 프로인트 보조제(FCA), 불완전 프로인트 보조제(FIA), 리포폴리사카라이드(LPS), 스쿠알렌, 비로좀, MSP1, QS21 등을 포함할 수도 있다. 나아가, 제형은 담체, 예컨대, 폴리펩티드 담체, 탄수화물 담체(예를 들어, 만노스와 같은 모노사카라이드의 하나 이상의 유니트, 뮤신의 하나 이상의 유니트 등), 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 오브알부민, 달걀 알부민, 파상풍 독소 또는 디프테리아 독소 등에 융합된 면역원도 포함할 수 있다. 당업자는 경우에 따라 본 발명에서 사용될 수 있는 다수의 보조제, 담체, 부형제, 안정화제 등을 알 것이다.

뿐만 아니라, 항체 및/또는 면역원 제형화를 위해 사용될 수 있는 통상적인 부형제의 예는 완충제(예컨대, 포스페이트 완충제, 시트레이트 완충제, 및 다른 유기산으로부터 제조된 완충제), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산), 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드, 추가적 단백질(예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 및 면역글로불린), 친수성 중합체(예컨대, 폴리비닐피롤리돈), 아미노산(예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 및 라이신), 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물(글루코스, 만노스 및 덱스트린을 포함함), 킬레이팅제(예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산[EDTA]), 당 알코올(예컨대, 만니톨 및 소르비톨), 염-형성 반대 이온(예를 들어, 나트륨) 및/또는 음이온성 계면활성제(예컨대, 트윈(상표명), 플루로닉스(상표명) 및 PEG)를 포함한다.

사용되는 구체적인 보조제, 부형제 또는 안정화제 및 제형은 예를 들어, 제형이 본 발명의 항체 또는 비천연 면역원을 포함하는지 여부, 구체적인 투여 경로, 투여되는 다른 약물, 사용되는 투여량 등에 따라 달라질 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 정맥내, 근육내 또는 피하 투여에서, 항체 또는 면역원은 약학적으로 허용가능하고 주사가능한 부형제 내로 도입될 수 있다. 전형적으로, 부형제는 멸균수, 수성 식염수, 완충된 수성 식염수, 덱스트로스 수용액, 글리세롤 수용액, 에탄올 또는 이들의 조합물과 같은 부형제이다. 멸균성, 적절한 pH, 등장성 및 안정성을 보장하는 이러한 용액들의 제조는 항체 또는 항원성 단백질의 투여를 위한, 당업계에 확립된 프로토콜에 따라 달성된다. 일반적으로, 부형제는 알레르기 효과 및 다른 바람직하지 않은 효과를 최소화하고 구체적인 투여 경로, 예를 들어, 경피, 근육내 등에 적합하도록 선택된다.

일부 실시양태에서, 제제는 경구 투여, 예를 들어, 음식 또는 음료 내로의 도입, 저작가능한 또는 삼킬 수 있는 정제 또는 캡슐제로의 제형화 등의 용도로 제조될 수 있다. 따라서, 이러한 제형은 혈류 내로의 신속한 흡수 및 신체의 다양한 구획으로의 분배를 가능하게 한다. 전형적으로, 경구 투여의 경우, 부형제는 약학적 등급의 락토스, 만니톨, 전분, 메틸 셀룰로스, 스테아르산마그네슘, 소듐 사카린, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 젤라틴, 수크로스, 탄산마그네슘 등을 포함할 수 있다. 조성물이 경구 투여를 위한 고체 제제의 형태로 사용되는 경우, 상기 제제는 정제, 과립제, 산제, 캡슐제 등일 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 항체 및/또는 비천연 면역원을 전달하기 위해 지속 방출 약학 제형을 사용한다. 예시적 지속 방출 제형은 본 발명의 항체 및/또는 비천연 면역원이 부착되거나 캡슐화되는 고체 소수성 중합체로 구성된 반투과성 매트릭스를 포함한다. 적절한 중합체의 예는 폴리에스테르, 히드로겔, 폴리락티드, L-글루탐산 및 T-에틸-L-글루타마제로 구성된 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 이러한 매트릭스는 성형된 제품의 형태, 예컨대, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태일 수 있다.

본원의 다양한 방법에서, 면역원, 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 비천연 TNFα 또는 임의의 다른 면역원, 또는 표적 부분과 교차 반응하는 항-면역원 항체는 대상체에 경피 투여되는 제형으로 제조될 수도 있다. 경피 투여의 경우, 상기 항체 및/또는 비천연 면역원은 친유성 담체 내로 도입되어 국소 크림 또는 연고로서 또는 부착 패치로서 제형화될 수 있다. 다양한 통상적인 제형의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 자명할 것이다(예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21^st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, 2005)] 참조). 따라서, 지속 방출 제제는 리포좀 내로 포획된 활성화제를 포함할 수 있다. 리포좀은 다양한 종류의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 소포체이다. 이 성분들은 전형적으로 생물학적 막의 지질 배열과 유사한 이중층 형태로 배열된다. 항체/비천연 면역원을 함유하는 리포좀은 공지된 방법, 예를 들어, 문헌[Epstein, et al., (1985) PNAS USA, 82:3688-92]; 및 문헌[Hwang, et al., (1980) PNAS USA, 77:4030-34]에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 유용한 리포좀은 예를 들어, 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 제형을 사용하여 역상 증발 방법으로 제조할 수 있다. 원하는 경우, 리포좀은 특정 직경의 리포좀을 생성하도록 한정된 공극 크기의 필터를 통해 압출될 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 및/또는 비천연 면역원, 예컨대, 본 명세서 전체에 기재된 항체 및/또는 비천연 면역원은 점막 투여용 제형으로 제조될 수 있다. 점막 투여는 협측, 기관내, 흡입, 비강, 인두, 직장, 설하, 질 등과 같은 경로를 포함한다. 점막을 통한 투여의 경우, 항체 및/또는 비천연 면역원은 유화액, 검, 로젠지, 스프레이, 정제 등으로서 제형화될 수 있다. 비강 투여는 산제 또는 스프레이 제제를 통해 수행될 수 있다. 직장 및 질 투여의 경우, 제형은 크림, 관수기, 관장제 또는 좌약제 등을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 항체 및/또는 비천연 면역원은 안 투여에 적합한 용액 또는 현탁액, 예를 들어, 적제 또는 스프레이 내로 도입됨으로써 안 투여용 제형으로 제조될 수 있다.

본원에서 사용되는 약학 제형은 국제특허출원 공개 제WO 91/04014호에 기재된 바와 같이 이식될 수 있는 막, 예컨대, 실라스틱 막 상에 흡착된 항체 및/또는 비천연 면역원도 포함할 수 있다.

본 발명에 의해 사용되는 약학 제형은 예를 들어, 수용액 또는 동결건조된 케이크를 포함하는 임의의 표준 형태로 저장될 수 있다. 이러한 제형은 전형적으로 대상체에 투여될 때 멸균된 상태이다. 수용액의 멸균은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 제형이 동결건조된 형태로 저장되는 경우, 상기 제형은 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 여과될 수 있다.

항체 및/또는 비천연 면역원의 투여

본원에 기재된 바와 같이, 본 발명은 표적 부분과 교차 반응하는, 비천연 표적 부분(비천연 면역원)에 대한 항체의 투여 및/또는 비천연 표적 부분 자체의 투여를 통해 대상체 내에서 상기 표적 부분, 예를 들어, TNFα와 같은 자가 부분에 대한 면역학적 반응을 일으키거나 증강시키는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 상기 표적 부분은 예를 들어, 하기 실시예에 기재된 임의의 비천연 TNFα 및 다수의 다른 분자, 예컨대, 본원에 기재된 분자를 포함할 수 있다. 전형적으로, 특정 제형은 단독으로 투여되거나, 다수의 의학적 병태/질환 상태 중 하나 이상을 치유적으로 및/또는 예방적으로 치료하기 위한 다른 치료 또는 약물 투여와 함께(예를 들어, 동시) 투여된다. 비천연 면역에 대한 항체가 투여되는지 여부, 비천연 면역원이 투여되는지 여부, 투여되는 항체 및/또는 비천연 면역원의 구체적인 제형 등에 따라 투여/치료 계획이 달라질 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체의 투여는 본 발명의 비천연 면역원의 투여와 (예를 들어, 투여량, 시간-곡선 등에서) 상이하다. 또한, 본원에서 특정 제형 및/또는 투여 계획의 언급은 반드시 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 됨을 인식할 것이다.

당업자는 조성물을 투여받는 대상체 및/또는 본 발명의 방법이 수행되는 대상체의 선택에 있어서 도움이 되는 다수의 의학적/생리학적/정신학적 시험 및 측정을 알 것이다. 예를 들어, 바이러스 또는 박테리아 감염(예를 들어, HTV 감염) 등의 검출은 당업자에게 잘 공지되어 있고 당업자에 의해 널리 실시되고 있다. 유사하게, 다수의 진단 시험(예를 들어, 증상 및/또는 특정 감염체의 존재 등에 기초한 진단 시험)이 다른 의학적 질환, 예를 들어, 암, 자가면역 질환(예컨대, SLE) 등을 위해 이용가능하다. 이러한 측정을 이용하여 본원의 비천연 면역원 및/또는 이에 대한 항체가 투여될 대상체를 용이하게 선택할 수 있다. 나아가, 일부 경우, 대상체는 경우에 따라 그의 가족력, 환경 노출 등에 기초하여 선택된다. 예를 들어, 대상체는 질환 상태(예컨대, 알츠하이머병, 유방암 등)에 대한 가족력 또는 가족 소인에 기초하여 선택될 수 있다. 또한, 대상체는 경우에 따라 감염체 또는 다른 질환 유발제에의 노출 또는 노출 잠재력/노출 위험(예를 들어, HIV에의 윤락 행위자의 노출 또는 가능한 노출, 간염에의 건강관리 종사자의 노출 또는 가능한 노출, 실리카 유발성 폐 섬유증을 초래할 수 있는 실리카 화합물에의 작업자의 노출 등)에 기초하여 선택될 수 있다. 당업자는 추가적 예를 알 것이다.

항체 투여

본 발명의 항체는 치유적 및/또는 예방적 용도를 가진다. 따라서, 다양한 실시양태에서, 본 발명의 항체를 사용하여, 예를 들어, 하나 이상의 특정 표적 부분에 대한 면역학적 반응을 일으키거나 증강시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항체를 사용하여 이러한 표적 부분과 관련된 또는 연관된 하나 이상의 질환 상태(예를 들어, 암, 자가면역 질환, 병원체 감염 등)를 치료하는 방법을 제공한다. 본 명세서 전체에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 항체는 다수의 질환 및/또는 장애의 치료 및/또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 내독성 쇼크, 뇌 말라리아, 자가면역 질환, 다발성 장기 부전, 다발성 경화증, 심장 기능장애, 아테롬성동맥경화증, 허혈-재관류 손상, 인슐린 내성, 류마티스 관절염, 크론병, 염증성 장 질환, 악액질, 패혈증 쇼크, AIDS, 이식편 대 숙주 질환, 살균 육아종, 성인 호흡 곤란 증후군 및/또는 실리카 유발성 폐 섬유증과 같은 질환/장애뿐만 아니라 다수의 다른 질환이 본 발명의 이용을 통해 치료될 수 있다. 전술된 바와 같이, 본 발명의 항체는 비천연 아미노산을 포함하지 않는 상응하는 표적 부분(예컨대, 천연 TNFα)과 교차 반응하는 비천연 면역원(비천연 질환 관련 부분, 예컨대, 비천연 TNFα)에 대한 특이성을 나타낸다. 인식될 바와 같이, 항체 투여를 포함하는 본 발명의 다양한 방법은 경우에 따라 다른 치유적/예방적 치료(예컨대, 화학요법, 항생제 및/또는 항바이러스 치료, 수술 등)와 함께 이용될 수 있다.

본 발명의 항체는 주사(예를 들어, 정맥내, 복강내, 피하 또는 근육내 주사)를 통해 대상체에 투여될 수 있거나, 관주와 같은 다른 방법에 의해 대상체에 투여될 수 있다. 상기 항체는 종양내, 종양주위, 병소내 또는 병소주위 경로를 통해 투여될 수도 있으므로 전신 효과뿐만 아니라 국소 효과도 발휘할 수 있다.

본 발명의 항체를 투여하기에 효과적인 투여량, 시간-곡선, 스케쥴 등은 경험적으로 결정될 수 있다. 당업자는 다수의 의학적 병태를 위한 항체 치료의 이러한 조정을 알 것이다. 대상체의 항체 치료에 수반되는 파라미터(예를 들어, 투여량, 시간-곡선 등)는 예를 들어, 항체를 제공받을 개개의 대상체(예컨대, 대상체의 종, 질환 상태, 전체적인 신체적 상태 등), 투여 경로, 사용되는 항체 및 투여되는 다른 약물의 구체적인 종류, 치료가 예방적인 치료인지 아니면 치유적 치료인지 여부 등에 따라 달라질 수 있다. 항체 치료 프로그램의 제조에 있어서 추가적 지침은 문헌, 예를 들어, 문헌[Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone, et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, NJ., (1985)]; 및 문헌[Antibodies in Diagnosis and Therapy: Technologies Mechanisms and Clinical Data, CRC, 1999] 전체에서 찾을 수 있다.

비천연 면역원 투여

다른 실시양태에서, 본 발명의 비천연 면역원(즉, 하기 비천연 TNFα 또는 RBP4 중 임의의 것을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 하나 이상의 비천연 아미노산을 가진 표적 부분의 버젼)은 예방적 및/또는 치유적 치료를 위해 대상체에 투여될 수 있다. 본원에 상세히 기재된 바와 같이, 이러한 비천연 면역원의 투여는 대상체에서 면역학적 반응, 즉 상기 비천연 면역원에 대한 항체 반응을 일으킨다. 그러나, 나아가, 비천연 면역원에 대해 대상체에 의해 생성된 항체는 바람직하게는 대상체 내에 존재하는 표적 부분(비천연 면역원에 상응함) 또는 대상체 내에 존재할 수 있는 표적 부분(즉, 병원체 감염, 암, 자가면역 질환 등으로부터 비롯되지만 비천연 아미노산을 포함하지 않는 질환 관련 부분)의 천연 버젼에 대한 교차 반응성을 나타낸다.

본원의 방법에서, 비천연 면역원, 예컨대, 비천연 TNFα 또는 본원에 기재된 다수의 다른 가능한 표적 중 임의의 표적은 약학 조성물의 투여에 있어서 통상적으로 허용되는 방식 중 임의의 방식으로 투여될 수 있다. 또한, 당업자는 이러한 경로 및 전달 프로토콜을 잘 알 것이다. 예를 들어, 비천연 면역원의 투여 경로는 경구, 뇌내, 경막내, 복강내, 근육내, 정맥내, 피하, 경피, 점막(예를 들어, 좌약제 또는 비강내 또는 경협측 투여를 통해) 또는 안 투여 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 따라서, 투여 경로에 따라 비천연 면역원은 다양한 제형, 예를 들어, 정제, 캡슐제, 산제, 조절 방출 제형, 현탁액, 유화액, 좌약제, 크림, 연고, 로션 또는 에어로졸의 형태로 제공될 수 있다. 전술한 바를 참조한다. 구체적인 실시양태는 정확한 투여량의 단순한 투여에 적합한 제형을 사용한다.

전달은 총 1일 투여량 이하를 함유할 수 있거나, 또는 비천연 면역원은 적어도 평균 1일 투여량을 발생시키기에 효과적인 양으로 연장된 기간, 예를 들어, 3 내지 10일에 걸쳐 전달될 수 있다.

대상체에서 항체 반응(전형적으로 비천연 아미노산을 포함하지 않는 상응하는 천연 표적 부분에 대한 항체 반응)이 약하거나 원하는 수준보다 낮은 경우, 비천연 면역원의 추가적 투여를 (예를 들어, 원하는 항체의 역가가 충분히 증가할 때까지) 수행할 수 있다. 뿐만 아니라, 비천연 면역원을 사용한 면역화 후, 혈청 샘플을 대상체로부터 회수하여 원하는 항체의 생성에 대해 시험할 수 있다.

항체 및/또는 비천연 면역원 및 다른 조성물의 동시 투여

원하는 경우, 본 발명의 항체 및/또는 비천연 면역원의 투여는 하나 이상의 다른 약물 또는 치료제의 투여와 함께 수행될 수 있다. 상기 항체/비천연 면역원은 또 다른 약물과 동일한 제형 중에 함유되어 투여될 수 있거나, (예를 들어, 별도의 시간에 상이한 제제 중에 함유되어 상이한 스케쥴 및 상이한 기준 등에 따라) 별도로 투여될 수 있다. 나아가, 다양한 실시양태에서, 다수의 항체 종류 및/또는 다수의 비천연 면역원이 경우에 따라 다른 약물(또는 치료제)과 함께 동시에 또는 순차적으로 대상체에 투여될 수 있다.

본 발명의 항체 및/또는 비천연 면역원은 수술, 방사선 치료 등과 같은 다양한 치료와 동시에 또는 순차적으로 투여될 수도 있다.

경우에 따라 본 발명의 항체 및/또는 비천연 면역원과 동시 투여될 수 있는 추가적 약물/치료제는 본 발명의 항체/비천연 면역원과 동일한 특정 양태의 의학적 병태를 치료하거나(예를 들어, 대상체 내의 특정 표적 부분의 감소) 대상체에서 다른 의학적 병태 또는 관련된(또는 심지어 관련되지 않은) 의학적 병태를 치료할 수 있다. 따라서, 동시 투여되는 약물/치료제는 근원적인 의학적 병태(질환 상태)의 다른 양태를 치료할 수 있다. 예를 들어, 다양한 치료에서, 본 발명의 항체 및/또는 비천연 면역원은 경우에 따라 다수의 통상적인 치료제 중 임의의 치료제, 예컨대, 발열, 관절 통증 및 염증 등을 위한 아스피린, 살리실레이트, 이부프로펜, 나프록센, 술린닥(예컨대, 클리노릴(상표명)), 옥사프로진 및 톨메틴과 함께 투여된다. 일부 실시양태에서, 항말라리아 약물, 예컨대, 히드록시클로로퀸, 클로로퀸 및 퀴나크린이 말라리아의 치료 또는 다른 병태(예를 들어, SLE)에 수반되는 다양한 피부 이상의 치료용으로 처방될 수 있다. 코르티코스테로이드, 전형적으로 프레드니손은 장기 염증 등을 위해 투여될 수 있다. 일부 안드로겐성 화합물, 예를 들어, 다나졸(예컨대, 다노크린(상표명))은 면역 혈소판감소증 및 심각한 용혈 빈혈의 제어에 사용될 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명의 항체/비천연 면역원은 근원적인 의학적 병태로부터 비롯된 2차적 병태 또는 심지어 근원적인 의학적 병태의 치료로부터 비롯된 2차적 병태에 효과적인 약물과 함께 투여될 수도 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 치료제는 치료 프로그램에서 프레드니손, 메토트렉세이트, 면역억제제, 소염제 등의 사용으로부터 비롯될 수 있는 다양한 부수적 병태의 치료로부터 비롯된 골 밀도 손실의 치료를 돕기 위해 칼시토닌과 함께 투여될 수 있다.

항체 및/또는 비천연 면역원의 시간-곡선 및 투여량 조절

전술된 바와 같이, 대상체에서 원하는 결과(및, 경우에 따라 이로써 얻어지는 의학적 병태/질환 상태의 효과적인 치료)의 달성에 효과적인 항체/비천연 면역원의 투여량 범위 및 투여 속도는 표준 산업적 관행에 따라 결정될 수 있다. 상기 투여량 범위는 원하는 반응이 의학적 병태(예를 들어, 암, SLE, 소그렌 증후군, 박테리아 감염, 바이러스 감염, 공피증, 알레르기 질환, HIV/AIDS 등)의 예방적 치료, 치유적 치료 및 완치적 치료 중 어느 것인지 여부, 증상의 종류 또는 심각도, 투여될 다른 약물, 연령, 성별, 의학적 병력 및 치료될 대상체의 다른 개개의 파라미터 등에 따라 상이할 것으로 예측될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여량은 측정되는, 표적 부분의 구체적인 수준에서 일어난 변화, 예를 들어, ELISA 등에 의해 측정되는 변화에 기초하여 결정될 수 있다. 대상체에서 이러한 수준을 결정하기 위해, 본원의 전형적인 실시양태는 생물학적 조직, 말초혈, 혈청, 혈장, 소변, 질액, 정액, 타액, 복막액, 림프액, 수성 또는 점성 체액, 눈물, 폐 유출물 또는 융모막액 중 임의의 하나 이상에서 표적 부분의 수준을 측정할 수 있다.

당업자는 다양한 대상체에서 원하는 결과를 얻기 위한 치료 계획의 개개의 조정을 알 것이다. 따라서, 많은 실시양태에서, 항체 및/또는 비천연 면역원의 특정 투여량이 출발점 또는 표적 수준으로서 사용지만, 이러한 투여량은 경우에 따라 치료를 받는 대상체의 특정 인자들에 기초하여 조절된다. 예를 들어, 투여량은 표적 부분의 원하는 수준이 도달되지 않으면 증가될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 원하는 수준이 달성된다면/달성되는 경우, 투여량을 점차 줄임으로써 원하는 수준에서 안정성을 달성할 최저 수준을 찾을 수 있다.

항체/비천연 면역원 투여량은 치료될 근원적인 의학적 병태의 증상에 기초하여 조절될 수도 있다. 예를 들어, 대상체가 특정 의학적 병태에 대해 치료받는 경우, 상기 특정 의학적 병태의 증상은 경우에 따라 투여량(양 및 시간-경과)에 대한 지침 또는 표시자로서 사용된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 예를 들어, 증상의 발현 사이의 시간 간격 등에 의해 측정되는, 상기 병태의 심각도의 평가는 치료 진행의 간접적인 측정으로서 이용될 수 있으므로, 이에 따라 투여를 조정할 수 있다. 당업자는 의학적 병태에서 증상의 모니터링에서 사용될 수 있는 다른 시험/진단 스케일을 알 것이다.

항체 및/또는 비천연 면역원이 투여될 수 있는 대상체

다양한 동물이 본 발명에 의해 제공되는 백신, 치유적 치료 및/또는 예방적 치료로부터 이익을 얻을 수 있다. 이러한 동물은 가축, 예컨대, 소, 돼지, 염소, 양, 닭, 및/또는 다른 일반 농장 동물을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일반 가정 애완동물, 예를 들어, 고양이, 개, 앵무새, 잉꼬 등도 투여받은, 비천연 면역원에 대한 교차 반응성 항체 및/또는 상기 면역원 자체로부터 이점을 얻을 수 있다.

생체의학적 시험 및 수의학적 치료에 있어서 동물 모델 및 동물 대상체의 사용에 관한 추가적 세부설명은 예를 들어, 문헌[Ng, Chow, and Ogden, eds. Using Animal Models in Biomedical Research: A Primer for the Investigator. First Edition. Singapore: World Scientific Publishing Company, 2008]; 문헌[Conn, ed. Sourcebook of Models for Biomedical Research. Totowa, NJ: Springer, 2008]; 및 문헌[Woodhead, ed. N onmammalian Animal Models for Biomedical Research (Vol. 1), New York: Academic Press, 1990]을 참조한다. 또한, 예를 들어, 문헌[Adams, ed. Veterinary Pharmacology and Therapeutics. Eighth Edition. USA: Wiley-Blackwell, 2001]; 문헌[Kahn and Line, Eds. Merck Veterinary Manual. Ninth Edition. USA: Merck, 2005]; 및 이 문헌들에서 인용된 참고문헌을 참조한다.

본 발명에 의해 제공되는 항체 및/또는 비천연 면역원은 대상체, 예를 들어, 인간에서 질환 상태를 치료하기 위해 투여될 수 있을 뿐만 아니라, 치료 효능 시험, 대사 시험, 독성 시험 및 생식 기능 또는 배아 독성에 대한 항체 및/또는 비천연 면역원의 효과를 측정하기 위한 또는 상기 항체 및/또는 비천연 면역원의 암유발 잠재력을 측정하기 위한 특수 시험을 수행하기 위해 투여될 수도 있다. 이러한 관찰 연구의 수행은 본 발명의 항체 및/또는 비천연 면역원을 다양한 동물 대상체에 투여하는 단계를 수반할 수 있다. 당업자는 본 발명의 조성물이 투여되거나 본 발명의 방법이 실시될 동물 대상체의 선택에 있어서 도움이 될 다수의 의학적 시험 및 측정을 잘 알 것이다. 이러한 동물 대상체는 포유동물, 예를 들어, 염소, 양, 낙타, 소, 돼지 토끼, 말, 햄스터, 인간이 아닌 영장류(사이노몰거스 원숭이, 개코원숭이, 올드 월드(Old World) 원숭이 및 침팬지를 포함하는 원숭이), 기니아 피그, 래트, 마우스 및/또는 고양이를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 조류, 예를 들어, 가축 가금류(닭, 칠면조), 콕카틸앵무새, 시타신앵무새, 및 관행 케이지 사육조 및/또는 개방형 복지 케이지 사육조뿐만 아니라 조류 배아도 본 발명에 의해 제공되는 항체 및/또는 비천연 면역원의 연구 및 개발, 제조, 질 조절, 또는 안정성 시험에서 사용될 수 있다.

어류, 예컨대, 제브라피쉬, 플라티피쉬 및 검상꼬리송사리; 예를 들어, 개구리 및 도롱뇽을 포함하는 양서류; 및 파충류(뱀, 도마뱀 및 거북이) 또한 본원에 기재된 조성물 및/또는 이의 투여 방법의 안정성, 유효량 및/또는 독성을 측정하기 위한 매우 다양한 시험에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Barry, et al., (2002) "Information Resources for Reptiles, Amphibians, Fish, and Cephalopods Used in Biomedical Research." United States Department of Agriculture National Agricultural Library Animal Welfare Information Center] 및 이 문헌에서 인용된 참고문헌을 참조한다.

키트 및 제품

일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법 및 조성물용으로 유용한 물질을 함유하는 키트 또는 제품을 제공한다. 이러한 키트는 항체 및/또는 비천연 면역원의 구축을 위한 성분들 및/또는 실제 항체 및/또는 비천연 면역원(예를 들어, 비천연 TNFα 또는 본원의 다른 많은 예들 중 임의의 예)뿐만 아니라 경우에 따라 하나 이상의 용기, 표지 및 설명서를 포함할 수 있다.

키트는 경우에 따라 하나 이상의 항체(즉, 대상체 내의 천연 표적 부분에 대해 교차 반응성을 나타내는, 비천연 면역원에 대한 항체) 및/또는 하나 이상의 비천연 면역원뿐만 아니라 경우에 따라 다른 성분들(예를 들어, 다양한 항생제, 다양한 항진균제 등)도 포함할 수 있다. 이러한 비천연 면역원은 본 발명에 의해 제공되는 비천연 TNFα 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 키트는 경우에 따라 성분들을 저장하거나 성분들을 혼합/제조하기 위한 튜브 또는 다른 용기(예를 들어, 유리, 플라스틱, 나일론, 면, 폴리에스터, 금속 등으로 만들어짐)뿐만 아니라, 상기 성분들을 대상체(예를 들어, 치료가 필요한 인간 등)에 투여함에 있어서 사용되는 하나 이상의 장치도 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 성분들을 대상체에 투여함에 있어서 사용되는 장치는 성분들의 저장 및/또는 혼합/제조를 위해 사용되는 용기를 포함한다.

또한, 키트는 경우에 따라 본 발명의 항체/비천연 면역원 성분들 이외에 추가적 성분들, 예를 들어, 완충제, 희석제, 필터, 드레싱, 붕대, 도포기, 거즈, 차단막, 반투과성 차단막, 설압자, 바늘 및 주사기 등을 포함할 수 있다.

많은 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 의학적 병태/질환 상태에 대해 대상체를 치료하기 위한 키트의 용도에 관한 설명서(예를 들어, 전형적으로 쓰여진 설명서)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 사용자가 설명서 또는 추가적 설명서와 접촉할 수 있게 하기 위한 URL 주소 또는 전화번호 등을 포함한다. 키트는 단위 투여분, 벌크 포장물(예를 들어, 다회 투여분 포장물) 또는 하위 단위 투여분일 수 있다.

[실시예]

하기 실시예는 특허청구된 본 발명을 설명하기 위해 제공되는 것이지 본 발명을 제한하기 위해 제공되는 것이 아니다. 본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 설명을 위한 것일 뿐이고 실시예 및 실시양태의 다양한 수식 또는 변화가 당업자에게 암시될 것이고 본원의 기술적 사상 및 범위, 및 첨부된 특허청구범위 내에 포함되는 것임을 이해할 것이다.

실시예 1: 유전적으로 코딩된 비천연 아미노산을 사용한 면역 내성의 파괴

자가 단백질에 대한 강한 면역 반응을 선별적으로 유도하거나 외래 항원의 특정 에피토프의 면역원성을 증가시키는 능력은 암, 단백질 미스폴딩(misfolding) 질환 및 감염 질환을 위한 백신의 제조에 대해 상당한 영향을 미칠 것이다. 여기서, 본 발명자들은 관심있는 단백질 내로의 면역원성 비천연 아미노산의 부위 특이적 도입이 야생형 단백질과 교차 반응하는 고역가 항체를 생성함을 보여준다. 구체적으로, 뮤린 종양 괴사 인자-α(mTNFα)의 단일 티로신 잔기(Tyr⁸⁶)가 p-니트로페닐알라닌(pNO₂Phe)으로 돌연변이됨으로써 마우스에서 고역가 항체 반응이 유도되는 반면, Tyr⁸⁶→Phe 돌연변이체의 경우에는 유의한 항체 반응이 관찰되지 않았다. pNO₂Phe에 대해 생성된 항체는 천연 mTNFα와 고도로 교차 반응하고 리포폴리사카라이드(LPS)-유도된 사망으로부터 마우스를 보호한다. 이 방법은 중화 면역 반응을 유도하는 자가 항원 및 외래 항원의 특정 에피토프에 대한 항체 반응을 유도하는 일반적인 방법을 제공할 수 있다.

현대 백신학에서의 주요 과제는 자가 단백질에 대한 강한 면역 반응을 선별적으로 유도하거나 중화 항체를 유도할 수 있지만 면역우성을 나타내지 않는 외래 항원의 특정 에피토프의 면역원성을 증가시키는 강력한 방법의 개발이다. 개선된 보조제의 개발, 키메라 항원 내로의 외래-보조 펩티드의 도입 및 DNA 백신의 사용을 포함하는 다수의 방법이 상기 과제를 해결하기 위해 시도되고 있다(문헌[Dalum, et al., (1999) "Therapeutic antibodies elicited by immunization against TNF-alpha." Nat Biotechnol 17: 666-669]; 문헌[Makela, et al (2002) "Evolution of conjugate vaccines." Expert Rev Vaccines 1: 399-410]; 문헌[Restifo, et al., (1996) "The new vaccines: building viruses that elicit anti-tumor immunity." Curr Opin Immunol, 8: 658-663]; 및 문헌[Baldridge, et al., Vaccine Adjuvants: Immunological and Clinical Principles. C.J. Hackett, Harn, D.A., Jr., Ed. (Humana Press, Totowa, NJ, 2006), pp235-255]). 흥미롭게도, 거의 50년 전, 웨이글(Weigle)은 문헌[Weigle (1965) "The induction of autoimmunity on rabbits following injections of heterologous or altered homologous thyroglobulin." J Exp Med 121: 289-308]에서 디아조늄으로 비특이적으로 표지된 토끼 티로글로불린으로 면역화된 토끼가 천연 티로글로불린에 대해 교차 반응성을 나타내는 항체를 생성함을 보였다. 이 초기 실험이 고도의 이종성을 나타내는 항원을 생성하였지만, 화학적 수식이 고역가 교차 반응성 항체를 유도하는 면역원성 에피토프를 발생시킨다는 해석이 가능하다. 유사하게, T 세포 내성이 하나 또는 소수의 아미노산에 의해 자가 항원으로부터 구별되는 교차 반응성 외래 항원을 사용한 면역화에 의해 용이하게 유도될 수 있는 자가 반응성 B 세포에 의해 파괴될 수 있음을 입증하는 앞선 증거가 있다(문헌[Mamula, et al., (1992) Breaking T cell tolerance with foreign and self co-immunogens. A study of autoimmune B and T cell epitopes of cytochrome c." J Immunol 149: 789-795]).

단백질을 수식하기 위한 상대적으로 비선별적인 화학적 방법과 대조적으로, 오늘날에는 유전적으로 코딩된 비천연 아미노산을 사용하여 단백질 구조에 대한 고도로 정확한 "화학적 돌연변이"를 만들 수 있다. 금속 결합 및 번역 후 수식된 아미노산, 형광 및 산화환원 활성 아미노산, 및 광 반응성 및 화학적 반응성 아미노산을 포함하는 50종 이상의 비천연 아미노산이 박테리아, 효모 또는 포유동물 세포 내에 코딩되어 있다(문헌[Wang, et al., (2001) Expanding the genetic code of Escherichia coli." Science 292: 498-500]; 문헌[Chin, et al., (2003) "An expanded eukaryotic genetic code." Science 301: 964-967]; 및 문헌[Xie and Schultz (2006) "A chemical toolkit for proteins - an expanded genetic code." Nat Rev Mol Cell Biol 7: 775-782]). 보다 구체적으로, 페닐알라닌 유도체인 p-니트로페닐알라닌(pNO₂Phe, 도 1a)은 분광 거리 프로브로서 사용되기 위해 높은 신뢰도 및 우수한 효율로 앰버 넌센스 코돈에 반응하여 박테리아에서 단백질 내로 도입되어 왔다(문헌[Tsao, et al., (2006) "The genetic incorporation of a distance probe into proteins in Escherichia coli." J Am Chem Soc 128: 4572-4573]). 니트로아릴 기는 아마도 항체 결합 부위에 공통적으로 존재하는 Tyr 및 Trp 측쇄와 상호작용하는 전자-결핍 파이(pi) 시스템의 성향으로 인해 고도의 면역원성 햅텐으로서 역사적으로 사용되어 왔다(문헌[Keinan, Ed., Catalytic Antibodies (Wiley-VCH, Weinheim, 2005]). 본 발명자들은 Phe, Tyr 및 pNO₂Phe이 구조적으로 매우 유사하기 때문에 Phe→pNO₂Phe 또는 Tyr→pNO₂Phe 돌연변이를 함유하는 단백질이 천연 단백질과 교차 반응할 강력한 면역 반응을 발생시킬 것이고 추정하였다. 여기서, 본 발명자들은 뮤린 종양 괴사 인자-α(mTNFα)의 Tyr⁸⁶→pNO₂Phe 돌연변이체를 사용한 마우스의 면역화가 리포폴리사카라이드(LPS) 자극으로부터 마우스를 효율적으로 보호하는, wt mTNFα에 대한 고역가 항체 반응을 발생시킴을 보여준다.

mTNFα는 (i) 감염, 염증 및 자가면역 현상의 조절에 관여하는 잘 특징규명된 시토킨이라는 점(문헌[Vassalli (1992) "The Pathophysiology of Tumor Necrosis Factors." Ann Rev Immunol 10: 411-452]); (ii) 발현, 구조, 기능 및 신호전달 기작을 포함하는 상기 단백질의 생물학적 성질이 광범위하게 연구되고 있다는 점(문헌[Vassalli (1992) "The Pathophysiology of Tumor Necrosis Factors." Ann Rev Immunol 10: 411-452]; 문헌[Baeyens, et al., (1999) "The structure of mouse tumour-necrosis factor at 1.4 A resolution: towards modulation of its selectivity and trimerization. "Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 55: 772-778]; 문헌[Pennica, et al., (1985) "Cloning and expression in Escherichia coli of the cDNA for murine tumor necrosis factor." Proc Natl Acad Sci USA 82: 6060-6064]; 문헌[Pasparakis, et al., (1996) "Immune and inflammatory responses in TNF alpha-deficient mice: a critical requirement for TNF alpha in the formation of primary B cell follicles, follicular dendritic cell networks and germinal centers, and in the maturation of the humoral immune response." J Exp Med 184: 1397-1411]; 문헌[Baeyens, et al., (1997) "Crystallization and preliminary X-ray studies of mouse tumor necrosis factor." Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53: 329-330]; 및 문헌[B. B. Aggarwal, Vileck, J., Ed., Tumor Necrosis Factors: Structure, Function and Mechanism of Action. (Dekker, New York, 1992), pp. 1-587]); 및 (iii) mTNFα 넉아웃 마우스가 생존가능하고 명백한 표현형적 이상을 보이지 않는다는 점(이점은 마우스가 TNFα에 대한 중화 면역 반응에서 생존할 것임을 암시함)(문헌[Pasparakis, et al., (1996) "Immune and inflammatory responses in TNF alpha-deficient mice: a critical requirement for TNF alpha in the formation of primary B cell follicles, follicular dendritic cell networks and germinal centers, and in the maturation of the humoral immune response." J Exp Med 184: 1397-1411]) 때문에 본 연구에서 표적 단백질로서 선택되었다. 또한, 항-TNFα 항체(문헌[Knight, et al., (1993) "Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody." Mol Immunol 30: 1443-1453]; 및 문헌[Present, et al., (1999) "Infliximab for the Treatment of Fistulas in Patients with Crohn's Disease." New Engl J Med 340: 1398-1405]) 및 가용성 키메라 TNFα 수용체(문헌[Peppel, et al., (1991) "A tumor necrosis factor (TNF) receptor-IgG heavy chain chimeric protein as a bivalent antagonist of TNF activity." J Exp Med 174: 1483-1489]; 및 문헌[Williams, et al., (1995) "Successful therapy of collagen-induced arthritis with TNF receptor-IgG fusion protein and combination with anti-CD4." Immunology 84: 433-439])는 자가면역 질환의 치료에서 널리 사용되고, 임상적으로 사용될 TNFα-특이적 백신을 개발하기 위해 다수의 방법이 시도되고 있다. 가용성 키메라 TNFα 수용체는 외래-면역우성 T-헬퍼 에피토프를 함유하는 재조합 TNFα 분자, 박테리오파지 Q^β의 바이러스-유사 입자와 TNFα의 융합체, 및 키홀 림펫 헤모시아닌-TNFα 이종결합체를 포함한다(문헌[Dalum, et al., (1999) "Therapeutic antibodies elicited by immunization against TNF-alpha." Nat Biotechnol 17: 666-669]; 문헌[Spohn, et al., (2007) "A Virus-Like Particle-Based Vaccine Selectively Targeting Soluble TNFα Protects from Arthritis without Inducing Reactivation of Latent Tuberculosis." J Immunol 178: 7450-7457]; 및 문헌[Le Buanec, et al., "TNFα kinoid vaccination-induced neutralizing antibodies to TNFα protect mice from autologous TNFα-driven chronic and acute inflammation." Proc Natl Acad Sci USA 103: 19442-19447]).

삼량체 mTNFα의 X-선 결정 구조(문헌[Baeyens, et al., (1997) "Crystallization and preliminary X-ray studies of mouse tumor necrosis factor." Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53: 329-330]; 및 문헌[Baeyens, et al., (1999) "The structure of mouse tumour-necrosis factor at 1.4 A resolution: towards modulation of its selectivity and trimerization." Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 55: 772-778])에 기초하여, 단일 Tyr⁸⁶→pNO₂Phe 돌연변이체 mTNFα(pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα)를 본 발명자들의 초기 연구를 위한 면역원으로서 선택하였다(도 1b). Tyr⁸⁶은 다양한 포유동물 TNF 사이에서 고도로 보존되어 있고, 이 부위에서의 돌연변이는 단백질 폴딩 및 삼량체 형성에 대해 전혀 영향을 미치지 않지만, 세포독성에서의 상당한 손실을 초래함이 확인되었다(문헌[Van Ostade, et al., (1994) "Structure-activity studies of human tumour necrosis factors." Protein Engineering 7: 5-22]; 문헌[Loetscher, et al., (1993) "Human tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) mutants with exclusive specificity for the 55-kDa or 75-kDa TNF receptors." J Biol Chem 268: 26350-7]; 및 문헌[Zhang, et al., (1992) "Site-directed mutational analysis of human tumor necrosis factor-alpha receptor binding site and structure-functional relationship." J Biol Chem 267: 24069-75])(이것은 백신 목적을 위해 유리함).

본 실시예에서, 비천연 아미노산 p-니트로페닐알라닌(pNO₂Phe)을 뮤린 종양 괴사 인자-α(mTNFα) 내로 유전적으로 도입하여 잔기 Tyr⁸⁶을 치환시켰다. pNO₂Phe 함유 단백질로 면역화된 마우스는 야생형 mTNFα와 효과적으로 교차 반응하는 강한 중화 항체 반응을 발생시키는 것으로 밝혀졌다. 나아가, 이 면역화는 리포폴리사카라이드(LPS)에 의해 유도되는 치사 효과로부터 마우스를 효과적으로 보호하는 것으로 밝혀졌다. 이 결과는 자연 발생 단백질에서 발견되지 않는 고도의 면역원성 부분인 독특한 NO₂ 기를 보유하는 자가 단백질이 면역 시스템에 의해 외래 항원으로서 인식될 것임을 보여준다. 상기 독특한 NO₂ 기를 포함하는 단백질과 천연 단백질이 구조적으로 매우 유사하기 때문에, 수식된 단백질에 대해 유도된 항체는 상응하는 자가 단백질과 교차 반응하였다. 따라서, 이 방법은 자가 단백질의 면역 내성을 파괴하는 일반적 방법 및 백신의 제조 방법을 제공한다.

실험에서, 이. 콜라이 XL1-블루(Blue) 및 BL21(DE3)을 각각 클로닝 및 발현을 위한 숙주로서 사용하였다. 벡터 pET26b를 노바겐(Novagen)(미국 위스콘신주 매드슨 소재)으로부터 입수하였다. 달리 명시하지 않은 한, 이. 콜라이 균주를 1% 글리세롤 및 0.3 mM 류신이 함유된 최소 배지(GMML 배지) 또는 2x YT 배지 중에서 생장시켰다. 제한 효소, T4 DNA 리가제, dNTP 및 인자 Xa 단백질분해효소를 엔이비(NEB)(미국 매사추세츠주 비벌리 소재)로부터 입수하였다. IPTG, 및 소듐 도데실설페이트 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)용 4 내지 12% 비스-트리스 겔을 인비트로겐(Invitrogen)(미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)으로부터 구입하였다. pNO₂-Phe을 어드밴스드 켐테크(Advanced ChemTech)(미국 켄터키주 루이스빌 소재)로부터 구입하였다. 프라이머를 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지이스(Integrated DNA Technologies)(미국 아이오와주 코랄빌 소재)로부터 구입하였다. DNA 중합효소를 스트라타진(Stratagene)(미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)으로부터 입수하였다. 항-TNFα 항체를 알앤드디 시스템(R&D system)(미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)으로부터 입수하였고, 재조합 TNFα를 바이오소스(BioSource)(미국 캘리포니아주 카마릴로 소재)로부터 입수하였다. 퀴아젠(QIAGEN) 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 단리하고, 제한 분해 후 DNA 정제를 퀴아퀵(QIAquick) PCR(중합효소 연쇄 반응) 또는 겔 정제 키트(퀴아젠, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 수행하였다.

mTNFα 발현 벡터의 구축

이. 콜라이에서 mTNFα를 발현시키기 위해, N-말단 His₆ 태그, 인자 Xa 절단 부위 및 mTNFα 유전자(T7-lac 프로모터 뒤에서 사용됨)로 구성된 플라스미드 pET26 mTNFα를 구축하였다. 상기 플라스미드를 하기와 같이 구축하였다: 하기 프라이머를 사용한 PCR을 이용하여 플라스미드 pMuTNFα(ATCC # 63169)로부터 뮤린 tnfα 유전자를 증폭하였다: 5'-ATATACATATGCTCAGATCATCTTCTCAAAATTCG 및 5'- AACAACCTCGAGTTATCACAGAGCAATGACTCCAAAGTAGACC. 생성된 PCR 생성물을 NdeI 및 XhoI 제한효소로 분해하여 pET26b 벡터(노바겐) 내로 결찰시켰다. 그 다음, N-말단 헥사히스티딘-태그(His₆-태그)가 부가된 후 성숙 wt mTNFα에 대한 제1 코돈 직전에 인자 Xa에 대한 단백질분해 부위가 부가되도록 상기 재조합 벡터를 수식하였다. 플라스미드 pET26 mTNFα 내에서 Tyr⁸⁶, Lys¹¹ 또는 Asp⁴²에 대한 코돈을 TAG 앰버 코돈으로 돌연변이시킴으로써 mTNFα 돌연변이체 내로의 pNO₂Phe의 부위 특이적 도입을 수행하였고, 이 치환은 퀵 채인지(Quick Change) 돌연변이유발 키트(스트라타진)를 사용하여 발생시켰다. 동일한 키트를 다시 사용하여 mTNFα 돌연변이체 Ala⁸⁶ mTNFα, Phe⁸⁶ mTNFα 및 Phe⁴² mTNFα를 제조하였다. 모든 mTNFα 구축물의 서열은 노바티스 리서치 파운데이션(Novartis Research Foundation)(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)의 유전학 연구소에 의해 수행된 DNA 서열 분석으로 확인하였다.

에스케리키아 콜라이에서의 pNO ₂ Phe ⁸⁶ mTNF α의 발현

이어서, pNO₂Phe(도 1a에 나타낸 구조를 가짐)를 앰버 코돈에 반응하여 이. 콜라이 내에서 단백질 내로 특이적으로 삽입하는, 엠. 잔나스키이로부터 유래된 오르토고날 앰버 억제자 tRNA_CUA/아미노아실-tRNA 합성효소 쌍의 존재 하에 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα, pNO₂Phe¹¹ mTNFα 및 pNO₂Phe⁴² mTNFα 돌연변이체를 발현시켰다(문헌[Tsao, et al., (2006) "The genetic incorporation of a distance probe into proteins in Escherichia coli." J Am Chem Soc 128:4572-4573]). 변성 또는 천연 조건 하에 Ni²⁺ 친화성 크로마토그래피에 이어 His₆-태그의 절단 및 크기 배제 크로마토그래피를 수행하여 돌연변이체 단백질(GMML 최소 배지 중의 약 1 mg/ℓ)을 정제하였다. pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα, pNO₂Phe¹¹ mTNFα 및 pNO₂Phe⁴² mTNFα 돌연변이체를 발현시키기 위해, 이. 콜라이 BL21(DE3) 세포를 mutNO₂PheRS, mutRNA_CUA 및 각각의 돌연변이체 mTNFα 유전자로 동시 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 37℃에서 GMML 배지 중의 1 mM pNO₂Phe의 존재 하에 생장시키고, OD_600nm가 0.5에 도달하였을 때 1 mM IPTG로 유도하였다. 그 후, 세포를 37℃에서 12 내지 16시간 동안 계속 진탕한 다음 수거하였다. 세포 펠렛을 사용할 때까지 -80℃에 저장하였다. wt mTNFα, Phe⁸⁶ mTNFα 및 Phe⁴² mTNFα를 본질적으로 동일한 절차로 발현시켰다. 그러나, pNO₂Phe mTNFα 돌연변이체와 대조적으로, 이 단백질들을 pNO₂Phe의 부재 하에 풍부 배지(2x YT 배지) 중에서 발현시켰다.

변성 조건 하의 wt mTNF α 및 pNO ₂ Phe ⁸⁶ mTNF α의 정제

모든 정제 단계를 실온에서 수행하였다. 세포 펠렛을 얼음 상에서 15분 동안 해동한 후, 세포 페이스트를 습윤 중량 1 g 당 5 ㎖의 양으로 용해 완충제(100 mM NaH₂PO₄, pH=8.0, 10 mM 트리스/HCl, 8 M 우레아)에 재현탁하였다. 세포 현탁액을 얼음 상에서 3분 동안 초음파처리하였다. 10,000 x g에서 25분 동안 원심분리한 후, 10 ㎖의 Ni-NTA His 결합 수지(노바겐, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)를 상청액에 첨가하고 회전 진탕기 상에서 60분 동안 혼합하였다.

용해물-수지 혼합물을 5 ㎖의 폴리프로필렌 컬럼(퀴아젠) 상에 적재하고 40 ㎖의 세척 완충제 A(100 mM NaH₂PO₄, pH=6.3, 10 mM 트리스/HCl, 8 M 우레아)로 2회 세척하였다. 10 ㎖의 세척 완충제 B(100 mM NaH₂PO₄, pH=5.9, 10 mM 트리스/HCl, 8 M 우레아)를 사용한 또 다른 2회 세척 단계를 수행한 후, 용출 완충제(100 mM NaH₂PO₄, pH=4.5, 10 mM 트리스/HCl, 8 M 우레아)를 사용하여 용출을 수행하였다. 단백질 혼합물을 10K 분자량 컷-오프 아미콘 울트라-15(Amicon Ultra-15) 원심분리 필터 장치(밀리포어(Milipore), 미국 매사추세츠주 베드포드 소재)로 농축하고, 인자 Xa 절단 완충제(20 mM 트리스/HCl; 200 mM NaCl; 1 mM EDTA, pH=7.4)로 예비 평형화된 하이프렙(HiPrep)(상표명) 26/10 탈염 컬럼(지이 헬쓰케어(GE Healthcare), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 상에 적재하였다. 인자 Xa(5% 중량/중량)의 첨가 전에 10K 분자량 컷-오프 아미콘 울트라-15 원심분리 필터 장치를 이용한 정용여과(diafiltration)을 수회 수행하여 봉입체(inclusion body)를 함유하는 혼탁 분획을 농축하였다.

N-말단 His₆-태그의 정량적 제거는 실온에서 약 3일 이내에 달성하였는데, 이는 SDS-PAGE 분석에 의해 검증되었다. 단백질분해효소로 분해한 후, 가용성 인자 Xa 단백질분해효소 및 His₆-태그 팹티드를 원심분리를 통해 봉입체로부터 분리하였다. 이어서, 단백질을 약 1 ㎖의 가용화 완충제(8 M 우레아, 50 mM 트리스/HCl, pH=8.0, 10 mM DTT)에 용해시키고 가용화 완충제로 예비 평형화된 수퍼덱스(Superdex) 75 10/300 GL 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 주입하였다. AKTA 정제 기구(지이 헬쓰케이) 상에서 크기 배제 크로마토그래피를 0.3 ㎖/분의 유속으로 2회 수행하였다. 재폴딩을 위해, 10K 분자량 컷-오프 슬라이드-에이-라이저(Slide-A-Lyzer) 투석 카세트(피어스(Pierce), 미국 일리노이주 록포드 소재)를 이용하여 재생 완충제(24O mM NaCl; 10 mM KCl; 0.5% 트리톤 X-100; 50 mM 트리스/HCl; 1 mM EDTA, pH=8.0)에 대해 단백질 샘플을 투석하였다. 재폴딩된 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα를 포스페이트-완충 식염수(PBS)에 대해 투석하였다.

천연 조건 하의 wt mTNF α 및 돌연변이체 mTNF α의 정제

천연 조건 하의 모든 정제 단계를 4℃에서 수행하였다. 세포 펠렛을 얼음 상에서 15분 동안 해동한 후, 세포 페이스트를 습윤 중량 1 g 당 5 ㎖의 양으로 용해 완충제(50 mM 트리스/HCl, pH=8.0; 150 mM NaCl, 10% (부피/부피) 글리세롤)에 재현탁하였다. 완전 단백질분해효소 억제제 칵테일(Complete Protease Inhibitor Cocktail)(로슈(Roche), 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재)을 첨가한 후, 10 ㎖의 세포 현탁액을 150 ㎕의 리소자임(100 mg/㎖; 엠피 바이오메디칼스(MP Biomedicals), 미국 캘리포니아주 어빈 소재), 50 ㎕의 DNase I(5 mg/㎖; 로슈), 5 ㎕의 RNase A(100 mg/㎖; 시그마-알드리치, 미국 미조리주 세인트 루이스 소재) 및 125 U의 벤조나제 뉴클레아제(benzonase nuclease)(노바겐)로 처리하였다. 세포 현탁액을 실온에서 20분 동안 교반하여 용해가 일어나게 하였다. 그 후, 예비 용해된 세포를 액체 질소 중에서 즉석-동결하고 37℃ 수조 내에서 해동하였다. 이 동결-해동 주기를 1회 반복하였다. 그 다음, 얼음 상에서 2분 동안 초음파처리하여 완전한 용해를 달성하였다.

18,000 x g에서 20분 동안 원심분리한 후, 1 ㎖의 Ni-NTA His 결합 수지(노바겐)를 상청액에 첨가하고 회전 진탕기 상에서 30분 동안 혼합하였다. 용해물-수지 혼합물을 5 ㎖의 폴리프로필렌 컬럼(퀴아젠) 상에 적재하고 20 ㎖의 용해 완충제로 2회 세척하였다. 2 ㎖의 용출 완충제(50 mM 트리스/HCl, pH8.0; 150 mM NaCl, 250 mM 이미다졸, 10% (부피/부피) 글리세롤)를 사용하여 단백질을 용출하고, 10K 분자량 컷-오프 아미콘 울트라-15 원심분리 필터 장치(밀리포어)로 농축하고, PBS로 예비 평형화된 수퍼덱스 75 10/300 GL 컬럼(0.3 ㎖/분의 유속)으로 더 정제하였다. 더 스크립스 리서치 인스티튜트(The Scripps Research Institute)(미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)의 스크립스 질량 분광측정 센터(Scripps center for Mass Spectrometry)에서 매트릭스로서 시나핀산(sinapinic acid)을 사용하여 보이야거(Voyager)-DE-STR 기구(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems), 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재) 상에서 수행된 MALDI-TOF 질량 분광측정으로 모든 단백질을 특징규명하였다. 천연 조건 하에 정제된 모든 mTNFα 단백질은 25℃에서 PBS 완충제(pH=7.5) 중에서 10 mg/㎖을 초과하는 수준으로 완전한 가용성을 나타내었다.

pNO ₂ Phe ⁸⁶ mTNF α의 조성 및 균질성 분석

이어서, 돌연변이체 단백질의 조성 및 균질성을 SDS-PAGE(도 1c) 및 질량 분광측정(도 1d)으로 분석하였다. pNO₂Phe 특이적 mutRNA_CUA/아미노아실-tRNA 합성효소 쌍과 함께 1 mM pNO₂Phe의 부재(레인 2) 및 존재(레인 3) 하에 mTNFα의 Tyr⁸⁶ 앰버 돌연변이체의 발현이 도 1c에 도시되어 있다. 단백질 샘플을 Ni-NTA 친화성 컬럼으로 정제하여 심플리블루(SimplyBlue)(상표명) 염색을 이용한 SDS-PAGE로 분석하였다. 레인 4는 야생형 mTNFα를 나타내고, 레인 1은 분자량 표준이다. 도 1c에 나타낸 결과는 변성 조건 하에 정제된 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα가 SDS-PAGE 상에서 wt mTNFα와 유사한 이동성을 나타냄을 보여주고, 전장 mTNFα는 돌연변이체 유전자가 pNO₂Phe의 부재 하에 발현되었을 때 전혀 관찰되지 않았는데, 이는 위치 86에서 내재 아미노산의 검출가능한 도입이 없음을 의미한다.

또한, 돌연변이체 단백질의 균질성의 조성을 그의 트립신 분해 단편의 MS/MS 시퀀싱 분석으로 분석하였다(도 1d). 이 절차를 위한 단백질 샘플을 제조하기 위해, pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα를 함유하는 절개된 겔 슬라이스를 작은 조각으로 잘라 100 ㎕의 25 mM NH₄HCO₃/50% 아세토니트릴과 혼합하였다. 10분 동안 볼텍싱(vortexing)한 후, 상청액을 버렸다. 이 단계를 2회 반복한 후, 겔 조각을 스피드 백(Speed Vac)에서 약 20분 동안 건조하였다. 25 mM NH₄HCO₃ 중의 10 mM DTT 25 ㎕를 첨가하여 단백질 샘플을 환원시켰다. 반응을 56℃에서 1시간 동안 진행시켰다. 상청액의 제거 후, 겔 조각을 25 ㎕의 55 mM 요오도아세트아미드와 혼합하였다. 실온에서 암실 내에서 45분 동안 항온처리한 후, 공개된 절차에 기재된 바와 같이 겔 조각에 대해 트립신 인-겔(in-gel) 분해를 수행하였다(문헌[Rosenfeld, et al., (1992) "In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis." Anal Biochem 203:173-179]; 및 문헌[Hellman, et al., (1995) "Improvement of an 'In-Gel' digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing." Anal Biochem 224:451-455]). 생성된 펩티드 혼합물을 C18 집팁(ZipTip)(밀리포어)으로 정제하고 써모 핀니간(Thermo Finnigan) LTQ 질량 분광측정기(써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 미국 뉴저지주 소머셋 소재) 상에서 MS/MS 단편화를 수행하였는데, 이 단편화는 더 스크립스 리서치 인스티튜트(미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)의 스크립스 질량 분광측정 센터에서 나노스프레이 공급원을 사용하여 양성 이온 모드로 실시하였다. 전술한 바와 같이 제조된 8-머 트립신 분해 단편의 MS/MS 분석은 잔기 86에서 pNO₂Phe의 도입을 위한 패턴과 정확히 일치한다(도 1d, 도 12). 팔량체 단편 FAISXQEK의 부분 서열(이때, X는 pNO₂-Phe을 나타냄)은 도 1d에서 해석된 b 또는 y 이온 시리즈로부터 판독될 수 있다. 도 12에서, pNO₂Phe을 함유하는 트립신 분해 단편의 서열은 단문자 코드(X, pNO₂Phe)로 표시된다. y 시리즈 및 b 시리즈의 관찰된 단편 이온이 표시되어 있다. pNO₂Phe의 도입을 입증하는 핵심 y 이온 및 b 이온은 적색으로 표시되어 있다. 모든 질량은 단일동위원소(monoisotopic) 질량으로서 기재되어 있다.

더 스크립스 리서치 인스티튜트(미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)의 스크립스 질량 분광측정 센터에서 매트릭스로서 시나핀산을 사용하여 보이야거-DE-STR 기구(어플라이드 바이오시스템스, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재) 상에서 수행된 MALDI-TOF 질량 분광측정으로 모든 단백질을 특징규명하였다. MALDI-TOF 스펙트럼(표 1, 도 2) 또한 pNO₂Phe 함유 전장 mTNFα의 예측된 분자량([M-H]+: 17286)과 일치하는 피크([M-H]+: 17287)를 보였다. 이 결과는 돌연변이체 mTNFα 내로의 pNO₂Phe의 선별적 도입을 입증한다.

pNO ₂ Phe ⁸⁶ mTNF α의 3차 구조 분석

pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα, Phe⁸⁶ mTNFα, pNO₂Phe⁴² mTNFα, Phe⁴² mTNFα 및 pNO₂Phe¹¹ mTNFα의 3차/4차 구조에 대한 pNO₂Phe 돌연변이의 효과를 측정하기 위해, wt mTNFα 및 돌연변이체 mTNFα 샘플 둘 다를 신속 단백질 액체 크로마토그래피로 분석하였다(표 2). 유도된 Tyr-86, Asp42m 및 Lys-11을 가진 mTNFα 삼량체의 X-선 결정 구조(PDB ID 코드 2TNF)는 도 1b에 도시되어 있다. 모든 단백질 샘플을, 수퍼덱스 75 10/300 GL 겔 여과 컬럼(지이 헬쓰케어)을 사용한 신속 단백질 액체 크로마토그래피(FLPC)로 분석하였다. 0.3 ㎖/분의 유속을 사용하여 25℃에서 PBS 완충제 중에서 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. wt mTNFα 및 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα 둘 다 25℃에서 PBS 완충제(pH=7.5) 중에서 10 mg/ml를 초과하는 농도로 완전한 가용성을 나타내었다. 컬럼을 티로글로불린(670 kDa), 감마 글로불린(158 kDa), 오브알부민(44.0 kDa), 미요글로불린(17.0 kDa) 및 비타민 B-12(1.35 kDa)가 함유된, 바이오-라드로부터 입수한 분자량 겔-여과 표준물(바이오-라드 랩스(Bio-Rad Labs), 미국 캘리포니아주 허큘레스 소재)로 보정하였다. 단백질 용출을 수행한 후 용출된 분획의 흡광도를 280 nm에서 측정하였다.

wt mTNFα 및 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα 둘 다 이들의 삼량체 형태와 일치하는 분자량에 상응하는 유사한 체류 시간을 보였다. 수퍼덱스 75 10/300 GL 겔 여과 컬럼 상에서의 체류 시간에 대한 단백질 표준물의 분자량의 로그 곡선은 도 4에 도시되어 있다. 티오글로불린(670 kDa)은 보정을 위해 생략하였는데, 이는 그의 분자량이 수퍼덱스 75 10/300 GL 컬럼의 분리 범위(3 kDa 내지 70 kDa)를 많이 벗어나 있기 때문이었다. 도 4에 도시된 곡선에 기초하여, 4차 구조의 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα, wt mTNFα, mTNFα F⁸⁶, pNO₂Phe⁴² mTNFα, mTNFα F⁴² 및 pNO₂Phe¹¹ mTNFα의 분자량을 측정하고 표 2(하기)에 나타내었다. 단량체 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα는 41.47분의 체류 시간에서 용출되었다.

pNO₂Phe⁸⁶ TNFα, Phe⁸⁶ mTNFα, pNO₂Phe⁴² mTNFα, Phe⁴² mTNFα, pNO₂Phe¹¹ mTNFα 및 WT mTNFα의 4차 구조를, 수퍼덱스 75 10/300 GL 겔 여과 컬럼 상의 체류 시간에 대한 단백질 표준물의 분자량의 로그 곡선에 기초하여 결정하였다.

pNO ₂ Phe ⁸⁶ mTNFα의 생물학적 활성의 분석

단백질의 생물학적 활성은 NFκB-루시퍼라제 레포터 세포주에서 NFκB 경로의 mTNFα-유도된 활성화를 측정함으로써 분석하였다. NFκB-루시퍼라제를 안정하게 발현하는 HEK293 세포를 레포터 유전자 분석에서 사용하였다(문헌[Ye, et al., (2000) "ER Stress Induces Cleavage of Membrane-Bound ATF6 by the Same Proteases that Process SREBPs" Mol Cell 6:1355-1364]). 안정한 세포를 트립신으로 탈착시키고, 10% FBS가 함유된 DMEM에 5 x 10⁵ 세포/ml로 재현탁하고, 384-웰 백색 플레이트(그레이너(Greiner), 미국 플로리다주 롱우드 소재) 내에 20 ㎕/웰로 플레이팅하였다. 37℃ 조직 배양 항온처리기 내에서 5% CO₂ 하에 2시간 동안 항온처리한 후, 20 ㎕의 TNFα를 세포에 첨가하였다. 세포를 24시간 동안 계속 항온처리하였다. 20 ㎕ 브라이트-글로(Bright-Glo)(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)를 첨가하여 루시퍼라제 활성을 측정하고, 발광 플레이트 판독기를 이용하여 플레이트를 판독하였다. 분석 결과는 wt mTNFα가 NFκB-루시퍼라제 레포터 세포주에서 NFκB 신호전달을 활성화하였음을 보여주었다. 대조적으로, pNO₂Phe⁸⁶ 돌연변이체(도 5)는 이 분석에서 wt mTNFα의 활성의 2%만을 나타내었는데, 이는 Tyr⁸⁶이 수용체 결합을 위해 필수적이고 잔기 86에서의 다양한 돌연변이가 활성의 상당한 손실을 초래한다는 앞선 보고와 일치한다(문헌[Van Ostade, et al., (1994) "Structure-activity studies of human tumour necrosis factors" Protein Engineering 7:5-22]; 문헌[Loetscher, et al., (1993) "Human tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) mutants with exclusive specificity for the 55-kDa or 75-kDa TNF receptors" J Biol Chem 268:26350-7]; 및 문헌[Zhang, et al., (1992) "Site-directed mutational analysis of human tumor necrosis factor-alpha receptor binding site and structure-functional relationship" J Biol Chem 267:24069-75]). 하나의 추가적 피크 또한 MALDI-TOF 스펙트럼에서 발견되었는데, 이는 아마도 인자 Xa 단백질분해 절단 단계 동안의 과다-분해로 인한 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα의 처음 2개 아미노산의 결실에 상응한다(표 1, 도 2). 전장 단백질로부터 이 말단절단된(truncated) 단백질을 분리하기 어렵고 상기 처음 2개의 N-말단 아미노산의 결실이 TNF 활성에 미미한 영향만을 미치기 때문에(문헌[Van Ostade, et al., (1994) "Structure-activity studies of human tumour necrosis factors" Protein Engineering 7:5-22]), 혼합물을 직접 사용하여 돌연변이체 mTNFα 및 wt 대조군 둘 다에 대해 마우스를 면역화시켰다.

N-말단 His₆-태그의 존재 또는 부재가 면역화 결과에 전혀 영향을 미치지 않음을 보여주기 위해 추가적 실험을 수행하였다(도 13). 5마리의 Bcl-2 마우스, 예를 들어, #3262, #3263, #3264, #3331 및 #3351을 2군으로 무작위 분류하고 RIMMS(다중 부위에서의 반복적 면역화) 프로토콜(하기 기재됨)을 이용하여 His₆-Phe⁸⁶ mTNFα(wt) 또는 His₆-pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα를 주사하였다. 요약하건대, 마우스를 18일에 걸쳐 8회 주사하였다. 각각의 주사에서, 200 ㎕ PBS 중의 5 ㎍ 단백질을 제1 주사를 수행하기 위해 완전 프로인트 보조제(CFA)와 1:1로 혼합하거나, 또는 말초 림프절에 인접한 6개의 특정 부위에서 남은 주사를 수행하기 위해 불완전 프로인트(IFA)와 1:1로 혼합하였다. 21일째 날, 염소 항-마우스 IgG 2차 항체의 호스라디쉬 퍼록시다제 접합체를 사용한 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)으로 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα 및 Phe⁸⁶ mTNFα에 대한 항체 역가를 측정하였다. 도 13을 참조한다. 이 도면에서, 면역화 전, 마우스 혈청을 100배(1:100 전) 희석하고, 면역화 후, 마우스 혈청을 1,000배(1:1 K 후) 또는 10,000배(1:10 K 후) 희석하고 ELISA를 수행하였다. ELISA 플레이트를 wt mTNFα(wt, 첫 번째 3개의 막대) 또는 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα(mod, 마지막 3개의 막대)로 코팅하였다.

pNO ₂ Phe ⁸⁶ mTNFα로 면역화된 마우스에서 pNO ₂ Phe ⁸⁶ mTNFα 또는 wt mTNFα에 대한 혈청 역가 분석

mTNFα 넉아웃 마우스는 생존가능하고 명백한 표현형적 이상을 보이지 않는는데(문헌[Pasparakis, et al., (1996) "Immune and inflammatory responses in TNF alpha-deficient mice: a critical requirement for TNF alpha in the formation of primary B cell follicles, follicular dendritic cell networks and germinal centers, and in the maturation of the humoral immune response." J Exp Med 184: 1397-1411]), 이는 마우스가 TNFα에 대한 중화 면역 반응에서 생존하여 백신접종된 마우스가 항-TNFα 항체 생성 및 생물학적 활성에 대해 분석될 수 있게 할 것임을 암시한다. pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα 돌연변이체의 면역원성을 측정하기 위해, 32마리의 C57BL/6 마우스를 3개의 군으로 분류하고 각각 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα, wt mTNFα 및 PBS 완충제로 주사한 후, RIMMS(다중 부위에서의 반복적 면역화) 프로토콜(문헌[Kilpatrick, et al., (1997) "Rapid development of affinity matured monoclonal antibodies using RIMMS" Hybridoma 16:381-389])을 수행하였다. mTNFα의 세포독성으로 인한 불리한 효과를 피하기 위해, 주사당 5 ㎍ 투여량의 mTNFα를 본 연구 전체에서 사용하였다(문헌[Libert, et al., (1999) "Identification of a locus on distal mouse chromosome 12 that controls resistance to tumor necrosis factor-induced lethal shock" Genomics 55:284-289]). 도 6은 PBS(6A); wt mTNFα(6B); pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα(6C); 또는 Phe⁸⁶ mTNFα(6D)로 면역화된 C57BL/6 마우스에 대한 혈청 역가를 보여준다. 요약하면, 마우스를 17일에 걸쳐 8회 주사하였다. 각각의 주사에서, 200 ㎕ PBS 중의 5 ㎍ 단백질을 제1 주사를 수행하기 위해 완전 프로인트 보조제(CFA)와 1:1로 혼합하거나, 또는 말초 림프절에 인접한 6개의 특정 부위에서 남은 주사를 수행하기 위해 불완전 프로인트 보조제(IFA)와 1:1로 혼합하였다. 21일째 날, 염소 항-마우스 IgG 2차 항체의 호스라디쉬 퍼록시다제 접합체를 사용한 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)으로 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα 및 wt mTNFα에 대한 항체 역가를 측정하였다.

ELISA를 수행하기 위해, 맥시소르프(Maxisorp) 384-웰 플레이트(넌크, 미국 뉴욕주 로체스터 소재)를 4℃에서 0.5 ㎍/ml 단백질 30 ㎕로 코팅하였다. 코팅된 플레이트를 PBS + 0.05% 트윈 20(PBST)으로 세척하고, PBS 중의 1% BSA 80 ㎕로 블로킹하고 PBST로 다시 세척하였다. 상기 플레이트를 PBS 중의 1% BSA 중에 희석된 1차 항체 또는 혈청 20 ㎕, HRP-접합된 염소 항-마우스 IgG 20 ㎕(잭슨 이뮤노리서치 라보라토리스(Jackson ImmunoResearch Laboratories), 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브 소재), 및 TMB 기질 20 ㎕(케이피엘(KPL), 미국 매릴랜드주 가이터스버스 소재)와 함께 순차적으로 항온처리하고, 650 nm에서 흡광도를 판독하였다. 상기 플레이트를 항온처리 사이에 PBST로 세척하였다.

wt mTNFα(도 6A 및 6B, 좌측 막대) 또는 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα(도 6A 및 6B, 우측 막대)에 대해 ELISA를 측정하였다. Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 마우스의 경우, wt mTNFα(도 6C 및 6D, 좌측 막대) 또는 Phe⁸⁶ mTNFα(도 6C 및 6D, 우측 막대)에 대해 ELISA를 측정하였다. 측정 전, 혈청 샘플을 PBS 완충제 중의 1% BSA로 1/1000 비율로 희석하였다. wt mTNFα 또는 PBS 완충제 단독으로 면역화된 마우스는 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα 및 wt mTNFα 둘 다에 대한 무의미한 혈청 IgG 역가를 보였다(도 6). 이것은 wt mTNFα가 자가 단백질이고 뮤린 면역 시스템이 이에 대해 내성을 나타내어야 하기 때문에 예측되는 결과이었다. 대조적으로, pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 마우스는 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα(도 6C, 막대 쌍 각각에서 우측 막대) 및 wt mTNFα(도 6C, 막대 쌍 각각에서 좌측 막대) 둘 다에 대한 현저히 높은 혈청 역가를 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서, (단량체 분자량을 29 Da만큼 변화시키는) 단일 pNO₂Phe 돌연변이는 wt mTNFα와 고도로 교차 반응하는 항체를 생성하는 강한 면역학적 반응을 유도하였다. Bcl-2 마우스를 사용하였을 경우 유사한 결과가 얻어졌는데, 이는 상기 결과가 균주 의존적이 아님을 암시한다(도 7). 또한, RIMMS 프로토콜은 제1 주사의 경우 CFA의 존재 하에 및 남은 7회 주사의 경우 IFA의 존재 하에 17일의 기간에 걸쳐 8회 주사(5 ㎍의 단백질/주사)를 포함한다. ELISA는 wt mTNFα(4개 막대로 구성된 군 각각에서 제2 막대 및 제1 막대) 또는 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα(4개 막대로 구성된 군 각각에서 제4 막대 및 제3 막대)에 대해 측정되었다. 측정 전, 혈청 샘플을 PBS 완충제 중의 1% BSA로 1/100 또는 1/1,000 비율로 희석하였다.

추가로, 본 발명자들은 강한 면역증강제의 부재 하에 면역원성을 조사하였고 임의의 보조제의 부재 하에 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα를 사용한 Bcl-2 마우스의 면역화 또한 유의한 항-TNFα 역가를 유도함을 확인하였는데(도 8), 이는 이 방법이 강한 보조제가 바람직하지 않은 치료 환경에 이용될 수 있음을 암시한다. CFA 또는 IFA의 부재 하에 17일의 기간에 걸쳐 8회 주사(5 ㎍의 단백질/주사)의 경우 (a) wt mTNFα 또는 (b) pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 Bcl-2 마우스에 대한 혈청 역가를 조사하였다. wt mTNFα(막대 쌍 각각에서 좌측 막대) 또는 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα(막대 쌍 각각에서 우측 막대)에 대해 ELISA를 측정하였다. 측정 전, 혈청 샘플을 PBS 완충제 중의 1% BSA로 1/1,000 비율로 희석하였다.

나아가, pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα를 사용한 순차적인 8회 면역화를 수행한 후 항체 반응의 지속은 19주 후 가장 강력한 것으로 확인되었다(도 14). 이러한 긴 지속성은 임상적 사용을 위해 매우 바람직한데, 이는 현재 방법들이 면역화를 중단하였을 경우 자가 항체 역가가 급격히 감소하는 문제점을 종종 갖기 때문이다. 도 14는 혈청 역가 지속성의 측정 결과를 보여준다. 실험을 수행하기 위해, 3마리의 Bcl-2 형질전환 마우스를 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화시켰다. 순차적인 8회 면역화 후, 정해진 시점에서 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα에 대한 ELISA 분석을 수행하기 위해 혈액을 채취하였다. 각각의 측정 전, 혈청 샘플을 PBS 완충제 중의 1% BSA로 1:100 비율로 희석하였다. Δt는 마지막 면역화와 채혈 사이의 시간에 상응한다.

면역학적 반응이 비천연 아미노산의 면역원성 니트로아릴 기의 결과인지를 검증하기 위해, Tyr⁸⁶→Phe 돌연변이체 mTNFα(Phe⁸⁶ mTNFα)를 발생시켰다. 크기-배재 크로마토그래피에 의한 삼량체 4차 구조의 확인 후, Bcl-2 마우스를 CFA/IFA의 존재 또는 부재 하에 상기 돌연변이체로 면역화시켰다. 보조제 없이 면역화된 마우스의 경우, RIMMS 프로토콜은 17일의 기간에 걸친 8회 주사(5 ㎍의 단백질/주사)를 포함하였다. 보조제로 면역화된 마우스의 경우, CFA를 제1 주사를 위해 사용하였고, IFA를 남은 7회 주사를 위해 사용하였다. wt mTNFα(도 9, 4개의 막대로 구성된 군 각각에서 제2 막대 및 제1 막대) 또는 Phe⁸⁶ mTNFα(도 9, 4개의 막대로 구성된 군 각각에서 제4 막대 및 제3 막대)에 대한 ELISA를 측정하였다. 측정 전, 혈청 샘플을 PBS 완충제 중의 1% BSA로 1/100 또는 1/1,000 비율로 희석하였다. 두 경우, 예를 들어, 보조제의 존재 또는 부재의 경우, 유의한 항-TNFα 역가가 전혀 발생되지 않았는데, 이는 NO₂ 기가 면역 내성의 파괴를 위해 필요함을 의미한다(도 6D 및 9). 나아가, pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα에 대해 특이성을 나타내는 CD₄ ⁺ T 세포는 마우스가 이 돌연변이체 단백질로 면역화된 경우에만 유도되었고 마우스가 wt mTNFα 또는 Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 경우에는 유도되지 않았다(도 15A). 대조적으로, pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 Bcl-2 마우스로부터 유래된 CD₄ ⁺ T 세포가 시험관내에서 wt mTNFα로 자극받았을 경우 유의한 증식이 관찰되지 않았다(도 15B). T 세포 증식 분석을 수행하기 위해, 면역화된 마우스로부터 유래된 CD₄ ⁺ T 세포를 MACS 비드(밀테니이 바이오텍(Miltenyi Biotec))를 사용한 자기 소모(magnetic depletion)로 림프절로부터 단리하였다. 이어서, T 세포를 천연 Bcl-2 마우스로부터 유래된 방사선조사된 비장세포 및 증가하는 양의 항원이 함유된 배양물 내로 배치하였다. 배양물을 48시간 동안 항온처리한 후 [³H]-티미딘을 사용하여 밤새 펄스(pulse)하였다. 배양물 플레이트를 필터 매트 상으로 수거하고, 방사성을 탑카운트 신틸레이션 카운터(TopCount scintillation counter)(퍼킨엘머(PerkinElmer))로 정량하였다.

mTNFα 돌연변이체 및 wt mTNFα의 펩티드 단편을 사용한 예비 에피토프 맵핑 실험은 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα에 대한 다클론 반응이 다수의 단백질 에피토프를 수반함을 보여준다. 또한, 이 결과는 mTNFα의 서열 내로의 pNO₂Phe의 삽입이 T 세포 에피토프를 생성하고, 이 T 세포 에피토프가 이 질환 관련 자가 단백질에 대한 효과적인 면역 반응이 유발되도록 T 세포 보조를 증강시킴을 암시한다. 다른 면역화 프로토콜(예를 들어, 돌연변이체 및 wt TNFα를 사용한 순차적 면역화) 또한 고역가 교차 반응성 항체를 생성할 수 있다. 이 결과는 면역우성 T-헬퍼 세포 에피토프를 mTNFα 내로 도입하여 면역 내성을 파괴한 문헌[Dalum, et al., (1999) "Therapeutic antibodies elicited by immunization against TNF-alpha." Nat Biotechnol 17: 666-669]의 결과와 일치한다. 그러나, 현재 방법은 단백질에서 약간의 혼란만을 야기하고 단백질의 3차 폴드를 파괴하지 않아야 하거나 발현, 가용성 또는 안정성에 현저한 영향을 주지 않아야 한다.

Tyr⁸⁶을 둘러싸는 폴리펩티드 서열은 TNFα에서 잠재적 MHC 클래스 II DR 에피토프의 인 실리코(in silico) 서열 기초 분석에 기초할 때 T 세포 에피토프인 것으로 예측되지 않는다(문헌[Steed, et al., (2003) "Inactivation of TNF Signaling by Rationally Designed Dominant-Negative TNF Variants." Science 301: 1895-1898]). 그럼에도 불구하고, 이 방법의 일반성 조사를 시작하기 위해, 본 발명자들은 다른 부위에서 pNO₂Phe의 치환이 유사한 효과를 나타내는지를 확인하였다. 따라서, 삼량체화 또는 수용체 결합에 관여하지 않는 표면 노출된 잔기 Asp⁴²를 pNO₂Phe으로 돌연변이시켰다. SDS-PAGE 및 질량 분광측정으로 돌연변이를 확인한 후, C57BL/6 마우스의 2개 군을 pNO₂Phe⁴² mTNFα 또는 Phe⁴² mTNFα 돌연변이체로 면역화시켰다(도 10). RIMMS 프로토콜은 보조제의 부재 하에 17일의 기간에 걸친 8회 주사(5 ㎍의 단백질/주사)를 포함하였다. wt mTNFα(도 10A, 3개의 막대로 구성된 군 각각에서 제1 막대; 도 10B, 막대 쌍 각각에서 제1 막대), pNO₂Phe⁴² mTNFα/pNO₂Phe¹¹ mTNFα(도 10A, 3개의 막대로 구성된 군 각각에서 제2 막대; 도 10B, 막대 쌍 7, 8 및 9 각각에서 제2 막대), Phe⁴² mTNFα(도 10A, 막대 군 각각에서 제3 막대) 또는 PBS(도 10B, 막대 쌍 5 및 6 각각에서 제2 막대)에 대해 ELISA를 측정하였다. 측정 전, 혈청 샘플을 PBS 완충제 중의 1% BSA로 1/100(도 10A) 또는 1/800(도 10B) 비율로 희석하였다. 또한, 유의한 항-TNFα 역가는 pNO₂Phe⁴² mTNFα를 사용한 면역화에 의해서만 유도되었다. 즉, pNO₂Phe⁴² mTNFα로 면역화된 마우스만이 유의한 항-TNFα 역가를 유도하였다. 이 결과는 pNO₂Phe 돌연변이유발이 특정 자가 항원 또는 외래 항원이 고도의 면역원성을 나타내게 하는 꽤 일반적인 방법일 것임을 암시한다.

유사한 결과는 또 다른 표면 노출된 잔기 Lys¹¹를 pNO₂Phe으로 돌연변이시켜 수득하였다. 이 결과는 pNO₂Phe 돌연변이유발이 특정 자가 항원 또는 외래 항원이 고도의 면역원성을 나타내게 하는 꽤 일반적인 방법일 수 있고 표면 노출된 Tyr 또는 Phe 잔기에서의 치환으로 제한되지 않을 수 있음을 암시한다. 그러나, 예비 연구는 pNO₂Phe의 도입이 위치 104 및 19에서 보다 덜 효과적임을 암시한다. pNO₂Phe¹⁰⁴ mTNFα를 사용한 C57BL/6 마우스의 면역화는 천연 mTNFα와의 유의한 교차 반응성을 결여한 항체를 발생시켰다. 따라서, 상기 내용의 효과는 면역 반응의 성질을 결정함에 있어서 중요하다. 마지막으로, 다른 유전적으로 코딩된 면역원성 아미노산도 유리하게 사용될 수 있을 것이고, 대안적으로 보다 작은 항원의 경우, 면역원성 비천연 아미노산이 반합성 또는 전체 펩티드 합성에 의해 도입될 수 있을 것이다.

LPS 자극에 대한 pNO ₂ Phe ⁸⁶ mTNF α-면역화된 마우스의 반응 분석

다음으로, 본 발명자들은 pNO₂Phe⁸⁶ TNFα를 사용한 마우스의 백신접종이 중증 내독소혈증 마우스 모델에서 리포폴리사카라이드(LPS) 자극으로부터 보호할 것인지를 확인하였다(문헌[F. Niessen, et al., (2008) "Dendritic cell PAR-S1P3 signalling couples coagulation and inflammation." Nature 452: 654-658]). 이 모델에서 LPS에 의해 유도된 패혈증 쇼크는 TNFα의 생성 및 방출에 관여하는 것으로 공지되어 있었다. 마우스 내독소혈증을 연구하기 위한 모든 실험은 국립 동물 건강 보호회의 지침에 따라 수행하였고 더 스크립스 리서치 인스티튜트의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인받았다. 리포폴리사카라이드(LPS, 이. 콜라이 O111:B4, 칼바이오켐(Calbiochem)/이엠디 바이오사이언시스(EMD Biosciences), 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)를 초음파처리 2분 전 및 2분 후 30초 동안 볼텍싱함으로써 37℃ 일반 식염수(0.9% 중량/부의 NaCl)에 용해시켰다. 수동 면역화를 위해 9주령 시점에서 2% 이소플루란 하에, 잭슨 라보라토리스(미국 메인주 바 하버 소재)로부터 입수한 수컷 C57BL/6 마우스에게 7.5 mg/kg LPS를 복강내 주사하고, 능동 면역화를 위해 15주령 시점에 2% 이소플루란 하에 8.5 mg/kg LPS로 복강내 주사하였다. 모든 실험은 안정한 조건(20 내지 22℃의 온도 및 40 내지 60%의 상대 습도) 하에 12시간의 명주기 및 암주기를 교대로 반복하면서 실내에서 수행하였다. 능동 면역화 또는 수동 면역화를 제공받은 마우스의 캐플란-메이에르(Kaplan-Meier) 생존 곡선은 도 11에 도시되어 있다. 캐플란-메이에르 곡선을 작도하여 생존 차이를 로그 등급 시험을 이용하여 분석하였다.

C57BL/6 마우스를 PBS, wt mTNFα 및 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화시켰다. 이어서, 상기 면역화 계획의 완결로부터 3일 후 상기 마우스에게 LPS(8.5 mg/kg)를 복강내 주사하고, 마우스의 생존율을 측저하였다. 도 11A에서, pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα 또는 wt mTNFα로 면역화된 마우스(군당 8마리)를 모의(sham) 면역화를 제공받은 7마리 마우스와 비교하였다. 야생형에 비해 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 마우스의 생존 이점이 보여진다(p<0.01). 도 11B에서, pNO₂Phe mTNFα 또는 야생형 mTNFα로 면역화된 마우스로부터 정제된 IgG 100 ㎍을 주사받은 마우스(군당 8마리)를, 식염수를 주사받은 대조군과 비교하였다. 야생형에 비해 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 마우스의 생존 이점이 보여진다(p<0.01). 도 11C에서, pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα 또는 야생형 mTNFα로 면역화된 마우스로부터 모은 합쳐진 혈청 100 ㎕를 제공받은 마우스(군당 6마리)를, 식염수를 주사한 대조군과 비교하였다. 야생형에 비해 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 마우스의 생존 이점이 보여진다(p<0.01). 대조군 마우스에게는 동일한 부피의 생리 식염수를 주사하였다.

도 11A에 나타낸 바와 같이, pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 마우스는 PBS 면역화를 제공받은 마우스 및 wt mTNFα 면역화를 제공받은 마우스(12.5% 생존율)보다 유의하게 더 높은 생존 이점(87.5%)을 보였다. 유사하게, pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 예비 면역화된 Bcl-2 마우스로부터 모은 합쳐진 혈청(100 ㎕) 또는 정제된 IgG 항체(4 mg/kg)를 제공받은 C57BL/6 마우스는 wt mTNFα로 면역화된 Bcl-2 마우스로부터 모은 합쳐진 혈청 또는 IgG를 제공받은 마우스(16.7 내지 25.0%)보다 유의하게 더 높은 생존율(83.3 내지 87.5%)을 보였다(도 11B 및 11C). 따라서, 이 결과는 자가 단백질의 단일 NO₂Phe 돌연변이체가 질환 모델에서 보호성을 나타내는, 천연 단백질에 대한 강력한 교차 반응성 항체 반응을 유도함을 입증한다. 본 발명자들은 현재 이 연구를 콜라겐-유도된 관절염(CIA) 모델 및 KRN 형질전환 마우스(K/BxN) 모델(문헌[Ditzel (2004) "The K/BxN mouse: A model of human inflammatory arthritis." Trends Mol Med 10: 40-45])을 포함하는 다른 TNFα 의존적 모델까지 확장하고 있다.

전술한 주사에서 사용된 IgG 항체는 뮤린 혈청을 10 ㎖ 세파로스-접합된 단백질 G 친화성 컬럼(감마바인드 플러스 세파로스(GammaBind Plus Sepharose), 파마시아 바이오텍(Pharmacia Biotech), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 상에 적재하여 제조하였다. 상기 컬럼을 3배 컬럼 부피의 PBS(pH=7.4)로 세척하였다. 2배 컬럼 부피의 0.1 M 아세트산(pH=3.0)으로 용출을 수행하였다. 이어서, 용출물을 1 M 트리스/HCl(pH=9.0)로 중화하고 PBS(pH=7.4) 내로 투석하였다.

내독소 자극 24시간 전, 마우스를 수동 면역화시켰다. 제1 실험에서, pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα 또는 wt mTNFα로 면역화된 마우스로부터 얻은 합쳐진 혈청 100 ㎕를 마우스에게 복강내 주사하였다. pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα 또는 wt mTNFα로 면역화된 마우스의 혈청으로부터 정제된 IgG 4 mg/kg을 제2 군에게 제공하였다. 대조군 마우스에게는 동일한 부피의 식염수를 주사하였다.

상기 발견은 Tyr⁸⁶을 pNO₂Phe으로 치환시킨 단일 돌연변이(wt 단백질과의 유일한 차이점은 용매에 노출된 부위에서 -OH가 -NO₂ 기로 치환되었다는 것임)가 단백질의 면역원성을 급격히 증강시키고 TNFα 의존적 마우스 모델에서 중화 항체 반응을 유도함을 입증한다. 잔기 86 및 매우 인접한 잔기 85를 Ala으로 돌연변이시키는 것은 pNO₂Phe 또는 wt 단백질에 대한 항체 역가에 대해 거의 영향을 미치지 않았는데, 이는 항체가 불연속적인 에피토프를 인식함을 암시한다. 이 결과는 자연 발생 단백질에서 발견되지 않는 고도의 면역원성 잔기인 독특한 NO₂ 기를 보유하는 단백질이 면역 시스템에 의해 외래 항원으로 인식될 것임을 암시한다. 구조가 매우 유사하기 때문에, 유도된 항체들은 상응하는 자가 단백질과 교차 반응함으로써 면역 내성을 파괴한다.

본 실시예는 예를 들어, 백신 제조를 위해 pNO₂Phe을 예를 들어, 표적 자가 단백질 내의 단백질 에피토프 내로 부위 특이적으로 도입함으로써 면역학적 자가 내성을 파괴할 수 있음을 보여준다. 변경된 단백질이 자가 항체를 유도할 수 있음이 꽤 오랫동안 공지되어 있었다 하더라도, 단백질이 면역원성을 띠게 하는 변화의 불충분하게 정의된 성질은 단백질의 제조 및 치료적 용도를 복잡하게 만든다(문헌[Lemer, et al., (1968) "The induction of acute glomerulonephritis in rabbits with soluble antigens isolated from normal homologous and autologous urine" J Immunol 100:1277-1287]). 예를 들어, 웨이글(Weigle)의 연구에서 사용된 아라사닐-설파닐-트리오글로불린(arsanil-sulfanil-thryoglobulin) 제제는 트리오글로불린 1 분자 당 약 50개의 아조 결합을 함유하였고(문헌[Weigle (1965) "The production of thyroiditis and antibody following injection of unaltered thyroglobulin without adjuvant into rabbits previously stimulated with altered thyroglobulin" J Exp Med 122:1049-1062]), 이는 고도의 이종성을 나타내고 가능하게는 응집된 또는 부분적으로 폴딩되지 않은 항원을 발생시켰다. 유사하게, 항원의 다양한 위치에서 T 세포 에피토프의 삽입은 천연 단백질에 비해 변경된 3차 구조, 가용성 및 안정성을 나타내는 단백질을 생성할 수 있다. 대조적으로, 여기서 만들어진 변화는 화학적으로 정의되고 단일 잔기로 국한된다. 게다가, 이 돌연변이들은 단백질의 전체적인 4차 구조에 영향을 미치지 않는 듯하며 단백질의 가용성에도 영향을 미치지 않는 듯하다. 따라서, 생성된 항체는 천연 단백질에서 상응하는 에피토프를 인식할 가능성이 더 높다. 마지막으로, pNO₂Phe 함유 TNFα 돌연변이체는 강한 보조제를 필요로 하지 않으면서 보호적 교차 반응성 면역 반응을 유도하고 4개월 이상 동안 높은 역가를 발생시키는데, 이는 본 방법의 치료적 적용을 촉진할 수 있는 성질이다.

본 방법은 단백질 폴딩 질환(예를 들어, 아밀로이드-베타1-42 펩티드) 또는 암과 관련된 자가 단백질을 포함하는 다른 자가 단백질에도 적용될 수 있다. 또한, 본 방법은 pNO₂Phe 기를 면역원성이 약한 에피토프 또는 침묵(silent) 에피토프에 도입함으로써 바이러스, 박테리아 또는 연충 감염에 대한 중화 항체를 발생시키는 것으로 예측되는 병원체의 영역(예를 들어, 말라리아의 CS1 단백질 또는 HIV-1 gp41의 E410 에피토프)에 대한 강한 항체 반응의 발생을 허용할 수도 있다. 나아가, 단백질 내로의 면역원성 아미노산의 선별적 도입은 역사적으로 강한 항체 반응을 발생시키기 어려운 G 단백질 커플링 수용체 및 다른 막 결합된 수용체의 기능성 항체, 예를 들어, 작용제 또는 길항제의 발생을 촉진할 수 있다. 이 현상에 대한 구조적 근거 및 인간 질환에의 상기 현상의 적용 조사가 현재 밝혀지고 있다.

실시예 1의 도면에 나타낸 결과의 설명

도 1은 mTNFα 내로의 pNO₂Phe의 도입을 확인하기 위해 수행된 실험의 결과를 보여준다. 도 1a는 비천연 아미노산 pNO₂Phe의 구조를 보여준다. 도 1b는 표시된 Tyr-86, Asp-42 및 Lys-11을 가진 mTNFα 삼량체의 X-선 결정 구조를 제공한다(PDB ID 코드 2TNF). 도 1c는 mTNFα의 Tyr⁸⁶ 앰버 돌연변이체의 발현이 pNO₂Phe-특이적 mutRNA_CUA/아미노아실-tRNA 합성효소 쌍과 함께 1 mM pNO₂Phe의 존재 하에(레인 3) 일어나지만 부재 하에(레인 2)서는 일어나지 않음을 확인하기 위해 수행된 실험의 결과를 보여준다. 도 1c에서 단백질 샘플은 변성 조건 하에 Ni-NTA 친화성 컬럼으로 정제되고 심플리블루 염색을 사용한 SDS/PAGE로 분석하였다. 레인 4는 wt mTNFα를 함유하고, 레인 1은 분자량 표준물이다. pNO₂Phe mTNFα 돌연변이체는 도 1d에서 특징규명되어 있다. 팔량체 단편 FAISXQEK의 텐덤(tandem) 질량 스펙트럼이 제공되고, 이때 X는 pNO₂Phe을 표시한다. 상기 팔량체 단편은 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα의 트립신 분해로부터 생성되었다. pNO₂Phe을 함유하는 팔량체의 부분 서열은 해석된 b 또는 y 이온 시리즈로부터 판독될 수 있다.

mTNFα 내로의 pNO₂Phe의 도입을 확인하고 pNO₂Phe의 도입이 비천연 TNFα의 4차 구조에 영향을 미치지 않음을 보여주기 위해 여러 실험을 수행하였다. 도 2는 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα의 MALDI-TOF 질량 분광측정 분석의 결과를 제공하고, 도 3은 wt mTNFα의 MALDI-TOF 질량 분광측정 분석의 결과를 제공한다. 도 2에서 피크는 비천연 TNFα의 질량이, pNO₂Phe 잔기가 도입되었음을 암시함을 확인시켜준다. 도 4는 Tyr⁸⁶→pNO₂Phe 치환이 돌연변이체 mTNFα 단백질의 3차 구조에 대해 미치는 영향을 확인하기 위해 수행된 FPLC 실험의 결과를 보여준다. 돌연변이체는 이 돌연변이체가 삼량체화됨을 암시하는 시점에서 용출되었다.

돌연변이체 TNFα에 대한 활성 분석 또한 수행하였다. 도 5는 wt mTNFα(사각형), pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα(삼각형), pNO₂Phe⁴² mTNFα(역삼각형), Phe⁸⁶ mTNFα(마름모형) 및 Phe⁴² mTNFα(원형)의 NFκB-루시퍼라제 활성 분석의 결과를 보여준다. 비천연 TNFα의 활성은 wt TNFα와 비교할 때 감소된다.

PBS로 면역화된 C57BL/6 마우스에 대한 혈청 역가는 도 6A에 표시되어 있고, wt mTNFα로 면역화된 마우스에 대한 혈청 역가는 도 6B에 표시되어 있으며, pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 마우스에 대한 혈청 역가는 도 6C에 표시되어 있고, Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 마우스의 혈청 역가는 도 6D에 표시되어 있다. wt mTNFα 또는 PBS 완충제 단독으로 면역화된 마우스는 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα 및 wt mTNFα 둘 다에 대한 무의미한 혈청 IgG 역가를 보였다. 이것은 wt mTNFα가 자가 단백질이고 뮤린 면역 시스템이 이에 대한 내성을 나타내어야 하기 때문에 예측되는 결과이었다. 대조적으로, pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 마우스는 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα에 대한 현저히 높은 혈청 역가를 나타내는 것으로 확인되었다.

프로토콜은 제1 주사의 경우 완전 프로인트 보조제(CFA)의 존재 하에 및 나머지 주사의 경우 불완전 프로인트 보조제(IFA)의 존재 하에 17일의 기간에 걸쳐 8회 주사(5 ㎍ 단백질/주사)를 포함하였다. wt mTNFα(막대 쌍 1 내지 32 각각에서 좌측 막대) 및 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα(막대 쌍 1 내지 32 각각에서 우측 막대)에 대해 ELISA를 측정하였다. Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 마우스의 경우(도 6D), wt mTNFα(막대 쌍 33 내지 36 각각에서 좌측 막대) 또는 Phe⁸⁶ mTNFα(막대 쌍 33 내지 36 각각에서 우측 막대)에 대해 ELISA를 수행하였다. 측정 전, 혈청 샘플을 PBS 완충제 중의 1% BSA로 1:1,000 비율로 희석하였다.

상기 결과와 유사한 결과가 Bcl-2 마우스를 사용한 경우 얻어졌는데, 이는 이 결과가 균주 의존적이 아님을 암시한다. 도 7은 wt mTNFα 또는 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 Bcl-2 마우스의 경우 wt mTNFα 및 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα에 대한 혈청 역가 수준을 보여준다. RIMMS 프로토콜은 제1 주사의 경우 CFA의 존재 하에 및 나머지 7회 주사의 경우 IFA의 존재 하에 17일의 기간에 걸쳐 8회 주사(5 ㎍ 단백질/주사)를 포함하였다. wt mTNFα(4개의 막대로 구성된 군 각각에서 제2 막대 및 제1 막대) 및 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα(4개의 막대로 구성된 군 각각에서 제4 막대 및 제3 막대)에 대해 ELISA를 측정하였다. 측정 전, 혈청 샘플을 PBS 완충제 중의 1% BSA로 1:100 또는 1:1,000 비율로 희석하였다.

도 8은 보조제의 부재 하에 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 마우스에 대한 혈청 역가 측정의 결과를 보여준다. 또한, 이 면역화는 유의한 항-TNFα 역가를 유도하였는데, 이는 이 방법이 강한 보조제가 바람직하지 않은 치료적 환경에 적용될 수 있음을 암시한다. wt mTNFα로 면역화된 Bcl-2 마우스에 대한 혈청 역가는 도 8A에 나타나 있고, pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 마우스에 대한 역가는 도 8B에 나타나 있다. 면역화는 하기와 같이 수행하였다: 8회 주사(주사당 5 ㎍의 단백질)를 CFA 또는 IFA의 부재 하에 17일의 기간에 걸쳐 수행하였다. wt mTNFα(막대 쌍 각각에서 좌측 막대) 또는 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα(막대 쌍 각각에서 우측 막대)에 대해 ELISA를 측정하였다. 측정 전, 혈청 샘플을 PBS 완충제 중의 1% BSA로 1:1,000 비율로 희석하였다.

면역학적 반응이 비천연 아미노산의 면역원성 니트로아릴 기의 결과임을 검증하기 위해, Tyr⁸⁶→Phe 돌연변이체 mTNFα(Phe⁸⁶ mTNFα)를 발생시키고, Bcl-2 마우스를 CFA/IFA의 존재 또는 부재 하에 상기 돌연변이체로 면역화시켰다. 도 9는 보조제의 부재 또는 존재 하에 Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 Bcl-2 마우스의 경우 wt mTNFα 및 Phe⁸⁶ mTNFα에 대한 혈청 역가 측정을 제공한다. 두 경우에서, 예를 들어, 보조제의 존재 또는 부재 하에, 무의미한 항-TNFα 역가가 발생되었는데, 이는 NO₂ 기가 면역 내성의 파괴를 위해 필요함을 암시한다.

보조제 없이 면역화된 마우스의 경우, RIMMS 프로토콜은 17일의 기간에 걸쳐 8회 주사(주사당 5 ㎍의 단백질)를 포함하였다. 보조제로 면역화된 마우스의 경우, CFA는 제1 주사를 위해 사용되었고, IFA는 남은 7회 주사를 위해 사용되었다. wt mTNFα(4개의 막대로 구성된 군 각각에서 제2 막대 및 제1 막대) 또는 Phe⁸⁶ mTNFα(4개의 막대로 구성된 군 각각에서 제4 막대 및 제3 막대)에 대해 ELISA를 측정하였다. 측정 전, 혈청 샘플을 PBS 완충제 중의 1% BSA로 1:100 또는 1:1,000 비율로 희석하였다.

도 10은 TNFα 상의 다른 표면 부위의 면역원성을 측정하기 위해 수행된 실험의 결과를 보여준다. 도 10A에서, pNO₂Phe⁴² mTNFα 또는 Phe⁴² mTNFα로 면역화된 C57BL/6 마우스의 경우 wt mTNFα, pNO₂Phe⁴² mTNFα 및 Phe⁴² mTNFα에 대한 혈청 역가가 나타나 있다. 도 10B에서, pNO₂Phe¹¹ mTNFα 또는 wt mTNFα로 면역화된 C57BL/6 마우스의 경우 wt mTNFα, PBS 및 pNO₂Phe¹¹ mTNFα에 대한 혈청 역가가 나타나 있다. 유의한 항-TNFα 역가는 pNO₂Phe⁴² mTNFα를 사용한 면역화에 의해서만 유도되었다. 즉, pNO₂Phe⁴² mTNFα로 면역화된 마우스만이 유의한 항-TNFα 역가를 유도하였다. 이 결과는 pNO₂Phe 돌연변이유발이 특정 자가 항원 또는 외래 항원이 고도의 면역원성을 나타내게 하는 매우 일반적인 방법일 것임을 암시한다.

실험에서 RIMMS 프로토콜은 보조제의 부재 하에 17일의 기간에 걸쳐 8회 주사(주사당 5 ㎍의 단백질)를 포함하였다. wt mTNFα(도 10A에서 3개의 막대로 구성된 군 각각에서 제1 막대; 도 10B에서 막대 쌍 각각에서 좌측 막대), pNO₂Phe⁴² mTNFα/pNO₂Phe¹¹ mTNFα(도 10A에서 3개의 막대로 구성된 군 각각에서 제2 막대; 도 10B에서 막대 쌍 7, 8 및 9 각각에서 우측 막대), Phe⁴² mTNFα(도 10A에서 3개의 막대로 구성된 군 각각에서 제3 막대) 또는 PBS(도 10B에서 막대 쌍 5 및 6 각각에서 우측 막대)에 대해 ELISA를 측정하였다. 측정 전, 혈청 샘플을 PBS 완충제 중의 1% BSA로 1/100(10A의 경우) 또는 1/800(10B의 경우) 비율로 희석하였다.

이 모델에서 LPS에 의해 유도된 패혈증 쇼크는 TNFα의 생성 및 방출에 관여하는 것으로 공지되어 있었다. 다음으로, 본 발명자들은 pNO₂Phe⁸⁶ TNFα를 사용한 마우스의 백신접종이 중증 내독소혈증 마우스 모델에서 리포폴리사카라이드(LPS) 자극으로부터 보호할 것인지를 확인하였다(문헌[F. Niessen, et al., (2008) "Dendritic cell PAR-S1P3 signalling couples coagulation and inflammation." Nature 452: 654-658]). 도 11은 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα를 사용한 면역화가 TNFα 의존적 중증 내독소혈증 모델에서 마우스의 생존을 개선시키는지를 확인하기 위해 수행된 실험을 결과를 보여준다. 능동 또는 수동 면역화를 제공받은 마우스의 캐플란-메이에르 생존 곡선이 나타나 있다. 도 11A에서, pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα 또는 wt mTNFα로 면역화된 마우스(군당 8마리)를 모의 면역화를 제공받은 7마리 마우스와 비교하였다. 야생형에 비해 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 마우스의 생존 이점(p<0.01)이 보여진다. 도 11B에서, pNO₂Phe mTNFα 또는 야생형 mTNFα로 면역화된 마우스로부터 정제된 IgG 100 ㎍을 주사받은 마우스(군당 8마리)를, 식염수를 주사받은 대조군과 비교하였다. 야생형에 비해 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 마우스의 생존 이점(p<0.01)이 보여진다. 도 11C에서, pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα 또는 야생형 mTNFα로 면역화된 마우스로부터 수득된 합쳐진 혈청 100 ㎕를 제공받은 마우스(군당 6마리)를, 식염수를 주사받은 대조군과 비교하였다. 야생형에 비해 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 마우스의 생존 이점(p<0.01)이 보여진다.

도 12는 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로부터 유래된 8-머 트립신 분해 생성물의 MS/MS 분석의 결과를 제공한다. pNO₂Phe을 함유하는 트립신 분해 단편의 서열은 단문자 코드(X=pNO₂Phe)로 표시되어 있다. y 시리즈 및 b 시리즈의 관찰된 단편 이온이 표시되어 있다. pNO₂Phe의 도입을 입증하는 핵심 y 이온 및 b 이온은 b₅, b₆, b₇, y₇, y₆, y₅ 및 y₄이다. 모든 질량은 단일동위원소 질량으로서 기재되어 있다. MS/MS 분석은 잔기 86에서 pNO₂Phe의 도입에 대한 패턴과 정확히 일치한다.

도 13은 His₆-Phe⁸⁶ mTNFα(wt) 또는 His₆-pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα 상의 N-말단 His₆-태그의 존재가 후속 면역화 실험의 결과에 영향을 미치지 않음을 입증하기 위해 수행된 실험의 결과를 보여준다.

혈청 항체 역가의 장기 지속성은 임상적 사용에 있어서 매우 바람직한데, 이는 현재 방법들이 면역화를 중단하였을 경우 자가 항체 역가가 급격히 감소하는 문제점을 종종 갖기 때문이다. 도 14는 TNFα에 대한 면역 반응의 혈청 역가 지속성을 측정하기 위해 수행된 실험의 결과를 보여준다. 3마리의 Bcl-2 형질전환 마우스를 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화시켰다. 순차적인 8회 면역화 후, 정해진 시점에서 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα에 대한 ELISA 분석을 수행하기 위해 혈액을 채취하였다. 각각의 측정 전, 혈청 샘플을 PBS 완충제 중의 1% BSA로 1:100 비율로 희석하였다. Δt는 마지막 면역화와 채혈 사이의 시간에 상응한다. 6개의 막대로 구성된 군 각각에서 제1 막대는 채혈전이고, 제2 막대는 Δt=l주이며, 제3 막대는 Δt=8주이고, 제4 막대는 Δt=12주이며, 제5 막대는 Δt=16주이고, 제6 막대는 Δt=19주이다.

도 15는 T 세포 증식 분석의 결과를 보여준다. 도 15A에서, wt mTNFα, pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα 및 Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 Bcl-2 형질전환 마우스로부터 유래되고 pNO₂Phe⁸⁶ mTNF의 연속적 희석물로 시험관내에서 자극받은 CD₄ ⁺ T 세포의 증식이 나타나 있다. 도 15B에서, wt mTNFα, pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα 및 Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 Bcl-2 형질전환 마우스로부터 유래되고 wt mTNFα의 연속적 희석물로 시험관내에서 자극받은 CD₄ ⁺ T 세포의 증식이 나타나 있다. pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα에 대해 특이성을 나타내는 CD₄ ⁺ T 세포는 마우스가 상기 돌연변이체 단백질로 면역화된 경우에만 유도되었고, 마우스가 wt mTNFα 또는 Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 경우에는 유도되지 않았다. 대조적으로, pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 Bcl-2 마우스로부터 유래된 CD₄ ⁺ T 세포가 시험관내에서 wt mTNFα로 자극받은 경우에는 유의한 증식이 관찰되지 않았다.

실시예 2: 비천연 아미노산을 사용한 내성의 면역학적 종결의 기작 연구

실시예 2는 비천연 아미노산을 TNFα 내로 도입하여 생성한 다클론 IgG 항체 반응의 성질 및 지속성을 특징규명하고 비천연 아미노산에 의해 유도된(예를 들어, pNO₂Phe에 의해 유도된) 자가 내성의 상실의 일반성에 대한 추가적 지지를 부가한다. 실시예 2는 뮤린 종양 괴사 인자-α(mTNFα)의 여러 표면 잔기를 독립적으로 p-니트로페닐알라닌(pNO₂Phe)으로 돌연변이시킨 것이 40주 이상 동안 지속되는 T 세포 의존적 다클론성 및 지속성 항-mTNFα IgG 자가 항체 반응을 일으킴을 보여준다. 본 실시예는 항체가 mTNFα 상의 다수의 에피토프에 결합하여 리포폴리사카라이드(LPS) 자극에 의해 유도된 중증 내독소혈증으로부터 마우스를 보호함을 보여준다. 뮤린 레티놀 결합 단백질(RBP4)의 pNO₂Phe⁴³ 돌연변이체를 사용한 마우스의 면역화 또한 야생형 mRBP4와 교차 반응하는 고역가 IgG 항체 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 실시예 2는 본 발명이 암 관련 또는 다른 약한 면역원성 항원에 대한 효과적인 면역요법을 발생시키는 일반적인 방법일 수 있음을 더 지지한다.

2백년 이상의 기간 동안, 능동 면역요법은 감염 질환을 예방하기 위한 노력의 선두에 있어 왔다(문헌[Waldmann, T.A. (2003) "Immunotherapy: past, present and future" Nat Med 9:269-277]). 그러나, 자가 항원에 대한 강력한 면역 반응을 일으키기 위한 면역 시스템의 감소된 능력은 암 또는 만성 변성 퇴행성 질환에 대한 치료 백신을 제조하는 것을 더 어렵게 만들었다. 최근에, 본 발명자들은 자가 단백질 내로의 면역원성 비천연 아미노산의 부위 특이적 도입이 자가 내성을 극복하는 단순하고 효과적인 방법을 제공함을 밝혔다(문헌[Grunewald, J. et al., (2008) "Immunochemical termination of self-tolerance" Proc Natl Acad Sci USA 105: 11276-11280] 및 실시예 1 참조). 여기서, 본 발명자들은 다클론 IgG 항체 반응의 성질 및 지속성을 특징규명하고 pNO₂Phe에 의해 유도된 자가 내성의 상실의 일반성을 확립하기 시작한다. 뮤린 종양 괴사 인자-α(mTNFα)의 여러 표면 잔기를 독립적으로 p-니트로페닐알라닌(pNO₂Phe)으로 돌연변이시킨 것은 40주 이상의 기간 동안 지속되는 T 세포 의존적 다클론성 및 지속성 항-mTNFα IgG 자가 항체 반응을 유도한다. 항체는 mTNFα 상의 다수의 에피토프에 결합하여 리포폴리사카라이드(LPS) 자극에 의해 유도된 중증 내독소혈증으로부터 마우스를 보호한다. 뮤린 레티놀 결합 단백질(RBP4)의 pNO₂Phe⁴³ 돌연변이체를 사용한 마우스의 면역화 또한 야생형 mRBP4와 교차 반응하는 고역가 IgG 항체 반응을 유도하였다. 이 발견은 이것이 암 관련 또는 다른 약한 면역원성 항원에 대한 효과적인 면역요법을 발생시키는 비교적 일반적인 방법일 수 있음을 암시한다.

주로 자가 반응성 B 세포 또는 T 세포의 부재 또는 불활성화로 인한 자가면역 질환을 피하기 위해 포유동물의 면역 시스템이 자가 단백질에 대해 "내성을 띠게되는 "자가 내성은 면역학적 자가 비자가 구별의 과정에 있어서 매우 중요하다(문헌[Goodnow (2007) "Multistep pathogenesis of autoimmune disease" Cell 130:25-35]). 그러나, 수년 동안 면역 시스템은 자가 단백질을 공격하도록 유도될 수 있음이 공지되어 있다. 예를 들어, 자가 단백질에 대한 교차 반응성 면역 반응은 키메라 항원 내로의 외래-T 헬퍼 세포 에피토프의 도입(문헌[Dalum, et al., (1999) "Therapeutic antibodies elicited by immunization against TNF-alpha" Nat Biotechnol 17:666-669]; 및 문헌[Zuany-Amorim, et al., (2004) "Induction of TNF-alpha autoantibody production by AutoVac TNF106: a novel therapeutic approach for the treatment of allergic diseases" Int Arch Allergy Immunol 133:154-163]), 자가 항원의 광범위한 화학적 유도체화(문헌[Weigle, W. O. (1965) "The Induction of Autoimmunity in Rabbits Following Injection of Heterologous or Altered Homologous Thyroglobulin" J Exp Med 121:289-308]), 및 DNA 백신(문헌[Leitner, et al., (2003) "Alphavirus-based DNA vaccine breaks immunological tolerance by activating innate antiviral Pathways" Nat Med 9:33-39])에 의해 유도될 수 있다. 나아가, 자가 내성에 관여하는 다수의 특정 유전자 및 세포 기작은 이들의 파괴가 내성 및 자가면역 질환의 파괴를 야기하였을 때 동정되었다(문헌[Goodnow (2007) "Multistep pathogenesis of autoimmune disease" Cell 130:25-35]; 및 문헌[Hill, et al., (2008) "Recent acquisitions on the genetic basis of autoimmune disease" Front Biosci 13:4838-4851]). 이러한 진보에도 불구하고, 효과적인 면역요법의 디자인은 암 치료를 위한 단지 몇몇 백신이 후기 임상 개발에 도달하였다는 사실에 의해 예시되는 바와 같이 느리게 진행되고 있다(문헌[Small, et al., (2006) "Placebo controlled phase III trial of immunologic therapy with sipuleucel-T (APC8015) in patients with metastatic, asymptomatic hormone refractory prostate cancer" J Clin Oncol 24:3089-3094]; 및 문헌[Schlom, et al., (2007) "Role of vaccine therapy in cancer: biology and practice" Curr Oncol 14:238-245]).

니트로아릴 기는 아마도 강한 적층체를 형성하는 그의 능력 및 반 데르 발스 상호작용으로 인해 고도의 면역원성을 띤다. 실제로, 디니트로페닐 기를 가진 자가 암세포의 비특이적 유도체화는 흑색종 환자에서 백신으로서 활용되고 있고(문헌[Berd, D. (2004) "M-Vax: an autologous, hapten-modified vaccine for human cancer." Expert Rev Vaccines 3:521-527]), 생리학적 3'-니트로티로신 형성은 다수의 자가면역 질환의 병리에 관련되어 있다(문헌[Aulak, et al., (2001) "Proteomic method identifies proteins nitrated in vivo during inflammatory challenge" Proc Natl Acad Sci USA 98:12056-12061]; 문헌[Pacher, et al., (2007) "Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease "Physiol Rev 87:315-424]; 및 문헌[Hardy, et al., (2008) "Conversion of tyrosine to the inflammation-associated analog 3'-nitrotyrosine at either TCR- or MHC -contact positions can profoundly affect recognition of the MHC class I-restricted epitope of lymphocytic choriomeningitis virus glycoprotein 33 by CD8 T cells." J Immunol 180: 5956-5962]). 이 면역원성 기가 특정 자가 단백질에 대한 내성의 파괴에서 사용될 수 있는지를 시험하기 위해, 본 발명자들은 먼저 p-니트로페닐알라닌(pNO₂Phe) 잔기를 뮤린 TNFα의 단일 부위에 도입하였다. mTNFα의 Tyr⁸⁶을 pNO₂Phe으로 유전적으로 치환시킴으로써, T 세포 에피토프를 생성하였고 이 질환 관련 자가 단백질에 대한 강한 교차 반응성 항체 반응을 유도하도록 T 세포 도움을 증강시켰다(문헌[Grunewald, J. et al., (2008) "Immunochemical termination of self-tolerance." Proc Natl Acad Sci USA 105: 11276-11280]). 여기서, 본 발명자들은 자가 내성의 면역화학적 파괴가 리포폴리사카라이드(LPS) 자극으로부터 마우스를 효과적으로 보호하는 지속된 고역가 항체 반응을 유도함을 보여준다. 뿐만 아니라, 본 발명자들은 이 방법이 면역 기능과 관련되지 않은 자가 단백질, 즉 레티놀 결합 단백질 4(RBP4)에 대해서도 일반화될 수 있음을 입증한다.

pNO ₂ Phe에 의해 유도된 자가 내성의 파괴의 기작 연구

이전에, 본 발명자들은 mTNFα의 Tyr⁸⁶을 pNO₂Phe으로 치환시킨 것이 야생형(wt) 단백질에 대한 고역가 교차 반응성 항체 반응을 유도함을 보였다. 상기 돌연변이체 단백질은 면역화된 동물에서 T 세포 증식을 유도하는 것으로 밝혀진 반면, wt 단백질은 그러하지 못하였다(문헌[Grunewald, J. et al., (2008) "Immunochemical termination of self-tolerance." Proc Natl Acad Sci USA 105: 11276-11280]). pNO₂Phe TNFα에 대한 T 세포 의존적 면역 반응에 대한 추가적 증거를 제공하기 위해, 본 발명자들은 항-마우스 IgM 또는 항-마우스 IgG 2차 항체를 사용하여 mTNFα 자가 항체의 ELISA 분석을 수행하였다. pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 Bcl-2 마우스으로부터 수득된 혈청 중의 항-mTNFα 자가 항체의 대다수는 IgG 서브타입인데, 이는 T 세포-매개 면역글로불린 클래스 전환을 암시한다(도 16a). pNO₂Phe의 존재가 면역화 과정 전체에 있어서 매우 중요한지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 우선 완전 프로인트 보조제(CFA) 중의 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα를 4마리의 마우스에게 주사한 후, 불완전 프로인트 보조제(IFA) 중의 wt mTNFα 또는 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα를 7회 주사하였다. 도 20에 나타낸 결과는 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα와 대조적으로 wt mTNFα가 교차 반응성 항-mTNFα 항체의 유의한 역가를 지속할 수 없음을 분명히 입증한다. 이 결과는 pNO₂Phe에 의해 유도된 자가 내성의 파괴가 니트로페닐 기에 의해 매개되는 T 세포 반응을 필요로 한다는 결론을 지지하고 Tyr⁸⁶Phe TNFα 돌연변이체가 강한 면역 반응을 유도할 수 없음을 보여주는 이전 연구와 일치한다.

pNO₂Phe에 의해 유도된 자가 내성 파괴의 기작에 관한 한 가지 질문은 항체 반응이 pNO₂Phe을 함유하는 에피토프에 대해 유되되는지 또는 에피토프 퍼짐이 일어나 표적 단백질의 다수의 에피토프에 대한 다클론 IgG 반응을 발생시키는지이다. 이 의문을 해결하기 위해, Bcl-2 마우스를 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화시켜 50종의 B 세포 하이브리도마를 발생시켰고, 상기 하이브리도마를 ELISA로 스크리닝하여 wt mTNFα에 대한 항체를 생성하는 클론을 동정하였다. 이어서, 본 발명자들은 이. 콜라이에서 발현되어 그의 분자량이 MALDI-TOF로 검증된(도 21) 3개의 mTNFα 단편, 즉 N-말단 단편(aa 1-60), 내부 단편(aa 61-100) 및 C-말단 단편(aa 101-156)으로 구성된 한 세트와 상기 단클론 항체(mAb)의 결합을 평가하였다. 이 분석이 일렬로 배열된(추측건대, 연속적인) B 세포 에피토프들에 대한 특이성을 주로 검출하지만, 본 발명자들은 N-말단 단편에 결합하는 5종의 mAb(3L24, 5K19, 6J22, 7O1 및 7F23) 및 C-말단 단편에 결합하는 1종의 mAb(1P19)를 동정하였다. 중요하게는, 상기 mAb들 중 어느 것도 원래의 면역원에 존재하는 pNO₂Phe⁸⁶를 코딩하는 내부 단편에 결합하지 못하였다. 따라서, 1개 초과의 에피토프에 결합하는 항체는 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα 면역화를 통해 생성되고, 이 에피토프들은 면역원의 pNO₂Phe 잔기를 반드시 포함하지 않는다. pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 마우스로부터 수득된 다클론 IgG는 나노몰 범위 내의 K_d 값으로 천연 mTNFα와 교차 반응한다(도 16b). 또한, 이 결과들은 pNO₂Phe 잔기를 그의 서열 내에 단순히 삽입함으로써 자가 단백질에 대한 교차 반응성 중화 항체 반응을 발생시킬 수 있다는 가설을 더 지지한다.

pNO ₂ Phe에 의해 유도된 항체 반응의 지속성

항-mTNFα IgG 항체 역가의 지속성을 측정하기 위해, 본 발명자들은 3마리의 Bcl-2 마우스를 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화시켰다. 마지막 부스팅 주사 후, 혈액을 정해진 시점에서 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα에 대한 ELISA로 분석하였다. 놀랍게도, 항체 수준은 40주 이상의 기간 동안 그의 초기 수준의 80%를 초과하는 정도로 유지되었고(도 16c), 상기 기간 후 마우스는 희생되었다. 대조적으로, 난백 리소자임 T 세포 에피토프를 함유하는 mTNFα 돌연변이체를 사용한 면역화에 기초한 앞선 항-mTNFα 백신접종 연구에서, 역가는 마지막 부스팅으로부터 4주 경과 후 감소하였고, 26주 경과 후 mTNFα 항체 역가는 80 내지 87%만큼 감소하였다(문헌[Dalum, et al., (1999) "Therapeutic antibodies elicited by immunization against TNF-alpha." Nat Biotechnol 17: 666-669]). 따라서, 본 발명자들의 pNO₂Phe 기초 백신 방법은 질환 관련 자가 항원으로서의 TNFα에 대한 지속적 면역 및 장기간 보호를 유도함에 있어서 효과적이다.

mTNFα 내의 다른 표면 부위에서의 돌연변이로의 확장

pNO₂Phe에 의해 유도된 자가 내성의 파괴의 일반성을 조서하기 위해, mTNFα의 추가적 4개 표면 노출된 잔기들(Lys¹¹, Gln²¹, Asp⁴² 및 Val⁴⁹)을 pNO₂Phe으로 돌연변이시켰다(도 23A). 이 잔기들은 p-니트로페닐알라닌과 구조적으로도 상이하다. pNO₂Phe¹¹ mTNFα, pNO₂Phe²¹ mTNFα, pNO₂Phe⁴² mTNFα 및 pNO₂Phe⁴⁹ mTNFα의 조성 및 균질성을 SDS-PAGE 및 질량 분광측정으로 확인한 후(도 23B 및 표 3), 이 돌연변이체 단백질들의 4차 구조는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 삼량체인 것으로 밝혀졌다(표 4). 나아가, NFκB-루시퍼라제 레포터 유전자 분석은 pNO₂Phe¹¹ mTNFα가 wt mTNFα의 활성의 9%, pNO₂Phe²¹ mTNFα가 wt mTNFα의 활성의 22%, pNO₂Phe⁴² mTNFα가 wt mTNFα의 활성의 22%, pNO₂Phe⁴⁹ mTNFα가 wt mTNFα의 활성의 10%임을 보여주었다(표 4 및 도 23C). 따라서, 모든 돌연변이체들은 이 분석에서 야생형 단백질의 활성의 2%만을 나타내는 이전에 특징규명된 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα보다 유의하게 더 높은 활성을 나타낸다. 이 pNO₂Phe mTNFα 돌연변이체들의 면역원성을 측정하기 위해, 14마리의 C57BL/6 마우스들을 5개의 군으로 무작위적으로 나누고 RIMMS(다중 부위에서의 반복적 면역화) 프로토콜(문헌[Kilpatrick, et al., (1997) "Rapid development of affinity matured monoclonal antibodies using RIMMS." Hybridoma 16: 381-389])로 상기 돌연변이체들 또는 wt mTNFα를 주사하였다. ELISA 분석은 NFκB-루시퍼라제 레포터 유전자 분석에서의 mTNFα 활성과 항체 반응을 유도하는 능력 사이에 상관관계가 없음을 보임으로써, 면역 시스템에 대한 직접적인 효과를 배제하였다. 도 17에 나타낸 바와 같이, 위치 11에 존재하는 pNO₂Phe은 pNO₂Phe¹¹ mTNFα 면역원에 대한 고역가 IgG 반응과 동등한, wt mTNFα에 대한 고역가 IgG 반응을 유도하였다. 대조적으로, 위치 21, 42 및 49의 돌연변이 또한 pNO₂Phe 함유 면역원에 대한 고역가 IgG 반응을 유도하였지만, IgG 항체는 wt mTNFα에 대한 중등도의 교차 반응성만을 나타내었다. 이어서, 모든 4종의 돌연변이체 TNFα에 대해 생성된 항체들을, 5개의 군으로 무작위적으로 나누어져 항-pNO₂Phe 또는 항-wt mTNFα IgG를 주사받은 40마리의 C57BL/6 마우스의 수동 면역화에 사용하였다. 수동 면역화로부터 24시간 후, 동물들을 문헌[Niessen, et al., (2008) "Dendritic cell PAR1-S1P3 signalling couples coagulation and inflammation." Nature 452: 654-658]에 이미 기재된 바와 같이 LPS로 자극하였다. 항-pNO₂Phe¹¹ mTNFα IgG를 제공받은 모든 마우스들은 치명적인 LPS 자극에서 생존하였다(도 18). 비록 중등도의 교차 반응성 항-pNO₂Phe²¹ mTNFα IgG, 항-pNO₂Phe⁴² mTNFα IgG 및 항-pNO₂Phe⁴⁹ mTNFα IgG를 제공받은 다른 군들은 75% 이상의 생존율을 나타낸 반면, 항-wt mTNFα IgG를 주사받은 마우스들은 단지 13%의 생존율을 보였다. 따라서, pNO₂Phe을 사용한 자가 내성의 파괴 능력은 단일 아미노산 위치에 의존하지 않는데, 이는 본 발명자들이 5개 이상의 위치(위치 86을 포함함)가 생체내에서 중화 교차 반응성 항-mTNFα IgG 반응을 유도할 수 있음을 보였기 때문이다. 더욱이, 치환 부위는 p-니트로페닐알라닌과 구조적으로 유사할 필요가 없다.

돌연변이체 mRBP4 단백질의 발현 및 특징규명

mTNFα 내의 다수의 위치가 pNO₂Phe으로 돌연변이되었을 때 자가 내성의 파괴를 일으키는 한, 본 발명자들은 이 방법이 다른 자가 단백질에 일반화될 수 있을지 궁금하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 혈청에서 발견된 또 다른 모델 자가 단백질 RBP4에 대한 자가 내성을 파괴하는 pNO₂Phe의 능력을 조사하였다(문헌[Zanotti, et al., (2004) "Plasma retinol-binding protein: structure and interactions with retinol, retinoids, and transthyretin." Vitam Horm 69: 271-295]; 및 문헌[Raghu, et al., (2004) "Interactions amongst plasma retinol-binding protein, transthyretin and their ligands: implications in vitamin A homeostasis and transthyretin amyloidosis." Biochim Biophys Acta 1703: 1-9]). TNFα와 대조적으로, 이 단백질은 높은 가용성 및 비교적 낮은 분자량(20 kDa)의 단량체 단백질이다. RBP4 넉아웃 마우스는 시력 결핍 이외의 명백한 표현형적 이상을 보이지 않는데(문헌[Vogel, et al., (2002) "Retinol-binding protein-deficient mice: biochemical basis for impaired vision." Biochemistry 41: 15360-15368]), 이는 마우스가 자가 RBP4에 대한 중화 면역 반응에서 생존할 것임을 암시한다. 단량체 인간 RBP4의 X-선 결정 구조에 기초하여(문헌[Cowan, et al., (1990) "Crystallographic refinement of human serum retinol binding protein at 2A resolution." Proteins 8: 44-61]), 본 발명자들은 pNO₂Phe으로의 돌연변이를 위한 하기 표면 노출된 잔기들을 선택하였다: Tyr⁴³ 및 Tyr¹⁰⁸(도 24). 이 잔기들은 뮤린 RBP4(mRBP4)를 포함하는 다양한 포유동물 RBP4 사이에서 고도로 보존되어 있다. 이 mRBP4 돌연변이체 및 wt mRBP4를 N-말단 His₆-태그가 부착된 단백질로서 이. 콜라이에서 발현시키고, 변성 조건 하에 Ni^{2 +} 친화성 크로마토그래피로 정제하고, 문헌[Greene, et al., (2001) "Role of conserved residues in structure and stability: tryptophans of human serum retinol-binding protein, a model for the lipocalin superfamily." Protein Sci 10: 2301-2316]에 기재된 프로토콜에 따라 재폴딩시켰다. 위치 43 및 108에서 mRBP4 내로의 pNO₂Phe의 부위 특이적 도입은 SDS-PAGE 분석뿐만 아니라 비천연 아미노산을 함유하는 트립신 분해 단편의 MS/MS 단편화로 확인하였다(도 24, 25 및 27). 분석적 크기 배제 크로마토그래피는 인간 RBP4의 공개된 4차 구조와 일치하는, 모든 mRBP4 단백질들에 대한 단량체 구조를 보여주었다(표 5)(문헌[Cowan, et al., (1990) "Crystallographic refinement of human serum retinol binding protein at 2A resolution." Proteins 8: 44-61]). 뿐만 아니라, 레티놀 치환 분석에 따르면, 모든 pNO₂Phe mRBP4 돌연변이체들은 나노몰 범위 내의 K_d 값으로 레티놀에 결합하고, 이는 wt mRBP4와 잘 일치한다(표 5).

pNO₂Phe⁴³ mRBP4, pNO₂Phe¹⁰⁸ mRBP4 및 wt mRBP4의 4차 구조를 수퍼덱스 75 10/300 GL 컬럼 상의 체류 시간에 대한 단백질 표준물의 분자량의 로그 곡선에 기초하여 결정하였다. mRBP4 단백질들의 결합 친화성은 TR-FRET 레티놀 결합 분석으로 측정하였다.

pNO ₂ Phe에 의해 유도된 자가 내성 파괴의 일반성

pNO₂Phe mRBP4 돌연변이체의 면역원성을 측정하기 위해, 12마리의 Bcl-2 마우스들을 4개의 군으로 무작위로 나누고 RIMMS 프로토콜(예를 들어, 문헌[Kilpatrick, et al., (1997) "Rapid development of affinity matured monoclonal antibodies using RIMMS." Hybridoma 16: 381-389] 참조)로 pNO₂Phe⁴³ mRBP4, pNO₂Phe¹⁰⁸ mRBP4 및 wt mRBP4를 주사하였다. ELISA 분석에 따르면, wt mRBP4 또는 pNO₂Phe¹⁰⁸ mRBP4로 면역화된 마우스는 wt mRBP4에 대한 무의미한 혈청 IgG 역가를 나타내었다(도 19A). 대조적으로, pNO₂Phe⁴³ mRBP4로 면역화된 마우스는 pNO₂Phe⁴³ mRBP4 면역원 및 야생형 단백질 둘 다에 결합하는 현저히 높은 혈청 IgG 역가(1:100,000 이하)를 나타내는 것으로 확인되었다. 유사한 결과를 C57BL/6 마우스를 사용하여 수득하였다(도 26). 나아가, pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα를 사용한 이전 관찰결과에 따르면, pNO₂Phe⁴³ mRBP4에 대해 특이성을 나타내는 CD₄ ⁺ T 세포는 pNO₂Phe⁴³ mRBP4 단백질을 사용한 면역화 시 유도되었는데, 이는 성숙 T 세포 의존적 면역 반응을 암시한다(도 19B). 또한, 이 결과는 단백질 서열 내로의 pNO₂Phe의 도입이 지속된 교차 반응성 IgG 항체 반응을 개시하는 강한 T 세포 에피토프를 생성할 수 있다는 가설을 더 지지한다. 모든 부위가 강한 교차 반응성 면역 반응을 유도하는 것은 아니었는데, 이는 모든 부위가 잠재적 T 세포 에피토프에 상응하지 않을 것이기 때문에 놀라운 사실이 아니다.

본 발명자들은 pNO₂Phe의 유전적 도입이 자가 단백질 mTNFα 및 mRBP4에 대한 지속된 IgG 항체 반응을 유도함을 보였다. 기작 면에서, 단일 위치에서 p-니트로페닐 기의 도입은 pNO₂Phe 변이체에 의해 자극될 수 있을 뿐 wt 단백질에 의해서는 자극될 수 없는 T 세포를 발생시킨다. 이러한 pNO₂Phe에 의해 유도된 T 세포 의존적 반응은 궁극적으로 자가 반응성 B 세포의 활성화 및 천연 자가 단백질에 대한 고도의 교차 반응성을 보이는 다클론 항체의 생성을 유도한다. 이 결과는 번역 후 수식된 단백질이 T 세포 반응성을 증강시킬 수 있음을 보여주는 최근 연구에 필적할만하다(문헌[Cantaert, et al., (2006) "Citrullinated proteins in rheumatoid arthritis: crucial...but not sufficient!" Arthritis Rheum 54: 3381-3389]; 문헌[Backlund, et al., (2002) "Predominant selection of T cells specific for the glycosylated collagen type II epitope (263-270) in humanized transgenic mice and in rheumatoid arthritis." Proc Natl Acad Sci USA 99: 9960-9965]; 및 문헌[Dzhambazov, et al., (2005) "The major T cell epitope on type II collagen is glycosylated in normal cartilage but modified by arthritis in both rats and humans" Eur J Immunol 35: 357-366]). 예를 들어, 시트룰린화(citrullination) 및 글리코실화는 T 세포 의존적 자가면역 질환에 관여하는 번역 후 수식이다(문헌[Cantaert, et al., (2006) "Citrullinated proteins in rheumatoid arthritis: crucial...but not sufficient!" Arthritis Rheum 54: 3381-3389]; 문헌[Backlund, et al., (2002) "Predominant selection of T cells specific for the glycosylated collagen type II epitope (263-270) in humanized transgenic mice and in rheumatoid arthritis." Proc Natl Acad Sci USA 99: 9960-9965]; 문헌[Dzhambazov, et al., (2005) "The major T cell epitope on type II collagen is glycosylated in normal cartilage but modified by arthritis in both rats and humans" Eur J Immunol 35: 357-366]; 문헌[Klareskog, et al., (2008) "Immunity to citrullinated proteins in rheumatoid arthritis." Annu Rev Immunol 26: 651-675]; 및 문헌[Sollid, L. M. (2000) "Molecular basis of celiac disease." Annu Rev Immunol 18: 53-81]). 유사하게, 피부 항원의 디니트로플루오로벤젠 수식은 접촉 과다민감성에서 T 세포 반응의 모델로서 수십년 동안 이용되어 왔다(문헌[Toews, et al., (1980) "Epidermal Langerhans cell density determines whether contact hypersensitivity or unresponsiveness follows skin painting with DNFB." J Immunol 124: 445-453]). 따라서, 자가 단배질 내로의 pNO₂Phe의 부위 특이적 도입은 자가 내성의 생화학적으로 유사한 번역 후 매개 또는 화학적 매개 상실에 대한 단순한 모델 시스템을 확립한다. 따라서, 이 방법은 면역 시스템이 자가면역 동안 화학적으로 수식된 항원에 어떻게 반응하는지를 이해함에 있어서 도움을 줄 수도 있다. 뿐만 아니라, pNO₂Phe에 의해 유도된 자가 내성의 파괴는 암 또는 퇴행성 질환과 관련된 병원성 자가 단백질에 대한 중화 항체를 생성하는 강력한 방법을 제공할 수 있을 뿐만 아니라 감염성 물질의 약한 면역원성 외래 항원에도 적용될 수 있다.

박테리아 균주 및 시약

이. 콜라이 XL1-블루 및 XL10-골드를 클로닝을 위한 숙주로서 사용하였고, 이. 콜라이 BL21(DE3)을 발현 균주로서 사용하였다. 제한효소, T4 DNA 리가제, dNTP 및 인자 Xa 단백질분해효소는 엔이비(NEB; 미국 매사추세츠주 비벌리 소재)로부터 입수하였다. 프라이머는 인티그레이티드 DNA 테크놀로지스(미국 아이오와주 코랄빌 소재)로부터 구입하였다. 플라스미드 DNA 제제는 퓨어링크(PureLink)(상표명) 퀵 플라스미드 미니프렙 키트(인비트로겐)를 사용하여 수행하였고, 제한효소 분해 후 DNA 정제는 퓨어링크(상표명) PCR 마이크로 키트(인비트로겐)를 사용하여 수행하였다.

pNO ₂ Phe 함유 mTNFα 및 wt mTNFα의 제조

wt mTNFα 및 pNO₂Phe mTNFα 돌연변이체는 문헌[Grunewald, J. et al., (2008) "Immunochemical termination of self-tolerance." Proc Natl Acad Sci USA 105: 11276-11280]에 기재된 바와 같이 제조하였다. 요약하건대, 뮤린 TNFα 유전자 내로의 pNO₂Phe의 부위 특이적 도입은 표준 PCR 돌연변이유발 절차를 이용하여 TAG 앰버 코돈을 도입함으로써 수행하였다. pNO₂Phe mTNFα 돌연변이체를 발현시키기 위해, 이. 콜라이 BL21(DE3) 세포를 mutNO₂PheRS, mutRNA_CUA 및 돌연변이된 mTNFα 유전자로 동시 형질전환시켰다. 이어서, 형질전환된 세포를 37℃에서 1% 글리세롤 및 0.3 mM 류신이 함유된 최소 배지(GMML 배지) 중의 1 mM의 pNO₂Phe(알파 애사르(Alfa Aesar), 미국 매사추세츠주 워드 힐 소재)의 존재 하에 생장시키고, 1 mM IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 개시하였다. pNO₂Phe의 부재 하에 2x YT 배지에서 wt mTNFα를 발현시켰다. 천연 또는 변성 조건 하에 고정된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 단백질 정제를 수행하였다. 모든 단백질들을 MALDI-TOF 또는 ESI 질량 분광측정으로 특징규명하였다. 또한, 돌연변이체 단백질 내로의 pNO₂Phe의 성공적인 도입은 트립신 분해 인-겔 분해, 및 상기 비천연 아미노산을 함유하는 개개의 트립신 분해 단편의 후속 MS/MS 단편화를 통해 검증하였다. 바이오-라드(바이오-라드 랩스, 미국 캘리포니아주 허큘레스 소재)로부터 입수한 분자량 겔-여과 표준물로 보정된 수퍼덱스 75 10/300 GL 겔 여과 컬럼 상의 분석 SEC로 단백질 4차 구조를 분석하였다. pNO₂Phe mTNFα 돌연변이체의 활성은 문헌[Grunewald, J. et al., (2008) "Immunochemical termination of self-tolerance." Proc Natl Acad Sci USA 105: 11276-11280]에 기재된 바와 같이 NFκB-루시퍼라제를 안정하게 발현하는 HEK293 세포를 사용한 NFκB-루시퍼라제 레포터 유전자 분석으로 측정하였다.

mRBP4 발현 벡터인 pSpeedET-mRBP4의 구축

중합효소 불완전 프라이머 연장(PIPE) 클로닝 방법(문헌[Klock, et al., (2008) "Combining the polymerase incomplete primer extension method for cloning and mutagenesis with microscreening to accelerate structural genomics efforts." Proteins 71: 982-994])을 위해 특별히 디자인된 하기 2개의 프라이머를 사용한 PCR로 뮤린 RBP4(aa 19-201)를 코딩하는 cDNA(노바티스 리서치 파운데이션(Novartis Research Foundation)의 게놈 연구소)를 증폭하였다: 5'-CTGTACTTCCAGGGCGAGCGCGACTGCAGGG(5' 삽입체 전방향 프라이머) 및 5'-AATTAAGTCGCGTTACAAACTGTTTCTGGAGGGCC(3' 삽입체 역방향 프라이머). 5' 벡터 역방향 프라이머 5'-GCCCTGGAAGTACAGGTTTTCGTGATGATGATGATGATG 및 3' 벡터 전방향 프라이머 5'-TAACGCGACTTAATTAACTCGTTTAAACGGTCTCCAGC를 사용하여 pSpeedET 벡터를 증폭하였다. 밑줄친 염기 및 이탤릭체로 표기된 염기는 어닐링이 일어나는 프라이머들 사이의 2개의 상이한 상보적 영역을 강조한다. pSpeedET 벡터는 N-말단 His₆-태그 서열(MGSDKIHHHHHH)을 첨부하고, mRBP4에 대한 19번째 코돈 직전에 TEV 단백질분해효소 부위(ENLYFQG)를 첨부한다. 정제되지 않은 mRBP4(aa 19-201) 삽입체 PCR 생성물을 정제되지 않은 pSpeedET 벡터 PCR 생성물과 1:1(부피/부피)로 혼합하였다. 혼합 후, 이. 콜라이 XL10-골드 세포를 반응 혼합물 2 ㎕로 형질전환시켰다. mRBP4(aa 19-201) 내로의 pNO₂Phe의 부위 특이적 도입은 Tyr⁴³ 또는 Tyr¹⁰⁸에 대한 코돈을 TAG 앰버 코돈으로 돌연변이시킴으로써 수행하였다. 모든 pSpeedET-mRBP4 구축물의 서열은 DNA 서열 분석으로 확인하였다.

pNO ₂ Phe mRBP4 및 wt mRBP4의 단백질 발현 및 정제

pNOPhe mRBP4 돌연변이체를 발현시키기 위해, 이. 콜라이 BL21(DE3) 세포를 mutNO₂PheRS, mutRNA_CUA 및 개개의 돌연변이체 mRBP4 유전자로 동시 형질전환시켰다. 형질전환된 균주를 GMML 배지 중의 1 mM pNO₂Phe의 존재 하에 37℃에서 생장시키고, OD₆₀₀이 0.5에 도달하였을 때 0.2%(중량/부피) 아라비노스로 유도하고, 12 내지 16시간 후 수거하였다. pNO₂Phe mRBP4 돌연변이체와 대조적으로, wt mRBP4를 pNO₂Phe의 부재 하에 2x YT 배지에서 3시간 동안 발현시켰다. 세포 펠렛을 100 mM NaH₂PO₄ 및 10 mM 트리스(pH 8.0)가 함유된 8 M 우레아에 현탁하고, 얼음 상에서 3분 동안 초음파처리하여 용해시켰다. 세포 데브리스를 40,000 x g에서 25분 동안 원심분리하여 제거하였다. 5 ㎖의 50% Ni-NTA 슬러리(노바겐, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)를 상청액에 첨가하고 60분 동안 진탕하여 약하게 혼합하였다. Ni-NTA 비드를 8 M 우레아, 100 mM NaH₂PO₄ 및 10 mM 트리스(pH 6.3)로 세척하였다. 100 mM NaH₂PO₄ 및 10 mM 트리스(pH 4.5)가 함유된 8 M 우레아를 사용하여 용출을 수행하였다. 단백질을 10K 분자량 컷-오프 아미콘 울트라-15 원심분리 필터 장치(밀리포어, 미국 매사추세츠주 베드포드 소재)로 농축하였다. mRBP4 단백질을 포스페이트 완충 식염수(PBS, pH 7.4)에 대한 투석으로 침전시키고, 20 mM 트리스 및 20 mM 디티오트레이톨(pH 8.0)이 함유된 8 M 우레아에 재용해시켰다. mRBP4 단백질의 시험관내 폴딩을 문헌[Greene, et al., (2001) "Role of conserved residues in structure and stability: tryptophans of human serum retinol-binding protein, a model for the lipocalin superfamily." Protein Sci 10: 2301-2316]에 따라 수행하였다. 요약하건대, 8 M 우레아 중의 변성된 물질을 20 mM 트리스, 10 mM β-머캡토에탄올, 1 mM 2-히드록시에틸디설피드 및 1% 글리세롤이 함유된 폴딩 완충제(pH 8.5)에 약 30 방울/분의 속도로 적가함으로써 천연 단백질을 발생시켰다. 폴딩을 4℃에서 16시간 동안 진행시킨 후, 단백질 용액을 10K 분자량 컷-오프 아미콘 울트라-15 원심분리 필터 장치(밀리포어)를 사용하여 농축하였다. 0.3 ㎖/분의 유속으로 PBS(pH 7.4)로 평형화된 수퍼덱스 75 10/300 GL 컬럼(지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 상의 SEC로 단백질을 더 정제하였다.

중증 전신 염증의 마우스 모델

모든 실험은 국립 동물 건강 보호회의 지침에 따라 수행하였고 더 스크립스 리서치 인스티튜트의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인받았다. 동물 실험은 안정한 조건(20 내지 22℃의 온도 및 40 내지 60%의 상대 습도) 하에 12시간의 명주기 및 암주기를 교대로 반복하면서 실내에서 수행하였다(문헌[Niessen, et al., (2008) "Dendritic cell PAR1-S1P3 signalling couples coagulation and inflammation." Nature 452: 654-658]). LPS 자극으로부터 24시간 전, 9주령의 수컷 C57BL/6 마우스(잭슨 라보라토리스, 미국 메인주 바 하버 소재)를, 음성 대조군으로서 사용된 비면역화된 야생형 마우스로부터 유래된 pNO₂Phe¹¹ mTNFα, pNO₂Phe²¹ mTNFα, pNO₂Phe⁴² mTNFα 및 pNO₂Phe⁴⁹ mTNFα IgG로 면역화된 마우스의 혈청으로부터 정제된 4 mg/kg의 IgG를 복강의 좌측 절반 내로 주입함으로써 수동 면역화시켰다. 이어서, 2% 이소플루란 하에 7.5 mg/kg 리포폴리사카라이드(LPS, 이. 콜라이 O111:B4 칼바이오켐/이엠디 바이오사이언시스, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)를 마우스의 복강의 우측 절반 내로 주사하였다. 통계학적 분석을 위해, 캐플란-메이에르 곡선을 작도하고, 생존 차이를 본페로니 보정과 함께 로그 등급 시험을 이용하여 분석하였다.

ELISA

0.5 ㎍/㎖ 단백질 30 ㎕를 사용하여 4℃에서 맥시소르프 384-웰 플레이트(넌크, 미국 뉴욕주 로체스터 소재)의 웰을 밤새 코팅하였다. 코팅된 플레이트를 PBS + 0.05% 트윈 20(PBST)으로 세척한 후, PBS 중의 1% BSA 80 ㎕로 블로킹하고 PBST로 다시 세척하였다. 상기 플레이트를 PBS 중의 1% BSA 중에 희석된 1차 항체 또는 혈청 20 ㎕, HRP-접합된 염소 항-마우스 IgG 20㎕(잭슨 이뮤노리서치 라보라토리스, 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브 소재) 및 TMB 기질 20 ㎕(케이피엘, 미국 매릴랜드주 가이터스버스 소재)와 함께 순차적으로 항온처리하고, 650 nm에서 흡광도를 판독하였다. 항온처리 사이에 플레이트를 PBST로 6회 이상 세척하였다.

T 세포 증식 분석

면역화된 C57BL/6 마우스의 림프절로부터 유래된 CD₄ ⁺ T 세포의 단리를 MACS 비드(밀테니이 바이오텍, 미국 캘리포니아주 아우번 소재)를 사용한 자기 고갈로 수행하였다. 그 다음, T 세포를 천연 C57BL/6 마우스로부터 유래된 방사선조사된 비장세포 및 증가하는 양의 항원이 함유된 배양물 내로 배치하였다. 배양물을 48시간 동안 항온처리한 후 [³H]-티미딘과 함께 밤새 항온처리하였다. 배양물 플레이트를 필터 매트 상으로 수거한 후, 방사성을 탑카운트 신틸레이션 카운터(퍼킨엘머, 미국 매사추세츠주 보스톤 소재)로 정량하였다.

뮤린 RBP4 활성 분석

wt mRBP4 및 pNO₂Phe mRBP4 돌연변이체 단백질을, 제조자의 설명서에 따라 설포-NHS-바이오틴 키트(피어스, 미국 일리노이주 록포드 소재)를 사용하여 바이오틴으로 표지하였다. 레티놀 결합 활성을 측정하기 위해, 10 nM 바이오틴으로 표지된 RBP4를 1 nM 스트렙타비딘-유로퓸 킬레이트(란스(LANCE)(등록상표) Eu-W8044 스트렙타비딘, 퍼킨엘머, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)와 혼합하였다. 증가하는 농도의 Cy5 표지된 레티놀을 반응물에 첨가하고, 레티놀 결합을 균질 시간-해상된 형광 공명 에너지 전달(TR-FRET)로 평가하였다.

단클론 항체(mAb)의 면역화 및 발생

항-mTNFα 항체를 제조하기 위한 면역원으로서 정제된 wt 또는 pNO₂Phe mTNFα를 사용하였다. Bcl-2 형질전환 마우스(C57BL/6-TgN(BCL2)22Wehi) 또는 C57BL/6 마우스를 RIMMS 프로토콜을 이용하여 면역화시켰다. 예를 들어, 문헌[Kilpatrick, et al., (1997) "Rapid development of affinity matured monoclonal antibodies using RIMMS." Hybridoma 16: 381-389]을 참조한다. Bcl-2 형질전환 마우스는 연장된 B 세포 생존, 및 이 마우스를 면역화에 특히 적합하게 만드는 여포성 림프증식을 보인다. 요약하건대, 마우스를 18일에 걸쳐 8회 주사하였다. 각각의 주사에서, PBS 200 ㎕ 중의 단백질 5 ㎍을 완전 프로인트 보조제(제1 주사의 경우)와 1:1로 혼합하거나 불완전 프로인트 보조제(남은 주사의 경우)와 1:1로 혼합하였다. 면역원을 말초 림프절(PLN)에 인접한 6개의 특정 부위에 주사하였다. 8회째 주사당일, 시험 혈액을 채취하고, 혈청 항체 역가를 ELISA로 분석하였다. 높은 혈청 역가 마우스로부터 얻은 PLN을 수거하여 분리하였다. 단리된 림프구를 50% PEG 1500을 사용하여 F0 마우스 골수종 세포와 융합시켰다. 융합된 세포를 384-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하였다. 하이브리도마를 하이포잔틴 아미노프테린 티미딘(HAT) 배지에서 선별하여 wt mTNFα에 대해 ELISA로 스크리닝하였다.

실시예 2의 도면에 나타낸 결과의 설명

도 16은 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα 면역화가 IgG 반응으로의 클래스-전환을 촉진하는지를 확인하기 위해 수행된 실험의 결과를 보여준다. 검출된 IgG 반응은 wt mTNFα와의 유의한 교차 반응성을 나타내고 마우스에서 40주 이상의 기간 동안 지속된다. 도 16a에서, pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα 또는 wt mTNFα로 면역화된 Bcl-2 마우스에 대한 혈청 역가는 제1 주사의 경우 완전 프로인트 보조제(CFA)의 존재 하에 17일의 기간에 걸쳐 측정되었고, 나머지 주사의 경우 불완전 프로인트 보조제(IFA)의 존재 하에 17일의 기간에 걸쳐 측정되었다. 항-마우스 IgM(4개의 막대로 구성된 군 각각에서 제1 막대 및 제2 막대) 또는 항-마우스 IgG(4개의 막대로 구성된 군 각각에서 제3 막대 및 제4 막대)를 2차 항체로 사용하여 wt mTNFα에 대해 ELISA를 측정하였다. 측정 전, 혈청 샘플을 PBS 완충제 중의 1% BSA로 1:100(제1 막대 및 제3 막대) 또는 1:1,000(제2 막대 및 제4 막대) 비율로 희석하였다. 도 16b는 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα 또는 wt mTNFα에 대한 다클론 항-wt mTNFα IgG(역삼각형) 및 다클론 항-pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα IgG(마름모형)의 친화성을 정량하기 위해 수행된 ELISA 적정을 보여준다. 도 16c는 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα로 면역화된 3마리의 Bcl-2 마우스의 항체 역가 지속성 연구를 보여준다. 순차적인 8회 면역화 후, 정해진 시점에서 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα에 대한 20 ELISA 분석을 위해 혈액을 채취하였다(Δt는 마지막 면역화와 채혈 사이의 시간에 상응함). 각각의 측정 전, 혈청 샘플을 PBS 완충제 중의 1% BSA로 1:100 비율로 희석하였다. 7개의 막대로 구성된 군 각각에서 제1 막대는 채혈 전이고, 제2 막대는 Δ19주이며, 제3 막대는 Δ23주이고, 제4 막대는 Δ28주이며, 제5 막대는 Δ32주이고, 제6 막대는 Δ36주이고, 제7 막대는 Δ40주이다.

mTNFα 상의 다른 표면 노출된 부위들도 유의한 면역원성을 나타내었다. 도 17a에서, pNO₂Phe¹¹ mTNFα 또는 wt mTNFα로 면역화된 C57BL/6 마우스의 경우 wt mTNFα(막대 쌍 각각에서 좌측 막대), pNO₂Phe¹¹ mTNFα(막대 쌍 3, 4, 및 5에서 우측 막대) 및 PBS(막대 쌍 1 및 2에서 우측 막대)에 대한 혈청 역가가 표시되어 있다. 도 17b에서, pNO₂Phe²¹ mTNFα 또는 wt mTNFα로 면역화된 C57BL/6 마우스의 경우 wt mTNFα(막대 쌍 각각에서 좌측 막대), pNO₂Phe²¹ mTNFα(막대 쌍 6, 7 및 8에서 우측 막대) 및 PBS(막대 쌍 1 및 2에서 우측 막대)에 대한 혈청 역가가 표시되어 있다. 도 17c에서, pNO₂Phe⁴² mTNFα 또는 wt mTNFα로 면역화된 C57BL/6 마우스의 경우 wt mTNFα(막대 쌍 각각에서 좌측 막대), pNO₂Phe⁴² mTNFα(막대 쌍 9, 10 및 11에서 우측 막대) 및 PBS(막대 쌍 1 및 2에서 우측 막대)에 대한 혈청 역가가 표시되어 있다. 도 17d에서, pNO₂Phe⁴⁹ mTNFα 또는 wt mTNFα로 면역화된 C57BL/6 마우스의 경우 wt mTNFα(막대 쌍 각각에서 좌측 막대), pNO₂Phe⁴⁹ mTNFα(막대 쌍 12, 13 및 14에서 우측 막대) 및 PBS(막대 쌍 1 및 2에서 우측 막대)에 대한 혈청 역가가 표시되어 있다. 각각의 측정 전, 혈청 샘플을 PBS 완충제 중의 1% BSA로 1/800(도 17a), 1/200(도 17b), 1/200(도 17c) 또는 1/200(도 17d) 비율로 희석하였다.

결과는 위치 11에 존재하는 pNO₂Phe이 pNO₂Phe¹¹ mTNFα 면역원에 대한 IgG 반응과 동일한, wt mTNFα에 대한 고역가 IgG 반응을 유도함을 보여준다. 대조적으로, 위치 21, 42 및 49의 돌연변이 또한 pNO₂Phe 함유 면역원에 대한 고역가 IgG 반응을 유도하였지만, IgG 항체는 wt mTNFα에 대한 중등도의 교차 반응성만을 보였다.

도 18은 리포폴리사카라이드(LPS) 자극 후 다양한 pNO₂Phe mTNFα 돌연변이체로 면역화된 마우스에 대한 유의한 생존 이점이 존재함을 보여준다. 도 18A에서, LPS 자극 1일 전 pNO₂Phe¹¹ mTNFα 및 pNO₂Phe⁴⁹ mTNFα로 면역화된 마우스로부터 정제된 IgG 4 mg/kg을 수컷 C57BL/6 마우스에게 복강내로 주사하였다. 도 18B에서, LPS 자극 1일 전 pNO₂Phe²¹ mTNFα 및 pNO₂Phe⁴² mTNFα로 면역화된 마우스로부터 정제된 IgG 4 mg/kg을 상기 마우스에게 복강내로 주사하였다. 이 마우스들의 캐플란-메이에르 생존 곡선을 대조군 IgG를 주사받은 마우스(n=8/군)와 비교하였다. 대조군에 대한, 수식된 TNF 각각으로 면역화된 마우스의 생존 이점(p<0.01)을 본페로니 보정과 함께 로그 등급 시험을 이용하여 분석하였다.

항-pNO₂Phe¹¹ mTNFα IgG를 제공받은 모든 마우스들은 치명적인 LPS 자극에서 생존하였다. 중등도의 교차 반응성 항-pNO₂Phe²¹ mTNFα IgG, 항-pNO₂Phe⁴² mTNFα IgG 및 항-pNO₂Phe⁴⁹ mTNFα IgG를 제공받은 다른 군들이 75% 이상의 생존율을 보인 반면, 항-wt mTNFα IgG를 주사받은 마우스는 단지 13%의 생존율을 보였다. 따라서, pNO₂Phe을 사용한 자가 내성 파괴 능력은 단일 아미노산 위치에 의존하지 않는다.

도 19는 제2 자가 항원인 mRBP4에 대한 내성의 상실을 보여주는 실험 결과를 보여준다. wt mRBP4(도 19a), pNO₂Phe⁴³ mRBP4(도 19b) 및 pNO₂Phe¹⁰⁸ mRBP4(도 19c)로 면역화된 Bcl-2 마우스에 대한 혈청 역가가 표시되어 있다. wt mRBP4(1, 2, 3, 7, 8 및 9에서 단일 막대; 막대 쌍 4, 5 및 6 각각에서 좌측 막대) 및 pNO₂Phe⁴³ mRBP4(막대 쌍 4, 5 및 6 각각에서 우측 막대)에 대해 ELISA를 측정하였다. 측정 전, 혈청 샘플을 PBS 완충제 중의 1% BSA로 1:1,000 비율로 희석하였다. 도 19B는 pNO₂Phe⁴³ mRBP4로 면역화된 C57BL/6 마우스로부터 유래되고 pNO₂Phe⁴³ mRBP4의 연속 희석물로 시험관내에서 자극받은 CD₄ ⁺ T 세포의 증식을 보여주는 결과를 보여준다.

도 19에 나타낸 ELISA 분석에 따르면, wt mRBP4 또는 pNO₂Phe¹⁰⁸ mRBP4로 면역화된 마우스는 wt mRBP4에 대한 무의미한 혈청 IgG 역가를 보였다. 대조적으로, pNO₂Phe⁴³ mRBP4로 면역화된 마우스는 pNO₂Phe⁴³ mRBP4 면역원 및 야생형 단백질 둘 다에 결합하는 현저히 높은 혈청 IgG 역가(1:100,000 이하)를 보이는 것으로 확인되었다.

도 20은 wt mTNFα가 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα에 의해 유도된 내성 상실을 지속할 수 없음을 보여준다. RIMMS 프로토콜에 따라 wt mTNFα(도 20a), pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα(도 20b) 및 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα에 이은 wt mTNFα(도 20c)로 면역화된 Bcl-2 마우스에 대한 혈청 역가가 표시되어 있다. 도 20c의 경우, 면역화는 CFA 중의 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα의 1회 제1 주사, 및 IFA 중의 wt mTNFα의 7회 후속 주사를 포함하였다. ELISA 측정 전, 혈청 샘플을 PBS 완충제 중의 1% BSA로 1:1,000의 비율로 희석하였다. wt mTNFα(막대 쌍 각각에서 좌측 막대) 또는 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα(막대 쌍 각각에서 우측 막대)에 대해 ELISA를 측정하였다. pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα와 대조적으로, wt mTNFα는 교차 반응성 항-mTNFα 항체의 유의한 역가를 지속할 수 없다. 이 결과는 pNO₂Phe에 의해 유도된 자가 내성의 파괴가 니트로페닐 기에 의해 매개되는 T 세포 반응을 필요로 한다는 결론을 지지한다.

도 21은 3개의 mTNFα 단편들의 질량 분광측정 분석의 결과를 보여준다. 도 21a는 N-말단 단편 mTNFα(aa 1-60)(계산 질량: 7776.51)의 MALDI-TOF 질량 분광측정 분석을 보여준다. 도 21b는 내부 단편 mTNFα(aa 61-100)(계산 질량: 5597.36)의 MALDI-TOF 질량 분광측정 분석을 보여준다. 도 21c는 C-말단 단편 mTNFα(aa 101-156)(계산 질량 7388.18)의 MALDI-TOF 질량 분광측정 분석을 보여준다. 도 21에 나타낸 각 패널에서 피크는 TNFα 단편들 각각이 예측된 질량을 가짐을 확인시켜준다.

항-mTNFα mAb와 3개의 mTNFα 단편들의 결합을 측정하기 위한 실험을 수행하였다. 도 22에서, wt mTNFα aa 1-156(4개의 막대로 구성된 군 각각에서 제1 막대) 또는 wt mTNFα aa 1-60(4개의 막대로 구성된 군 각각에서 제2 막대), wt mTNFα aa 61-100(4개의 막대로 구성된 군 각각에서 제3 막대) 및 wt mTNFα aa 101-156(4개의 막대로 구성된 군 각각에서 제4 막대)에 대해 ELISA를 측정하였다. 항-mTNFα IgG를 분비하는 50개의 하이브리도마가 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα-면역화된 마우스로부터 발생되었다. mTNFα의 3개 단편들, 즉 N-말단 단편(aa 1-60), 내부 단편(aa 61-100) 및 C-말단 단편(aa 101-156)이 이. 콜라이로부터 발현되고 정제되었다. pNO₂Phe이 원래의 면역원에서 위치 86(내부 단편)에서 코딩됨을 주목해야 한다. 각각의 단편 및 대조군으로서의 wt mTNFα를 사용하여 ELISA 분석을 수행하였다. 상기 단편들 중 하나에 결합하는 항체는 다음과 같이 표시되어 있다: 정사각형: N-말단 단편; 별모양: C-말단 단편). 6개의 mAb만이 한 단편을 명확히 인식하는 것으로 확인되었다. 하나의 mAb(6G17)가 3개의 단편을 모두 인식하였고 아마도 비특이적 결합 활성을 나타내는 듯하다. 주목할 만한 것은 50개의 mAb 중 어느 것도 돌연변이체 TNFα 내의 pNO₂Phe을 함유하는 영역인 중간 단편에 상응하는 선형 에피토프를 인식하지 못한다는 것이다.

도 23은 pNO₂Phe이 mTNFα의 표면 노출된 부위 내로 도입되었는지를 확인하기 위해 수행된 실험의 결과를 보여준다. 도 23A는 표시된 Lys¹¹, Gln²¹, Asp⁴², Val⁴⁹ 및 Tyr⁸⁶을 가진 mTNFα 삼량체의 X-선 결정 구조의 개략도를 제공한다(PDB ID 코드 2TNF)³⁰. 문헌[Baeyens, et al., (1999) "The structure of mouse tumour-necrosis factor at 1.4 A resolution: towards modulation of its selectivity and trimerization. "Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 55: 772-8]을 참조한다. 도 23B는 pNO₂Phe¹¹ mTNFα(레인 1), pNO₂Phe¹⁹ mTNFα(레인 2), pNO₂Phe²¹ mTNFα(레인 3), pNO₂Phe⁴² mTNFα(레인 4), pNO₂Phe⁴⁹ mTNFα(레인 5) 및 wt mTNFα(레인 6)의 SDS-PAGE 겔 분석을 보여준다. 천연 조건 하에 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피로 단백질 샘플을 정제하고 코마시 G-250 염색을 이용한 SDS-PAGE로 분석하였다. 도 23C는 wt mTNFα(작은 정사각형), pNO₂Phe¹¹ mTNFα(삼각형), pNO₂Phe²¹ mTNFα(빈 마름모형), pNO₂Phe⁴² mTNFα(채워진 마름모형), pNO₂Phe⁴⁹ mTNFα(원형) 및 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα(큰 정사각형)의 NFκB-루시퍼라제 활성 분석의 결과를 제공한다. 따라서, 모든 돌연변이체들은 이 분석에서 야생형 단백질의 활성의 2% 활성만을 보이는, 이전에 특징규명된 pNO₂Phe⁸⁶ mTNFα보다 유의하게 더 높은 활성을 보인다.

도 24는 mRBP4의 표면 부위 내로의 pNO₂Phe의 부위 특이적 도입을 확인하기 위해 수행된 실험의 결과를 보여준다. 도 24A는 표시된 Tyr⁴³ 및 Tyr¹⁰⁸을 가진 인간 RBP4의 X-선 결정 구조의 개략도를 보여준다(PDB ID 코드 1RBP)²¹. 문헌[Cowan, et al., (1990) Crystallographic refinement of human serum retinol binding protein at 2A resolution. Proteins 8: 44-61]을 참조한다. 레티놀 보조인자는 황색으로 표시되어 있다. 도 24B는 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피 후 wt mRBP4, pNO₂Phe⁴³ mRBP4 및 pNO₂Phe¹⁰⁸ mRBP4의 SDS-PAGE 분석을 보여주는데, 이 분석은 각각의 돌연변이체가 삼량체화됨을 보여준다. 도 24C는 1 mM pNO₂Phe의 부재(레인 1) 및 존재(레인 2) 하에 mRBP4의 Tyr⁴³ 앰버 돌연변이체의 발현, 및 1 mM pNO₂Phe의 부재(레인 3) 및 존재(레인 4) 하에 mRBP4의 Tyr¹⁰⁸ 앰버 돌연변이체의 발현을 보여준다. 이 결과는 pNO₂Phe이 높은 특이성으로 mRBP 돌연변이체 내로 도입됨을 보여준다. 변성 조건 하에 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피로 단백질 샘플을 정제하고 코마시 G-250 염색을 이용한 SDS-PAGE로 분석하였다. 레인 5는 wt mRBP4를 함유한다.

도 25에서, pNO₂Phe⁴³ mRBP4 및 pNO₂Phe¹⁰⁸ mRBP4의 트립신 분해 단편들의 MS/MS 분석은 pNO₂Phe의 도입에 대한 패턴과 일치한다. 도 25a는 십일량체 단편 FSGLWXAIAKK의 탠덤 질량 스펙트럼을 보여주고, 이때 X는 pNO₂Phe을 나타낸다. 상기 단편은 pNO₂Phe⁴³ mRBP4의 트립신 분해로부터 수득되었다. 도 25b는 십일량체 단편 MKXWGVASFLQR의 탠덤 질량 스펙트럼을 보여주고, 이때 X는 pNO₂Phe을 나타낸다. 이 단편은 pNO₂Phe¹⁰⁸ mRBP4의 트립신 분해로부터 수득되었다. pNO₂Phe을 함유하는 펩티드 올리고머의 부분 서열은 해석된 b 또는 y 이온 시리즈로부터 판독될 수 있다.

도 26은 C57BL/6 마우스에서 pNO₂Phe⁴³ mRBP의 면역원성을 측정하기 위해 수행된 실험의 결과를 보여준다. 도 26a는 wt mRBP4로 면역화된 C57BL/6 마우스의 경우 wt mRBP4 및 pNO₂Phe⁴³ mRBP4에 대한 혈청 역가를 보여준다. 도 26b는 pNO₂Phe⁴³ mRBP4로 면역화된 C57BL/6 마우스에 대한 wt mRBP4 및 pNO₂Phe⁴³ mRBP4에 대한 혈청 역가를 보여준다. wt mRBP4(군 1 내지 10에서 제2 막대 및 제1 막대) 또는 pNO₂Phe⁴³ mRBP4(군 6 내지 10에서 제4 막대 및 제3 막대)에 대해 ELISA를 측정하였다. 측정 전, 혈청 샘플을 PBS 완충제 중의 1% BSA로 1:100 또는 1:1,000 비율로 희석하였다.

이 ELISA 분석에 따르면, wt mRBP4 또는 pNO₂Phe¹⁰⁸ mRBP4로 면역화된 마우스는 wt mRBP4에 대한 무의미한 혈청 IgG 역가를 보였다. 대조적으로, pNO₂Phe⁴³ mRBP4로 면역화된 마우스는 pNO₂Phe⁴³ mRBP4 면역원 및 야생형 단백질 둘 다에 결합하는, 현저히 높은 혈청 IgG 역가(1:100,000 이하)를 나타내는 것으로 밝혀졌다.

도 27a는 pNO₂Phe⁴³ mRBP4의 pNO₂Phe 함유 트립신 분해 단편의 MS/MS 시퀀싱의 결과를 제공한다. pNO₂Phe을 함유하는 트립신 분해 단편의 서열은 단문자 코드(X, pNO₂Phe)로 표시되어 있다. y 시리즈 및 b 시리즈의 관찰된 단편 이온들이 표시되어 있다. pNO₂Phe의 도입을 입증하는 핵심 y 이온 및 b 이온은 적색으로 표시되어 있다. 모든 질량은 단일동위원소 질량으로서 기재되어 있다. 도 27b는 pNO₂Phe¹⁰⁸ mRBP4의 pNO₂Phe 함유 트립신 분해 단편의 MS/MS 시퀀싱의 결과를 제공한다. pNO₂Phe을 함유하는 트립신 분해 단편의 서열은 단문자 코드(X, pNO₂Phe)로 표시되어 있다. y 시리즈 및 b 시리즈의 관찰된 단편 이온들이 표시되어 있다. pNO₂Phe의 도입을 입증하는 핵심 y 이온 및 b 이온은 b₉, b₁₀, y₁₀, y₉, y₈, y₇ 및 y₆이다. 모든 질량은 단일동위원소 질량으로서 기재되어 있다.

상기 본 발명이 명료함 및 이해를 위해 다소 상세히 기재되어 있지만, 형태 및 세부설명에서의 다양한 변화가 본 발명의 진정한 범위를 벗어나지 않으면서 만들어질 수 있음이 본 개시내용을 읽은 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 전술된 모든 기법 및 장치는 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 본원에서 인용된 모든 간행물, 특허, 특허출원 또는 다른 문헌들은 개개의 간행물, 특허, 특허출원 또는 다른 문헌 각각이 모든 목적을 위해 참고로 도입되는 것으로 개별적으로 기재되어 있는 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 전체가 참고로 도입된다.

SEQUENCE LISTING <110> The Scripps Research Institute <120> Breaking Immunological Tolerance with a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid <130> 54-002750PC <140> PCT/US2009/000813 <141> 2009-07-02 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 1 atatacatat gctcagatca tcttctcaaa attcg 35 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 2 aacaacctcg agttatcaca gagcaatgac tccaaagt 38 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonuclotide primer <400> 3 ctgtacttcc agggcgagcg cgactgcagg g 31 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 4 aattaagtcg cgttacaaac tgtttctgga gggcc 35 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 5 gccctggaag tacaggtttt cgtgatgatg atgatgatg 39 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 6 taacgcgact taattaactc gtttaaacgg tctccagc 38 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11 amino acid fragment of mRBP4 <220> <221> Xaa <222> (6)..(6) <223> Xaa = p-nitrophenylalanine <400> 7 Phe Ser Gly Leu Trp Xaa Ala Ile Ala Lys Lys 1 5 10 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 12 amino acid fragment of mRBP4 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa = p-nitrophenylalanine <400> 8 Met Lys Xaa Trp Gly Val Ala Ser Phe Leu Gln Arg 1 5 10 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8 amino acid tryptic fragment of TNFalpha <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa = p-nitrophenylalanine <400> 9 Phe Ala Ile Ser Xaa Gln Glu Lys 1 5

Claims (121)

1. 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 면역원을 제공하는 단계; 및
   상기 비천연 면역원을 대상체에 투여함으로써 표적 부분(target moiety)에 대한 면역학적 반응을 일으키거나 증강시키는 단계로서, 이때 상기 대상체는 상기 비천연 면역원에 대한 하나 이상의 항체를 생성하고, 상기 항체는 상기 표적 부분에 대해 교차 반응성을 나타내는 것인 단계
   를 포함하는, 대상체에서 표적 부분에 대한 면역학적 반응을 일으키거나 증강시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 면역학적 반응이 B 세포 매개 반응 및/또는 T 세포 매개 반응을 포함하는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 비천연 면역원을 제공하는 단계가 오르토고날(orthogonal) 번역 시스템에서 비천연 면역원을 제조하는 것을 포함하는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 비천연 면역원을 제공하는 단계가 시험관내 번역 시스템에서 비천연 면역원을 제조하는 것을 포함하는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 비천연 면역원이 20종의 정규 천연 아미노산 중 하나 이외의 비천연 아미노산을 포함하는 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 비천연 면역원이 이 면역원의 20종의 정규 천연 아미노산 중 하나의 화학적 수식 이외의 과정에 의해 제조되는 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 비천연 면역원이 이 면역원의 20종의 정규 천연 아미노산 중 하나의 번역 후 수식 이외의 과정에 의해 제조되는 것인 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 대상체가 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 소, 닭, 관행 케이지 사육조(cage birds), 개방형 복지 케이지 사육조(aviary birds), 파충류 및 양서류로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 표적 부분이 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 표적 부분이 폴리펩티드 및/또는 탄수화물을 포함하는 것인 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 표적 부분이 대상체의 자가 부분인 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 표적 부분이 질환 관련 부분인 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 자가 부분이 자가면역 질환과 관련된 자가 항원, 종양 관련 항원, 알츠하이머병 관련 항원, 아밀로이드 베타40, 아밀로이드 베타42, 유방암 관련 항원, 난소암 관련 항원, 전립선암 관련 항원, MAGE, BAGE, RAGE, NY-ESO, 계통 특이적 종양 관련 항원, 멜라닌세포-흑색종 계통 항원, MART-1/Melan-A, 티로시나제 또는 티로시나제 관련 단백질, 티로시나제 관련 단백질 2, PSMA, PSA, 돌연변이 ras, 재배열 bcr/ab1, Her2/neu, 돌연변이 또는 야생형 p53, 사이토크롬 P450 1B1, N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제-V의 비정상적으로 발현된 인트론 서열, CA19-9, p53, OCAA, HOXB7, Ca125, PSA, PSMA, STEAP, PCTA-1, Ca15-3, EGF, EGFR, HER-1, CXCR4, G 단백질 커플링 수용체(GCPR) 또는 CA27-29 중 하나 이상인 방법.
14. 제1항에 있어서, 상기 표적 부분이 대상체의 자가 부분이 아닌 것인 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 표적 부분이 박테리아, 바이러스, 진균, 마이코플라스마, 원생동물, 연충 또는 프리온으로부터 유래되는 것인 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 표적 부분이 박테리아 항원, 바이러스 항원, 진균 항원, 마이코플라스마 항원, 원생동물 항원, 연충 항원, 프리온 항원, HIV 항원, HIV gp120, HIV gp41, HIV gag, HIV pol, HIV env, HIV tat, HIV nef, HIV rev, 칼리시바이러스(calicivirus) 캡시드 항원, B형 간염 코어 항원, B형 간염 표면 항원, 간염 델타 물질, 허피스 심플렉스 바이러스 당단백질, 수두 대상포진 바이러스 당단백질, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제, 인플루엔자 바이러스 핵단백질, HPV 캡시드 단백질, 파라인플루엔자(parainfluenza) 바이러스 헤마글루티닌/뉴라미니다제, 폴리오바이러스(poliovirus) 캡시드 폴리펩티드, Hep A 항원, 백시니아 바이러스 폴리펩티드, 공수병 바이러스 당단백질 G, 비. 버그도페리(B. burgdorferi) OspA, 에이치. 인플루엔자(H. influenzae) 타입 b 외막 단백질, 마이코박테리움 리포아라비노만난, 마이코박테리움 mAPG, 에스. 파이오진스(S. pyogenes) M 단백질, 에스. 뉴모니아(S. pneumoniae) 캡슐형 폴리사카라이드, 와이. 페스티스(Y. pestis) F1, 와이. 페스티스 V 항원, 피. 팔시파룸 서컴스포로조이트(P. falciparum circumsporozoite)(PfCSP), 피. 팔시파룸 스포로조이트(P. falciparum sporozoite) 표면 단백질 2(PfSSP2), 간 상태(liver state) 항원 1의 피. 팔시파룸 카르복실 말단(PfLSA1 c-말단), 피. 팔시파룸 외수송 단백질 1(PfExp-1), Pfs 48/45, Pfs 28, Pfs 25 또는 Pfs 230 중 하나 이상인 방법.
17. 제15항에 있어서, 상기 표적 부분이 박테리아, 바이러스, 진균, 마이코플라스마, 원생동물, 연충, 프리온, 액티노마이세스(Actinomyces), 바실러스(Bacillus), 박테로이드(Bacteroides), 보르데텔라(Bordetella), 바르토넬라(Bartonella), 보렐리아(Borrelia), 브루셀라(Brucella), 캠필로박터(Campylobacter), 캡노사이토파가(Capnocytophaga), 클라미디아(Chlamydia), 클로스트리듐(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 콕시엘라(Coxiella), 더마토필러스(Dermatophilus), 엔테로코커스(Enterococcus), 에를리히아(Ehrlichia), 에스케리키아(Escherichia), 프란시셀라(Francisella), 푸소박테리움(Fusobacterium), 해모바르토넬라(Haemobartonella), 해모필러스(Haemophilus), 헬리코박터(Helicobacter), 크렙시엘라(Klebsiella), L형 박테리아, 렙토스피라(Leptospira), 리스테리아(Listeria), 마이코박테리움, 마이코플라스마, 네이세리아(Neisseria), 네오릿케치아(Neorickettsia), 노카르디아(Nocardia), 파스투렐라(Pasteurella), 펩토코커스(Peptococcus), 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus), 뉴모코커스(Pneumococcus), 프로테우스(Proteus), 슈도모나스(Pseudomonas), 릿케치아(Rickettsia), 로칼리매아(Rochalimaea), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 트레포네마(Treponema), 여시니아(Yersinia), 아데노바이러스(adenovirus), 알파바이러스(alphavirus), 칼리시바이러스, 코로나바이러스(coronavirus), CMV, 디스템퍼(distemper) 바이러스, 에볼라(Ebola) 바이러스, 엔테로바이러스(enterovirus), EBV, 플라비바이러스(flavivirus), Hep C, 헤파드나바이러스(hepadnavirus), Hep B, 간염 델타 물질, Hep E 또는 F 바이러스, GBV-C, 허피스바이러스(herpesvirus), 허피스 심플렉스 바이러스, 수두 대상포진 바이러스, 면역결핍 바이러스, HIV, 감염성 복막염 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스, 백혈병 바이러스, 마버그(Marburg) 바이러스, 오르토믹소바이러스(orthomyxovirus), 파필로마(papilloma) 바이러스, HPV, 파라인플루엔자 바이러스, 파라믹소바이러스(paramyxovirus), RSV, 파보바이러스(parvovirus), 페스티바이러스(pestivirus), 피코나(picorna) 바이러스, 폴리오바이러스, 폭스(pox) 바이러스, 백시니아 바이러스, 공수병 바이러스, 레오바이러스(reovirus), 레트로바이러스(retrovirus), 로타바이러스(rotavirus), 압시디아(Absidia), 아크레모늄(Acremonium), 알터나리아(Alternaria), 아스퍼질러스(Aspergillus), 바시디오볼루스(Basidiobolus), 비폴라리스(Bipolaris), 블라스토마이세스(Blastomyces), 칸디다(Candida), 콕시디오이드(Coccidioides), 코니디오볼루스(Conidiobolus), 크립토코커스(Cryptococcus), 쿠르발라리아(Curvalaria), 에피더모파이톤(Epidermophyton), 엑소피알라(Exophiala), 지오트리쿰(Geotrichum), 히스토플라스마(Histoplasma), 마두렐라(Madurella), 말라스세지아(Malassezia), 마이크로스포룸(Microsporum), 모닐리엘라(Moniliella), 모르티에렐라(Mortierella), 뮤코(Mucor), 패실로마이세스(Paecilomyces), 페니실륨(Penicillium), 피알레모늄(Phialemonium), 피알로포라(Phialophora), 프로토테카(Prototheca), 슈달레스케리아(Pseudallescheria), 슈도마이크로도키움(Pseudomicrodochium), 파이티움(Pythium), 리노스포리듐(Rhinosporidium), 리조푸스(Rhizopus), 스콜레코바시듐(Scolecobasidium), 스포로트릭스(Sporothrix), 스템파일리움(Stemphylium), 트리코파이톤(Trichophyton), 트리코스포론(Trichosporon), 크실로하이파(Xylohypha), 바베시아(Babesia), 발란티듐(Balantidium), 베스노이티아(Besnoitia), 크립토스포리듐(Cryptosporidium), 에이메리아(Eimeria), 엔세팔리토조온(Encephalitozoon), 엔타모에바(Entamoeba), 기아르디아(Giardia), 함몬디아(Hammondia), 헤파토조온(Hepatozoon), 이소스포라(Isospora), 레이쉬마니아(Leishmania), 마이크로스포리디아(Microsporidia), 네오스포라(Neospora), 노세마(Nosema), 펜타트리코모나스(Pentatrichomonas), 플라스모듐(Plasmodium), 피. 팔시파룸, 뉴모시스티스(Pneumocystis), 사코시스티스(Sarcocystis), 스키스토소마(Schistosoma), 테일레리아(Theileria), 톡소플라스마(Toxoplasma), 트리파노소마(Trypanosoma), 아칸소케일로네마(Acanthocheilonema), 앨루로스트론길루스(Aelurostrongylus), 안실로스토마(Ancylostoma), 안지오스트론길루스(Angiostrongylus), 아스카리스(Ascaris), 브루기아(Brugia), 부노스토뭄(Bunostomum), 캐필라리아(Capillaria), 차베르티아(Chabertia), 코오페리아(Cooperia), 크레노소마(Crenosoma), 딕티오카울루스(Dictyocaulus), 디옥토파임(Dioctophyme), 디페탈로네마(Dipetalonema), 디파일로보스륨(Diphyllobothrium), 디플라이듐(Diplydium), 디로필라리아(Dirofilaria), 드라쿤쿨러스(Dracunculus), 엔테로비우스(Enterobius), 필라로이데스(Filaroides), 해몬쿠스(Haemonchus), 라고킬라스카리스(Lagochilascaris), 로아(Loa) 폴리펩티드, 만소넬라(Mansonella), 무엘레리우스(Muellerius), 나노파이에투스(Nanophyetus), 네카토르(Necator), 네마토디루스(Nematodirus), 오에소파고스토뭄(Oesophagostomum), 온코세르카(Onchocerca), 오피스토르키스(Opisthorchis), 오스터타기아(Ostertagia), 파라필라리아(Parafilaria), 파라고니무스(Paragonimus), 파라스카리스(Parascaris), 파이살로프테라(Physaloptera), 프로토스트론길루스(Protostrongylus), 세타리아(Setaria), 스피로세르카(Spirocerca), 스피로메트라(Spirometra), 스테파노필라리아(Stephanofilaria), 스트론길로이데스(Strongyloides), 스트론길루스(Strongylus), 텔라지아(Thelazia), 톡사스카리스(Toxascaris), 톡소카라(Toxocara), 트리키넬라(Trichinella), 트리코스트론길루스(Trichostrongylus), 트리쿠리스(Trichuris), 운시나리아(Uncinaria) 또는 우케레리아(Wuchereria) 중 하나 이상으로부터 유래되는 것인 방법.
18. 제1항에 있어서, 상기 표적 부분이 제1 아미노산 서열을 포함하고, 상기 비천연 면역원이 제2 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제1 아미노산 서열의 하나 이상의 천연 아미노산이 상기 제2 아미노산 서열의 하나 이상의 비천연 아미노산으로 치환된 것을 제외하고는 상기 제2 아미노산 서열이 상기 제1 아미노산 서열과 동일한 것인 방법.
19. 제1항에 있어서, 상기 표적 부분이 제1 아미노산 서열을 포함하고, 상기 비천연 면역원이 제2 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제2 아미노산 서열이 하나 이상의 추가적인 비천연 아미노산을 추가로 포함하는 것을 제외하고는 상기 제2 아미노산 서열이 상기 제1 아미노산 서열과 동일한 것인 방법.
20. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 교차 반응성 항체가, 상기 비천연 면역원 상의 상응하는 에피토프와 비교할 때 동일한 서열을 포함하는 표적 부분 상의 에피토프에 대해 특이성을 나타내는 것인 방법.
21. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 교차 반응성 항체가, 비천연 면역원 상의 상응하는 에피토프와 비교할 때 상이한 서열을 포함하는 표적 부분 상의 에피토프에 대해 특이성을 나타내는 것인 방법.
22. 제21항에 있어서, 상기 비천연 면역원 상의 상응하는 에피토프 상의 상이한 서열이 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 것인 방법.
23. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 비천연 아미노산은 항체의 접근이 가능한 것인 방법.
24. 제1항에 있어서, 상기 비천연 면역원이 표적 부분과 실질적으로 유사한 구조를 포함하는 것인 방법.
25. 제1항에 있어서, 상기 비천연 면역원이 표적 부분과 실질적으로 유사한 3차 구조 및/또는 4차 구조를 포함하는 것인 방법.
26. 제1항에 있어서, 상기 비천연 아미노산이 20종의 정규 아미노산 중 하나 이외의 아미노산이고, 상기 비천연 아미노산이 하기 화학식 I, II, III 또는 IV의 구조를 포함하는 것인 방법:
    화학식 I
    

    

    
    화학식 II
    

    

    
    화학식 III
    

    

    
    화학식 IV
    

    

    
    상기 식에서,
    R은 20종의 정규 천연 아미노산 중 임의의 아미노산에서 사용되는 측쇄 이외의 임의의 치환기이고;
    R₁은 20종의 정규 천연 아미노산 중 하나에서 사용되는 임의의 치환기이고;
    R₂는 R₂-R₁이 함께 20종의 정규 천연 아미노산 중 임의의 아미노산의 측쇄 이외의 것이 되도록 하는 임의의 치환기이고;
    Z는 OH, NH₂, SH, NH-R' 또는 S-R'이고, 이때 R'는 H 이외의 임의의 치환기이고;
    X 및 Y는 각각 S 또는 O이다.
27. 제1항에 있어서, 상기 비천연 아미노산이 p-니트로페닐알라닌; o-니트로페닐알라닌; m-니트로페닐알라닌; p-보로닐 Phe; o-보로닐 Phe; m-보로닐 Phe; p-아미노 Phe; o-아미노 Phe; m-아미노 Phe; p-아실 Phe; o-아실 Phe; m-아실 Phe; p-OMe Phe; o-OMe Phe; m-OMe Phe; p-설포 Phe; o-설포 Phe; m-설포 Phe; 5-니트로 His; 3-니트로 Tyr; 2-니트로 Tyr; 니트로 치환된 Leu; 니트로 치환된 His; 니트로 치환된 Ile; 니트로 치환된 Trp; 2-니트로 Trp; 4-니트로 Trp; 5-니트로 Trp; 6-니트로 Trp; 7-니트로 Trp; 3-아미노티로신; 2-아미노티로신; O-설포티로신; 2-설포옥시페닐알라닌; 3-설포옥시옥시페닐알라닌 또는 p-카르복시페닐알라닌; o-카르복시페닐알라닌; 및 m-카르복시페닐알라닌으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
28. 제12항에 있어서, 상기 표적 부분이 TNFα인 방법.
29. 제28항에 있어서, 상기 대상체가 마우스이고, 상기 표적 부분이 mTNFα이며, 상기 면역원이 비천연 mTNFα인 방법.
30. 제29항에 있어서, 상기 비천연 mTNFα가 pNO₂Phe⁸⁶-mTNFα를 포함하는 것인 방법.
31. 제29항에 있어서, 상기 비천연 mTNFα가 pNO₂Phe¹¹-mTNFα, pNO₂Phe¹⁹-mTNFα, pNO₂Phe²¹-mTNFα, pNO₂Phe⁴²-mTNFα, pNO₂Phe⁴⁹-mTNFα, pNO₂Phe¹⁰⁴-mTNFα 및 pNO₂Phe¹¹³-mTNFα로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
32. 제28항에 있어서, 상기 대상체가 인간이고, 상기 표적 부분이 hTNFα이며, 상기 면역원이 비천연 hTNFα인 방법.
33. 제32항에 있어서, 상기 비천연 hTNFα가 pNO₂Phe¹¹-hTNFα, pNO₂Phe¹⁹-hTNFα, pNO₂Phe²¹-hTNFα, pNO₂Phe⁴²-hTNFα, pNO₂Phe⁴⁹-hTNFα, pNO₂Phe⁸⁷-hTNFα, pNO₂Phe¹⁰⁵-hTNFα 및 pNO₂Phe¹¹⁴-hTNFα로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
34. 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 면역원을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 상태를 예방적으로 또는 치유적으로 치료하는 방법으로서, 상기 비천연 면역원은 상기 질환 상태와 관련된 대상체 내에 존재하는 하나 이상의 표적 부분에 대해 또는 대상체 내에 존재할 수 있는 하나 이상의 표적 부분에 대해 교차 반응성을 나타내는 항체의 생성을 대상체 내에서 자극하는 것인 방법.
35. 하나 이상의 표적 부분에 대한 항체를 생성하는 단계로서, 상기 항체의 생성이 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 면역원에 대한 항체를 제조하는 것을 포함하고, 상기 항체가 상기 표적 부분에 대해 교차 반응성을 나타내는 것인 단계; 및
    상기 항체를 대상체에 투여하는 단계
    를 포함하는, 대상체에서 질환 상태를 예방적으로 또는 치유적으로 치료하는 방법.
36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 예방적 또는 치유적 치료가 대상체에서 B 세포 매개 반응 및/또는 T 세포 매개 반응을 일으키는 것을 포함하는 것인 방법.
37. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 비천연 면역원이 오르토고날 번역 시스템에서 제조되는 것인 방법.
38. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 비천연 면역원이 시험관내 번역 시스템에서 제조되는 것인 방법.
39. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 비천연 면역원이 번역 후 수식된 또는 화학적으로 수식된 아미노산을 포함하지 않는 것인 방법.
40. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 비천연 면역원이 20종의 정규 천연 아미노산 중 하나 이외의 비천연 아미노산을 포함하는 것인 방법.
41. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 비천연 면역원이 이 면역원의 20종의 정규 천연 아미노산 중 하나의 화학적 수식 이외의 과정에 의해 제조되는 것인 방법.
42. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 비천연 면역원이 이 면역원의 20종의 정규 천연 아미노산 중 하나의 번역 후 수식 이외의 과정에 의해 제조되는 것인 방법.
43. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 질환 상태가 자가면역 질환, 암, 박테리아 감염, 바이러스 감염, 진균 감염, 마이코플라스마 감염, 프리온 감염, 원생동물 감염 또는 연충 감염인 방법.
44. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 대상체가 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 소, 닭, 관행 케이지 사육조, 개방형 복지 케이지 사육조, 파충류 및 양서류로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
45. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 표적 부분이 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
46. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 표적 부분이 폴리펩티드 및/또는 탄수화물을 포함하는 것인 방법.
47. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 표적 부분이 대상체의 자가 부분인 방법.
48. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 표적 부분이 질환 관련 부분인 방법.
49. 제48항에 있어서, 상기 표적 부분이 자가면역 질환과 관련된 자가 항원, 종양 관련 항원, 알츠하이머병 관련 항원, 아밀로이드 베타40, 아밀로이드 베타42, 유방암 관련 항원, 난소암 관련 항원, 전립선암 관련 항원, MAGE, BAGE, RAGE, NY-ESO, 계통 특이적 종양 관련 항원, 멜라닌세포-흑색종 계통 항원, MART-1/Melan-A, 티로시나제 또는 티로시나제 관련 단백질, 티로시나제 관련 단백질 2, PSMA, PSA, 돌연변이 ras, 재배열 bcr/ab1, Her2/neu, 돌연변이 또는 야생형 p53, 사이토크롬 P450 1B1, N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제-V의 비정상적으로 발현된 인트론 서열, CA19-9, p53, OCAA, HOXB7, Ca125, PSA, PSMA, STEAP, PCTA-1, Ca15-3, EGF, EGFR, HER-1, CXCR4, G 단백질 커플링 수용체(GCPR) 또는 CA27-29 중 하나 이상인 방법.
50. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 표적 부분이 대상체의 자가 부분이 아닌 것인 방법.
51. 제50항에 있어서, 상기 표적 부분이 박테리아, 바이러스, 진균, 마이코플라스마, 원생동물, 연충 또는 프리온으로부터 유래되는 것인 방법.
52. 제51항에 있어서, 상기 표적 부분이 박테리아 항원, 바이러스 항원, 진균 항원, 마이코플라스마 항원, 원생동물 항원, 연충 항원, 프리온 항원, HIV 항원, HIV gp120, HIV gp41, HIV gag, HIV pol, HIV env, HIV tat, HIV nef, HIV rev, 칼리시바이러스 캡시드 항원, B형 간염 코어 항원, B형 간염 표면 항원, 간염 델타 물질, 허피스 심플렉스 바이러스 당단백질, 수두 대상포진 바이러스 당단백질, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제, 인플루엔자 바이러스 핵단백질, HPV 캡시드 단백질, 파라인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌/뉴라미니다제, 폴리오바이러스 캡시드 폴리펩티드, Hep A 항원, 백시니아 바이러스 폴리펩티드, 공수병 바이러스 당단백질 G, 비. 버그도페리 OspA, 에이치. 인플루엔자 타입 b 외막 단백질, 마이코박테리움 리포아라비노만난, 마이코박테리움 mAPG, 에스. 파이오진스 M 단백질, 에스. 뉴모니아 캡슐형 폴리사카라이드, 와이. 페스티스 F1, 와이. 페스티스 V 항원, 피. 팔시파룸 서컴스포로조이트(PfCSP), 피. 팔시파룸 스포로조이트 표면 단백질 2(PfSSP2), 간 상태 항원 1의 피. 팔시파룸 카르복실 말단(PfLSA1 c-말단), 피. 팔시파룸 외수송 단백질 1(PfExp-1), Pfs 48/45, Pfs 28, Pfs 25 또는 Pfs 230 중 하나 이상인 방법.
53. 제51항에 있어서, 상기 표적 부분이 박테리아, 바이러스, 진균, 마이코플라스마, 원생동물, 연충, 프리온, 액티노마이세스, 바실러스, 박테로이드, 보르데텔라, 바르토넬라, 보렐리아, 브루셀라, 캠필로박터, 캡노사이토파가, 클라미디아, 클로스트리듐, 코리네박테리움, 콕시엘라, 더마토필러스, 엔테로코커스, 에를리히아, 에스케리키아, 프란시셀라, 푸소박테리움, 해모바르토넬라, 해모필러스, 헬리코박터, 크렙시엘라, L형 박테리아, 렙토스피라, 리스테리아, 마이코박테리움, 마이코플라스마, 네이세리아, 네오릿케치아, 노카르디아, 파스투렐라, 펩토코커스, 펩토스트렙토코커스, 뉴모코커스, 프로테우스, 슈도모나스, 릿케치아, 로칼리매아, 살모넬라, 시겔라, 스타필로코커스, 스트렙토코커스, 트레포네마, 여시니아, 아데노바이러스, 알파바이러스, 칼리시바이러스, 코로나바이러스, CMV, 디스템퍼 바이러스, 에볼라 바이러스, 엔테로바이러스, EBV, 플라비바이러스, Hep C, 헤파드나바이러스, Hep B, 간염 델타 물질, Hep E 또는 F 바이러스, GBV-C, 허피스바이러스, 허피스 심플렉스 바이러스, 수두 대상포진 바이러스, 면역결핍 바이러스, HIV, 감염성 복막염 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스, 백혈병 바이러스, 마버그 바이러스, 오르토믹소바이러스, 파필로마 바이러스, HPV, 파라인플루엔자 바이러스, 파라믹소바이러스, RSV, 파보바이러스, 페스티바이러스, 피코나 바이러스, 폴리오바이러스, 폭스 바이러스, 백시니아 바이러스, 공수병 바이러스, 레오바이러스, 레트로바이러스, 로타바이러스, 압시디아, 아크레모늄, 알터나리아, 아스퍼질러스, 바시디오볼루스, 비폴라리스, 블라스토마이세스, 칸디다, 콕시디오이드, 코니디오볼루스, 크립토코커스, 쿠르발라리아, 에피더모파이톤, 엑소피알라, 지오트리쿰, 히스토플라스마, 마두렐라, 말라스세지아, 마이크로스포룸, 모닐리엘라, 모르티에렐라, 뮤코, 패실로마이세스, 페니실륨, 피알레모늄, 피알로포라, 프로토테카, 슈달레스케리아, 슈도마이크로도키움, 파이티움, 리노스포리듐, 리조푸스, 스콜레코바시듐, 스포로트릭스, 스템파일리움, 트리코파이톤, 트리코스포론, 크실로하이파, 바베시아, 발란티듐, 베스노이티아, 크립토스포리듐, 에이메리아, 엔세팔리토조온, 엔타모에바, 기아르디아, 함몬디아, 헤파토조온, 이소스포라, 레이쉬마니아, 마이크로스포리디아, 네오스포라, 노세마, 펜타트리코모나스, 플라스모듐, 피. 팔시파룸, 뉴모시스티스, 사코시스티스, 스키스토소마, 테일레리아, 톡소플라스마, 트리파노소마, 아칸소케일로네마, 앨루로스트론길루스, 안실로스토마, 안지오스트론길루스, 아스카리스, 브루기아, 부노스토뭄, 캐필라리아, 차베르티아, 코오페리아, 크레노소마, 딕티오카울루스, 디옥토파임, 디페탈로네마, 디파일로보스륨, 디플라이듐, 디로필라리아, 드라쿤쿨러스, 엔테로비우스, 필라로이데스, 해몬쿠스, 라고킬라스카리스, 로아 폴리펩티드, 만소넬라, 무엘레리우스, 나노파이에투스, 네카토르, 네마토디루스, 오에소파고스토뭄, 온코세르카, 오피스토르키스, 오스터타기아, 파라필라리아, 파라고니무스, 파라스카리스, 파이살로프테라, 프로토스트론길루스, 세타리아, 스피로세르카, 스피로메트라, 스테파노필라리아, 스트론길로이데스, 스트론길루스, 텔라지아, 톡사스카리스, 톡소카라, 트리키넬라, 트리코스트론길루스, 트리쿠리스, 운시나리아 또는 우케레리아 중 하나 이상으로부터 유래되는 것인 방법.
54. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 표적 부분이 제1 아미노산 서열을 포함하고, 상기 비천연 면역원이 제2 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제1 아미노산 서열의 하나 이상의 천연 아미노산이 상기 제2 아미노산 서열의 하나 이상의 비천연 아미노산으로 치환된 것을 제외하고는 상기 제2 아미노산 서열이 상기 제1 아미노산 서열과 동일한 것인 방법.
55. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 표적 부분이 제1 아미노산 서열을 포함하고, 상기 비천연 면역원이 제2 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제2 아미노산 서열이 하나 이상의 추가적인 비천연 아미노산을 추가로 포함하는 것을 제외하고는 상기 제2 아미노산 서열이 상기 제1 아미노산 서열과 동일한 것인 방법.
56. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 하나 이상의 교차 반응성 항체가, 비천연 면역원 상의 상응하는 에피토프와 비교할 때 동일한 서열을 포함하는 표적 부분 상의 에피토프에 대해 특이성을 나타내는 것인 방법.
57. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 하나 이상의 교차 반응성 항체가, 비천연 면역원 상의 상응하는 에피토프와 비교할 때 상이한 서열을 포함하는 표적 부분 상의 에피토프에 대해 특이성을 나타내는 것인 방법.
58. 제57항에 있어서, 상기 비천연 면역원 상의 상응하는 에피토프 상의 상이한 서열이 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 것인 방법.
59. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 하나 이상의 비천연 아미노산은 항체의 접근이 가능한 것인 방법.
60. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 면역원이 표적 부분과 실질적으로 유사한 구조를 포함하는 것인 방법.
61. 제60항에 있어서, 상기 면역원이 표적 부분과 실질적으로 유사한 3차 구조 및/또는 4차 구조를 포함하는 것인 방법.
62. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 비천연 아미노산이 20종의 정규 아미노산 중 하나 이외의 아미노산이고, 상기 비천연 아미노산이 하기 화학식 I, II, III 또는 IV의 구조를 포함하는 것인 방법:
    화학식 I
    

    

    
    화학식 II
    

    

    
    화학식 III
    

    

    
    화학식 IV
    

    

    
    상기 식에서,
    R은 20종의 정규 천연 아미노산 중 임의의 아미노산에서 사용되는 측쇄 이외의 임의의 치환기이고;
    R₁은 20종의 정규 천연 아미노산 중 하나에서 사용되는 임의의 치환기이고;
    R₂는 R₂-R₁이 함께 20종의 정규 천연 아미노산 중 임의의 아미노산의 측쇄 이외의 것이 되도록 하는 임의의 치환기이고;
    Z는 OH, NH₂, SH, NH-R' 또는 S-R'이고, 이때 R'는 H 이외의 임의의 치환기이고;
    X 및 Y는 각각 S 또는 O이다.
63. 제 항에 있어서, 상기 비천연 아미노산이 p-니트로페닐알라닌인 방법.
64. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 비천연 아미노산이 p-니트로페닐알라닌; o-니트로페닐알라닌; m-니트로페닐알라닌; p-보로닐 Phe; o-보로닐 Phe; m-보로닐 Phe; p-아미노 Phe; o-아미노 Phe; m-아미노 Phe; p-아실 Phe; o-아실 Phe; m-아실 Phe; p-OMe Phe; o-OMe Phe; m-OMe Phe; p-설포 Phe; o-설포 Phe; m-설포 Phe; 5-니트로 His; 3-니트로 Tyr; 2-니트로 Tyr; 니트로 치환된 Leu; 니트로 치환된 His; 니트로 치환된 Ile; 니트로 치환된 Trp; 2-니트로 Trp; 4-니트로 Trp; 5-니트로 Trp; 6-니트로 Trp; 7-니트로 Trp; 3-아미노티로신; 2-아미노티로신; O-설포티로신; 2-설포옥시페닐알라닌; 3-설포옥시옥시페닐알라닌 또는 p-카르복시페닐알라닌; o-카르복시페닐알라닌; 및 m-카르복시페닐알라닌으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
65. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 표적 부분이 TNFα인 방법.
66. 제65항에 있어서, 상기 질환 상태가 내독성 쇼크, 뇌 말라리아, 자가면역 질환, 다발성 장기 부전, 다발성 경화증, 심장 기능장애, 아테롬성동맥경화증, 허혈-재관류 손상, 인슐린 내성, 류마티스 관절염, 크론병, 염증성 장 질환, 악액질, 패혈증 쇼크, AIDS, 이식편 대 숙주 질환, 살균 육아종, 성인 호흡 곤란 증후군 및 실리카 유발성 폐 섬유증 중 하나 이상인 방법.
67. 제65항에 있어서, 상기 대상체가 마우스이고, 상기 표적 부분이 mTNFα이며, 상기 면역원이 비천연 mTNFα인 방법.
68. 제67항에 있어서, 상기 비천연 mTNFα가 pNO₂Phe⁸⁶-mTNFα를 포함하는 것인 방법.
69. 제67항에 있어서, 상기 비천연 mTNFα가 pNO₂Phe¹¹-mTNFα, pNO₂Phe¹⁹-mTNFα, pNO₂Phe²¹-mTNFα, pNO₂Phe⁴²-mTNFα, pNO₂Phe⁴⁹-mTNFα, pNO₂Phe¹⁰⁴-mTNFα 및 pNO₂Phe¹¹³-mTNFα로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
70. 제65항에 있어서, 상기 대상체가 인간이고, 상기 표적 부분이 hTNFα이며, 상기 면역원이 비천연 hTNFα인 방법.
71. 제70항에 있어서, 상기 비천연 hTNFα가 pNO₂Phe¹¹-hTNFα, pNO₂Phe¹⁹-hTNFα, pNO₂Phe²¹-hTNFα, pNO₂Phe⁴²-hTNFα, pNO₂Phe⁴⁹-hTNFα, pNO₂Phe⁸⁷-hTNFα, pNO₂Phe¹⁰⁵-hTNFα 및 pNO₂Phe¹¹⁴-hTNFα로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
72. 항체 요법을 위한 표적 부분을 동정하는 단계로서, 상기 표적 부분은 비천연 아미노산을 포함하지 않는 것인 단계;
    하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 면역원을 제공하는 단계로서, 상기 비천연 면역원은 대상체에 투여될 경우 상기 대상체가 상기 표적 부분에 대해 교차 반응성을 나타내는 상기 비천연 면역원에 대한 항체를 생성하도록 상기 표적 부분과 구조적으로 유사한 것인 단계; 및
    상기 비천연 면역원을 하나 이상의 약학적으로 허용되는 보조제, 담체 또는 부형제와 혼합하여 백신을 제조하는 단계
    를 포함하는 백신 제조 방법.
73. 제72항에 있어서, 비천연 면역원을 제공하는 단계가 오르토고날 번역 시스템에서 비천연 면역원을 제조하는 것을 포함하는 것인 방법.
74. 제72항에 있어서, 비천연 면역원을 제공하는 단계가 시험관내 번역 시스템에서 비천연 면역원을 제조하는 것을 포함하는 것인 방법.
75. 제72항에 있어서, 상기 비천연 면역원이 20종의 정규 천연 아미노산 중 하나 이외의 비천연 아미노산을 포함하는 것인 방법.
76. 제72항에 있어서, 상기 비천연 면역원이 이 면역원의 20종의 정규 천연 아미노산 중 하나의 화학적 수식 이외의 과정에 의해 제조되는 것인 방법.
77. 제72항에 있어서, 상기 비천연 면역원이 이 면역원의 20종의 정규 천연 아미노산 중 하나의 번역 후 수식 이외의 과정에 의해 제조되는 것인 방법.
78. 제72항에 있어서, 상기 대상체가 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 소, 닭, 관행 케이지 사육조, 개방형 복지 케이지 사육조, 파충류 및 양서류로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
79. 제72항에 있어서, 상기 표적 부분이 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
80. 제72항에 있어서, 상기 표적 부분이 폴리펩티드 및/또는 탄수화물을 포함하는 것인 방법.
81. 제72항에 있어서, 상기 표적 부분이 대상체의 자가 부분인 방법.
82. 제72항에 있어서, 상기 표적 부분이 질환 관련 부분인 방법.
83. 제82항에 있어서, 상기 표적 부분이 자가면역 질환과 관련된 자가 항원, 종양 관련 항원, 알츠하이머병 관련 항원, 아밀로이드 베타40, 아밀로이드 베타42, 유방암 관련 항원, 난소암 관련 항원, 전립선암 관련 항원, MAGE, BAGE, RAGE, NY-ESO, 계통 특이적 종양 관련 항원, 멜라닌세포-흑색종 계통 항원, MART-1/Melan-A, 티로시나제 또는 티로시나제 관련 단백질, 티로시나제 관련 단백질 2, PSMA, PSA, 돌연변이 ras, 재배열 bcr/ab1, Her2/neu, 돌연변이 또는 야생형 p53, 사이토크롬 P450 1B1, N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제-V의 비정상적으로 발현된 인트론 서열, CA19-9, p53, OCAA, HOXB7, Ca125, PSA, PSMA, STEAP, PCTA-1, Ca15-3, EGF, EGFR, HER-1, CXCR4, G 단백질 커플링 수용체(GCPR) 또는 CA27-29 중 하나 이상인 방법.
84. 제72항에 있어서, 상기 표적 부분이 대상체의 자가 부분이 아닌 것인 방법.
85. 제84항에 있어서, 상기 표적 부분이 박테리아, 바이러스, 진균, 마이코플라스마, 원생동물, 연충 또는 프리온으로부터 유래되는 것인 방법.
86. 제85항에 있어서, 상기 표적 부분이 박테리아 항원, 바이러스 항원, 진균 항원, 마이코플라스마 항원, 원생동물 항원, 연충 항원, 프리온 항원, HIV 항원, HIV gp120, HIV gp41, HIV gag, HIV pol, HIV env, HIV tat, HIV nef, HIV rev, 칼리시바이러스 캡시드 항원, B형 간염 코어 항원, B형 간염 표면 항원, 간염 델타 물질, 허피스 심플렉스 바이러스 당단백질, 수두 대상포진 바이러스 당단백질, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제, 인플루엔자 바이러스 핵단백질, HPV 캡시드 단백질, 파라인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌/뉴라미니다제, 폴리오바이러스 캡시드 폴리펩티드, Hep A 항원, 백시니아 바이러스 폴리펩티드, 공수병 바이러스 당단백질 G, 비. 버그도페리 OspA, 에이치. 인플루엔자 타입 b 외막 단백질, 마이코박테리움 리포아라비노만난, 마이코박테리움 mAPG, 에스. 파이오진스 M 단백질, 에스. 뉴모니아 캡슐형 폴리사카라이드, 와이. 페스티스 F1, 와이. 페스티스 V 항원, 피. 팔시파룸 서컴스포로조이트(PfCSP), 피. 팔시파룸 스포로조이트 표면 단백질 2(PfSSP2), 간 상태 항원 1의 피. 팔시파룸 카르복실 말단(PfLSA1 c-말단), 피. 팔시파룸 외수송 단백질 1(PfExp-1), Pfs 48/45, Pfs 28, Pfs 25 또는 Pfs 230 중 하나 이상인 방법.
87. 제85항에 있어서, 상기 표적 부분이 박테리아, 바이러스, 진균, 마이코플라스마, 원생동물, 연충, 프리온, 액티노마이세스, 바실러스, 박테로이드, 보르데텔라, 바르토넬라, 보렐리아, 브루셀라, 캠필로박터, 캡노사이토파가, 클라미디아, 클로스트리듐, 코리네박테리움, 콕시엘라, 더마토필러스, 엔테로코커스, 에를리히아, 에스케리키아, 프란시셀라, 푸소박테리움, 해모바르토넬라, 해모필러스, 헬리코박터, 크렙시엘라, L형 박테리아, 렙토스피라, 리스테리아, 마이코박테리움, 마이코플라스마, 네이세리아, 네오릿케치아, 노카르디아, 파스투렐라, 펩토코커스, 펩토스트렙토코커스, 뉴모코커스, 프로테우스, 슈도모나스, 릿케치아, 로칼리매아, 살모넬라, 시겔라, 스타필로코커스, 스트렙토코커스, 트레포네마, 여시니아, 아데노바이러스, 알파바이러스, 칼리시바이러스, 코로나바이러스, CMV, 디스템퍼 바이러스, 에볼라 바이러스, 엔테로바이러스, EBV, 플라비바이러스, Hep C, 헤파드나바이러스, Hep B, 간염 델타 물질, Hep E 또는 F 바이러스, GBV-C, 허피스바이러스, 허피스 심플렉스 바이러스, 수두 대상포진 바이러스, 면역결핍 바이러스, HIV, 감염성 복막염 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스, 백혈병 바이러스, 마버그 바이러스, 오르토믹소바이러스, 파필로마 바이러스, HPV, 파라인플루엔자 바이러스, 파라믹소바이러스, RSV, 파보바이러스, 페스티바이러스, 피코나 바이러스, 폴리오바이러스, 폭스 바이러스, 백시니아 바이러스, 공수병 바이러스, 레오바이러스, 레트로바이러스, 로타바이러스, 압시디아, 아크레모늄, 알터나리아, 아스퍼질러스, 바시디오볼루스, 비폴라리스, 블라스토마이세스, 칸디다, 콕시디오이드, 코니디오볼루스, 크립토코커스, 쿠르발라리아, 에피더모파이톤, 엑소피알라, 지오트리쿰, 히스토플라스마, 마두렐라, 말라스세지아, 마이크로스포룸, 모닐리엘라, 모르티에렐라, 뮤코, 패실로마이세스, 페니실륨, 피알레모늄, 피알로포라, 프로토테카, 슈달레스케리아, 슈도마이크로도키움, 파이티움, 리노스포리듐, 리조푸스, 스콜레코바시듐, 스포로트릭스, 스템파일리움, 트리코파이톤, 트리코스포론, 크실로하이파, 바베시아, 발란티듐, 베스노이티아, 크립토스포리듐, 에이메리아, 엔세팔리토조온, 엔타모에바, 기아르디아, 함몬디아, 헤파토조온, 이소스포라, 레이쉬마니아, 마이크로스포리디아, 네오스포라, 노세마, 펜타트리코모나스, 플라스모듐, 피. 팔시파룸, 뉴모시스티스, 사코시스티스, 스키스토소마, 테일레리아, 톡소플라스마, 트리파노소마, 아칸소케일로네마, 앨루로스트론길루스, 안실로스토마, 안지오스트론길루스, 아스카리스, 브루기아, 부노스토뭄, 캐필라리아, 차베르티아, 코오페리아, 크레노소마, 딕티오카울루스, 디옥토파임, 디페탈로네마, 디파일로보스륨, 디플라이듐, 디로필라리아, 드라쿤쿨러스, 엔테로비우스, 필라로이데스, 해몬쿠스, 라고킬라스카리스, 로아 폴리펩티드, 만소넬라, 무엘레리우스, 나노파이에투스, 네카토르, 네마토디루스, 오에소파고스토뭄, 온코세르카, 오피스토르키스, 오스터타기아, 파라필라리아, 파라고니무스, 파라스카리스, 파이살로프테라, 프로토스트론길루스, 세타리아, 스피로세르카, 스피로메트라, 스테파노필라리아, 스트론길로이데스, 스트론길루스, 텔라지아, 톡사스카리스, 톡소카라, 트리키넬라, 트리코스트론길루스, 트리쿠리스, 운시나리아 또는 우케레리아 중 하나 이상으로부터 유래되는 것인 방법.
88. 제72항에 있어서, 상기 표적 부분이 제1 아미노산 서열을 포함하고, 상기 비천연 면역원이 제2 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제1 아미노산 서열의 하나 이상의 천연 아미노산이 상기 제2 아미노산 서열의 하나 이상의 비천연 아미노산으로 치환된 것을 제외하고는 상기 제2 아미노산 서열이 상기 제1 아미노산 서열과 동일한 것인 방법.
89. 제72항에 있어서, 상기 표적 부분이 제1 아미노산 서열을 포함하고, 상기 비천연 면역원이 제2 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제2 아미노산 서열이 하나 이상의 추가적인 비천연 아미노산을 추가로 포함하는 것을 제외하고는 상기 제2 아미노산 서열이 상기 제1 아미노산 서열과 동일한 것인 방법.
90. 제72항에 있어서, 상기 하나 이상의 교차 반응성 항체가, 비천연 면역원 상의 상응하는 에피토프와 비교할 때 동일한 서열을 포함하는 표적 부분 상의 에피토프에 대해 특이성을 나타내는 것인 방법.
91. 제72항에 있어서, 상기 하나 이상의 교차 반응성 항체가, 비천연 면역원 상의 상응하는 에피토프와 비교할 때 상이한 서열을 포함하는 표적 부분 상의 에피토프에 대해 특이성을 나타내는 것인 방법.
92. 제91항에 있어서, 상기 비천연 면역원 상의 상응하는 에피토프 상의 상이한 서열이 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 것인 방법.
93. 제72항에 있어서, 상기 하나 이상의 비천연 아미노산이 항체의 접근이 가능한 것인 방법.
94. 제72항에 있어서, 상기 비천연 면역원이 표적 부분과 실질적으로 유사한 구조를 포함하는 것인 방법.
95. 제94항에 있어서, 상기 비천연 면역원이 표적 부분과 실질적으로 유사한 3차 구조 및/또는 4차 구조를 포함하는 것인 방법.
96. 제72항에 있어서, 상기 비천연 아미노산이 20종의 정규 아미노산 중 하나 이외의 아미노산이고, 상기 비천연 아미노산이 하기 화학식 I, II, III 또는 IV의 구조를 포함하는 것인 방법:
    화학식 I
    

    

    
    화학식 II
    

    

    
    화학식 III
    

    

    
    화학식 IV
    

    

    
    상기 식에서,
    R은 20종의 정규 천연 아미노산 중 임의의 아미노산에서 사용되는 측쇄 이외의 임의의 치환기이고;
    R₁은 20종의 정규 천연 아미노산 중 하나에서 사용되는 임의의 치환기이고;
    R₂는 R₂-R₁이 함께 20종의 정규 천연 아미노산 중 임의의 아미노산의 측쇄 이외의 것이 되도록 하는 임의의 치환기이고;
    Z는 OH, NH₂, SH, NH-R' 또는 S-R'이고, 이때 R'는 H 이외의 임의의 치환기이고;
    X 및 Y는 각각 S 또는 O이다.
97. 제72항에 있어서, 상기 비천연 아미노산이 p-니트로페닐알라닌; o-니트로페닐알라닌; m-니트로페닐알라닌; p-보로닐 Phe; o-보로닐 Phe; m-보로닐 Phe; p-아미노 Phe; o-아미노 Phe; m-아미노 Phe; p-아실 Phe; o-아실 Phe; m-아실 Phe; p-OMe Phe; o-OMe Phe; m-OMe Phe; p-설포 Phe; o-설포 Phe; m-설포 Phe; 5-니트로 His; 3-니트로 Tyr; 2-니트로 Tyr; 니트로 치환된 Leu; 니트로 치환된 His; 니트로 치환된 Ile; 니트로 치환된 Trp; 2-니트로 Trp; 4-니트로 Trp; 5-니트로 Trp; 6-니트로 Trp; 7-니트로 Trp; 3-아미노티로신; 2-아미노티로신; O-설포티로신; 2-설포옥시페닐알라닌; 3-설포옥시옥시페닐알라닌 또는 p-카르복시페닐알라닌; o-카르복시페닐알라닌; 및 m-카르복시페닐알라닌으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
98. 제72항에 있어서, 상기 표적 부분이 TNFα인 방법.
99. 제98항에 있어서, 상기 대상체가 마우스이고, 상기 표적 부분이 mTNFα이며, 상기 비천연 면역원이 비천연 mTNFα인 방법.
100. 제99항에 있어서, 상기 비천연 mTNFα가 pNO₂Phe⁸⁶-mTNFα를 포함하는 것인 방법.
101. 제99항에 있어서, 상기 비천연 mTNFα가 pNO₂Phe¹¹-mTNFα, pNO₂Phe¹⁹-mTNFα, pNO₂Phe²¹-mTNFα, pNO₂Phe⁴²-mTNFα, pNO₂Phe⁴⁹-mTNFα, pNO₂Phe¹⁰⁴-mTNFα 및 pNO₂Phe¹¹³-mTNFα로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
102. 제98항에 있어서, 상기 대상체가 인간이고, 상기 표적 부분이 hTNFα를 포함하며, 상기 면역원이 비천연 hTNFα를 포함하는 것인 방법.
103. 제102항에 있어서, 상기 비천연 hTNFα가 pNO₂Phe¹¹-hTNFα, pNO₂Phe¹⁹-hTNFα, pNO₂Phe²¹-hTNFα, pNO₂Phe⁴²-hTNFα, pNO₂Phe⁴⁹-hTNFα, pNO₂Phe⁸⁷-hTNFα, pNO₂Phe¹⁰⁵-hTNFα 및 pNO₂Phe¹¹⁴-hTNFα로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
104. 제72항의 방법에 의해 제조된 백신.
105. pNO₂Phe⁸⁶-TNFα를 포함하는 비천연 TNFα를 세포 내에서 제조하는 방법으로서,
     세포를 적절한 배지 중에서 배양하는 단계로서, 상기 세포는 TNFα를 코딩하며 86번 아미노산 위치에서 하나 이상의 셀렉터 코돈(selector codon)을 포함하는 핵산을 포함하는 것인 단계; 및
     pNO₂Phe을 제공하는 단계
     를 포함하며, 상기 세포는
     상기 셀렉터 코돈을 인식하는 오르토고날-tRNA(O-tRNA); 및
     상기 O-tRNA를 pNO₂Phe으로 우선적으로 아미노아실화하고 상기 셀렉터 코돈에 반응하여 pNO₂Phe을 86번 아미노산 위치 내로 도입함으로써 비천연 TNFα를 생성하는 오르토고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 추가로 포함하는 것인 방법.
106. pNO₂Phe⁸⁶-mTNFα를 포함하는 비천연 TNFα.
107. pNO₂Phe¹¹-mTNFα, pNO₂Phe¹⁹-mTNFα, pNO₂Phe²¹-mTNFα, pNO₂Phe⁴²-mTNFα, pNO₂Phe⁴⁹-mTNFα, pNO₂Phe¹⁰⁴-mTNFα 및 pNO₂Phe¹¹³-mTNFα로 구성된 군에서 선택되는 TNFα를 포함하는 비천연 TNFα.
108. pNO₂Phe¹¹-hTNFα, pNO₂Phe¹⁹-hTNFα, pNO₂Phe²¹-hTNFα, pNO₂Phe⁴²-hTNFα, pNO₂Phe⁴⁹-hTNFα, pNO₂Phe⁸⁷-hTNFα, pNO₂Phe¹⁰⁵-hTNFα 및 pNO₂Phe¹¹⁴-hTNFα로 구성된 군에서 선택되는 TNFα를 포함하는 비천연 TNFα.
109. 제106항 내지 제108항 중 어느 한 항의 비천연 TNFα를 포함하는 조성물.
110. 제106항 내지 제108항 중 어느 한 항의 비천연 TNFα에 대한 항체.
111. 제106항 내지 제108항 중 어느 한 항의 비천연 TNFα에 대한 항체로서, 비천연 아미노산을 포함하지 않는 TNFα에 대해 교차 반응성을 나타내는 항체.
112. 제110항 또는 제111항의 항체를 포함하는 조성물.
113. pNO₂Phe⁴³ mRBP4를 포함하는 비천연 RBP4.
114. 제113항의 비천연 RBP4를 포함하는 조성물.
115. 제113항의 비천연 RBP4에 대한 항체로서, 비천연 아미노산을 포함하지 않는 RBP4에 대해 교차 반응성을 나타내는 항체.
116. 제115항의 항체를 포함하는 조성물.
117. 제1항, 제34항, 제35항 또는 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 비천연 아미노산이 면역원의 합성 중에 비천연 면역원 내로 도입되는 것인 방법.
118. 제1항, 제34항, 제35항 또는 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 비천연 아미노산이 번역 후 수식 또는 합성 후 화학적 수식 이외의 과정을 통해 비천연 면역원 내로 도입되는 것인 방법.
119. 제1항, 제34항, 제35항 또는 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 비천연 아미노산이 오르토고날 번역, 시험관내 번역, 천연 화학적 결찰, 발현된 단백질 결찰 및 고체상 합성 중 하나 이상을 통해 비천연 면역원 내로 도입되는 것인 방법.
120. 제1항, 제34항, 제35항 또는 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비천연 면역원이 글리코실화, 니트로아릴 수식, 니트레이트화, 알킬화, 아세틸화, 산화, 설페이트화 또는 인산화된 20종의 정규 천연 아미노산 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
121. 제120항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산이 번역 후 수식 이외의 과정 또는 화학적 수식 이외의 과정에 의해 글리코실화, 니트로아릴 수식, 니트레이트화, 알킬화, 아세틸화, 산화, 설페이트화 또는 인산화되는 것인 방법.

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