WO2012026309A9 - 抗ｐａｄ４抗体医薬の創成 - Google Patents

抗ｐａｄ４抗体医薬の創成 Download PDF

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WO2012026309A9
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清水　敏之
道之 山田
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    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • the present invention relates to the creation of an anti-PAD4 (Peptidylarginine deiminase 4) antibody drug.
  • Rheumatoid arthritis is a disease that causes inflammation in the joint synovium due to immune abnormalities, forms pannus (granulation tissue) with abnormal growth similar to cancer cells, and erodes and destroys articular cartilage and bone. About 1% of the world population suffers, and the incidence is particularly high among elderly people and women.
  • RA rheumatoid arthritis
  • the former can be further divided into non-steroidal anti-inflammatory drugs such as aspirin and steroid drugs that have strong side effects but have side effects.
  • the disease-modifying anti-rheumatic drug is an immunosuppressant that normalizes immune abnormalities, and methotrexate (trade name: Rheumatrex), which was released in 1999, is famous.
  • antirheumatic drugs that suppress the action of inflammatory cytokines such as IL1, IL6, and TNF ⁇ have attracted attention.
  • RA is an autoimmune disease that causes inflammation in the joint synovium due to immune abnormalities, causing swelling and pain in the joint.
  • anti-inflammatory drugs that relieve inflammation, drugs that suppress immune function, and antibodies to cytokines that cause inflammation have been used to treat this. Many problems remain, such as the need to take.
  • Non-Patent Documents cyclic citrullinated peptide antibodies have high specificity and sensitivity, are very effective for early diagnosis of RA, and have been insured in Japan since April 2007. Anti-CCP antibodies became the new diagnostic criteria for RA at the American College of Rheumatology Annual Meeting (ACR2009).
  • Non-patent Document 3 a single nucleotide polymorphism susceptible to rheumatoid arthritis has been found on the gene of peptidylarginine deiminase 4 (PAD4) by genome-wide large-scale case-control analysis.
  • Non-patent Documents 5 and 6 As a mechanism for the onset of rheumatoid arthritis, the theory that citrullinated proteins are recognized as non-self and autoantibodies are produced (Non-patent Documents 5 and 6).
  • Non-Patent Document 7 the entire structure of human PAD4 has been analyzed.
  • the present invention aims to provide a novel anti-rheumatic drug.
  • the present inventors have created an anti-PAD4 antibody that inhibits the activity of PAD4, which is thought to be a causative protein of rheumatoid arthritis (RA), based on the three-dimensional structure of PAD4, and a novel anti-PAD4 effect that exhibits rheumatoid arthritis-like lesions.
  • RA rheumatoid arthritis
  • D1CC mouse transgenic mouse
  • the gist of the present invention is as follows. (1) A polypeptide comprising at least 6 consecutive amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4. (2) The polypeptide according to (1), wherein cysteine is added to the N-terminus and / or C-terminus. (3) The polypeptide according to (1) or (2), wherein the N-terminal and / or C-terminal amino acid is modified. (4) The polypeptide according to (3), wherein the C-terminal amino acid is amidated and / or the N-terminal amino acid is acetylated.
  • An anti-rheumatic drug comprising the anti-peptidylarginine deiminase 4 antibody, the antibody according to (7) or a combination thereof.
  • a nucleic acid encoding the polypeptide according to (1) A nucleic acid encoding the polypeptide according to (1).
  • a vector comprising the nucleic acid according to (15).
  • a transformant comprising the vector according to (16).
  • Anti-PAD4 antibody drugs are drugs based on the etiology of RA (autoimmune diseases against protein citrullination by PAD4), and are expected to be a fundamental therapeutic drug for RA, unlike conventional targeted therapeutic drugs. Since it is expected as a fundamental therapeutic agent for RA, it is expected to have a greater inflammation-inhibiting effect, shorter administration, and less side effects than conventional anti-rheumatic drugs.
  • the anti-PAD4 antibody drug of the present invention is effective as a therapeutic drug for RA.
  • PAD4 substrate complex
  • PAD4 Ca 2+ -bound PAD4
  • PAD4 Ca 2+ -free PAD4
  • Most of the regions of the antigen peptides 1 and 2 of the present invention shown in the figure are disordered in the structure of PAD4 (Ca 2+ -free PAD4) in which neither calcium ion nor substrate is bound,
  • the structure is stabilized by binding (Ca 2+ -bound PAD4) and binding of both calcium ions and the substrate (substratecomplex), and an ordered structure is induced.
  • Most of the regions of the antigen peptides 1 and 2 of the present invention shown in the figure are disordered in the structure of PAD4 (Ca 2+ -free PAD4) (left figure) in which neither calcium ion nor substrate is bound. When both calcium ions and the substrate are combined (substrate complex) (right figure), the disordered region is stabilized and a regular structure is induced.
  • D1CC mice were initially immunized with bovine type II collagen, and 3 weeks later, a second immunization (boost) was performed.
  • the horizontal axis indicates the number of weeks that have passed since the first immunization.
  • the vertical axis scores the appearance findings in each limb joint, and indicates the total score of the limbs.
  • the maximum score for each limb is 4, and the total for all limbs is 16.
  • the criteria for each score are: Score 1: Redness and swelling in the limb, Score 2: Clear swelling with redness in the limb or each finger, Score 3: Swelling throughout the limb, Score 4: Stiffness after swelling reduction is there.
  • the therapeutic effect of the anti-PAD4 antibody was examined by comparing the anti-PAD4 antibody mixture administration group (anti-PAD4 antibody) and the PBS administration group (control). A mixture of 25 ⁇ g of each of the four types of anti-PAD4 antibodies, a total of 100 ⁇ g, was prepared and administered intraperitoneally to each individual (100 ⁇ l / mouse, control was PBS 100 ⁇ l / mouse).
  • the administration was started after the second immunization, and then administered three times at intervals of 5 days.
  • Inhibitory activity of PAD4 by the prepared four types of anti-PAD4 antibodies (L78-4, L119-5, L198-3, L207-11).
  • the red, blue, and green bar graphs show the residual enzyme activity of PAD4 when anti-PAD4 antibodies are added to final concentrations of 1000 nM, 250 nM, and 62.5 nM, respectively.
  • the residual enzyme activity is expressed as a relative value (%) normalized to 100 for the residual enzyme activity of PAD4 when the anti-PAD4 antibody concentration is 0.0 nM indicated by the black bar graph.
  • the present invention provides a polypeptide comprising at least 6 consecutive amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence from V366 to K382 of human PAD4.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence from E340 to Y356 of human PAD4.
  • the polypeptide of the present invention may be composed of 6 to 17, preferably 6 to 13, more preferably 6 to 9 consecutive amino acid residues found in the amino acid sequence of human PAD4.
  • polypeptide of the present invention is useful as an antigen peptide. If the number of amino acids is a minimum of 6 to 9, it can be considered as an antigen.
  • the polypeptide of the present invention can be chemically synthesized by a known method.
  • a cysteine may be added to the N-terminus and / or C-terminus of the polypeptide of the present invention.
  • cysteine In order to bind to a carrier protein when immunizing an animal, it is preferable to add cysteine to the N-terminus and / or C-terminus. Addition to cysteine at the N-terminal and / or C-terminal can be carried out by a known method.
  • the N-terminal and / or C-terminal amino acids may be modified such as amidation or acetylation. Such modification can prevent the antibody against the terminal site from being made main.
  • polypeptide of the present invention a polypeptide in which cysteine is added to the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and lysine at the C-terminus is amidated, cysteine is added to the C-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 And a polypeptide in which N-terminal glutamic acid is acetylated.
  • the polypeptide of the present invention can also be produced by a known genetic engineering technique.
  • a DNA encoding the polypeptide of the present invention is obtained, the obtained DNA is incorporated into an appropriate expression vector, introduced into an appropriate host, and the resulting transformant is cultured to obtain a recombinant polypeptide.
  • It can be produced as a peptide (for example, Saigo Satoshi, Yoko Sano co-translation, CURRENT PROTOCOLS compact version, Molecular Biology Experiment Protocol, I, II, III, Maruzen Co., Ltd .: Original, Ausubel, FM, etc., Short (See Protocols in Molecular Biology, Third Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York).
  • the present invention also provides a nucleic acid encoding a polypeptide comprising at least 6 consecutive amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4.
  • the nucleic acid encoding the polypeptide of the present invention may be any nucleic acid as long as it contains a nucleotide sequence encoding the polypeptide of the present invention.
  • Nucleic acids can be DNA, cDNA, RNA and their complementary nucleic acids and derivatives thereof.
  • DNA encoding the polypeptide of the present invention examples include DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, DNA encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (for example, DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1).
  • DNA encoding a polypeptide that hybridizes with a complementary DNA under stringent conditions and can be an antigen DNA consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, DNA encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 Examples thereof include a DNA that hybridizes with a DNA complementary to (for example, a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3) under a stringent condition and encodes a polypeptide that can serve as an antigen.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA complementary to the DNA encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4 is DNA encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4 At least 80% (preferably at least 95%, more preferably at least 98%) identity with all or part of the DNA complementary to (for example, DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3) Good.
  • Hybridization is performed under stringent conditions.
  • the stability of the nucleic acid duplex or hybrid is expressed by the melting temperature Tm (the temperature at which the probe dissociates from the target DNA). This melting temperature is used to define stringent conditions. Assuming that the Tm drops by 1 ° C.
  • the temperature of the final wash of the hybridization reaction must be lowered.
  • the final washing temperature must be lowered by 5 ° C.
  • the Tm will vary between 0.5 and 1.5 ° C.
  • An example of stringent conditions is to hybridize in 5x °C SSC / 5x Denhardt solution / 1.0% SDS at 68 ° C and wash in 0.2x SSC / 0.1% SDS at room temperature.
  • An example of moderately stringent conditions is a wash in 3x SSC at 42 ° C.
  • the salt concentration or temperature can be varied to achieve an optimal level of identity between the probe and the target nucleic acid.
  • DNA encoding the polypeptide of the present invention can be synthesized using a commercially available synthesizer.
  • DNA encoding the polypeptide of the present invention can be obtained by amplifying the coding region of the polypeptide of the present invention by PCR using human myeloid leukemia HL-60 cell cDNA.
  • a recombinant vector containing a nucleic acid encoding the polypeptide of the present invention can be obtained by a known method (for example, the method described in Molecular Cloning 2nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). It can be obtained by inserting a DNA encoding the above polypeptide into an appropriate expression vector.
  • plasmids derived from E. coli eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • plasmids derived from Bacillus subtilis eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast-derived plasmids eg, pSH19, pSH15
  • ⁇ phage etc.
  • Bacteriophages, animal viruses such as retroviruses and vaccinia viruses, insect pathogenic viruses such as baculoviruses, and the like can be used.
  • a promoter, enhancer, splicing signal, poly A addition signal, selection marker, SV40 replication origin, etc. may be added to the expression vector.
  • the expression vector may be a fusion protein expression vector.
  • fusion protein expression vectors are commercially available: pGEX series (Amersham Pharmacia Biotech), pET CBD Fusion System 34b-38b (Novagen), pET Dsb Fusion Systems 39b and 40b (Novagen), pET GST Fusion System 41 and 42 (Novagen).
  • a transformant can be obtained by introducing a recombinant vector containing DNA encoding the polypeptide of the present invention into a host.
  • Hosts include bacterial cells (eg, Escherichia, Bacillus, Bacillus, etc.), fungal cells (eg, yeast, Aspergillus, etc.), insect cells (eg, S2 cells, Sf cells, etc.), animal cells (eg, CHO cells, COS cells, HeLa cells, C127 cells, 3T3 cells, BHK cells, HEK293 cells, etc.), plant cells and the like.
  • bacterial cells eg, Escherichia, Bacillus, Bacillus, etc.
  • fungal cells eg, yeast, Aspergillus, etc.
  • insect cells eg, S2 cells, Sf cells, etc.
  • animal cells eg, CHO cells, COS cells, HeLa cells, C127 cells, 3T3 cells, BHK cells, HEK293 cells, etc.
  • the transformant can be cultured in a medium, and the polypeptide of the present invention can be collected from the culture.
  • the medium may be recovered, the polypeptide separated from the medium, and purified.
  • the polypeptide is produced in the transformed cell, the cell is lysed, and the polypeptide is separated from the lysate and purified.
  • the polypeptide When the polypeptide is expressed in the form of a fusion protein with another protein (functioning as a tag), the fusion protein is separated and purified, and then treated with FactorXa or an enzyme (enterokinase).
  • the target polypeptide can be obtained by cleaving the protein.
  • Separation and purification of the polypeptide can be performed by known methods.
  • Known separation and purification methods include methods that utilize differences in solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Method utilizing difference method utilizing charge difference such as ion exchange chromatography, method utilizing specific affinity such as affinity chromatography, method utilizing hydrophobic difference such as reverse phase high performance liquid chromatography
  • the present invention also provides an antibody that specifically binds to a polypeptide comprising at least 6 consecutive amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4.
  • the antibody of the present invention can be used as a medicament such as an anti-rheumatic drug or as a peptidylarginine deiminase 4 (PAD4) inhibitor.
  • the antibody of the present invention can also be used for detection and / or quantification of a polypeptide containing at least 6 consecutive amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4.
  • the antibody refers to Fab, F (ab) ′ 2 , ScFv, Diabody, V H , V L , Sc (Fv) 2 , Bispecific sc (Fv) 2 , Minibody, scFv-Fc monomer, scFv ⁇ It is a concept that includes low molecular weight compounds such as Fc dimer.
  • the antibody of the present invention can be obtained by administering to an animal a polypeptide containing at least 6 consecutive amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4 or a fragment containing an epitope thereof using a conventional protocol.
  • the antibody of the present invention may be any of a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a chimeric antibody, a single chain antibody, a humanized antibody, and a human type antibody.
  • polyclonal antibody In order to produce a polyclonal antibody, it can be produced according to a known or similar method. For example, by creating a complex of an immunizing antigen (antigen peptide) and a carrier protein, administering (immunizing) the animal, collecting the antibody-containing material against the antigenic peptide from the immunized animal, and separating and purifying the antibody. Can be manufactured. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. The administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, about twice in total. Polyclonal antibodies can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood of immunized animals.
  • Polyclonal antibodies can be separated and purified by immunoglobulin separation and purification methods (for example, salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric precipitation method, electrophoresis method, adsorption / desorption method using ion exchanger, ultracentrifugation method, gel filtration method, A specific purification method in which only an antibody is collected using an antigen-binding solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G, and the antibody is obtained by dissociating the binding.
  • immunoglobulin separation and purification methods for example, salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric precipitation method, electrophoresis method, adsorption / desorption method using ion exchanger, ultracentrifugation method, gel filtration method, A specific purification method in which only an antibody is collected using an antigen-binding solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G, and the antibody is obtained by dissociating the binding.
  • Monoclonal antibodies can be prepared by the hybridoma method of G. Koehler and C. Milstein described in Nature (1975) 256: 495, Science (1980) 208: 692-. That is, after immunizing an animal, antibody-producing cells are isolated from the spleen of the immunized animal and fused with myeloma cells to prepare monoclonal antibody-producing cells (hybridoma). Furthermore, an antibody that specifically reacts with a polypeptide containing at least 6 consecutive amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4 but does not substantially cross-react with other antigenic proteins (or peptides) is produced. The cell line to be isolated may be isolated.
  • hybridomas examples include hybridomas with accession numbers FERM BP-11389, FERM BP-11390, FERM BP-11391, and FERM BP-11392.
  • This cell line can be cultured, and the desired monoclonal antibody can be obtained from the culture. Purification of the monoclonal antibody can be performed according to the above-described method for separating and purifying immunoglobulin.
  • Techniques for producing human antibodies include phage display methods (J. Mol. Biol., 222, 581-597 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4457-4461 (1992); EMBO J., 13, 3245-3260 (1994)), human peripheral blood B lymphocyte method (J. Immunol. Methods, 275, 223-237 (2003); Nat. Med., 10, 871-875 (2004)) , Human antibody production methods using chimeric animals incorporating human antibody genes (J. Immuno. Methods, 23, 11-23 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 722-727 (2000)) Is available.
  • the antibody of the present invention, anti-peptidylarginine deiminase 4 antibody, or a combination thereof can be used as a medicament such as an anti-rheumatic drug or as a peptidyl arginine deiminase 4 inhibitor.
  • the peptidylarginine deiminase 4 inhibitor can be used as a medicine or as an experimental reagent.
  • Anti-peptidyl arginine deiminase 4 antibody can be prepared by the method described in JP-A-2009-156615.
  • anti-peptidylarginine deiminase 4 antibody or a combination thereof is used as a medicament, prevention and / or prevention of rheumatoid arthritis, interstitial pneumonia, pneumonia, bronchitis, episclerosis, osteoporosis, etc. Can be used for treatment.
  • This medicine is based on the pathogenesis of RA (autoimmune disease against protein citrullination by PAD4), and is expected to be a fundamental therapeutic drug for RA, unlike conventional therapeutic drugs. Since it is expected as a fundamental therapeutic agent for RA, it is expected to have a greater inflammation-inhibiting effect, shorter administration, and less side effects than conventional anti-rheumatic drugs.
  • the antibody of the present invention anti-peptidyl arginine deiminase 4 antibody or a combination thereof is dissolved in a buffer solution such as PBS, physiological saline, sterilized water, etc. Should be administered.
  • a buffer solution such as PBS, physiological saline, sterilized water, etc.
  • additives for example, colorants, emulsifiers, suspending agents, surfactants, solubilizers, stabilizers, preservatives, antioxidants, buffering agents, tonicity agents, etc.
  • intravenous, intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous, intradermal administration, and the like are possible, and nasal or oral administration may be used.
  • the dose, frequency and frequency of administration of the antibody of the present invention, anti-peptidylarginine deiminase 4 antibody or a combination thereof vary depending on the symptom, age, body weight, administration method, administration mode, etc. of the subject. 0.1 to 100 mg / kg body weight per person, preferably 1 to 10 mg / kg body weight, may be administered at least once at a frequency at which the desired effect persists.
  • Example 1 Of the two types of antigen peptides shown in FIG. 2, those in which cysteine was added to the N-terminus of antigen peptide 1 (SEQ ID NO: 2) and the C-terminus of antigen peptide 2 (SEQ ID NO: 4) were chemically synthesized by a known method. The C-terminal lysine of antigen peptide 1 with cysteine added to the N-terminus was amidated, and the glutamic acid at the N-terminus of antigen peptide 2 with cysteine added to the C-terminus was acetylated. Animals were immunized using these antigenic peptides as sensitizing antigens, antibody-producing cells were collected from the immunized animals, and fused with myeloma cells to prepare hybridoma cells.
  • Each monoclonal antibody (L78-4, L119-5, L198-3 and L207-11) was prepared from each hybridoma cell.
  • Each hybridoma cell was cultured using RPMI1640 as a basal medium and supplemented with fetal bovine serum (10-20%) and antibiotics (penicillin, streptavidin) under 5% CO 2 at 37 ° C. .
  • the monoclonal antibody was obtained by proliferating hybridoma cells in the peritoneal cavity of mice by a known method, collecting ascites, and purifying by human PAD4 affinity chromatography.
  • Each hybridoma cell used for the production of each monoclonal antibody is an international depositary authority, IPOD National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki, Japan, 6th Central) 8566) on June 11, 2010.
  • the deposit numbers of each hybridoma cell are FERM BP-11389 (producing monoclonal antibody L78-4), FERM BP-11390 (producing monoclonal antibody L119-5), FERM BP-11391 (producing monoclonal antibody L198-3) and FERM BP-11392 (producing monoclonal antibody L207-11)
  • This deposit was deposited on June 11, 2010 (domestic deposit date) Transferred from FERM P-21972, FERM P-21973, FERM P-21974, and FERM P-21975.
  • Example 2 D1CC mice (transgenic non-human mammals that reproduce the pathology of human rheumatoid arthritis, international publication number WO2005 / 085438) were tested for arthritis-suppressing effects using four types of anti-PAD4 antibodies (L78-4, L119-5, L198- 3, L207-11). Each mouse received Freund's complete adjuvant containing bovine type II collagen (10 ng) as the initial immunization, and Freund's incomplete adjuvant containing bovine type II collagen (10 ng) as the second immunization.
  • the purified monoclonal antibody mixture (25 ⁇ g each, total 100 ⁇ g / mouse / one dose) or control (phosphate buffer) was intraperitoneally administered three times at 5-day intervals. After administration, swelling of the joint was observed externally and scored. In the group administered with a mixture of 4 types of anti-PAD4 antibodies (L78-4, L119-5, L198-3, L207-11), a significant arthritis inhibitory effect was observed compared to the phosphate buffer group . No obvious side effects due to antibody administration were observed.
  • Example 3 For each of the four types of anti-PAD4 antibodies (L78-4, L119-5, L198-3, and L207-11), prepare different concentrations of anti-PAD4 antibody solutions.
  • Human PAD4 (5 nM) and a total volume of 44 ⁇ l
  • the mixture was mixed with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6) containing 1 mM EDTA and 1 mM DTT.
  • BAEE benzoylarginine ethyl ester
  • the present invention can be used for prevention and / or treatment and diagnosis of rheumatoid arthritis.
  • ⁇ SEQ ID NO: 1> This shows the DNA sequence encoding antigenic peptide 1 (V366 to K382 of human PAD4).
  • GTGGTCTTCGACTCTCCAAGGAACAGAGGCCTGAAGGAGTTTCCCATCAAA ⁇ SEQ ID NO: 2> This shows the amino acid sequence of antigenic peptide 1 (V366 to K382 of human PAD4).
  • V V F D S P R N R G L K E F PI K ⁇ SEQ ID NO: 3> This shows the DNA sequence encoding antigenic peptide 2 (E340 to Y356 of human PAD4).

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Abstract

　新規抗リウマチ薬を提供する。　配列番号２又は４のアミノ酸配列中の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体。前記抗体、抗ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４抗体又はそれらの組み合わせを含有する医薬組成物、抗リウマチ薬、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４阻害剤も提供される。さらに、配列番号２又は４のアミノ酸配列中の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドである抗原ペプチドも提供される。

Description

抗ＰＡＤ４抗体医薬の創成
　本発明は、抗ＰＡＤ４(Peptidylarginine deiminase 4)抗体医薬の創成に関する。
　関節リウマチは、免疫異常によって関節滑膜に炎症が生じ、がん細胞に似た異常増殖性を有するパンヌス（肉芽組織）を形成し、関節軟骨や骨を侵食・破壊する病気である。全世界人口の約１％が患っており、特に高齢者・女性での発症率が高い。
　関節リウマチ（RA）の薬物治療は炎症を緩和させる抗炎症薬とリウマチの免疫異常を直して関節破壊の進行を抑えることが期待される疾患修飾性抗リウマチ薬に分けられる。前者はさらにアスピリンなどの非ステロイド抗炎症薬と炎症を抑える作用は強いが副作用もあるステロイド薬とに分けられる。疾患修飾性抗リウマチ薬は免疫異常を正常化する免疫抑制剤では、1999年に発売されたメトトレキサート（商品名リウマトレックス）が有名である。さらに最近ではIL1, IL6, TNFαなどの炎症性サイトカインの作用を抑える抗リウマチ薬が注目されている。
　RAは免疫異常によって関節滑膜に炎症が起こり、関節に腫れや痛みを引き起こす自己免疫疾患である。これを治療するために、これまでは炎症を緩和させる抗炎症薬や免疫機能を抑制する薬剤、炎症を引きおこすサイトカインに対する抗体が利用されてきたが、いずれの薬物も対象療法であるために定期的に服用する必要があるなど多くの問題が残されている。
　関節リウマチ患者は関節リウマチに特異的な自己抗体を産生しているが、いずれの自己抗体もシトルリン化されたタンパク質を自己抗原として認識して産生されていることが報告されている（非特許文献１、２）。抗CCP(環状シトルリン化ペプチド)抗体は高い特異性と感度を有し、RAの早期診断に非常に有効で、日本でも2007年4月より保険適応されている。米国リウマチ学会年次学術集会（ACR2009）で抗CCP抗体がRAの新しい診断基準となった。
　また、ゲノムワイド大規模ケース・コントロール解析によってペプチジルアルギニンデイミナーゼ4（Peptidylarginine deiminase 4, PAD4）の遺伝子上に関節リウマチ感受性の一塩基多型が見つかっている（非特許文献３）。
　関節リウマチ発症に関与する主要組織適合系複合体（MHC Class II: HLA=DRB1*0401）はシトルリン化ペプチドに対して高い親和性を示すことが報告されている（非特許文献４）。
　関節リウマチ発症のメカニズムとしては、シトルリン化されたタンパク質が非自己として認識されて自己抗体が産生されるという説が提唱されている（非特許文献５、非特許文献６）。
　一方、ヒトPAD4の全体構造の解析がなされている（非特許文献７）。
　Foulquierらは、PADによってシトルリン化されたタンパク質が炎症を起こしている滑膜に局在していること、PAD2及びPAD4が炎症を起こしている滑膜で産生されていることを報告している（非特許文献８）。
　Harrisらは、抗PAD4抗体が36 ～ 42% のRA患者で検出され、RA感受性PAD4遺伝子の存在と強い相関があると報告している（非特許文献９）。
Schellekens et al. J. Clin. Invest. 101,273-281 (1998) Van Jaarsvelt  et al. Clin. Exp.Rheumatol. 17, 689-697(1999) Suzuki et al. Nat. Genet. 34,395-402 (2003) Hill et al., J. Imm. 171,538-541 (2003) Nijenhuis et al., Clin Chim Acta. (2004) Vossenaar et al. Arthritis Res. Ther. 6, 1-5 (2004) Arita et al., Nat. Struct. Mol.Biol. 11, 777-783 (2004) Foulquier et al. Arthritis Rheum. 56, 3541-3553 (2007) Harris et al. Arthritis Rheum. 58, 1958-1967 (2008)
　本発明は、新規抗リウマチ薬を提供することを目的とする。
　本発明者らは、関節リウマチ（RA）の原因タンパク質と考えられるPAD4の活性を阻害する抗PAD4抗体をPAD4の立体構造に基づいて創成し、そのRA抑制効果を、関節リウマチ様病変を示す新規トランスジェニックマウス（D1CCマウス）で検証したところ、関節炎抑制効果を示すことを確認した。本発明はこれらの知見に基づいて完成された。
　本発明の要旨は以下の通りである。
（１）配列番号２又は４のアミノ酸配列中の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むポリペプチド。
（２）N末端及び/又はC末端にシステインを付加した（１）記載のポリペプチド。
（３）N末端及び/又はC末端のアミノ酸を修飾した（１）又は（２）記載のポリペプチド。
（４）C末端のアミノ酸をアミド化及び/又はN末端のアミノ酸をアセチル化した（３）記載のポリペプチド。
（５）配列番号２のアミノ酸配列のN末端にシステインが付加され、C末端のリシンがアミド化された（４）記載のポリペプチド。
（６）配列番号４のアミノ酸配列のC末端にシステインが付加され、N末端のグルタミン酸がアセチル化された（４）記載のポリペプチド。
（７）（１）記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
（８）抗体がモノクローナル抗体である（７）記載の抗体。
（９）受託番号FERM BP-11389、FERM BP-11390、FERM BP-11391又はFERM
BP-11392のハイブリドーマから産生される（８）記載のモノクローナル抗体。
（１０）（８）記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（１１）受託番号FERM BP-11389、FERM BP-11390、FERM BP-11391又はFERM
BP-11392のハイブリドーマである（１０）記載のハイブリドーマ。
（１２）抗ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４抗体、（７）記載の抗体又はそれらの組み合わせを含有する医薬組成物。
（１３）抗ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４抗体、（７）記載の抗体又はそれらの組み合わせを含有する抗リウマチ薬。
（１４）抗ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４抗体、（７）記載の抗体又はそれらの組み合わせを含有するペプチジルアルギニンデイミナーゼ４阻害剤。
（１５）（１）記載のポリペプチドをコードする核酸。
（１６）（１５）記載の核酸を含むベクター。
（１７）（１６）記載のベクターを含む形質転換体。
（１８）（１７）記載の形質転換体を培養することを含む、配列番号２又は４のアミノ酸配列中の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドの製造方法。
　抗PAD4抗体医薬はRAの病因（PAD4によるタンパク質のシトルリン化に対する自己免疫疾患）に基づいた医薬であり、従来の対象療法的な医薬とは異なり、RAの根本的な治療薬として期待される。RAの根本的な治療薬として期待されることから、従来の抗リウマチ薬に比べて、炎症の抑制効果が大きいこと、服用が短期間で済むこと、副作用が弱いことなどが期待される。
　本発明の抗PAD4抗体医薬は、ＲＡの治療薬として有効である。
　本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2010‐185734の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
ヒト（human）およびマウス（mouse）PAD4のアミノ酸配列の比較。ヒトPAD4は663アミノ酸残基、マウスPAD4は666アミノ酸残基から構成される。ヒトとマウスPAD4の間のアミノ酸配列の相同性（一致度）は、N末端ドメインで68.3%、C末端ドメインで76.9%。C末端ドメインのアミノ酸配列を詳細に比較したものを赤の四角内に示す。赤の四角内にはアミノ酸配列の比較の下にＸ線結晶構造解析されたヒトPAD4の二次構造（赤の棒：αへリックス、赤の矢印：βストランド、点線は構造がディスオーダーしている部分）も合わせて表示している。Ｘ線結晶構造解析されたのは、カルシウムイオンと基質が結合したPAD4（substrate complex）、カルシウムイオンのみが結合したPAD4（Ca2+-bound PAD4）、および、カルシウムイオンも基質も結合していないPAD4（Ca2+-free PAD4）の３つである。図に示した本発明の抗原ペプチド１および２の領域の大部分は、カルシウムイオンも基質も結合していないPAD4（Ca2+-free PAD4）では構造がディスオーダーしているが、カルシウムイオンの結合（Ca2+-bound PAD4）、カルシウムイオンと基質の両方の結合（substratecomplex）に伴い構造が安定化されて規則構造が誘起される。また、この領域におけるヒトとマウス間のアミノ酸配列の相同性は、抗原ペプチド１および２では、それぞれ82％と94％と全体におけるそれよりも高い。 Ｘ線結晶構造解析されたヒトPAD4のC末端ドメインの立体構造。αへリックスはらせん状のリボン、βストランドは矢印のリボンで表示。左側の図はカルシウムイオンも基質も結合していないPAD4（Ca2+-free PAD4）、右の図はカルシウムイオンと基質の両方が結合したPAD4（substrate complex）。図に示した本発明の抗原ペプチド１および２の領域の大部分は、カルシウムイオンも基質も結合していないPAD4（Ca2+-free PAD4）（左図）では構造がディスオーダーしているが、カルシウムイオンと基質の両方が結合（substrate complex）すると（右図）、ディスオーダー領域が安定化されて規則構造が誘起される。 D1CCマウスにウシII型コラーゲンを初回免疫し、3週間後に後に2次免疫（boost）を行った。横軸は初回免疫後の経過週数を示す。縦軸は、各肢関節部における外見的所見をスコア化し、四肢のスコアの合計値を示している。各肢におけるスコアの最高値は４、四肢全体の合計は16となる。各スコアの基準は、スコア1：肢における発赤、腫脹、スコア2：肢または各指における発赤を伴う明らかな腫脹、スコア3：肢全体におよぶ腫脹、スコア4：腫脹軽減後の強直状態、である。抗PAD4抗体による治療効果の検討は、抗PAD4抗体混合物投与群（抗PAD4抗体）とPBS投与群（control）の比較により行った。4種類の抗PAD4抗体それぞれを25μg、合計100μgの混合物を作製し各個体に腹腔内投与した（100μl/mouse,controlはPBS 100μl/mouse）。投与開始は、2次免疫後開始し、その後5日間隔で合計3回投与した。 作成した４種類の抗PAD4抗体（L78-4, L119-5, L198-3, L207-11）によるPAD4の阻害活性。赤、青、緑の棒グラフは、それぞれ抗PAD4抗体を終濃度1000 nM,250 nM, 62.5 nMになるように加えたときのPAD4の残存酵素活性。なお、残存酵素活性は、黒の棒グラフで示した抗PAD4抗体濃度0.0 nMのときのPAD4の残存酵素活性を100に規格化した相対値（%）で表示している。
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
　本発明は、配列番号２又は４のアミノ酸配列中の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドを提供する。
　配列番号２のアミノ酸配列は、ヒトPAD4のV366からK382のアミノ酸配列である。配列番号４のアミノ酸配列は、ヒトPAD4のE340からY356のアミノ酸配列である。
　本発明のポリペプチドは、ヒトPAD4のアミノ酸配列中に見出される、６～１７個、好ましくは６～１３個、より好ましくは６～９個の連続するアミノ酸残基からなるものであるとよい。
　本発明のポリペプチドは、抗原ペプチドとして有用である。アミノ酸の数が最小で６～９個あれば、抗原となりうると考えられる。
　本発明のポリペプチドは公知の方法で化学合成することができる。
　本発明のポリペプチドには、N末端及び/又はC末端にシステインを付加してもよい。動物を免疫する際にキャリア蛋白質と結合させるためにはN末端及び/又はC末端にシステインを付加することが好ましい。N末端及び/又はC末端にシステインへの付加は公知の方法で行うことができる。
　本発明のポリペプチドは、N末端及び/又はC末端のアミノ酸にアミド化、アセチル化などの修飾を施してもよい。このような修飾により、末端部位に対する抗体がメインにできるのを防ぐことができる。
　本発明のポリペプチドの具体例として、配列番号２のアミノ酸配列のN末端にシステインが付加され、C末端のリシンがアミド化されたポリペプチド、配列番号４のアミノ酸配列のC末端にシステインが付加され、N末端のグルタミン酸がアセチル化されたポリペプチドなどを挙げることができる。
　本発明のポリペプチドは、公知の遺伝子工学的手法によっても製造することができる。例えば、本発明のポリペプチドをコードするDNAを得、得られたDNAを適当な発現ベクターに組み込んだ後、適当な宿主に導入し、得られた形質転換体を培養することにより、組換えポリペプチドとして生産させることができる（例えば、西郷薫、佐野弓子共訳、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳコンパクト版、分子生物学実験プロトコール、Ｉ、II、III、丸善株式会社：原著、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等，　Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照のこと）。
　本発明は、配列番号２又は４のアミノ酸配列中の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドをコードする核酸も提供する。本発明のポリペプチドをコードする核酸は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。核酸は、DNA、cDNA、RNAおよびそれらに相補的な核酸およびそれらの誘導体でありうる。
　本発明のポリペプチドをコードするDNAとしては、配列番号１のヌクレオチド配列からなるDNA、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA（例えば、配列番号１のヌクレオチド配列からなるDNA）に相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ抗原となりうるポリペプチドをコードするDNA、配列番号３のヌクレオチド配列からなるDNA、配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA（例えば、配列番号３のヌクレオチド配列からなるDNA）に相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ抗原となりうるポリペプチドをコードするDNAなどを例示することができる。
　配列番号２又は４のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAは、配列番号２又は４のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA（例えば、配列番号１又は３のヌクレオチド配列からなるDNA）に相補的なDNAの全部又は一部と少なくとも80%（好ましくは、少なくとも95%、より好ましくは、少なくとも98%）の同一性があるとよい。ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で行われる。核酸二本鎖又はハイブリッドの安定性は、融解温度Tm（プローブが標的DNAから解離する温度）で表される。この融解温度はストリンジェントな条件を定義するために用いられる。1%のミスマッチによりTmが１℃低下すると仮定すると、ハイブリダイゼーション反応の最終洗浄の温度を低くしなければならない。例えば、プローブと95%以上の同一性を有する配列を求める場合には、最終洗浄温度を５℃低くしなければならない。実際、1%のミスマッチにつき、0.5～1.5℃の間でTmが変わることになる。ストリンジェントな条件の例としては、5x SSC/5x デンハルト溶液/1.0% SDS中68℃でハイブリダイズさせ、0.2x SSC/0.1%SDS中室温で洗浄することである。中程度にストリンジェントな条件の例としては、3x SSC中42℃で洗浄することである。塩濃度や温度は、プローブと標的核酸との同一性の最適なレベルを達成するために変更されうる。このような条件に関するさらなる指針として、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; and Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons. N.Y.)  at Unit 2.10を参照されたい。
　本発明のポリペプチドをコードするDNAは、市販の合成機を用いて合成することができる。あるいは、ヒト骨髄性白血病HL-60細胞 cDNAを用いて、本発明のポリペプチドのコード領域をPCRによって増幅することによって、本発明のポリペプチドをコードするDNAを得ることもできる。
　本発明のポリペプチドをコードする核酸を含む組換えベクターは、公知の方法（例えば、Molecular Cloning２nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法）により、本発明のポリペプチドをコードするDNAを適当な発現ベクターに挿入することにより得られる。
　発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫病原ウイルスなどを用いることができる。
　発現ベクターには、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、SV40複製オリジンなどを付加してもよい。
　また、発現ベクターは、融合タンパク質発現ベクターであってもよい。種々の融合タンパク質発現ベクターが市販されており、pGEXシリーズ（アマシャムファルマシアバイオテク社）、pET CBD Fusion System 34b-38b（Novagen社）、pET Dsb Fusion Systems 39b and 40b（Novagen社）、pET GST Fusion System 41 and 42（Novagen社）などを例示することができる。
　本発明のポリペプチドをコードするDNAを含む組換えベクターを宿主に導入することにより、形質転換体を得ることができる。
　宿主としては、細菌細胞（例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、枯草菌など）、真菌細胞（例えば、酵母、アスペルギルスなど）、昆虫細胞（例えば、S2細胞、Sf細胞など）、動物細胞（例えば、CHO細胞、COS細胞、HeLa細胞、C127細胞、3T3細胞、BHK細胞、HEK293細胞など）、植物細胞などを例示することができる。
　組換えベクターを宿主に導入するには、Molecular Cloning２nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法（例えば、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、トランスフェクション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、エレクロトポレーション法、形質導入法、スクレープローディング法、ショットガン法など）または感染により行うことができる。
　形質転換体を培地で培養し、培養物から本発明のポリペプチドを採取することができる。ポリペプチドが培地に分泌される場合には、培地を回収し、その培地からポリペプチドを分離し、精製すればよい。ポリペプチドが形質転換された細胞内に産生される場合には、その細胞を溶解し、その溶解物からポリペプチドを分離し、精製すればよい。
　ポリペプチドが別のタンパク質（タグとして機能する）との融合タンパク質の形態で発現される場合には、融合タンパク質を分離及び精製した後に、FactorXaや酵素（エンテロキナーゼ）処理をすることにより、別のタンパク質を切断し、目的とするポリペプチドを得ることができる。
　ポリペプチドの分離及び精製は、公知の方法により行うことができる。公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度の差を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
　本発明は、配列番号２又は４のアミノ酸配列中の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体も提供する。
　本発明の抗体は、抗リウマチ薬などの医薬として、あるいはペプチジルアルギニンデイミナーゼ４(PAD4)阻害剤として、利用することができる。また、本発明の抗体は、配列番号２又は４のアミノ酸配列中の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドの検出及び／又は定量に利用することもできる。
　本明細書において、抗体とは、Fab、F(ab)’2、ScFv、Diabody、VH、VL、Sc(Fv)2、Bispecific sc(Fv)2、Minibody、scFv-Fc monomer、scFv-Fc dimerなどの低分子化されたものも含む概念である。
　本発明の抗体は、慣用のプロトコールを用いて、配列番号２又は４のアミノ酸配列中の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むポリペプチド又はそのエピトープを含む断片を動物に投与することにより得られる。
　本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、ヒト型抗体のいずれであってもよい。
　ポリクローナル抗体を作製するには、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（抗原ペプチド）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、動物に投与（免疫）を行ない、該免疫動物から抗原ペプチドに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２～６週毎に１回ずつ、計２回程度行なわれる。ポリクローナル抗体は、免疫動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。ポリクローナル抗体の分離精製は、免疫グロブリンの分離精製法（例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法）に従って行なうことができる。
　モノクローナル抗体は、Nature (1975) 256: 495、Science (1980) 208: 692-に記載されている、G. Koehler及びC. Milsteinのハイブリドーマ法により作製することができる。すなわち、動物を免疫した後、免疫動物の脾臓から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞と融合させることによりモノクローナル抗体産生細胞（ハイブリドーマ）を調製する。さらに、配列番号２又は４のアミノ酸配列中の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドと特異的に反応するが、他の抗原タンパク質（あるいはペプチド）とは実質的に交差反応しない抗体を産生する細胞系を単離するとよい。このようなハイブリドーマとしては、受託番号FERM BP-11389、FERM BP-11390、FERM BP-11391、FERM BP-11392のハイブリドーマなどを例示することができる。この細胞系を培養し、培養物から所望のモノクローナル抗体を取得することができる。モノクローナル抗体の精製は、上記の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
　一本鎖抗体を作製する技法は、米国特許第4,946,778号に記載されている。
　ヒト化抗体を作製する技法は、Biotechnology 10, 1121-, 1992; Biotechnology 10, 169-, 1992に記載されている。
　ヒト型抗体を作製する技法としては、ファージディスプレイ法（J. Mol. Biol., 222, 581-597(1991); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 4457-4461(1992); EMBO J., 13, 3245-3260(1994)）、ヒト末梢血Ｂリンパ球法（J. Immunol. Methods, 275, 223-237(2003); Nat. Med., 10, 871-875(2004)）、ヒト抗体遺伝子を組み込んだキメラ動物によるヒト抗体作製法（J. Immuno. Methods, 231, 11-23(1999); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, 722-727(2000)）などが利用できる。
　本発明の抗体、抗ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４抗体又はそれらの組み合わせは、抗リウマチ薬などの医薬として、あるいはペプチジルアルギニンデイミナーゼ４阻害剤として、利用することができる。ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４阻害剤は、医薬としても、また、実験用試薬としても用いることができる。
　抗ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４抗体は、特開2009-156615に記載の方法で作製することができる。
　本発明の抗体、抗ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４抗体又はそれらの組み合わせを医薬として利用する場合には、リウマチ関節炎、間質性肺炎、肺炎、気管支炎、上強膜炎、骨粗鬆症などの予防及び／又は治療に用いることができる。この医薬は、RAの病因（PAD4によるタンパク質のシトルリン化に対する自己免疫疾患）に基づいた医薬であり、従来の対象療法的な医薬とは異なり、RAの根本的な治療薬として期待される。RAの根本的な治療薬として期待されることから、従来の抗リウマチ薬に比べて、炎症の抑制効果が大きいこと、服用が短期間で済むこと、副作用が弱いことなどが期待される。本発明の抗体、抗ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４抗体又はそれらの組み合わせをPBSなどの緩衝液、生理食塩水、滅菌水などに溶解し、必要に応じてフィルタ-などで濾過滅菌した後、注射により被験者に投与するとよい。また、この溶液には、添加剤（例えば、着色剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、溶解補助剤、安定化剤、保存剤、酸化防止剤、緩衝剤、等張化剤など）などを添加してもよい。投与経路としては、静脈、筋肉、腹腔、皮下、皮内投与などが可能であり、また、経鼻、経口投与してもよい。
　本発明の抗体、抗ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４抗体又はそれらの組み合わせの投与量、投与の回数及び頻度は、被験者の症状、年齢、体重、投与方法、投与形態などにより異なるが、例えば、通常、成人一人当たり0.1～100mg/kg体重、好ましくは、1～10mg/kg体重を、少なくとも１回、所望の効果が持続する頻度で投与するとよい。
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
　図２に示す2種類の抗原ペプチドのうち抗原ペプチド１（配列番号２）のN末端及び抗原ペプチド２（配列番号４）のC末端にシステインを付加したものを公知の方法で化学合成した。N末端にシステインを付加した抗原ペプチド１のC末端のリシンはアミド化し、C末端にシステインを付加した抗原ペプチド２のN末端のグルタミン酸はアセチル化した。これらの抗原ペプチドを感作抗原として動物を免疫し、免疫動物から抗体産生細胞を採取し、ミエローマ細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を作成した。
[規則91に基づく訂正 13.01.2012]　
　各モノクローナル抗体（L78-4, L119-5, L198-3及びL207-11）は、各ハイブリドーマ細胞から調整した。各ハイブリドーマ細胞は、RPMI1640を基礎培地としこれにウシ胎児血清（１０～２０％）、抗生物質（ペニシリン、ストレプトアビジン）を加えた培地を用い、5％CO2、37度条件下にて培養した。モノクローナル抗体は，公知の方法でハイブリドーマ細胞をマウス腹腔で増殖させ、腹水を採取し、ヒトPAD4親和クロマトグラフィにより精製した。各モノクローナル抗体産生に利用した各ハイブリドーマ細胞は、国際寄託当局であるIPOD 独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（日本国　茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号305-8566）に2010年6月11日に寄託した。各ハイブリドーマ細胞の寄託番号は、FERM BP-11389 （モノクローナル抗体L78-4を産生）、FERM BP-11390（モノクローナル抗体L119-5を産生）、FERM BP-11391（モノクローナル抗体L198-3を産生）、FERM BP-11392（モノクローナル抗体L207-11を産生）である。なお、本受託は、2010年6月11日（国内受託日）に寄託されたFERM P-21972、FERM P-21973、FERM P-21974、FERM P-21975より移管されたものである。
〔実施例２〕
　D1CCマウス（ヒト関節リウマチの病態を再現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物、国際公開番号WO2005/085438）による関節炎抑制効果の検証実験を4種類の抗PAD4抗体（L78-4, L119-5, L198-3, L207-11）の混合物を用いて行った。各マウスに初回免疫としてウシII型コラーゲン（10ng）を含むフロイント完全アジュバントを投与し、2次免疫として同じくウシII型コラーゲン（10ng）を含むフロイント不完全アジュバントを投与した。2次免疫投与後上記精製モノクローナル抗体混合物（各25μｇ、合計100 μｇ/マウス/1回投与）またはコントロール（リン酸緩衝液）を5日間隔で3回腹腔内に投与した。投与後関節部の腫脹を外見的に観察し、スコア化した。4種類の抗PAD4抗体（L78-4, L119-5,  L198-3, L207-11）混合物を投与した群では、リン酸緩衝液投与群と比較して顕著な関節炎抑性効果が観察された。抗体投与による明らかな副作用は観察されなかった。
〔実施例３〕
　作成した４種類の抗PAD4抗体（L78-4, L119-5, L198-3, L207-11）それぞれについて、異なる濃度の抗PAD4抗体の溶液を調製し、ヒトPAD4（5 nM）と全量が44μl になるように1 mM EDTA、1 mM DTTを含む20 mM Tris-HCl 緩衝液（pH 7.6）と混合した。一晩静置後、攪拌しながら5μl の100 mM BAEE（ベンゾイルアルギニンエチルエステル）を加え、さらに1μl の0.5 M CaCl2を加えてよく攪拌した（全量50μl、BAEEの終濃度は10 mM、カルシウムイオンの終濃度は10 mM）。この溶液を37℃（湯浴）で3時間静置させ、5Mの過塩素酸を12.5 μl加えて反応を停止させた。この溶液を5分間氷冷下で静置し、4℃で5分間遠心（15,000 rpm）後、上清に含まれるシトルリン化されたBAEEを比色定量した。
　いずれの抗体も濃度に依存してPAD4活性を阻害した。1000nM L207-11は４０％阻害、L78-4, L119-5, L198-3 は３０～１０％阻害を示した。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
本発明は、関節リウマチの予防及び/又は治療、並びに診断に利用可能である。
〈配列番号１〉抗原ペプチド１（ヒトPAD4のV366からK382）をコードするDNA配列を示す。
GTGGTCTTCGACTCTCCAAGGAACAGAGGCCTGAAGGAGTTTCCCATCAAA
〈配列番号２〉抗原ペプチド１（ヒトPAD4のV366からK382）のアミノ酸配列を示す。
V  V  F  D  S  P  R  N R  G  L  K  E  F  PI  K
〈配列番号３〉抗原ペプチド２（ヒトPAD4のE340からY356）をコードするDNA配列を示す。
GAGGAG AAC ATG GAT GAC CAG TGG ATG CAG GAT GAA ATG GAGATC GGC TAC
〈配列番号４〉抗原ペプチド２（ヒトPAD4のE340からY356）のアミノ酸配列を示す。
E  E  N  M  D  D  Q  W  M  Q  D  E  M  E  I  G  Y
〈配列番号５〉N末端にシステインを付加した抗原ペプチド１（ヒトPAD4のV366からK382）のアミノ酸配列を示す。
C  V  V  F  D  S  P  R  N  R  G  L  K  E  F  PI  K
〈配列番号６〉C末端にシステインを付加した抗原ペプチド２（ヒトPAD4のE340からY356）のアミノ酸配列を示す。
E  E  N  M  D  D  Q  W  M  Q  D  E  M  E  I  G  Y  C

Claims (18)

  1. 配列番号２又は４のアミノ酸配列中の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むポリペプチド。
  2. N末端及び/又はC末端にシステインを付加した請求項１記載のポリペプチド。
  3. N末端及び/又はC末端のアミノ酸を修飾した請求項１又は２記載のポリペプチド。
  4. C末端のアミノ酸をアミド化及び/又はN末端のアミノ酸をアセチル化した請求項３記載のポリペプチド。
  5. 配列番号２のアミノ酸配列のN末端にシステインが付加され、C末端のリシンがアミド化された請求項４記載のポリペプチド。
  6. 配列番号４のアミノ酸配列のC末端にシステインが付加され、N末端のグルタミン酸がアセチル化された請求項４記載のポリペプチド。
  7. 請求項１記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
  8. 抗体がモノクローナル抗体である請求項７記載の抗体。
  9. 受託番号FERM BP-11389、FERM BP-11390、FERM BP-11391又はFERM
    BP-11392のハイブリドーマから産生される請求項８記載のモノクローナル抗体。
  10. 請求項８記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
  11. 受託番号FERM BP-11389、FERM BP-11390、FERM BP-11391又はFERM
    BP-11392のハイブリドーマである請求項１０記載のハイブリドーマ。
  12. 抗ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４抗体、請求項７記載の抗体又はそれらの組み合わせを含有する医薬組成物。
  13. 抗ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４抗体、請求項７記載の抗体又はそれらの組み合わせを含有する抗リウマチ薬。
  14. 抗ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４抗体、請求項７記載の抗体又はそれらの組み合わせを含有するペプチジルアルギニンデイミナーゼ４阻害剤。
  15. 請求項１記載のポリペプチドをコードする核酸。
  16. 請求項１５記載の核酸を含むベクター。
  17. 請求項１６記載のベクターを含む形質転換体。
  18. 請求項１７記載の形質転換体を培養することを含む、配列番号２又は４のアミノ酸配列中の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドの製造方法。
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