KR20100098394A

KR20100098394A - 암 치료제로서의 키네신 억제제

Info

Publication number: KR20100098394A
Application number: KR1020107012912A
Authority: KR
Inventors: 티냐 아브람스; Paul Barsanti; 데이비드 둘; 미셸 포레; 폴 에이. 레노우; 안네테 올가 발터
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2007-12-14
Filing date: 2008-12-12
Publication date: 2010-09-06
Also published as: MY150214A; US20130012560A1; US20090239922A1; SMP201000095B; AR069676A1; WO2009077448A1; US8252832B2; NI201000091A; ECSP10010248A; UY31532A1; GT201000172A; JP2011506402A; IL205831A0; DOP2010000175A; CR11412A; TW200930704A; AU2008337570B2; CA2708822A1; NZ585142A; AU2008337570A1

Abstract

본 발명은 키네신 방추체 단백질 (KSP, 또한 Eg5라고 함)의 활성을 억제하는 신규 이미다졸 화합물을 제공한다. KSP의 억제제는 바람직하지 않은 세포 증식을 감소시키고 다른 치료 효과를 제공할 수 있다. 본 발명은 또한 이들 신규 화합물을 함유하는 제약 조성물, 및 다양한 유형의 암을 치료하기 위해 신규 KSP 억제제 및 그의 제약 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 화합물, 조성물 및 방법은 통상적인 약물 치료에 대해 내성인 특정 부류의 암의 치료에 특히 유용하며, 이는 이러한 암이 본 발명의 화합물에 대한 민감성을 유지하는 것으로 나타났기 때문이다.

Description

암 치료제로서의 키네신 억제제 {KINESIN INHIBITORS AS CANCER THERAPEUTICS}

본 발명은 KSP 억제제를 투여함으로써, 암과 같은 증식성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

키네신은 미세소관을 따라 이동하면서 아데노신 트리포스페이트를 가수분해하여 기계적 힘을 발생시키는 모터 단백질이다. 이 단백질은 약 350개의 아미노산 잔기를 갖는 모터 도메인을 함유하는 것을 특징으로 한다. 여러 키네신 모터 도메인의 결정 구조가 밝혀졌다.

현재, 약 100개의 키네신-관련 단백질 (KRP)이 확인되었다. 키네신은 세포소기관 및 소포의 수송 및 소포체의 유지를 포함하는 다양한 세포 생물학적 과정에 관여된다. 여러 KRP는 유사분열 방추체의 미세소관 또는 염색체와 직접 상호작용하고, 세포 주기의 유사분열 단계에서 중추적 역할을 담당하는 것으로 보인다. 상기 유사분열 KRP는 암 치료제 개발에 있어서 특히 관심 대상이다.

키네신 방추체 단백질 (KSP) (Eg5, HsEg5, KNSL1 또는 KIF11이라고도 공지됨)은 유사분열 방추체에 국지화되고 양극성 유사분열 방추체의 형성 및/또는 기능에 필요한 것으로 공지된 여러 키네신-유사 모터 단백질 중 하나이다.

1995년에, KSP의 C-말단에 대해 지정된 항체를 사용한 KSP의 고갈은 미세소관의 단일성상체 배열로 유사분열 중 HeLa 세포를 정지시키는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Blangy et al., Cell 83:1159-1169, 1995]). KSP의 동족체로 고려되는 bimC 및 cut7 유전자에서의 돌연변이는 아스페르길루스 니듈란스(Aspergillus nidulans) (문헌 [Enos, A.P., and N.R. Morris, Cell 60:1019-1027, 1990]) 및 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (문헌 [Hagan, I., and M. Yanagida, Nature 347:563-566, 1990])에서 중심체가 분리하지 못하게 한다. 단백질 수준에서 KSP 발현을 감소시키는 ATRA (올-트랜스-레티노산)에 의한 세포의 처리 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용한 KSP의 고갈은 DAN-G 췌장 암종 세포의 상당한 성장 억제를 나타내었는데, 이는 KSP가 올-트랜스-레티노산의 항증식성 작용에 관여될 수 있다는 것을 나타낸다 (문헌 [Kaiser, A., et al., J. Biol. Chem. 274, 18925-18931, 1999]). 흥미롭게도, 제노푸스 라에비스 오로라(Xenopus laevis Aurora)-관련 단백질 키나제 pEg2는 XlEg5와 회합하고 인산화시키는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Giet, R., et al., J. Biol. Chem. 274:15005-15013, 1999]). 오로라-관련 키나제의 잠재적인 기질은 암 약물 개발에 있어서 특히 관심 대상이다. 예를 들어, 오로라 1 및 2 키나제는 단백질 및 RNA 수준에서 과다발현되고, 유전자는 결장 암 환자에서 증폭된다.

KSP에 대한 제1 세포 투과성 소분자 억제제인 "모나스트롤(monastrol)"은 통상의 화학요법제, 예컨대 탁산 및 빈카 알칼로이드가 그렇듯이 미세소관 중합에 영향을 미치지 않고 단극성 방추체로 세포를 정지시키는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Mayer, T.U., et al., Science 286:971-974, 1999]). 모나스트롤은 표현형-기반 스크린에서 억제제로 확인되었고, 상기 화합물은 항암 약물 개발을 위한 선도적인 역할을 담당할 수 있다는 사실이 제안되었다. 상기 억제는 KSP와의 아데노신 트리포스페이트 상호작용에 대해 경쟁적이지 않은 것으로 결정되었고, 신속하게 가역적인 것으로 밝혀졌다 (문헌 [DeBonis, S., et al., Biochemistry, 42:338-349, 2003]; 및 [Kapoor, T.M., et al., J. Cell Biol. 150:975-988, 2000]).

개선된 화학요법제의 중요성의 면에서, KSP 및 KSP-관련 단백질의 효과적인 생체내 억제제인 KSP 억제제에 대한 필요성이 존재한다. 몇몇 KSP 억제제는 이전에 보고되었다. 예를 들어, 제WO 06/002236호 및 제PCT/US2006/031129호에는 KSP 억제제인 것으로 나타난 특정 부류의 화합물이 개시되어 있다. 이스피네십 (SB-715992)은 KSP 억제제로서 작용하는 것으로 나타난 사이토키네틱스(Cytokinetics)로부터의 임상 후보물질이다. 본 발명은 개선된 활성을 갖는 새로운 KSP 억제제 및 이들 KSP 억제제를 사용하는 새로운 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 유출 펌프로서 작용하는 P-당단백질의 발현으로 인해 파클리탁셀과 같은 다른 치료제에 대해 내성인 암 세포에 대해 효과적인 신규 KSP 억제제를 제공한다.

<발명의 요약>

본 발명은 포유동물에게 치료 유효량의 화학식 I의 화합물, 상기 화합물의 호변이성질체, 상기 화합물의 제약상 허용되는 염, 상기 호변이성질체의 제약상 허용되는 염 또는 이들의 혼합물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 고형 종양 또는 혈액계 암에서 선택된 증식성 질병의 치료 방법을 제공한다.

<화학식 I>

상기 식에서,

R¹은 아미노아실, 아실아미노, 카르복실, 카르복실 에스테르, 아릴, 및 히드록시 또는 할로로 임의로 치환된 알킬로 구성된 군에서 선택되고;

R²는 수소, 알킬 및 아릴로 구성된 군에서 선택되고;

R^a는 L-A¹이고;

L은 -S(O)_q- (여기서, q는 1 또는 2임), 및 히드록시, 할로 또는 아실아미노로 임의로 치환된 C₁ 내지 C₅ 알킬렌으로 구성된 군에서 선택되고;

A¹은 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭, 치환된 헤테로시클릭, 시클로알킬 및 치환된 시클로알킬로 구성된 군에서 선택되고;

R⁶은 헤테로시클릭, 아릴 및 헤테로아릴로 구성된 군에서 선택되며, 이들 모두는 -(R⁸)_m (여기서, R⁸은 하기 정의된 바와 같고, m은 1 내지 3의 정수임)으로 임의로 치환될 수 있고;

R⁸은 시아노, 알킬, 알케닐, 알키닐, -CF₃, 알콕시, 할로 및 히드록시로 구성된 군에서 선택되나; 단, m이 2 또는 3인 경우, R⁸은 각각 동일하거나 상이할 수 있고;

R^b는 R⁴ 또는 R⁵이고;

R⁴는 수소, 선형 알킬, -알킬렌-아미노아실, -알킬렌-옥시아실, -알킬렌-아실옥시, -알킬렌-히드록시, -[알킬렌]_p-질소-함유 헤테로시클릭, -[알킬렌]_p-질소-함유 치환된 헤테로시클릭, -[알킬렌]_p-질소-함유 헤테로아릴, -[알킬렌]_p-질소-함유 치환된 헤테로아릴 및 -[알킬렌]_p-NR¹⁰R¹¹ (여기서, p는 0 또는 1임)로 구성된 군에서 선택되고, R⁴ 알킬렌은 아미노, 치환된 아미노, 히드록시, 알킬, 치환된 알킬, 카르복실, 카르복실 에스테르, 옥소, 스피로시클로알킬 및 할로로 구성된 군에서 선택된 상기 치환기 중 하나로 임의로 일치환 또는 이치환된 직쇄 알킬렌이고;

R¹⁰ 및 R¹¹은 수소, 알킬, 치환된 알킬, -S(O)-알킬, -S(O)-치환된 알킬, -S(O)₂-알킬, -S(O)₂-치환된 알킬, 헤테로시클릭, 치환된 헤테로시클릭, 아실, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 시클로알킬 및 치환된 시클로알킬로 구성된 군에서 독립적으로 선택되거나, 또는 R¹⁰이 수소인 경우, R¹¹은 히드록시, 알콕시 또는 치환된 알콕시이고;

R⁵는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 헤테로시클릭, 치환된 헤테로시클릭, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴 및 치환된 헤테로아릴로 구성된 군에서 선택되고;

R^c는 R³ 및 -C(O)-N(R¹³)(R¹⁴)로 구성된 군에서 선택되고;

R³은 수소 및 -X-A로 구성된 군에서 선택되며, 여기서 X는 -C(O)-, -C(S)-, -S(O)-, -S(O)₂- 및 -S(O)₂-N(R)-로 구성된 군에서 선택되며, 여기서 R은 수소 또는 알킬이고;

A는 수소, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알콕시, 임의로 치환된 아릴, 카르복실, 카르복실 에스테르, 아미노아실, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 헤테로시클릭 및 임의로 치환된 시클로알킬로 구성된 군에서 선택되며, 여기서 임의로 치환된 기는 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 아릴옥시, 치환된 아릴옥시, 시아노, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭, 치환된 헤테로시클릭, 헤테로시클릴옥시, 치환된 헤테로시클릴옥시, 아실, 카르복실, 카르복실 에스테르, 옥소 (A가 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴인 경우 제외), 할로, 히드록시, -S(O)₂-R⁹ (여기서, R⁹는 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴임) 및 니트로로 구성된 군에서 선택된 1 내지 4개의 치환기로 치환되고;

R¹³ 및 R¹⁴는 수소, 히드록시, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭으로 구성된 군에서 독립적으로 선택되나, 단 R¹³ 또는 R¹⁴ 중 하나만이 히드록시이거나; 또는 R¹³ 및 R¹⁴는 이에 결합된 질소 원자와 함께 결합하여 헤테로시클릭 또는 치환된 헤테로시클릭을 형성한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 포유동물에게 치료 유효량의 화학식 I의 화합물, 상기 화합물의 호변이성질체, 상기 화합물의 제약상 허용되는 염, 상기 호변이성질체의 제약상 허용되는 염 또는 이들의 혼합물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 폐 암종, 유방 암종, 난소 암종, 피부 암종, 결장 암종, 방광 암종, 간 암종, 위 암종, 전립선암, 신장 세포 암종, 비인두 암종, 편평 세포 암종, 갑상선 유두 암종, 자궁경부 암종, 소세포 폐 암종 (SCLC), 비-소세포 폐 암종, 췌장암, 두경부 편평 세포암 및 육종으로 구성된 군에서 선택된 고형 종양 또는 혈액계 암에서 선택된 증식성 질병의 치료 방법을 제공한다.

다른 실시양태에서, 고형 종양은 유방 암종이다. 추가 실시양태에서, 유방 암종은 전이성 유방 암종이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 포유동물에게 치료 유효량의 화학식 I의 화합물, 상기 화합물의 호변이성질체, 상기 화합물의 제약상 허용되는 염, 상기 호변이성질체의 제약상 허용되는 염 또는 이들의 혼합물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 위 암종인 고형 종양 또는 혈액계 암에서 선택된 증식성 질병의 치료 방법을 제공한다.

다른 실시양태에서, 고형 종양은 전립선암이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 종양이 다약제 내성 종양인 치료 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 다약제 내성 종양은 상승된 수준의 P-당단백질을 발현한다. 몇몇 실시양태에서, 치료는

R¹이 C1-C6 알킬 또는 시클로알킬이고/거나;

R²가 H 또는 C1-C4 알킬이고/거나;

R⁶이 임의로 치환된 아릴기이고/거나;

R^a가 임의로 치환된 벤질 또는 아릴메틸 기이고/거나;

R^b가 아미노-치환된 C2-C6 알킬렌이며, 이는 히드록시, C1-C4 알킬, C1-C4 할로알킬, C1-C4 히드록시알킬, 옥소 또는 할로에 의해 추가로 치환될 수 있고/거나;

R^c가 -X-A이며, 여기서 -X는 -C(O)-이고, A는 아미노, 할로, 히드록시, 알콕시, 시아노, 치환된 아미노 또는 S(O)₂R⁹ (여기서, R⁹는 C1-C4 알킬임)에서 선택된 4개 이하의 기로 치환될 수 있는 알킬인 화학식 I의 화합물의 사용을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 포유동물에게 치료 유효량의 화학식 I의 화합물, 상기 화합물의 호변이성질체, 상기 화합물의 제약상 허용되는 염, 상기 호변이성질체의 제약상 허용되는 염 또는 이들의 혼합물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 고형 종양, 또는 호지킨 림프종 (HL), 비-호지킨 림프종 (NHL), 백혈병, 골수성 백혈병, 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 골수이형성 증후군 (MDS), 모발상 세포 백혈병 및 다발성 골수종으로 구성된 군에서 선택된 혈액계 암에서 선택된 증식성 질병의 치료 방법을 제공한다. 포유동물은 인간일 수 있다.

추가 실시양태에서, 혈액계 암은 급성 골수성 백혈병이다. 별법의 실시양태에서, 혈액계 암은 다발성 골수종이다.

바람직한 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 하나 이상의 하기 바람직한 구조적 특징을 갖는다:

이들 바람직한 실시양태 중 몇몇에서, 화학식 I의 화합물에서 R¹은 C1-C6 알킬 또는 시클로알킬 기이다.

이들 바람직한 실시양태 중 몇몇에서, 화학식 I의 화합물에서 R²는 H 또는 C1-C4 알킬이다.

이들 바람직한 실시양태 중 몇몇에서, 화학식 I의 화합물에서 R⁶은 임의로 치환된 아릴기이고; 특정 실시양태에서, 이는 할로-치환된 페닐 고리이다.

이들 바람직한 실시양태 중 몇몇에서, 화학식 I의 화합물에서 R^a는 임의로 치환된 벤질 또는 아릴메틸 (-CH₂-아릴) 기이고; 특정 실시양태에서, 이는 비치환된 벤질이다.

이들 바람직한 실시양태 중 몇몇에서, 화학식 I의 화합물에서 R^b는 아미노-치환된 C2-C6 알킬렌이며, 이는 히드록시, C1-C4 알킬, C1-C4 할로알킬, C1-C4 히드록시알킬, 옥소 또는 할로에 의해 추가로 치환될 수 있다.

이들 바람직한 실시양태 중 몇몇에서, 화학식 I의 화합물에서 R^c는 -X-A이며, 여기서 -X는 -C(O)-이고, A는 아미노, 할로, 히드록시, 알콕시, 시아노, 치환된 아미노 또는 S(O)₂R⁹ (여기서, R⁹는 C1-C4 알킬임)에서 선택된 4개 이하의 기로 치환될 수 있는 알킬이다.

구체적인 바람직한 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 R¹, R², R⁶, R^a, R^b 및 R^c에 대해 상기 확인된 바람직한 기 중 2개 이상을 포함한다. 추가 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 이들 바람직한 기 중 3개 이상을 포함한다. 추가 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 바람직한 기 중 4개 이상을 포함한다.

본 발명의 방법에서 사용하기 위해 고려되는 화합물의 추가 실시양태는 발명의 명칭이 "치환된 이미다졸 유도체"이고 2006년 1월 5일에 공개된 제WO2006/002236호에 개시되어 있으며, 상기 공개는 그 전문이 본원에 참고로 도입된다. 화합물의 또 다른 추가 실시양태는 발명의 명칭이 "KSP 억제제로서 치환된 이미다졸 화합물"이고 2006년 8월 9일에 출원된 제PCT/US2006/031129호에 개시되어 있으며, 상기 출원은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다. 화합물의 또 다른 추가 실시양태는 발명의 명칭이 "EG-5 억제제로서 환형 유도체"이고 2007년 1월 5일에 출원된 미국 가출원 제60/883740호에 개시되어 있으며, 상기 출원은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.

다른 실시양태에서, 포유동물에게 치료 유효량의 화학식 II의 화합물, 상기 화합물의 호변이성질체, 상기 화합물의 제약상 허용되는 염, 상기 호변이성질체의 제약상 허용되는 염 또는 이들의 혼합물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 고형 종양 또는 혈액계 암에서 선택된 증식성 질병의 치료 방법이 제공된다.

<화학식 II>

상기 식에서,

R^1c는 에틸, 이소프로필, t-부틸, 페닐, -CH(CH₂)₂O (옥세탄-3-일) 및 -CCH₃(CH₂)₂O (3-메틸옥세탄-3-일)로 구성된 군에서 선택되고;

R^2c는 수소 또는 메틸이고;

R¹⁵, R¹⁶, R¹⁷ 및 R¹⁸은 각각 독립적으로 H, 할로, C1-4 알킬, C1-4 할로알킬 및 CN에서 선택되고;

R¹⁹, R²⁰ 및 R²¹은 각각 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 C1-C10 아실이고;

R²²는 C1-C4 할로알킬이고;

p는 1 내지 3의 정수이고;

q는 1 내지 3의 정수이다.

화학식 II의 화합물의 몇몇 실시양태에서,

R^1c는 에틸, 이소프로필 및 t-부틸로 구성된 군에서 선택되고;

R^2c는 H이고;

R¹⁵, R¹⁷ 및 R¹⁸은 각각 독립적으로 H, 할로, C1-4 알킬, C1-4 할로알킬 및 CN에서 선택되고;

R¹⁶은 H 또는 C1-C4 알킬이고;

R²²는 C1-C4 할로알킬이고;

p는 2이고;

q는 1이다.

이들 화합물은 또한 상응하는 제약상 허용되는 염을 포함한다.

화학식 II 및 화학식 IIa 내지 IIc (하기)의 화합물은 화학식 I의 화합물의 서브세트이고, 아실 부분에서 유리 히드록실기 또는 유리 히드록실기의 전구약물 버전의 존재를 특징으로 한다 (즉, 이들 화합물에서 R¹⁹는 H이거나, 또는 R¹⁹는 생체내에서 가수분해되어 R¹⁹가 H인 화합물을 제공할 수 있는 아실기임). R¹⁹가 적합한 아실기인 화합물은 체내에서 쉽게 가수분해되어 R¹⁹가 H인 화합물을 생성하는 전구약물이다. R¹⁹가 H인 화합물은 놀랍게도 전립선암과 같은 특정 장애의 치료를 위한 양호한 활성을 갖는 것으로 밝혀졌고, P-gp가 발현된 종양 및 특정 혈액계 암에 대해 특히 효과적이다. 특히, 이들 화합물은 흔한 내성 메카니즘인 P-gp를 발현하는 약제-내성 종양에 대해 효과적이나, 매우 유사하나 히드록실이 없는 화합물은 이러한 약제-내성 종양에 대해 훨씬 덜 효과적이다. 유리 히드록실은 산화 및 글리코실화와 같은 대사 문제로 인해 약물 후보물질에서 바람직하지 않은 부분인 경우가 흔하나, 놀랍게도 화학식 II 또는 IIa, IIb 또는 IIc의 화합물이 유리 히드록실을 함유하지 않고 쉽게 가수분해되어 유리 히드록실 (R¹⁹ = H)을 제공할 수 없는 유사한 화합물보다 생체내에서 특정 종양에 대해 더 효과적인 것으로 밝혀졌다. 약제-내성 종양에 대한 유효성에 의해 이들 화학식 II의 화합물이 암 치료에 특히 유용하게 된다.

추가 실시양태에서, 포유동물에게 치료 유효량의 화학식 II의 화합물, 상기 화합물의 호변이성질체, 상기 화합물의 제약상 허용되는 염, 상기 호변이성질체의 제약상 허용되는 염 또는 이들의 혼합물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 폐 암종, 유방 암종, 난소 암종, 피부 암종, 결장 암종, 방광 암종, 간 암종, 위 암종, 전립선암, 신장 세포 암종, 비인두 암종, 편평 세포 암종, 갑상선 유두 암종, 자궁경부 암종, 소세포 폐 암종 (SCLC), 비-소세포 폐 암종, 췌장암, 뇌암, 두경부 편평 세포암 및 육종으로 구성된 군에서 선택된 고형 종양 또는 혈액계 암에서 선택된 증식성 질병의 치료 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 종양은 다약제 내성 종양 또는 상승된 수준의 P-당단백질 (P-gp)을 발현하는 종양이다.

추가 실시양태에서, 고형 종양이 유방 암종인 방법이 제공된다. 추가 실시양태에서, 유방 암종은 전이성 유방 암종이다.

별법의 실시양태에서, 고형 종양은 위 암종이다. 추가 실시양태에서, 고형 종양은 전립선암이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 화학식 II의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 다약제 내성 암인 고형 종양 또는 혈액계 암에서 선택된 증식성 질병의 치료 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 혈액계 악성종양은 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 다발성 골수종 (MM), 비-호지킨 림프종 (NHL) 및 호지킨 림프종 (HL)에서 선택된다. 특정 실시양태에서, 악성종양은 다약제 내성 악성종양 또는 상승된 수준의 P-당단백질 (P-gp)을 발현하는 악성종양이다.

추가 실시양태에서, 포유동물에게 치료 유효량의 화학식 II의 화합물, 상기 화합물의 호변이성질체, 상기 화합물의 제약상 허용되는 염, 상기 호변이성질체의 제약상 허용되는 염 또는 이들의 혼합물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 고형 종양, 또는 호지킨 림프종 (HL), 비-호지킨 림프종 (NHL), 백혈병, 골수성 백혈병, 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 골수이형성 증후군 (MDS), 모발상 세포 백혈병 및 다발성 골수종으로 구성된 군에서 선택된 혈액계 암에서 선택된 증식성 질병의 치료 방법이 제공된다.

추가 실시양태에서, 상기 혈액계 암이 급성 골수성 백혈병인 방법이 제공된다. 별법의 실시양태에서, 혈액계 암은 다발성 골수종이다.

다른 실시양태에서, 포유동물에게 일정량의 화학식 I 또는 화학식 II의 KSP 억제제를 투여하는 것을 포함하고, 제2 항암 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 상기 포유동물에서 고형 종양 또는 혈액계 암에서 선택된 증식성 질병의 치료 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 제2 항암 치료제는 화학식 I 또는 화학식 II의 KSP 억제제에 의한 치료 전에, 이와 함께 또는 그 후에 제공된다.

제2 항암 치료제는 이리노테칸, 토포테칸, 젬시타빈, 이매티닙, 트라스투주맙, 5-플루오로우라실, 류코보린, 카르보플라틴, 시스플라틴, 도세탁셀, 파클리탁셀, 테자시타빈, 시클로포스파미드, 빈카 알칼로이드, 안트라사이클린, 리툭시맙 및 닐로티닙에서 선택될 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 제2 화합물은 Bcr-Abl 억제제이다.

특정 실시양태에서, Bcr-Abl 억제제는 이매티닙 및 닐로티닙의 군에서 선택된다.

또 다른 추가 실시양태에서, KSP 억제제는

R¹이 C1-C6 알킬 또는 시클로알킬이고/거나;

R²가 H 또는 C1-C4 알킬이고/거나;

R⁶이 임의로 치환된 아릴기이고/거나;

R^a가 임의로 치환된 벤질 또는 아릴메틸 기이고/거나;

R^c가 -X-A이며, 여기서 -X는 -C(O)-이고, A는 아미노, 할로, 히드록시, 알콕시, 시아노, 치환된 아미노 또는 S(O)₂R⁹ (여기서, R⁹는 C1-C4 알킬임)에서 선택된 4개 이하의 기로 치환될 수 있는 알킬인 화학식 I의 화합물이다.

본 발명은 화학식 II의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

<화학식 II>

상기 식에서,

R^2c는 수소 또는 메틸이고;

R²²는 C1-C4 할로알킬이고;

p는 1 내지 3의 정수이고;

q는 1 내지 3의 정수이다.

한 실시양태에서, R²²는 플루오로메틸이다.

다른 실시양태에서, p는 2이다.

추가 실시양태에서, q는 1이다.

다른 실시양태에서, R^2c 및 R¹⁵는 각각 H이다.

추가 실시양태에서, R¹⁷ 및 R¹⁸은 각각 할로이다.

또 다른 실시양태에서, R¹⁹, R²⁰ 및 R²¹은 각각 H이다.

추가 실시양태에서, R¹⁹는 H이다.

다른 실시양태에서, R¹⁹는 임의로 치환된 C1-C10 아실이다.

몇몇 실시양태에서, 화합물은 R²², p, q, R^2c 및 R¹⁷ 내지 R²¹에 대해 상기 기재된 구조적 특징 중 2개 이상을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 화합물은 이들 구조적 특징 중 3개 이상을 포함한다. 이들 화합물의 몇몇 바람직한 실시양태에서, R²²는 플루오로메틸이고, p는 2이고, q는 1이고, R^2c 및 R¹⁵는 각각 H이다. 몇몇 이러한 실시양태에서, R¹⁷ 및 R¹⁸은 각각 F를 나타낸다. 이들 바람직한 실시양태 중 몇몇에서, R¹⁹, R²⁰ 및 R²¹은 각각 H이다. 바람직하게는, 이들 실시양태에서, R^1c는 에틸, 이소프로필 및 t-부틸에서 선택된다.

본 발명은 또한 화학식 IIa의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

<화학식 IIa>

본 발명은 또한 화학식 IIb의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

<화학식 IIb>

본 발명은 또한 화학식 IIc의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

<화학식 IIc>

(S)-N-((S)-3-아미노-4-플루오로부틸)-N-((R)-1-(1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-이미다졸-2-일)-2,2-디메틸프로필)-2-히드록시프로판아미드

한 실시양태에서, 본 발명은 포유동물에게 치료 유효량의 화학식 II, IIa, IIb 또는 IIc의 화합물 중 어느 하나의 화합물, 이들 화합물 중 어느 하나의 호변이성질체, 이들 화합물 중 어느 하나의 제약상 허용되는 염, 상기 호변이성질체의 제약상 허용되는 염 또는 이들의 혼합물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 고형 종양 또는 혈액계 암에서 선택된 증식성 질병의 치료 방법을 제공한다.

추가 실시양태에서, 고형 종양은 폐 암종, 유방 암종, 난소 암종, 피부 암종, 결장 암종, 방광 암종, 간 암종, 위 암종, 전립선암, 신장 세포 암종, 비인두 암종, 편평 세포 암종, 갑상선 유두 암종, 자궁경부 암종, 소세포 폐 암종 (SCLC), 비-소세포 폐 암종, 췌장암, 두경부 편평 세포암, 뇌암 및 육종으로 구성된 군에서 선택된다. 특정 실시양태에서, 고형 종양은 다른 암 약제에 대해 내성인 종양이다. 이는 약물 내성을 촉진하는 P-gp와 같은 유출 펌프를 발현하는 암, 또는 파클리탁셀 또는 SB-715992와 같은 약물에 의한 치료에 대해 내성을 나타낸 암일 수 있다. 유출 펌프, 특히 P-당단백질 (P-gp)의 암 세포에 의한 과다발현으로 인해 파클리탁셀과 같은 약물에 대해 내성인 암은 본원에 나타낸 바와 같은 화학식 II의 화합물에 대해 민감하나, 화학식 II의 화합물의 히드록실이 없는 유사한 화합물은 이들 약물 내성 종양에서 효과적이지 않을 수 있다. 화학식 IIa, IIb 및 IIc의 화합물은 P-gp를 발현하고 다른 치료제에 대해 내성을 나타내는 종양의 치료에 특히 유용하다. 이들 화합물은 약제-내성 종양을 치료하는 이러한 예상밖의 능력이 있으므로 이롭다. 약제-내성 종양에 대한 그의 활성은 화학식 II의 아미드 부분 상의 유리 히드록실과 관련된 것으로 여겨진다.

별법의 실시양태에서, 고형 종양은 위 암종이다.

다른 실시양태에서, 고형 종양은 전립선암이다.

각 이들 실시양태에서, 종양은 종종 다른 약물에 대해 내성인 종양이다. 몇몇 실시양태에서, 종양은 신장, 간, 결장, 뇌 또는 유방 암에서 선택된다. 특정 실시양태에서, 이는 상승된 수준의 P-gp를 발현하는 종양이다. P-gp의 이러한 상승된 발현은 자연적으로 또는 다른 약물에 의한 치료의 결과로서 발생할 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 포유동물에게 치료 유효량의 화학식 IIa, IIb 또는 IIc의 화합물 중 어느 하나의 화합물, 이들 화합물 중 어느 하나의 호변이성질체, 이들 화합물 중 어느 하나의 제약상 허용되는 염, 상기 호변이성질체의 제약상 허용되는 염 또는 이들의 혼합물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 고형 종양, 또는 호지킨 림프종 (HL), 비-호지킨 림프종 (NHL), 백혈병, 골수성 백혈병, 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 골수이형성 증후군 (MDS), 모발상 세포 백혈병 및 다발성 골수종으로 구성된 군에서 선택된 혈액계 암에서 선택된 증식성 질병의 치료 방법을 제공한다.

다른 실시양태에서, 혈액계 암은 급성 골수성 백혈병이다.

다른 실시양태에서, 혈액계 암은 다발성 골수종이다.

도 1. 혈액계 악성종양으로부터 유래된 세포주의 화합물 IIa에 대한 상대 민감도. 혈액계 악성종양 패널의 세포주의 셀타이터 글로(CellTiter Glo)® 검정을 기초로 한 상대 민감도는 전체 패널에 대한 Log(GI50) (GI50은 50％ 억제에서의 농도임) 값의 평균과 세포주 각각에 대한 Log(GI50) 값 간의 차이를 플롯팅함으로써 나타내고; 양의 값 (오른쪽 막대)은 평균보다 더 민감한 세포주를 나타내고, 음의 값 (왼쪽 막대)은 평균보다 덜 민감한 세포주를 나타낸다.
도 2. 화합물 IIa에 의해 처리된 SUDHL-4 및 RL 세포주에 대한 FACS에 의한 세포 단계 평가: 제1 컬럼은 처리되지 않은 세포를 나타내고, 제2 컬럼은 화합물 IIa에 의한 처리 24시간 후 세포를 나타내고, 제3 컬럼은 화합물 IIa에 의한 처리 48시간 후 세포를 나타낸다.
도 3. 화합물 IIa가 AML 환자로부터의 AML 모세포에 대해 세포독성인 것을 나타내는 데이터. 패널 A는 투여량 함수로서 생존율％를 나타낸다. 패널 B는 성장 시간 2주후 세포 배양을 나타낸다. 패널 C는 화합물 IIa의 효과를 파클리탁셀의 효과와 비교하여 <2N, 2N 또는 4N 단계의 세포의 백분율을 나타낸다.
도 4. MV4;11 피하 종양 이종이식편 모델에서 q4d x 3 용량 스케쥴로 투여된 화합물 IIa의 효능. 암컷 무흉선 nu/nu 마우스에서 마우스 각각의 우측 측복부로의 1:1 비율의 HBSS 및 마트리겔™ 0.2 mL 중 10⁷개 세포의 피하 주사에 의해 MV4;11 종양을 확립하였다. 종양이 250 ㎣에 도달하였을 때, 세포 이식 대략 24일 후, 마우스를 종양 부피에 따라 처리군 (n=9)으로 무작위화하였다. 동물에게 정맥내로 비히클 (캡티솔(Captisol)®), 화합물 IIa 또는 SB-715992 (이스피네십, 임상 시험 중인 사이토키네틱스에 의한 KSP 억제제)를 투여하였다. 모두에게 q4d x 3 스케쥴로 투여하였다. (A) 무작위화후 일수에 대한 처리군의 효능/종양 부피; (B) 무작위화 일자에 초기 체중에 대한 체중 변화 백분율.
도 5. KB8.5 종양 이종이식편 모델에서 q4d x 3 용량 스케쥴로 투여된 화합물 IIa의 효능. 암컷 무흉선 nu/nu 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories))에서 마우스 각각의 우측 측복부로의 1:1 비율의 HBSS 및 마트리겔™ 0.2 mL 중 5 x 10⁶개 세포의 피하 주사에 의해 KB8.5 종양을 확립하였다. 종양이 대략 300 ㎣에 도달하였을 때, 세포 이식 대략 10일 후, 마우스를 종양 부피에 따라 처리군 (n=9/군)으로 무작위화하였다. 동물에게 정맥내로 화합물 IIa 또는 SB-715992를 투여하였다. 파클리탁셀을 30 mg/kg으로 i.p. 투여하였다. 모두에게 q4d x 3 스케쥴로 투여하였다. (왼쪽) 투여 개시후 일수에 대한 처리군의 효능/종양 부피; (오른쪽) 무작위화/투여 개시 일자에 초기 체중에 대한 체중 변화 백분율. *p < 0.05로 비히클 및 SB-715992과 비교하였다 (ANOVA/던(Dunn) 방법).
도 6. KB8.5 종양 이종이식편 모델에서 q4d x 3 용량 스케쥴로 투여된 화합물 IIc의 효능. 암컷 무흉선 nu/nu 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈)에서 마우스 각각의 우측 측복부로의 1:1 비율의 HBSS 및 마트리겔™ 0.2 mL 중 5 x 10⁶개 세포의 피하 주사에 의해 KB8.5 종양을 확립하였다. 종양이 평균 339 ㎣에 도달하였을 때, 마우스를 종양 부피를 기준으로 처리군 (n=9)으로 무작위화하였다. 동물에게 정맥내로 화합물 IIc 또는 SB-715992를 투여하였다. 파클리탁셀을 30 mg/kg으로 i.p. 투여하였다. 모두에게 q4d x 3 스케쥴로 투여하였다. (왼쪽) 투여 개시후 일수에 대한 처리군의 효능/종양 부피; (오른쪽) 무작위화/투여 개시 일자에 초기 체중에 대한 체중 변화 백분율. 1.25 mg/kg의 화합물 IIc는 11째일에 비히클 군과 통계적으로 상이하였다 (*p < 0.05, ANOVA/투키(Tukey) 시험).
도 7. KB8.5 종양 이종이식편 모델에서 q4d x 3 용량 스케쥴로 투여된 화합물 Ia의 효능. 암컷 무흉선 nu/nu 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈)에서 마우스 각각의 우측 측복부로의 1:1 비율의 HBSS 및 마트리겔™ 0.2 mL 중 5 x 10⁶개 세포의 피하 주사에 의해 KB8.5 종양을 확립하였다. 종양이 평균 285 ㎣에 도달하였을 때, 마우스를 종양 부피를 기준으로 처리군 (n=10)으로 무작위화하였다. 동물에게 정맥내로 화합물 Ia 또는 SB-715992를 투여하였다. 파클리탁셀을 30 mg/kg으로 i.p. 투여하였다. 모두에게 q4d x 3 스케쥴로 투여하였다. (왼쪽) 투여 개시후 일수에 대한 처리군의 효능/종양 부피; (오른쪽) 무작위화/투여 개시 일자에 초기 체중에 대한 체중 변화 백분율. 비히클 군과 통계적으로 상이한 군은 없었다 (순위에 대한 ANOVA).

A. 정의 및 개괄

본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시양태를 기술하기 위한 것이지 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아니라는 점을 이해하여야 한다. 본원 및 청구 범위에서 사용된 것과 같은 단수 형태인 "a," "an" 및 "the"는 문맥상 분명하게 다르게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상도 포함한다는 것을 주목해야 한다. 본 명세서 및 하기 청구 범위에서, 다음 의미를 갖는 것으로 정의될 수 있는 수많은 용어들을 언급할 것이다:

본원에서 사용되는 "알킬"은 1 내지 10개의 탄소 원자 및 보다 바람직하게는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 1가 포화 지방족 직쇄, 분지된 또는 시클릭 히드로카르빌 기를 지칭한다. 상기 용어의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, 이소-부틸, n-부틸, t-부틸, n-펜틸 등과 같은 기를 들 수 있다.

용어 "선형 알킬"은 분지되지 않은 알킬기를 지칭한다.

"치환된 알킬"은 1개 이상의 치환기, 종종 1 내지 4개, 및 바람직하게는 1 내지 2개의 치환기를 갖는 알킬기를 지칭한다. 알킬기를 위한 적합한 치환기는 치환된 또는 비치환된 알콕시, 치환된 또는 비치환된 아실, 치환된 또는 비치환된 아실아미노, 치환된 또는 비치환된 아실옥시, 치환된 또는 비치환된 아미노, 치환된 또는 비치환된 아미노아실, 아릴, 치환된 아릴, 아릴옥시, 치환된 아릴옥시, 시아노, 할로겐, 히드록실, 니트로, 카르복실, 옥소, 히드록시-이미노, 치환된 또는 비치환된 알콕시-이미노 카르복실 C1-C4 에스테르, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 스피로시클로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭, 치환된 헤테로시클릭, -SO₂-알킬, -SO₂-치환된 알킬로 구성된 군에서 선택되며, 여기서 상기 치환기는 본원에서 정의된다. 알킬기를 위한 바람직한 치환기에는 알콕시, 히드록시, 할로 (바람직하게는 F 또는 Cl임), 시아노, 옥소, 치환된 또는 비치환된 아미노, 치환된 또는 비치환된 아실옥시 및 치환된 또는 비치환된 아실아미노가 포함된다.

용어 "할로알킬"은 1개 이상의 수소 원자가 할로겐 원자로 대체된 알킬기를 지칭한다. 한 실시양태에서, 상기 용어는 플루오로메틸, 디플루오로메틸 또는 트리플루오로메틸 등을 지칭한다.

용어 "히드록시알킬"은 1개 이상의 수소 원자가 히드록시기로 대체된 알킬기를 지칭한다. 한 실시양태에서, 상기 용어는 히드록시메틸, 1- 또는 2-히드록시에틸, 1-, 2- 또는 3-히드록시프로필 등을 지칭한다.

"알킬렌"은 직쇄 또는 분지된, 바람직하게는 1 내지 5개, 및 보다 바람직하게는 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는 2가 포화 지방족 히드로카르빌 기를 지칭한다. 상기 용어의 예로는 메틸렌 (-CH₂-), 에틸렌 (-CH₂CH₂-), n-프로필렌 (-CH₂CH₂CH₂-), 이소-프로필렌 (-CH₂CH(CH₃)-) 등을 들 수 있다. "치환된 알킬렌"은 알킬기를 위한 적합한 치환기에서 선택된 1개 이상의 치환기, 바람직하게는 1 내지 4개, 및 보다 바람직하게는 1 내지 2개의 치환기를 갖는 알킬렌기를 지칭한다.

"알콕시"는 예로서 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소-프로폭시, n-부톡시, t-부톡시, sec-부톡시, n-펜톡시 등을 포함하는 "알킬-O-" 기를 지칭한다.

"치환된 알콕시"는 "치환된 알킬-O-" 기를 지칭한다.

"아실"은 H-C(O)-, 알킬-C(O)-, 치환된 알킬-C(O)-, 알케닐-C(O)-, 치환된 알케닐-C(O)-, 알키닐-C(O)-, 치환된 알키닐-C(O)-, 시클로알킬-C(O)-, 치환된 시클로알킬-C(O)-, 아릴-C(O)-, 치환된 아릴-C(O)-, 헤테로아릴-C(O)-, 치환된 헤테로아릴-C(O)-, 헤테로시클릭-C(O)- 및 치환된 헤테로시클릭-C(O)- 기를 지칭하며, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에서 정의된 바와 같다.

"아미노아실"은 -C(O)NRR 기를 지칭하고, 여기서 R은 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭으로 구성된 군에서 선택되고, 2개의 R 기는 이에 부착된 질소 원자와 함께 결합하여 헤테로시클릭 또는 치환된 헤테로시클릭 고리를 형성할 수 있고; 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에서 정의된 바와 같다. 2개의 R 기가 결합하여 고리를 형성하는 경우, 종종 이는 R 기 상에 존재할 수 있는 치환기에 따라 허용되는 바와 같이 임의로 치환된 5원 내지 6원 고리이고; 종종 이는 피롤리딘, 피페리딘, 모르폴린, 티오모르폴린 및 피페라진에서 선택된다.

"아실옥시"는 알킬-C(O)O-, 치환된 알킬-C(O)O-, 알케닐-C(O)O-, 치환된 알케닐-C(O)O-, 알키닐-C(O)O-, 치환된 알키닐-C(O)O-, 아릴-C(O)O-, 치환된 아릴-C(O)O-, 시클로알킬-C(O)O-, 치환된 시클로알킬-C(O)O-, 헤테로아릴-C(O)O-, 치환된 헤테로아릴-C(O)O-, 헤테로시클릭-C(O)O- 및 치환된 헤테로시클릭 -C(O)O- 기를 지칭하며, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에서 정의된 바와 같다.

"옥시아실" 또는 "카르복실 에스테르"는 -C(O)O-알킬, 치환된 -C(O)O-알킬, -C(O)O-알케닐, -C(O)O-치환된 알케닐, -C(O)O-알키닐, -C(O)O-치환된 알키닐, -C(O)O-아릴, -C(O)O-치환된 아릴, -C(O)O-시클로알킬, -C(O)O-치환된 시클로알킬, -C(O)O-헤테로아릴, -C(O)O-치환된 헤테로아릴, -C(O)O-헤테로시클릭 및 -C(O)O-치환된 헤테로시클릭 기를 지칭하며, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에서 정의된 바와 같다.

"알케닐"은 2 내지 6개의 탄소 원자, 및 바람직하게는 2 내지 4개의 탄소 원자를 갖고, 1개 이상, 및 바람직하게는 1 내지 2개의 알케닐 불포화 부위를 갖는 알케닐기를 지칭한다. 이러한 기의 예로는 비닐, 알릴, 부트-3-엔-1-일 등을 들 수 있다.

"치환된 알케닐"은 1개 이상, 바람직하게는 1 내지 4개의 치환기, 및 보다 바람직하게는 1 내지 2개의 치환기를 갖는 알케닐기를 지칭한다. 적합한 치환기에는 본원에서 알킬기에 대해 기재된 것들이 포함된다.

"알키닐"은 2 내지 6개의 탄소 원자, 및 바람직하게는 2 내지 3개의 탄소 원자를 갖고, 1개 이상, 및 바람직하게는 1 내지 2개의 알키닐 불포화 부위를 갖는 알키닐기를 지칭한다.

"치환된 알키닐"은 1개 이상, 바람직하게는 1 내지 4개의 치환기, 및 보다 바람직하게는 1 내지 2개의 치환기를 갖는 알키닐기를 지칭한다. 적합한 치환기에는 본원에서 알킬기에 대해 치환기로서 기재된 것들이 포함된다. "시아노"는 -CN 기를 지칭한다.

"아미노"는 -NH₂ 기를 지칭한다.

"치환된 아미노"는 -NR'R" 기를 지칭하며, 여기서 R' 및 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭, 치환된 헤테로시클릭, -SO₂-알킬, -SO₂-치환된 알킬로 구성된 군에서 선택되고, R' 및 R"가 모두 수소가 아닌 경우 R' 및 R"는 임의로 이에 결합된 질소와 함께 결합하여 헤테로시클릭 또는 치환된 헤테로시클릭 기를 형성한다. R'가 수소이고 R"가 알킬인 경우, 치환된 아미노기는 본원에서 종종 알킬아미노라고 지칭된다. R' 및 R"가 알킬인 경우, 치환된 아미노기는 본원에서 종종 디알킬아미노라고 지칭된다. 일치환된 아미노를 지칭하는 경우, 이는 R' 또는 R"가 수소이나, 둘 다 수소는 아닌 것을 의미한다. 이치환된 아미노를 지칭하는 경우, 이는 R' 또는 R"가 둘 다 수소가 아닌 것을 의미한다.

"아실아미노"는 -NRC(O)알킬, -NRC(O)치환된 알킬, -NRC(O)시클로알킬, -NRC(O)치환된 시클로알킬, -NRC(O)알케닐, -NRC(O)치환된 알케닐, -NRC(O)알키닐, -NRC(O)치환된 알키닐, -NRC(O)아릴, -NRC(O)치환된 아릴, -NRC(O)헤테로아릴, -NRC(O)치환된 헤테로아릴, -NRC(O)헤테로시클릭 및 -NRC(O)치환된 헤테로시클릭 기를 지칭하며, 여기서 R은 수소 또는 알킬이고, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에서 정의된 바와 같다.

"니트로"는 -NO₂ 기를 지칭한다.

"시아노"는 -CN 기를 지칭한다.

"아릴" 또는 "Ar"은 단일 고리 (예를 들어, 페닐) 또는 다중 축합 고리 (예를 들어, 나프틸 또는 안트릴)를 갖는 6 내지 14개의 탄소 원자의 1가 방향족 카르보시클릭 기를 지칭하며, 여기서 축합 고리는 부착 지점이 방향족 탄소 원자에 존재하는 한 방향족 (예를 들어, 2-벤족사졸리논, 2H-1,4-벤족사진-3(4H)-온-7-일 등)일 수 있거나 방향족이 아닐 수 있다. 바람직한 아릴에는 페닐 및 나프틸이 포함된다.

"치환된 아릴"은 1개 이상, 바람직하게는 1 내지 3개의 치환기, 및 보다 바람직하게는 1 내지 2개의 치환기에 의해 치환된 아릴기를 지칭한다. 적합한 치환기에는 히드록시, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아릴, 치환된 아릴, 아릴옥시, 치환된 아릴옥시, 카르복실, 카르복실 에스테르, 시아노, 티올, 알킬티오, 치환된 알킬티오, 아릴티오, 치환된 아릴티오, 헤테로아릴티오, 치환된 헤테로아릴티오, 시클로알킬티오, 치환된 시클로알킬티오, 헤테로시클릭티오, 치환된 헤테로시클릭티오, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 할로, 니트로, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭, 치환된 헤테로시클릭, 헤테로아릴옥시, 치환된 헤테로아릴옥시, 헤테로시클릴옥시, 치환된 헤테로시클릴옥시, 아미노 술포닐 (NH₂-SO₂-) 및 치환된 아미노 술포닐이 포함된다.

"아릴옥시"는 예로서, 페녹시, 나프톡시 등을 포함하는 아릴-O- 기를 지칭한다.

"치환된 아릴옥시"은 치환된 아릴-O- 기를 지칭한다.

"벤질"은 -CH₂-페닐 기를 지칭한다.

"아릴메틸"은 -CH₂-아릴 기를 지칭한다.

"카르복실"은 -COOH 또는 그의 염을 지칭한다.

"카르복실 에스테르"는 화학식 -COOR (여기서, R은 치환된 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬임)을 갖는 기를 지칭한다. 종종, R은 임의로 치환된 C1-C4 알킬기, 예컨대 메틸, 에틸, 이소프로필 또는 메톡시에틸이다.

"시클로알킬"은 예로서, 아다만틸, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로옥틸 등을 포함하는, 단일 또는 다중 시클릭 고리를 갖는 3 내지 10개의 탄소 원자의 시클릭 알킬기를 지칭한다.

"스피로시클로알킬"은 하기 구조에 의해 예시되는 스피로 결합 (고리의 유일한 공통 구성원인 단일 원자에 의해 형성된 결합)을 갖는 시클로알킬 고리를 갖는 3 내지 10개의 탄소 원자의 시클릭 기를 지칭하며, 여기서, 2개의 개방 원자가는 함께 연결되어 고리를 형성한다:

"치환된 시클로알킬"은 알킬, 치환된 알킬, 옥소 (=O), 티옥소 (=S), 알콕시, 치환된 알콕시, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아릴, 치환된 아릴, 아릴옥시, 치환된 아릴옥시, 시아노, 할로겐, 히드록실, 니트로, 카르복실, 카르복실 에스테르, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭으로 구성된 군에서 선택된 1 내지 5개의 치환기를 갖는 시클로알킬기를 지칭한다.

"할로" 또는 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도를 지칭하고, 바람직하게는 플루오로 또는 클로로이다.

"히드록시"는 -OH 기를 지칭한다.

"옥소"는 =O 기를 지칭한다.

"헤테로아릴"은 고리 구성원으로서 산소, 질소 및 황으로 구성된 군에서 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함하는 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 방향족 기를 지칭한다. 이러한 헤테로아릴기는 단일 고리 (예를 들어, 피리디닐 또는 푸릴) 또는 다중 축합 고리 (예를 들어, 인돌리지닐 또는 벤조티에닐)를 가질 수 있고, 여기서 상기 축합 고리는 부착 지점이 방향족 헤테로아릴기의 원자를 통한 경우 방향족이거나 또는 아닐 수 있고/거나 헤테로원자를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 한 실시양태에서, 헤테로아릴기의 질소 및/또는 황 고리 원자(들)는 임의로 산화되어 N-옥시드 (N→O), 술피닐 또는 술포닐 부분을 제공한다. 바람직한 헤테로아릴에는 피리디닐, 피롤릴, 인돌릴, 티오페닐, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 이미다졸릴, 트리아졸릴 및 푸라닐이 포함된다.

"치환된 헤테로아릴"은 치환된 아릴에 대해 정의된 동일한 치환기의 군에서 선택된 1 내지 3개의 치환기, 바람직하게는 1 또는 2개의 치환기로 치환된 헤테로아릴기를 지칭한다.

"질소-함유 헤테로아릴" 및 "질소-함유 치환된 헤테로아릴"은 1개 이상의 질소 고리 원자를 포함하고 임의로 고리 구성원으로서 다른 헤테로원자, 예컨대 황, 질소 또는 산소 등을 포함하는 헤테로아릴기 및 치환된 헤테로아릴기를 지칭한다.

"헤테로아릴옥시"는 -O-헤테로아릴 기를 지칭하고, "치환된 헤테로아릴옥시"는 -O-치환된 헤테로아릴 기를 지칭하며, 여기서 헤테로아릴 및 치환된 헤테로아릴은 본원에서 정의된 바와 같다.

"헤테로사이클" 또는 "헤테로시클릭" 또는 "헤테로시클로알킬" 또는 "헤테로시클릴"은 고리 구성원으로서 질소, 황 및 산소로 구성된 군에서 선택된 1 내지 4개의 헤테로 원자를 포함하는 3 내지 10개의 고리 원자의 단일 고리 또는 다중 축합 고리 (융합된 가교 및 스피로 고리계 포함)를 갖는 포화 또는 불포화 기를 지칭하고; 부착 지점이 헤테로시클릭 고리를 통한 경우 융합된 고리계 중 하나 이상의 고리는 시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴일 수 있다. 한 실시양태에서, 헤테로시클릭 기의 질소 및/또는 황 원자(들)는 임의로 산화되어 N-옥시드, 술피닐, 술포닐 부분을 제공한다.

"치환된 헤테로시클릭" 또는 "치환된 헤테로시클로알킬" 또는 "치환된 헤테로시클릴"은 본원에 기재된 치환기에서 선택된 1개 이상, 및 바람직하게는 1 내지 3개의 치환기로 치환된 헤테로시클릴 기를 지칭한다. 적합한 치환기에는 알킬 및 시클로알킬 기에 대해 본원에 기재된 것들이 포함된다.

헤테로시클릴 및 헤테로아릴의 예로는 아제티딘, 피롤, 이미다졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리미딘, 피리다진, 인돌리진, 이소인돌, 인돌, 디히드로인돌, 인다졸, 퓨린, 퀴놀리진, 이소퀴놀린, 퀴놀린, 프탈라진, 나프틸피리딘, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 시놀린, 프테리딘, 카르바졸, 카르볼린, 페난트리딘, 아크리딘, 페난트롤린, 이소티아졸, 페나진, 이속사졸, 페녹사진, 페노티아진, 이미다졸리딘, 이미다졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌린, 프탈이미드, 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린, 4,5,6,7-테트라히드로벤조[b]티오펜, 티아졸, 티아졸리딘, 티오펜, 벤조[b]티오펜, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐 (티아모르폴리닐이라고도 지칭됨), 1,1-디옥소티오모르폴리닐, 피페리디닐, 피롤리딘, 테트라히드로푸라닐 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

"질소-함유 헤테로시클릭" 및 "질소-함유 치환된 헤테로시클릭"은 1개 이상의 질소 고리 원자를 포함하고 및 임의로 고리 원자로서 황, 산소 등에서 선택된 다른 헤테로원자를 포함하는 헤테로시클릭 기 및 치환된 헤테로시클릭 기를 지칭한다.

"티올"은 -SH 기를 지칭한다.

"알킬티오" 또는 "티오알콕시"는 -S-알킬 기를 지칭한다.

"치환된 알킬티오" 또는 "치환된 티오알콕시"는 -S-치환된 알킬 기를 지칭한다.

"아릴티오"는 -S-아릴 기를 지칭하고, 여기서 아릴은 상기 정의되어 있다.

"치환된 아릴티오"는 -S-치환된 아릴 기를 지칭하며, 여기서 치환된 아릴은 상기 정의되어 있다.

"헤테로아릴티오"는 -S-헤테로아릴 기를 지칭하며, 여기서 헤테로아릴은 상기 정의된 바와 같다.

"치환된 헤테로아릴티오"는 -S-치환된 헤테로아릴 기를 지칭하며, 여기서 치환된 헤테로아릴은 상기 정의되어 있다.

"헤테로시클릭티오"는 -S-헤테로시클릭 기를 지칭하고, "치환된 헤테로시클릭티오"는 -S-치환된 헤테로시클릭 기를 지칭하며, 여기서 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭은 상기 정의된 바와 같다.

"헤테로시클릴옥시"는 헤테로시클릴-O- 기를 지칭하고, "치환된 헤테로시클릴옥시"는 치환된 헤테로시클릴-O- 기를 지칭하며, 여기서 헤테로시클릴 및 치환된 헤테로시클릴은 상기 정의된 바와 같다.

"시클로알킬티오"는 -S-시클로알킬 기를 지칭하고, "치환된 시클로알킬티오"는 -S-치환된 시클로알킬 기를 지칭하며, 여기서 시클로알킬 및 치환된 시클로알킬은 상기 정의된 바와 같다.

본원에서 사용되는 "생물학적 활성"은 실시예 1 내지 13에 약술된 하나 이상의 검정으로 시험하는 경우 억제 농도를 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "제약상 허용되는 염"은 화학식 I 및 II의 화합물의 비독성 산 또는 알칼리 토금속 염을 지칭한다. 이들 염은 화학식 I 및 II의 화합물의 최종 단리 및 정제 중 계내에서 제조될 수 있거나, 또는 별도로 염기 또는 산 관능기를 적합한 유기산 또는 유기염기 또는 무기산 또는 무기염기와 각각 반응시켜 제조될 수 있다. 대표적인 제약상 허용되는 염에는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, 바이술페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포술포네이트, 디글루코네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 도데실술포네이트, 에탄술포네이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미-술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 푸마레이트, 히푸레이트, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로요오다이드, 2-히드록시에탄술포네이트, 락테이트, 말레에이트, 메탄술포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발로에이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 술페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔술포네이트 및 운데카노에이트가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 또한, 염기성 질소-함유 기는 알킬 할로겐화물, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드; 디알킬 술페이트, 예컨대 디메틸, 디에틸, 디부틸 및 디아밀 술페이트, 장쇄 할로겐화물, 예컨대 데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드; 아릴알킬 할로겐화물, 예컨대 벤질 및 페네틸 브로마이드 등과 같은 작용제로 사차화될 수 있다. 이에 의해, 수용성 또는 지용성 또는 수분산성 또는 지분산성 생성물을 수득한다.

제약상 허용되는 산 부가염을 형성하는데 사용될 수 있는 산의 예로는 무기산, 예컨대 염산, 황산 및 인산, 및 유기산, 예컨대 아세트산, 히푸르산, 락트산, 옥살산, 말레산, 메탄술폰산, 숙신산 및 시트르산이 포함된다. 염기 부가염은 화학식 I 및 II의 화합물의 최종 단리 및 정제 중 계내에서 제조될 수 있거나, 또는 별도로 카르복실산 부분을 적합한 염기, 예컨대 제약상 허용되는 금속 양이온의 수산화물, 탄산염 또는 중탄산염과, 또는 암모니아 또는 일차, 이차 또는 삼차 유기 아민과 반응시켜 제조될 수 있다. 제약상 허용되는 염에는 알칼리 금속 및 알칼리 토금속, 예컨대 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 알루미늄 염 등을 기재로 하는 양이온, 뿐만 아니라 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 에틸아민 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 암모늄, 사차 암모늄 및 아민 양이온이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 염기 부가염의 형성에 유용한 다른 대표적인 유기 아민에는 디에틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진 등이 포함된다.

본원에서 사용되는 용어 "제약상 허용되는 에스테르"는 생체내에서 가수분해하는 에스테르를 지칭하고, 인간 체내에서 분해하여 모 화합물 또는 그의 염을 남기는 에스테르를 포함한다. 적합한 에스테르 기는 예를 들어 제약상 허용되는 지방족 카르복실산, 특히 알칸산, 알켄산, 시클로알칸산 및 알칸디산으로부터 유도되는 에스테르를 포함하고, 여기서 각각의 알킬 또는 알케닐 부분은 유리하게는 6개 이하의 탄소 원자를 갖는다. 특정 에스테르의 대표적인 예로는 포르메이트, 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 아크릴레이트 및 에틸숙시네이트가 포함되나 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는 용어 "제약상 허용되는 전구약물"은 합리적인 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 인간 및 저급 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하고, 그의 의도된 용도에 효과적인 본 발명의 화합물 뿐만 아니라 가능한 경우 본 발명의 화합물의 양쪽이온 형태의 전구약물을 지칭한다. 용어 "전구약물"은 생체내에서 빠르게 변환하여, 예를 들어 혈액 내에서 가수분해에 의해 상기 화학식의 모 화합물을 제공하는 화합물을 지칭한다. 문헌 [T. Higuchi and V. Stella, PRO-DRUGS AS NOVEL DELIVERY SYSTEMS, Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series] 및 [Edward B. Roche, ed., BIOREVERSIBLE CARRIERS IN DRUG DESIGN, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987]에 논의가 제공되어 있으며, 두 문헌 모두 본원에 참고로 도입된다.

본원에서 사용되는 "항암제" 또는 "암 치료를 위한 작용제" 또는 "암 치료제"는 단지 예로서 세포 사멸을 유발하는 작용제; 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 리보자임); 폴리펩티드 (예를 들어, 효소); 약물; 생물학적 모방체; 알칼로이드; 알킬화제; 항종양 항생제; 항대사물; 호르몬; 백금 화합물; 모노클로날 항체; 항암 약물, 독소 및/또는 방사성 핵종과 접합된 모노클로날 항체; 생물학적 반응 변경제 (예를 들어, 인터페론 및 인터류킨 등); 입양 면역요법제; 조혈 성장 인자; 종양 세포 분화를 유도하는 작용제 (예를 들어, 올-트랜스-레티노산 등); 유전자요법 시약; 안티센스 요법 시약 및 뉴클레오티드; 종양 백신; 혈관신생 억제제 등을 포함하는 작용제를 지칭한다. 기타 수많은 작용제들이 당업자의 영역 내에 있다.

상기 정의된 모든 치환된 기에서, 추가 치환기를 갖는 치환기를 그 자신으로 지정하여 생성된 중합체 (예를 들어, 그 자체가 치환된 아릴기로 치환된 치환기로서 치환된 아릴기를 갖는 치환된 아릴 등)는 본원에 포함되지 않는 것으로 이해된다. 이러한 경우에, 상기 치환기의 최대 개수는 3개이다. 다시 말해서, 상기 정의는 각각 한정되는데, 예를 들어 '치환된 아릴' 기는 -치환된 아릴-(치환된 아릴)-치환된 아릴로 제한된다.

유사하게, 상기 정의는 허용되지 않는 치환 패턴 (예를 들어, 5개의 플루오로기로 치환된 메틸, 또는 에테닐계 또는 아세틸렌계 불포화 상의 히드록시기, 또는 페닐 고리에 있는 옥소와 같은 2가 기)을 포함하지 않는 것으로 이해된다. 상기 허용되지 않는 치환 패턴은 당업자에게 익히 공지되어 있다.

본 발명의 화합물은 화합물 내에 하나 이상의 비대칭 또는 키랄 중심이 존재하는 덕분에 입체이성질체현상을 나타낼 수 있다. 본 발명은 다양한 입체이성질체 각각 및 이들의 혼합물을 고려한다. 본 발명의 특정 화합물은 비대칭으로 치환된 탄소 원자를 포함한다. 이러한 비대칭으로 치환된 탄소 원자로 인해 본 발명의 화합물은 비대칭으로 치환된 특정 탄소 원자에서의 입체이성질체들의 혼합물 또는 단일 입체이성질체를 포함할 수 있게 된다. 결과적으로, 본 발명의 화합물의 라세미 혼합물, 부분입체이성질체의 혼합물, 단일 거울상이성질체 뿐만 아니라 단일 부분입체이성질체가 본 발명에 포함된다. 본원에서 사용되는 용어 "S" 및 "R" 배위는 문헌 [IUPAC 1974 "RECOMMENDATIONS FOR SECTION E, FUNDAMENTAL STEREOCHEMISTRY", Pure Appl. Chem. 45:13-30, 1976]에 정의된 바와 같다. 원하는 거울상이성질체는 상업적으로 이용가능한 키랄 출발 물질로부터 당분야에 익히 공지된 방법에 의해 키랄 합성하여 수득될 수 있거나, 또는 공지된 기술을 사용하여 거울상이성질체의 혼합물로부터 원하는 거울상이성질체를 분리하여 수득될 수 있다. 화학식 II의 화합물의 몇몇 실시양태에서, 단일 이성질체는 화합물 내에 하나 이상의 입체중심에 대해 도시되고; 특정 입체중심의 단일 이성질체가 도시된 경우, 도시된 절대 상대 입체화학이 바람직한 실시양태이다. 특정 입체화학이 표시되지 않은 경우, 입체중심은 R 또는 S 배위일 수 있거나, 또는 둘의 임의의 혼합물, 예를 들어 라세미 혼합물일 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 기하 이성질체현상을 나타낼 수 있다. 기하 이성질체는 알케닐, 옥심, 이민 또는 알케닐에닐 부분과 같은 이중 결합을 갖는 시스 및 트랜스 형태의 본 발명의 화합물을 포함한다. 본 발명은 개별 기하 이성질체 및 입체이성질체 및 이들의 혼합물을 포함한다.

본 발명의 화합물은 당분야에 공지된 방법 및 본원에 추가로 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 화학식 I 및 화학식 II의 화합물의 제조 방법은 출원 공개 제PCT/US2005/022062호 (제WO 06/002236호) 및 상응하는 미국 특허 출원에 기재되어 있다. 화학식 II의 화합물의 제조에 적용가능한 추가 합성 방법의 예가 본원에 제공된다.

화학식 I 및/또는 화학식 II의 특정 KSP 억제제의 제조예는 하기 반응식 1에 나타낸다.

<반응식 1>

KI를 함유하는 아세톤에서 화합물 1.1 및 1.2를 K₂CO₃과 반응시켰다. K₂CO₃/아세톤의 사용은 K₂CO₃의 저렴한 비용 및 물 첨가시 아세톤 용액으로부터 침전되는 화합물 1.3 때문에 (1.3을 추출하기 위한 수성 후처리에 대한 필요성을 제거함) Cs₂CO₃/에탄올보다 우수한 것으로 밝혀졌다. 그 후, 케토 에스테르 1.3을 톨루엔 중 암모늄 아세테이트 (NH₄OAc)로 환류하여, 이미다졸 1.4를 얻었다. 톨루엔의 사용은 딘 스타크(Dean Stark) 트랩에 의한 크실렌 중 환류와 비교하여 이미다졸의 더 높은 수율을 제공하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 후자 방법이 반응 혼합물로부터 트랩으로 암모늄 아세테이트의 제거를 야기하기 때문이다. 디메틸포름아미드 중 벤질브로마이드 및 K₂CO₃과 1.4의 반응은 1.5를 제공하였으며, 이는 물 첨가시 반응 용액으로부터 침전할 수 있었다. 1.5를 메탄올 및 아세틸 클로라이드에 의해 처리하여, 1.6의 HCl 염을 얻었으며, 그 후 이는 NaOH/메탄올 용액으로 적정시 유리 염기로 전환되었다. 1.1 및 1.2로부터 1.6의 형성은 높은 순도 (>97％, HPLC에 의해 결정됨) 및 높은 광학 순도 (>99％ e.e.)와 함께 81％ 수율로 진행되는 것으로 밝혀졌다.

화합물 1.6을 환원성 아민화 조건 하에 알데히드 HC(O)R^b'와 또는 Y-R^b (여기서, Y는 이탈기임)와 반응시켜, 아민 질소 상에 알킬기를 도입할 수 있으며, 그 후 이를 아실화하여 화학식 I 또는 II의 화합물을 제공할 수 있다. 반응식 2는 화학식 I 및/또는 화학식 II의 화합물, 및 특히 화학식 IIa 또는 IIb 또는 IIc의 화합물을 제조하기 위한 환원성 아민화 단계에서 사용될 수 있는 알데히드의 제조를 예시한다.

<반응식 2>

환원성 아민화 후, 이차 아민을 아실화하기 위해 공지된 아실화제 및 조건을 사용하여, 화학식 I 또는 II의 화합물을 제공한다. 반응식 3은 VIIIa를 제공하기 위한 환원성 아민화를 예시한다. 아민의 아실화, 이어서 프탈이미드의 탈보호 및 유리 히드록실기 상의 보호기의 제거는 화합물 IIa를 제공한다. 히드록실을 위한 적합한 보호기에는 예를 들어 수소화분해에 의해 제거될 수 있는 벤질 에테르, 및 트리메틸실릴 요오다이드와 같은 시약에 의해 선택적으로 제거될 수 있는 알킬 카르보네이트가 포함된다. 화합물 IIa의 측정된 질량 (고분해능 질량 분석법에 의해 결정됨)은 [M+H]⁺ 이온에 대해 503.2609였으며, 이는 분자식 C₂₇H₃₃N₄O₂F₃과 일치한다.

<반응식 3>

이 화합물은 3500-2700 (br), 1641, 1591, 1508, 1491, 1162 및 1088 cm^-1에서 흡수 밴드를 갖는 IR 스펙트럼을 추가로 특징으로 한다. 이는 다음 nmr 데이터를 추가로 특징으로 한다:

*다중도: AB(AB 사중선), b(광폭), d(이중선), dd(이중 이중선), m(다중선), s(단일선), t(삼중선).

**¹⁹F -커플 다중선의 중간점 이동

이 분자 내의 키랄 중심의 절대 입체화학은 공지된 출발 물질 또는 중간체의 키랄성을 기준으로 확인된다는 것을 주목한다. HPLC 및 nmr 데이터는 상기 공정이 단일 이성질체로서 화합물을 제공한다는 결론을 지지한다.

동일한 방법을 사용하여, 공지된 키랄 알파-히드록시 아실화제의 사용에 의해 화합물 IIc를 제조하였다. 할당 구조에 대한 기대 질량 스펙트럼이 m/z에서 분자 이온 M+H = 517.3 및 분석용 HPLC Rt= 3.70분 (역상)을 포함하는 것으로 나타났다. 이중 전기분무 이온화 공급원 및 아길런트 1100 액체 크로마토그래프를 갖는 워터스(Waters) LCT 프리미어 분석기를 사용하여 LC/ESI-MS 데이터를 기록하였다. MS 시스템의 분해능은 대략 12000 (FWHM 정의)였다. 1.0 mL/분 유속으로 10％로부터 95％까지의 기울기로 2.5분 내에 HPLC 분리를 수행하였다. 10 mM 암모늄 포르메이트를 수성상에서 변경제 첨가제로서 사용하였다. 술파디메톡신 (시그마(Sigma); 양성자화된 분자 m/z 311.0814)을 기준물질로서 사용하고, 세번째 스캔 마다 락스프레이(LockSpray)™ 채널을 통해 획득하였다. 시스템의 질량 정확도는 <5 ppm인 것으로 밝혀졌다.

아실화 단계를 위한 적합한 아실화제 및 산은 적절한 R^c 기 (화학식 I 참조)를 갖는 아실 할로겐화물, 무수물 및 산을 포함한다. 적합한 아미드 커플링 조건은 아미드 결합을 형성시키기 위한 다양한 아미드 커플링 시약, 예컨대 카르보디이미드 N-N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), N-N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIPCDI) 및 1-에틸-3-(3'-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDCI)의 사용을 포함한다. 카르보디이미드는 첨가제, 예컨대 디메틸아미노피리딘 (DMAP) 또는 벤조트리아졸, 예컨대 7-아자-1-히드록시벤조트리아졸 (HOAt), 1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt) 및 6-클로로-1-히드록시벤조트리아졸 (Cl-HOBt)과 함께 사용될 수 있고; 이러한 아미드 결합 형성을 위한 조건은 당분야에 익히 공지되어 있다.

추가 아미드 커플링 시약에는 또한 우로늄 및 포스포늄 기재 시약이 포함된다. 우로늄 염에는 N-[(디메틸아미노)-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리딘-1-일메틸렌]-N-메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 N-옥시드 (HATU), N-[(1H-벤조트리아졸-1-일)(디메틸아미노)메틸렌]-N-메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 N-옥시드 (HBTU), N-[(1H-6-클로로벤조트리아졸-1-일)(디메틸아미노)메틸렌]-N-메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 N-옥시드 (HCTU), N-[(1H-벤조트리아졸-1-일)(디메틸아미노)메틸렌]-N-메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 N-옥시드 (TBTU) 및 N-[(1H-6-클로로벤조트리아졸-1-일)(디메틸아미노)메틸렌]-N-메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 N-옥시드 (TCTU)가 포함된다. 포스포늄 염에는 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP), 7-아자벤조트리아졸-1-일-N-옥시-트리스(피롤리디노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyAOP) 및 벤조트리아졸-1-일-N-옥시-트리스(피롤리디노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBOP)가 포함된다.

아미드 형성 단계는 극성 용매, 예컨대 디메틸포름아미드 (DMF)에서 수행될 수 있고, 또한 유기 염기, 예컨대 디이소프로필에틸아민 (DIEA) 또는 디메틸아미노피리딘 (DMAP)을 포함할 수 있다.

화학식 II의 화합물의 제조 동안 히드록실을 위한 적합한 보호기의 선택, 도입 및 제거 방법은 당분야에 익히 공지되어 있다. 상기 반응식을 기초로 하여, 화학식 II의 화합물은 원하는 생성물을 제공하기 위한 적합한 출발 물질을 선택하는 방법을 알고 있는 당업자가 당분야의 통상적인 기술을 사용하여 쉽게 제조된다.

"KSP 억제제"는 키네신 방추체 단백질 (KSP)의 임의의 측정가능한 활성을 억제할 수 있는 화합물이다. 바람직하게는, KSP 억제제는 100 마이크로몰 농도 미만, 보다 바람직하게는 10 마이크로몰 농도 미만, 및 종종 1 마이크로몰 농도 미만의 IC50을 갖는다.

"증식성 질병"은 과량의 또는 바람직하지 않은 증식성 세포를 특징으로 하는 척추동물을 해롭게 하는 임의의 질병 또는 상태를 포함한다. 본 발명에 따른 "증식성 질병의 치료 방법"은 유효량의 KSP 억제제를 단독으로 또는 유효량의 화학요법제 및/또는 방사선과 조합하여 동시에 또는 순차적으로 투여함으로써, 세포의 비정상적인 성장의 치료를 필요로 하는 환자 (예를 들어, 포유동물, 예컨대 인간)에서 형질전환된 세포를 포함하는 세포의 비정상적인 성장을 치료하는 (억제하는) 방법을 포함한다. 세포의 비정상적인 성장은 종양 세포 또는 다른 증식성 질병의 양성 및 악성 세포의 비정상적인 성장을 포함하는, 정상적인 조절 메카니즘 (예를 들어, 접촉 억제의 손실)에 대해 독립적인 세포 성장을 의미한다.

용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 이를 기술한다.

본원에서 사용되는 "종양"은 모든 신생물 세포 성장 및 증식 (악성 또는 양성, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직)을 지칭한다. 용어 "고형 종양"은 혈액, 골수 및 림프계 이외의 신체 조직의 암 또는 암종을 지칭한다. 고형 종양의 예로는 폐 암종, 유방 암종, 난소 암종, 피부 암종, 결장 암종, 방광 암종, 간 암종, 위 암종, 전립선암, 췌장암, 신장 세포 암종, 비인두 암종, 편평 세포 암종, 갑상선 유두 암종, 자궁경부 암종, 소세포 폐 암종, 비-소세포 폐 암종, 두경부 편평 세포암 및 육종을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는 용어 "혈액계 암"은 혈액의 암을 지칭하고, 특히 백혈병 및 악성 림프구증식성 질환을 포함한다. "백혈병"은 너무 많은 백혈구 또는 적혈구가 생성되어 혈액을 구성하는 다른 부분, 예컨대 혈소판 및 정상적인 적혈구를 밀어내는 혈액의 암을 지칭한다. 백혈병의 사례는 급성 또는 만성으로 분류되는 것으로 이해된다. 급성 백혈병에서 암 세포는 미숙 단계에서 차단되나, 계속 증식한다. 결과적으로, 비기능성 미숙 세포가 많이 축적하고 기능성 세포가 동시에 손실된다. 만성 백혈병은 더 천천히 진행하여, 암 세포가 완전히 성숙한 상태로 발달한다. 또한, 백혈구는 골수성 또는 림프성일 수 있다. 그러므로, 백혈병의 특정 형태는 예로서 급성 림프성 (또는 림프구성) 백혈병 (ALL); 급성 골수성 백혈병 (AML); 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 또는 만성 골수성 백혈병 (CML); 및 골수이형성 증후군일 수 있다. "악성 림프구증식성 질환"은 특히 림프종, 예컨대 호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종 또는 다발성 골수종을 지칭할 수 있다.

본원에 기재된 몇몇 종양은 다양한 치료제에 대해 내성일 수 있다. '내성'은 암이 정상적인 투여 비율 또는 환자에 의해 관용되는 비율에서 치료제에 의해 실질적으로 영향을 받지 않는다는 것을 의미한다. 다양한 항신생물제에 대한 내성의 주요 형태는 이들 세포독성 분자를 압출하는 일군의 막 단백질 펌프의 기능을 수반한다. "다약제 내성 펌프"는 박테리아로부터 인간에 이르는 유기체에 존재하는 ATP 결합 카세트 (ABC) 단백질의 거대족을 지칭할 수 있다. ABC 수송체 펌프는 세포의 원형질막 또는 상이한 세포 세포소기관의 막에 위치되고, 이들 장벽을 가로지르는 다양한 분자의 전좌를 매개한다. 대부분의 ABC 펌프는 이 수송 활성을 위해 ATP 가수분해의 에너지를 이용하나 (능동 수송체), 몇몇 ABC 펌프는 특정 막 채널을 형성한다.

종양에서 다약제 내성 표현형이 특정 ABC 펌프 (다약제 내성 (MDR) 단백질이라고 함)의 과다발현과 관련되어 있다는 것이 수많은 임상 연구에 의해 밝혀졌다. P-당단백질 (P-gp, MDR1 또는 ABCB1이라고 함)-매개 다약제 내성이 처음 발견되었고 (문헌 [Juliano,R.L. and Ung,v., Biochim.Biophys.Acta, 455, 152-162 (1976)]; [Chen,D. et al., Cell, 47, 381-389 (1986)]; [Ueda,K. et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 84, 3004-3008 (1987)]), 아마 여전히 임상 다약제 내성에서 가장 광범위하게 관찰된 메카니즘일 것이다 (문헌 [Endicott, JA and Ling,v., Annu. Rev. Biochem., 58, 137-171 (1989)]; [Higgins, C.E, Ann. Rev. Cell Biol., 8, 67-113(1992)]; [Gottesman, MM. and Pastan, I., Annu. Rev. Biochem., 62, 385-427(1993)]; [Gottesman, M.M et al., Nat. Rev. Cancer; 2, 48-58 (2002)]). 2종의 다른 ABC 펌프가 존재하며, 이들은 종양의 다약제 내성에 관여하는 것으로 밝혀졌다: 다약제 내성 단백질 1 (MRP1, ABCC1) 및 미톡산트론 내성 단백질 (MXR/BCRP, ABCG2) (문헌 [Gottesman, M.M ibid, Cole, S.P.c. et al., Science, 258, 1650-1654 (1992)]; [Borst, P. et al., J. Natl. Cancer. Inst., 92, 1295-1302 (2000)]; [Deeley, R.G. and Cole, S.P.c., Sem. Cancer Bio I., 8, 193-204 (1997)]; [Litman, l et al., Cell. Mol. Life Sci., 58, 931-959 (2001)]). 또한, 다양한 화합물을 세포 밖으로 능동적으로 수송할 수 있는 다른 인간 ABC 펌프는 또한 다약제 내성의 선택된 사례에서 참가자일 수 있다. 이들에는 ABCB4 (MDR3) 및 ABCB11 (시스터 P-gp 또는 BSEP)이 포함되며, 상기 2종의 펌프는 간에 주로 존재하며 포스파티딜 콜린 및 담즙산의 분비에 각각 관여하는 기능을 갖는다 (문헌 [Lecureur, V. et al., Toxicol., 152, 203-219 (2000)]; [Paulusma, c.c. et al., Science, 271, 1126-1128 (1996)]; [Paulusma, c.c. et al., Hepatology, 25, 1539-1542 (1997)]). MDR3은 또한 특정 약물을 수송하는 것으로 이미 밝혀졌다 (문헌 [Smith, AJ. et al., J. Bioi.Chem., 275, 23530-23539 (2000)]). MRP1 이외에 5종의 동족체 (MRP2-MRP6)가 클로닝되었다. MRP2 (소수성 화합물을 또한 압출할 수 있는 유기 음이온 수송체)의 과다발현은 암 MDR9를 제공하는 것으로 명확하게 나타났다 (문헌 [Kool, M et al., Cancer Res., 57, 3537-3547 (1997)]). 유기 접합체 수송체 펌프인 MRP3 및 뉴클레오시드 수송체 펌프인 MRP5가 또한 특정 형태의 약물 내성을 야기하는 후보물질 단백질이다 (Borst, P. et al. ibid).

"항체" 및 "이뮤노글로불린" (Ig)은 동일한 구조적 특징을 갖는 당단백질이다. 항체는 항원에 대한 결합 특이성을 나타내지만, 이뮤노글로불린은 항체, 및 항원 특이성이 결핍된 다른 항체-유사 분자 양자 모두를 포함한다. 후자 종류의 폴리펩티드는 예를 들어 림프계에 의해 낮은 수준으로 생성되고, 골수종에 의해 증가된 수준으로 생성된다.

본원에서 사용되는 용어 "표지"는 "표지된" 항체를 생성하기 위해 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 접합되는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 그 자체로 검출가능할 수 있거나 (예를 들어, 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다. 검출가능한 표지로서 작용할 수 있는 방사성 핵종에는 예를 들어, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212 및 Pd-109가 포함된다. 표지는 또한 생물학적 또는 생화학적 활성에 의해 검출가능한 독소와 같은 비-방사성 실체일 수 있다.

용어 "길항제"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 본원에 개시된 천연 표적의 생물학적 활성 또는 그의 전사 또는 번역을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나 억제하거나 또는 중화시키는 임의의 분자를 포함한다.

본원에서 사용되는 "담체"는 사용되는 투여량 및 농도에서 세포 또는 포유동물이 이에 노출시 세포 또는 포유동물에게 비독성인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 종종, 생리학적으로 허용되는 담체는 수성 pH 완충 용액이다. 생리학적으로 허용되는 담체의 예로는 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 숙시네이트 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당 알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 플루로닉스(Pluronics)가 포함된다. 1종 이상의 추가 치료제와의 "조합" 투여는 동시 (동시발생) 및 임의의 순서의 순차적 투여를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 방법으로 조합되는 치료제는 치료되는 대상체의 체내에 동시에 치료 관련 수준으로 존재한다.

본원에서 사용되는 "숙주 세포"는 재조합 벡터 또는 다른 전이 폴리뉴클레오티드에 대해 수용자로서 사용될 수 있거나 사용된 단세포 실체로서 배양된 미생물 또는 진핵 세포 또는 세포주를 지칭하고, 형질감염된 본래 세포의 자손을 포함한다. 단일 세포의 자손은 자연, 우연한 또는 계획적인 돌연변이로 인해 본래 부모와 형태학 또는 게놈 또는 총 DNA 상보서열이 반드시 완전히 동일할 필요는 없다는 것이 이해된다.

"치료"는 본원에서 대상체로의 KSP 억제제의 적용 또는 투여, 또는 대상체로부터의 단리된 조직 또는 세포주로의 KSP 억제제의 적용 또는 투여라고 정의되며, 여기서 대상체는 고형 종양 또는 혈액계 암, 고형 종양 또는 혈액계 암과 관련된 증상, 또는 고형 종양 또는 혈액계 암의 발병을 향한 소인을 갖고, 목적은 고형 종양 또는 혈액계 암, 고형 종양 또는 혈액계 암의 임의의 관련 증상, 또는 고형 종양 또는 혈액계 암의 발병을 향한 소인을 회복시키거나 치유하거나 경감시키거나 구제하거나 개조하거나 완화시키거나 개량하거나 개선하거나 또는 영향을 미치는 것이다. 대상체는 포유동물일 수 있고, 몇몇 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 종종, 대상체는 본 발명의 화합물 및 방법에 의한 치료에 적합한 것으로 본원에 기재된 상태 중 하나 이상으로 진단된 인간이다. 구체적인 실시양태에서, 대상체는 약물 내성을 촉진하는 유출 펌프, 예컨대 P-gp를 발현하는 암을 갖는 대상체일 수 있거나, 또는 대상체는 파클리탁셀 또는 SB-715992와 같은 약물에 대해 내성을 나타낸 종양을 갖는 대상체일 수 있다.

"치료"는 또한 대상체로의 KSP 억제제를 포함하는 제약 조성물의 적용 또는 투여, 또는 대상체로부터의 단리된 조직 또는 세포주로의 KSP 억제제를 포함하는 제약 조성물의 적용 또는 투여를 의도하며, 여기서 대상체는 고형 종양 또는 혈액계 암, 고형 종양 또는 혈액계 암과 관련된 증상, 또는 고형 종양 또는 혈액계 암의 발병을 향한 소인을 갖고, 목적은 고형 종양 또는 혈액계 암, 고형 종양 또는 혈액계 암의 임의의 관련 증상, 또는 고형 종양 또는 혈액계 암의 발병을 향한 소인을 회복시키거나 치유하거나 경감시키거나 구제하거나 개조하거나 완화시키거나 개량하거나 개선하거나 또는 영향을 미치는 것이다.

"항종양 활성"은 악성 세포 증식 또는 축적의 속도의 감소, 및 그러므로 기존의 종양 또는 치료요법 도중 발생하는 종양의 성장 속도의 감퇴, 및/또는 기존의 신생물 (종양) 세포 또는 새로운 형성된 신생물 세포의 파괴, 및 그러므로 치료요법 도중 종양의 전체 크기의 감소를 의도한다. 하나 이상의 KSP 억제제에 의한 치료요법은 인간에서 고형 종양의 치료와 관련하여 유익한 생리학적 반응을 야기한다. 하나 이상의 KSP 억제제에 의한 치료요법은 인간에서 혈액계 종양의 치료와 관련하여 유익한 생리학적 반응을 야기한다. 본 발명의 방법은 치료요법 도중 발생하는 추가 종양 과성장의 예방에 유용할 수 있는 것으로 인식된다.

본 발명의 방법에 따라, 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 KSP 억제제는 고형 종양 또는 혈액계 암과 관련하여 양성 치료 반응을 촉진하는데 사용된다. 암 치료와 관련하여 "양성 치료 반응"은 이들 항체 또는 그의 단편의 항암 활성과 관련된 질병의 개선, 및/또는 질병과 관련된 증상의 개선을 의도한다. 즉, 항증식성 효과, 추가 종양 과성장의 예방, 종양 크기의 감소, 암 세포수의 감소 및/또는 암 세포의 자극에 의해 매개된 하나 이상의 증상의 감소가 관찰될 수 있다. 그러므로, 예를 들어, 질병의 개선은 완전 반응으로서 특징화될 수 있다. "완전 반응"은 임의의 이전 비정상적인 방사선기록 연구, 골수 및 뇌척수액 (CSF)의 표준화에 의한 임상적으로 검출가능한 질병의 부재를 의도한다. 이러한 반응은 본 발명의 방법에 따른 치료후 1개월 이상 동안 지속해야 한다. 별법으로, 질병의 개선은 부분 반응인 것으로 범주화될 수 있다. "부분 반응"은 새로운 병소의 부재 하에 및 1개월 이상 동안 지속하는 모든 측정가능한 종양 존재량 (즉, 대상체에 존재하는 종양 세포수)의 약 50％ 이상의 감소를 의도한다. 이러한 반응은 오직 측정가능한 종양에 적용가능하다.

종양 반응은 스크리닝 기술, 예컨대 자기 공명 영상화 (MRI) 스캔, x-방사선기록 영상화, 전산화 단층촬영 (CT) 스캔, 생체발광 영상화, 예를 들어 루시페라제 영상화, 골 스캔 영상화, 및 종양 생검 샘플링, 예를 들어 골수 흡입 (BMA)을 사용하여 종양 형태학 (즉, 전체 종양 존재량, 종양 크기 등)의 변화에 대해 평가될 수 있다. 이들 양성 치료 반응 이외에, KSP 억제제에 의한 치료요법을 받은 대상체는 질병과 관련된 증상의 개선의 유익한 효과를 경험할 수 있다.

"치료상 효과적인 용량 또는 치료 유효량" 또는 "유효량"은 투여시 고형 종양 또는 혈액계 암을 갖는 환자의 치료와 관련하여 양성 치료 반응을 야기하는 KSP 억제제의 양을 의도한다. 치료 방법은 억제제의 치료상 효과적인 용량의 단일 투여 또는 치료상 효과적인 용량의 다중 투여를 포함할 수 있는 것으로 인식된다.

Bcr-Abl 티로신 키나제 유전자는 융합 단백질을 코딩하고, BCR 및 ABL 유전자의 비정상적인 접합에 의해 생성된다. 이 융합은 ABL 티로신 키나제의 조절되지 않는 발현을 유발하는 Bcr-Abl 융합 유전자의 형성을 야기하는 상호 전좌 t(9:22)에 의해 유발된 소위 필라델피아 염색체 상에서 발견된다. 필라델피아 염색체의 존재는 CML 및 ALL 양자 모두에서 원인 인자 중 하나로 고려된다 (문헌 [Abraham, (2007) Community Oncology 4(1) p. 11-14]). 현재, Bcr-Abl 티로신 키나제는 새로운 부류의 Bcr-Abl 억제 치료 화합물, 예컨대 이매티닙 (글리벡(Gleevec)®, 노파르티스(Novartis)), 다사티닙 (스프리셀(Sprycel)®, 브리스톨-마이어스 스퀴브(Bristol-Myers Squibb)) 및 닐로티닙 (AML107, 노파르티스)에 대한 표적이다. Bcr-Abl 티로신 키나제는 KSP 단백질의 상류에서 작용한다.

몇몇 바람직한 실시양태에서, KSP 억제제는 관심있는 고형 종양의 치료에서 사용하는 것으로 의도된 암 치료요법 (수술, 방사선요법, 화학요법, 사이토카인 치료요법 또는 다른 모노클로날 항체를 포함하나 이에 제한되지 않음)일 수 있는 하나 이상의 다른 "활성 화합물"과 조합하여 투여되며, 여기서 추가 암 치료요법은 KSP 억제제 치료요법 전에, 도중 또는 후에 투여되고, 치료제 양자 모두는 대상체에서 동시에 치료 수준으로 존재한다. 그러므로, 조합된 치료요법이 화학요법, 사이토카인 치료요법 또는 다른 모노클로날 항체와 같은 다른 치료제의 투여와 조합된 KSP 억제제의 투여를 포함하는 경우, 본 발명의 방법은 별도의 제형 또는 단일 제약 제형을 사용하는 공동투여, 및 임의의 순서의 순차적 투여를 포함하며, 바람직하게는 두 (또는 모든) 활성제가 동시에 그의 치료 활성을 발휘하는 기간이 존재한다. 본 발명의 방법이 조합된 치료 요법을 포함하는 경우, 이들 치료요법은 동시에 제공될 수 있으며, 즉, KSP 억제제는 다른 암 치료요법과 동시에 또는 동일한 시간대 내에 투여된다 (즉, 치료요법은 동시에 진행되나, KSP 억제제는 다른 암 치료요법과 정확하게 동일한 시간에 투여되지 않음). 별법으로, 본 발명의 KSP 억제제는 또한 다른 암 치료요법 전에 또는 후에 투여될 수 있다. 상이한 암 치료요법의 순차적 투여는 치료되는 대상체가 치료요법의 제1 과정에 대해 반응하여 관해 또는 재발의 가능성을 감소시키는가와 상관없이 수행될 수 있다.

본 발명의 몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 KSP 억제제는 화학요법 또는 사이토카인 치료요법과 조합하여 투여되며, 여기서 KSP 억제제 및 화학요법제(들) 또는 사이토카인(들)은 순차적으로, 순서대로 또는 동시에 (즉, 동시에 또는 동일한 시간대 내에) 투여될 수 있다. 적합한 화학요법제의 예로는 CPT-11 (이리노테칸) (예를 들어, 결장직장암 및 비-소세포 폐암의 치료에서 사용될 수 있음); 젬시타빈 (예를 들어, 폐암, 유방암 및 상피 난소암의 치료에서 사용될 수 있음); 및 고형 종양의 치료에 적합한 다른 화학요법제가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 관심있는 사이토카인에는 알파 인터페론, 감마 인터페론, 인터류킨-2 (IL-2), IL-12, IL-15 및 IL-21, 과립구 대식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF), 과립구 집락 자극 인자 (G-CSF), 또는 이들 사이토카인의 생물학적으로 활성 변이체가 포함되나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 KSP 억제제는 고형 종양의 치료를 위해 의도된 모노클로날 항체와 조합하여 투여된다. 그러므로, 예를 들어, 대상체가 위암 또는 결장암을 위한 치료를 받고 있는 경우, 치료요법은 유효량의 모노클로날 항체, 예컨대 에르비툭스(Erbitux)® (세툭시맙(Cetuximab)이라고도 공지됨; 임클론 시스템스 인코포레이티드(ImClone Systems Incorporated), 미국 뉴욕주 뉴욕시 소재, 및 브리스톨 마이어스 스퀴브, 미국 뉴저지주 프린스톤 소재)의 투여와 조합된 유효량의 본원에 기재된 KSP 억제제의 투여를 포함할 수 있다. 유사하게, 대상체가 결장직장암을 위한 치료를 받고 있는 경우, 치료요법은 종양 혈관신생에서 중요한 역할을 담당하는 단백질인 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 결합하여 억제하는 유효량의 인간화된 모노클로날 항체 아바스틴(Avastin)™ (베바시주맙이라고도 공지됨; 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.), 미국 캘리포니아주 샌프란시스코 소재)의 투여와 조합된 유효량의 본원에 기재된 KSP 억제제의 투여를 포함할 수 있다. 별법으로, 대상체가 유방암을 위한 치료를 받고 있는 경우, 치료요법은 유효량의 인간화된 모노클로날 항체 헤르셉틴(Herceptin)® (트라스투주맙이라고도 공지됨; 제넨테크, 인크., 미국 캘리포니아주 샌프란시스코 소재)과 조합된 유효량의 본원에 기재된 KSP 억제제의 투여를 포함할 수 있다. 본 발명의 KSP 억제제와 조합하여 사용될 수 있는 고형 종양의 치료를 위해 의도된 모노클로날 항체의 다른 예로는 표피 성장 인자 수용체를 표적으로 하는 항-EGFR 항체 (예를 들어, IMC-C225 (임클론 시스템스(ImClone Systems), 미국 뉴욕주 뉴욕시 소재) (예를 들어, 문헌 [Mendelsohn and Baselga (2000) Oncogene 19:6550-6565] 및 [Solbach et al. (2002) Int. J. Cancer 101:390-394] 참조); IGF-1 수용체 단백질을 표적으로 하는 항-IGF-1 수용체 항체 (예를 들어, 문헌 [Maloney et al. (2003) Cancer Res. 63:5073-5083] 및 [Hailey et al. (2002) Mol. Cancer. Ther. 1:1349-1353] 참조); 종양-관련 항원 MUC1을 표적으로 하는 항-MUC1 항체; 항-α5β1, 항-αvβ5 및 항-αvβ3 (세포 증식 및 생존에 관여하는 신호전달 프로세스 및 세포 접착을 조절하는 이들 각 인테그린을 표적으로 함) (예를 들어, 문헌 [Laidler et al. (2000) Acta Biochimica Polonica 47(4):1159-1170] 및 [Cruet-Hennequart et al. (2003) Oncogene 22(11):1688-1702] 참조); 항-P-카드헤린 항체 (이 카드헤린 족 구성원을 표적으로 함) (예를 들어, 동시계류중 미국 특허 출원 제20030194406호 참조); 및 항-VE-카드헤린 항체 (이 내피 세포-특이적 접착 분자의 혈관형성-관련 기능을 표적으로 함) (예를 들어, 문헌 [Liao et al. (2002) Cancer Res. 62:2567-2575] 참조)가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 이들 조합의 바람직한 실시양태에서, KSP 억제제는 화학식 II의 화합물이고, 이는 화학식 IIa, IIb 또는 IIc의 화합물일 수 있다.

본 발명의 KSP 억제제 및 모노클로날 항체는 순차적으로, 순서대로 또는 동시에 (즉, 동시에 또는 동일한 시간대 내에) 투여될 수 있다. 하나 초과의 유형의 모노클로날 항체가 투여되는 경우, 본 발명의 방법은 암 진행중 치료에 대해 보증되고 감독 의료 전문인에 의해 추천되는 바와 같은 방사선 및/또는 화학요법에 대한 노출을 추가로 포함할 수 있다.

<실시예>

실시예 1: KSP 활성을 결정하기 위한 검정

소 뇌로부터 얻은 정제된 미세소관을 사이토스켈레톤 인크.(Cytoskeleton Inc.) (미국 콜로라도주 덴버 소재)로부터 구입하였다. 인간 KSP (Eg 5, KNSL1)의 모터 도메인을 클로닝하고, 발현시키고, 균질성이 95％를 초과하도록 정제하였다. 바이오몰 그린(Biomol Green)™을 어피너티 리서치 프로덕츠 리미티드(Affinity Research Products Ltd.) (영국 데본 엑서터 맷포드 코트 소재)로부터 구입하였다. 미세소관 및 KSP 모터 단백질 (즉, KSP 모터 도메인)을 검정 완충액 (20 mM 트리스-HCl (pH 7.5), 1 mM MgCl₂, 10 mM DTT 및 0.25 mg/mL BSA)에서 희석하여, 최종 농도가 35 ㎍/mL 미세소관 및 45 nM KSP가 되도록 하였다. 그 후, 미세소관/KSP 혼합물을 37℃에서 10분 동안 전인큐베이션하여 KSP의 미세소관에의 결합을 촉진시켰다.

DMSO 중 억제제 또는 시험 화합물 (또는 대조군의 경우 오직 DMSO만) 1.25 ㎕를 함유하는 시험 플레이트 (384-웰 플레이트)의 웰 각각에 ATP 용액 (검정 완충액 내에서 300 μM의 농도로 희석된 ATP) 25 ㎕ 및 상기 기재된 미세소관/KSP 용액 25 ㎕를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 바이오몰 그린™ (무기 포스페이트의 방출을 검출하는 말라카이트 그린-기재 염료) 65 ㎕를 웰 각각에 첨가하였다. 플레이트를 추가 5 내지 10분 동안 인큐베이션한 후, 빅터(Victor) II 플레이트 판독기를 사용하여 630 nm에서의 흡광도를 결정하였다. 630 nm에서의 흡광도의 양은 샘플 내의 KSP 활성의 양에 상응하였다. 그 후, 농도 각각에서 630 nm에서의 흡광도 감소에 기초하여, 엑셀(Excel)을 위한 엑스엘피트 (XLFit) 또는 그래프패드 소프트웨어 인크.(GraphPad Software Inc.)의 프리즘(Prism) 데이타 분석 소프트웨어를 이용한 비선형 회귀법을 통해 억제제 또는 시험 화합물 각각의 IC50을 결정하였다.

바람직한 본 발명의 화합물은 약 1 mM 미만의 IC5O에 의해 측정된 바와 같은 생물학적 활성을 갖고, 바람직한 실시양태에서 약 25 μM 미만의 생물학적 활성을 갖고, 특히 바람직한 실시양태에서 약 1000 nM 미만의 생물학적 활성을 갖고, 가장 바람직한 실시양태에서 약 100 nM 미만의 생물학적 활성을 갖는다. 화학식 II의 화합물을 이 검정에서 시험하였으며, 이 검정에 대한 정량의 한계 미만의 IC50 값을 갖는 것으로 밝혀졌다 (2 내지 4 nM로 추정됨).

실시예 2: 화합물 IIa로 처리된 종양 세포주에서의 세포 증식의 억제

사용된 세포주는 다음과 같았다: HCT-116 (미국 국립암연구소의 DCTF 종양 저장소, 카탈로그 # NCI 502568, 미국 메릴랜드주 락빌 소재), HCT-15 (미국 국립암연구소의 DCTF 종양 저장소, 카탈로그 # NCI 502711, 미국 메릴랜드주 락빌 소재, 아메리칸 티슈 컬쳐 콜렉션(American Tissue Culture Collection)으로부터 이용가능함, 카탈로그 # CLL-225), KB-3-1 (DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) (독일 미생물 및 세포 배양물 보존기관)으로부터 이용가능함 - 카탈로그 번호 ACC 158), KB-V1 (DSMZ로부터 이용가능함 - 카탈로그 번호 ACC 149), AGS (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (미국 버지니아주 마나사스 소재)으로부터 이용가능함, 카탈로그 번호 CRL-1739™), N87 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 버지니아주 마나사스 소재)으로부터 이용가능함, 카탈로그 번호 CRL-5822), Hel92.1.7 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 버지니아주 마나사스 소재)으로부터 이용가능함, 카탈로그 번호 TIB 180), K562 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 버지니아주 마나사스 소재)으로부터 이용가능함, 카탈로그 번호 CRL-243™), MV4;11 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 버지니아주 마나사스 소재), 카탈로그 번호 CRL-9591) 및 U937 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 버지니아주 마나사스 소재)으로부터 이용가능함, 카탈로그 번호 CRL-1593.2).

세포를 96-웰 플레이트의 웰 당 약 500개 세포의 농도로 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 24시간 동안 성장하도록 두었다. 그 후, 상기 세포를 다양한 농도의 화합물로 72시간 동안 처리하였다. 그 후, 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)® 시약 100 ㎕를 첨가하였다 (프로메가 코포레이션(Promega Corporation)). ATP 검출을 위한 단일 셀타이터-글로® 시약 (미국 특허 제6,602,677호 및 제7,241,584호) (프로메가(Promega) 제품 카탈로그 #G7570 참조)을 사용하여 생존가능한 세포수를 결정하는 균일 방법에서 셀타이터-글로®를 사용하였다. 셀타이터-글로® 시약의 첨가 후, 상기 세포를 암소에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 왈락 트리룩스(Wallac Trilux) 플레이트 판독기를 사용하여 웰 각각에 대해 발광량을 결정하였으며, 이는 웰 당 세포수와 상관관계가 있었다. DMSO (0.5％)만 수용하는 웰 내의 생존가능한 세포수는 0％ 억제의 표시로서 기능하는 반면, 세포가 없는 웰은 세포 성장의 100％ 억제로서 기능하였다. 72 시간의 연속적인 화합물 노출에서 Log-변환 용량 값 대 세포 개수 (대조군의 백분율)의 S상 용량-반응 곡선으로부터 50％ 성장 억제를 유발하는 화합물 농도 (GI50)를 그래프로 결정하였다. 데이터는 하기 표 1에 제공된다. 시험된 모든 세포주에서 광범위 항증식성 효과 (GI50 값 0.1 내지 6.5 nM)가 관찰되었다. 이 광범위 활성은 유사분열 억제제인 화합물과 일치하였다.

P-당단백질 (P-gp, 또한 MDR1이라고 공지됨)은 이를 발현하는 세포에서 여러 세포독성 약물에 대한 다약제 내성을 매개하는 ABC 수송체인 유출 펌프이다. 이 연구에서 사용되는 몇몇 세포주 (HCT-15, KBV1 및 KB8.5)는 P-gp를 발현하고, 표 1에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 이들 세포주는 화학식 II의 KSP 억제제에 대해 민감하다. 하기 실시예 12는 아실 부분 상에 히드록실이 없는 유사한 화학식 I의 화합물이 생체내에서 이러한 종양에 대해 활성이 아닌 것으로 나타내었다.

실시예 3: 암 세포주에서의 세포 주기 프로파일에 대한 KSP 억제제의 시험관내 효과

림프종 세포주 세포를 본 발명의 KSP 억제제로 처리하고, FACS 분석에 의해 분석하였다. 대략 2 x 10⁵개 세포를 수확하고, 세포 펠렛을 냉 PBS로 2회 세척하고, 냉 PBS 500 ㎕에서 재현탁하였다. 천천히 볼텍싱하면서 냉 80％ 에탄올 8 mL를 첨가함으로써 세포를 고정시켰다. 인큐베이션 15분 후, 고정된 세포를 PBS로 2회 세척하고, 세포 펠렛을 PI/RNASE 염색 완충액 (BD 파민겐(Pharmingen)™ 카탈로그 #550825) 1 mL에서 재현탁하고, 15분 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 빛으로부터 보호하였다. 요오드화프로피듐 (PI)은 DNA 및 RNA 양자 모두를 염색하는 형광 생체 염료이다. 그러므로, RNA는 리보뉴클레아제 (RNase)에 의한 소화에 의해 제거되어야 한다. FACS 분석 전에 세포 응집물의 수를 감소시키기 위해 염색된 세포를 세포 여과기를 통해 FACS 튜브로 통과시켰다 (BD 팔콘(Falcon) # 352235). 고정되고 염색된 세포의 DNA 함량을 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어를 사용하여 BD 팩스칼리버(FACSCalibur) 유동 세포계측기에 의해 분석하였다.

KSP 억제제에 의한 암 세포의 처리는 유사분열 정지를 야기하였으나, 정지 정도, 그의 지속시간 및 정지후 예후는 세포주 간에 다양할 수 있었다. 유사분열 정지 후, 세포는 정지의 출현 및 정상적 분열, 직접적 세포자멸 경험, 또는 세포질분열이 없는 유사분열 (유사분열 불이행이라고 불리는 현상)의 존재를 포함하는 여러 옵션을 갖는다. 세포가 유사분열 불이행을 겪는 경우, 가성-G1 단계에 진입한 후, 주기를 계속하고 성숙하거나, 또는 세포자멸을 겪을 수 있다. 이들 차이 중 일부는 KSP 억제제에 의한 림프종 세포주 SUDHL-4 (DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) (독일 미생물 및 세포 배양물 보존기관)으로부터 얻은 B 세포 림프종 세포주, 카탈로그 번호 ACC 495) 및 RL (인간 비-호지킨 림프종 세포주, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 미국 버지니아주 마나사스 소재, 카탈로그 번호 CRL-2261™)의 처리에서 강조되었다.

세포주 양자 모두는 화합물 IIa에 반응하여 유사분열에서 정지하였으나, SUDHL-4 세포는 48시간 처리 후 세포자멸을 겪은 반면 (< 2N DNA 함량을 갖는 세포의 증가에 의해 나타남), RL 림프종 세포는 유사분열 정지를 유지하였고, 세포자멸의 유도 및 유사분열 불이행 모두 일어나지 않았다. 도 2를 참조한다.

실시예 4 - KSP 억제제 스크리닝 검정

여러 세포-기재 검정을 사용하는 불편(unbiased) 접근법을 사용하여 본 발명의 KSP 억제제에 대해 가장 민감한 종양 유형의 확인을 달성할 수 있었다. 선택된 검정은 다음과 같았다:

■ 셀타이터-글로®. 이는 세포 배양물 중 ATP 농도를 측정하도록 설계된 검정이고, 이는 세포수와 상관관계가 있을 수 있다. 간단히, 셀타이터-글로® (프로메가 코포레이션)는 ATP를 검출하기 위해 단일 셀타이터-글로® 시약을 사용하는 균일 방법이며, 여기서 검정에서 ATP는 열안정성 루시페라제의 활성이 측정되고 생존가능한 세포수와 상관관계가 있을 수 있는 발광 신호를 생성하도록 구동한다. 간단히, 접착성 세포의 경우, 1,000 내지 5,000개 세포/웰을 96-웰 플레이트에서 플레이팅하고 (100 ㎕/웰), 약물에 의해 처리하기 전에 24시간 동안 접착하게 두었다. 비접착성 세포의 경우, 1,000 내지 10,000개 세포/웰을 96-웰 플레이트에서 플레이팅하고 (100 ㎕/웰), 즉시 약물로 처리하였다. 약물 희석물들을 DMSO에서 1000배 최종 농도로 제조하였다. 그 후, 이들 희석물을 세포 (11 ㎕/웰)에 첨가하기 전에 성장 배지에서 1/100으로 희석하여, 원하는 최종 농도를 달성하였다. 37℃ 조직 배양 인큐베이터에서 48시간 후, 제조자의 지시사항에 따라 셀타이터-글로® 검정을 위해 플레이트를 처리하였다. 72시간 세포 증식 검정을 위한 프로토콜: 히가 변경사항을 제외하고 48시간 검정과 동일한 방법으로 72시간 검정을 수행하였다: 접착성 세포의 경우, 500 내지 5,000개 세포/웰을 96-웰 플레이트에서 플레이팅하고 (90 ㎕/웰 세포 성장 배지), 약물에 의해 처리하기 전에 24시간 동안 접착하게 두었다. 비접착성 세포의 경우, 1,000 내지 10,000개 세포/웰을 96-웰 플레이트에서 플레이팅하고 (90 ㎕/웰 세포 성장 배지), 즉시 약물로 처리하였다. 제공된 데이터 값은 성장의 50％ 감소를 위해 필요한 시험 화합물의 농도를 나타내었다.

■ LDH 방출. 세포독성 검출 키트플러스(KitPLUS) (LDH) 검정 (로슈 디아그노스틱스(Roche Diagnostics), 독일 만하임 소재)은 세포의 사멸에 의해 배지 중 방출된 LDH의 양을 측정하고; LDH는 락테이트의 피루베이트로의 전환을 촉매한다. 효소 반응을, 테트라졸륨 염을 사용하여 적색이고 490 nm에서의 흡광도에 의해 검출될 수 있는 포르마잔을 형성하는 화학적 반응에 커플링시킨다. 이 검정은 약물 처리 후 세포 사멸의 양을 측정한다. 세포를 10,000개 세포/웰로 96-웰 플레이트에서 플레이팅하였다 (100 ㎕/웰). 접착성 세포는 약물에 의해 처리하기 전에 24시간 동안 접착하게 둔 반면, 비접착성 세포는 즉시 약물로 처리하였다. 약물 희석물들을 DMSO에서 1000배 최종 농도로 제조하였다. 그 후, 이들 희석물을 세포 (11 ㎕/웰)에 첨가하기 전에 성장 배지에서 1/100으로 희석하여, 원하는 최종 농도를 달성하였다. 37℃ 조직 배양 인큐베이터에서 48시간 후, 제조자의 지시사항에 따라 세포독성 검출 키트플러스 (LDH) 검정을 위해 플레이트를 처리하였다. 분석전 모든 데이터 점으로부터 오직 배지 값을 공제하였다. 제공된 데이터 값은 LDH 산출량이 최대 수준의 절반일 때의 화합물 농도에 상응하였다.

■ 카스파제-글로(Caspase-Glo)® 3/7. 카스파제-글로® 3/7 검정 (프로메가 코포레이션)은 카스파제-3/7 활성을 측정하는 균일 발광 검정이다. 상기 검정은 카스파제-3/7 활성, 루시페라제 활성 및 세포 용해를 위해 최적화된 시약 중 전발광 카스파제-3/7 DEVD-아미노루시페린 기질 및 열안정성 루시페라제를 제공한다. 단일 카스파제-글로® 3/7 시약의 첨가는 세포 용해, 이어서 기질의 카스파제 절단을 야기하였다. 이는 유리 아미노루시페린을 방출하였고, 유리 아미노루시페린은 루시페라제에 의해 소모되었고, 발광 신호를 생성하였다. 신호는 카스파제-3/7 활성과 비례하였다. 제공된 데이터 값은 카스파제 3/7 활성이 최대 수준의 절반일 때의 화합물 농도에 상응하였다.

스크리닝 검정의 예측 성질을 나타내기 위한 노력으로 본 발명의 KSP 억제제에 대한 민감성의 공지된 차이로 다섯 세포주를 선택하였다. 세포주는 다음과 같았다:

HCT-116 및 HT29. HCT-116은 인간 결장 상피 암종으로부터 유래된 세포주이고, 생체내에서 본 발명의 KSP 억제제에 대해 민감한 것으로 나타났다. HT29 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 버지니아주 마나사스 소재)으로부터 이용가능함, 카탈로그 번호 HTB-38)는 또한 인간 결장 상피 암종으로부터 유래하나, KSP 억제제에 대해 덜 민감하다.

MV4;11 (아메리칸 티슈 컬쳐 콜렉션 (카탈로그 # CRL-9591, 미국 메릴랜드주 락빌 소재)은 급성 골수성 백혈병 (AML) 세포주이다.

Colo205 (아메리칸 티슈 타입 컬쳐 콜렉션 (카탈로그 # HB-8307, 미국 메릴랜드주 락빌 소재)는 인간 결장직장암 세포주이다.

T47D (아메리칸 티슈 컬쳐 콜렉션으로부터 이용가능함 (카탈로그 # HTB-133, 미국 메릴랜드주 락빌 소재)는 방추체 검사점에서 결함을 갖는 것으로 보이는 인간 유방 유관 암종으로부터 유래된 세포주이다.

화합물 IIa에 대한 데이터는 하기 표 2에 제공된다. 결과는 일반적으로 검정이 서로 잘 일치하고 KSP 억제제를 스크리닝하고 민감성 세포 유형에 대해 스크리닝하기 위해 다양한 세포 유형의 광폭 스크린에서 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 5 - 세포주의 NCI60 패널에 대한 KSP 억제제의 활성

NCI-60 패널은 주어진 작용제에 대한 상이한 기원으로부터의 종양의 민감도를 연구하는데 종종 사용되는 종양 세포주의 표준화된 패널이다 (문헌 [Shoemaker 2006 Nat Rev Cancer; 6:813-23]). KSP 억제제 화합물에 대한 수많은 종양 유래 세포주의 민감도를 측정하기 위해 상기 기재된 셀타이터-글로® 검정을 사용하였다. 화합물 IIa에 대한 데이터는 하기 표 3에 제공되고, 이는 많은 종양 유래 세포주가 본 발명의 KSP 억제제에 대해 민감하다는 것을 나타내었다.

GI50 값은 50％ 생존율에 이르게 하는 화합물 농도 (nM으로 표시됨)이다.

시차: 평균 Log(GI₅₀) (0.331)와 각 세포주의 Log(GI₅₀) 간의 차이

평균: GI₅₀ 값에 대한 기하 평균 및 Log(GI₅₀) 값에 대한 산술 평균

실시예 6 - 혈액계 악성종양으로부터 유래된 세포주에 대한 KSP 억제제의 활성

표 3에 제공된 데이터는 백혈병 세포주가 본 발명의 KSP 억제제에 대해 가장 민감한 것으로 나타내었다. 그러므로, 혈액계 악성종양으로부터 유래된 여러 세포주의 패널을 상기 기재된 셀타이터-글로® 검정에서 시험하였으며, 이는 하기 표 4 및 도 1에 제공된다.

GI₅₀ 값은 50％ 생존율에 이르게 하는 화합물 농도이다. 시차: 평균 Log(GI₅₀) (-0.470) 및 각 세포주의 Log(GI₅₀) 간의 차이. 평균: GI₅₀ 값에 대한 기하 평균 및 Log(GI₅₀) 값에 대한 산술 평균. (KMS-11, 문헌 [Namba et al (1989) In Vitro Cell Dev. Biol. 25 (8) p. 723-729] 참조)

실시예 7 - KSP 억제제에 대한 일차 모세포의 민감도

표 4로부터의 데이터는 여러 유형의 혈액계 암 세포주가 본 발명의 KSP 억제제에 대해 민감하다는 것을 나타낸다. AML 환자로부터의 일차 모세포를 하기 나타낸 바와 같이 화합물 IIa에 대한 민감도에 대해 시험하였다. 말초 혈액으로부터의 동결 AML 모세포를 올셀 엘엘씨.(AllCell LLC.) (미국 캘리포니아주 에머리빌 소재)로부터 얻었다. 약 1 x 10⁷개 PBMC를 함유하는 동결 바이알 3개를 구입하였다. 높은 백분율의 모세포를 갖는 새로 진단된 AML 환자 3명 (#06-188, 80％; #06-366, 88％; #06-503, 73％)으로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수주 동안 배양하고, KSP 억제제로 처리하였다. 바이알을 신속하게 해동하고, 세포를 10％ FBS 및 하기 사이토카인 (모두 10 ng/ml임)이 보충된 이스코브(Iscove) DMEM에서 배양하였다: GM-CSF, G-CSF, SCF, IL-3 및 IL-6 (모두 알앤디 시스템스(R&D Systems)로부터). 세포에 대해 세개의 검정을 다음과 같이 수행하였다:

■ AML 모세포에 대한 셀타이터-글로® 검정. AML 모세포를 함유하는 PBMC를 96-웰 플레이트에 시딩하고 (5000개/웰), 48시간 동안 다양한 농도의 화합물 IIa (10 pM 내지 10 nM)로 처리한 후, 세포 생존을 상기 기재된 바와 같이 측정하였다. 세포주에 대해 GI50 값 (nM)을 계산하였다.

■ 요오드화프로피듐 염색을 사용한 세포 주기 분석. AML 모세포를 함유하는 PBMC를 6개의 웰 플레이트에 시딩하고 (0.6 내지 1 x 10⁶개 세포/웰), 다음 중 하나로 처리하였다: DMSO (비히클), 화합물 IIa (0.2 또는 2 nM) 또는 파클리탁셀 (100 nM). 대략 2 x 10⁵개 세포를 수확하고, 세포 펠렛을 냉 PBS로 2회 세척하고, 냉 PBS 500 ㎕에서 재현탁하였다. 천천히 볼텍싱하면서 냉 80％ 에탄올 8 mL를 첨가함으로써 세포를 고정시켰다. 인큐베이션 15분 후, 고정된 세포를 PBS로 2회 세척하고, 세포 펠렛을 PI/RNASE 염색 완충액 (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences) #550825) 1 mL에서 재현탁하고, 15분 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 빛으로부터 보호하였다. 요오드화프로피듐 (PI)은 DNA 및 RNA 양자 모두를 염색하는 형광 생체 염료이다. 그러므로, RNA는 리보뉴클레아제 (RNase)에 의한 소화에 의해 제거되어야 한다. FACS 분석 전에 세포 응집물의 수를 감소시키기 위해 염색된 세포를 세포 여과기를 통해 FACS 튜브로 통과시켰다 (BD 팔콘 # 352235). 고정되고 염색된 세포의 DNA 함량을 셀퀘스트 소프트웨어를 사용하여 BD 팩스칼리버 유동 세포계측기에 의해 분석하였다.

■ 메틸셀룰로스 함유 배지에서의 집락 형성 검정. 메틸셀룰로스를 함유하는 반고체 배지를 스템셀 테크놀로지스 인크.(StemCell Technologies Inc.)로부터 구입하였다 (메토컬트(Methocult)™ GF+ H4435, Cat# 04435). 모세포를 비-조직 배양 처리된 6-웰 플레이트에서 1 x 10³ 내지 1 x 10⁵개 세포/웰 범위의 밀도로 시딩하였다. DMSO (비히클) 또는 화합물 IIa (0.1, 0.2, 0.5, 1 및 2 nM)를 세포와 동시에 배지에 첨가하였다. 2주 후 현미경으로 콜로니를 개수하였다. 살아있는 세포를 P-요오도니트로테트라졸륨 750 ㎕/웰 (1 mg/ml) (시그마 Cat#I8377)로 염색하고; 37℃에서 밤새 인큐베이션 후 사진을 찍었다.

결과: 이들 모세포의 겉보기 배가 시간은 대부분의 AML 세포주의 겉보기 배가 시간보다 더 느렸으나 (50 내지 70시간 대 30 내지 50시간), 화합물 IIa에 대해 얻은 GI50 값 (0.12, 0.28 및 0.34 nM)은 AML 세포주에 대해 상기 나타낸 것과 일치하였다. 집락 형성 검정을 사용하여 유사한 결과를 얻었으며, 샘플 #06-366의 경우 콜로니의 수는 0.2 nM에서 현저하게 감소하였고, 0.5 nM 이상에서 콜로니가 존재하지 않았다. 샘플 #06-188 및 #06-503에서 유사한 결과를 얻었으며, 모든 경우에 0.5 nM 이상에서 콜로니가 존재하지 않았다. 세포 주기 프로파일은 샘플 #06-366의 경우 24시간에 유사분열이 정지된 세포 (4N 집단)의 수의 증가가 있었고, 이어서 48시간에 죽어가는 세포 (<2N 집단)의 수의 증가가 있었다는 것을 나타내었다. 이들 변화는 더 낮은 농도 (0.2 nM) (GI₅₀에 인접함)에서보다 더 높은 농도 (2 nM)에서 더 현저하였다. 강한 유사분열 정지에 대한 양성 대조군으로서 고용량의 파클리탁셀 (100 nM)을 사용하였다. 샘플 #06-188 및 #06-503에서 유사한 결과를 얻었다. 샘플 #06-503의 경우, 48 및 72시간 시점에 데이터를 수집하였다. 48시간에서의 패턴은 샘플 #06-366에서 관찰된 것과 유사하고, 72시간에 죽어가는 세포 (<2N 집단)의 수의 증가가 특히 2 nM에서 더 현저하였다. 도 2를 참조한다. GI50 값이 매우 낮다는 사실은 세포 주기에 진입한 세포가 화합물 IIa에 의해 매우 효과적으로 사멸된다는 것을 나타낸다.

실시예 8 - KSP 억제제의 생체내 효능 결정

세포주 HCT-116은 유사분열 억제제, 예컨대 미세소관 붕괴제, 유사분열 키나제 억제제 및 KSP 억제제의 평가에서 광범위하게 사용되어 왔다. 3일 동안 일일 4회 (q4d x 3) 투여 스케쥴로 다중-용량 효능 연구를 수행하였다. 대략 6 내지 8주령의 이계교배된 무흉선 nu/nu 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 홀리스터 소재)를 사용하여 실험을 수행하였다. 도착시, 개별 동물의 확인을 위해 동물에게 견갑하 영역에 피하 마이크로칩 이식물 (AVID, 미국 루이지애나주 폴솜 소재)을 이식하였다. 임의의 실험 과정을 시작하기 전에 1주 동안 동물을 익숙하게 되도록 두었다. 12-시간 명, 12-시간 암 주기로 70 내지 80 화씨도의 온도 및 30 내지 70％ 상대 습도에서 투명한 폴리카르보네이트 마이크로-분리기 우리에서 우리 당 마우스 4 내지 5마리를 가두었다. 사료 (퓨리나(Purina) 설치류 먹이 펠렛) 및 물을 자유롭게 제공하였다. 노파르티스 ACUC 규제 및 가이드라인 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 ILAR 지침에 따라 마우스를 다루었다. ACUC 승인 프로토콜 하에 AAALAC 공인 기관에서 실험을 수행하였다.

화합물 IIa (유리 염기) 및 SB-715992 (이스피네십, 임상 시험 중인 사이토키네틱스에 의한 KSP 억제제; 유리 염기로서)를 8 mL/kg의 용량 부피에 대한 상기 용량 모두에 대해 20％ 캡티솔®에서 제제화하였다. 용량을 각 동물의 체중에 대해 조절하였다. 제형을 연구 시작시 1회 제조하고, 실온에서 저장하였다. 크레모포어-기재 비히클에 예비혼합된 임상 등급 파클리탁셀을 구입하고 (메인 파마(Mayne Pharma), 현재 호스피라(Hospira), 미국 일리노이주 레이크 포리스트 소재, 카탈로그 # NDC-6170334209), 멸균 염수에서 희석하여, i.p. 투여 30 mg/kg 용량에 대한 16 mL/kg의 용량 부피를 제공하였다.

인간 HCT116 결장 암종 세포를 미국 국립암연구소의 DCTD 종양 저장소 (카탈로그 # NCI 502568, 미국 메릴랜드주 락빌 소재)로부터 얻고, IMPACT1 PCR 검정 패널 (라딜(RADIL), 미주리대학교, 미국 미주리주 콜럼비아 소재)에서 마이코플라스마(Mycoplasma) 종 및 뮤린 바이러스가 없는가에 대해 시험하였다. 10％ 소 태아 혈청 (JRH 바이오사이언시스(JRH Biosciences), 카탈로그 #12003-1000M)이 보충된 2 mM L-글루타민을 갖는 RPMI 1640 (메디아테크 인크.(Mediatech Inc.), 카탈로그 #15-040-CV)에서 HCT116 세포를 성장시켰다. 이들 세포를 접착성 배양물로서 성장시키고, 37℃에서 5％ 이산화탄소를 함유하는 가습 대기에서 유지하였다. 사용전 10회 미만의 경과 동안 세포를 배양하였다. 세포를 95％ 전면성장에서 수확하고, 약 800 x g에서 5분 동안 4℃에서 원심분리한 후, 피하 이식을 위해 (0.1 mL의 주사 부피) 5천만개 세포/mL의 농도로 냉 HBSS (메디아테크 인크., 카탈로그 #21-021-CV)에서 재현탁하였다.

암컷 nu/nu 마우스 (찰스 리버, 미국 캘리포니아주 홀리스터 소재)에게 행크(Hank) 균형 염 용액 (HBSS)에 현탁된 5백만개 HCT-116 종양 세포를 0.1 mL/마우스의 총 부피로 우측 측복부에 피하로 주사하였다. 효능 연구를 위해, 마우스를 이식후 10일에 무작위화하였다. 대략 300 ㎣의 평균 종양 부피를 갖는, 연구 1에 마우스 72마리 및 연구 2에 마우스 81마리를 등록시켰다. 0째일에 투여 시작으로부터 매주 2회 디지털 캘리퍼스(digital caliper)에 의해 이차원으로 (L 및 W) 종양 이종이식편을 측정하였다. 종양 부피를 (L x W²)/2로서 계산하였다. 체중을 매주 2회 측정하고, 임상 관찰을 매일 기록하였다. 종양 부피 및 체중을 스터디디렉터(StudyDirector) 소프트웨어 (스터디로그(StudyLog), 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재)에 의해 포획하고 저장하였다. 다음 식을 사용하여 처리군/대조군 (T/C) 백분율 값을 계산하였다:

T/C ％ = 100 × ΔT/ΔC

상기 식에서,

T = 연구 최종일에 약물-처리군의 평균 종양 부피

ΔT = 연구 최종일에 약물-처리군의 평균 종양 부피 - 투여 최초일에 약물-처리군의 평균 종양 부피

C = 연구 최종일에 대조군의 평균 종양 부피; 및

ΔC = 연구 최종일에 대조군의 평균 종양 부피 - 투여 최초일에 대조군의 평균 종양 부피

모든 데이터를 평균 및 SEM으로 표시하였다. 일원 ANOVA 쌍별 분석을 사용하여 최종 종양 측정에 대한 군간 비교를 수행하였다. 순위에 대한 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 일원 ANOVA 및 다중 쌍별 비교를 위한 던 방법을 사용하여 유의성을 결정하였다. 시그마스타트(SigmaStat) (시스타트 소프트웨어 인크.(Systat Software Inc.), 미국 캘리포니아주 산호세 소재)를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다.

화합물 IIa의 항종양 활성을 SB-715992 및 파클리탁셀과 비교하기 위해 q4d x 3 스케쥴로 다중-용량 효능 연구를 수행하였다. 결과는 표 5에 나타낸다. 이 연구에서, 5 mg/kg 화합물 IIa 및 15 mg/kg SB-715992의 최대 용량으로 처리된 동물은 유의한 체중 손실로 인해 계획된 q4d x 3 스케쥴의 오직 처음 2개의 용량만을 투여받았으며, 이로부터 마우스는 회복되었다. 심지어 오직 두 용량에 의해서도, 유사한 방식의 유의한 종양 퇴행이 있었다 (73％ 퇴행, 각각에 대해 p<0.05). q4d x 3으로 제공된 2.5 및 1.25 mg/kg 화합물 IIa 및 7.5 mg/kg SB-715992의 더 낮은 두 용량도 또한 유사하게 HCT116 종양 이종이식편의 퇴행을 야기하였다 (각각 82％, 66％, 65％ 퇴행, p<0.05). 전체적으로, 파클리탁셀은 화합물 IIa보다 덜 효과적이었고; 종양은 초기에 퇴행하였으나, 투여 중단 후 성장이 곧 재개되었다.

q4d x 3 스케쥴로 1.25 mg/kg만큼 낮은 용량이 HCT116 이종이식편의 퇴행을 유도하였기 때문에, 2 내지 0.125 mg/kg의 용량 범위로 효능 연구를 반복하여, 용량 반응을 관찰하고, 종양 퇴행을 유도하기 위해 얼마나 낮은 용량이 제공될 수 있는가를 결정하였다. 표 6의 결과는 종양의 퇴행이 화합물 IIa의 1 mg/kg만큼 낮은 용량에서 관찰되었고 (46％ 퇴행, p<0.05, 17째일), 종양 정체가 투여 간격 도중 화합물 IIa의 0.25 mg/kg만큼 낮은 용량에서 관찰되었으나, 비히클 대조군과 비교하여 통계적 유의성에 도달하지 않았음을 나타낸다. 0.125 mg/kg에서의 화합물 IIa의 항종양 효과는 비히클 대조군과 유의하게 상이하지 않았다. SB-715992의 7.5 mg/kg 용량만이 종양 퇴행을 유도하였다. 또한, 마지막 용량 후 72시간에 혈액을 수집하여, 군 간의 순환 호중구 수준을 비교하였다. 종양 효능 효과와 유사한 용량 반응 방식으로 호중구가 감소되었다.

실시예 9 - HCT15 종양 이종이식편 모델에서 KSP 억제제의 효능

HCT15는 인간 선암종 세포주 (또한 P-gp 펌프를 발현하는 것으로 공지됨)이다. 그러므로, 실시예 10으로부터 결과를 입증하기 위해 이 세포주를 사용하여 이종이식편 종양 모델을 수행하였다.

대략 6 내지 8주령의 이계교배된 무흉선 nu/nu 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈)을 사용하여 실험을 수행하였다. 도착시, 개별 동물의 확인을 위해 동물에게 견갑하 영역에 피하 마이크로칩 이식물 (AVID, 미국 루이지애나주 폴솜 소재)을 이식하였다. 임의의 실험 과정을 시작하기 전에 1주 동안 동물을 익숙하게 되도록 두었다. 일상적인 동물 관리 및 복지 보증은 상기 기재된 바와 같았다.

인간 HCT15 결장 암종 세포를 미국 국립암연구소의 DCTD 종양 저장소 (카탈로그 # NCI 502711, 미국 메릴랜드주 락빌 소재)로부터 얻었다. 10％ 소 태아 혈청 (JRH 바이오사이언시스, 카탈로그 #12003-1000M)이 보충된 2 mM L-글루타민을 갖는 RPMI 1640 (메디아테크 인크., 카탈로그 #15-040-CV)에서 HCT15 세포를 성장시켰다. IMPACT1 PCR 검정 패널 (라딜, 미주리대학교, 미국 미주리주 콜럼비아 소재)에서 마이코플라스마 종 및 뮤린 바이러스가 없는가에 대해 세포를 시험하였다.

이들 세포를 접착성 배양물로서 성장시키고, 37℃에서 5％ 이산화탄소를 함유하는 가습 대기에서 유지하였다. 사용전 10회 미만의 경과 동안 세포를 배양하였다. 세포를 95％ 전면성장에서 수확하고, 약 800 x g에서 5분 동안 4℃에서 원심분리한 후, 피하 이식을 위해 (0.2 mL의 주사 부피) 5천만개 세포/mL의 농도로 1:1 비율의 HBSS (메디아테크 인크., 카탈로그 #21-021-CV) + 마트리겔™에서 재현탁하였다.

종양 세포 이식후 10일에, 종양이 대략 300 ㎣이 됐을 때 효능 연구를 위한 처리를 개시하였다. 정맥내로 (i.v.) 꼬리 정맥을 통해 8 mL/kg의 부피로 지시된 용량으로 화합물 IIa 및 SB-715992를 투여하였다. 복강내로 (i.p.) 16 mL/kg의 부피로 30 mg/kg으로 파클리탁셀을 투여하였다.

효능 연구를 위해, 마우스를 이식후 10일에 무작위화하고, 대략 300 ㎣의 평균 종양 부피를 갖는 마우스를 등록시켰다. 0째일에 투여 시작으로부터 매주 2회 디지털 캘리퍼스에 의해 이차원으로 (L 및 W) 종양 이종이식편을 측정하였다. 종양 부피를 (L x W²)/2로서 계산하였다. 체중을 매주 2회 측정하고, 임상 관찰을 매일 기록하였다. 종양 부피 및 체중을 스터디디렉터 소프트웨어 (스터디로그, 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재)에 의해 포획하고 저장하였다. 상기 기재된 바와 같이 데이터를 분석하였다.

표 7에 나타낸 결과는 화합물 IIa가 파클리탁셀보다 더 큰 항-HCT15 종양 효능을 나타내었고; 4 mg/kg 용량에서, T/C 백분율은 26％였다 (비히클과 비교하여 p <0.05, 및 파클리탁셀과 비교하여 유사함)는 것을 나타내었다. 데이터는 4 mg/kg KSP 억제제 및 7.5 및 15 mg/kg SB-715992 투여된 군 간의 분리를 나타내었으나, 이 모델에서 종양 부피의 가변성으로 인해 통계적 유의성은 달성되지 않았다. 10째일에, 4 mg/kg 화합물 IIa 및 7.5 mg/kg SB-715992 용량 간에 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었다 (p<0.05). P-gp에 대한 공지된 기질인 파클리탁셀은 이 모델에서 매우 낮은 항종양 활성을 가졌다. 유의한 체중 손실 또는 독성의 외적 징후가 어떠한 처리된 마우스에서도 관찰되지 않았다. HCT15 모델에서 증가된 항종양 활성은 P-gp를 높은 수준으로 발현하는 종양 이종이식편 모델에서의 화합물 IIa의 효능을 나타내었다.

실시예 10 - 급성 골수성 백혈병 (AML) 이종이식편 모델에서 KSP 억제제의 효능

무흉선 마우스에서 MV4;11 종양 이종이식편 모델 (O'Farrell, et al 2003)에 대한 화합물 IIa의 효능을 평가하였다. 효능을 먼저 마우스에서 피하 MV4;11 종양 이종이식편 모델에서 시험하였고, 또한 골수 미세환경이 AML 세포 성장 및 생존에서 중요한 역할을 담당하기 때문에, 마우스에서 MV4;11-luc 파종성 질병 모델에서 효능을 추가로 평가하였으며, 여기서 세포는 골수 및 몇몇 연질 장기를 향하고 여기에서 성장하였다. 종양 세포에 의한 루시페라제 발현으로 인해, 생체발광 영상화를 사용하여 백혈병 병소의 성장의 일련의 포괄적 모니터링을 결정하였다.

대략 6 내지 8주령의 이계교배된 무흉선 nu/nu 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 홀리스터 소재)를 사용하여 피하 종양 효능 연구를 수행하였다. 대략 7 내지 8주령의 면역결핍 NOD-SCID 암컷 마우스 (잭슨 래보러토리즈(Jackson Laboratories), 미국 메인주 바 하버 소재)를 사용하여 파종성 질병 모델에서 효능 연구를 수행하였다. 도착시, 개별 동물의 확인을 위해 동물에게 견갑하 영역에 피하 마이크로칩 이식물 (AVID, 미국 루이지애나주 폴솜 소재)을 이식하였다. 임의의 실험 과정을 시작하기 전에 1주 동안 동물을 익숙하게 되도록 두었다. 일상적인 동물 관리 및 복지 보증은 상기 기재된 바와 같았다.

인간 MV4;11 급성 골수성 백혈병 세포를 아메리칸 티슈 컬쳐 콜렉션 (카탈로그 # CRL-9591, 미국 메릴랜드주 락빌 소재)으로부터 얻고, IMPACT1 PCR 검정 패널 (라딜, 미주리대학교, 미국 미주리주 콜럼비아 소재)에서 마이코플라스마 종 및 뮤린 바이러스가 없는가에 대해 세포를 시험하였다. 파종성 질병 모델의 경우, 노파르티스 연구 재단의 게놈 연구소(Genomics Institute of the Novartis Research Foundation) (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에 있는 팡시안 선(Fangxian Sun)으로부터 루시페라제 유전자를 발현하는 MV4;11 세포의 안정한 풀을 받았다 (MV4;11-luc). MV4;11 세포를 10％ 소 태아 혈청 (JRH 바이오사이언시스, 카탈로그 #12003-1000M), 4 mM L-글루타민 및 5 ng/mL 재조합 인간 과립구 M-CSF (GM-CSF) (알앤디 시스템스, 카탈로그 #215-GM)가 보충된 이스코브 개질 둘베코 배지 (메디아테크 인크., 카탈로그 #15-016-CV)에서 성장시켰다. 루시페라제 발현의 선택을 위한 2 ㎍/mL 퓨로마이신의 첨가를 제외하고 동일한 배지에서 MV4;11-luc를 성장시켰다. 이들 세포를 현탁액 배양물로서 성장시키고, 37℃에서 5％ 이산화탄소를 함유하는 가습 대기에서 유지하였다. 사용전 10회 미만의 경과 동안 세포를 배양하였다. 세포를 대략 2백만개 세포/mL에서 수확하고, 약 800 x g에서 5분 동안 4℃에서 원심분리한 후, 피하 이식을 위해 (0.2 mL의 주사 부피) 2500만개 세포/mL (50％ 마트리겔™ 함유, BD 바이오사이언시스, 카탈로그 #354234)의 농도로 또는 꼬리 정맥을 통한 (0.1 mL의 주사 부피) 정맥내 (i.v.) 이식을 위해 1억개 세포/mL의 농도로 냉 HBSS (메디아테크 인크., 카탈로그 #21-021-CV)에서 재현탁하였다. 마우스를 정맥내 세포 이식 전날 3분 동안 3 그레이로 조사하였다.

화합물 IIa (유리 염기) 및 SB-715992 (유리 염기)를 8 mL/kg의 용량 부피에 대해 20％ 캡티솔에서 제제화하였다. 용량을 각 동물의 체중에 대해 조절하였다. 제형을 연구 시작시 1회 제조하고, 실온에서 저장하였다. 크레모포어-기재 비히클에 예비혼합된 임상 등급 파클리탁셀을 구입하고 (메인 파마, 현재 호스피라, 미국 일리노이주 레이크 포리스트 소재, 카탈로그 # NDC-6170334209), 멸균 염수에서 희석하여, i.p. 투여 30 mg/kg 용량에 대해 16 mL/kg의 용량 부피를 제공하였다.

피하 종양 모델에서 2개의 효능 평가를 위해, HBSS 및 마트리겔™의 1:1 혼합물에서 조합된 1천만개 세포를 0.2 mL/마우스의 총 부피로 우측 측복부에 피하로 주사하였다. 마우스를 이식후 17일에 무작위화하고, 대략 250 ㎣의 평균 종양 부피를 갖는 마우스들을 등록시켰다. 0째일에 투여 시작으로부터 매주 2회 디지털 캘리퍼스에 의해 이차원으로 (L 및 W) 종양 이종이식편을 측정하였다. 종양 부피를 (L x W²)/2로서 계산하였다. 체중을 매주 2회 측정하고, 임상 관찰을 매일 기록하였다. 종양 부피 및 체중을 스터디디렉터 소프트웨어 (스터디로그, 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재)에 의해 포획하고 저장하였다.

파종성 질병 모델에서 효능 평가를 위해, 0.1 mL HBSS 중 1천만개 세포의 꼬리 정맥 주사 전날 암컷 NOD-SCID 마우스를 3 그레이로 전신 조사하였다. 마우스 40마리를 무작위화하고, 이식후 연구 28째일에 대략 5 x 10⁷개 광자/초의 평균 광자 개수 (배부상 + 복부상) (생체발광 영상화에 의해 결정됨)를 갖는 마우스들을 등록시켰다. 영상화 대략 10분 전에, 마우스에게 150 mg/kg 루시페린 (제노겐 코포레이션(Xenogen Corporation), 미국 캘리포니아주 앨러미다 소재)을 i.p. 주사한 후, 이소플루란으로 마취하였다. IVIS 영상화 시스템 (제노겐 코포레이션)에서 전하 커플링 장치 카메라를 사용하여 광자 방출을 측정하였다. 간단히, 마우스의 그레이-스케일 영상을 포획한 후, 루시페라제를 발현하는 암 세포에서 절단된 루시페린으로부터 검출된 광자의 공간 분포를 나타내는 생체발광 지도를 겹치게 하였다. 리빙 이미지(Living Image) 버전 2.50.2 (제노겐)이라 불리는 IGOR 프로 버전 4.09A 소프트웨어 (웨이브메트릭스, 인크.(WaveMetrics, Inc.), 미국 오리건주 레이크 오스위고 소재)의 주문제작 버전을 사용하여 신호 세기를 정량하였다. 배부상 + 복부상으로부터의 모든 검출된 광자 개수의 합을 결정하였다. 첫번째 마우스가 질병 존재량으로 인해 뒷다리 마비를 발병할 때까지, 마우스를 인도적으로 안락사시키는 순간에 대한 주요 종말점까지, 지정된 일자에 동물에서 암 세포의 생체발광을 영상화에 의해 측정하였다. 각 마우스에 대한 안락사 일자를 기록하고, 생존한 마우스의 나머지 백분율을 시간에 따라 플롯팅하였다 (카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 분석). 로그-순위 시험 (그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 4.0 소프트웨어)을 사용하여 P 값을 계산하여, 처리군과 대조군 간에 차이를 평가하였다 (p < 0.05는 유의한 것으로 고려됨). 체중을 매주 2회 측정하고, 임상 관찰을 매일 기록하였다. 체중을 스터디디렉터 소프트웨어 (스터디로그, 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재)에 의해 포획하고 저장하였다. 상기 기재된 바와 같이 데이터를 분석하였다.

결과, 피하 종양 모델: q4d x 3 투여된 화합물 IIa의 일정 범위의 용량의 활성을 비교하기 위해 피하 종양 모델에서 효능 연구를 수행하였다. 제1 연구에서, nu/nu 마우스에서 최대 내성 용량을 평가하였다: 4 mg/kg 화합물 IIa, 15 mg/kg SB-715992 및 30 mg/kg 파클리탁셀. 종양을 갖는 나머지 마우스 4마리에게 KSP 억제제 0.625 mg/kg을 동일한 스케쥴로 투여하였다. 결과는 표 8에 나타낸다. 투여 간격 동안 모든 처리군에서 종양 퇴행이 관찰되었으며, 9/9, 6/9 및 7/9 마우스는 100일 초과 동안 고용량의 화합물 IIa, SB-715992 및 파클리탁셀 각각으로 처리된 군에서 완전한 종양 퇴행 (CR)을 지속하였다. 종양이 0.625 mg/kg 화합물 IIa 처리군에서 퇴행하였으나, 마지막 용량 후 대략 10일에 다시 성장하였다. 시험 작용제의 용량은 <10％ 최대 평균 체중 손실로 일반적으로 잘 관용되었으나, SB-715992 처리군에서 마우스 2마리는 >20％ 체중을 손실하였다.

q4d x 3 투여된 화합물 IIa의 일정 범위의 저용량의 활성을 비교하기 위해, 피하 종양 모델에서 제2 효능 연구를 수행하였다. 사용된 최대 용량은 누드 마우스에서 최대 내성 용량의 절반인 2 mg/mg이었다. 화합물 IIa의 활성을 최대 내성 용량의 절반인 7.5 mg/kg에서 SB-715992와 비교하였다. 결과는 표 9 및 도 2에 나타낸다. 0.5, 1 및 2 mg/kg 용량의 화합물 IIa 및 1.75, 3.5 및 7.5 mg/kg SB-715992에서 다양한 정도로 종양 퇴행이 관찰되었다. 마지막 용량후 5일 내에, 0.5 mg/kg 화합물 IIa 및 1.75 mg/kg SB-715992로 처리된 군에서 종양이 성장하기 시작하였다. 그 후, 투여후 30일 내에, 7.5 mg/kg SB-715992 처리군에서 종양이 성장하기 시작하였다. 1 및 2 mg/kg 용량의 화합물 IIa는 장기간 퇴행을 유발하였으며, 100일 초과 동안 각각 6 및 5 완전한 종양 퇴행을 유발하였다. 시험 작용제의 용량은 <10％ 최대 평균 체중 손실로 일반적으로 잘 관용되었다.

결과, 파종성 AML 질병 모델: 종양 세포가 정맥내로 이식된 MV4;11-luc의 파종성 AML 질병 모델에서 화합물 IIa의 활성을 평가하였다. 세포 이식후 28일에, 동물이 진행성 질병 단계에 있을 때 (광범위 생체발광 신호에 의해 나타냄), 치료 투여를 개시하였다. 결과는 표 10에 나타낸다. 초기 영상화에서, 생체발광 신호가 골 (하악골, 두개골, 척추 및 장골)에서 관찰되었으나, 또한 폐 및 간을 포함하는 신체 전반에 걸쳐 파종성 신호가 관찰되었다. 그러므로, 전신으로부터의 광자 방출을 후속적으로 기록하였다 (배부상 + 복부상). 이들 병소는 궁극적으로 종양 존재량으로 인해 부차적인 유의한 체중 손실과 함께 뒷다리 마비에 이르게 하였으며, 이 때 마우스를 희생시켰다. 이를 "조건부 생존"이라고 하였다.

제1 마우스가 연구 12째일 후 발생한 질병으로 쓰러질 때까지, 마우스에서 MV4;11-luc로부터의 광자 방출의 일련의 전신 모니터링을 수행하였다. q4d x 3 투여된 0.5 및 1 mg/kg 용량의 화합물 IIa는 비히클 처리군과 비교하여 생체발광 신호 (질병 존재량의 측정)를 유의하게 감소시켰으나 (p < 0.05), 0.25 mg/kg 처리 효과는 비히클의 효과와 유의하게 상이하지 않았다. 화합물 IIa는 이들 용량에서 잘 관용되었다. 화합물 IIa는 비히클-처리 코호트와 비교하여 세 용량 모두에서 뒷다리 마비의 유도를 유의하게 지연시키고, 마우스의 생존을 향상시켰다 (p < 0.05). 비히클-처리군에서 중위수 생존은 15일인 반면, 0.25, 0.5 및 1 mg/kg 화합물 IIa-처리군의 중위수 생존은 각각 27, 31 및 30일이었다. 투여 시간 동안 발생된 종양 존재량 (생체발광)의 초기 용량 의존적 감소는 생존의 용량 의존적 증가로 변역되지 않았다. 화합물 효과가 소멸하면 모든 군에서 질병이 신속하게 진행되는 것으로 나타났다.

실시예 11 - 인간 다발성 골수종 KMS-11-luc 종양 이종이식편에서 KSP 억제제의 효능의 평가

인간 다발성 골수종 KMS-11-luc 종양 이종이식편에 대한 화합물 IIa의 효능을 평가하였다. 이 세포주를 갖는 마우스에서 피하 종양 이종이식편 모델에서 효능을 먼저 시험하였으며, 여기서 화합물 IIa는 현저한 항종양 효과를 유도하였다. 골수 미세환경이 골수종 세포 성장 및 생존에서 중요한 역할을 담당하기 때문에, 마우스에서 MV4;11-luc 파종성 질병 모델에서 효능을 추가로 평가하였으며, 여기서 세포는 바람직하게는 골수의 동소 부위를 향하고 여기에서 성장하였다. 세포에서 루시페라제 리포터 유전자의 발현은 생체발광 영상화에 의한 골에서의 골수종 병소의 성장의 일련의 포괄적 모니터링을 허용하였다.

대략 7 내지 8주령의 면역결핍 SCID-베이지 암컷 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈, 미국 매사추세츠주 윌밍턴 소재)를 사용하여 실험을 수행하였다. 도착시, 개별 동물의 확인을 위해 동물에게 견갑하 영역에 피하 마이크로칩 이식물 (AVID, 미국 루이지애나주 폴솜 소재)을 이식하였다. 임의의 실험 과정을 시작하기 전에 1주 동안 동물을 익숙하게 되도록 두었다. 일상적인 동물 관리 및 복지 보증은 상기 기재된 바와 같았다.

인간 KMS-11-luc 다발성 골수종 세포를 토론토대학교 (캐나다 온타리오 소재)에 있는 수잔 트루델(Suzanne Trudel)의 실험실로부터 얻고, IMPACT1 PCR 검정 패널 (라딜, 미주리대학교, 미국 미주리주 콜럼비아 소재)에서 마이코플라스마 종 및 뮤린 바이러스가 없는가에 대해 세포를 시험하였다. 이 세포주를 받기 전에, pGC-gfp/luc 벡터의 레트로바이러스 형질감염에 의해 루시페라제를 발현하도록 안정하게 조작하였다. KMS-11-luc 세포를 2 mmol/L L-글루타민 (메디아테크 인크., 미국 버지니아주 헌던 소재) 및 10％ 소 태아 혈청 (JRH 바이오사이언시스, 카탈로그 #12003-1000M)이 보충된 이스코브 배지에서 성장시켰다. 이들 세포를 현탁액 배양물로서 성장시키고, 37℃에서 5％ 이산화탄소를 함유하는 가습 대기에서 유지하였다. 사용전 10회 미만의 경과 동안 세포를 배양하였다. 세포를 대략 2백만개 세포/mL에서 수확하고, 약 800 x g에서 5분 동안 4℃에서 원심분리한 후, 피하 이식을 위해 (0.2 mL의 주사 부피) 5천만개 세포/mL의 농도로 냉 행크 균형 염 용액 (HBSS) 및 마트리겔™ (각각 메디아테크 인크., 카탈로그 #21-021-CV; BD 바이오사이언시스, 카탈로그 #354234)의 1:1 혼합물에서 재현탁하였다. 별법으로, 파종성 질병 모델의 경우, 세포를 꼬리 정맥을 통한 (0.1 mL의 주사 부피) 정맥내 (i.v.) 이식을 위해 1억개 세포/mL의 농도로 오직 냉 HBSS에서 제조하였다.

화합물 IIa 및 SB-715992 (유리 염기)를 8 mL/kg의 용량 부피에 대해 20％ 캡티솔에서 제제화하였다. 용량을 각 동물의 체중에 대해 조절하였다. 제형을 연구 시작시 1회 제조하고, 실온에서 저장하였다. 크레모포어-기재 비히클에 예비혼합된 임상 등급 파클리탁셀을 구입하고 (메인 파마, 현재 호스피라, 미국 일리노이주 레이크 포리스트 소재, 카탈로그 # NDC-6170334209), 멸균 염수에서 희석하여, i.p. 투여 30 mg/kg 용량에 대해 16 mL/kg의 용량 부피를 제공하였다.

피하 종양 모델에서 효능 평가를 위해, HBSS 및 마트리겔™의 1:1 혼합물에서 조합된 1천만개 세포를 200 mL/마우스의 총 부피로 우측 측복부에 피하로 주사하였다. 마우스를 이식후 11일에 무작위화하고, 대략 140 ㎣의 평균 종양 부피를 갖는 마우스 54마리를 등록시켰다. 0째일에 투여 시작으로부터 매주 2회 디지털 캘리퍼스에 의해 이차원으로 (L 및 W) 종양 이종이식편을 측정하였다. 종양 부피를 (L x W²)/2로서 계산하였다. 체중을 매주 2회 측정하고, 임상 관찰을 매일 기록하였다. 종양 부피 및 체중을 스터디디렉터 소프트웨어 (스터디로그, 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재)에 의해 포획하고 저장하였다. 데이터 분석은 상기 기재된 바와 같았다.

파종성 질병 모델에서 효능 평가를 위해, HBSS 중 1천만개 세포를 100 mL/마우스의 총 부피로 정맥내로 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 마우스 40마리를 무작위화하고, 이식후 연구 10째일에 대략 9 x 10⁵개 광자/초의 다리뼈 (오른쪽 + 왼쪽)에서의 평균 광자 개수 (생체발광 영상화에 의해 결정됨)를 갖는 마우스를 등록시켰다. 영상화 대략 10분 전에, 마우스에게 150 mg/kg 루시페린 (제노겐 코포레이션, 미국 캘리포니아주 앨러미다 소재)을 i.p. 주사한 후, 이소플루란으로 마취하였다. IVIS 영상화 시스템 (제노겐 코포레이션)에서 전하 커플링 장치 카메라를 사용하여 광자 방출을 측정하였다. 간단히, 마우스의 그레이-스케일 영상을 포획한 후, 루시페라제를 발현하는 암 세포에서 절단된 루시페린으로부터 검출된 광자의 공간 분포를 나타내는 생체발광 지도를 겹치게 하였다. 리빙 이미지 버전 2.50.2 (제노겐)이라 불리는 IGOR 프로 버전 4.09A 소프트웨어 (웨이브메트릭스, 인크., 미국 오리건주 레이크 오스위고 소재)의 주문제작 버전을 사용하여 신호 세기를 정량하였다. 오른쪽 + 왼쪽 다리로부터의 모든 검출된 광자 개수의 합을 결정하였다. 첫번째 마우스가 질병 존재량으로 인해 뒷다리 마비를 발병할 때까지, 마우스를 인도적으로 안락사시키는 순간에 대한 주요 종말점까지, 지정된 일자에 동물에서 암 세포의 생체발광을 영상화에 의해 측정하였다. 각 마우스에 대한 안락사 일자를 기록하고, 생존한 마우스의 나머지 백분율을 시간에 따라 플롯팅하였다 (카플란-마이어 생존 분석). 로그-순위 시험 (그래프패드 프리즘 4.0 소프트웨어)을 사용하여 P 값을 계산하여, 처리군과 대조군 간의 차이를 평가하였다 (p < 0.05는 유의한 것으로 고려됨). 체중을 매주 2회 측정하고, 임상 관찰을 매일 기록하였다. 체중을 스터디디렉터 소프트웨어 (스터디로그, 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재)에 의해 포획하고 저장하였다. 데이터 분석은 상기 기재된 바와 같았다.

결과, 피하 KMS-11-luc 종양 이종이식편 모델: 피하 종양 모델에서 효능 연구는 q4d x 3 스케쥴로 투여된 화합물 IIa의 일정 범위의 용량의 활성을 평가하였으며, 여기서 1 mg/mg의 고용량은 SCID-Bg 마우스에서 최대 내성 용량의 대략 절반이었다. 화합물 IIa 활성을 SB-715992 (이스피네십, 임상 시험 중인 사이토키네틱스에 의한 KSP 억제제) (7.5 mg/kg의 최대 내성 용량의 절반에서) 및 파클리탁셀 (q4d x 3 30 mg/kg의 최대 내성 용량에서)과 비교하였다. 결과는 표 11에 나타낸다. 투여 간격 동안 모든 처리군에서 종양 퇴행이 다양한 정도로 관찰되었으나; 투여 종료후 종양 성장이 재개되었다. 종양은 더 낮은 용량의 화합물 IIa로 처리된 마우스에서 더 일찍 재성장하기 시작하였고, 더 신속하게 진행되었다. 치료 종료 후 8일 내에, 파클리탁셀 및 0.25 mg/kg 화합물 IIa로 처리된 군에서 종양 재성장이 관찰되었다. 처리후 13일 내에, 0.5 mg/kg 화합물 IIa로 처리된 군에서 종양 재성장이 관찰되었다. 1 mg/kg 화합물 IIa 및 7.5 mg/kg SB-715992의 투여는 각각 56％ 및 49％만큼 KMS-11-luc 종양의 최대 퇴행을 야기하였고 (p < 0.05), 치료 종료후 대략 4주까지 종양 재성장은 발생하지 않았다. 시험 작용제의 용량은 <10％ 최대 평균 체중 손실로 일반적으로 잘 관용되었으나, 예외적으로 1 mg/kg 용량의 화합물 IIa는 투여 개시후 10일에 12％ 평균 체중 손실을 야기하였다. 이 군의 마우스 1마리는 20％ 체중을 손실하였고, 이를 연구에서 제거하였다. 상기 군의 모든 다른 마우스는 마지막 투여후 임의의 체중 손실에서 회복되었다.

파종성 KMS-11-luc 종양 모델의 결과: 세포 이식후 10일에 약물 처리를 개시하였다. 생체발광 영상화는 비히클-처리군에서 시간에 따른 신호 증가를 나타내었으며, 이는 폐, 간 및 비장을 포함하는 골격외 영역에서의 국소화를 제안하였다. 그러나, 우세한 생체발광 신호는 대부분의 마우스에서 다중 신호 공급원을 갖는 골격, 예를 들어 장골, 두개골, 치근/하악골, 골반 및 척추인 것으로 보였다. 이 모델에 의한 이전 연구로부터 수집된 대퇴골의 조직학적 분석은 골수로의 골수종 세포 침윤을 확인하였다 (문헌 [Xin, et al 2006 Clin. Cancer Res. Aug 15;12(16):4908-15]). 질병 진행은 주로 종양 존재량으로 인해 부차적인 유의한 체중 손실과 함께 뒷다리 마비에 이르게 하였으며, 이 때 마우스를 인도적으로 안락사시켰다. 이를 "조건부 생존"이라고 하였다.

결과는 표 12에 나타낸다. q4d x 3 투여된 0.5 및 1 mg/kg 용량의 화합물 IIa는 전체 질병 존재량의 측정치인 생체발광 신호를 유의하게 감소시켰으나, 0.25 mg/kg 처리군은 비히클 처리군과 통계적으로 상이하지 않았다. 1 mg/kg 용량으로 처리된 마우스의 13째일에 신호의 47％ 백분율 퇴행은 이 군의 마우스 1마리에서 13째일 내의 > 20％ 체중 손실과 동반되었다. 상기 군의 모든 다른 동물은 이 용량을 관용하였다. 더 낮은 용량에서, 화합물 IIa는 잘 관용되었다.

질병 존재량의 이 용량 의존적 억제 (생체발광에 의해 측정됨)는 뒷다리 마비에서 유사한 지연을 초래하였고, 그러므로 모든 군의 비히클-처리 코호트과 비교하여 마우스의 조건부 생존을 향상시켰다. 비히클-처리군에서 중위수 생존은 19일인 반면, 0.25, 0.5 및 1 mg/kg 화합물 IIa-처리군의 중위수 생존은 각각 29, 35 및 52일이었다.

실시예 12: 화학식 II의 화합물은 약제-내성 종양에 대해 효과적이었다.

전임상 생체내 실험은 화학식 II의 화합물이 예상밖으로 아실 부분에 히드록실기 또는 히드록실 전구약물 기를 갖지 않는 구조적으로 유사한 화합물보다 우수하다는 것을 나타내었다. 화학식 II의 화합물 및 다른 약물, 예를 들어 화학식 II의 화합물에 존재하는 히드록실기 (또는 아실옥시기)가 없는 구조적으로 유사한 화합물에 대한 민감도에 대해, 원형질막 P-당단백질 (P-gp)인 유출 펌프를 발현하는 종양 모델을 시험하였다. P-gp는 종양 내성의 한 메카니즘이고, 아마도 유출 내성 메카니즘의 가장 잘 이해되고 가장 전통적인 예일 것이다. 이들 화합물의 약물학적 스크리닝 및 후속적인 선택 및 평가를 위해 마우스에서 KB8.5 인간 자궁경부 암종 피하 이종이식편 모델을 선택하였고; 이는 KB3.1 세포주에 상응하고, 유출 펌프을 갖는다는 것만이 상이하였다. 화학식 II의 화합물을 다른 KSP 억제제 뿐만 아니라 파클리탁셀 (P-gp에 의해 영향을 받는 것으로 공지됨)과 비교하였다. 본원에 기재된 연구는 화학식 II의 화합물 (예를 들어, 화합물 IIa 및 IIc)이 P-gp를 발현하고 다른 약물에 대해 내성인 종양에 대해 생체내에서 효능있는 것으로 나타내었으나, 히드록실기가 없는 유사한 화학식 I의 화합물은 이 종양에 대해 활성이 없었다.

물질

대략 6 내지 8주령의 이계교배된 무흉선 nu/nu 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈)를 사용하여 실험을 수행하였다. 도착시, 개별 동물의 확인을 위해 동물에게 견갑하 영역에 피하 마이크로칩 이식물 (AVID, 미국 루이지애나주 폴솜 소재)을 이식하였다. 임의의 실험 과정을 시작하기 전에 1주 동안 동물을 익숙하게 되도록 두었다.

유지 조건

12-시간 명, 12-시간 암 주기로 70 내지 80 화씨도의 온도 및 30 내지 70％ 상대 습도에서 투명한 폴리카르보네이트 마이크로-분리기 우리에서 우리 당 마우스 4 내지 5마리를 가두었다. 사료 (퓨리나 설치류 먹이 펠렛) 및 물을 자유롭게 제공하였다.

실험 조건

10％ 소 태아 혈청 (JRH 바이오사이언시스, 카탈로그 #12003-1000M)이 보충된 2 mM L-글루타민 (메디아테크 인크., 카탈로그 #10-013-CV)을 갖는 DMEM에서 KB8.5 세포를 성장시켰다. KB8.5 세포가 양호한 성장 속도를 나타내면, P-gp 발현 수준을 유지하기 위해 10 ng/ml 콜히친을 첨가하였다.

이들 세포를 접착성 배양물로서 성장시키고, 37℃에서 5％ 이산화탄소를 함유하는 가습 대기에서 유지하였다. 사용전 10회 미만의 경과 동안 세포를 배양하였다. 세포를 95％ 전면성장에서 수확하고, 약 800 x g에서 5분 동안 4℃에서 원심분리한 후, 피하 이식을 위해 (0.2 mL의 주사 부피) KB8.5 세포주에 대해 2500만개 세포/mL의 농도로 1:1 비율의 HBSS (메디아테크 인크., 카탈로그 #21-021-CV) + 마트리겔™에서 재현탁하였다.

화합물 및 제형

화합물 IIa, 화합물 IIc, 화합물 Ia (하기 나타냄) 및 SB-715992를 캡티솔®-기재 제형으로 제제화하였다. 용량을 정맥내로 (i.v.) 투여하고, 각 동물의 체중에 대해 조절하였다. 제형을 연구 시작시 1회 제조하고, 실온에서 저장하였다. 크레모포어-기재 비히클에 예비혼합된 임상 등급 파클리탁셀을 구입하고 (메인 파마, 현재 호스피라, 미국 일리노이주 레이크 포리스트 소재, 카탈로그 # NDC-6170334209), 멸균 염수에서 희석하여, 복강내 (i.p.) 투여 30 mg/kg 용량에 대해 16 mL/kg의 용량 부피를 제공하였다.

<화학식 Ia>

화합물 Ia는 화학식 II의 화합물과 구조적으로 유사하나, 히드록시기 또는 아실옥시기가 아닌 메톡시기를 갖고, KSP에 대한 시험관내 활성은 화합물 IIa 및 IIc의 활성과 매우 유사하다. 예를 들어, 셀타이터-글로® 검정에서, HCT-15 세포에서의 화합물 Ia에 대해 측정된 GI50 값은 0.3 nM이었고, 이는 화합물 IIa와 등가이다 (실시예 2 참조). 유사하게, KB3.1 및 KB8.5 세포주의 경우 화합물 Ia에 대해 0.4 nM의 값이 측정되었으나, 이들 동일한 세포주의 경우 화합물 IIa에 대해 0.6 nM 및 0.5 nM의 값이 측정되었다 (실시예 2 참조). 그러나, 화학식 II의 화합물은 아실기 (또는 유리 히드록실에 대한 전구약물인 아실옥시기) 상에 유리 히드록실을 갖는 반면, 화학식 Ia의 화합물은 대신에 메틸 에테르를 갖는다. 메틸 에테르는 활성 부위에 의해 잘 관용되고 (시험관내 활성에 의해 나타냄), 특히 시험관내에서 p-GP 내성 세포주에 대해 또한 매우 효과적이다. 또한, 이는 생체내에서 화학식 II의 화합물보다 대사 비활성화에 대해 덜 감수성인 것으로 기대될 수 있었다. 사실, 하기 표의 데이터가 예시하는 바와 같이, 약동학 파라미터의 비교는 화합물 Ia가 화학식 IIa 및 IIc의 화합물보다 생체내에서 더 높은 노출 및 증가된 대사 안정성을 나타낸다는 것을 나타내었다. 놀랍게도, P-gp 내성 이종이식편 암이 화학식 II의 화합물에 대해서는 민감하나 화합물 Ia에 대해서는 민감하지 않기 때문에, 화학식 II의 화합물은 P-gp를 발현하는 암에 대해 선행기술에 공지된 화합물과 비교하여 생체내에서 이롭다.

흥미롭게도, 화학식 II의 화합물은 또한 히드록실이 완전히 결핍된 화합물, 예를 들어 하기 화학식 Ib의 화합물보다 유의하게 더 효능있는 것으로 밝혀졌다.

<화학식 Ib>

화합물 Ib는 화합물 IIa 및 IIc (각각 1 nm 미만의 IC-50을 가짐)와 비교하여 22 nm의 IC-50을 갖는 화학식 II의 화합물보다 시험관내에서 훨씬 덜 활성이다. 화합물 Ib는 이종이식편 모델에서 시험하지 않았으며, 이는 그의 약동학 및 시험관내 활성이 생체내 효능을 기대하기에 너무 바람직하지 않았기 때문이다. 이는 더 높은 청소율 및 더 낮은 AUC ("곡선하면적", 화합물에 대한 시험 대상체의 생체내 노출을 측정하는 표준 방법)을 나타내었음을 나타내는 데이터를 기초로 하여 훨씬 더 낮은 생체내 이용율을 갖는 것으로 나타났고, 또한 표적 부위에서 훨씬 덜 활성이었다 (더 높은 IC-50에 의해 나타냄). 비교하여, 화합물 Ia, IIa 및 IIc는 각각 생체내에서 더 양호한 약동학 효과 뿐만 아니라 우수한 시험관내 활성를 나타내었고, 이것들을 이종이식편 암에서 시험하였다.

그러므로, 화학식 II의 화합물은 화합물 Ib보다 시험관내에서 더 효과적이고, 생체내에서 더 지속적이고, 예상밖으로 다약제 내성 (MDR) 유출 펌프를 발현하는 약제-내성 암에 대해 효과적인 것으로 나타났으나, 화합물 Ia는 시험관내에서 p-GP 세포주에 대해 동일한 효력 및 시험 동물에서 더 높은 이용율 (더 낮은 청소율 및 더 높은 AUC)에도 불구하고 동일한 MDR 암에 대해 비효과적이었다.

연구 방법

효능 연구를 위해, 대략 300 ㎣의 평균 종양 부피를 갖는 마우스들을 등록시켰다. 0째일에 투여 시작으로부터 매주 2회 디지털 캘리퍼스에 의해 이차원으로 (L 및 W) 종양 이종이식편을 측정하였다. 종양 부피를 (L x W²)/2로서 계산하였다. 체중을 매주 2회 측정하고, 임상 관찰을 매일 기록하였다. 종양 부피 및 체중을 스터디디렉터 소프트웨어 (스터디로그, 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재)에 의해 포획하고 저장하였다.

데이터 분석

다음 수학식을 사용하여 종양 부피에 대한 처리군/대조군 (ΔT/ΔC) 백분율 값을 계산하였다:

ΔT/ΔC ％ = 100 x ΔT/ΔC

상기 식에서,

T = 연구 최종일에 약물-처리군의 평균 종양 부피;

ΔT = 연구 최종일에 약물-처리군의 평균 종양 부피 - 투여 최초일에 약물-처리군의 평균 종양 부피;

C = 연구 최종일에 대조군의 평균 종양 부피; 및

ΔC = 연구 최종일에 대조군의 평균 종양 부피 - 투여 최초일에 대조군의 평균 종양 부피.

모든 데이터를 평균 및 SEM으로서 표시하였다. 일원 ANOVA 쌍별 분석을 사용하여 최종 종양 측정에 대한 군간 비교를 수행하였다. 순위에 대한 크루스칼-왈리스 일원 ANOVA, 이어서 다중 쌍별 비교를 위한 적절한 사후 시험 (던 방법 또는 투키 시험)을 사용하여 유의성을 결정하였다. 시그마스타트 (시스타트 소프트웨어 인크., 미국 캘리포니아주 산호세 소재)를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다.

P-gp 발현 이종이식편 모델에서 효능 평가

이들 모델에서 화합물 IIa 및 화합물 Ia의 활성을 비교하기 위해 동일한 5 mg/kg 용량에서 q4d x 3 스케쥴로 다중-용량 효능 연구를 수행하였다. 화합물 IIc의 경우, 2.5 mg/kg는 잘 관용되지 않았고, 그러므로 효능 비교는 1.25 mg/kg의 용량 수준까지였다. 도 3 및 표 13의 결과는 화합물 IIa가 상기 모델에서 유의한 항종양 효능을 나타내었음을 나타낸다 (11째일에 KB8.5 이종이식편 모델에서 19％의 ΔT/ΔC 백분율 (p < 0.05)).

암컷 nu/nu 마우스 (찰스 리버)에서 마우스의 우측 측복부로의 1:1 비율의 HBSS + 마트리겔™ 0.2 mL 중 5 x 10⁶개 세포의 피하 주사에 의해 KB8.5 세포를 확립하였다. 종양이 대략 300 ㎣에 도달하였을 때, 마우스를 종양 부피에 따라 처리군 (n=9)으로 무작위화하였다. 화합물을 지정된 용량 수준 및 스케쥴로 투여하였다. 종양 부피 및 체중에 대한 치료 효과는 평균 ± SEM으로서 나타낸다. 처리 11째일에 실험을 평가하였다. *p<0.05 대 비히클 및 SB-715992 (순위에 대한 크루스칼-왈리스 일원 ANOVA/던 방법).

마찬가지로, 도 4 및 표 14의 결과는 화합물 IIc가 이 모델에서 유의한 항종양 효능을 나타내었음을 나타낸다 (11째일에 39％의 ΔT/ΔC 백분율 (p < 0.05)).

암컷 nu/nu 마우스 (찰스 리버)에서 마우스의 우측 측복부로의 1:1 비율의 HBSS + 마트리겔™ 0.2 mL 중 5 x 10⁶개 세포의 피하 주사에 의해 KB8.5 세포를 확립하였다. 종양이 평균 339 ㎣에 도달하였을 때, 마우스를 종양 부피에 따라 처리군 (n=9)으로 무작위화하였다. 화합물을 지정된 용량 수준 및 스케쥴로 투여하였다. 종양 부피 및 체중에 대한 치료 효과는 평균 ± SEM으로서 나타낸다. 처리 11째일에 실험을 평가하였다. *p<0.05 대 비히클 (순위에 대한 크루스칼-왈리스 일원 ANOVA/투키 시험).

대조적으로, 아실 부분에 히드록실을 갖지 않고 대신에 메톡시를 갖는 유사한 화합물인 화합물 Ia는 도 5 및 표 15에 나타낸 바와 같이 KB8.5 종양 이종이식편 모델에서 효능이 없었다.

암컷 nu/nu 마우스 (찰스 리버)에서 마우스의 우측 측복부로의 1:1 비율의 HBSS + 마트리겔™ 0.2 mL 중 5 x 10⁶개 세포의 피하 주사에 의해 KB8.5 세포를 확립하였다. 종양이 285 ㎣에 도달하였을 때, 마우스를 종양 부피에 따라 처리군 (n=10)으로 무작위화하였다. 화합물을 지정된 용량 수준 및 스케쥴로 투여하였다. 종양 부피 및 체중에 대한 치료 효과는 평균 ± SEM으로서 나타낸다. 처리 11째일에 실험을 평가하였다. 비히클 군과 통계적으로 상이한 군은 없었다 (순위에 대한 크루스칼-왈리스 일원 ANOVA).

2.5 mg/kg 화합물 IIc 처리군에서의 유의한 체중 손실을 제외하고, 유의한 체중 손실 또는 독성의 외적 징후가 어떠한 처리된 마우스에서도 관찰되지 않았다. P-gp 양성 KB8.5 모델에서 보여진 증가된 항종양 활성은 화학식 II의 화합물을 특징화하는 히드록실 관능성이 없는 유사한 화학식 I의 화합물보다 우수하게 화학식 II의 화합물의 예상밖의 장점을 나타내었다.

실시예 13: 화학식 II의 화합물은 많은 종양 외식물(explant)에 대해 효과적이었다.

문헌 [Fiebig, H.H., Maier,A., and Burger,A.M. (Clonogenic assay with established human tumour xenografts: correlation of in vitro to in vivo activity as a basis for anticancer drug discovery, Eur. J. Cancer 40, 802-820 (2004))]에 기재된 바와 같은 연질 한천 검정에서 세포주 및 종양 외식물의 패널에 대해 화합물 IIa를 시험하였다. 표 16에는 암의 유형, 샘플의 명칭, 검정에서 그의 GI₅₀ (50％ 성장 억제를 달성하는데 필요한 농도) 값, GI₅₀의 로그 (Log(GI₅₀)) 및 샘플 각각의 상대 민감도 (시차)가 나열되어 있다. 전체 패널에 걸쳐 평균 Log(GI₅₀)으로부터 세포주 각각에 대한 Log(GI₅₀)을 공제함으로써 시차를 계산하였고 (이 경우에 0.236); 양의 값은 평균보다 더 민감한 샘플을 나타내는 반면, 음의 값은 평균보다 덜 민감한 샘플을 나타내었다.

대부분의 표시는 민감한 샘플을 가졌다. 이 검정을 기준으로 가장 민감한 암은 혈액계 암 (백혈병 및 림프종, 5/5), 소세포 폐암 (SCLC; 5/5), 유방 (7/10), 방광 (4/6) 및 육종 (4/7)이었다.

실시예 14: 화학식 II의 화합물은 많은 고형 종양 세포주에 대해 효과적이었다.

본원에 기재된 바와 같이 고형 종양으로부터 유래된 세포주의 패널에 대해 화합물 IIa를 시험하였다. 또한 문헌 [McDermott, U., Sharma, S.V., Dowell, L., Greninger, P., Montagut, C., Lamb, J., Archibald, H., Raudales, R., Tam, A., Lee, D., Rothenberg, S.M., Supko, J.G., Sordella, R., Ulkus, L.E., Iafrate, A.J., Maheswaran, S., Njauw, C.N., Tsao, H., Drew, L., Hanke, J.H., Ma, X.J., Erlander, M.G., Gray N.S., Haber, D.A., and Settleman, J. (2007), Identification of genotype-correlated sensitivity to selective kinase inhibitors by using high-throughput tumor cell line profiling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 104, 19936-19941 (2007)]을 참조한다. 세포를 72시간 동안 화합물로 처리하고, 처리되지 않은 대조군과 비교하여 생존하는 세포의 비율을 보고하였다. 표 17에는 세포주의 명칭, 기원 장기, 시험된 세 농도 (0.2 nM, 2.0 nM 및 20 nM)에서 생존한 세포의 비율 및 민감도 점수가 나열되어 있다. 민감도 점수는 5 (최대 민감성)로부터 1 (최소 민감성)까지였고, 점수화는 다음과 같았다: 5 = 0.2 nM에서 생존한 비율 ≤ 0.2; 4 = 0.2 nM에서 0.2 < 생존한 비율 ≤ 0.5; 3 = 0.2 nM에서 생존한 비율 > 0.5 및 2.0 nM에서 ≤ 0.5; 2 = 2.0 nM에서 생존한 비율 > 0.5 및 20 nM에서 ≤ 0.5; 1 = 20 nM에서 생존한 비율 > 0.5.

모든 표시는 민감한 샘플을 가졌다. 이들 암을 민감도에 대해 순서 등급매기는 많은 가능한 방법 중 하나는 표시 각각에 대한 평균 민감도 점수를 계산하는 것이었다 (민감도 점수의 합/샘플의 수). 3 이상의 평균 점수를 사용하는 매우 엄격한 기준을 취한 경우, 이 검정을 기초로 하여 가장 민감한 암은 난소 (3.38), 위 (3.32), 뇌 (3.21), 피부 (3.02), 자궁경부 (3.00) 및 갑상선 (3.00)이었다.

화합물의 존재하에 48시간 후 판독기로서 셀타이터-글로®를 사용하여 세포 생존 검정에서 혈액계 악성종양으로부터 유래된 세포주의 패널에 대해 화합물 IIa를 시험하였다. 표 18에는 혈액계 악성종양의 유형, 샘플의 명칭, 검정에서 그의 GI₅₀ (50％ 성장 억제를 달성하는데 필요한 농도) 값, GI₅₀의 로그 (Log(GI₅₀)) 및 샘플 각각의 상대 민감도 (시차)가 나열되어 있다. 전체 패널에 걸쳐 평균 Log(GI₅₀)으로부터 세포주 각각에 대한 Log(GI₅₀)을 공제함으로써 시차를 계산하였고 (이 경우에 0.236); 양의 값은 평균보다 더 민감한 샘플을 나타내는 반면, 음의 값은 평균보다 덜 민감한 샘플을 나타내었다.

민감한 혈액계 악성종양은 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 다발성 골수종 (MM), 비-호지킨 림프종 (NHL) 및 호지킨 림프종 (HL)이었다.

Claims

포유동물에게 치료 유효량의 화학식 I의 화합물, 상기 화합물의 호변이성질체, 상기 화합물의 제약상 허용되는 염, 상기 호변이성질체의 제약상 허용되는 염 또는 이들의 혼합물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 고형 종양 또는 혈액계 암에서 선택된 증식성 질병의 치료 방법.
<화학식 I>

상기 식에서,
R¹은 아미노아실, 아실아미노, 카르복실, 카르복실 에스테르, 아릴, 및 히드록시 또는 할로로 임의로 치환된 알킬로 구성된 군에서 선택되고;
R²는 수소, 알킬 및 아릴로 구성된 군에서 선택되고;
R^a는 L-A¹이고;
L은 -S(O)_q- (여기서, q는 1 또는 2임), 및 히드록시, 할로 또는 아실아미노로 임의로 치환된 C₁ 내지 C₅ 알킬렌으로 구성된 군에서 선택되고;
A¹은 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭, 치환된 헤테로시클릭, 시클로알킬 및 치환된 시클로알킬로 구성된 군에서 선택되고;
R⁶은 헤테로시클릭, 아릴 및 헤테로아릴로 구성된 군에서 선택되며, 이들 모두는 -(R⁸)_m (여기서, R⁸은 하기 정의된 바와 같고, m은 1 내지 3의 정수임)으로 임의로 치환될 수 있고;
R⁸은 시아노, 알킬, 알케닐, 알키닐, -CF₃, 알콕시, 할로 및 히드록시로 구성된 군에서 선택되나; 단, m이 2 또는 3인 경우, R⁸은 각각 동일하거나 상이할 수 있고;
R^b는 R⁴ 또는 R⁵이고;
R⁴는 수소, 선형 알킬, -알킬렌-아미노아실, -알킬렌-옥시아실, -알킬렌-아실옥시, -알킬렌-히드록시, -[알킬렌]_p-질소-함유 헤테로시클릭, -[알킬렌]_p-질소-함유 치환된 헤테로시클릭, -[알킬렌]_p-질소-함유 헤테로아릴, -[알킬렌]_p-질소-함유 치환된 헤테로아릴 및 -[알킬렌]_p-NR¹⁰R¹¹ (여기서, p는 0 또는 1임)로 구성된 군에서 선택되고, R⁴ 알킬렌은 아미노, 치환된 아미노, 히드록시, 알킬, 치환된 알킬, 카르복실, 카르복실 에스테르, 옥소, 스피로시클로알킬 및 할로로 구성된 군에서 선택된 상기 치환기 중 하나로 임의로 일치환 또는 이치환된 직쇄 알킬렌이고;
R¹⁰ 및 R¹¹은 수소, 알킬, 치환된 알킬, -S(O)-알킬, -S(O)-치환된 알킬, -S(O)₂-알킬, -S(O)₂-치환된 알킬, 헤테로시클릭, 치환된 헤테로시클릭, 아실, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 시클로알킬 및 치환된 시클로알킬로 구성된 군에서 독립적으로 선택되거나, 또는 R¹⁰이 수소인 경우, R¹¹은 히드록시, 알콕시 또는 치환된 알콕시이고;
R⁵는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 헤테로시클릭, 치환된 헤테로시클릭, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴 및 치환된 헤테로아릴로 구성된 군에서 선택되고;
R^c는 R³ 및 -C(O)-N(R¹³)(R¹⁴)로 구성된 군에서 선택되고;
R³은 수소 및 -X-A로 구성된 군에서 선택되며, 여기서 X는 -C(O)-, -C(S)-, -S(O)-, -S(O)₂- 및 -S(O)₂-N(R)-로 구성된 군에서 선택되며, 여기서 R은 수소 또는 알킬이고;
A는 수소, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알콕시, 임의로 치환된 아릴, 카르복실, 카르복실 에스테르, 아미노아실, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 헤테로시클릭 및 임의로 치환된 시클로알킬로 구성된 군에서 선택되며, 여기서 임의로 치환된 기는 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 아릴옥시, 치환된 아릴옥시, 시아노, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭, 치환된 헤테로시클릭, 헤테로시클릴옥시, 치환된 헤테로시클릴옥시, 아실, 카르복실, 카르복실 에스테르, 옥소 (A가 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴인 경우 제외), 할로, 히드록시, -S(O)₂-R⁹ (여기서, R⁹는 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴임) 및 니트로로 구성된 군에서 선택된 1 내지 4개의 치환기로 치환되고;
R¹³ 및 R¹⁴는 수소, 히드록시, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭 및 치환된 헤테로시클릭으로 구성된 군에서 독립적으로 선택되나, 단 R¹³ 또는 R¹⁴ 중 하나만이 히드록시이거나; 또는 R¹³ 및 R¹⁴는 이에 결합된 질소 원자와 함께 결합하여 헤테로시클릭 또는 치환된 헤테로시클릭을 형성한다.
제1항에 있어서, 상기 증식성 질병이 폐 암종, 유방 암종, 난소 암종, 피부 암종, 결장 암종, 방광 암종, 간 암종, 위 암종, 전립선암, 신장 세포 암종, 비인두 암종, 편평 세포 암종, 갑상선 유두 암종, 자궁경부 암종, 소세포 폐 암종 (SCLC), 비-소세포 폐 암종, 췌장암, 두경부 편평 세포암 및 육종으로 구성된 군에서 선택된 고형 종양인 방법.
제2항에 있어서, 고형 종양이 유방 암종인 방법.
제3항에 있어서, 유방 암종이 전이성 유방 암종인 방법.
제2항에 있어서, 고형 종양이 위 암종인 방법.
제2항에 있어서, 고형 종양이 전립선암인 방법.
제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 다약제 내성 종양인 방법.
제7항에 있어서, 종양이 상승된 수준의 P-당단백질을 발현하는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 I의 화합물에서
R¹이 C1-C6 알킬 또는 시클로알킬이고/거나;
R²가 H 또는 C1-C4 알킬이고/거나;
R⁶이 임의로 치환된 아릴기이고/거나;
R^a가 임의로 치환된 벤질 또는 아릴메틸 기이고/거나;
R^b가 아미노-치환된 C2-C6 알킬렌이며, 이는 히드록시, C1-C4 알킬, C1-C4 할로알킬, C1-C4 히드록시알킬, 옥소 또는 할로에 의해 추가로 치환될 수 있고/거나;
R^c가 -X-A이며, 여기서, -X는 -C(O)-이고, A는 아미노, 할로, 히드록시, 알콕시, 시아노, 치환된 아미노 또는 S(O)₂R⁹ (여기서, R⁹는 C1-C4 알킬임)에서 선택된 4개 이하의 기로 치환될 수 있는 알킬인 방법.
제1항에 있어서, 상기 증식성 질병이 호지킨 림프종 (HL), 비-호지킨 림프종 (NHL), 백혈병, 골수성 백혈병, 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 골수이형성 증후군 (MDS), 모발상 세포 백혈병 및 다발성 골수종으로 구성된 군에서 선택된 혈액계 암인 방법.
제10항에 있어서, 상기 혈액계 암이 급성 골수성 백혈병인 방법.
제10항에 있어서, 상기 혈액계 암이 다발성 골수종인 방법.
포유동물에게 치료 유효량의 화학식 II의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 상기 화합물의 호변이성질체, 상기 화합물의 제약상 허용되는 염, 상기 호변이성질체의 제약상 허용되는 염 또는 이들의 혼합물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 고형 종양 또는 혈액계 암에서 선택된 증식성 질병의 치료 방법.
<화학식 II>

상기 식에서,
R^1c는 에틸, 이소프로필, t-부틸, 페닐, -CH(CH₂)₂O (옥세탄-3-일) 및 -CCH₃(CH₂)₂O (3-메틸옥세탄-3-일)로 구성된 군에서 선택되고;
R^2c는 수소 또는 메틸이고;
R¹⁵, R¹⁶, R¹⁷ 및 R¹⁸은 각각 독립적으로 H, 할로, C1-4 알킬, C1-4 할로알킬 및 CN에서 선택되고;
R¹⁹, R²⁰ 및 R²¹은 각각 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 C1-C10 아실이고;
R²²는 C1-C4 할로알킬이고;
p는 1 내지 3의 정수이고;
q는 1 내지 3의 정수이다.
제13항에 있어서, 상기 증식성 질병이 폐 암종, 유방 암종, 난소 암종, 피부 암종, 결장 암종, 방광 암종, 간 암종, 위 암종, 전립선암, 신장 세포 암종, 비인두 암종, 편평 세포 암종, 갑상선 유두 암종, 자궁경부 암종, 소세포 폐 암종 (SCLC), 비-소세포 폐 암종, 췌장암, 두경부 편평 세포암 및 육종으로 구성된 군에서 선택된 고형 종양인 방법.
제14항에 있어서, 고형 종양이 유방 암종인 방법.
제15항에 있어서, 유방 암종이 전이성 유방 암종인 방법.
제14항에 있어서, 고형 종양이 위 암종인 방법.
제14항에 있어서, 고형 종양이 전립선암인 방법.
제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 다약제 내성 종양인 방법.
제19항에 있어서, 종양이 상승된 수준의 P-당단백질을 발현하는 것인 방법.
제13항에 있어서, 상기 증식성 질병이 호지킨 림프종 (HL), 비-호지킨 림프종 (NHL), 백혈병, 골수성 백혈병, 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 골수이형성 증후군 (MDS), 모발상 세포 백혈병 및 다발성 골수종으로 구성된 군에서 선택된 혈액계 암인 방법.
제21항에 있어서, 상기 혈액계 암이 급성 골수성 백혈병인 방법.
제21항에 있어서, 상기 혈액계 암이 다발성 골수종인 방법.
화학식 II의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
<화학식 II>

상기 식에서,
R^1c는 에틸, 이소프로필, t-부틸, 페닐, -CH(CH₂)₂O (옥세탄-3-일) 및 -CCH₃(CH₂)₂O (3-메틸옥세탄-3-일)로 구성된 군에서 선택되고;
R^2c는 수소 또는 메틸이고;
R¹⁵, R¹⁶, R¹⁷ 및 R¹⁸은 각각 독립적으로 H, 할로, C1-4 알킬, C1-4 할로알킬 및 CN에서 선택되고;
R¹⁹, R²⁰ 및 R²¹은 각각 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 C1-C10 아실이고;
R²²는 C1-C4 할로알킬이고;
p는 1 내지 3의 정수이고;
q는 1 내지 3의 정수이다.
제24항에 있어서, R²²가 플루오로메틸인 화합물.
제24항 또는 제25항에 있어서, p가 2인 화합물.
제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, q가 1인 화합물.
제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, R^2c 및 R¹⁵가 각각 H인 화합물.
제28항에 있어서, R¹⁷ 및 R¹⁸이 각각 할로인 화합물.
제28항에 있어서, R¹⁹, R²⁰ 및 R²¹이 각각 H인 화합물.
제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, R¹⁹가 H인 화합물.
제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, R¹⁹가 임의로 치환된 C1-C10 아실인 화합물.
화학식 IIb의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
<화학식 IIb>
화학식 IIa의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
<화학식 IIa>
화학식 IIc의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
<화학식 IIc>

(S)-N-((S)-3-아미노-4-플루오로부틸)-N-((R)-1-(1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-이미다졸-2-일)-2,2-디메틸프로필)-2-히드록시프로판아미드
포유동물에게 치료 유효량의 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항의 화합물, 이들 화합물 중 어느 하나의 호변이성질체, 이들 화합물 중 어느 하나의 제약상 허용되는 염, 상기 호변이성질체의 제약상 허용되는 염 또는 이들의 혼합물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 고형 종양 및 혈액계 암에서 선택된 증식성 질병의 치료 방법.
제36항에 있어서, 상기 증식성 질병이 폐 암종, 유방 암종, 난소 암종, 피부 암종, 결장 암종, 방광 암종, 간 암종, 위 암종, 전립선암, 신장 세포 암종, 비인두 암종, 편평 세포 암종, 갑상선 유두 암종, 자궁경부 암종, 소세포 폐 암종 (SCLC), 비-소세포 폐 암종, 췌장암, 두경부 편평 세포암 및 육종으로 구성된 군에서 선택된 고형 종양인 방법.
제37항에 있어서, 고형 종양이 유방 암종인 방법.
제38항에 있어서, 유방 암종이 전이성 유방 암종인 방법.
제32항에 있어서, 고형 종양이 위 암종인 방법.
제32항에 있어서, 고형 종양이 전립선암인 방법.
제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 다약제 내성 종양인 방법.
제42항에 있어서, 종양이 상승된 수준의 P-당단백질을 발현하는 것인 방법.
제36항에 있어서, 상기 증식성 질병이 호지킨 림프종 (HL), 비-호지킨 림프종 (NHL), 백혈병, 골수성 백혈병, 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 골수이형성 증후군 (MDS), 모발상 세포 백혈병 및 다발성 골수종으로 구성된 군에서 선택된 혈액계 암인 방법.
제44항에 있어서, 상기 혈액계 암이 급성 골수성 백혈병인 방법.
제44항에 있어서, 상기 혈액계 암이 다발성 골수종인 방법.