PL213249B1 - Zastosowanie pochodnych semikarbazydowych oraz 1,2,4-triazolino-5-onu posiadających układ 1-metylopirolu - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie 4-(4-bromofenylo)-1-[(1-metylopirol-2-yl)acetylo]semikarbazydu (wzór 1) oraz 3-[(1-metylopirol-2-yl)metylo 4-podstawionych-1,2,4-triazolino-5-onu (wzór 2) gdzie R oznacza etyl, 4-bromofenyl, benzyl wykazujących działanie przeciwnowotworowe.

Substancje będące przedmiotem wynalazku znane są z publikacji; „Pitucha i inni, Z. Naturforsch. 2009, 64b, 570-576. W dokumencie tym ujawniono również zastosowanie substancji według wynalazku jako substancji o działaniu przeciwbakteryjnym. W wyniku prowadzonych badań nieoczekiwanie okazało się, że związki o wzorze 1 i 2 są użyteczne do wytwarzania leków o działaniu przeciwnowotworowym, w szczególności mających zastosowanie w leczeniu nowotworów jajnika. Dodatkowo substancje te charakteryzują się niską toksycznością.

Dane epidemiologiczne dotyczące zachorowań i zgonów z powodu nowotworów złośliwych pokazują, że są one jednym z najpoważniejszych problemów zdrowia publicznego na świecie, w Europie i w Polsce. W naszym kraju co roku na nowotwory zł oś liwe umiera ponad 90 tys. osób, a rejestrowanych jest ok. 130 tys. nowych zachorowań. Współczesna wiedza medyczna nie pozwala jednoznacznie ustalić przyczyny powstawania chorób nowotworowych. Nie wiemy, dlaczego tkanka zaczyna odnawiać się w formie guza, który rozrasta się w sposób niepohamowany. Znamy jednakże istotne mechanizmy, w jakich dochodzi do tworzenia się zmian nowotworowych. Otóż, współcześnie uważa się, że komórki nowotworowe powstają w wyniku mutacji nośników informacji genetycznej, kwasu deoksyrybonukleinowego, czyli DNA. Pod wpływem takiej mutacji komórka określonej tkanki staje się słabo zróżnicowaną oraz szybko proliferującą komórką nowotworową. Dzieląc się w sposób niekontrolowany takie komórki tworzą masę guza nowotworowego, który niewiele przypomina tkankę, z której się wywodzi. Idealnym sposobem leczenia nowotworów byłby lek wybiórczo niszczący wyłącznie komórki nowotworowe, nienaruszający jednocześnie równowagi biologicznej chorego. Takie działanie wykazuje jedynie nasz własny układ immunologiczny. Niestety jego aktywność w chorobach nowotworowych jest bardzo ograniczona.

Nowotwory jajnika są dość częstym schorzeniem. Rokowanie w przypadku złośliwych nowotworów jajnika zazwyczaj nie jest dobre. Choroba rozpoznawana jest zbyt późno, co zmniejsza szanse na wyleczenie. Rak jajnika może występować praktycznie w każdym wieku. Na całym świecie testowanych jest ponad sto leków biotechnologicznych, które nie niszczą komórek rakowych, tak jak chemioterapia, lecz blokują ich rozwój na poziomie molekularnym.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie 4-(4-bromofenylo)-1-[(1-metylopirol-2-yl)acetylo]semikarbazydu o wzorze 1 oraz 3-[(1-metylopirol-2-yl)metylo-4-podstawionych-1,2,4-triazolino-5-onu o wzorze 2 gdzie R oznacza etyl, 4-bromofenyl, benzyl do wytwarzania leku do leczenia chorób nowotworowych jajnika.

Przeciwnowotworowe działanie zsyntetyzowanych związków występuje już od wczesnego etapu proliferacji komórek, to jest od fazy syntezy DNA w cyklu komórkowym.

W prowadzonych badaniach nad aktywnoś cią związków wykorzystano komórki nabłonkowe pierwotnego raka jajnika dającego przerzuty do endometrium. Komórki te są ciągłą stransformowaną linią nowotworową. Do doświadczeń linia ta była pasażowana przy użyciu roztworu trypsyny i EDTA.

W niniejszych badaniach wykazano po raz pierwszy, ż e semikarbazydy i 1,2,4- triazolino-5-ony z układem 1-metylopirolu wywierają działanie cytotoksyczne oraz cytopatyczne na komórki raka jajnika in vitro (TOV 112D). Efekt toksyczności oraz zaburzeń w strukturze organelli badanych komórek wzrasta wraz z czasem inkubacji 4-etylo-3-[(1-metylopirol-2-yl)metylo-1,2,4-triazolino-5-on wykazuje najbardziej nasilony efekt cytotoksyczny w stężeniu 50 μg/ml, a drugi badany związek - 4-(4-bromofenylo)-3-[(1-metylopirol-2-yl)metylo-1,2,4-triazolino-5-on w najwyższym stężeniu, to jest 100 μg/ml.

Bardzo istotnym wynikiem badań jest brak efektu cytotoksycznego i cytopatycznego badanych związków na komórki prawidłowe fibroblastów skóry ludzkiej (HSF).

Uzyskane wyniki pozwalają na stwierdzenie, że związki te mogą być stosowane do produkcji leków przeciwko nowotworom jajnika. Ich działanie można tłumaczyć hamującym wpływem na proces replikacji komórek nowotworowych. Proces syntezy DNA w komórkach nowotworowych jest przyspieszony, dlatego też jego zahamowanie po zastosowaniu opisanych związków chemicznych może być skutecznym środkiem terapeutycznym w leczeniu chorób nowotworowych jajnika, przy jednoczesnym braku cytotoksyczności w odniesieniu do hodowli fibroblastów skóry człowieka.

Poniżej przedstawiono schemat badania cytotoksyczności pozwalający na określenie aktywności przeciwnowotworowej.

PL 213 249 B1

P r z y k ł a d 1: Badanie aktywności przeciwnowotworowej pochodnych semikarbazydowych i 1,2,4-triazolino-5-onu posiadają cych ukł ad 1-metylopirolu

Określanie tempa proliferacji komórek raka jajnika in vitro (TOV 112D) oraz komórek prawidłowych skóry ludzkiej in vitro (HSF) testem BrdU po inkubacji z badanym związkiem.

Test proliferacji BrdU

Określenie tempa proliferacji komórek i ich aktywności metabolicznej są istotnymi czynnikami biologii komórek nowotworowych. Włączenie 5-bromo-2-deoxyurydyny (BrdU) w miejsce tymidyny jest wykorzystywane w analizie syntezy DNA i proliferacji komórek w oparciu o metody immunocytochemiczne. Komórki, które posiadają włączony BrdU w DNA jest łatwo wykryć używając mononuklearne przeciwciała przeciwko BrdU i analizować przy pomocy drugiego przeciwciała sprzężonego z fluorochromem. Technika oznaczania z zastosowaniem BrdU jest używana w teście ELISA.

BrdU jest dodawany do hodowli i włączany do zsyntetyzowanych pasm DNA. Komórkowy DNA jest częściowo trawiony przez nukleazę, po uprzednim utrwaleniu warstwy komórek. Kolejnym etapem jest dodawanie przeciwciała anty- BrdU, które łączy się z BrdU. Na koniec dodaje się peroksydazę. Enzym ten katalizuje reakcję rozkładu substratów, dając barwny produkt. Ostatnim etapem jest pomiar absorbancji roztworu barwnego (E450) w czytniku ELISA (BioRad).

Wyniki badań aktywności przeciwnowotworowej zamieszczono w Tabeli Nr 1.

Badane związki były nietoksyczne dla komórek prawidłowych skóry człowieka hodowanych in vitro. Działanie to nie wzrastało wraz z czasem inkubacji oraz ze wzrostem stężenia tych związków.

W komórkach raka jajnika in vitro cytotoksyczne działanie związków z układem triazolu było zależne od czasu inkubacji. Najwyższe działanie toksyczne wystąpiło po 72-godzinnej inkubacji z badanymi związkami. Najwyższą cytotoksyczność wykazała dawka 50,0 μg/ml dla 4-etylo-3-[(1-metylopirol-2-yl)metylo-1,2,4-triazolino-5-onu oraz 100,0 μg/ml dla 4-(4-bromofenylo)-3-[(1-metylopirol-2-yl)metylo-1,2,4-triazolino-5-onu.

Stężenia 50,0 μg/ml do 100,0 μg/ml są najbardziej skuteczne w niszczeniu komórek nowotworowych jajnika in vitro.

T a b e l a I. Wyniki badań aktywności przeciwnowotworowej przykładowo wskazanych związków

Czas inkubacji (h) GI (%)
Związek	4-(4-bromofenylo)1-[(1- -metylopirol-2- -yl)acetylo]semikarbazyd	4-etylo-3-[(1-metylopirol-2- -yl)metylo-1,2,4-triazolino- -5-on	4-(4-bromofenylo)-3-[(1- -metylopirol-2-yl)metylo- -1,2,4-triazolino-5-on
Dawka	I	II	III	I	II	III	I	II	III
HSF	24	0	0	0	0	0	0	10	0	0
	48	0	1	1	0	0	0	0	0	0
72	0	1	1	0	0	0	0	0	0
TOV 112D	24	0	50	20C	0	45C	10	10C	25C	50C
48	0	75	30C	0	50C	15	10C	50C	75C
72	0	85	30C	0	70C	50C	50C	70C	80C

Gl-współczynnik zahamowania proliferacji w odniesieniu do komórek kontrolnych

HSF-fibroblasty skóry ludzkiej

TOV 112D-komórki nabłonkowe raka jajnika

C-efekt cytopatyczny komórek

I- stężenie 10.0 iig/ml

II- stężenie 50.0 μ g/ml

III- stężenie 100.0 Lg/ml

PL 213 249 B1

Claims (1)

1. Zastosowanie 4-(4-bromofenylo)-1-[(1-metylopirol-2-yl)acetylo] semikarbazydu o wzorze 1 oraz 3-[(1-metylopirol-2-yl)metylo 4-podstawionych-1,2,4-triazolino-5-onu o wzorze 2, gdzie R oznacza etyl, 4-bromofenyl, benzyl do wytwarzania leku do leczenia chorób nowotworowych jajnika.