CN101939005A - 作为癌症治疗剂的驱动蛋白抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了抑制驱动蛋白纺锤体蛋白(KSP，也称为Eg5)活性的新的咪唑化合物。KSP的抑制剂能减少不希望的细胞增殖并提供其他治疗效果。本发明还提供了含有这些新化合物的药物组合物，以及使用所述新KSP抑制剂及其药物组合物治疗多种类型癌症的方法。本发明的这些化合物、组合物和方法尤其可用于治疗对常规药物治疗耐药的某些种类的癌症，因为这些癌症显示对本发明的化合物保持敏感。

Description

作为癌症治疗剂的驱动蛋白抑制剂
技术领域
本发明涉及通过施用KSP抑制剂治疗增殖性病症例如癌症的方法。
背景技术
驱动蛋白是当其沿微管运动时水解三磷酸腺苷、产生机械力的动力蛋白。这些蛋白的特征在于具有约350个氨基酸残基的动力结构域。已解析了几种驱动蛋白动力结构域的晶体结构。
目前，已鉴别了约100种驱动蛋白-相关蛋白(KRP)。驱动蛋白涉及许多细胞的生物学过程，包括细胞器和囊泡的转运及内质网的维持。一些KRP与有丝分裂纺锤体的微管相互作用或与染色体直接作用，表现为在细胞周期的有丝分裂阶段发挥重要作用。这些有丝分裂的KRP对于开发癌症治疗剂特别有价值。
驱动蛋白纺锤体蛋白(KSP)(也称为：Eg5、HsEg5、KNSL1或KIF11)是几种驱动蛋白样动力蛋白之一，它们位于有丝分裂的纺锤体中，已知是两极有丝分裂纺锤体的形成和/或功能所必需的。
1995年，使用针对KSP C-末端的抗体来耗竭KSP显示阻滞HeLa细胞于具有单星微管阵列的有丝分裂(Blangy等人，Cell 83：1159-1169，1995)。被视为KSP同系物的bimC和cut7基因的突变导致构巢曲霉菌(Aspergillus nidulans)(Enos，A.P.和N.R.Morris，Cell 60：1019-1027，1990)和裂殖酵母菌丝(Schizosaccharomyces pombe)(Hagan，I.和M.Yanagida，Nature 347：563-566，1990)中的中心体分离失败。用在蛋白水平降低KSP表达的ATRA(全反式视黄酸)处理细胞或使用反义寡核苷酸耗竭KSP，显示了DAN-G胰腺癌细胞中显著的生长抑制，提示KSP可能与全反式视黄酸的抗增殖作用有关(Kaiser，A.等人，J.Biol.Chem.274，18925-18931，1999)。有趣的是，光滑爪蟾(Xenopuslaevis)的极光(Aurora)-相关蛋白激酶pEg2显示结合并磷酸化XIEg5(Giet，R.等人，J.Biol.Chem.274：15005-15013，1999)。极光相关激酶的潜在底物对于癌症药物研发特别有价值。例如，结肠癌患者中极光1和2激酶在蛋白水平和RNA水平过表达并且基因被扩增。
第一种可渗透细胞的小分子KSP抑制剂“monoastrol”显示阻滞单极纺锤体细胞，而不是象常规化疗剂如紫杉烷类和长春花生物碱类那样影响微管聚合作用(Mayer，T.U.等人，Science 286：971-974，1999)。在基于表型的筛选中已鉴定Monastrol是一种抑制剂，提示该化合物可用作抗癌药物开发的前导物。抑制作用确定为相对于和KSP相互作用的三磷酸腺苷是非竞争性的，且快速可逆(DeBonis，S.等人，Biochemistry，42：338-349，2003；Kapoor，T.M.等人，J.Cell Biol.，150：975-988，2000)。
由于改善化疗的重要性，需要KSP抑制剂，其是KSP和KSP-相关蛋白的有效的体内抑制剂。之前报道了一些KSP抑制剂，例如，WO 06/002236和PCT/US2006/031129披露了表明为KSP抑制剂的某些类型的化合物。Ispinesib(SB-715992)是来自Cytokinetics的临床候选物，指出用作KSP抑制剂。本发明提供了具有改善活性的新的KSP抑制剂以及使用这些KSP抑制剂的新方法。此外，提供了对癌细胞有效的新KSP抑制剂，所述癌细胞由于表达充当流出泵的P-糖蛋白而对其他诸如紫杉醇的治疗剂耐药。
发明概述
本发明提供了治疗选自哺乳动物实体瘤或血液癌症的增殖性疾病的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的结构I的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的可药用盐、所述互变异构体的可药用盐或它们的混合物，其中结构I的化合物为
其中：
R1选自氨基酰基、酰基氨基、羧基、羧基酯、芳基和任选被羟基或卤素取代的烷基；
R2选自氢、烷基和芳基；
Ra是L-A1；
L选自-S(O)q-，其中q是1或2，以及任选被羟基、卤素或酰基氨基取代的C1至C5亚烷基；
A1选自芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基、环烷基和取代的环烷基；
R6选自杂环基、芳基和杂芳基，它们都可以任选的被-(R8)m所取代，其中R8如本文中所定义，m是1至3的整数；
R8选自氰基、烷基、链烯基、炔基、-CF3、烷氧基、卤素和羟基；条件是当m是2或3时，各R8可以相同或不同；
Rb是R4或R5；
R4选自氢、直链烷基、-亚烷基-氨基酰基、-亚烷基-氧酰基、-亚烷基-酰氧基、亚烷基-羟基、-[亚烷基]p-含氮杂环基、-[亚烷基]p-含氮的取代杂环基、-[亚烷基]p-含氮杂芳基、-[亚烷基]p-含氮的取代杂芳基和-[亚烷基]p-NR10R11，其中p是0或1，R4亚烷基是直链的亚烷基，其任选地被选自氨基、取代的氨基、羟基、烷基、取代的烷基、羧基、羧基酯、氧代、螺环烷基和卤素的前述取代基之一单或双取代；
R10和R11独立的选自氢、烷基、取代的烷基、-S(O)-烷基、-S(O)-取代的烷基、-S(O)2-烷基、-S(O)2-取代的烷基、杂环基、取代的杂环基、酰基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基和取代的环烷基，或当R10为氢时，R11是羟基、烷氧基或取代的烷氧基；
R5选自氢、烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳基、取代的芳基、杂芳基和取代的杂芳基；
Rc选自R3和-C(O)-N(R13)(R14)；
R3选自氢和-X-A，其中X选自-C(O)-、-C(S)-、-S(O)-、-S(O)2-和-S(O)2-N(R)-，其中R是氢或烷基；
A选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烷氧基、任选取代的芳基、羧基、羧基酯、氨基酰基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环基以及任选取代的环烷基，其中任选取代的基团被1至4个选自烷基、取代的烷基、烷氧基、取代的烷氧基、氨基、取代的氨基、芳氧基、取代的芳氧基、氰基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基、杂环氧基、取代的杂环氧基、酰基、羧基、羧基酯、氧代(除当A是任选取代的芳基或任选取代的杂芳基外)、卤素、羟基、-S(O)2-R9以及硝基的取代基所取代，其中R9是烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基；并且
R13和R14独立的选自氢、羟基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基，条件是仅R13或R14之一是羟基；或R13和R14和与之连接的氮原子一起形成杂环或取代的杂环。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗选自哺乳动物实体瘤或血液癌症的增殖性疾病的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的结构I的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的可药用盐、所述互变异构体的可药用盐或它们的混合物，其中所述实体瘤选自肺癌、乳腺癌、卵巢癌、皮肤癌、结肠癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、肾细胞癌、鼻咽癌、鳞状细胞癌、甲状腺乳头状癌、宫颈癌、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌、胰腺癌、头和颈部鳞状细胞癌和肉瘤。
在另一个实施方案中，所述实体瘤是乳腺癌。在另一个实施方案中，所述乳腺癌是转移的乳腺癌。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗选自哺乳动物实体瘤或血液癌症的增殖性疾病的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的结构I的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的可药用盐、所述互变异构体的可药用盐或它们的混合物，其中所述实体瘤是胃癌。
在另一个实施方案中，所述实体瘤是前列腺癌。在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗方法，其中所述肿瘤是多重耐药肿瘤。在另一个实施方案中，所述多重耐药肿瘤表达升高水平的P-糖蛋白。在某些实施方案中，治疗包括使用式(I)的化合物，其中：
R1是C1-C6烷基或环烷基，和/或
R2是H或C1-C4烷基，和/或
R6是任选取代的芳基，和/或
Ra是任选取代的苄基或芳基甲基，和/或
Rb是氨基取代的C2-C6亚烷基，其可进一步被羟基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4羟基烷基、氧代或卤素取代，和/或
Rc是-X-A，其中-X是-C(O)-，并且A是烷基，其可被最多4个选自氨基、卤素、羟基、烷氧基、氰基、取代的氨基或S(O)2R9的基团所取代，其中R9是C1-C4烷基。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗选自哺乳动物实体瘤或血液癌症的增殖性疾病的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的结构I的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的可药用盐、所述互变异构体的可药用盐或它们的混合物，其中所述血液癌症选自霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、白血病、髓细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、多毛细胞白血病和多发性骨髓瘤。所述哺乳动物可以是人类。
在另一个实施方案中，所述血液癌症是急性髓细胞性白血病。在一个备选的实施方案中，所述血液癌症是多发性骨髓瘤。
在优选的实施方案中，式I的化合物具有至少一个以下优选的结构特征：
在某些所述优选的实施方案中，式I化合物中的R1是C1-C6烷基或环烷基。
在某些所述优选的实施方案中，式I化合物中的R2是H或C1-C4烷基。
在某些所述优选的实施方案中，式I化合物中的R6是任选取代的芳基；在某些实施方案中，其为卤素取代的苯环。
在某些所述优选的实施方案中，式I化合物中的Ra是任选取代的苄基或芳基甲基(-CH2-芳基)；在某些实施方案中，其为未取代的苄基。
在某些所述优选的实施方案中，式I化合物中的Rb是氨基取代的C2-C6亚烷基，其可进一步被羟基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4羟基烷基、氧代或卤素取代。
在某些所述优选的实施方案中，式I化合物中的Rc是-X-A，其中-X是-C(O)-，并且A是烷基，其可被至多4个选自氨基、卤素、羟基、烷氧基、氰基、取代的氨基或S(O)2R9的基团取代，其中R9是C1-C4烷基。
在特别优选的实施方案中，式I的化合物包含至少两个上述R1、R2、R6、Ra、Rb和Rc所优选的基团，在另外的实施方案中，其包含至少3个所述的优选基团。在另外的实施方案中，式I的化合物包含至少4个所述的优选基团。
其他可用于本发明方法中的化合物实施方案披露于2006年1月5日公布的题为“取代的咪唑衍生物”的WO2006/002236中，其公开文本整体引入本文作为参考。另外的化合物实施方案披露于2006年8月9日提交的题为“作为KSP抑制剂的取代的咪唑化合物”的PCT/US2006/031129中，其整体引入本文作为参考。另外的化合物实施方案披露于2007年1月5日提交的题为“作为EG-5抑制剂的环化衍生物”的美国临时申请60/883740中，其整体引入本文作为参考。
在另一个实施方案中，提供了治疗选自哺乳动物实体瘤或血液癌症的增殖性疾病的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的式II的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的可药用盐、所述互变异构体的可药用盐或它们的混合物，其中式II的化合物是：
Figure GPA00001158902400071
或其可药用盐，
其中，
R1c选自乙基、异丙基、叔丁基、苯基、-CH(CH2)2O(环氧丙烷-3-基)和-CCH3(CH2)2O(3-甲基环氧丙烷-3-基)；
R2c是氢或甲基；
R15、R16、R17和R18各自独立的选自H、卤素、C1-4烷基、C1-4卤代烷基和CN；
R19、R20和R21各自独立的是H或任选取代的C1-C10酰基；
R22是C1-C4卤代烷基；
p是1至3的整数；并且
q是1-3的整数。
在式II化合物的某些实施方案中，
R1c选自乙基、异丙基和叔丁基；
R2c是H；
R15、R17和R18各自独立的选自H、卤素、C1-4烷基、C1-4卤代烷基和CN；
R16是H或C1-C4烷基；
R19、R20和R21各自独立的是氢或任选取代的C1-C10酰基；
R22是C1-C4卤代烷基；
p是2，并且
q是1。
这些化合物还包括相应的可药用盐。
式II和式IIa-IIc(下文)的化合物是式I化合物的亚组，其特征为存在游离羟基或在酰基部分中的游离羟基的前药形式，即，在这些化合物中，R19是H，或R19是酰基，其能在体内水解以提供R19是H的化合物。R19是适当酰基的化合物是容易在体内水解产生R19是H的化合物的前药。已发现R19是H的化合物在治疗某些病症例如前列腺癌中具有令人惊讶的良好活性，并且对表达P-gp的肿瘤和某些血液癌症尤其有效。具体而言，这些化合物对表达P-gp(通常的耐药机制)的耐药肿瘤是有效的，而没有羟基的类似化合物针对所述耐药肿瘤的效果要差很多。通常，由于诸如氧化和糖基化的代谢问题，游离羟基是候选药物中不期望出现的特征，但令人惊讶的发现，式II或IIa、IIb或IIc的化合物在体内针对某些肿瘤比不含游离羟基和不容易水解为游离羟基(R19＝H)的类似化合物更为有效。它们针对耐药肿瘤的效力使得这些式II的化合物在治疗癌症中尤其有效。
在另一个实施方案中，提供了治疗选自哺乳动物实体瘤或血液癌症的增殖性疾病的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的式II的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的可药用盐、所述互变异构体的可药用盐或它们的混合物，其中所述实体瘤选自肺癌、乳腺癌、卵巢癌、皮肤癌、结肠癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、肾细胞癌、鼻咽癌、鳞状细胞癌、甲状腺乳头状癌、宫颈癌、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌、胰腺癌、脑癌、头和颈部鳞状细胞癌和肉瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤是多药耐药肿瘤，或P-糖蛋白(P-gp)表达水平升高的肿瘤。
在另一个实施方案中，提供了所述实体瘤为乳腺癌的方法。在另一个实施方案中，所述乳腺癌是转移的乳腺癌。
在一个备选的实施方案中，所述实体瘤是胃癌。在另一个实施方案中，所述实体瘤是前列腺癌。在一个实施方案中，本发明提供了治疗选自实体瘤或血液癌症的增殖性疾病的方法，该方法包括施用式II的化合物，其中所述肿瘤是多药耐药癌症。在某些实施方案中，所述血液恶性肿瘤选自急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和霍奇金淋巴瘤(HL)。在某些实施方案中，所述恶性肿瘤是多药耐药肿瘤，或P-糖蛋白(P-gp)表达水平升高的肿瘤。
在另一个实施方案中，提供了治疗选自哺乳动物实体瘤或血液癌症的增殖性疾病的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的式II的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的可药用盐、所述互变异构体的可药用盐或它们的混合物，其中所述血液癌症选自霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、白血病、髓细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、多毛细胞白血病和多发性骨髓瘤。
在另一个实施方案中，提供了所述血液癌症是急性髓细胞性白血病的方法。在一个备选的实施方案中，所述血液癌症是多发性骨髓瘤。
在另一个实施方案中，提供了治疗选自哺乳动物实体瘤或血液癌症的增殖性疾病的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用一定量的式(I)或(II)的KSP抑制剂，还包括施用第二抗癌治疗剂。在一个实施方案中，所述第二抗癌治疗剂在使用式(I)或(II)的KSP抑制剂治疗之前、同时或之后给予。
所述第二抗癌治疗剂可选自伊立替康、托泊替康、吉西他滨、伊马替尼、曲妥珠单抗、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、卡铂、顺铂、多西他赛、紫杉醇、替扎他滨(tezacitabine)、环磷酰胺、长春花生物碱、蒽环类、利妥昔单抗和尼洛替尼。
在某些实施方案中，所述第二化合物是Bcr-Abl抑制剂。
在具体的实施方案中，所述Bcr-Abl抑制剂选自伊马替尼和尼洛替尼。
在另一个实施方案中，所述KSP抑制剂是式(I)的化合物，其中：
R1是C1-C6烷基或环烷基；和/或
R2是H或C1-C4烷基，和/或
R6是任选取代的芳基，和/或
Ra是任选取代的苄基或芳基甲基，和/或
Rb是氨基取代的C2-C6亚烷基，其可进一步被羟基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4羟基烷基、氧代或卤素取代，和/或
Rc是-X-A，其中-X是-C(O)-，并且A是烷基，其可被最多4个选自氨基、卤素、羟基、烷氧基、氰基、取代的氨基或S(O)2R9的基团所取代，其中R9是C1-C4烷基。
本发明提供了式(II)的化合物或其可药用盐：
Figure GPA00001158902400101
其中：
R1c选自乙基、异丙基、叔丁基、苯基、-CH(CH2)2O(环氧丙烷-3-基)和-CCH3(CH2)2O(3-甲基环氧丙烷-3-基)；
R2c是氢或甲基；
R15、R16、R17和R18各自独立的选自H、卤素、C1-4烷基、C1-4卤代烷基和CN；
R19、R20和R21各自独立的是H或任选取代的C1-C10酰基；
R22是C1-C4卤代烷基；
p是1至3的整数；并且
q是1-3的整数。
在一个实施方案中，R22是氟甲基。
在另一个实施方案中，p是2。
在另一个实施方案中，q是1。
在另一个实施方案中，R2c和R15各自是H。
在另一个实施方案中，R17和R18各自是卤素。
在又一个实施方案中，R19、R20和R21各自是H。
在又一个实施方案中，R19是H。
在另一个实施方案中，R19是任选取代的C1-C10酰基。
在某些实施方案中，该化合物包含上述R22、p、q、R2c和R17-R21中的两个或多个结构特征。在某些实施方案中，所述化合物包含至少3个这些结构特征。在这些化合物的某些优选的实施方案中，R22是氟甲基，并且p是2，q是1，R2c和R15各自是H。在某些所述实施方案中，R17和R18各自代表F。在某些所述优选的实施方案中，R19、R20和R21各自是H。在这些实施方案中，R1c优选选自乙基、异丙基和叔丁基。
本发明还提供了式IIa的化合物或其可药用盐：
Figure GPA00001158902400111
本发明还提供了式IIb的化合物或其可药用盐：
Figure GPA00001158902400121
本发明还提供了式IIc的化合物或其可药用盐：
Figure GPA00001158902400122
在一个实施方案中，本发明提供了治疗选自哺乳动物实体瘤或血液癌症的增殖性疾病的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的任意一种式II、IIa、IIb或IIc的化合物、任意一种这些化合物的互变异构体、任意一种这些化合物的可药用盐、所述互变异构体的可药用盐或它们的混合物。
在另一个实施方案中，所述实体瘤选自肺癌、乳腺癌、卵巢癌、皮肤癌、结肠癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、肾细胞癌、鼻咽癌、鳞状细胞癌、甲状腺乳头状癌、宫颈癌、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌、胰腺癌、头和颈部鳞状细胞癌、脑癌和肉瘤。在某些实施方案中，所述实体瘤是对其他癌症药物耐药的肿瘤，其可以是表达诸如促进耐药的P-gp的流出泵的癌症，或已显示对用诸如紫杉醇或SB-715992的药物治疗耐药的癌症。由于癌细胞过表达流出泵、尤其是P-糖蛋白(P-gp)而对药物如紫杉醇耐药的癌症对式II的化合物是敏感的，如本文所证实，而缺乏式II化合物的羟基的类似化合物在这些耐药肿瘤中没有效果。式IIa、IIb和IIc的化合物在治疗表达P-gp并显示对其他治疗剂耐药的肿瘤中是特别有效的。这些化合物的这种令人意外的治疗耐药肿瘤的能力是有利的。它们对耐药肿瘤的活性被认为与式II的酰胺部分上的羟基有关。
在另一个实施方案中，所述实体瘤是乳腺癌。在另一个实施方案中，所述乳腺癌是转移的乳腺癌。
在一个备选的实施方案中，所述实体瘤是胃癌。
在另一个实施方案中，所述实体瘤是前列腺癌。
在上述各实施方案中，所述肿瘤有时是对其他药物耐药的肿瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤选自肾、肝、结肠、脑或乳腺癌。在某些实施方案中，其是P-gp表达水平升高的肿瘤。所述P-gp表达的升高可自然发生，或者是其他药物治疗的结果。
在其他实施方案中，本发明提供了治疗选自哺乳动物实体瘤或血液癌症的增殖性疾病的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的任意一种式IIa、IIb或IIc的化合物、任意一种这些化合物的互变异构体、任意一种这些化合物的可药用盐、所述互变异构体的可药用盐或它们的混合物，其中所述血液癌症选自霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、白血病、髓细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、多毛细胞白血病和多发性骨髓瘤。
在另一个实施方案中，所述血液癌症是急性髓细胞性白血病。
在另一个实施方案中，所述血液癌症是多发性骨髓瘤。
附图简述
图1.化合物IIa对于衍生自血液恶性肿瘤的细胞系的相对灵敏度。基于血液恶性肿瘤组的细胞系的CellTiter
Figure GPA00001158902400141
试验的相对灵敏度是通过对整个组的Log(GI50)(GI50是50％抑制时的浓度)平均值和每一细胞系的Log(GI50)值间的差异进行作图来显示；正值(竖线右侧的柱)表示比平均值更灵敏的细胞系，负值(竖线左侧的柱)表示不如平均值灵敏的细胞系。
图2.通过FACS评价用化合物IIa处理的SUDHL-4和RL细胞系的细胞期：第一栏显示了未处理的细胞，第二栏显示了用化合物IIa处理后24小时的细胞，第三栏显示了用化合物IIa处理后48小时的细胞。
图3.显示化合物IIa对来自AML患者的AML母细胞的毒性的数据。图A显示作为剂量的函数的存活率％。图B显示了两周的生长期后的细胞培养物。图C显示了在＜2N、2N或4N期的细胞的百分比，比较了化合物IIa与紫杉醇的效果。
图4.在MV4；11皮下肿瘤异种移植物模型中以q4d x 3给药方案施用化合物IIa的效力。通过将在0.2mL 1∶1比例的HBSS和MatrigelTM中的107个细胞皮下注射到每只小鼠的右侧腹中，在雌性无胸腺nu/nu小鼠中建立MV4；11肿瘤。细胞植入后约24天，当肿瘤到达250mm3时，根据肿瘤体积将小鼠随机分配到治疗组中(n＝9)。动物被静脉内施用溶媒
Figure GPA00001158902400142
化合物IIa或SB-715992(Ispinesib，来自Cytokinetics的一种处于临床试验阶段的KSP抑制剂)。所有给药均按q4d x 3方案进行。(A)效力/治疗组的肿瘤体积vs随机化后的天数；(B)相对于随机化当天的起始体重的体重变化百分比。
图5.以q4d x 3给药方案施用的化合物IIa在KB8.5肿瘤异种移植物模型中的效力。通过将在0.2mL 1∶1比例的HBSS和MatrigelTM中的5×106个细胞皮下注射到每只小鼠的右侧腹中，在雌性无胸腺nu/nu小鼠(CharlesRiver Laboratories)中建立KB8.5肿瘤。细胞植入后约10天，当肿瘤到达约300mm3，根据肿瘤体积将小鼠随机分到治疗组(n＝9/组)中。动物静脉内施用化合物IIa或SB-715992。紫杉醇以30mg/kg腹腔内注射。所有均按q4d x 3方案给药。(左)效力/治疗组的肿瘤体积vs开始给药后的天数；(右)相对于随机化/开始给药当天的起始体重的体重变化百分比。＊p＜0.05，与溶媒和SB-715992相比(方差分析/Dunn法)。
图6.以q4d x 3给药方案施用的化合物IIc在KB8.5肿瘤异种移植物模型中的效力。通过将在0.2mL 1∶1比例的HBSS和MatrigelTM中的5×106个细胞皮下注射到每只小鼠的右侧腹中，在雌性无胸腺nu/nu小鼠(CharlesRiver Laboratories)中建立KB8.5肿瘤。当肿瘤达到平均约339mm3，根据肿瘤体积将小鼠随机分到治疗组(n＝9)中。动物被静脉内施用化合物IIc或SB-715992。紫杉醇以30mg/kg腹腔内注射。所有均按q4d x 3方案给药。(左)效力/治疗组的肿瘤体积vs开始给药后天数；(右)相对于随机化/开始给药当天的起始体重的体重变化百分比。在第11天，1.25mg/kg的化合物IIc与溶媒组间具有统计学差异(＊p＜0.05，方差分析/Tukey检验)。
图7.以q4d x 3给药方案施用的化合物Ia在KB8.5肿瘤异种移植物模型中的效力。通过将在0.2mL 1∶1比例的HBSS和MatrigelTM中的5×106个细胞皮下注射到每只小鼠的右侧腹中，在雌性无胸腺nu/nu小鼠(CharlesRiver Laboratories)中建立KB8.5肿瘤。当肿瘤达到平均约285mm3，根据肿瘤体积将小鼠随机分到治疗组(n＝10)中。动物被静脉内施用化合物Ia或SB-715992。紫杉醇以30mg/kg腹腔内注射。所有均按q4d x 3方案给药。(左)效力/治疗组的肿瘤体积vs开始给药后天数；(右)相对于随机化/开始给药当天的起始体重的体重变化百分比。各组与溶媒组间无统计学差异(秩次方差分析)。
本发明的实施方案
A.定义和概述
应当理解，本文所用的术语仅是为描述具体实施方案的目的，不意味着限制本发明范围。应当指出，如本文和权利要求书中所使用的单数形式“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另有明确指示。在本说明书及所附的权利要求书中将提及若干术语，它们具有如下的含义：
如本文所用，“烷基”是指具有1至10个碳原子且更优选1至4个碳原子的单价饱和脂肪族直链、支链或环状烃基。此术语示例性的基团例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、异丁基、正丁基、叔丁基、正戊基等。
术语“直链烷基”是指非支链的烷基。
“取代的烷基”是指具有一个或多个取代基的烷基，通常为1至4个，优选1至2个取代基。烷基适当的取代基选自取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的酰基、取代或未取代的酰基氨基、取代或未取代的酰氧基、取代或未取代的氨基、取代或未取代的氨基酰基、芳基、取代的芳基、芳氧基、取代的芳氧基、氰基、卤素、羟基、硝基、羧基、氧代、肟基、取代或未取代的烷氧基-亚氨基羧酸C1-C4酯、环烷基、取代的环烷基、取代或未取代的螺环烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基、-SO2-烷基、-SO2-取代的烷基，其中所述取代基如本文所定义。烷基优选的取代基包括烷氧基、羟基、卤素(优选为F或Cl)、氰基、氧代、取代或未取代的氨基、取代或未取代的酰氧基和取代或未取代的酰基氨基。
术语“卤代烷基”是指至少一个氢原子被卤素原子替换的烷基。在一个实施方案中，该术语是指氟甲基、二氟甲基或三氟甲基等。
术语“羟基烷基”是指其中至少一个氢原子被羟基替换的烷基。在一个实施方案中，该术语是指羟甲基、1-或2-羟基乙基、1-、2-或3-羟基丙基等。
“亚烷基”是指直链或支链的二价饱和脂肪族烃基，优选具有1至5个且更优选1至3个碳原子。此术语示例性的基团例如亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚正丙基(-CH2CH2CH2-)、亚异丙基(-CH2CH(CH3)-)等。“取代的亚烷基”是指具有一个或多个取代基、优选1-4个、更优选1-2个取代基的亚烷基，所述取代基选自适合于烷基的取代基。
“烷氧基”是指基团“烷基-O-”，其示例性地包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基等。
“取代的烷氧基”是指基团“取代的烷基-O-”。
“酰基”是指基团H-C(O)-、烷基-C(O)-、取代的烷基-C(O)-、链烯基-C(O)-、取代的链烯基-C(O)-、炔基-C(O)-、取代的炔基-C(O)-、环烷基-C(O)-、取代的环烷基-C(O)-、芳基-C(O)-、取代的芳基-C(O)-、杂芳基-C(O)-、取代的杂芳基-C(O)-、杂环-C(O)-和取代的杂环-C(O)-，其中烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环和取代的杂环如本文定义。
“氨基酰基”是指基团-C(O)NRR，其中各个R独立地选自氢、烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、环烷基、取代的环烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环、取代的杂环，且其中两个R基团可以与所连接的氮原子一起形成杂环或取代的杂环；其中烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环和取代的杂环如本文定义。当两个R连接成环时，通常是5-6元环，其任选地被能在R基团上存在的取代基所取代；通常其选自吡咯烷、哌啶、吗啉、硫吗啉和哌嗪。
“酰氧基”是指基团烷基-C(O)O-、取代的烷基-C(O)O-、链烯基-C(O)O-、取代的链烯基-C(O)O-、炔基-C(O)O-、取代的炔基-C(O)O-、芳基-C(O)O-、取代的芳基-C(O)O-、环烷基-C(O)O-、取代的环烷基-C(O)O-、杂芳基-C(O)O-、取代的杂芳基-C(O)O-、杂环-C(O)O-和取代的杂环-C(O)O-，其中烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环和取代的杂环如本文定义。
“氧酰基”或“羧基酯”是指基团-C(O)O-烷基、-C(O)O-取代的烷基、-C(O)O-链烯基、-C(O)O-取代的链烯基、-C(O)O-炔基、-C(O)O-取代的炔基、-C(O)O-芳基、-C(O)O-取代的芳基、-C(O)O-环烷基、-C(O)O-取代的环烷基、-C(O)O-杂芳基、-C(O)O-取代的杂芳基、-C(O)O-杂环和-C(O)O-取代的杂环，其中烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环和取代的杂环如本文定义。
“链烯基”是指具有2至6个碳原子且优选2至4个碳原子的链烯基，并且具有至少1个且优选1至2个链烯基不饱和位置。此类基团示例性的是乙烯基、烯丙基、丁-3-烯-1-基等。
“取代的链烯基”是指具有1个或多个、优选1至4个取代基且更优选1至2个取代基的链烯基。适当的取代基包括本文对烷基所描述的那些。
“炔基”是指具有2至6个碳原子且优选2至3个碳原子的炔基，并且具有至少1个且优选1至2个炔基不饱和位置。
“取代的炔基”是指具有1个或多个、优选1至4个取代基且更优选1至2个取代基的炔基。适当的取代基包括本文对烷基所描述的那些。“氰基”是指基团-CN。
“氨基”是指基团-NH2。
“取代的氨基”是指基团-NR’R”，其中R’和R”独立地选自氢、烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、环烷基、取代的环烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环、取代的杂环、-SO2-烷基、-SO2-取代的烷基，且其中R’和R”任选地与它们所连接的氮一起形成杂环或取代的杂环；条件是R’和R”不同时为氢。当R’是氢且R”是烷基时，该取代的氨基基团在本文中有时称为烷基氨基。当R’和R”都是烷基时，该取代的氨基基团在本文中有时称为二烷基氨基。当涉及单取代的氨基时，它表示R’或R”是氢但不同时为氢。当涉及二取代的氨基时，它表示R’或R”均不是氢。
“酰基氨基”是指基团-NRC(O)烷基、-NRC(O)取代的烷基、-NRC(O)环烷基、-NRC(O)取代的环烷基、-NRC(O)链烯基、-NRC(O)取代的链烯基、-NRC(O)炔基、-NRC(O)取代的炔基、-NRC(O)芳基、-NRC(O)取代的芳基、-NRC(O)杂芳基、-NRC(O)取代的杂芳基、-NRC(O)杂环和-NRC(O)取代的杂环，其中R是氢或烷基，且其中烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环和取代的杂环如本文定义。
“硝基”是指基团-NO2。
“氰基“是指基团-CN。
“芳基”或“Ar”是指6至14个碳原子的单价芳香族碳环基团，其具有单环(例如苯基)或者多个稠合的环(例如萘基或蒽基)，其中稠合的环可以是或者不是芳香族的(例如2-苯并噁唑啉酮、2H-1，4-苯并噁嗪-3(4H)-酮-7-基等)，条件是连接点在芳香族碳原子上。优选的芳基包括苯基和萘基。
“取代的芳基”是指被1个或多个、优选1至3个取代基且更优选1至2个取代基取代的芳基，适宜的取代基包括羟基、酰基、酰基氨基、酰氧基、烷基、取代的烷基、烷氧基、取代的烷氧基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、氨基、取代的氨基、氨基酰基、芳基、取代的芳基、芳氧基、取代的芳氧基、羧基、羧基酯、氰基、巯基、烷硫基、取代的烷硫基、芳基硫基、取代的芳基硫基、杂芳基硫基、取代的杂芳基硫基、环烷基硫基、取代的环烷基硫基、杂环基硫基、取代的杂环基硫基、环烷基、取代的环烷基、卤素、硝基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环、取代的杂环、杂芳氧基、取代的杂芳氧基、杂环氧基、取代的杂环氧基、氨基磺酰基(NH2-SO2-)和取代的氨基磺酰基。
“芳氧基”是指基团芳基-O-，其示例性地包括苯氧基、萘氧基等。
“取代的芳氧基”是指取代的芳基-O-基团。
“苄基”是指基团-CH2-苯基。
“芳基甲基”是指基团-CH2-芳基。
“羧基”是指-COOH或其盐。
“羧基酯”是指具有式-COOR的基团，其中R是取代或未取代的烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基。通常，R是任选取代的C1-C4烷基，例如甲基、乙基、异丙基或甲氧基乙基。
“环烷基”是指3至10个碳原子的环状烷基，其具有单个或多个环状环，示例性地包括金刚烷基、环丙基、环丁基、环戊基、环辛基等。
“螺环烷基”是指3至10个碳原子的环状基团，具有螺连接(该连接由单个原子形成，该原子是这些环的唯一共用成员)的环烷基环，如以下结构所示例，其中两个开放的价键连接形成环：
Figure GPA00001158902400201
“取代的环烷基”是指环烷基基团，其具有1至5个选自下组的取代基：烷基、取代的烷基、氧代(＝O)、硫代(＝S)、烷氧基、取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨基酰基、芳基、取代的芳基、芳氧基、取代的芳氧基、氰基、卤素、羟基、硝基、羧基、羧基酯、环烷基、取代的环烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环和取代的杂环。
“卤素”是指氟、氯、溴或碘，且优选是氟或氯。
“羟基”是指基团-OH。
“氧代”是指基团＝O。
“杂芳基”是指具有5至10个环原子，包括1至4个选自氧、氮和硫的作为环成员的杂原子的芳香族基团。此类杂芳基基团可具有单环(例如吡啶基或呋喃基)或者多个稠合的环(例如吲嗪基或苯并噻吩基)，其中所述稠合的环可以是或者不是芳香性的和/或含有杂原子，条件是该连接点是芳香族杂芳基基团的原子。在一个实施方案中，杂芳基基团的氮和/或硫环原子任选被氧化，以提供N-氧化物(N→O)、亚磺酰基或磺酰基部分。优选的杂芳基包括吡啶基、吡咯基、吲哚基、噻吩基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、咪唑基、三唑基和呋喃基。
“取代的杂芳基”是指被1至3个、优选1至2个选自对取代的芳基所定义的相同组取代基所取代的杂芳基基团。
“含氮杂芳基”和“含氮的取代杂芳基”是指包含至少一个环氮原子且任选地包含其它杂原子如硫、氮或氧等的杂芳基基团和取代的杂芳基基团。
“杂芳氧基”是指基团-O-杂芳基，“取代的杂芳氧基”是指基团-O-取代的杂芳基，其中杂芳基和取代的杂芳基如本文定义。
“杂环”或“杂环烷基”或“杂环基”是指具有单环或多个稠合环的饱和或不饱和基团，其环内具有3至10个碳原子(包括1至4个选自氮、硫或氧的杂原子作为环原子)，包括稠合桥接和螺环系统，其中在稠合环系统中，一个或多个环可以是环烷基、芳基或杂芳基，条件是连接点通过杂环。在一个实施方案中，杂环基团的氮和/或硫原子任选地被氧化，以提供N-氧化物、亚磺酰基和磺酰基部分。
“取代的杂环”或“取代的杂环烷基”或“取代的杂环基”是指被1个或多个，优选1至3个选自本文所述取代基的取代基取代的杂环基。适宜的取代基包括本文所述用于烷基和环烷基的那些。
杂环基和杂芳基的例子包括但不限于：氮杂环丁烷、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲嗪、异吲哚、吲哚、二氢吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、酞嗪、萘基吡啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、菲咯啉、异噻唑、吩嗪、异噁唑、吩噁嗪、吩噻嗪、咪唑烷、咪唑啉、哌啶、哌嗪、二氢吲哚、邻苯二甲酰亚胺、1，2，3，4-四氢异喹啉、4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩、噻唑、噻唑烷、噻吩、苯并[b]噻吩、吗啉基、硫代吗啉基(也称为硫吗啉基)、1，1-二氧代硫代吗啉基、哌啶基、吡咯烷、四氢呋喃基等。
“含氮杂环”和“含氮的取代杂环”是指包含至少一个环氮原子且任选地包含其它选自硫、氧等杂原子作为环原子的杂环基团。
“巯基”是指基团-SH。
“烷硫基”或“硫代烷氧基”是指基团-S-烷基。
“取代的烷硫基”或“取代的硫代烷氧基”是指基团-S-取代的烷基。
“芳基硫基”是指基团-S-芳基，其中芳基如上文定义。
“取代的芳基硫基”是指基团-S-取代的芳基，其中取代的芳基如上文定义。
“杂芳基硫基”是指基团-S-杂芳基，其中杂芳基如上文定义。
“取代的杂芳基硫基”是指基团-S-取代的杂芳基，其中取代的杂芳基如上文定义。
“杂环基硫基”是指基团-S-杂环基，“取代的杂环基硫基”是指基团-S-取代的杂环基，其中杂环基和取代的杂环基如上文定义。
“杂环氧基”是指基团杂环基-O-，“取代的杂环氧基”是指基团取代的杂环基-O-，其中杂环基和取代的杂环基如上文定义。
“环烷基硫基”是指基团-S-环烷基，“取代的环烷基硫基”是指基团-S-取代的环烷基，其中环烷基和取代的环烷基如上文定义。
本文所用“生物活性”是指在实施例1-13所列的至少一种测定法中测试的抑制浓度。
如本文所用，术语“可药用盐”是指式(I)和(II)化合物的无毒酸盐或碱土金属盐。这些盐可以在式(I)和(II)化合物的最终分离和纯化期间原位制备，或单独将碱或酸官能团分别与合适的有机或无机酸或碱反应来制备。代表性的可药用盐包括但不限于下列：乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、环戊烷丙酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、葡糖庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、马尿酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酯酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。也可用以下试剂将碱性含氮基团季铵化：例如烷基卤化物，例如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物；硫酸二烷基酯，例如硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二丁酯和硫酸二戊酯；长链卤化物，例如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基的氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基卤化物，例如苄基溴和苯乙基溴等。因而获得水或油可溶性或可分散的产物。
可用于形成可药用的酸加成盐的酸的例子包括无机酸，例如盐酸、硫酸和磷酸；有机酸，例如乙酸、马尿酸、乳酸、草酸、马来酸、甲磺酸、琥珀酸和柠檬酸。可以在最终分离和纯化式(I)和(II)化合物的期间原位制备碱加成盐，或单独将羧酸部分与合适的碱如可药用的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐，或与氨或有机伯胺、仲胺或叔胺反应来制备。可药用盐包括但不限于：基于碱金属和碱土金属的阳离子如钠、锂、钾、钙、镁、铝盐等，以及铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。其它可用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。
如本文所用，术语“可药用的酯”是指在体内水解的酯，包括在人体内裂解形成母体化合物或其盐的酯。合适的酯基团包括例如：来源于可药用的脂肪族羧酸的酯，尤其是链烷酸、链烯酸、环烷酸和链烷二酸的酯，其中每个烷基或链烯基部分有利地具有不超过6个碳原子。具体酯的代表性例子包括但不限于：甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、丙烯酸酯和乙基琥珀酸酯。
本文所用的术语“可药用的前药”是指本发明化合物的那些前药，其在合理的医学判断范围内适合用于与人和较低级动物的组织接触而无过度的毒性、刺激性、过敏反应等，具有合理的利益/风险比例，并且在用于预期用途时有效，可能的话也指本发明化合物的两性离子形式。术语“前药”是指在体内快速转化、例如通过在血液中水解而产生上述式的母体化合物的化合物。讨论见T.Higuchi和V.Stella，Pro-drugs as Novel DeliverySystems，Vol.14，A.C.S.Symposium Series，以及Edward B.Roche，编辑，Bioreversible Carriers in Drug Design，American PharmaceuticalAssociation和Pergamon Press，1987，二者通过引用并入本文。
本文所用的“抗癌药”或“治疗癌症的药物”或“癌症治疗剂”是指这些活性剂，其示例性地包括：诱导凋亡的活性剂；多聚核苷酸(例如核酶)；多肽(例如酶)；药物；生物学模拟物；生物碱；烷化剂；抗肿瘤抗生素；抗代谢物；激素；铂化合物；单克隆抗体；与抗癌药物、毒素和/或放射性核素缀合的单克隆抗体；生物学应答调节剂(例如干扰素和白介素等)；过继性免疫治疗药物；造血生长因子；诱导肿瘤细胞分化的活性剂(如全反式视黄酸等)；基因治疗试剂；反义治疗试剂和核苷酸；肿瘤疫苗；血管生成抑制剂；等等。许多其它活性剂也在本领域技术人员熟知的范围内。
应当理解，上述定义的所有取代基团中，用进一步的取代基限定取代基本身而得到的多重取代基(例如具有取代的芳基作为取代基的取代芳基，所述取代基本身又被取代的芳基所取代等)不包括在本文内容范围内。在这种情况下，这类取代基的最大数量为3。也就是说，每个上述定义具有以下限制，例如“取代的芳基”限于-取代的芳基-(取代的芳基)-取代的芳基。
类似地，应当理解上述定义不包括不被允许的取代模式(例如被5个氟取代的甲基，或在烯键或炔键的不饱和位置上的羟基基团，或在苯环上的二价基团例如氧代)。这些不被允许的取代模式是本领域技术人员熟知的。
本发明化合物可因为化合物中一个或多个不对称或手性中心的存在而显示立体异构性。本发明考虑了各种立体异构体及其混合物。本发明的某些化合物包含不对称取代的碳原子，这种不对称取代的碳原子可造成本发明化合物包含在特定不对称取代的碳原子处的立体异构体混合物或单一立体异构体。因此，本发明化合物的外消旋混合物、非对映体混合物、单一对映体以及单一非对映体都包括在本发明范围内。本文所用的术语“S”和“R”构型如IUPAC 1974“Recommendations for SectionE，FundamentalStereochemistry”，Pure Appl.Chem.45：13-30，1976所定义。所需的对映体可通过市售手性起始物质经本领域公知方法手性合成得到，或者可采用已知技术从对映体混合物通过分离所需的对映体得到。对于式(II)化合物的某些实施方案，所述化合物中至少一个立体中心描述了单一异构体；描述特定立体中心的单一异构体时，所描述的绝对相对立体化学是优选的实施方案。未指明具体立体化学时，立体中心可以是R或S构型，或可以是两者的任何混合物，包括外消旋混合物。
本发明的化合物也可具有几何异构现象。几何异构体包括具有双键例如链烯基、肟、亚胺或亚链烯基部分的本发明化合物的顺式或反式形式。本发明包括单个的几何异构体和立体异构体及其混合物。
本发明的化合物可通过本领域已知的方法制备，其在本文中进一步描述。例如，制备式(I)和式(II)的化合物的方法描述于已公布的申请PCT/US2005/022062(WO 06/002236)和相应的美国专利申请中。本文中提供了适用于制备式(II)化合物的另外的合成方法的实例。
式I和/或式II的某些KSP抑制剂的制备实例见下述方案1。
方案1
Figure GPA00001158902400251
将化合物1.1和1.2在含KI的丙酮中与K2CO3反应。发现使用K2CO3/丙酮的效果比Cs2CO3/乙醇好，因为K2CO3成本更低，并且由于化合物1.3在添加水后从丙酮溶液中沉淀，从而不需要含水的后处理来提取1.3。随后用乙酸铵(NH4OAc)在甲苯中的溶液回流酮酯1.3，获得咪唑1.4。与用迪安-斯托克分离器在二甲苯中回流相比，发现使用甲苯能提供更高的咪唑产率，因为前一方法导致反应混合物中的乙酸铵在除去时进入分离器内。将1.4与苄基溴和K2CO3在二甲基甲酰胺中的溶液反应获得1.5，其在加入水后可从反应溶液中沉淀。用甲醇和乙酰氯处理1.5获得1.6的盐酸盐，随后用NaOH/甲醇溶液滴定而转化为其游离碱。发现从1.1和1.2形成1.6的产率为81％，并具有高纯度(HPLC测定＞97％)和高光学纯度(＞99％e.e.)。
化合物1.6可在还原胺化条件下与醛HC(O)Rb′反应，或与Y-Rb反应(其中Y是离去基团)以引入氨基氮上的烷基，其随后可被酰化获得式(I)或(II)的化合物。方案2说明了可用于还原胺化步骤而制备式I和/或式II化合物、尤其是式IIa或IIb或IIc化合物的醛的制备。
方案2
Figure GPA00001158902400261
在还原胺化后，使用已知的酰化剂和条件来酰化所述仲胺，得到式(I)或(II)的化合物。方案3说明了还原胺化以提供VIIIa。胺被酰化后，脱去邻苯二甲酰亚胺的保护，除去游离羟基上的保护基团，获得式IIa的化合物。适宜的羟基保护基团包括例如可通过氢解除去的苄基醚，以及可通过诸如三甲基硅基碘化物的试剂而选择性除去的烷基碳酸酯。式IIa化合物经高分辨质谱测定质量为503.2609([M+H]+离子)，与分子式C27H33N4O2F3一致。
方案3
Figure GPA00001158902400271
该化合物进一步通过其IR谱鉴定，吸收带在3500-2700(br)，1641，1591，1508，1491，1162和1088cm-1。其通过下列NMR数据进一步表征。
Figure GPA00001158902400272
＊峰裂数：AB(AB四重峰)，b(宽峰)，d(二重峰)，dd(双二重峰)，m(多重峰)，s(单峰)，t(三重峰)。
＊＊19F-偶联多重峰的中点位移。
注意该分子中手性中心的绝对立体化学是基于已知原料或中间体的手性进行确认。HPLC和NMR数据支持上述方法能提供单一异构体形式化合物的结论。
使用同样的方法，用已知的手性α-羟基酰化剂制备化合物IIc。其显示了给定结构的预期质谱，包括m/z=517.3处的M+H分子离子峰，并且分析型HPLC的Rt＝3.70分(反相)。使用Waters LCT Premier质谱记录LC/ESI-MS数据，采用双电喷雾离子源和Agilent 1100液相色谱。MS系统的分辨率约为12000(FWHM定义)。以1.0mL/分的流速，用10％至95％梯度在2.5分钟内进行HPLC分离。使用10mM甲酸铵作为水相中的改性添加剂。磺胺地托辛(Sigma；质子化分子m/z 311.0814)作为参照，通过LockSprayTM通道每第3次扫描获得。该系统的质量精确度实测＜5ppm。
用于酰化步骤的适宜酰化剂和酸包括具有适当Rc基团的酰卤、酸酐和酸(参见式I)。适宜的酰胺偶联条件包括使用各种酰胺偶联剂形成酰胺键，例如碳二亚胺，N-N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、N-N’-二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)和1-乙基-3-(3’-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDCI)。碳二亚胺可用于和诸如二甲氨基吡啶(DMAP)的添加剂或苯并三唑如7-氮杂-1-羟基苯并三唑(HOAt)、1-羟基苯并三唑(HOBt)和6-氯-1-羟基苯并三唑(Cl-HOBt)结合使用；所述酰胺键形成的条件是本领域公知的。
其他的酰胺偶联剂还包括基于脲鎓和鏻的试剂，脲鎓盐包括N-[(二甲氨基)-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基脲鎓六氟磷酸盐N-氧化物(HATU)、N-[(1H-苯并三唑-1-基)(二甲氨基)亚甲基]-N-甲基脲鎓六氟磷酸盐N-氧化物(HBTU)、N-[(1H-6-氯苯并三唑-1-基)(二甲氨基)亚甲基]-N-甲基脲鎓六氟磷酸盐N-氧化物(HCTU)、N-[(1H-苯并三唑-1-基)(二甲氨基)亚甲基]-N-甲基脲鎓四氟硼酸盐N-氧化物(TBTU)和N-[(1H-6-氯苯并三唑-1-基)(二甲氨基)亚甲基]-N-甲基脲鎓四氟硼酸盐N-氧化物(TCTU)。鏻盐包括苯并三唑-1-基-氧-三-(二甲氨基)-鏻六氟磷酸盐(BOP)、7-氮杂苯并三唑-1-基-N-氧-三(吡咯烷子基)鏻六氟磷酸盐(PyAOP)和苯并三唑-1-基-N-氧-三(吡咯烷子基)鏻六氟磷酸盐(PyBOP)。
酰胺形成步骤可在极性溶剂例如二甲基甲酰胺(DMF)中进行，还可包括有机碱例如二异丙基乙胺(DIEA)或二甲氨基吡啶(DMAP)。
在制备式II化合物时选择、掺入和去除羟基的适当保护基团的方法是本领域公知的。基于上述反应方案，式II的化合物可由知晓如何选择适当原料以提供所需产物的人员使用本领域普通技术方便地制备。
“KSP抑制剂”是能抑制驱动蛋白纺锤体蛋白(KSP)任何可测量的活性的化合物。优选的，KSP抑制剂具有低于100mM的IC50，更优选低于10mM，通常低于1mM。
“增殖性疾病”包括任何影响脊椎动物的疾病或病症，其特征在于过度或不希望的增殖细胞。根据本发明，“治疗增殖性疾病的方法”包括在需要这种治疗的患者(例如哺乳动物，例如人)中通过单独施用有效量的KSP抑制剂或同时或先后施用有效量的化疗剂和/或放疗来治疗(抑制)细胞的异常生长的方法，包括转化的细胞。细胞的异常生长表示不依赖正常调节机制的细胞生长(例如接触抑制的丧失)，包括肿瘤细胞或其他增殖性疾病的良性和恶性细胞的异常生长。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述了哺乳动物的生理状况，其典型特征在于失控的细胞生长。
本文所用“肿瘤”是指所有的恶性或良性赘生细胞生长和增殖，以及所有的癌前和癌性细胞和组织。术语“实体瘤”是指除血液、骨髓和淋巴系统以外身体组织的癌或癌瘤。实体瘤的实例包括但不限于肺癌、乳腺癌、卵巢癌、皮肤癌、结肠癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、鼻咽癌、鳞状细胞癌、甲状腺乳头状癌、宫颈癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、头和颈部鳞状细胞癌和肉瘤。
本文所用术语“血液癌症”是指血液的癌症，包括白血病和恶性淋巴组织增生病症等。“白血病”是一种血液癌症，其中产生过多的白细胞或红细胞，由此造成其他构成血液的部分例如血小板和正常红细胞减少。应当理解白血病的病例分为急性或慢性。急性白血病中的癌细胞在未成熟阶段被阻断，但其继续扩增。因此，无功能的未成熟细胞大量积累，伴随的是功能性细胞的损失。慢性白血病进展缓慢，癌细胞发育至完全成熟。此外，白细胞可以是骨髓或淋巴的。因此，某些形式的白血病可以是例如急性淋巴性(或成淋巴细胞)白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴性白血病(CLL)或慢性髓细胞性白血病(CML)以及骨髓增生异常综合症。“恶性淋巴组织增生病症”是指淋巴瘤，例如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，或多发性骨髓瘤等。
某些本文中描述的肿瘤可对多种治疗剂耐药。“耐药”表示以正常施用速率或患者耐受的频率施用治疗剂对所述癌症未产生实质性影响。针对多种抗肿瘤剂的抗性的主要形式涉及排出细胞毒性分子的膜蛋白泵组的功能。“多药耐药泵”是指ATP结合盒(ABC)蛋白的超家族，其在细菌至人的有机体内均存在。ABC转运体泵位于细胞的质膜或不同细胞器的膜内，介导多种分子穿过这些屏障。大多数ABC泵利用了ATP水解的能量来完成该转运活性(活性转运蛋白)，但某些ABC泵形成特异性的膜通道。
许多临床研究披露，肿瘤的多药耐药表型与某些ABC泵的过表达有关，其称为多药耐药(MDR)蛋白。首先发现的是P-糖蛋白(称为P-gp、MDR1或ABCB1)介导的多药耐药性(Juliano，R.L.和Ung，v.，Biochim.Biophys.Acta，455，152-162(1976)；Chen，D.等，Cell，47，381-389(1986)；Ueda，K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，84，3004-3008(1987))，其或许仍然是最见的临床多药耐药机制(Endicott，JA和Ling，v.，Annu.Rev.Biochem.，58，137-171(1989)；Higgins，C.E，Ann.Rev.Cell Biol.，8，67-113(1992)；Gottesman，MM.和Pastan，I.，Annu.Rev.Biochem.，62，385-427(1993)；Gottesman，M.M等，Nat.Rev.Cancer；2，48-58(2002))。还有两个已证实参与肿瘤多药耐药性的其他ABC泵：多药耐药蛋白1(MRP1，ABCC1)和米托蒽醌耐药蛋白(MXR/BCRP，ABCG2)((Gottesman，M.M，同上，Cole，S.P.c.等，Science，258，1650-1654(1992)；Borst，P.等，J.Natl.Cancer.Inst.，92，1295-1302(2000)；Deeley，R.G.和Cole，S.P.c.，Sem.Cancer Bio I.，8，193-204(1997)；Litman，l等，Cell.Mol.Life Sci.，58，931-959(2001))。此外，其他能将多种化合物主动转运出细胞的人ABC泵也在选定的多药耐药例子中起作用。其包括ABCB4(MDR3)和ABCB11(姐妹P-gp或BSEP)，此二者主要位于肝，其功能分别与磷脂酰胆碱和胆汁酸的分泌有关(Lecureur，V.等，Toxicol.，152，203-219(2000)；Paulusma，c.c.等，Science，271，1126-1128(1996)；Paulusma，c.c.等，Hepatology，25，1539-1542(1997))。已显示MDR3也能转运某些药物(Smith，AJ.等，J.Bioi.Chem.，275，23530-23539(2000))。除MRP1外，已克隆了5种同系物(MRP2-MRP6)。MRP2(一种能排出疏水化合物的有机阴离子转运蛋白)的过表达明显显示能造成癌症MDR9(Kool，M等，Cancer Res.，57，3537-3547(1997))。MRP3(一种有机缀合物转运蛋白泵)和MRP5(一种核苷转运蛋白泵)也是引起某些形式的耐药性的候选蛋白(Borst，P.等，同上)。
“抗体”和“免疫球蛋白”(Ig)是具有同样结构特征的糖蛋白。抗体具有对抗原的结合特异性，免疫球蛋白包括抗体和其他缺乏抗原特异性的抗体样分子。后一种多肽例如由淋巴细胞以低水平生成和由骨髓瘤以高水平生成。
本文所用词语“标记”是指与抗体直接或间接缀合的可检测的化合物或成分，以产生“标记的”抗体。标记可以通过其自身检测(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶标记的情况下，可催化底物化合物或组合物产生可检测的化学变化。可作为可检测标记的放射性核素包括，例如I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212和Pd-109。标记也可以是非放射性物质，例如可通过其生物学或生物化学活性检测的毒素。
术语“拮抗剂”以最宽的含义使用，包括部分或完全地阻断、抑制或中和本文公开的天然靶点的生物活性或其转录或翻译的任何分子。
本文所用“载体”包括可药用的载体、赋形剂或稳定剂，其对于暴露在使用剂量和浓度下的细胞或哺乳动物是无毒的。通常生理学上可接受的载体是水性pH缓冲溶液。生理学可接受的载体实例包括缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和其他有机酸类；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(低于约10个残基)的多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；成盐平衡离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如TWEEN、聚乙二醇(PEG)和普流罗尼类。与一种或多种其他治疗剂“组合”施用包括同时和以任何顺序先后施用。优选的，所述方法中组合的治疗剂均以治疗相关水平在所治疗的个体体内同时存在。
本文所用“宿主细胞”是指作为单细胞实体培养的微生物或真核细胞或细胞系，其可用作重组载体或其他转移多核苷酸的受者，包括被转染的原始细胞的子代。应当理解，由于天然的、偶然的或故意的突变，单细胞的子代可能与原始母体的形态学或基因组或总DNA并不必然完全相同。
本文所用“治疗”定义为向个体应用或施用KSP抑制剂，或向来自个体的分离组织或细胞系应用或施用KSP抑制剂，其中所述个体患有实体瘤或血液癌症、与实体瘤或血液癌症相关的症状，或对发生实体瘤或血液癌症易感，其目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、纠正、改善、改良或影响实体瘤或血液癌症、与实体瘤或血液癌症相关的任何症状或对发生实体瘤或血液癌症的易感性。个体可以是哺乳动物，在某些实施方案中个体是人类。通常，个体是已诊断为具有至少一种本文所述病症的人，其适于使用本发明的化合物和方法治疗。在特别的实施方案中，所述个体可以是具有表达促进耐药的流出泵例如P-gp的癌症的患者，或者所述个体可以是具有证实对药物例如紫杉醇或SB-715992耐药的肿瘤的患者。
“治疗”同样意味着向个体应用或施用包含KSP抑制剂的药物组合物，或向来自个体的分离组织或细胞系应用或施用包含KSP抑制剂的药物组合物，其中所述个体患有实体瘤或血液癌症、与实体瘤或血液癌症相关的症状，或对发生实体瘤或血液癌症易感，其目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、纠正、改善、改良或影响实体瘤或血液癌症、与实体瘤或血液癌症相关的任何症状或对发生实体瘤或血液癌症的易感性。
“抗肿瘤活性”意味着恶性细胞增殖或蓄积的速率下降，由此导致已有肿瘤或治疗期间发生的肿瘤的生长速率下降，和/或已有瘤(肿瘤)细胞或新生瘤细胞破坏，进而使治疗期间肿瘤的总体尺寸减小。至少一种KSP抑制剂的治疗引起对人实体瘤治疗有益的生理学响应。至少一种KSP抑制剂的治疗引起对人血液肿瘤治疗有益的生理学响应。已认识到本发明的方法能有效预防治疗期间肿瘤的进一步向外生长。
根据本发明的方法，使用至少一种本文别处定义的KSP抑制剂来促进关于实体瘤或血液癌症的积极的治疗响应。关于癌症治疗的“积极的治疗响应”意指改善与这些抗体或其片段的抗肿瘤活性相关的疾病，和/或改善与所述疾病相关的症状。即，可观察到抗增殖效应、预防肿瘤进一步向外生长、降低肿瘤尺寸、降低癌细胞数目和/或减少一种或多种由刺激癌细胞介导的症状。因此，例如，所述疾病的改善可以完全的响应为特征。“完全的响应”是指根据任何先前的异常放射照相研究、骨髓和脑脊液(CSF)的标准而没有临床可检测到的疾病。所述响应必须在根据本发明的方法治疗后持续至少1个月。或者，疾病的改善可属于部分响应。“部分响应”指在无新的病变情况下，所有可测量的肿瘤负荷(即个体体内的肿瘤细胞数目)降低至少约50％，并且持续至少1个月。所述的响应仅适用于可测量的肿瘤。
肿瘤的响应可使用筛选技术以肿瘤形态学(即总体肿瘤负荷、肿瘤尺寸等)的变化进行评估，所述筛选技术例如磁共振成像(MRI)扫描、X放射照相成像、计算机体层摄影术(CT)、生物发光成像例如荧光素酶成像、骨扫描成像和包括骨髓穿刺(BMA)的肿瘤活体组织检查。除这些积极的治疗响应外，接受KSP抑制剂治疗的个体可体验改善疾病相关症状的有益效果。
“治疗有效剂量或治疗有效量”或“有效量”是指在治疗实体瘤或血液癌症患者时能带来积极的治疗响应的KSP抑制剂的量。已认识到所述治疗方法可包括单次施用治疗有效剂量或多次施用治疗有效剂量的抑制剂。
Bcr-Abl酪氨酸激酶基因编码融合蛋白，其由BCR和ABL基因的异常连接产生。该融合物发现于由交互易位t(9：22)造成的所谓费城染色体上，该易位导致Bcr-Abl融合基因的形成，从而引起ABL酪氨酸激酶不受调节的表达。费城染色体的存在被认为是导致CML和ALL的诱发因素之一(Abraham，(2007)Community Oncology 4(1)p.11-14)。目前，Bcr-Abl酪氨酸激酶是新一类Bcr-Abl抑制性治疗化合物的靶点，例如伊马替尼(
Figure GPA00001158902400341
Novartis)、dasatinib(
Figure GPA00001158902400342
Bristol-Myers Squibb)和尼洛替尼(AML107，Novartis)。Bcr-Abl酪氨酸激酶作用于KSP蛋白上游。
在某些优选的实施方案中，所述KSP抑制剂与至少一种其他“活性化合物”组合施用，其可以是癌症治疗，包括但不限于外科手术、放射治疗、化学治疗、细胞因子治疗、或其他用于治疗该实体瘤的单克隆抗体，其中所述其他癌症治疗在所述KSP抑制剂治疗之前、期间或之后进行，两种治疗剂均以治疗水平存在于个体中。因此，当组合治疗包括施用KSP抑制剂与另一种治疗剂如化疗、细胞因子治疗或其他单克隆抗体的组合时，本发明的方法包括使用分离的制剂或单一药物制剂的共同施用，以及以任何顺序进行的先后施用，其中优选两种(或所有)活性剂同时发挥其治疗活性的时期。当本发明的方法包括组合治疗方案时，这些治疗可同时进行，即KSP抑制剂与另一种癌症治疗同时或在相同的时间段内施用(即，所述治疗同时进行，但KSP抑制剂并非精确地与另一种癌症治疗在同一时间点施用)。或者，本发明的KSP抑制剂可在另一种癌症治疗前或后施用。不同癌症治疗的先后施用可以不考虑所治疗的个体是否对第一阶段治疗有响应，以降低减轻或复发的可能。
在本发明的某些实施方案中，本文所述KSP抑制剂与化学治疗或细胞因子治疗组合施用，其中KSP抑制剂和化疗剂或细胞因子可以任何顺序先后或同时(即同时或在同一时间段内)施用。适宜化疗剂的实例包括但不限于CPT-11(伊立替康)，其可用于治疗例如结肠直肠癌和非小细胞肺癌；吉西他滨，其可用于例如治疗肺癌、乳腺癌和上皮卵巢癌；以及其他适于治疗实体瘤的化疗剂。所述细胞因子包括但不限于α-干扰素、γ-干扰素、白介素2(IL-2)、IL-12、IL-15和IL-21，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或这些细胞因子的生物活性变体。
在本发明的其他实施方案中，本文所述KSP抑制剂与用于治疗实体瘤的单克隆抗体组合施用。因此，例如当个体正接受胃或结肠癌治疗时，治疗可包括施用有效量的本文所述KSP抑制剂与施用有效量的单克隆抗体，例如(也称为西妥昔单抗；ImClone Systems Incorporated，NewYork，New York and Bristol Meyers Squibb，Princeton，New Jersey)。类似的，当个体正接受结肠直肠癌治疗时，治疗可包括施用有效量的本文所述KSP抑制剂与施用有效量的人源化单克隆抗体AvastinTM(也称为贝伐珠单抗，Genentech，Inc.，San Francisco，California)的组合，所述抗体结合并抑制血管内皮生长因子(VEGF)，一种在肿瘤血管发生中起重要作用的蛋白。或者，在正接受乳腺癌治疗的个体中，治疗可包括施用有效量的本文所述KSP抑制剂与施用有效量的人源化单克隆抗体
Figure GPA00001158902400352
(也称为曲妥珠单抗，Genentech In，San Francisco，California)的组合。其他可与本发明的KSP抑制剂组合施用以治疗实体瘤的单克隆抗体实例包括但不限于针对表皮生长因子受体的抗EGFR抗体(例如IMC-C225(ImClone Systems，NewYork，New York)(参见例如Mendelsohn和Baselga(2000)Oncogene19：6550-6565和Solbach等(2002)Int.J.Cancer 101：390-394)；抗IGF-1受体的抗体，靶向于IGF-1受体蛋白(参见例如Maloney等(2003)CancerRes.63：5073-5083和Hailey等(2002)Mol.Cancer.Ther.1：1349-1353；抗MUC1抗体，其靶向于肿瘤相关抗原MUC1；抗-α5β1、抗-αVβ5和抗-αvβ3，其靶向于这些各自的整联蛋白，所述整联蛋白调节细胞粘附和与细胞增殖和存活相关的信号过程(参见例如Laidler等(2000)ActaBiochimica Polonica 47(4)：1159-1170和Cruet-Hennequart等(2003)Oncogene 22(11)：1688-1702)；抗-P-钙粘蛋白抗体，靶向于该钙粘蛋白家族成员(参见例如未决的美国专利申请20030194406)；以及抗-VE-钙粘蛋白抗体，其靶向于该表皮细胞特异性粘附分子的血管生成相关功能(参见例如Liao等(2002)Cancer Res.62：2567-2575)。在这些组合优选的实施方案中，KSP抑制剂是式(II)的化合物，其可以是式IIa、IIb或IIc的化合物。
本发明的KSP抑制剂和单克隆抗体可以任何顺序先后或同时(即同时或在同一时间段内)施用。当施用不只一种类型的单克隆抗体时，本发明的方法还可包括根据指导医师的建议和正接受治疗的癌症所需而接受放射和/或化学治疗。
实施例
实施例1：测定KSP活性的试验
来自牛脑的经纯化的微管购自Cytoskeleton Inc.(Denver，Colorado，USA)。将人KSP(Eg 5，KNSL1)的动力域克隆，表达，纯化至大于95％同质性。Biomol GreenTM购自Affinity Research Products Ltd.(MatfordCourt，Exeter，Devon，英国)。将微管和KSP动力蛋白(即KSP动力域)稀释在试验缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM MgCl2、10mM DTT和0.25mg/mL BSA)中，最终浓度35μg/mL微管和45nM KSP。然后将微管/KSP混合物在37℃预先孵育10分钟以促进KSP与微管的结合。
向含有1.25μL抑制剂或试验化合物的DMSO溶液(或在对照中仅有DMSO)的试验板(384-孔板)的每个孔中加入25μL ATP溶液(ATP在试验缓冲液中稀释至浓度300μM)和25μL上述微管/KSP溶液。将板在室温孵育1小时。孵育后，向每个孔中加入65μL Biomol GreenTM(基于孔雀石绿的染料，检测无机磷酸盐的释放)。将板再孵育5-10分钟，然后用Victor II型读板仪测定630nm处的吸光度。630nm处吸光度的量对应于样品中KSP活性的量。然后，基于每个浓度下630nm处吸光度的降低，采用Excel的XLFit或GraphPad Software Inc的Prism数据分析系统，通过非线性回归，确定每种抑制剂或试验化合物的IC50。
本发明优选的化合物测定的生物活性为IC50小于约1mM，优选实施方案的生物活性小于约25μM，特别优选实施方案的生物学活性小于约1000nM，最优选实施方案的生物学活性小于约100nM。式II的化合物在该试验中进行了测试，发现其IC50值低于该试验的检测限(约为2-4nM)。
实施例2：用化合物IIa处理的肿瘤细胞系中细胞增殖的抑制作用
使用的细胞系如下：HCT-116(国立癌症研究所的DCTF肿瘤贮藏室，目录#NCI 502568，Rockville，MD)，HCT-15(国立癌症研究所的DCTF肿瘤贮藏室，目录#NCI 502711，Rockville，MD，从美国典型组织收藏中心获得，目录#CLL-225)，KB-3-1(从DSMZ获得，Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德国微生物和细胞培养物收藏中心-目录编号ACC 158)，KB-V1(从DSMZ获得-目录编号ACC 149)，AGS(美国典型培养物收藏中心获得，Manassas VA，目录编号CRL-1739TM)，N87(美国典型培养物收藏中心获得，Manassas VA，目录编号CRL-5822)，Hel92.1.7(美国典型培养物收藏中心获得，Manassas VA，目录编号TIB 180)，K562(美国典型培养物收藏中心获得，Manassas VA，目录编号CRL-243TM)，MV4；11(美国典型组织收藏中心，Manassas VA，目录编号CRL-9591)和U937(美国典型培养物收藏中心获得，Manassas VA，目录编号CRL-1593.2)。
将细胞以约500个细胞/孔的密度接种到96孔板中，使细胞生长24小时。然后用各种浓度的化合物处理细胞72小时。接着加入100微升CellTiter
Figure GPA00001158902400381
(Promega公司)。CellTiter
Figure GPA00001158902400382
用于测定活细胞数的同质方法，使用单一CellTiter-
Figure GPA00001158902400383
试剂检测ATP(美国专利6,602,677和7,241,584)(参见Promega产品编号#G7570)。加入CellTiter-
Figure GPA00001158902400384
试剂后，将细胞在黑暗中孵育30分钟。采用Walloc Trilux读板仪测定每孔发光量，其对应于每孔细胞数。仅接受DMSO(0.5％)的孔中活细胞的数量用作0％抑制的指征，而无细胞的孔用作100％细胞生长抑制。由连续接触化合物72小时的对数-转换的剂量值相对细胞计数(对照的百分数)的S形剂量-响应曲线经图解法确定导致50％生长抑制的化合物浓度(GI50)。数据在表1中列出，在所有测试的细胞系中观察到广谱抗增殖效应(GI50值0.1-6.5nM)。该广谱活性与作为有丝分裂抑制剂的化合物一致。
表1-化合物IIa的体外抗增殖活性(GI50值，nM)
  肿瘤类型   细胞系   GI50(nM)  #试验数   倍增时间(hr)
  结肠   HCT-116   0.1   4   22
  结肠   HCT-15   0.3   9   34
  表皮   KB3.1   0.6   15   24
  表皮   KB8.5   0.5   16   24
  表皮   KBV1   6.5   11   29
  胃   AGS   0.2   4   20
  胃   N87   1.0   2   47
  白血病   Hel92.1.7   0.5   4   18
  白血病   K562   0.1   4   30
  白血病   MV4-11   0.2   2   36.5
  白血病   U937   0.1   4   24
P-糖蛋白(P-gp，也称为MDR1)是流出泵，它是介导表达其的细胞内对若干细胞毒药物的多药耐药性的ABC转运蛋白。本研究中使用的某些细胞系(HCT-15、KBV1和KB8.5)表达P-gp，可从表1中看出，这些细胞系对于式II的KSP抑制剂是敏感的。下面的实施例12说明了在酰基部分缺乏羟基的式I的类似化合物在体内对所述肿瘤是无活性的。
实施例3：KSP抑制剂对癌细胞系细胞周期的体外效应
用本发明的KSP抑制剂处理淋巴瘤细胞系的细胞，用FACS分析。收集约2×105个细胞，细胞沉淀用冷的PBS洗两次，再悬浮于500μL冷PBS中。缓慢旋转的同时加入8mL冷的80％乙醇固定细胞。温育15分钟后，固定的细胞用PBS洗两次，细胞沉淀再悬浮于1mL PI/RNASE染色缓冲液中(BD PharmingenTM目录号#550825)，并在37℃避光温育15分钟。碘化丙啶(PI)是染色DNA和RNA的荧光活体染料。因此RNA必须用核糖核酸酶(RNase)消化除去。在FACS分析前，使染色的细胞通过细胞滤器进入FACS管中以减少细胞团的数目(BD Falcon#352235)。固定并染色的细胞的DNA含量使用BD FACSCalibur流式细胞仪分析，使用CellQuest软件。
用KSP抑制剂处理癌细胞导致有丝分裂停滞，但各细胞系停滞的程度、其持续时间和停滞的后果不同。有丝分裂停滞后，细胞具有若干种选择，包括从停滞中恢复并正常分裂、直接凋亡或进入无胞质分裂的有丝分裂(一种现象，称为有丝分裂滑脱)。如果细胞发生有丝分裂滑脱，它们可进入假的G1期，随后继续循环、衰老或经历凋亡。某些所述差异是使用KSP抑制剂治疗淋巴瘤细胞系SUDHL-4(从DSMZ获得的B细胞淋巴瘤，Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德国微生物和细胞培养物收藏中心，目录编号ACC 495)和RL(人非霍奇金淋巴瘤细胞系，美国典型培养物收藏中心，Manassas VA，目录编号CRL-2261TM)的要点。
两种细胞系均由于化合物IIa而在有丝分裂时停滞，但SUDHL-4细胞在处理48小时后凋亡，其标志为具有低于2N DNA含量的细胞数增加，而RL淋巴瘤细胞仍然维持在有丝分裂停滞状态，既没有诱导凋亡也没有发生有丝分裂滑脱。参见图2。
实施例4-KSP抑制剂筛选试验
对本发明KSP抑制剂最敏感的肿瘤类型的鉴定可使用一些基于细胞试验的无偏见的方法完成。所选择的试验如下：
■CellTiter-
Figure GPA00001158902400401
这是设计测量细胞培养物中ATP浓度的试验，可与细胞数目相关。简而言之，CellTiter-
Figure GPA00001158902400402
(Promega公司)是使用单一CellTiter-
Figure GPA00001158902400403
试剂检测ATP的均质方法，该试验中ATP驱动热稳定的荧光素酶活性来产生荧光信号，其可随后测量并与活细胞的数目相关联。简言之，对于粘附细胞，以1,000至5,000细胞/孔置于96孔板(100μl/孔)中，在用药物处理前粘附24小时。对于非粘附细胞，以1,000至10,000细胞/孔置于96孔板(100μl/孔)中，立即用药物处理。药物稀释液在DMSO中以1000倍最终浓度制备。这些稀释液在生长培养基中1/100稀释，加入到细胞中(11μl/孔)获得最终所需浓度。在37℃组织培养箱中培育48小时后，根据厂商说明书处理培养板，用于CellTiter-
Figure GPA00001158902400404
测试。72小时细胞增殖试验方案：该72小时试验按48小时试验同样进行，除了以下改变：对于粘附细胞，以500至5,000细胞/孔置于96孔板(90μl/孔细胞生长培养基)中，在用药物处理前粘附24小时。对于非粘附细胞，以1,000至10,000细胞/孔置于96孔板(90μl/孔细胞生长培养基)中，立即用药物处理。给出的数值表示生长下降50％所需的试验化合物浓度。
■LDH释放。细胞毒性检测KitPLUS(LDH)试验(Roche Diagnostics，Manheim，德国)测定了培养基中由濒死细胞释放的LDH量；LDH催化乳酸盐转化为丙酮酸盐。该酶反应与使用四唑鎓盐形成红色甲
Figure GPA00001158902400405
的化学反应偶联，可通过其在490nm处的吸收检测。该试验测定了药物处理后细胞死亡的量。细胞以10,000细胞/孔铺于96-孔板中(100μl/孔)。粘附细胞在用药物处理前粘附24小时，而非粘附细胞则立即用药物处理。药物稀释液在DMSO中以1000倍最终浓度制备。这些稀释液在加入到细胞中(11μl/孔)获得最终所需浓度前在生长培养基中1/100稀释。在37℃组织培养箱培育48小时后，根据厂商说明书处理培养板，用于细胞毒性检测KitPLUS(LDH)测试。分析前从所有数据点扣除仅有培养基的值。给出的数值对应于化合物的浓度，其中LDH产量是半数最高水平。
■半胱天冬酶-3/7。半胱天冬酶-
Figure GPA00001158902400412
3/7试验(Promega公司)是测量半胱天冬酶-3/7活性的均质发光试验。该试验提供了发光原半胱天冬酶-3/7DEVD-氨基荧光素底物和热稳定的荧光素酶，其位于用于优化半胱天冬酶-3/7活性、荧光素酶活性和细胞裂解的试剂中。加入单一半胱天冬酶-
Figure GPA00001158902400413
3/7试剂导致细胞裂解和随后的半胱天冬酶底物切割。其释放出游离的氨基荧光素，其被荧光素酶消耗，产生发光信号。该信号与半胱天冬酶-3/7活性成比例。给出的数值对应于化合物的浓度，其中半胱天冬酶3/7活性是半数最高水平。
选择5种已知对本发明KSP抑制剂具有不同敏感性的细胞系，以证实所述筛选方法的可预测性。所述细胞系如下：
HCT-116和HT29。HCT-116是衍生自人结肠上皮癌的细胞系，已显示在体内对本发明的KSP抑制剂敏感。HT29(从美国典型培养物收藏中心获得，Manassas VA，目录号HTB-38)同样衍生自人结肠上皮癌，但对KSP抑制剂的敏感性较低。
MV4；11(美国组织培养物收藏中心(目录号#CRL-9591，Rockville，MD)是急性髓细胞性白血病(AML)细胞系。
Colo205(美国组织培养物收藏中心(目录号#HB-8307，Rockville，MD)是人结肠直肠癌细胞系)。
T47D(从美国组织培养物收藏中心获得(目录号#HTB-133，Rockville，MD)是衍生自人乳导管癌的细胞系，在纺锤体检查点中有缺陷。
化合物IIa的数据如表2中所示。这些结果表明这些试验之间普遍符合较好，可用于不同细胞类型的广泛筛选，以筛选KSP抑制剂和筛选敏感性细胞类型。
表2-增殖/存活筛选试验
Figure GPA00001158902400421
实施例5-KSP抑制剂对细胞系NCI60组的活性
NCI-60组是标准化的肿瘤细胞系组，通常用于研究不同来源的肿瘤对给定试剂的敏感性(Shoemaker 2006 Nat Rev Cancer；6：813-23.)。使用上述的CellTiter-
Figure GPA00001158902400422
试验测量多种肿瘤衍生细胞系对KSP抑制剂化合物的敏感性。表3给出了化合物IIa的数据，表明许多肿瘤衍生的细胞系对本发明的KSP抑制剂是敏感的。
表3-化合物IIa的CellTiter-Glo数据概述
  细胞组   细胞系   GI50   Log(GI50)   差值
  白血病   CCRF-CEM   0.215   -0.6676   0.999
  白血病   HL-60   0.165   -0.7825   1.114
  白血病   K-562   0.218   -0.6615   0.993
  白血病   MOLT-4   0.331   -0.4802   0.811
  细胞组   细胞系   GI50   Log(GI50)   差值
  白血病   RPMI-8226   0.351   -0.4547   0.786
  白血病   SR   0.095   -1.0223   1.353
  NSCL   A549   10   1.0000   -0.669
  NSCL   EKVX   10   1.0000   -0.669
  NSCL   HOP-62   10   1.0000   -0.669
  NSCL   HOP-92   10   1.0000   -0.669
  NSCL   NCI-H226   10   1.0000   -0.669
  NSCL   NCI-H23   0.223   -0.6517   0.983
  NSCL   NCI-H322M   10   1.0000   -0.669
  NSCL   NCI-H460   0.378   -0.4225   0.754
  NSCL   NCI-H522   0.166   -0.7799   1.111
  结肠   COLO 205   10   1.0000   -0.669
  结肠   HCC-2998   0.608   -0.2161   0.547
  结肠   HCT-116   0.138   -0.8601   1.191
  结肠   HCT-15   0.378   -0.4225   0.754
  结肠   HT29   10   1.0000   -0.669
  结肠   KM12   0.423   -0.3737   0.705
  结肠   SW-620   0.236   -0.6271   0.958
  CNS   SF-268   10   1.0000   -0.669
  CNS   SF-295   0.162   -0.7905   1.122
  CNS   SF-539   0.387   -0.4123   0.743
  CNS   SNB-19   10   1.0000   -0.669
  CNS   SNB-75   10   1.0000   -0.669
  CNS   U251   0.239   -0.6216   0.953
  黑素瘤   LOX IMVI   10   1.0000   -0.669
  黑素瘤   MALME-3M   10   1.0000   -0.669
  细胞组   细胞系   GI50   Log(GI50)   差值
  黑素瘤   M14   0.209   -0.6799   1.011
  黑素瘤   SK-MEL-2   2.773   0.4429   -0.112
  黑素瘤   SK-MEL-28   10   1.0000   -0.669
  黑素瘤   SK-MEL-5   10   1.0000   -0.669
  黑素瘤   UACC-257   10   1.0000   -0.669
  黑素瘤   UACC-62   10   1.0000   -0.669
  黑素瘤   MDA-MB-435   0.152   -0.8182   1.149
  卵巢   IGROV1   10   1.0000   -0.669
  卵巢   OVCAR-3   10   1.0000   -0.669
  卵巢   OVCAR-4   10   1.0000   -0.669
  卵巢   OVCAR-5   10   1.0000   -0.669
  卵巢   OVCAR-8   0.324   -0.4895   0.821
  卵巢   SK-OV-3   0.421   -0.3757   0.707
  卵巢   NCI/ADR-RES   4.18   0.6212   -0.290
  肾   786-0   10   1.0000   -0.669
  肾   A498   10   1.0000   -0.669
  肾   ACHN   10   1.0000   -0.669
  肾   CAKI-1   10   1.0000   -0.669
  肾   RXF 393   10   1.0000   -0.669
  肾   SN12C   10   1.0000   -0.669
  肾   TK-10   10   1.0000   -0.669
  肾   UO-31   10   1.0000   -0.669
  前列腺   PC-3   10   1.0000   -0.669
  前列腺   DU-145   0.435   -0.3615   0.693
  乳腺   MCF7   10   1.0000   -0.669
  乳腺   MDA-MB-231   0.333   -0.4776   0.809
  细胞组   细胞系   GI50   Log(GI50)   差值
  乳腺   HS 578T   0.22   -0.6576   0.989
  乳腺   BT-474   10   1.0000   -0.669
  乳腺   BT-549   0.809   -0.0921   0.423
  乳腺   T-47D   10   1.0000   -0.669
  平均值   2.143   0.331
GI50值是导致50％生存率的化合物浓度(以nM表示)。
差值：平均Log(GI50)(0.331)和每一细胞系的Log(GI50)间的差异。
平均值：GI50值为几何平均值，Log(GI50)值为算术平均值。
实施例6-KSP抑制剂针对衍生自血液恶性肿瘤的细胞系的活性
表3中的数据显示白血病细胞系对本发明KSP抑制剂最为敏感。因此，对衍生自血液恶性肿瘤的若干种细胞系的组进行了CellTiter-
Figure GPA00001158902400451
试验，结果列于下表4和图1。
表4化合物IIa针对衍生自血液恶性肿瘤的GI50值
  疾病   细胞系   目录编号   GI50(nM)   Log(GI50)   差值
  AML   MV4；11   ATCC CRL-9591   0.08   -1.114   0.644
  AML   MV4；11Luc   衍生自MV4；11   0.11   -0.979   0.509
  AML   AML-193   ATCC CRL-9589   0.11   -0.959   0.489
  AML   Kasumi-1   ATCC CRL-2724   0.44   -0.357   -0.113
AML SET-2   可从DSMZ获得ACC608 0.34 -0.469 -0.001
  AML   MOLM13-Luc   得自ATCC 30-2001   0.23   -0.645   0.175
AML HL60   得自ATCCCCL-240 0.17 -0.783 0.313
  AML   HL60-Luc   得自ATCC 30-2001   0.51   -0.297   -0.173
  AML   HEL92   ATCC TIB-180   0.49   -0.310   -0.160
  疾病   细胞系   目录编号   GI50(nM)   Log(GI50)   差值
CML K562   得自ATCCCCL-243 0.21 -0.680 0.210
  ALL   CCRF-CEM   ATCC CCL-119   0.16   -0.785   0.315
  ALL   RS4；11   ATCC CRL-1873   0.10   -1.000   0.530
ALL MOLT-4   得自ATCCCRL-1582 0.33 -0.480 0.010
  ALL   SEM-Luc   得自ATCC 30-2001   0.15   -0.824   0.354
  MM   KMS11   参见下文Namba等   0.48   -0.316   -0.154
  MM   KMS11-Luc   衍生自KSM-11   0.29   -0.538   0.068
  MM   KMS18-Luc   得自ATCC 30-2001   0.52   -0.286   -0.184
  MM   OPM2   DSMZ Acc50   0.14   -0.870   0.400
MM KMS26   得自JCRBJCRB1187 0.24 -0.620 0.150
  MM   L363   得自DSMZ ACC49   0.13   -0.886   0.416
  MM   LP1   得自DSMZ ACC41   0.21   -0.688   0.218
MM RPMI-8226   得自ATCCCRL-8658TM 0.26 -0.582 0.112
MM H929   得自ATCCCRL-9068 0.34 -0.475 0.005
  MM   H929-Luc   得自ATCC 30-2001   1.69   0.227   -0.697
  NHL   RL   ATCC CRL-226TM   20.00   1.301   -1.771
  NHL   SuDHL-4   DSMZ ACC495   0.45   -0.350   -0.120
NHL U937   得自ATCCCRL-1593.2 0.20 -0.699 0.229
NHL SR   得自ATCCSLR-2262 0.11 -0.957 0.487
  疾病   细胞系   目录编号   GI50(nM)   Log(GI50)   差值
  NHL   Karpas-299-Luc   得自ATCC 30-2001   20.18   1.305   -1.775
  HL   L428   DSMZ ACC197   20.00   1.301   -1.771
  HL   KM-H2   DSMZ ACC 8   0.23   -0.632   0.162
  平均值   0.34   -0.470
GI50值是导致50％生存率的化合物浓度。
差值：平均Log(GI50)(-0.470)和每一细胞系的Log(GI50)间的差异。
平均值：GI50值为几何平均值，Log(GI50)值为算术平均值。
(KMS-11，参见Namba等(1989)In Vitro Cell Dev.Biol.25(8)p.723-729)。
实施例7-初级母细胞对KSP抑制剂的敏感性
表4中的数据显示，某些类型的血液癌症细胞系对本发明的KSP抑制剂是敏感的。检测了来自AML患者的初级母细胞对化合物IIa的敏感性，如下文所示。来自外周血的冷冻AML母细胞从AllCeu LLC(Emeryville，CA)获得。购买了3个含1×107PBMC的冷冻小瓶。将来自三名新诊断的AML患者的具有高百分比母细胞的外周血单核细胞(PBMCs)(#06-188，80％；#06-366，88％；#06-503，73％)培养数周，用KSP抑制剂处理。迅速解冻小瓶，将所述细胞在补充有10％FBS和下列细胞因子(均为10ng/ml)的Iscove’s DMEM培养基中培养：GM-CSF、G-CSF、SCF、IL-3和IL-6(均来自R&D Systems)。对细胞进行了以下三种试验：
■AML母细胞的CellTiter-
Figure GPA00001158902400471
试验。将含有AML母细胞的PBMC接种于96孔板(5000/孔)中，用不同浓度的化合物IIa(10pM至10nM)处理48小时后，如上所述测定细胞存活。计算细胞系的GI50值(nM)。
■使用碘化丙啶染色进行细胞周期分析。将含有AML母细胞的PBMC接种于6孔板(0.6-1×106细胞/孔)中，用下列试剂之一处理：DMSO(溶媒)、0.2或2nM的化合物IIa，或100nM的紫杉醇。收集约2×105细胞，细胞沉淀用冷的PBS洗涤2次，再悬浮于500μL冷PBS中。缓慢旋转的同时加入8mL冷的80％乙醇固定细胞。温育15分钟后，固定的细胞用PBS洗两次，细胞沉淀再悬浮于1mL PI/RNASE染色缓冲液(BDBiosciences#550825)中，并在37℃避光温育15分钟。碘化丙啶(PI)是染色DNA和RNA的荧光活体染料。因此RNA必须用核糖核酸酶(RNase)消化除去。在FACS分析前，使染色的细胞通过细胞滤器进入FACS管中以减少细胞团的数目(BD Falcon#352235)。固定并染色的细胞的DNA含量使用BD FACSCalibur流式细胞仪分析，使用CellQuest软件。
■在含有甲基纤维素的培养基中进行集落形成试验。半固体的含甲基纤维素的培养基购自StemCell Technologies Inc.(MethocultTM GF+H4435，Cat#04435)。将母细胞以1×103至1×105细胞/孔的密度接种于非组织培养基处理的6孔板中。向所述培养基中与细胞同时加入DMSO(溶媒)或化合物IIa(0.1、0.2、0.5、1和2nM)。2周后在显微镜下计数集落。活细胞用1mg/ml的P-碘代硝基四唑鎓盐(Sigma Cat#I8377)按750μl/孔染色；在37℃温育过夜后拍照。
结果：尽管这些母细胞的表观倍增时间要慢于大多数AML细胞系，分别为50-70h和30-50h，但获得的化合物IIa的GI50值(0.12、0.28和0.34nM)与上述的AML细胞系一致。使用集落形成试验获得了类似的结果，其中样本#06-366集落数在0.2nM显著下降，在0.5nM及以上无集落，样本#06-188和#06-503中也获得了类似的结果。在所有的试验中0.5nM及以上均无集落。细胞周期特征显示样本#06-366在24小时出现有丝分裂停滞的细胞(4N群体)数目增加，48小时后濒死细胞(＜2N群体)数目增加。这些变化在最高浓度下(2nM)比低浓度(0.2nM)下更为显著，其接近于GI50。使用高剂量的紫杉醇(100nM)作为强有丝分裂停滞的阳性对照。样本#06-188和#06-503也获得了类似的结果。对于样本#06-503，在48小时和72小时时间点收集数据。48小时处的特点类似于样本#06-366，72小时濒死细胞(＜2N群体)的数目增加更为显著，尤其是在2nM的时候。参见图2。GI50值依然很低，表明进入细胞周期的细胞非常有效地被化合物IIa杀死。
实施例8-KSP抑制剂的体内效果测定
细胞系HCT-116广泛用于评价诸如微管断裂剂、有丝分裂激酶抑制剂和KSP抑制剂的有丝分裂抑制剂。进行了一项多剂量效果研究，每天4次，共3天(q4d x 3)。试验采用约6周龄的远系杂交无胸腺nu/nu小鼠进行(Charles River Laboratories，Hollister，CA)。到达后，动物在肩胛下区域接受皮下微芯片移植(AVID，Folsom，LA)以区别个体。在开始任何试验操作前使动物适应环境一周。以每笼4-5只的数量将小鼠饲养于透明聚碳酸酯微隔离笼中，12小时光照、12小时黑暗循环，温度为70-80华氏度，30-70％相对湿度。食物(Purina啮齿动物饲料)和水均任意提供。小鼠根据NovartisACUC条约和指导原则以及实验室动物的照料和使用的ILAR指南管理。
在AAALAC认可的实验室中按照ACUC批准的方案进行试验。
化合物IIa(游离碱)和SB-715992(ispinesib，来自Cytokinetics的一种KSP抑制剂，正处于临床试验阶段；游离碱形式)在20％
Figure GPA00001158902400491
中配制成所有上述的剂量，剂量体积为8mL/kg。根据每只动物的体重调节剂量。在研究开始时制备制剂，于室温下储存。购买在基于克列莫佛的溶媒中预混合的临床级紫杉醇(Mayne Pharma，now Hospira，Lake Forest，IL，目录号#NDC-6170334209)，在无菌盐水中稀释，获得16mL/kg的剂量体积，用于腹腔内施用30mg/kg的剂量。
人HCT116结肠癌细胞从国立癌症研究所的DCTD肿瘤贮藏室获得(目录编号#NCI 502568，Rockville，MD)，在IMPACT1PCR测试板(RADIL，University of Missouri，Columbia，MO)中进行无支原体和鼠类病毒测试。HCT116细胞在含2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640(MediatechInc.目录#15-040-CV)中生长，补充有10％胎牛血清(JRH Biosciences，目录号#12003-1000M)。这些细胞贴壁培养生长，维持在37℃下，含5％二氧化碳的潮湿空气中。细胞在使用前培养不超过10个世代。在95％汇合度时收集细胞，在4℃于800xg离心5分钟，随后再悬浮于冷HBSS中(Mediatech Inc.，目录号#21-021-CV)，浓度为50百万细胞/mL，用于皮下移植(注射体积0.1mL)。
雌性nu/nu小鼠(Charles River，Hollister，CA)在右侧腹皮下注射混悬于汉克平衡盐溶液(HBSS)的5百万HCT-116肿瘤细胞，总体积为0.1mL/鼠。为进行效果研究，移植后10天将小鼠随机分组。研究1中72只小鼠和研究2中81只小鼠被纳入研究，其平均肿瘤体积为约300mm3。从第0天给药开始，每周两次用数字测径器测定肿瘤移植物的两个维度(L和W)。按(L×W2)/2计算肿瘤体积。一周测量体重两次，每天记录临床观察。通过StudyDirector软件(StudyLog，South San Francisco，CA)获取和记录肿瘤体积和体重。使用下式计算治疗/对照(T/C)百分比值：
％T/C＝100×ΔT/ΔC
其中：
T＝研究最后一天药物治疗组的平均肿瘤体积；
ΔT＝研究最后一天药物治疗组的平均肿瘤体积-给药第一天药物治疗组的平均肿瘤体积；
C＝研究最后一天对照组的平均肿瘤体积；以及
ΔC＝研究最后一天对照组的平均肿瘤体积-给药第一天对照组的平均肿瘤体积。
所有的数据均以平均值和SEM表示。使用单因素ANOVA配对分析进行最终肿瘤测量值的组间比较。使用Kruskal-Wallis单因素秩次方差分析和Dunn法进行多重配对比较来确定显著性。使用SigmaStat(SystatSoftware Inc.，San Jose，CA)进行统计学分析。
按q4d x 3方案进行多剂量效力研究，以比较化合物IIa和SB-715992以及紫杉醇的抗肿瘤活性。结果如表5所示。在该研究中，因为体重显著下降，用最高剂量5mg/kg化合物IIa和15mg/kg SB-715992治疗的动物仅接受了计划的q4d x 3方案的前两次给药，停药后小鼠恢复。即使仅给药两次，也都类似地存在显著的肿瘤退化(各自73％退化，p＜0.05)。按q4dx 3给予两个较低剂量2.5和1.25mg/kg化合物IIa和7.5mg/kg SB-715992也类似地引起HCT116肿瘤移植物的退化(分别为82％、66％、65％退化，p＜0.05)。总体而言，紫杉醇不如化合物IIa有效；尽管肿瘤在开始时退化，但停药后很快又继续生长。
表5-在HCT116肿瘤移植物模型中以q4d x 3给药方案施用化合物IIa的效力
由于以q4d x 3方案给药的1.25mg/kg的低剂量诱导HCT116移植物退化，因此使用2至0.125mg/kg的剂量范围重复效力研究，观察剂量响应，确定可使用何等低的剂量诱导肿瘤退化。表6的结果表明低达1mg/kg的剂量可观察到肿瘤退化(46％退化，p＜0.05，第17天)，而在给药间隔期间低达0.25mg/kg的化合物IIa观察到肿瘤停滞，但与溶媒对照组相比无统计学显著性。化合物IIa在0.125mg/kg的抗肿瘤效应与溶媒对照相比无显著差异。仅7.5mg/kg剂量的SB-715992诱导肿瘤退化。此外，最后一次给药后72小时，收集血液比较组间的血循环中性粒细胞水平。中性粒细胞以剂量响应的方式下降，类似于肿瘤效力的作用。
表6-在HCT116肿瘤移植物模型中以q4d x 3给药方案施用低剂量化合物IIa的效力
Figure GPA00001158902400521
Figure GPA00001158902400531
实施例9-KSP抑制剂在HCT15肿瘤移植物模型中的有效性
HCT15也是已知表达P-gp泵的人腺癌细胞系，因此使用该细胞系建立移植瘤模型以验证实施例10的结果。
实验使用约6-8周龄的远系杂交无胸腺nu/nu小鼠(Charles RiverLaboratories)进行。动物在到达后在肩胛下区域接受皮下微芯片(AVID，Folsom，LA)移植以区别个体。在开始任何试验操作前使动物适应环境一周。常规动物看护和福利保证如前文所述。
人HCT15结肠癌细胞从国立癌症研究所的DCTD肿瘤贮藏室获得(目录编号#NCI 502711，Rockville，MD)。HCT15细胞在含2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640(Mediatech Inc.，目录号#15-040-CV)中生长，补充有10％胎牛血清(JRH Biosciences，目录号#12003-1000M)。这些细胞在IMPACT1PCR测试板(RADIL，University of Missouri，Columbia，MO)中进行无支原体和鼠类病毒测试。
所述细胞贴壁培养生长，维持在37℃下，含5％二氧化碳的潮湿空气中。细胞在使用前培养不超过10个世代。在95％汇合度时收集细胞，在4℃于800x g下离心5分钟，随后再悬浮于1∶1的HBSS(Mediatech Inc.，目录号#21-021-CV)和浓度为50百万细胞/mL的MatrigelTM中，用于皮下移植(注射体积0.2mL)。
在肿瘤细胞移植后10天，当肿瘤体积约为300mm3时，开始治疗效力研究。通过尾静脉静脉内施用8mL/kg体积的给定剂量的化合物IIa和SB-715992。以30mg/kg剂量、16mL/kg体积经腹腔内(i.p.)施用紫杉醇。
为进行效力研究，小鼠在移植后10天随机分组，平均肿瘤体积约300mm3的被纳入研究。从第0天给药开始，每周两次用数字测径器测定肿瘤移植物的两个维度(L和W)。按(L×W2)/2计算肿瘤体积。一周两次测量体重，每天记录临床观察。通过StudyDirector软件(StudyLog，South SanFrancisco，CA)记录和储存肿瘤体积和体重，按上文所述分析数据。
表7的结果表明，化合物IIa具有比紫杉醇更好的抗HCT15肿瘤效果；在4mg/kg剂量下，T/C百分比为26％(p＜0.05相比溶媒，相比紫杉醇的结果类似)。尽管数据显示了4mg/kg KSP抑制剂与7.5和15mg/kg SB-715992给药组的差异，但该模型中的肿瘤体积差异并未达到统计学显著性。在第10天，在4mg/kg化合物IIa和7.5mg/kg SB-715992之间观察到统计学显著差异(p＜0.05)。紫杉醇是已知的P-gp底物，在该模型中具有很低的抗肿瘤活性。在任何治疗的小鼠中均未观察到显著的体重下降或毒性表面体征。HCT15模型中增加的抗肿瘤活性证明了化合物IIa在表达高水平P-gp的肿瘤移植模型中的有效性。
表7-在HCT15肿瘤移植物模型中以q4d x 3给药方案施用化合物IIa的有效性
Figure GPA00001158902400551
实施例10-KSP抑制剂在急性髓细胞性白血病(AML)移植物模型中的有效性
评价了无胸腺小鼠中化合物IIa针对MV4；11肿瘤移植物模型的有效性(O’Farrell，等2003)。有效性首先在小鼠皮下MV4；11肿瘤移植物模型中检验，并且，因为骨髓微环境在AML细胞生长和存活中起重要作用，还在小鼠的MV4；11-luc弥散性疾病模型中评价有效性，其中所述细胞归巢并生长于骨髓和某些软器官。由于肿瘤细胞表达荧光素酶，使用生物发光成像进行连续广泛的白血病病变的生长监测。
皮下肿瘤效力研究使用约6-8周龄的远系杂交无胸腺nu/nu小鼠(Charles River Laboratories，Hollister，CA)进行。弥散性疾病模型中的效力研究使用约7-8周龄的免疫缺陷NOD-SCID雌性小鼠(JacksonLaboratories，Bar Harbor，ME)进行。动物在到达后在肩胛下区域接受皮下微芯片移植(AVID，Folsom，LA)以区别个体。在开始任何试验操作前使动物适应环境一周。常规动物看护和福利保证如前文所述。
人MV4；11急性髓细胞性白血病细胞从美国组织培养物收藏中心获得(目录号#CRL-9591，Rockville，MD)，在IMPACT1PCR测试板(RADIL，University of Missouri，Columbia，MO)中进行无支原体和鼠类病毒测试。对于弥散性疾病模型，从加利福尼亚圣地亚哥的Novartis研究基金会基因组学研究所的Fangxian Sun处获得表达荧光素酶基因的稳定MV4；11细胞(MV4；11-luc)。MV4；11细胞在Iscove改良达尔伯克培养基(Mediatech Inc.，目录号#15-016-CV)中生长，补充有10％胎牛血清(JRH Biosciences，目录号#12003-1000M)、4mM L-谷氨酰胺和5ng/mL重组人粒细胞M-CSF(GM-CSF)(R&D Systems，目录号#215-GM)。MV4；11-luc在同样的培养基中生长，但加入2微克/mL的嘌呤霉素以选择荧光素酶表达。这些细胞作为混悬培养物生长，维持在37℃、含有5％二氧化碳的潮湿空气下。细胞在使用前培养不超过10个世代。在约2百万细胞/mL时收集细胞，在4℃于800xg下离心5分钟，随后再悬浮于冷HBSS中(Mediatech Inc.，目录号#21-021-CV)，皮下移植(注射体积为0.2mL)使用25百万细胞/mL的浓度(含有50％MatrigelTM，BD Biosciences，目录号#354234)，或通过尾静脉进行静脉内(i.v.)移植(注射体积为0.1mL)，使用100百万细胞/mL的浓度。在静脉内细胞移植前一天，用3格瑞的剂量辐照小鼠3分钟。
化合物IIa(游离碱)和SB-715992(游离碱)在20％
Figure GPA00001158902400561
中配制，剂量体积为8mL/kg。根据每只动物的体重调节剂量。在研究开始时制备制剂，于室温下储存。购买在基于克列莫佛的溶媒中预混合的临床级紫杉醇(Mayne Pharma，now Hospira，Lake  Forest，IL，目录号#NDC-6170334209)，在无菌盐水中稀释，获得16mL/kg的剂量体积，用于腹腔内施用30mg/kg的剂量。
为进行皮下肿瘤模型中的两种有效性评价，将混合在1∶1比例HBSS和MatrigelTM混合物中的10百万细胞皮下注射到小鼠的右侧腹下，总体积为0.2mL/小鼠。移植后17天将小鼠随机分组。平均肿瘤体积为约250mm3的小鼠被纳入研究。从第0天给药开始，每周两次用数字测径器测定肿瘤移植物的两个维度(L和W)。按(L×W2)/2计算肿瘤体积。一周两次测量体重，每天记录临床观察。通过StudyDirector软件(StudyLog，South SanFrancisco，CA)记录和储存肿瘤体积和体重。
为评价弥散性疾病模型中的有效性，在尾静脉注射10百万细胞的0.1mL HBSS溶液的前一天，雌性NOD-SCID小鼠接受3格瑞的全身照射。移植后28天，随机取40只小鼠纳入研究，生物发光成像测定，平均光子量(背视图+侧视图)为约5×107光子/秒。成像前约10分钟，给小鼠腹腔注射150mg/kg荧光素(Xenogen Corporation，Alameda，CA)，随后用异氟烷麻醉。使用IVIS成像系统(Xenogen Corporation)中的电荷耦合器件照相机测定光子发射。简言之，捕获小鼠的灰度成像，随后用表示根据表达荧光素酶的癌细胞所切割的荧光素而检测到的光子空间分布的生物发光图重叠。信号强度用IGOR Pro 4.09A版软件(WaveMetrics，Inc.，Lake Oswego，OR)的专业版，即活体成像版本2.50.2(Xenogen)进行定量。确定从背视图+侧视图检测到的所有光子量总和。动物癌细胞的生物发光通过在指定日期成像进行测定，直到首个小鼠因为疾病负担造成后肢肢体麻痹(小鼠安乐死的主要终点)为止。记录每只小鼠的安乐死日期，将剩余存活小鼠百分比对时间作图(Kaplan-Meier生存分析)。使用时序检验计算P值(GraphPadPrism 4.0软件)以评价治疗和对照组间的差异(p＜0.05被认为是显著的)。一周两次测量体重，每天记录临床观察。通过StudyDirector软件(StudyLog，South San Francisco，CA)记录和储存体重。数据分析按上文所述进行。
结果，皮下肿瘤模型：进行皮下肿瘤模型中的有效性研究来比较以q4dx 3施用的化合物IIa剂量范围的活性。在第一个研究中，评价了nu/nu小鼠中的最大耐受剂量；4mg/kg化合物IIa，15mg/kg SB-715992和30mg/kg紫杉醇。4只剩余的肿瘤小鼠按相同方案施用0.625mg/kg KSP抑制剂。结果如表8所示。在给药间隔期，所有的治疗组中观察到肿瘤退化，在用高剂量化合物IIa、SB-715992和紫杉醇治疗的组中，分别有9/9、6/9和7/9只小鼠在100天内表现出持续、完全的肿瘤退化(CR)。尽管在0.625mg/kg化合物IIa治疗组中也出现肿瘤退化，但其在最后一次给药后约10天再次生长。试验剂的剂量普遍耐受良好，最大平均体重下降＜10％，但SB-715992治疗组有两只小鼠体重下降＞20％。
表8-在皮下MV4；11肿瘤移植物模型中以q4d x 3给药方案施用化合物IIa的有效性
Figure GPA00001158902400581
皮下肿瘤模型中的第二个有效性研究比较了按q4d x 3施用的一定范围低剂量化合物IIa的活性。使用的最高剂量是2mg/mg，其是裸鼠中最大耐受剂量的一半。比较化合物IIa和7.5mg/kg SB-715992的活性，其为半数最大耐受剂量。结果如表9和图2所示。在不同浓度的0.5、1和2mg/kg剂量化合物IIa和1.75、3.5和7.5mg/kg SB-715992中均观察到肿瘤退化。到最后一次给药后5天，0.5mg/kg化合物IIa和1.75mg/kg SB-715992治疗组中肿瘤开始生长。到给药后30天，7.5mg/kg SB-715992治疗组中肿瘤开始生长。1和2mg/kg剂量的化合物IIa分别引起6和5只小鼠在100天内的完全肿瘤退化，试验剂的剂量普遍耐受良好，最大平均体重下降＜10％。
表9-研究2：化合物IIa针对MV4；11人AML皮下移植肿瘤的抗肿瘤有效性和耐受性概述
Figure GPA00001158902400591
结果，弥散性AML疾病模型：在弥散性AML疾病模型MV4；11-luc中评价了化合物IIa的活性，其中肿瘤细胞通过静脉内移植。细胞移植后28天开始治疗施用，此时广泛的生物发光信号表明动物处于重病阶段。结果如表10所示。最初的成像在骨中观察到生物发光信号(下颌骨、颅骨、脊柱和长骨)，但也在整个身体内弥散，包括肺和肝。因此，随后记录了从全身发射的光子(背视图+侧视图)。这些病变最终导致肿瘤负荷引起的后肢肢体麻痹，偶发严重的体重下降，此时处死小鼠。这称为“有条件的生存”。
对小鼠MV4；11-luc的光子发射进行连续全身监测，直到研究第12天后有小鼠死于疾病。与溶媒治疗组相比，按q4d x 3施用的0.5和1mg/kg化合物IIa显著降低了表征疾病负担的生物发光信号(p＜0.05)，而0.25mg/kg治疗与溶媒无显著区别。化合物IIa在这些剂量下是良好耐受的。与溶媒治疗的小组相比，所有3个剂量的化合物IIa显著延迟了后肢肢体麻痹的诱导，提高了小鼠的生存率(p＜0.05)。溶媒治疗组的生存中值是15天，而0.25、0.5和1mg/kg化合物IIa治疗组分别为27、31和30天。在给药时发生的早期剂量依赖性的肿瘤负荷(生物发光)下降并未进一步转化为剂量依赖性的生存率提高。似乎一旦化合物的效果发挥殆尽，在所有组中疾病就快速进展。
表10-在MV4；11弥散性疾病模型中以q4d x 3给药方案施用化合物IIa的有效性
Figure GPA00001158902400601
实施例11-KSP抑制剂在人多发性骨髓瘤KMS-11-luc肿瘤移植物中的有效性评价
评价了化合物IIa对人多发性骨髓瘤KMS-11-luc肿瘤移植物的效果。首先在具有该细胞系的小鼠中使用皮下肿瘤移植物模型进行有效性检验，其中化合物IIa诱导了显著的抗肿瘤效应。由于骨髓微环境在骨髓瘤细胞生长和生存中起重要作用，还在小鼠KMS-11-luc弥散性疾病模型中评价了有效性，其中细胞优先归巢和在骨髓的正位生长。细胞内荧光素酶报告基因的表达允许通过生物发光成像对骨髓瘤病变的生长进行连续广泛的监测。
试验使用约7-8周龄免疫缺陷的SCID-Beige雌性小鼠(Charles RiverLaboratories，Wilmington，MA)进行。动物在到达后在肩胛下区域接受皮下微芯片移植(AVID，Folsom，LA)以区别个体。在开始任何试验操作前使动物适应环境一周。常规动物看护和福利保证如前文所述。
人KMS-11-luc多发性骨髓瘤细胞从多伦多大学的Suzanne Trudel实验室获得(Ontario，Canada)，在IMPACT1PCR测试板(RADIL，Universityof Missouri，Columbia，MO)中进行无支原体和鼠类病毒测试。在我们收到该细胞系之前，其已通过逆转录病毒转染pGC-gfp/luc载体而稳定表达荧光素酶。KMS-11-luc细胞在补充有2mmol/L L-谷氨酰胺(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)和10％胎牛血清(JRH Biosciences，目录号#12003-1000M)的Iscove′s培养基中生长。这些细胞作为混悬培养物生长，维持在37℃、含有5％二氧化碳的潮湿空气下。细胞在使用前培养不超过10个世代。以约2百万细胞/mL收集细胞，在4℃于800xg下离心5分钟，随后以50百万细胞/mL的浓度再悬浮于1∶1的冷的汉克平衡盐溶液(HBSS)和MatrigelTM(分别为Mediatech Inc.，目录号#21-021-CV；BD Biosciences，目录号#354234)的混合物中，用于皮下移植(注射体积0.2mL)。或者，对于弥散性疾病模型，细胞以100百万细胞/mL的浓度在冷HBSS中制备，用于通过尾静脉静脉内(i.v.)移植(注射体积0.1mL)。
化合物IIa和SB-715992(游离碱)在20％
Figure GPA00001158902400611
中配制，剂量体积为8mL/kg。根据每只动物的体重调节剂量。在研究开始时制备制剂，于室温下储存。购买在基于克列莫佛的溶媒中预混合的临床级紫杉醇(MaynePharma，now Hospira，Lake Forest，IL，目录号#NDC-6170334209)，在无菌盐水中稀释，获得16mL/kg的剂量体积，用于腹腔内施用30mg/kg剂量。
为进行皮下肿瘤模型中的有效性评价，将混合在1∶1比例HBSS和MatrigelTM混合物中的10百万细胞以总体积200mL/鼠，皮下注射到小鼠的右侧腹。移植后11天将小鼠随机分组。平均肿瘤体积为约140mm3的54只小鼠被纳入研究。从第0天给药开始，每周两次用数字测径器测定肿瘤移植物的两个维度(L和W)。按(L×W2)/2计算肿瘤体积。一周两次测量体重，每天记录临床观察。通过StudyDirector软件(StudyLog，South SanFrancisco，CA)记录和储存肿瘤体积和体重。数据分析按上文所述进行。
为评价弥散性疾病模型中的有效性，在尾静脉静脉内注射总体积为100mL/小鼠的10百万细胞的HBSS溶液。移植后10天，随机取40只小鼠纳入研究，生物发光成像测定，腿骨平均光子量(左+右)为约9×105光子/秒。成像前约10分钟，给小鼠腹腔注射150mg/kg荧光素(XenogenCorporation，Alameda，CA)，随后用异氟烷麻醉。使用IVIS成像系统(Xenogen Corporation)中的电荷耦合器件照相机测定光子发射。简言之，捕获小鼠的灰度成像，随后用表示根据表达荧光素酶的癌细胞中切割的荧光素检测到的光子空间分布的生物发光图重叠。信号强度使用IGOR Pro4.09A版软件(WaveMetrics，Inc.，Lake Oswego，OR)的专业版，活体成像版本2.50.2(Xenogen)量化。确定从右+左腿检测到的所有光子量总和。动物癌细胞的生物发光通过在指定日期成像进行测定，直到有小鼠因为疾病负担造成后肢肢体麻痹(小鼠安乐死的主要终点)为止。记录每只小鼠的安乐死日期，将剩余存活小鼠百分比对时间作图(Kaplan-Meier生存分析)。使用时序检验计算P值(GraphPad Prism 4.0软件)以评价治疗和对照组间的差异(p＜0.05被认为是显著的)。一周两次测量体重，每天记录临床观察。通过StudyDirector软件(StudyLog，South San Francisco，CA)记录和储存体重。数据分析按上文所述进行。
结果，皮下KMS-11-luc肿瘤移植物模型：皮下肿瘤模型中进行的有效性研究评价了以q4d x 3施用的一定范围内化合物IIa剂量的活性，高剂量为1mg/mg，其约为SCID-Bg小鼠最高耐受剂量的一半。比较化合物IIa和半数最大耐受剂量7.5mg/kg SB-715992(ispinesib，来自Cytokinetics的一种KSP抑制剂，正处于临床试验阶段)以及最大耐受剂量30mg/kg的紫杉醇以q4d x 3施用的活性。结果如表11所示。在给药间隔期，所有的治疗组中观察到肿瘤退化；然而，给药完成后肿瘤继续生长。在用较低剂量化合物IIa治疗的小鼠中，肿瘤生长开始更早，生长更快。在治疗结束后8天，在用紫杉醇和0.25mg/kg化合物IIa治疗的组中观察到肿瘤二次生长。在治疗后13天，在用0.5mg/kg化合物IIa的治疗组中观察到肿瘤二次生长。1mg/kg化合物IIa和7.5mg/kg SB-715992分别导致KMS-11-luc肿瘤最大退化56％和49％(p＜0.05)，直到治疗结束后4周并未发生肿瘤再生长。试验剂的给药普遍良好耐受，最大平均体重下降＜10％，除了1mg/kg剂量的化合物IIa，其在给药开始后10天导致平均体重下降12％。该组的一只小鼠体重下降了20％，被从研究中去除。所有该组的其他小鼠在最后一次给药后恢复了任何下降的体重。
表11-在皮下KMS-11-luc肿瘤移植物模型中以q4d x 3给药方案施用化合物IIa的有效性
Figure GPA00001158902400641
弥散性KMS-11-luc肿瘤模型的结果：细胞移植后10天开始药物治疗，生物发光成像显示溶媒治疗组信号随时间增加，表明定位于骨外区域，包括肺、肝和脾。然而，在大多数小鼠中，主要生物发光信号出现在骨骼，具有多重信号来源，包括长骨、颅骨、牙根/下颌骨、骨盆和脊柱。使用该模型的先前研究收集的股骨组织学分析证实，骨髓瘤细胞可渗透入骨髓(Xin，等2006Clin.Cancer Res.Aug 15；12(16)：4908-15.)。疾病发展主要导致肿瘤负荷引起的后肢肢体麻痹，偶发严重的体重下降，此时安乐死小鼠。这称为“有条件的生存”。
结果如表12中所示，按q4d x 3施用的0.5和1mg/kg剂量化合物IIa显著降低了表征疾病负担的生物发光信号，而0.25mg/kg治疗组与溶媒组无显著差异。使用1mg/kg剂量治疗的小鼠在第13天信号退化47％，同时在该组中有一只小鼠在第13天伴有＞20％的体重下降。所有该组的其他动物耐受该剂量。在更低的剂量下，化合物IIa是良好耐受的。
通过生物发光测定的疾病负荷的剂量依赖性的抑制导致类似的后肢肢端麻痹延迟，因此与溶媒治疗的小组相比，提高小鼠有条件的生存。溶媒治疗组的生存中值是19天，而0.25、0.5和1mg/kg化合物IIa治疗组则分别为29、35和52天。
表12-在KMS-11-luc弥散性疾病模型中以q4d x 3给药方案施用化合物IIa的有效性
Figure GPA00001158902400651
实施例12：式II的化合物针对耐药肿瘤是有效的
临床前体内试验显示，式II的化合物令人意外地优于酰基部分不含羟基或羟基前药基团的结构类似的化合物。使用表达流出泵(浆膜蛋白P-糖蛋白(P-gp))的肿瘤模型测试式II化合物和其他药物的敏感性，包括缺乏式II化合物中存在的羟基(或酰氧基)的结构类似化合物。P-gp是肿瘤耐药的一种机制，可能是流出耐药机制的最好理解和最经典的实例。选择小鼠的KB8.5人宫颈癌皮下移植物模型用于药物筛选并随后选择和评价这些化合物；其相应于KB3.1细胞系，区别仅在于具有流出泵。式II的化合物与其他KSP抑制剂和紫杉醇(其已知受到P-gp影响)进行比较。本文所述的研究证实，式II的化合物(例如式IIa和IIc的化合物)在体内有效对抗表达P-gp并对其他药物耐药的肿瘤，而缺乏羟基的类似的式I化合物对该肿瘤无效。
材料
表-1动物特征
Figure GPA00001158902400652
试验使用约6-8周龄的远系杂交无胸腺nu/nu小鼠进行(Charles RiverLaboratories)，动物在到达后在肩胛下区域接受皮下微芯片移植(AVID，Folsom，LA)以区别个体。在开始任何试验操作前使动物适应一周环境。
维持条件
以每笼4-5只的数量将小鼠饲养于透明聚碳酸酯微隔离笼中，12小时光照、12小时黑暗循环，温度为70-80华氏度，30-70％相对湿度。食物(Purina啮齿动物饲料)和水均任意提供。
试验条件
KB8.5细胞生长于含2mM L-谷氨酰胺的DMEM(Mediatech Inc.，目录号#10-013-CV)中，补充有10％胎牛血清(JRH Biosciences，目录号#12003-1000M)。一旦KB8.5细胞表现出良好的生长速率，则加入10ng/ml秋水仙素以维持P-gp的表达水平。
细胞贴壁培养生长，维持在37℃下，含5％二氧化碳的潮湿空气中。细胞在使用前培养不超过10个世代。在95％汇合时收集细胞，在4℃于800xg下离心5分钟，随后以25百万细胞/mL的KB8.5细胞系的浓度再悬浮于1∶1的HBSS(Mediatech Inc.，目录号#21-021-CV)和MatrigelTM中，用于皮下移植(注射体积0.2mL)。
化合物和制剂
化合物IIa、化合物IIc、化合物Ia(下文所示)和SB-715992配制成基于
Figure GPA00001158902400661
的制剂。静脉内施用剂量，根据每只动物体重调节。在研究开始时制备制剂，于室温下储存。购买在基于克列莫佛的溶媒中预混合的临床级紫杉醇(Mayne Pharma，now Hospira，Lake Forest，IL，目录号#NDC-6170334209)，在无菌盐水中稀释，获得16mL/kg的剂量体积，用于腹腔内施用30mg/kg的剂量。
Figure GPA00001158902400671
式Ia的化合物结构类似于式II的化合物，但具有甲氧基而非羟基或酰氧基，其体外针对KSP的活性非常类似于式IIa和IIc化合物的活性。例如，在CellTiter-
Figure GPA00001158902400672
试验中，式Ia化合物对HCT-15细胞的GI50值是0.3nM，其相当于化合物IIa(参见实施例2)。类似的，化合物Ia对KB3.1和KB8.5细胞系的值为0.4nM，而化合物IIa对这些相同细胞系的值分别为0.6nM和0.5nM(参见实施例2)。然而，式II的化合物在酰基基团上具有游离的羟基(或者是作为游离羟基前药的酰氧基)，而Ia则代之以甲基醚。体外活性表明，甲基醚被活性位点良好耐受，尤其在体外对于p-GP耐药细胞系也是非常有效的。此外，其预期比式II的化合物在体内更不易代谢失活。的确，如下表中数据所示，药代动力学参数的比较显示化合物Ia具有比式IIa和IIc的化合物更高的体内接触量和增加的代谢稳定性。但令人惊讶的是，式II的化合物在体内相对于本领域已知针对表达P-gp的癌症的化合物是有利的，因为P-gp耐药的移植物癌症对式II的化合物敏感，但对化合物Ia则不敏感。
有趣的是，还发现式II的化合物比完全缺少羟基的化合物显著地更为有效，例如式Ib的化合物：
化合物Ib在体外比式II的化合物活性低很多，其IC-50为22nm，而化合物IIa和IIc各自的IC-50低于1nm。化合物Ib未进行移植物模型试验，因为其药代动力学和其体外活性不利于体内效果的预期。基于其在体内表现出更高的清除率和更低的AUC(“曲线下面积”测定个体对化合物体内接触的标准方法)的数据，已显示其具有低得多的体内利用度，并且更高的IC-50值显示在靶位点的活性低很多。通过比较，化合物Ia、IIa和IIc各自表现出较好的体内药代动力学效应和较高的体外活性，在移植物癌症中进行试验。
  化合物   体外活性(IC-50-nm)   体内清除率(mL/分/kg)   体内半衰期(分)   AUC(ng-分/mL)
  Ia   0.6   29   117   160,000
  Ib   22   94   90   52,000
  IIa   0.8   41   110   116,000
  IIc   0.9   47   110   102,000
因此式II的化合物在体外比化合物Ib更有效，体内更持久，并且意想不到地显示对表达多药耐药(MDR)流出泵的耐药癌症有效，而化合物Ia针对相同的MDR癌症并无效果，尽管其在体外对p-GP细胞系效果相同，并且在试验动物中具有更高的利用度(更低的清除率和更高的AUC)。
研究方法
为进行有效性研究，使用平均肿瘤体积为约300mm3的小鼠。从第0天给药开始，每周两次用数字测径器测定肿瘤移植物的两个维度(L和W)。按(L×W2)/2计算肿瘤体积。一周两次测量体重，每天记录临床观察。通过StudyDirector软件(StudyLog，South San Francisco，CA)记录和储存肿瘤体积和体重。
数据分析
肿瘤体积的治疗/对照(ΔT/ΔC)百分数使用下式计算：
％ΔT/ΔC＝100×ΔT/ΔC
其中：
T＝研究最后一天药物治疗组的平均肿瘤体积；
ΔT＝研究最后一天药物治疗组的平均肿瘤体积-给药第一天药物治疗组的平均肿瘤体积；
C＝研究最后一天对照组的平均肿瘤体积；以及
ΔC＝研究最后一天对照组的平均肿瘤体积-给药第一天对照组的平均肿瘤体积。
所有的数据均以平均值和SEM表示。使用单因素ANOVA配对分析进行最终肿瘤测量值的组间比较。使用Kruskal-Wallis单因素秩次方差分析确定显著性，随后进行适宜的多重配对比较的事后检验(Dunn法或Tukey检验)。使用SigmaStat(Systat Software Inc.，San Jose，CA)进行统计学分析。
在表达P-gp的移植物模型中的有效性评价
在这些模型中按q4d x 3方案进行同样5mg/kg剂量的多剂量效力研究，以比较化合物IIa和化合物Ia的活性。对于化合物IIc，2.5mg/kg未被良好耐受，因此效力比较仅达到1.25mg/kg的剂量水平。图3和表13中的结果显示，化合物IIa在模型中具有显著的抗肿瘤效果，在KB8.5移植物模型中第11天ΔT/ΔC％为19％(p＜0.05)。
表13.在KB8.5肿瘤移植物模型中以q4d x 3给药方案施用化合物IIa的有效性
Figure GPA00001158902400701
通过将在0.2mL 1∶1比例的HBSS和MatrigelTM中的5×106细胞皮下注射到每只小鼠的右侧腹中，在雌性nu/nu小鼠(Charles River)中建立KB8.5细胞。当肿瘤达到约300mm3时，根据肿瘤体积将小鼠随机分成治疗组(n＝9)。以指定的剂量水平和方案施用化合物。治疗对肿瘤体积和体重的影响用平均值±SEM表示，在治疗第11天评价试验。＊相对于溶媒和SB-715992，p＜0.05(Kruskal-Wallis单因素秩次方差分析/Dunn法)。
类似的，图4和表14中的结果表明，化合物IIc在该模型中具有显著的抗肿瘤效应，第11天的ΔT/ΔC％为39％(p＜0.05)。
表14-在KB8.5肿瘤移植物模型中以q4d x 3给药方案施用化合物IIc的有效性
Figure GPA00001158902400711
通过将在0.2mL 1∶1比例的HBSS和MatrigelTM中的5×106细胞皮下注射到每只小鼠的右侧腹中，在雌性nu/nu小鼠(Charles River)中建立KB8.5细胞。当肿瘤达到平均339mm3时，根据肿瘤体积将小鼠随机分成治疗组(n＝9)。以指定的剂量水平和方案施用化合物。治疗对肿瘤体积和体重的影响用平均值±SEM表示，在治疗第11天评价试验。＊相对于溶媒，p＜0.05(Kruskal-Wallis单因素秩次方差分析/Tukey检验)。
相反，在酰基部分缺乏羟基而代之以甲氧基的类似化合物Ia在KB8.5肿瘤移植物模型中无效，如图5和表15所示。
表15.在KB8.5肿瘤移植物模型中以q4d x 3给药方案施用化合物Ia的有效性
通过将在0.2mL 1∶1比例的HBSS和MatrigelTM中的5×106细胞皮下注射到每只小鼠的右侧腹中，在雌性nu/nu小鼠(Charles River)中建立KB8.5细胞。当肿瘤达到平均285mm3时，根据肿瘤体积将小鼠随机分成治疗组(n＝10)。以指定的剂量水平和方案施用化合物。治疗对肿瘤体积和体重的影响用平均值±SEM表示，在治疗第11天评价试验。没有任何组与溶媒组相比具有统计学差异(Kruskal-Wallis单因素秩次方差分析)。
除了在2.5mg/kg化合物IIc治疗组中出现显著的体重下降外，在任何治疗的小鼠中未观察到显著的体重下降或毒性表征，在P-gp阳性KB8.5模型中增加的抗肿瘤活性表明式II的化合物相对于缺乏羟基官能团的式I的类似化合物具有意想不到的优点，所述官能团构成了式II化合物的特点。
实施例13：式II的化合物对许多肿瘤外植体是有效的
在软琼脂试验中测试了化合物IIa对多种细胞系和肿瘤外植体的效果，如Fiebig，H.H.，Maier，A.，和Burger，A.M所述(Clonogenic assav with established human tumour xenografts：correlation of in vitro to in vivo activity as a basis for anticancer drug discovery，Eur.J.Cancer 40，802-820(2004).)。表16列出了癌症的类型、样品名称、该实验中的GI50(获得50％生长抑制需要的浓度)值、GI50的对数(log(GI50)和每个样品的相对敏感度(差值)。差值通过总体的平均log(GI50)(此处为0.236)减去每个细胞系的log(GI50)获得；正值表示样品比平均值更为敏感，而负值表示样品不如平均值敏感。
大多数适应症具有敏感的样品。基于本实验最敏感的癌症是：血液癌症(白血病和淋巴瘤，5/5)，小细胞肺癌(SCLC；5/5)，乳腺癌(7/10)，膀胱癌(4/6)和肉瘤(4/7)。
表16.化合物IIa在不同癌症细胞系中的活性
  癌症类型   肿瘤样品   GI50(nM)   log(GI50)   差值
  白血病(ALL)   CCRFCEM   0.287   -0.542   0.779
  白血病(ALL)   JURKAT   0.106   -0.975   1.211
  白血病(CML)   K562   0.27   -0.569   0.805
  白血病(ALL)   MOLT4   0.877   -0.057   0.293
  淋巴瘤(NHL)   U937   0.086   -1.066   1.302
  NSCLC   1012   0.926   -0.033   0.270
  NSCLC   289   4.899   0.690   -0.454
  NSCLC   526   1.265   0.102   0.134
  NSCLC   629   10   1.000   -0.764
  NSCLC   677   1.162   0.065   0.171
  NSCLC   737   3.068   0.487   -0.250
  NSCLC   1422   0.728   -0.138   0.374
  NSCLC   211   0.216   -0.666   0.902
  NSCLC   1176   3   0.477   -0.241
  NSCLC   1647   16.752   1.224   -0.988
  癌症类型   肿瘤样品   GI50(nM)   log(GI50)   差值
  SCLC   538   0.339   -0.470   0.706
  SCLC   573   0.587   -0.231   0.468
  SCLC   615   0.082   -1.086   1.323
  SCLC   650   0.376   -0.425   0.661
  SCLC   H69   0.269   -0.570   0.807
  结肠直肠癌   1034   0.214   -0.670   0.906
  结肠直肠癌   1044   0.612   -0.213   0.450
  结肠直肠癌   1103   1   0.000   0.236
  结肠直肠癌   1299   10   1.000   -0.764
  结肠直肠癌   1297   10   1.000   -0.764
  结肠直肠癌   158   10   1.000   -0.764
  结肠直肠癌   1729   10   1.000   -0.764
  结肠直肠癌   1753   11.279   1.052   -0.816
  结肠直肠癌   1788   2.246   0.351   -0.115
  结肠直肠癌   1783   0.721   -0.142   0.378
  结肠直肠癌   1784   5.969   0.776   -0.539
  结肠直肠癌   233   0.238   -0.623   0.860
  结肠直肠癌   243   10   1.000   -0.764
  结肠直肠癌   260   10   1.000   -0.764
  结肠直肠癌   268   6.24   0.795   -0.559
  结肠直肠癌   280   10   1.000   -0.764
  结肠直肠癌   504   0.273   -0.564   0.800
  结肠直肠癌   533   1.753   0.244   -0.007
  结肠直肠癌   609   10   1.000   -0.764
  结肠直肠癌   647   10   1.000   -0.764
  结肠直肠癌   676   10   1.000   -0.764
  结肠直肠癌   742   1.873   0.273   -0.036
  结肠直肠癌   94LX   19.52   1.290   -1.054
  癌症类型   肿瘤样品   GI50(nM)   log(GI50)   差值
  结肠直肠癌   975   10   1.000   -0.764
  黑素瘤   1341   10   1.000   -0.764
  黑素瘤   462   10   1.000   -0.764
  黑素瘤   989   12.722   1.105   -0.868
  卵巢癌   1353   10   1.000   -0.764
  卵巢癌   899   10.000   1.000   -0.764
  前列腺癌   22RV1   0.537   -0.270   0.506
  前列腺癌   DU145   1   0.000   0.236
  前列腺癌   MRIH1579   10   1.000   -0.764
  前列腺癌   PC3M   0.424   -0.373   0.609
  乳腺癌   1162   0.286   -0.544   0.780
  乳腺癌   1322   1.402   0.147   0.090
  乳腺癌   1384   2.666   0.426   -0.189
  乳腺癌   1398   0.239   -0.622   0.858
  乳腺癌   401   0.563   -0.249   0.486
  乳腺癌   449   0.534   -0.272   0.509
  乳腺癌   574   10   1.000   -0.764
  乳腺癌   583   0.239   -0.622   0.858
  乳腺癌   713   0.244   -0.613   0.849
  乳腺癌   857   2.456   0.390   -0.154
  膀胱癌   1036   0.115   -0.939   1.176
  膀胱癌   1218   0.509   -0.293   0.530
  膀胱癌   1228   0.315   -0.502   0.738
  膀胱癌   1258   17.076   1.232   -0.996
  膀胱癌   1352   0.972   -0.012   0.249
  膀胱癌   439   10   1.000   -0.764
  癌症类型   肿瘤样品   GI50(nM)   log(GI50)   差值
  胃癌   1172   10   1.000   -0.764
  胃癌   209   10   1.000   -0.764
  胃癌   214   9   0.954   -0.718
  肉瘤   117   0.249   -0.604   0.840
  肉瘤   1186   0.327   -0.485   0.722
  肉瘤   1301   0.235   -0.629   0.865
  肉瘤   1410   2.246   0.351   -0.115
  肉瘤   417   0.16   -0.796   1.032
  肉瘤   463   19.122   1.282   -1.045
  肉瘤   627   10   1.000   -0.764
  胰腺癌   1657   26.952   1.431   -1.194
  胰腺癌   1861   0.623   -0.206   0.442
  胰腺癌   1869   10.865   1.036   -0.800
  胰腺癌   1876   0.337   -0.472   0.709
  胰腺癌   1872   0.282   -0.550   0.786
  胰腺癌   1881   2.316   0.365   -0.128
  胰腺癌   1887   10   1.000   -0.764
  胰腺癌   1900   16.933   1.229   -0.992
  胰腺癌   1912   0.112   -0.951   1.187
  胰腺癌   1937   0.185   -0.733   0.969
  胰腺癌   546   2.591   0.413   -0.177
  胰腺癌   736   1.265   0.102   0.134
  平均值   1.724   0.236
实施例14：式II化合物对许多实体瘤细胞系是有效的
针对多种衍生自实体瘤的细胞系测试了化合物IIa，参见McDermott，U.，Sharma，S.V.，Dowell，L.，Greninger，P.，Montagut，C.，Lamb，J.，Archibald，H.，Raudales，R.，Tam，A.，Lee，D.，Rothenberg，S.M.，Supko，J.G.，Sordella，R.，Ulkus，L.E.，Iafrate，A.J.，Maheswaran，S.，Njauw，C.N.，Tsao，H.，Drew，L.，Hanke，J.H.，Ma，X.J.，Erlander，M.G.，Gray，N.S.，Haber，D.A.，and Settleman，J.(2007)，Identification ofgenotype-correlated sensitivity to selective kinase inhibitors by usinghigh-throughput tumor cell line profiling.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 104，19936-19941(2007).)，细胞用所述化合物处理72小时，报道了与未处理对照相比的存活细胞比例。表17列出了细胞系的名称、器官来源、3个测试浓度(0.2nM、2.0nM和20nM)下的存活细胞比例和敏感度评分。敏感度评分为5(最敏感)到1(最不敏感)，打分如下：5＝0.2nM时存活比例≤0.2；4＝0.2nM时0.2＜存活比例≤0.5；3＝0.2nM时存活比例＞0.5且2.0nM时≤0.5；2＝2.0nM时存活比例＞0.5且20nM时≤0.5；1＝20nM时存活比例＞0.5。
所有适应症均具有敏感性样本。对这些癌症进行敏感性排序的多种可能的方法的其中一种是计算每一适应症的平均敏感度评分(敏感度评分的总和/样本数)。如果使用平均分为3或更高的非常严格的标准，基于该测试的最敏感癌症是：卵巢癌(3.38)、胃癌(3.32)、脑癌(3.21)、皮肤癌(3.02)、宫颈癌(3.00)和甲状腺癌(3.00)。
表17.不同实体瘤细胞系中化合物IIa的活性
  细胞系   器官   0.2nM   2.0nM   20nM   敏感度
  SCaBER   膀胱   0.6666   0.0383   0.0238   3
  1A6   膀胱   0.9359   0.0473   0.0309   3
  RT112/84   膀胱   1.0884   0.0457   0.0312   3
  5637   膀胱   1.1044   0.0595   0.0423   3
  EJ138   膀胱   1.1072   0.0888   0.0712   3
  RT-112   膀胱   0.925   0.099   0.0915   3
  SW 780   膀胱   0.7289   0.091   0.0981   3
  细胞系   器官   0.2nM   2.0nM   20nM   敏感度
  RT4   膀胱   0.5091   0.1175   0.1008   3
  T24   膀胱   0.723   0.131   0.102   3
  647-V   膀胱   0.721   0.185   0.141   3
  VM-CUB1   膀胱   0.8161   0.1594   0.1497   3
  SW-1710   膀胱   0.7185   0.1353   0.1546   3
  KU-19-19   膀胱   0.9247   0.1929   0.1985   3
  UM-UC-3   膀胱   0.9804   0.2219   0.2074   3
  BFTC-905   膀胱   1.089   0.264   0.223   3
  HT 1376   膀胱   1.1586   0.2837   0.233   3
  CAL-29   膀胱   0.967   0.282   0.256   3
  J82   膀胱   0.7211   0.3475   0.2914   3
  639-V   膀胱   0.961   0.37   0.31   3
  TCCSUP   膀胱   1.0148   0.5876   0.4752   2
  HT-1197   膀胱   1.0133   0.9855   0.8308   1
  CSR1   骨   0.2156   0.0818   0.0769   4
  CS1   骨   0.4253   0.1844   0.1903   4
  Hs 888.T   骨   0.4945   0.4138   0.3803   4
  MHH-ES-1   骨   0.687   0.032   0.017   3
  SK-ES-1   骨   0.9862   0.0606   0.0516   3
  KHOS-240S   骨   0.925   0.071   0.065   3
  Saos-2   骨   0.6146   0.118   0.1008   3
  HOS   骨   1.033   0.078   0.118   3
  RD-ES   骨   0.6036   0.2671   0.1397   3
  KHOS-312H   骨   1.103   0.284   0.231   3
  U-2OS   骨   1.0283   0.241   0.2322   3
  NY   骨   1.293   0.341   0.3   3
  CAL-72   骨   0.9276   0.3256   0.3065   3
  HuO-3N1   骨   0.9177   0.3533   0.3165   3
  细胞系   器官   0.2nM   2.0nM   20nM   敏感度
  MG-63   骨   0.815   0.57   0.502   1
  H-EMC-SS   骨   0.8996   0.604   0.5042   1
  MC-IXC   脑   0.079   0.047   0.033   5
  SK-N-SH   脑   0.1798   0.0495   0.0574   5
  NB69   脑   0.0922   0.0639   0.0662   5
  Hs 683   脑   0.4152   0.0858   0.0278   4
  SK-N-AS   脑   0.357   0.0895   0.0819   4
  M059J   脑   0.4307   0.1343   0.0874   4
  SH-SY5Y   脑   0.4428   0.1183   0.0946   4
  Daoy   脑   0.4727   0.0556   0.1088   4
  MOG-G-CCM   脑   0.2092   0.1363   0.1564   4
  YKG-1   脑   0.3102   0.1764   0.1624   4
  CCF-STTG1   脑   0.3804   0.3579   0.2861   4
  GOS-3   脑   0.4488   0.3264   0.2977   4
  SK-N-MC   脑   0.5584   -0.0017   -0.0048   3
  U-251MG   脑   0.8575   0.0313   0.0321   3
  BE(2)-C   脑   0.757   0.0224   0.033   3
  LNZTA3WT4   脑   0.5274   0.0814   0.052   3
  LNZTA3WT11   脑   0.6268   0.0841   0.0567   3
  T98G   脑   0.6311   0.0972   0.0718   3
  LN-229   脑   0.7177   0.1241   0.0965   3
  MOG-G-UVW   脑   0.7682   0.1238   0.1114   3
  H4   脑   0.5851   0.1689   0.12   3
  PFSK-1   脑   0.5585   0.1428   0.1766   3
  SW 1783   脑   0.7547   0.2518   0.1872   3
  SF-295   脑   0.5622   0.2393   0.191   3
  DK-MG   脑   0.5941   0.228   0.1916   3
  A172   脑   0.6374   0.22   0.1923   3
  细胞系   器官   0.2nM   2.0nM   20nM   敏感度
  GAMG   脑   1.2891   0.2385   0.1923   3
  1321N1   脑   0.7485   0.2015   0.1977   3
  CHP-212   脑   0.946   0.267   0.216   3
  LN-18   脑   0.9918   0.238   0.2181   3
  U-118MG   脑   0.9433   0.2612   0.2391   3
  U373MG   脑   0.5474   0.307   0.2442   3
  SW 1088   脑   0.7941   0.242   0.2644   3
  DBTRG-05MG   脑   0.8442   0.387   0.2789   3
  KG-1-C   脑   0.9548   0.3391   0.3367   3
  SCCH-26   脑   0.8806   0.351   0.3398   3
  42-MG-BA   脑   0.9486   0.4389   0.3783   3
  SNB-19   脑   1.0241   0.4679   0.4543   3
  IPTP/98   脑   0.8158   0.3799   0.4603   3
  GMS-10   脑   0.9262   0.6735   0.5424   1
  U-138MG   脑   0.8028   0.4448   0.5689   1
  LN-405   脑   1.046   0.6715   0.7525   1
  AU565   乳房   0.1024   0.0539   0.0297   5
  HCC1954   乳房   0.2453   0.0742   0.0831   4
  Hs 578T   乳房   0.287   0.075   0.085   4
  CAL-85-1   乳房   0.2062   0.1707   0.1396   4
  EFM-192B   乳房   0.3565   0.2746   0.1884   4
  EFM-19   乳房   0.4888   0.2428   0.2227   4
  HCC1143   乳房   0.3856   0.2969   0.2799   4
  MDA-MB-415   乳房   0.4378   0.2779   0.2826   4
  MB 157   乳房   0.919   0.03   0.013   3
  MDA-MB-468   乳房   0.826   0.131   0.104   3
  MCF7   乳房   0.7312   0.1175   0.106   3
  MDA-MB-453   乳房   0.9677   0.1497   0.128   3
  细胞系   器官   0.2nM   2.0nM   20nM   敏感度
  HCC1806   乳房   0.63   0.157   0.135   3
  HCC38   乳房   0.799   0.198   0.135   3
  CAL-148   乳房   0.8879   0.1778   0.1446   3
  MDA-MB-436   乳房   0.9257   0.235   0.1588   3
  EVSA-T   乳房   0.8101   0.1921   0.1617   3
  JIMT-1   乳房   1.0342   0.2107   0.2045   3
  CAL-120   乳房   0.7606   0.3094   0.2346   3
  CAL-51   乳房   1.0399   0.252   0.2391   3
  HCC1569   乳房   0.8118   0.3757   0.2706   3
  MDA-MB-435S   乳房   0.736   0.4   0.369   3
  KPL-1   乳房   0.8294   0.4721   0.3691   3
  HCC70   乳房   1.029   0.4525   0.3868   3
  MDA-MB-361   乳房   0.51   0.4185   0.4945   3
  EFM-192C   乳房   1.1771   0.5303   0.2644   2
  MDA-MB-175-VII   乳房   0.9252   0.6705   0.4413   2
  UACC-893   乳房   0.578   0.635   0.474   2
  BT-474   乳房   1.7649   0.4043   0.4842   2
  BT-549   乳房   0.7005   0.6093   0.5628   1
  T47D   乳房   1.1392   0.657   0.6325   1
  ZR-75-30   乳房   0.979   0.7094   0.6879   1
  MT-3   乳房   0.8962   0.6827   0.704   1
  BT-483   乳房   0.8449   1.114   0.8657   1
  C-4I   宫颈   0.3791   0.0476   0.0328   4
  CAL-39   宫颈   0.3382   0.1481   0.1479   4
  C-33A   宫颈   0.916   0.0127   -0.006   3
  SISO   宫颈   0.7157   0.0163   -0.002   3
  HeLa   宫颈   0.7398   0.048   0.0072   3
  MS751   宫颈   0.6941   0.0256   0.0552   3
  细胞系   器官   0.2nM   2.0nM   20nM   敏感度
  BT-B   宫颈   0.788   0.0821   0.0657   3
  ME-180   宫颈   0.9997   0.1521   0.1564   3
  Ca Ski   宫颈   0.7077   0.2047   0.1791   3
  SKG-IIIb   宫颈   0.718   0.2701   0.2185   3
  DoTc24510   宫颈   0.9503   0.2981   0.2597   3
  SW756   宫颈   0.9509   0.371   0.3384   3
  SiHa   宫颈   0.5524   0.3919   0.3415   3
  C-4II   宫颈   0.8416   0.4293   0.4254   3
  HT-3   宫颈   0.8834   0.6888   0.6523   1
  KYSE-50   食道   0.183   0.055   0.063   5
  KYSE-410   食道   0.244   0.211   0.214   4
  T.Tn   食道   0.4246   0.3322   0.2448   4
  T.T   食道   0.8253   0.0649   0.0197   3
  KYSE-180   食道   0.617   0.085   0.079   3
  TE7   食道   0.718   0.113   0.113   3
  KYSE-510   食道   0.671   0.223   0.129   3
  KYSE-70   食道   0.824   0.201   0.158   3
  KYSE-150   食道   1.166   0.213   0.163   3
  OE21   食道   0.7539   0.2571   0.2117   3
  KYSE-520   食道   1.111   0.386   0.356   3
  KYSE-30   食道   0.7729   0.5353   0.4066   2
  KYSE-270   食道   1.057   0.582   0.453   2
  KYSE-140   食道   1.114   0.512   0.461   2
  HCE7   食道   0.865   0.488   0.512   1
  COLO-680N   食道   0.882   0.535   0.515   1
  OE33   食道   1.006   0.5977   0.5259   1
  KYSE-220   食道   0.833   0.626   0.661   1
  OE19   食道   0.9684   0.8451   0.6916   1
  细胞系   器官   0.2nM   2.0nM   20nM   敏感度
  JR 029   头颈   0.0671   0.0015   0.0021   5
  PCI-38   头颈   0.2035   0.0781   0.0682   4
  CAL 27   头颈   0.449   0.1068   0.069   4
  CAL-33   头颈   0.5807   0.0516   0.0204   3
  HSC-2   头颈   0.7659   0.0902   0.0707   3
  PCI-15B   头颈   0.8113   0.0605   0.0753   3
  HO-1-N-1   头颈   0.9323   0.095   0.096   3
  PCI-6A   头颈   1.1429   0.1568   0.1195   3
  H3118   头颈   0.8217   0.108   0.131   3
  ACC2   头颈   1.1233   0.1636   0.1357   3
  ACCS   头颈   0.7258   0.2017   0.1658   3
  ACC3   头颈   0.887   0.186   0.168   3
  BICR 78   头颈   1.0035   0.1602   0.1694   3
  JR 028   头颈   1.0931   0.2299   0.2027   3
  PCI-15   头颈   1.0668   0.1987   0.2061   3
  SCC-9   头颈   0.5841   0.2727   0.272   3
  SAT   头颈   0.854   0.302   0.307   3
  SCC90   头颈   0.5915   0.3331   0.3358   3
  HN   头颈   0.9124   0.3981   0.3481   3
  PCI-15A   头颈   0.8516   0.3844   0.3675   3
  JR 013   头颈   1.0158   0.3829   0.3766   3
  PCI-4B   头颈   1.2078   0.4475   0.3808   3
  PCI-30   头颈   0.8216   0.362   0.4064   3
  UDSCC2   头颈   0.5716   0.4203   0.4394   3
  JR 019   头颈   1.0805   0.4801   0.484   3
  RPMI 2650   头颈   1.1239   0.5619   0.4435   2
  JR 028EP   头颈   0.995   0.5386   0.4657   2
  BHY   头颈   1.0468   0.5311   0.4897   2
  细胞系   器官   0.2nM   2.0nM   20nM   敏感度
  PCI-4A   头颈   1.0214   0.6602   0.4984   2
  HSC-3   头颈   1.069   0.3074   0.5475   1
  ACC 8-2   头颈   1.1417   0.7519   0.5967   1
  JR 022   头颈   1.0441   0.7332   0.6409   1
  PCI-6B   头颈   1.1076   0.7016   0.6703   1
  ACC112   头颈   0.9498   0.7645   0.916   1
  GP5d   肠   0.185   0.116   0.0711   5
  SW 48   肠   0.471   0.028   0.053   4
  T84   肠   0.462   0.068   0.058   4
  LoVo   肠   0.2792   0.0659   0.0611   4
  CoLO 205   肠   0.8137   0.0578   0.0376   3
  Hs 257.T   肠   0.8128   0.0699   0.0465   3
  MDST8   肠   0.7601   0.094   0.0774   3
  CL-11   肠   0.9903   0.1858   0.1559   3
  SW-948   肠   1.0249   0.2096   0.1757   3
  CoCM-1   肠   1.062   0.227   0.191   3
  LS174T   肠   0.8916   0.2634   0.2176   3
  CoLo 201   肠   1.029   0.204   0.24   3
  SW620   肠   0.7593   0.2603   0.288   3
  WiDr   肠   0.8917   0.3977   0.3243   3
  LS180   肠   0.9989   0.4556   0.3266   3
  SW837   肠   1.0342   0.4365   0.3773   3
  SK-Co-1   肠   0.93   0.464   0.405   3
  CL-14   肠   0.8508   0.6531   0.4248   2
  HRT-18   肠   0.744   0.523   0.425   2
  Caco-2   肠   0.769   0.538   0.496   2
  CoLo-206F   肠   1.075   0.651   0.543   1
  SW 1417   肠   1.016   0.769   0.607   1
  细胞系   器官   0.2nM   2.0nM   20nM   敏感度
  CL-34   肠   1.1299   0.4878   0.6107   1
  RCM-1   肠   1.0188   0.8159   0.6594   1
  COLO-678   肠   1.06   0.802   0.661   1
  OUMS-23   肠   0.7971   0.9316   0.7076   1
  SW 1116   肠   1.0852   1.0031   0.7353   1
  SW 1463   肠   1.164   0.925   0.862   1
  G-402   肾   0.4146   0.1885   0.1583   4
  SW 156   肾   0.4381   0.3386   0.2802   4
  CAL-54   肾   0.4808   0.3592   0.326   4
  SW 13   肾   0.697   0.014   0.023   3
  G-401   肾   0.857   0.081   0.073   3
  NH-6   肾   0.9578   0.1525   0.1175   3
  KMRM-M1   肾   1.072   0.139   0.126   3
  SN-12C   肾   0.9117   0.1661   0.1382   3
  Caki-1   肾   0.6522   0.1373   0.1431   3
  786-O   肾   1.066   0.205   0.17   3
  VMRC-RCW   肾   1.081   0.156   0.171   3
  UO-31   肾   0.8695   0.3772   0.3758   3
  769-P   肾   0.977   0.478   0.431   3
  KMRC-20   肾   0.84   0.466   0.459   3
  BFTC-909   肾   1.076   0.4325   0.4869   3
  KMRC-1   肾   0.8824   0.6127   0.5558   1
  VMRC-RCZ   肾   0.9492   0.6125   0.5913   1
  ACHN   肾   1.005   0.623   0.6277   1
  JHH-4   肝   0.4019   0.0719   0.0775   4
  OCUG-1   肝   0.4247   0.115   0.0881   4
  SNU-182   肝   0.3211   0.3009   0.2618   4
  SNU-398   肝   0.7925   0.0572   0.048   3
  细胞系   器官   0.2nM   2.0nM   20nM   敏感度
  JHH-7   肝   0.526   0.0621   0.049   3
  SNU-475   肝   0.9855   0.1516   0.1274   3
  JHH-6   肝   0.6033   0.1987   0.1906   3
  HuCCT1   肝   0.731   0.2303   0.1941   3
  EGI-1   肝   0.8992   0.2121   0.2415   3
  huH-1   肝   0.637   0.3355   0.2569   3
  SK-HEP-1   肝   0.7567   0.2521   0.2684   3
  PLC/PRF/5   肝   0.7758   0.2551   0.3086   3
  Hep G2   肝   0.8333   0.2949   0.311   3
  SNU-423   肝   0.9714   0.304   0.3364   3
  SNU-387   肝   0.6457   0.4265   0.3953   3
  JHH-1   肝   0.6947   0.4443   0.4458   3
  SNU-449   肝   1.0774   0.486   0.4864   3
  C3A   肝   0.9439   0.4686   0.5087   1
  JHH-2   肝   1.0593   0.7702   0.7744   1
  A549   肺   0.4707   0.0974   0.129   4
  H290   肺   0.4248   0.4081   0.3961   4
  H2691   肺   0.468   0.4411   0.4795   4
  RERF-LC-MA   肺   0.639   0.0854   0.0623   3
  NCI-H841   肺   0.8459   0.1149   0.1057   3
  SBC-3   肺   0.9716   0.2057   0.155   3
  H2369   肺   1.0518   0.172   0.1562   3
  ChaGo-K-1   肺   1.0137   0.1936   0.1726   3
  H2804   肺   0.8272   0.2981   0.195   3
  NCI-H2286   肺   0.8997   0.2979   0.2466   3
  UMC-11   肺   0.6174   0.2438   0.276   3
  H2373   肺   0.8795   0.3019   0.2853   3
  H2461   肺   0.8732   0.3484   0.2912   3
  细胞系   器官   0.2nM   2.0nM   20nM   敏感度
  H2795   肺   1.0282   0.3473   0.3436   3
  NCI-H196   肺   0.8976   0.3922   0.389   3
  H2722   肺   0.8473   0.4877   0.4089   3
  H28   肺   0.9309   0.4937   0.4124   3
  H2803   肺   0.6578   0.4814   0.4939   3
  H2731   肺   0.9841   0.5147   0.4912   2
  H2591   肺   1.0024   0.5897   0.5288   1
  SW 1271   肺   1.054   0.681   0.585   1
  H2052   肺   0.9018   0.7748   0.6495   1
  H513   肺   0.8696   0.747   0.7763   1
  NCI-H2195   肺   1.0695   0.7473   0.7937   1
  VMRC-LCD   肺：NSCLC   0.1083   0.0165   0.0206   5
  NCI-H1703   肺：NSCLC   0.0217   0.0234   0.0387   5
  DV-90   肺：NSCLC   0.1662   0.0939   0.0801   5
  NCI-H520   肺：NSCLC   0.1553   0.0853   0.0943   5
  HCC-44   肺：NSCLC   0.4828   0.0622   0.0573   4
  LOU-NH91   肺：NSCLC   0.2854   0.0649   0.0667   4
  NCI-H1792   肺：NSCLC   0.4287   0.1012   0.085   4
  LU99A   肺：NSCLC   0.3858   0.1388   0.1203   4
  LU99B   肺：NSCLC   0.3259   0.1927   0.1616   4
  LCLC-103H   肺：NSCLC   0.4592   0.1711   0.163   4
  NCI-H2009   肺：NSCLC   0.2163   0.1481   0.1764   4
  NCI-H2170   肺：NSCLC   0.477   0.2033   0.1894   4
  CAL-12T   肺：NSCLC   0.4345   0.2399   0.2003   4
  SK-MES-1   肺：NSCLC   0.2868   0.2316   0.2173   4
  NCI-H2122   肺：NSCLC   0.8339   0.0731   0.0601   3
  NCI-H460   肺：NSCLC   0.9368   0.0626   0.0624   3
  NCI-H1437   肺：NSCLC   1.0697   0.11   0.0878   3
  细胞系   器官   0.2nM   2.0nM   20nM   敏感度
  ABC-1  肺：NSCLC   0.7461   0.1129   0.0899   3
  NCI-H1299  肺：NSCLC   0.902   0.105   0.094   3
  HCC-366  肺：NSCLC   1.1043   0.0917   0.1002   3
  LU65B  肺：NSCLC   0.9138   0.1102   0.1013   3
  VMRC-LCP  肺：NSCLC   0.6195   0.1294   0.1061   3
  NCI-H3122  肺：NSCLC   0.664   0.1227   0.113   3
  LU65A  肺：NSCLC   0.5925   0.1313   0.1233   3
  201T  肺：NSCLC   1.1069   0.1758   0.1239   3
  EBC-1  肺：NSCLC   0.806   0.155   0.128   3
  NCI-H1666  肺：NSCLC   1   0.112   0.135   3
  RERF-LC-MS  肺：NSCLC   0.6674   0.141   0.1425   3
  273T  肺：NSCLC   0.8467   0.1865   0.159   3
  NCI-H2110  肺：NSCLC   0.929   0.244   0.194   3
  NCI-H2085  肺：NSCLC   1.0485   0.2496   0.2008   3
  NCI-H358  肺：NSCLC   1.1308   0.2687   0.2249   3
  LU99C  肺：NSCLC   0.5091   0.1845   0.2281   3
  EPLC-272H  肺：NSCLC   0.7924   0.2789   0.24   3
  NCI-H2087  肺：NSCLC   0.7317   0.2612   0.2452   3
  NCI-H1915  肺：NSCLC   1.1651   0.2784   0.25   3
  COR-L23  肺：NSCLC   1.0115   0.2364   0.2645   3
  NCI-H1944  肺：NSCLC   0.7625   0.2508   0.2692   3
  LU65  肺：NSCLC   1.0552   0.3022   0.2768   3
  SW 1573  肺：NSCLC   0.6665   0.3095   0.2782   3
  SK-MES  肺：NSCLC   0.7978   0.3101   0.3203   3
  NCI-H2172  肺：NSCLC   0.9469   0.4313   0.3324   3
  NCI-H322  肺：NSCLC   0.5775   0.4467   0.3978   3
  NCI-H1623  肺：NSCLC   0.8983   0.436   0.4131   3
  NCI-H2030  肺：NSCLC   0.9091   0.4382   0.4146   3
  细胞系   器官   0.2nM   2.0nM   20nM   敏感度
  NCI-H1869   肺：NSCLC   0.53   0.4401   0.4219   3
  NCI-H1793   肺：NSCLC   0.8914   0.4837   0.426   3
  NCI-H2228   肺：NSCLC   1.111   0.419   0.431   3
  NCI-H1573   肺：NSCLC   0.5795   0.4795   0.4416   3
  HCC-15   肺：NSCLC   1.081   0.4963   0.4502   3
  RERF-LC-Ad2   肺：NSCLC   0.5334   0.4658   0.4902   3
  NCI-H838   肺：NSCLC   1.043   0.5099   0.3182   2
  NCI-H650   肺：NSCLC   1.0045   0.5034   0.502   1
  NCI-H2405   肺：NSCLC   0.8472   0.497   0.5105   1
  NCI-H2444   肺：NSCLC   0.9104   0.601   0.5357   1
  PC-3[JPC-3]   肺：NSCLC   0.7824   0.5818   0.5439   1
  NCI-H1693   肺：NSCLC   0.6644   0.6313   0.5467   1
  COR-L 105   肺：NSCLC   0.7921   0.5136   0.5478   1
  SK-LU-1   肺：NSCLC   0.8993   0.5272   0.582   1
  HCC-78   肺：NSCLC   0.865   0.666   0.595   1
  H3255   肺：NSCLC   0.894   0.686   0.598   1
  NCI-H1781   肺：NSCLC   0.8353   0.6108   0.6045   1
  HCC-827   肺：NSCLC   0.8265   0.6909   0.6187   1
  HOP92   肺：NSCLC   0.9934   0.695   0.6344   1
  Calu-1   肺：NSCLC   0.8105   0.6374   0.6643   1
  NCI-H2342   肺：NSCLC   0.8589   0.778   0.7798   1
  NCI-H2347   肺：NSCLC   0.9848   0.8783   0.845   1
  LC-1sq   肺：NSCLC   1.9116   0.996   1.2191   1
  JAR   混杂   0.0398   0.0104   0.0015   5
  HT 1080   混杂   0.0583   0.0135   0.0141   5
  TASK1   混杂   0.8609   0.0456   0.0344   3
  GCT   混杂   0.6099   0.097   0.0732   3
  STS 0421   肌肉   0.3838   0.1484   0.11   4
  细胞系   器官   0.2nM   2.0nM   20nM   敏感度
  A673   肌肉   0.5523   0.0896   0.0731   3
  OV-1063   卵巢   0.1051   -0.0465   -0.0045   5
  TOV-112D   卵巢   0.059   0.0111   0.0122   5
  A2780   卵巢   0.1745   0.0693   0.0442   5
  OVMIU   卵巢   0.1776   0.138   0.1443   5
  MDA-H2774   卵巢   0.2085   0.0117   0.0207   4
  IGROV-1   卵巢   0.4271   0.1121   0.1124   4
  RMG-I   卵巢   0.2666   0.2123   0.1716   4
  SK-OV-3   卵巢   0.2853   0.2647   0.291   4
  OAW42   卵巢   0.4569   0.3872   0.3435   4
  OVTOKO   卵巢   0.4835   0.42   0.412   4
  Caov-3   卵巢   0.5251   -0.0004   -0.0224   3
  MCAS   卵巢   1.2885   -0.0085   -0.0142   3
  PA-1   卵巢   0.636   0.005   0.005   3
  ES-2   卵巢   0.9311   0.0747   0.0623   3
  RKN   卵巢   1.0045   0.1482   0.1049   3
  OVCAR-8   卵巢   0.7166   0.1442   0.1224   3
  A2780ADR   卵巢   0.5276   0.1526   0.1356   3
  TYK-nu   卵巢   0.7871   0.245   0.2265   3
  NIH：OVCAR-3   卵巢   1.0723   0.2539   0.2416   3
  OAW28   卵巢   0.8974   0.2001   0.2458   3
  OVCAR-5   卵巢   0.7739   0.2162   0.2648   3
  EFO-27   卵巢   0.8772   0.2627   0.3237   3
  SW 626   卵巢   1.0372   0.3903   0.4064   3
  OVISE   卵巢   0.6107   0.4587   0.4191   3
  OVSAYO   卵巢   0.9829   0.4188   0.4195   3
  EFO-21   卵巢   0.8922   0.4971   0.4502   3
  OV-90   卵巢   1.175   0.4593   0.4735   3
  细胞系   器官   0.2nM   2.0nM   20nM   敏感度
  FU-OV-1   卵巢   0.9593   0.5098   0.495   2
  OVKATE   卵巢   1.0241   0.9374   0.8461   1
  KP-4   胰腺   0.1844   0.0203   0.0222   5
  PANC-1   胰腺   0.3146   0.1726   0.1474   4
  KP-3   胰腺   0.378   0.222   0.175   4
  KP-1N   胰腺   0.3155   0.1894   0.1894   4
  Panc 03.27   胰腺   0.702   0.111   0.117   3
  HUP-T4   胰腺   0.952   0.144   0.154   3
  A2.1   胰腺   1.339   0.186   0.208   3
  HPAC   胰腺   0.939   0.251   0.213   3
  KP-1NL   胰腺   0.702   0.287   0.219   3
  BxPC-3   胰腺   1.233   0.321   0.236   3
  A13A   胰腺   1.115   0.28   0.239   3
  KP-3L   胰腺   0.875   0.287   0.258   3
  Panc 10.05   胰腺   1.204   0.2845   0.267   3
  HUP-T3   胰腺   0.7682   0.2841   0.2686   3
  HPAF-II   胰腺   1.042   0.423   0.372   3
  DAN-G   胰腺   0.6668   0.3759   0.3811   3
  KP-2   胰腺   0.8359   0.4032   0.4095   3
  YAPC   胰腺   0.76   0.507   0.289   2
  Capan-1   胰腺   0.857   0.51   0.368   2
  Panc 02.03   胰腺   1.0158   0.5008   0.4159   2
  AsPC-1   胰腺   1.292   0.721   0.535   1
  SU.86.86   胰腺   1.1289   0.645   0.5435   1
  PL4   胰腺   0.929   0.651   0.544   1
  SUIT-2   胰腺   1.123   0.844   0.57   1
  Panc 08.13   胰腺   0.91   0.761   0.703   1
  Capan-2   胰腺   1.0128   0.7716   0.7456   1
  细胞系   器官   0.2nM   2.0nM   20nM   敏感度
  Panc 04.03   胰腺   0.994   0.798   0.77   1
  DU 145   前列腺   0.931   0.049   0.044   3
  MGH-BA-1   皮肤   0.15   0.044   -0.013   5
  WM1158   皮肤   0.0594   0.0252   0.0321   5
  IGR-1   皮肤   0.1978   0.0714   0.0587   5
  COLO-849   皮肤   0.4553   -0.0091   0.0093   4
  A2058   皮肤   0.2671   0.0255   0.02   4
  M-14   皮肤   0.3071   0.0703   0.0561   4
  MGH-ST-1   皮肤   0.4152   0.074   0.0578   4
  COLO 792   皮肤   0.3273   0.1011   0.0917   4
  VMRC-MELG   皮肤   0.4605   0.1462   0.1194   4
  MGH-BO-1   皮肤   0.353   0.186   0.151   4
  A375.S2   皮肤   0.452   0.1896   0.1536   4
  SK-MEL-39   皮肤   0.4542   0.2968   0.2391   4
  K19   皮肤   0.323   0.3   0.247   4
  IPC-298   皮肤   0.4501   0.3059   0.2539   4
  MGH-SW-1   皮肤   0.2458   0.2558   0.271   4
  A431   皮肤   1.0122   0.022   0.0192   3
  BU-ML   皮肤   0.7451   0.0443   0.0244   3
  CHL-1   皮肤   0.8801   0.0514   0.0326   3
  COLO 857   皮肤   0.7565   0.0666   0.0529   3
  SK-MEL-131   皮肤   0.7317   0.0848   0.0599   3
  UACC-62   皮肤   0.5483   0.1094   0.124   3
  Hs 944.T   皮肤   0.7522   0.1316   0.1388   3
  MGH-PO-1   皮肤   0.7752   0.1548   0.1397   3
  IGR-37   皮肤   0.5675   0.1714   0.1429   3
  UACC903   皮肤   0.555   0.181   0.175   3
  SK-MEL-37   皮肤   0.536   0.2181   0.1784   3
  细胞系   器官   0.2nM   2.0nM   20nM   敏感度
  MGH-MC-1   皮肤   0.7186   0.1934   0.1994   3
  C32   皮肤   0.9511   0.2482   0.2055   3
  G-MEL   皮肤   0.6624   0.2227   0.2122   3
  MEWO   皮肤   0.991   0.255   0.214   3
  IGR-39   皮肤   0.834   0.2702   0.2141   3
  MEL-JUSO   皮肤   0.7127   0.1949   0.2211   3
  451Lu   皮肤   0.7217   0.2594   0.2265   3
  WM35   皮肤   0.8726   0.2125   0.2318   3
  COLO 858   皮肤   0.806   0.306   0.234   3
  1205Lu   皮肤   0.5617   0.2665   0.2484   3
  K4   皮肤   0.919   0.257   0.254   3
  K1   皮肤   0.6275   0.2832   0.2662   3
  WM793B   皮肤   0.6332   0.3606   0.3015   3
  WM 266-4   皮肤   0.7552   0.3436   0.3252   3
  MM608   皮肤   0.7646   0.3161   0.3265   3
  MGH-TH-1   皮肤   1.114   0.4408   0.3347   3
  K2   皮肤   0.97   0.33   0.36   3
  Hs 939.T   皮肤   0.7495   0.4148   0.3821   3
  WM164   皮肤   0.805   0.414   0.399   3
  MGH-QU-1   皮肤   0.97   0.46   0.433   3
  SK-MEL-28   皮肤   0.841   0.476   0.459   3
  Hs 940.T   皮肤   0.899   0.552   0.492   2
  MEL-HO   皮肤   0.8835   0.6098   0.5037   1
  SK-MEL-119   皮肤   0.8436   0.4805   0.5052   1
  HMVII   皮肤   0.7604   0.6097   0.5073   1
  K8   皮肤   0.762   0.468   0.509   1
  MGH-MCC-1   皮肤   1.03   0.73   0.573   1
  WM239A   皮肤   1.447   0.732   0.64   1
  细胞系   器官   0.2nM   2.0nM   20nM   敏感度
  MM455   皮肤   1.257   0.718   0.672   1
  WM902B   皮肤   1.401   0.99   0.805   1
  AGS   胃   0.1829   0.0811   0.067   5
  Takigawa   胃   0.1891   0.1612   0.1255   5
  TMK-1   胃   0.334   0.0293   0.0321   4
  AZ-521   胃   0.3819   0.0702   0.0601   4
  MKN28   胃   0.3799   0.1106   0.0748   4
  IM-95m   胃   0.4254   0.1195   0.0834   4
  KATO II   胃   0.3873   0.2237   0.2532   4
  HGC-27   胃   0.536   0.044   0.057   3
  NUGC-3   胃   1.1004   0.09   0.0967   3
  23132/87   胃   1.0523   0.1618   0.1552   3
  MKN74   胃   1.0538   0.1651   0.1667   3
  KATO III   胃   0.6955   0.1991   0.196   3
  RERF-GC-1B   胃   0.8254   0.3142   0.2073   3
  MKN7   胃   1.1909   0.2781   0.2612   3
  NCI-N87   胃   0.8742   0.3371   0.29   3
  IM-95   胃   0.902   0.311   0.292   3
  OCUM-1   胃   0.8101   0.2168   0.3176   3
  NUGC-4   胃   0.5093   0.3328   0.335   3
  GTL-16   胃   0.7105   0.4124   0.3635   3
  MKN45   胃   0.851   0.326   0.429   3
  FU97   胃   0.7699   0.5171   0.404   2
  MKN1   胃   1.024   0.5318   0.4098   2
  KMH-2   甲状腺   0.343   0.017   0.0093   4
  IHH-4   甲状腺   0.3912   0.0328   0.0391   4
  FTC-133   甲状腺   0.3884   0.1596   0.1535   4
  8505C   甲状腺   0.7694   0.1011   0.0742   3
  细胞系   器官   0.2nM   2.0nM   20nM   敏感度
  FTC-238   甲状腺   0.5915   0.0995   0.0877   3
  CAL-62   甲状腺   0.9829   0.1362   0.1365   3
  ONCO-DG-1   甲状腺   1.0952   0.3063   0.1977   3
  TCO-1   甲状腺   0.7356   0.2228   0.1992   3
  HTC-C3   甲状腺   0.7903   0.2916   0.2857   3
  TT2609-C02   甲状腺   0.9862   0.3171   0.3136   3
  8305C   甲状腺   0.7851   0.435   0.3771   3
  ML-1   甲状腺   0.7562   0.4193   0.4005   3
  BHT-101   甲状腺   1.0259   0.4909   0.4394   3
  S-117   甲状腺   0.8908   0.4405   0.4683   3
  RO82-W-1   甲状腺   0.7894   0.4013   0.4831   3
  B-CPAP   甲状腺   1.378   0.763   0.49   2
  ASH-3   甲状腺   0.7518   0.6432   0.5762   1
  MFE-319   子宫   0.2338   0.0988   0.0843   4
  HEC-1   子宫   0.2361   0.0976   0.1034   4
  SNG-M   子宫   0.6532   0.0129   0.0117   3
  Ishikawa   子宫   0.9421   0.0306   0.0209   3
  MFE-296   子宫   0.6434   0.0852   0.0762   3
  ESS-1   子宫   0.881   0.1059   0.0827   3
  MES-SA   子宫   0.808   0.1341   0.1377   3
  SKN   子宫   0.864   0.2716   0.1851   3
  AN3CA   子宫   0.9261   0.2145   0.2207   3
  Ishikawa(Heraklio)02ER-   子宫 0.88 0.242 0.225 3
  MFE-280   子宫   0.9711   0.4052   0.3979   3
  EFE-184   子宫   0.986   0.5066   0.426   2
  EN   子宫   1.0579   0.6322   0.5471   1
实施例14：式II的化合物对许多实体瘤细胞系是有效的
在一项细胞生存试验中针对多种衍生自血液恶性肿瘤的细胞系测试了化合物IIa，使用CellTiter-在化合物存在48小时后读数。表18列出了血液恶性肿瘤的类型、样品名称、其在该试验中的GI50值(获得50％生长抑制所需要的浓度)、GI50的对数(log(GI50)和每个样品的相对敏感度(差值)。差值通过总体平均log(GI50)(此处为0.236)减去每个细胞系的log(GI50)获得。正值表示样品比平均值更为敏感，而负值表示样品不如平均值敏感。
敏感的血液恶性肿瘤包括：急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和霍奇金淋巴瘤(HL)。
表18.化合物IIa在血液癌症细胞系中的活性
  疾病   细胞系   GI50(nM)   Log(GI50)   差值
  AML   MV4；11   0.08   -1.114   0.747
  AML   MV4；11Luc   0.11   -0.979   0.613
  AML   AML-193   0.11   -0.959   0.593
  AML   Kasumi-1   0.44   -0.357   -0.010
  AML   UKE-1   0.18   -0.757   0.391
  AML   SET-2   0.34   -0.469   0.102
  AML   MOLM13-Luc   0.23   -0.645   0.279
  AML   HL60   0.17   -0.783   0.416
  AML   HL60-Luc   0.51   -0.294   -0.072
  AML   HEL92   0.49   -0.310   -0.056
  CML   K562   0.21   -0.680   0.314
  ALL   CCRF-CEM   0.16   -0.785   0.419
  ALL   RS4；11   0.10   -1.000   0.634
  疾病   细胞系   GI50(nM)   Log(GI50)   差值
  ALL   MOLT-4   0.33   -0.480   0.114
  ALL   SEM-Luc   0.15   -0.824   0.458
  ALL   MOLT-3   0.34   -0.475   0.109
  ALL   REH   0.18   -0.745   0.379
  ALL   SUP-B15   0.19   -0.721   0.355
  ALL   CCRF-HSB-2   0.19   -0.733   0.367
  ALL   697   0.11   -0.979   0.613
  ALL   NALM-6   0.14   -0.870   0.504
  ALL   NALM-19   0.19   -0.721   0.355
  ALL   TANOUE   10.00   1.000   -1.366
  ALL   MHH-CALL-2   0.32   -0.502   0.136
  ALL   MHH-CALL-3   0.20   -0.699   0.333
  ALL   MHH-CALL-4   10.00   1.000   -1.366
  ALL   MUTZ-5   10.00   1.000   -1.366
  ALL   YT   10.00   1.000   -1.366
  MM   KMS11   0.48   -0.316   -0.050
  MM   KMS11-Luc   0.29   -0.538   0.172
  MM   KMS18-Luc   0.52   -0.286   -0.080
  MM   OPM2   0.14   -0.870   0.504
  MM   MM1-S   0.24   -0.620   0.254
  MM   MM1-S-Luc   0.23   -0.638   0.272
  MM   KMS26   0.24   -0.620   0.254
  MM   KMS12   0.29   -0.538   0.172
  MM   L363   0.13   -0.886   0.520
  MM   LP1   0.21   -0.688   0.322
  MM   INA-6   0.12   -0.921   0.555
  疾病   细胞系   GI50(nM)   Log(GI50)   差值
  MM   RPMI8226   0.26   -0.582   0.216
  MM   H929   0.34   -0.475   0.109
  MM   H929-Luc   1.69   0.227   -0.593
  NHL   RL   20.00   1.301   -1.667
  NHL   SuDHL-1   10.00   1.000   -1.366
  NHL   SuDHL-4   0.45   -0.350   -0.016
  NHL   SuDHL-6   0.16   -0.796   0.430
  NHL   U937   0.20   -0.699   0.333
  NHL   SR   0.11   -0.957   0.591
  NHL   Karpas-299-Luc   20.18   1.305   -1.671
  NHL   Karpas-299   0.20   -0.699   0.333
  NHL   Karpas-422   5.14   0.711   -1.077
  NHL   Ramos   0.16   -0.796   0.430
  NHL   HuT78   0.28   -0.561   0.195
  NHL   HH   0.22   -0.668   0.301
  NHL   DEL   0.28   -0.548   0.182
  NHL   SUP-M2   0.18   -0.745   0.379
  NHL   DOHH2   0.24   -0.629   0.263
  NHL   SUP-T1   5.57   0.746   -1.112
  HL   HDLM-2   0.12   -0.921   0.555
  HL   L-1236   3.67   0.564   -0.930
  HL   L428   20.00   1.301   -1.667
  HL   KM-H2   0.23   -0.632   0.266
  平均值   0.430   -0.366

Claims (46)

1.治疗选自哺乳动物实体瘤或血液癌症的增殖性疾病的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的式I的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的可药用盐、所述互变异构体的可药用盐或它们的混合物，其中式I的化合物为
Figure FPA00001158902300011
其中：
R1选自氨基酰基、酰基氨基、羧基、羧基酯、芳基和任选被羟基或卤素取代的烷基；
R2选自氢、烷基和芳基；
Ra是L-A1；
L选自-S(O)q-，其中q是1或2，以及任选被羟基、卤素或酰基氨基取代的C1至C5亚烷基；
A1选自芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基、环烷基和取代的环烷基；
R6选自杂环基、芳基和杂芳基，它们都可以任选的被-(R8)m所取代，其中R8如本文中所定义，m是1至3的整数；
R8选自氰基、烷基、链烯基、炔基、-CF3、烷氧基、卤素和羟基；条件是当m是2或3时，各R8可以相同或不同；
Rb是R4或R5；
R4选自氢、直链烷基、-亚烷基-氨基酰基、-亚烷基-氧酰基、-亚烷基-酰氧基、亚烷基-羟基、-[亚烷基]p-含氮杂环基、-[亚烷基]p-含氮的取代杂环基、-[亚烷基]p-含氮杂芳基、-[亚烷基]p-含氮的取代杂芳基和-[亚烷基]p-NR10R11，其中p是0或1，R4亚烷基是直链的亚烷基，其任选地被选自氨基、取代的氨基、羟基、烷基、取代的烷基、羧基、羧基酯、氧代、螺环烷基和卤素的前述取代基之一单或双取代；
R10和R11独立的选自氢、烷基、取代的烷基、-S(O)-烷基、-S(O)-取代的烷基、-S(O)2-烷基、-S(O)2-取代的烷基、杂环基、取代的杂环基、酰基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基和取代的环烷基，或当R10为氢时，R11是羟基、烷氧基或取代的烷氧基；
R5选自氢、烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳基、取代的芳基、杂芳基和取代的杂芳基；
Rc选自R3和-C(O)-N(R13)(R14)；
R3选自氢和-X-A，其中X选自-C(O)-、-C(S)-、-S(O)-、-S(O)2-和-S(O)2-N(R)-，其中R是氢或烷基；
A选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烷氧基、任选取代的芳基、羧基、羧基酯、氨基酰基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环基以及任选取代的环烷基，其中任选取代的基团被1至4个选自烷基、取代的烷基、烷氧基、取代的烷氧基、氨基、取代的氨基、芳氧基、取代的芳氧基、氰基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基、杂环氧基、取代的杂环氧基、酰基、羧基、羧基酯、氧代(除当A是任选取代的芳基或任选取代的杂芳基外)、卤素、羟基、-S(O)2-R9以及硝基的取代基所取代，其中R9是烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基；并且
R13和R14独立的选自氢、羟基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基，条件是仅R13或R14之一是羟基；或R13和R14和与之连接的氮原子一起形成杂环或取代的杂环。
2.权利要求1的方法，其中所述增殖性疾病是选自肺癌、乳腺癌、卵巢癌、皮肤癌、结肠癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、肾细胞癌、鼻咽癌、鳞状细胞癌、甲状腺乳头状癌、宫颈癌、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌、胰腺癌、头和颈部鳞状细胞癌和肉瘤的实体瘤。
3.权利要求2的方法，其中所述实体瘤是乳腺癌。
4.权利要求3的方法，其中所述乳腺癌是转移的乳腺癌。
5.权利要求2的方法，其中所述实体瘤是胃癌。
6.权利要求2的方法，其中所述实体瘤是前列腺癌。
7.权利要求2-6任一项所述的方法，其中所述肿瘤是多药耐药肿瘤。
8.权利要求7的方法，其中所述肿瘤表达升高水平的P-糖蛋白。
9.权利要求1-8任一项所述的方法，其中式(I)的化合物：
R1是C1-C6烷基或环烷基，和/或
R2是H或C1-C4烷基，和/或
R6是任选取代的芳基，和/或
Ra是任选取代的苄基或芳基甲基，和/或
Rb是氨基取代的C2-C6亚烷基，其可进一步被羟基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4羟基烷基、氧代或卤素取代，和/或
Rc是-X-A，其中-X是-C(O)-，并且A是烷基，其可被最多4个选自氨基、卤素、羟基、烷氧基、氰基、取代的氨基或S(O)2R9的基团所取代，其中R9是C1-C4烷基。
10.权利要求1的方法，其中所述增殖性疾病是选自霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、白血病、髓细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、多毛细胞白血病和多发性骨髓瘤的血液癌症。
11.权利要求10的方法，其中所述血液癌症是急性髓细胞性白血病。
12.权利要求10的方法，其中所述血液癌症是多发性骨髓瘤。
13.治疗选自哺乳动物实体瘤或血液癌症的增殖性疾病的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的式II的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的可药用盐、所述互变异构体的可药用盐或它们的混合物，其中该式II的化合物是：
Figure FPA00001158902300041
或其可药用盐，
其中：
R1c选自乙基、异丙基、叔丁基、苯基、-CH(CH2)2O(环氧丙烷-3-基)和-CCH3(CH2)2O(3-甲基环氧丙烷-3-基)；
R2c是氢或甲基；
R15、R16、R17和R18各自独立的选自H、卤素、C1-4烷基、C1-4卤代烷基和CN；
R19、R20和R21各自独立的是H或任选取代的C1-C10酰基；
R22是C1-C4卤代烷基；
p是1至3的整数；并且
q是1-3的整数。
14.权利要求13的方法，其中所述增殖性疾病是选自肺癌、乳腺癌、卵巢癌、皮肤癌、结肠癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、肾细胞癌、鼻咽癌、鳞状细胞癌、甲状腺乳头状癌、宫颈癌、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌、胰腺癌、头和颈部鳞状细胞癌和肉瘤的实体瘤。
15.权利要求14的方法，其中所述实体瘤是乳腺癌。
16.权利要求15的方法，其中所述乳腺癌是转移的乳腺癌。
17.权利要求14的方法，其中所述实体瘤是胃癌。
18.权利要求14的方法，其中所述实体瘤是前列腺癌。
19.权利要求14-18任一项的方法，其中所述肿瘤是多药耐药肿瘤。
20.权利要求19的方法，其中所述肿瘤表达升高水平的P-糖蛋白。
21.权利要求13的方法，其中所述增殖性疾病是选自霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、白血病、髓细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、多毛细胞白血病和多发性骨髓瘤的血液癌症。
22.权利要求21的方法，其中所述血液癌症是急性髓细胞性白血病。
23.权利要求21的方法，其中所述血液癌症是多发性骨髓瘤。
24.式(II)的化合物或其可药用盐：
Figure FPA00001158902300051
其中：
R1c选自乙基、异丙基、叔丁基、苯基、-CH(CH2)2O(环氧丙烷-3-基)和-CCH3(CH2)2O(3-甲基环氧丙烷-3-基)；
R2c是氢或甲基；
R15、R16、R17和R18各自独立的选自H、卤素、C1-4烷基、C1-4卤代烷基和CN；
R19、R20和R21各自独立的是H或任选取代的C1-C10酰基；
R22是C1-C4卤代烷基；
p是1至3的整数；并且
q是1-3的整数。
25.权利要求24的化合物，其中R22是氟甲基。
26.权利要求24或权利要求25的化合物，其中p是2。
27.权利要求24-26任一项的化合物，其中q是1。
28.权利要求24-27任一项的化合物，其中R2c和R15各自是H。
29.权利要求28的化合物，其中R17和R18各自是卤素。
30.权利要求28的化合物，其中R19、R20和R21各自是H。
31.权利要求24-30任一项的化合物，其中R19是H。
32.权利要求24-30任一项的化合物，其中R19是任选取代的C1-C10酰基。
33.式IIb的化合物或其可药用盐：
Figure FPA00001158902300061
34.式IIa的化合物或其可药用盐：
Figure FPA00001158902300062
35.式IIc的化合物或其可药用盐：
Figure FPA00001158902300071
36.治疗选自哺乳动物实体瘤和血液癌症的增殖性疾病的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的权利要求33、34或35任一项的化合物、任何一种所述化合物的互变异构体、任何一种所述化合物的可药用盐、所述互变异构体的可药用盐或它们的混合物。
37.权利要求36的方法，其中所述增殖性疾病是选自肺癌、乳腺癌、卵巢癌、皮肤癌、结肠癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、肾细胞癌、鼻咽癌、鳞状细胞癌、甲状腺乳头状癌、宫颈癌、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌、胰腺癌、头和颈部鳞状细胞癌和肉瘤的实体瘤。
38.权利要求37的方法，其中所述实体瘤是乳腺癌。
39.权利要求38的方法，其中所述乳腺癌是转移的乳腺癌。
40.权利要求32的方法，其中所述实体瘤是胃癌。
41.权利要求32的方法，其中所述实体瘤是前列腺癌。
42.权利要求37-41任一项的方法，其中所述肿瘤是多药耐药肿瘤。
43.权利要求42的方法，其中所述肿瘤表达升高水平的P-糖蛋白。
44.权利要求36的方法，其中所述增殖性疾病是选自霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、白血病、髓细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、多毛细胞白血病和多发性骨髓瘤的血液癌症。
45.权利要求44的方法，其中所述血液癌症是急性髓细胞性白血病。
46.权利要求44的方法，其中所述血液癌症是多发性骨髓瘤。
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