CN110719906A - Bcl-2相关死亡促进因子(BAD)磷酸化的小分子抑制剂 - Google Patents

Bcl-2相关死亡促进因子(BAD)磷酸化的小分子抑制剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及通式(I)化合物：其中R1、n、R2a、R2b和R3如本文中所限定。所述化合物是Bcl‑2相关死亡促进因子(BAD)磷酸化的抑制剂并且具有抗凋亡活性，并且可用于治疗癌症，特别是乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肝癌、结肠癌、前列腺癌或胰腺癌。

Description

Bcl-2相关死亡促进因子(BAD)磷酸化的小分子抑制剂
本发明涉及新的化合物，并且特别地涉及作为癌细胞中Bcl-2相关死亡促进因子(Bcl-2-associated death promoter，BAD)之抑制剂的化合物，涉及所述化合物用于治疗或预防癌症，并且涉及包含所述化合物的药物组合物。
凋亡或程序性细胞死亡是一种调节机制，主要参与消除自身反应性免疫细胞、衰老细胞和具有不可修复之DNA损伤的细胞[1]。凋亡在脊椎动物中通过两种不同机制执行——外在途径和内在途径[2]。在缺氧条件下、严重的基因组损伤后、氧化应激或生长因子耗尽后，内在途径被激活[3]。BCL-2家族蛋白在调节内在凋亡途径中具有关键作用[4]。已经鉴定出超过20种BCL-2家族成员，并大致分为抗凋亡蛋白、促凋亡蛋白和仅BH3蛋白(BH3-only protein)。BCL-2、BCL-xL和BCL-w是抗凋亡的；BAK和BAX是促凋亡的；而BAD、BIM、PUMA和NOXA是主要的促凋亡的仅BH3蛋白[5-7]。因此，BCL-2家族成员发挥促凋亡和抗凋亡功能二者，并在二者之间保持平衡，并且通常抑制促凋亡的仅BH3蛋白以确保稳态[8]。
凋亡的抑制导致不适当的细胞存活以及癌症的发生和/或进展[9-11]。在大多数恶性肿瘤中，抗凋亡蛋白的表达提高，导致发生对凋亡的抵抗力。Bcl-2相关死亡促进因子(BAD)通过与Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w相互作用在调节凋亡中发挥关键作用[12]。人BAD通过p44/42MAP激酶在Ser75(等效的鼠残基为Ser112)处磷酸化，并且通过AKT/p70S6K在Ser99(等效的鼠残基为Ser136)处磷酸化[13]。这两个丝氨酸残基还通过Pim家族激酶磷酸化以阻止凋亡[14]。BAD在这些残基中任一处的磷酸化导致hBAD与BCL-xL或BCL-2异二聚的能力丧失[15]。磷酸化的BAD蛋白与14-3-3蛋白异二聚，并被隔离在细胞质中[16]。凋亡开始后，BAD经历去磷酸化并与BCL-2、BCL-xL或BCL-w异二聚化，这允许BAK和BAX促进细胞色素C向细胞质的释放，并随后促进内在凋亡途径[17]。还已经报道，BAD在细胞内具有其他蛋白质和功能相互作用。例如，BAD表达受p53调节，并且BAD与p53复合以促进凋亡[18]。Bad被p53转录上调，并在线粒体形成Bad/p53复合物以诱导凋亡[18]。临床上，高BAD表达与前列腺癌中的高Gleason评分相关[15]，并且已报道BAD磷酸化预示了卵巢癌的差的总体存活[19]并且与对顺铂的耐药性相关[19]。此外，在乳腺癌的CD44阳性癌症干细胞(cancer stemcell，CSC)群中的超过80％中观察到了磷酸化的BAD，并且已经报道BAD磷酸化对于CSC存活是必需的[20]。
已经开发出程序性细胞死亡的许多小分子调节剂，其靶向BCL-2家族蛋白以用于针对多种人恶性肿瘤的治疗应用[21-23]。迄今为止，还没有报道仅BH3蛋白(例如BAD)的小分子调节剂。因此，有必要开发通过抑制BAD磷酸化而不影响上游事件来控制癌症的更好且高效的化合物/治疗。
在本发明中，提供了通式(I)化合物或者其可药用盐、溶剂合物或水合物或者其氘化或氚化变体，包括所有立体异构体：
其中：
每个R1独立地为卤素、OH、氰基、硝基、NR10R11、C(O)R10、C(O)OR10、C(O)NR10R11、-S(O)qNR10R11、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、-O(C1-6烷基)、-O(C1-6卤代烷基)、芳基、杂芳基、-O-芳基或-O-杂芳基，
其中
R10和R11各自独立地选自H或C1-6烷基，所述C1-6烷基任选地被选自OH、卤素、氰基、NH2、芳基或杂芳基的一个或更多个取代基取代；
烷基和卤代烷基R1任选地被选自以下的一个或更多个取代基取代：OH、氰基、-S(O)PNR4R5、-C(O)NR4R5、芳基、杂芳基、-O-芳基或-O-杂芳基、任选地被芳基取代的-O(C1-6烷基)、或-O(C1-6卤代烷基)；
芳基或杂芳基R1任选地被选自以下的一个或更多个取代基取代：卤素、OH、氰基、硝基、-NR4R5、-S(O)PNR4R5、-C(O)NR4R5、-C(O)R4、-C(O)OR4或者-C1-6烷基或-O(C1-6烷基)，其任一个任选地被选自OH、卤素、芳基、杂芳基、-O(C1-6烷基)、O(C1-6卤代烷基)、-O-芳基或-O-
杂芳基)的一个或更多个取代基取代；
p为1或2；
R4和R5各自独立地选自H或C1-4烷基，或者R4和R5与它们所连接的氮原子一起可形成3或8元杂环环，所述杂环环任选地包含选自O、N和S的一个或更多个另外的杂原子；
n为0、1、2、3、4或5；
R2a和R2b各自独立地为C1-6烷基，所述C1-6烷基任选地被选自卤素、OH、芳基或杂芳基的一个或更多个取代基取代；或者
R2a和R2b与它们所连接的氮原子一起形成5或6元杂环环，所述杂环环任选地包含选自O、N或S的一个或更多个另外的杂原子，并且任选地被一个或更多个取代基R6取代；
每个R6独立地选自芳基、杂芳基、-O-芳基、-O-杂芳基、碳环基、杂环基、-O-碳环基，-O-杂环基、R12、OR12、C(O)R12、C(O)OR11、C(O)NR11R12、CN、OH，
R11和R12各自独立地为H或C1-4烷基，其任一个可被一个或更多个芳基或杂芳基取代，其中芳基和杂芳基被选自以下的一个或更多个取代基取代：卤素、OH、氰基、硝基、-NR4R5、-S(O)PNR4R5、-C(O)NR4R5、-C(O)R4、-C(O)OR4或者-C1-6烷基或-O(C1-6烷基)，其任一个任选地被选自OH、卤素、芳基、杂芳基、-O(C1-6烷基)、O(C1-6卤代烷基)、-O-芳基或-O-杂芳基)的一个或更多个取代基取代；
其中R4和R5如上所限定；或者R11和R12可与它们所连接的氮原子组合以形成3至8元杂环环，所述杂环环任选地包含选自O、N和S的一个或更多个另外的杂原子并且任选地被C1-4烷基、C1-4卤代烷基或卤素取代；
R3为芳基、杂芳基、碳环基或杂环基，其任一个任选地被一个或更多个取代基R7取代，所述R7选自卤素、任选地被芳基取代的-C1-4烷基、任选地被芳基取代的-O(C1-4烷基)、-C1-4卤代烷基、-O(C1-4卤代烷基)或-C(O)NR8R9；
R8和R9各自独立地选自H、C1-4烷基或C3-6环烷基，或者R8和R9与它们所连接的氮原子一起可形成5或6元杂环环，所述杂环环任选地包含选自O、N和S的一个或更多个另外的杂原子。
通式(I)化合物抑制位点特异性BAD磷酸化而不影响其上游激酶，并因此用于促进多种癌症来源细胞的凋亡。
在本说明书中，除非上下文由于表达语言或必要的暗示而另外需要，否则单词“包括”或变体如“包含”或“含有”以包括性含义使用，即在本发明的多种实施方案中存在所阐明的特征，但不排除其他特征的存在或添加。
在本说明书中，术语“C1-6烷基”是指具有1至6个碳原子的完全饱和的直链或支链烃链。实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、正己基。
术语“C1-4烷基”具有类似的含义，但是是指具有1至4个碳原子的烷基。
术语“C1-6卤代烷基”是指如上定义的C1-6烷基，其中一个或更多个氢原子被卤原子替换。卤代烷基可具有从1至全卤代取代的任何数量的卤素取代基。实例包括氯甲基、三氟甲基、1-溴乙基、1，1，2，2-四氟乙基等。
术语“碳环基”是指具有3至7个碳原子并且任选地包含一个或更多个碳-碳双键的非芳香族烃环。实例包括C3-7环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基，以及环烯基，例如环己烯基。
术语“杂环基”是指具有5至7个碳原子和选自N、O和S的至少一个环杂原子的非芳香族环。实例包括哌嗪基、哌啶基、吗啉基、吡咯烷基和咪唑啉基。
在本说明书中，“卤代”是指氟、氯、溴或碘。
在本说明书的上下文中，术语“芳基”是指除非另有指明否则具有5至14个环碳原子并且包含多至三个环的具有芳香族特征的环体系。当芳基包含多于一个环时，并非所有的环都必须具有完全芳香族特征。芳香族部分的实例是苯、萘，茚满和茚。
在本说明书的上下文中，术语“杂芳基”是指具有5至14个环原子(除非另有指明)，至少一个环原子是选自N、O和S的杂原子并且包含多至三个环的的具有芳香族特征的环体系。当杂芳基包含多于一个环时，并非所有的环都必须具有完全芳香族特征。杂芳基的实例包括吡啶、嘧啶、吲哚、异吲哚、苯并呋喃、苯并咪唑、苯并
Figure BDA0002238817980000041
唑、苯并异
Figure BDA0002238817980000042
唑和英杜林(indolene)。
在通式(I)化合物中，n合适地为2或3，例如2。至少一个R1基团可以是OH。在这种情况下，OH基团合适地在与-CH(R3)NR2aR2b基团相邻的位置。
合适地，通式(I)化合物是通式(IA)化合物：
其中R1、R2a、R2b和R3如上所限定，并且m为0、1、2、3或4。
合适地，在通式(I)和(IA)化合物或者其可药用盐、溶剂合物或水合物或者其氘化或氚化变体，包括所有立体异构体中：
每个R1独立地为卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、芳基或杂芳基，其中芳基或杂芳基任选地被选自以下的一个或更多个取代基取代：卤素、OH、氰基、硝基、-S(O)PNR4R5、-C(O)NR4R5、任选地被芳基取代的-C1-6烷基、-C1-6卤代烷基、任选地被芳基取代的-O(C1-6烷基)、或-O(C1-6卤代烷基)；
p为0、1或2；
R4和R5各自独立地选自H或C1-4烷基，或者R4和R5与它们所连接的氮原子一起可形成5或6元杂环环，所述杂环环任选地包含选自O、N和S的一个或更多个另外的杂原子；
R2a和R2b各自独立地为C1-6烷基，所述C1-6烷基任选地被选自卤素、OH、芳基或杂芳基的一个或更多个取代基取代；或者
R2a和R2b与它们所连接的氮原子一起形成5或6元杂环环，所述杂环环任选地包含选自O、N或S的一个或更多个另外的杂原子，并且任选地被一个或更多个取代基R6取代；
每个R6独立地选自芳基、杂芳基、-O-芳基、-O-杂芳基或者被一个或更多个芳基或杂芳基取代的C1-4烷基，其中芳基和杂芳基被选自卤素、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、-O(C1-4烷基)或-O(C1-4卤代烷基)的一个或更多个取代基取代；
R3为芳基、杂芳基、碳环基或杂环基，其任一个任选地被一个或更多个取代基R7取代，所述R7选自卤素、任选地被芳基取代的-C1-4烷基、任选地被芳基取代的-O(C1-4烷基)、-C1-4卤代烷基、-O(C1-4卤代烷基)或-C(O)NR8R9；
R8和R9各自独立地选自H、C1-4烷基或C3-6环烷基，或者R8和R9与它们所连接的氮原子一起可形成5或6元杂环环，所述杂环环任选地包含选自O、N和S的一个或更多个另外的杂原子。
在通式(IA)的一些合适的化合物中，m为0，因此基团R1不存在。
在另一些合适的化合物中，m为1或2，但更通常为1。
在这种情况下，R1合适地为卤素，特别是氯或氟；或者作为替代地R1为任选地如上所述进行取代的芳基或杂芳基。更通常地，R1为氯、氟或任选地如上所述进行取代的芳基。
当R1为芳基或杂芳基时，其合适地在苯环的4-位(其中被OH基团取代的碳被指定为位置1)。
芳基或杂芳基R1的合适的取代基包括卤素、OH、氰基、硝基、-SO2NH2、-C(O)NR4R5、任选地被芳基取代的-C1-4烷基、-C1-4卤代烷基、任选地被芳基取代的-O(C1-4烷基)、或-O(C1-4卤代烷基)；其中R4和R5与它们所连接的氮原子一起形成哌啶或吡咯烷环。
芳基或杂芳基R1的更合适的取代基包括氯、氟、甲基、乙基、三氟甲基、苄基、甲氧基、乙氧基、苄氧基、三氟甲氧基和哌啶-1-羰基。
在本发明的一些合适的化合物中，R2a和R2b与它们所连接的氮原子一起形成5或6元杂环环，所述杂环环任选地包含选自O、N或S的一个或更多个另外的杂原子并且任选地被一个或更多个取代基R6取代，其中R6如上所限定。
更合适地，R2a和R2b与它们所连接的氮原子一起形成任选地被一个或更多个取代基R6取代的6元杂环环。
更合适地，由R2a和R2b形成的6元环是哌啶或哌嗪环，最合适地是哌嗪环。当R2a和R2b形成哌嗪环时，其可任选地被一个或更多个如上所定限定的取代基R6取代，但是合适地在哌嗪4-位上被单个R6取代基取代，使得通式(I)化合物为通式(IB)化合物：
Figure BDA0002238817980000071
其中R1、n、R3和R6如对于通式(I)和(IA)所限定。
特别合适的取代基R6包括芳基、杂芳基、-O-芳基、-O-杂芳基或者一个或两个芳基或杂芳基取代的甲基；其中芳基和杂芳基被选自卤素、甲基、乙基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基或三氟甲氧基的一个或更多个取代基取代。
更合适的取代基R6包括苯基、杂芳基、-O-苯基、-O-杂芳基、苄基、-CH(苯基)2、-CH2-杂芳基和-CH(杂芳基)2，其中杂芳基选自吡啶基、吲哚基、异吲哚基、苯并
Figure BDA0002238817980000072
唑基和苯并异唑基，并且其中任何上述R6基团可以如上所限定进行取代，但是更合适地被选自卤素、甲基乙基和三氟甲基的一个或更多个取代基取代。
在通式(I)和(IA)的更合适的化合物中，R3为任选地被一个或更多个如上所限定的取代基R7取代的芳基或杂芳基。
最合适地，R3为任选地被一个或更多个取代基R7取代的苯基，使得通式(I)化合物为通式(IC)化合物：
Figure BDA0002238817980000074
其中R1、n、R2a、R2b和R7如对于通式(I)或(IA)所限定，并且z为0至5。
更合适地，z为0、1、2或3，最合适地为0、1或2。
R7如上所限定，但是在一些合适的化合物中R7不存在(即，z为0)，或者R7为卤素、-C1-4烷基、苄基、-O(C1-4烷基)苄氧基、-C1-4卤代烷基、-O(C1-4卤代烷基)或-C(O)NR8R9，其中R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成哌啶基环或其中R8是H并且R9是C3-7环烷基。
更合适地，R7不存在或者每个R7独立地为卤素(尤其是氯或氟)、甲基、乙基、苄基、甲氧基、乙氧基、苄氧基、-C(O)-哌啶基或-C(O)NH-C3-7环烷基。
本发明的一些特别合适的化合物是通式(ID)化合物：
其中R1、n、R6、R7和z如上文对于通式(I)、(IA)、(IB)和(IC)所限定。
示例性通式(I)化合物包括：
2-((2-氯苯基)(4-(4-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯酚(化合物1)；
2-((4-氯苯基)(4-(4-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯酚(化合物2)；
2-((4-(苄氧基)-3-氟苯基)(4-(4-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯酚(化合物3)；
(4-((2-羟基苯基)(4-(4-甲氧基苯基)哌嗪基)甲基)苯基)(哌啶-1-基)甲酮(化合物4)；
3-((5-氯-2-羟基苯基)(4-(4-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)甲基)-N-环戊基苯甲酰胺(化合物5)；
2-((4-(苄氧基)-3-氟苯基)(4-(4-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)甲基)-4-氯苯酚(化合物6)；
2-((4-(苄氧基)-3-氟苯基)(4-(6-氟苯并[d]异唑-3-基)哌啶-1-基)甲基)苯酚(化合物7)；
2-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(邻甲苯基)甲基)苯酚(化合物8)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(2-羟基苯基)甲基)苯甲酰胺(化合物9，NPB)；
2-((4-(苄氧基)-3-氟苯基)(4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯酚(化合物10)；
2-((4-((4-氯苯基)(苯基)甲基)哌嗪-1-基)(苯基)甲基)苯酚(化合物11)；
2-((4-((4-氯苯基)(苯基)甲基)哌嗪-1-基)(对甲苯基)甲基)苯酚(化合物12)；
2-((4-氯苯基)(4-((4-氯苯基)(苯基)甲基)哌嗪-1-基)甲基)苯酚(化合物13)；
2-((4-((4-氯苯基)(苯基)甲基)哌嗪-1-基)(4-乙基苯基)甲基)苯酚(化合物14)；
(4-((4-((4-氯苯基)(苯基)甲基)哌嗪-1-基)(2-羟基苯基)甲基)苯基)(哌啶-1-基)甲酮(化合物15)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物16)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-羟基-2′-甲基-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物17)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-羟基-3′-甲基-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物18)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-羟基-4′-甲基-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物19)；
3-((2′-氯-4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)(4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)-N-环戊基苯甲酰胺(化合物20)；
3-((3′-氯-4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)(4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)-N-环戊基苯甲酰胺(化合物21)；
3-((4′-氯-4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)(4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)-N-环戊基苯甲酰胺(化合物22)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4′-乙基-4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物23)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-羟基-4′-(哌啶-1-羰基)-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物24)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-羟基-4′-甲氧基-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物25)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(2′-乙基-4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物26)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(2′-氟-4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物27)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(3′-氟-4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物28)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4′-氟-4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物29)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-羟基-3′-硝基-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物30)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-羟基-3′-氨磺酰基-[1，1′-联苯-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物31)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-羟基-2′-(三氟甲基)-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物32)；
N-环戊基-3-(((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-羟基-3′-(三氟甲基)-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物33)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-羟基-4′-(三氟甲基)-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物34)；
3-((2′-氰基-4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)(4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)-N-环戊基苯甲酰胺(化合物35)；
3-((3′-氰基-4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)(4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)-N-环戊基苯甲酰胺(化合物36)
3-((4′-氰基-4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)(4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)-N-环戊基苯甲酰胺(化合物37)；
3-((2′-氯-4-羟基-4′-(三氟甲基)-[1，1′-联苯]-3-基)(4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)-N-环戊基苯甲酰胺(化合物38)；
N-环戊基-3-((2′，4′-二氯-4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)(4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯甲酰胺(化合物39)；
3-(((4′-氯-2′，4-二羟基-[1，1′-联苯]-3-基)(4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)-N-环戊基苯甲酰胺(化合物40)；
3-((4-(4-氯苯基)哌嗪-1-基)(2-羟基苯基)甲基)-N-环戊基苯甲酰胺(化合物41，NCK1)
2-((4-氯苯基)(4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯酚(化合物42，NCK2)
2-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(3-甲氧基苯基)甲基)苯酚(化合物43，NCK3)
1-(5-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(2-羟基苯基)甲基)噻吩-2-基)乙酮(化合物44，NCK4)
2-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(萘-1-基)甲基)苯酚(化合物45，NCK5)
5-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(2-羟基苯基)甲基)呋喃-2-甲醛(化合物46，NCK6)
2-((4-(5，6-二氯环己-1，5-二烯-1-基)哌嗪-1-基)(2-氟-3-甲基吡啶-4-基)甲基)苯酚(化合物47，NCK7)
2-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-(三氟甲基)苯基)甲基)苯酚(化合物48，NCK8)
2-((6-氯-5-甲基吡啶-3-基)(4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯酚(化合物49，NCK9)
2-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(吡啶-3-基)甲基)苯酚(化合物50，NCK10)
1-(5-((4-(4-氯苯基)哌嗪-1-基)(2-羟基苯基)甲基)噻吩-2-基)乙酮(化合物51，NCK14)
3-((4-(4-氯苯基)哌嗪-1-基)(4-(二乙氨基)-2-羟基苯基)甲基)-N-环戊基苯甲酰胺(化合物52，NCK16)
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-(二乙氨基)-2-羟基苯基)甲基)苯甲酰胺(化合物53，NCK18)
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(2-羟基-4，6-二甲氧基苯基)甲基)苯甲酰胺(化合物54，NCK19)
2-((4-氯苯基)(4-(4-氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯酚(化合物55，NCK20)
2-((4-(4-氯苯基)哌嗪-1-基)(6-甲基吡啶-3-基)甲基)苯酚(化合物56，NCK21)
2-(邻甲苯基(4-(对甲苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯酚(化合物57，SG1)
2-((4-(对甲苯基)哌嗪-1-基)(4-(三氟甲基)苯基)甲基)苯酚(化合物58，SG2)
N-环戊基-4-((2-羟基苯基)(4-(对甲苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯甲酰胺(化合物59，SG3)
2-((4-氯苯基)(4-(对甲苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯酚(化合物60，SG4)
2-((3-甲氧基苯基)(4-(对甲苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯酚(化合物61，SG5)
5-((2-羟基苯基)(4-(对甲苯基)哌嗪-1-基)甲基)呋喃-2-甲醛(化合物62，SG6)；以及
2-((6-甲基吡啶-3-基)(4-(对甲苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯酚(化合物63，SG7)。
通式(I)化合物可通过使通式(II)的醛与通式(III)化合物和通式(IV)的硼酸反应来制备：
Figure BDA0002238817980000121
其中R1和n如对于通式(I)所限定；
Figure BDA0002238817980000122
其中R2a和R2b如对于通式(I)所限定；
Figure BDA0002238817980000131
其中R3如对于通式(I)所限定。
该反应是Petasis反应，其为三组分硼酸曼尼希型反应，其使用通式(IV)的硼酸作为潜在的亲核物质与通式(II)的水杨醛衍生物和通式(III)的胺反应以形成新的碳-碳键。Petasis反应通过形成亚铵物质(iminium species)来进行，该亚铵物质与硼酸反应以生成叔胺。
合适的反应溶剂包括有机溶剂，例如环醚，例如二氧六环。
适当地，该过程包括：
i.使通式(II)化合物与通式(III)化合物反应以形成包含中间亚铵物质的混合物；
ii使步骤(i)的产物与通式(IV)化合物反应。
合适地，步骤(ii)在高温(例如50至100℃)下，例如在溶剂的回流温度下进行。当溶剂是二氧六环时，其为约85至95℃，通常为约90℃。
可使用例如下面实施例中所述的标准方法将产物萃取到第二溶剂(例如乙酸乙酯)中，干燥和并且纯化。
通式(II)、(III)和(IV)化合物是已知的并且可商购，或者可使用已知方法制备。
通式(I)化合物也可由通式(I)的其他化合物制备。例如，其中R1为任选被取代的芳基或杂芳基的通式(I)化合物可由其中R1为卤素的通式(I)化合物通过与通式(V)化合物反应来制备：
其中R1a为芳基或杂芳基，所述芳基或杂芳基任选地如对于通式(I)所限定进行取代。
该反应可使用铃木偶联反应(Suzuki coupling reaction)在钯催化剂上进行。
通式(V)化合物是已知的并且可商购，或者可使用已知的方法制备。
用于制备通式(I)化合物的方法代表了本发明的另一个方面。
通式(I)化合物能够在癌细胞中抑制/下调/遏制Bcl-2相关死亡促进因子(BAD)蛋白，特别是抑制/下调/遏制Bcl-2相关死亡促进因子(BAD)蛋白的磷酸化。发生BAD的抑制/下调/遏制，而不影响被称为Akt/蛋白激酶B(PKB)的上游Ser/Thr激酶。因此，通式(I)化合物优先抑制/下调/遏制BAD的磷酸化。
BAD的抑制/下调是通过通式(I)化合物占据Bcl-2/BAD的蛋白质-蛋白质界面内的疏水沟来进行的。另外，通式(I)化合物占据由人蛋白质的Leu-97、Trp-144和Phe-198的侧链与二氯苯基部分形成的界面内了另外的疏水侧口袋。
式(I)化合物是癌细胞(特别是乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肝癌、结肠癌、前列腺癌和胰腺癌细胞)中BAD的强效抑制剂/下调剂，并且由于BAD磷酸化的下调/抑制而诱导凋亡。所述化合物增强癌细胞的细胞毒性，并且进行BAD磷酸化的靶标特异性下调/抑制，而不影响上游激酶。
筛选通式(I)化合物对MCF7细胞的抗癌活性，并且发现NPB(化合物9)是最强效的化合物。随后针对以下组对NPB进行了评价：正常的永生化乳腺上皮细胞(MCF10A和MCF12A)、正常肝细胞(LO2)、乳腺癌(BT549、MDA-MB-231、MCF7、T47D、BT474)、子宫内膜癌(Ishikawa、Ecc1、RL95-2、AN3)、卵巢癌(SK-OV-3、OVCAR-2、Caov-3、HEY C2、Ovca433)、肝癌(Hep3B、H2P、H2M)、结肠癌(HCT116、DLD-1、Caco-2)、前列腺癌(PC3、LNCaP、DU145)和胰腺癌(AsPC-1、BxPC-3)细胞。NPB在所有受试癌细胞系中均显著增强凋亡，并且NPB对正常肝细胞和永生化乳腺上皮细胞没有实质性的活性。使用拉普拉斯修正的朴素贝叶斯分类器(Laplacian-modified
Figure BDA0002238817980000141
Bayes classifier)，对NPB进行计算机分析(in silicoanalysis)，其预测NPB的人靶标为BAD蛋白。
发现NPB在一系列癌细胞中诱导凋亡性细胞死亡，但对正常(永生化)上皮细胞没有细胞毒性作用。
经历凋亡的细胞的标志性特征是磷脂酰丝氨酸外在化(externalization)、胱天蛋白酶激活和基因组DNA片段化。在一个实施方案中，使用FITC-膜联蛋白-V和碘化丙锭染色，NPB表现出针对MCF7细胞的凋亡。FITC-膜联蛋白-V染色证实了膜完整性的丧失，且PI染色证实了晚期凋亡事件，并且这些结果与胱天蛋白3/7活性相关。
因此，在本发明的另一个方面，提供了通式(I)化合物用于药物。
通式(I)化合物特别用于治疗癌症，合适的是其中存在BAD磷酸化的癌症。
因此，在另一个方面，提供了通式(I)化合物用于治疗癌症。
此外，提供了通式(I)化合物在制备用于治疗癌症的药剂中的用途。
还提供了用于治疗癌症的方法，所述方法包括向有此治疗需要的患者施用有效量的通式(I)化合物。
所述化合物特别地可用于治疗其中存在BAD磷酸化的癌症，例如所述癌症可以是其中BAD被磷酸化的乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肝癌、结肠癌、前列腺癌或胰腺癌或者其他上皮来源的癌症。
通式(I)化合物适合在药物组合物中施用，因此在本发明的另一个方面提供了包含通式(I)化合物和可药用赋形剂的药物组合物。
可药用赋形剂可以是辅料、稀释剂、载体、制粒剂、黏合剂、润滑剂、崩解剂、甜味剂、助流剂、抗黏剂、抗静电剂、表面活性剂、抗氧化剂、树胶、包衣剂、着色剂、矫味剂、包衣剂、增塑剂、防腐剂、助悬剂、乳化剂、植物纤维素材料、滚圆剂(spheronization agent)、其他常规已知的可药用赋形剂或其赋形剂的任何组合。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物被配制成用于腹膜内施用、经肝门静脉施用(hepatoportal administration)、静脉内施用、关节内施用、经胰十二指肠动脉施用(pancreatic duodenal artery administration)或肌内施用，或其任意组合。
现在将参考实施例和附图更详细地描述本发明，其中：
图1(a)和1(b)描绘了化合物1的1H-NMR和13C-NMR谱。
图2描绘了化合物2的13C-NMR谱。
图3(a)和3(b)描绘了化合物3的1H-NMR和13C-NMR谱。
图4(a)和4(b)描绘了化合物4的1H-NMR和13C-NMR谱。
图5(a)和5(b)描述了化合物5的1H-NMR和13C-NMR谱。
图6描绘了化合物6的1H-NMR谱。
图7(a)和7(b)描述了化合物7的1H-NMR和13C-NMR谱。
图8描述了化合物8的13C-NMR谱。
图9(a)和9(b)描绘了化合物9的1H-NMR和LCMS谱。
图10描述了化合物10的1H-NMR谱。
图11：NPB在一系列癌细胞系中的IC50值。
图12：NPB在癌细胞系中抑制细胞活力并促进凋亡。
NPB(5μM)对癌细胞生存力的影响，包括乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肝癌、结肠癌、前列腺癌和胰腺癌细胞系。如研究方法中所述使用ApoTox-GloTM三重测定试剂盒评价(A)细胞生存力(B)半胱天冬酶3/7活性和(C)细胞毒性。使用GraphPad Prism5通过非配对双尾t检验(Student’s t-test)评估统计学显著性。柱代表一式三份测定的平均值；条，±SD。**P＜0.001，*P＜0.05。注：RFU，相对荧光单位；RLU，相对发光单位，#；未经转化的永生化上皮细胞；MB-231，MDA-MB-231。
图13：NPB在MCF7细胞中刺激凋亡性细胞死亡。
(A)在用10μM NPB处理之后，使用流式细胞术分析测量的MCF7细胞的凋亡性细胞死亡。X轴上指示膜联蛋白V-FITC染色，并且Y轴上指示PI染色。左下象限代表活细胞，右下象限代表早期凋亡细胞，左上象限代表坏死细胞，而右上象限显示晚期凋亡细胞。在每个象限中膜联蛋白V和PI数据的采集以百分比(％)表示。(B)在用10μM NPB处理之后，使用流式细胞术分析测量的MCF7细胞的细胞周期分析。(C)使用生存力测定，由MCF7在暴露于NPB或DMSO之后在3D基质胶(Matrigel)中培养14天产生的执行集落的细胞生存力。培养在3D基质胶中在暴露于暴露于NPB或DMSO之后，由MCF7细胞产生的钙黄绿素(Calcein)AM染色集落的显微镜可视化(下)。(D)使用
Figure BDA0002238817980000162
生存力测定，由培养在软琼脂中的MCF7细胞在暴露于NPB或DMSO之后产生的集落中的细胞生存力。(E)由MCF7细胞在暴露于NPB或DMSO之后产生的聚焦集落的结晶紫染色。如研究方法中所述进行所有测定。使用GraphPad Prism5通过非配对双尾t检验评估统计学显著性。柱代表一式三份测定的平均值；条，±SD。**P＜0.001，*P＜0.05。
图14：化学信息学和表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)分析预测NPB化合物与BAD蛋白的相互作用。
(A)通过NPB与BAD蛋白亚基的SPR分析获得的传感图(Sensorgram)。将BAD蛋白亚基固定在CM5传感器芯片的表面上。进样多种浓度(20-100μM)的NPB溶液以产生结果结合响应(RU)，其记录为时间(秒)的函数。使用BIA评估3.1来分析结果。(B)使用Western印迹(Western blot，WB)分析评估在用NPB处理之后MCF7细胞中BAD的Ser99磷酸化的水平。(下)使用来自美国NIH的ImageJ软件(http：//imagej，nih.gov/ij/)从如上所示对于BAD磷酸化(Ser99)、BAD和β-肌动蛋白的剂量响应计算NPB的IC50。(C)使用WB分析评估在NPB处理之后MCF7细胞中涉及BAD上游的多种蛋白质的水平。(D)使用WB分析评估在用NPB处理之后MCF7细胞中涉及细胞存活和细胞增殖的多种蛋白质的水平。对于WB分析，如研究方法中所述将可溶性全细胞提取物在SDS-PAGE上运行并进行免疫印迹。使用β-肌动蛋白(ACTB)作为细胞裂解物的输入对照。左侧示出了以kDa为单位的所检出蛋白质带的大小。
图15：NPB以不依赖于AKT信号转导的方式特异性抑制癌细胞系中BAD的磷酸化(在Ser99处)。
(A)在用NPB(5μM)处理之后，使用WB分析评估包括乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、子宫内膜癌、肝细胞癌、结肠癌和前列腺癌在内的一系列癌细胞系中磷酸化的人BAD(在Ser75和Ser99处)和BAD蛋白的水平。使用总BAD作为细胞裂解物的输入对照。(B)使用WB分析评估MCF7、Caov-3、Ishikawa和AsPC-1细胞中pBAD(Ser99)和pAKT(Ser473)、AKT和BAD的水平。使用AKT抑制剂(IV)和NPB各5μM处理细胞。如研究方法中所述，使用针对AKT转录物的短发夹(sh)-RNA(1和2)的瞬时转染实现AKT表达的耗尽。使用β-肌动蛋白作为细胞裂解物的输入对照。对于WB分析，如材料研究方法中所述将可溶性全细胞提取物在SDS-PAGE上运行并进行免疫印迹。左侧示出了以kDa为单位的所检出蛋白质带的大小。注意：#；未经转导的永生化细胞系。
图16：siRNA介导的BAD表达的耗尽阻止NPB在癌细胞系中的作用。
(A)在用5μM NPB处理之后，使用WB分析评估MCF7、BT474、Caov-3、Ishikawa、AsPC-1和DLD-1细胞中pBAD(Ser99)活性和BAD蛋白的水平。使用针对BAD转录物的小干扰(si)-RNA的瞬时转染实现BAD表达的耗尽。如材料和方法中所述，将可溶性全细胞提取物在SDS-PAGE上运行并进行免疫印迹。使用β-肌动蛋白作为输入对照。NPB(5μM)在MCF7、BT474、Caov-3、Ishikawa、AsPC-1和DLD-1细胞中的作用。使用ApoTox-GloTM三重分析试剂盒评估(B)细胞生存力和(C)胱天蛋白酶3/7活性。所有测定如研究方法中所述进行。使用GraphPadPrism5通过非配对双尾t检验评估统计学显著性(P＜0.05被认为是显著的)。柱代表一式三份测定的平均值；条，±SD。**P＜0.001，*P＜0.05。注：RFU，相对荧光单位；RLU，相对发光单位。
图17：NPB抑制乳腺癌中BAD Ser99的磷酸化并抑制肿瘤生长(A)如材料和方法中所述测量BALB/c-nu雌性小鼠中的肿瘤体积。用载剂、5mg/kg NPB或20mg/kg NPB处理动物(每组n＝5)，并记录相对肿瘤负荷。在实验过程中每天测量动物体重。(B)在NPB处理方案之后切除肿瘤并称重。右侧示出了代表性切除的肿瘤。(C)肿瘤组织的WB，以确定p-BAD(Ser99)和BAD的水平。如研究方法中所述将可溶性全细胞提取物在SDS-PAGE上运行并进行免疫印迹。使用β-肌动蛋白作为输入对照。左侧示出了以kDa为单位的所检出蛋白质带的大小。(D)磷酸化BAD、BAD、Ki67和TUNEL染色的组织学分析。将肿瘤组织切片用山羊抗pBAD(Ser 136)多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)、小鼠抗BAD单克隆抗体(Santa CruzBiotechnology)和抗Ki67抗体(Abeam，ab15580)进行免疫标记，并用苏木精染色。如研究方法中所述使用TUNEL凋亡检测试剂盒(Gen Script USA Inc.)检测凋亡性DNA片段化。使用GraphPad Prism5通过非配对双尾t检验评估统计学显著性(P＜0.05被认为是显著的)。点代表一式三份实验的平均值；条，±SD。**P＜0.001，*P＜0.05。
图18：
(A)在用NPB(10μM)处理延长的时间后，使用Western印迹分析评估MCF7细胞中pBAD、BAD、pAKT和AKT的BAD Ser99磷酸化的水平。如研究方法中所述将可溶性全细胞提取物在SDS-PAGE上运行并进行免疫印迹。左侧示出了以kDa为单位的所检出蛋白质带的大小。(B)使用Western印迹阵列(Proteome Profiler人磷酸化-激酶阵列试剂盒)检测激酶和磷酸化底物。在制备细胞裂解物之前，将MCF7细胞在37℃下用NPB(10μM)或DMSO处理12小时。使用ImageJ软件分析平均像素密度并如下示出。
图19描绘了化合物NCK5的1H-NMR谱。
图20描绘了化合物NCK16的1H-NMR谱。
图21描绘了化合物NCK18的1H-NMR谱。
图22A、22B、22C、22D和22E：癌细胞系中基于NPB结构的类似物的IC50值。
注：NV：没有值
用于实现本公开内容的实施例的材料
细胞培养和试剂-
人永生化乳腺上皮细胞系MCF10A和MCF12A；以及永生化肝细胞上皮细胞系LO2获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC，Rockville，MD)，并按照ATCC繁殖说明进行培养。MC细胞系MCF7、T47D、BT474、BT549和MDA-MB-231(表示为MB-231)；子宫内膜癌细胞系Ishikawa、ECC1、RL95-2和AN3；肝细胞癌细胞系Hep3B、H2P和H2M；结肠癌细胞系HCT116、DLD-1和Caco-2；以及前列腺癌细胞系PC3、LNCaP和DU145获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)。卵巢癌细胞系SK-OV-3、OVCAR-2、Caov-3、HEY C2和Ovca433获自新加坡国立大学(National University of Singapore，NUS)新加坡癌症科学研究所(The Cancer Science Institute of Singapore)的Ruby Huang博士的实验室。胰腺癌细胞系获自新加坡国立大学(NUS)新加坡癌症科学研究所的H.PhillipKoeffler教授的实验室。按照ATCC繁殖说明培养所有癌细胞系。AKT抑制剂IV购自Calbiochem(San Diego，CA，USA)。BAD定向隐形(sh)-RNA-BAD(shRNA-BAD1，5’-GCUCCGCACCAUGAGUGACGAGUUU-3’和shRNA-BAD2，5’AAACUCGUCACUCAUCCUCCGGAGC3’)购自Life Technologies(Singapore)。AKT定向shRNA(shRNA-AKT1，5’-CCGGCGCGTGACCATGAACGAGTTTCTCGAGAAACTCGTTCATGGTCACGCGTTTTTG-3’和shRNA2-AKT，5’-CCGGGGACTACCTGCACTCGGAGAACTCGAGTTCTCCGAGTGCAGGTAG TCCTTTTTG-3′)购自Life Technologies(Singapore)，并且克隆到PLKO.1载体(Sigma，Singapore)中。使用FuGENE HD(Promega)用20nM shRNA(AKT或BAD)或通用阴性对照(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)将细胞瞬时转染24小时，并进行进一步测定。丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、血尿素氮(BUN)商业试剂盒购自AGAPPE Diagnostics Ltd，Kerala，India。
实施例1
式T化合物的合成和表征
式I化合物的一般合成
将哌嗪(0.8mmol)和水杨醛(0.8mmol)置于RBF中，并且使用二氧六环作为溶剂搅拌约10分钟。约10分钟后，向混合物添加芳基硼酸(0.8mmol)，并且在保持在约90℃的热板上使用二氧六环作为溶剂在连续搅拌下回流约8小时。约8小时后，向反应混合物添加乙酸乙酯和水，使用分液漏斗分离乙酸乙酯层并且用无水硫酸钠干燥。蒸发乙酸乙酯以获得产物。通过使用柱色谱法进行分离获得期望的酚类化合物产物。
下表1中提供了用于获得化合物1至15和41至63的特定试剂。
表1
Figure BDA0002238817980000211
Figure BDA0002238817980000231
Figure BDA0002238817980000241
Figure BDA0002238817980000261
使用如方案1中所示的钯催化的铃木偶联反应使NPB溴化物(参见表2的第1列)与硼酸反应获得表2中所示化合物。
方案1
Figure BDA0002238817980000271
表2
Figure BDA0002238817980000272
Figure BDA0002238817980000281
Figure BDA0002238817980000301
Figure BDA0002238817980000311
Figure BDA0002238817980000321
Figure BDA0002238817980000331
化合物1的表征
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：3.691(s，3H)，5.303(s，1H，C-H)，1.184-3.691(m，8H-piperazine protons)，7.597-7.615(d，1H，J＝7.2Hz)，7.341-7.323(d，1H，J＝7.2Hz)，7.060-7.189(m，4H-ArH)，6.555-6.815(m，5H-ArH)，6.956-6.974，(d，1H，J＝7.2Hz)11.85(s，1H-OHbrd peak)；13C NMR(400MHz，CDCl3)δ：50.854，55.521，69.50，114.45，117.17，118.44，119.547，122.05，127.78，128.83，129.01，129.19，129.84，129.93，133.89，145.11，156.60；
熔点120-124℃。(图1)
化合物2的表征
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：2.539-3.065(m，8H)，3.674(s，3H)，4.359(s，1H)，6.651(m，1H)，6.740-6.804(m，5H)，6.855-6.872(d，1H，J＝6.8Hz)，7.086(m，1H)，7.165(m，2H)，7.280(m，1H)，7.361(m，1H)；13C NMR(400MHz，CDCl3)δ：50.74，51.76，55.52，75.86，114.49，117.24，118.43，119.62，124.41，126.58，128.28，128.54，128.92，129.20，130.28，134.66，141.63，145.07，154，156.18；
熔点85-89℃。(图2)
化合物3的表征
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：1.194-3.079(m，8H)，3.689(s，3H)，4.336(s，1H)，5.041(s，2H)，6.672-6.702(m，1H)，6.781-6.819(m，5H)，6.863-6.867(m，2H)，7.026-7.082(m，2H)，7.196(m，1H)，7.279-7.348(m，5H)；13C NMR(400MHz，CDCl3)δ：50.770，55.52，71.26，75.36，114.46，115.46，117.16，118.42，119.54，124.82，127.34，128.14，128.62，128.76，129.14，145.04，156.14；
熔点72-76℃。(图3)
化合物4的表征：
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：1.183-2.469(m，10H)，2.557-3.684(m，8H)，3.684(s，3H)，4.412(s，1H)，6.631(m，2H)，6.745-6.813(m，4H)，7.059-7.095(m，1H)，7.191-7.216(m，1H)，7.261-7.269(m，2H)，7.351-7.409(m，2H)；13C NMR(400MHz，CDCl3)δ：24.51，26.525，29.68，43.60，48.73，50.71，51.80，55.51，76.04，114.45，117.134，118.366，119.198，119.52，124.75，126.74，127.50，128.04，128.50，128.79，129.29，136.18，141.02，145，154，156.2，169.79(C＝O)；
熔点78-82℃。(图4)
化合物5的表征：
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：1.186-1.650(m，8H)，1.978-3.633(m，8H)，3.689(s，3H)，4.298-4.345(m，1H)，4.421(s，1H)，5.979-5.992(s，1H)6.736-6.803(m，5H)，6.860(m，1H)，7.192(s，1H)，7.737(s，1H)，7.304-7.339(m，1H)，7.540-7.557(m，2H)；13C NMR(400MHz，CDCl3)δ：23.79，33.18，50.67，51.83，55.51，67.06，75.06，114.46，118.45，118.58，124.02，126.11，126.42，128.72，128.87，129.39，139.39，144.89，154.19，154.95，166.68；
熔点102-106℃。(图5)
化合物6的表征：
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：1.179-3.620(m，8H)，3.676(s，3H)，4.261(s，1H)，5.029(s，2H)，6.716-6.791(m，5H)，6.823(m，1H)，6.862-6.882(m，1H)，6.973-7.015(m，2H)，7.110-7.139(m，1H)，7.243-7.258(m，2H)，7.280-7.317(m，1H)，7.331-7.350(m，2H)；13CNMR(400MHz，CDCl3)δ：50.70，51.59，55.52，71.27，74.93，114.48，115.52，118.58，123.97，124.39，126.3，127.3，128.2，128.8，132.1，136.27，144.96，146.74，154.19，154.93；
熔点60-64℃。(图6)
化合物7的表征：
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：2.648-3.820(m，8H)4.245(s，1H)，5.009(s，1H)，5.651(s，2H)，7.276(s，1H)，7.436-7.485(m，3H)，7.606-7.682(m，3H)，7.797(m，2H)，7.876-7.954(m，5H)，8.185(s，1H)；13C NMR(400MHz，CDCl3)δ：30.972，50.76，67.60，71.79，75.85，98.16，100.9，104.9，113.16，115.97，117.65，119.96，122.84，125.4，127.8，128.6，129.1，129.6，133.2，136.8，157.06，160.87，164.51，165.86；
熔点58-62℃。(图7)
化合物8的表征：
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：2.479(s，3H)，4.927(s，1H)，2.260-3.063(m，8H)，6.533-6.551(d，1H，J＝7.2Hz)，6.631-6.692(m，2H)，6.739-6.758(d，1H，J＝7.6Hz)，6.789-6.809(d，1H，J＝8Hz)，6.864(m，3H)，7.092-7.183(m，1H)，7.281-7.297(m，1H)，7.537-7.552(d，1H，J＝6Hz)；13C NMR(400MHz，CDCl3)δ：20.92，51.16，51.42，73.44，116.07，116.96，117.14，118.716，119.27，119.83，124.965，125.24，126.445，127.12，127.545，128.266，128.729，129.260，130.869，134.072，138.171，150.600，156.443
熔点108-112℃。(图8)
化合物9(NPB)的表征：
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：1.183-1.647(m，8H)，2.019-3.067(m，8H)，4.509(s，1H)，4.312-4.327(m，1H，NH)，5.965(s，1H)，6.668(m，1H)，6.801-6.896(m，3H)，7.073-7.190(m，3H)，7.305(m，1H)，7.527-7.542(m，2H)，7.770(s，1H)；13C NMR(400MHz，CDCl3)δ：23.78，33.18，51.22，51.78，76.10，117.14，118.59，119.67，124.69，124.98，126.22，127.53，128.85，129.29，131.08，134.08，135.53，140.28，150.5，156.1，166.73；m/z(M+2，526.2，527.2)
熔点174-178℃。(图9)
化合物10的表征：
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：1.183-3.074(m，8H)，4.361(s，1H)，5.034(s，2H)，6.658-6.694(t，1H，J＝7，2Hz)，6.768(m，1H)，6.856-6.873(m，3H)，7.023(m，1H)，7.055-7.094(m，3H)，7.164(m，1H)，7.231(m，1H)，7.266(m，1H)，7.304(m，1H)，7.322-7.355(m，2H)；13C NMR(400MHz，CDCl3)δ：51.264，71.260，75.434，117.15，118.6，119.6，124.8，124.9，127.3，127.5，128.1，128.6，128.8，129.18，150.5，156.09；
熔点75-80℃。(图10)
实施例2
式I化合物降低一系列癌细胞的细胞生存力
致癌性测定
我们最初使用
Figure BDA0002238817980000361
细胞生存力测定研究了新合成的小分子化合物对MCF7细胞(ER+MC细胞)的作用。在一系列新小分子化合物中，NPB被确定为有效的小分子化合物，与载剂(DMSO)处理的细胞相比，其降低MCF7细胞的生存力。在这些化合物中，化合物9N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(2-羟基苯基)甲基)苯甲酰胺(NPB)被确定为最强效的抗增殖化合物，IC50为6.5μM。我们接下来测定了NPB在广泛多种癌细胞系中的抑制浓度50％(IC50)，所述细胞系包括来自以下的那些：ER-乳腺癌(BT549、MDA-MB-231)、ER+乳腺癌(MCF7、T47D和BT474)、子宫内膜癌(Ishikawa、ECC-1、RL95-2和AN3)、卵巢癌(SK-OV-3、OVCAR-2、Caov-3、HEY C2和OVCA433)、肝细胞癌(Hep3B、H2P和H2M)、结肠癌(HCT116、DLD-1和Caco-2)、前列腺癌(PC3、LNCaP和DU145)和胰腺癌(AsPC-1、BxPC-3)。作为正常细胞对照，我们还在细胞系组中包括永生化乳腺上皮细胞(MCF10A和MCF12A)和永生化肝细胞(LO2)。图11中列出了癌细胞系中NPB的IC50值。
实施例3
NPB在一系列癌细胞系中诱导凋亡性细胞死亡
此外，根据制造商的说明书，使用Promega(Singapore)的ApoTox-GloTM三重测定试剂盒针对多种癌症来源的细胞系评价了NPB，以确定其对全细胞生存力、凋亡和细胞毒性的影响(图12)。简单地说，将细胞接种在黑色不透光的96孔板(
Figure BDA0002238817980000371
Singapore)中。在细胞孵育过夜之后，将培养基更换为指示的NPB浓度。在孵育约48小时之后，按照供应商的建议将包含GF-AFC底物和bis-AAF-R110底物二者的生存力/细胞毒性试剂添加至细胞。在约37℃下孵育约45分钟后，使用Tecan荧光微孔板读取仪(Tecan，Singapore)在用于生存力的400nm激发/505nm发射和用于细胞毒性的485nm激发/520nm发射下记录荧光。将Caspase-Glo 3/7试剂进一步添加至细胞并且在室温下孵育约25分钟之后，使用Tecan微孔板读取仪记录发光。一式三份测量活的、细胞毒性和凋亡细胞的数量。
膜联蛋白V和碘化丙啶(膜联蛋白V-PI)凋亡测定
使用膜联蛋-V-FLUOS染色试剂盒(Life Technologies，Singapore)和Pl染色的细胞，通过FACS分析评估磷脂酰丝氨酸暴露和细胞死亡。简单地说，将1×105个MCF细胞/孔(190μL/VβI)接种在6孔板中并用不同浓度的NPB孵育约24小时，并使用经DMSO处理的样品作为对照。然后用膜联蛋白V结合缓冲液(10mM HEPES/NaOH，pH7.4，140mM NaCl，2.5mMCaCl2)洗涤细胞，在室温下在黑暗中用膜联蛋白V FITC染色约30分钟，然后再次洗涤并重悬在含有PI的膜联蛋白V结合缓冲液中。立即用BD FACSAria细胞分选仪(BD Biosciences，San Jose，CA)分析样品。
膜完整性的丧失和磷脂酰丝氨酸向质膜外小叶的移位是凋亡的早期事件，其可使用FITC缀合的膜联蛋白-V和碘化丙啶染色进行检测。使用FITC-膜联蛋白V和碘化丙啶观察到NPB诱导MCF7细胞的凋亡。用NPB处理后，观察到早期(PI阴性，FITC-膜联蛋白V阳性)和晚期凋亡细胞(PI阳性，FITC-膜联蛋白V阳性)二者以剂量依赖性方式增多，如图13A中所示。
实施例4
NPB与重组BAD蛋白的分子相互作用
为了提供最有希望的候选物NPB与BAD的结合亲和力的分子相互作用，我们使用NPB作为分析物对固定化BAD亚基进行了表面等离子体共振(SPR)测量。我们知道BAD可在体外与BAD亚基结合。因此，我们使用BIAcore系统分析了相互作用。将重组BAD固定在CM5传感器芯片上。为了确定缔合和解离曲线，将多种浓度的NPB分别进样到包被有BAD的传感器芯片表面。共同分析图14中所示的叠加传感图。示出了BAD与NPB的直接结合(图14A)。NPB与BAD相互作用的动力学参数的计算揭示了结合亲和力的(1.4±.4)×103M-1S-1的缔合速率常数和(5.4±0.38)×103S-1的解离速率常数，其产生了37.12μM的解离平衡常数(Kd)。这些动力学参数显示了对BAD与NPB结构相互作用的亲和力支持。
表面等离子体共振分析
使用BIAcore-2000系统(BIAcore AB，Uppsala，Sweden)基于表面等离振子共振分析了分子相互作用。如制造商方案所述，将人重组BAD蛋白(目录号MBS143012，MyBiosource，USA)固定在传感器芯片上。为了检查BAD与NPB的相互作用，根据制造商的说明将运行缓冲液(HBS-EP，pH 7.4，BIAcore AB)中多种浓度的NPB(20至100μM)以15μl/min的流量进样到BAD固定化传感器芯片表面上。使NPB与BAD亚基相互作用2分钟以分别用于缔合和解离，此后，在下一次进样之前通过进样1M NaCl持续2分钟来再生传感器芯片。使用BIA评价软件4.1(BIAcore AB)，使用具有传质(mass transfer)的1∶1结合模型测定动力学参数，例如缔合和解离速率常数(ka和kd)、解离平衡常数(Kd)。使用BIA评价软件使所获得的传感图叠加。
实施例5
NPB对BAD磷酸化的影响是Ser99(人)特异性的
hBAD在残基Ser-75(小鼠BAD丝氨酸残基112)和Ser-99(小鼠BAD丝氨酸残基136)的磷酸化对于调节BCL-2抗凋亡蛋白家族的活性至关重要[15]。hBAD在Ser-75或Ser99处的磷酸化(或小鼠bad中的相应残基)导致hBAD与BCL-xL或BCL-2异二聚化的能力丧失[15]。为了进一步验证所预测的靶标，我们首先通过western印迹分析来分析NPB对Ser99处hBAD磷酸化的影响。用NPB处理MCF7细胞产生hBAD Ser99磷酸化的剂量依赖性降低，而总hBAD蛋白没有无明显变化(图14B)。计算出的通过NPB抑制BAD Ser99磷酸化的EC50为0.41±0.21μM。
我们接下来在来源于7种不同癌症的25种癌细胞系中通过western印迹分析对NPB对Ser75和Ser99处hBAD磷酸化的影响进行分析。观察到在所有受试癌细胞系中，NPB极大抑制了Ser99位点处的BAD磷酸化。然而，在相同的细胞系中NPB没有表现出对于Ser75位点处的BAD磷酸化的影响，表明NPB特异性抑制hBAD的Ser99处的磷酸化(图15)。
siRNA介导的BAD表达的耗尽逆转了癌细胞系中NPB的作用
为了确认NPB针对BAD蛋白的功能特异性，我们在6种癌细胞系(MCF7、BT474、Caov-3、Ishikawa、AsPC-1和DLD-1)中在siRNA介导的BAD表达耗尽之后进一步检查了NPB暴露的影响。如通过western印迹分析所观察到的(图16A)，与其对照细胞(用乱序寡核苷酸(scrambled oligo)转染)相比，用针对BAD转录物的siRNA瞬时转染不同的癌细胞降低了BAD表达，并且还降低了磷酸化-Ser99 BAD的水平。如先前报道的，在siRNA介导的BAD耗尽后，细胞生存力或凋亡均没有显著改变[26]。如上所述，与经载剂处理的细胞相比，对照转染癌细胞系的NPB处理降低了BAD磷酸化(Ser99)。同时，与载剂暴露的细胞相比，将相同癌细胞系暴露于NPB降低了细胞生存力并提高了胱天蛋白酶3/7活性。相反，在BAD表达耗尽的癌细胞系中，NPB不影响细胞生存力或胱天蛋白酶3/7活性(图16B和C)。
实施例6
在癌细胞系中NPB以不依赖于AKT信号转导的方式抑制BAD磷酸化
上游AKT Ser/Thr激酶调节hBAD在Ser99处的磷酸化[13]。因此，我们使用western印迹分析确定了NPB是否通过调节AKT的活性(如Ser473的磷酸化所指示)来抑制hBAD(Ser99)的磷酸化。在使四种不同的癌细胞系(MCF7、Caov-3、Ishikawa和AsPC-1)暴露于10μM NPB之后，我们未观察到pAKT水平或总AKT蛋白水平的变化。但是，所有经NPB处理的癌细胞系(MCF7、Caov-3、Ishikawa和AsPC-1)在Ser99位点显示出BAD磷酸化的抑制，并且总BAD蛋白的水平没有变化(图15B)。另外，作为阳性对照，我们在不同癌细胞系中在使用靶向AKT的两种独立的shRNA耗尽AKT或者用AKT抑制剂IV抑制AKT活性之后检查了BAD磷酸化。我们观察到，与对照细胞相比，癌细胞系中AKT表达耗尽与pAKT(Ser474)和pBAD(Ser99)水平的同时降低相关；表明在所有受试癌症来源的细胞系中，BAD Ser99的磷酸化是AKT依赖性的，并且如其他人先前公开的[13，15，27-29]。因此，NPB特异性抑制Ser99处的BAD磷酸化，而不会影响上游激酶(AKT)的活性[29]。这些结果与计算机靶标预测和通过SPR观察到的NPB与BAD的结合一致。因此，NPB以不依赖于上游(AKT)激酶的方式特异性抑制Ser99处的BAD磷酸化。
实施例7：
在颈背处向5至6周龄的BALB/c-nu雌性小鼠皮下植入0.72mg/粒且具有60天释放的17β-雌二醇颗粒(Innovative Research ofAmerica)，三天后，在右胁向小鼠皮下注射100μl细胞悬液(1×107个细胞)。通过使用卡尺测量肿瘤大小对肿瘤的生长进行监测。植入后约12天，将小鼠随机分为三组(每组n＝8)，根据处理通过每天腹膜内注射持续七天施用200μl NPB(溶解在5％DMSO，50％PEG400和45％水pH 5.0中)。第一组小鼠用载剂处理，第二组用5mg/kg的NPB剂量处理，且第三组用20mg/kg的NPB剂量处理。每天测量动物体重和肿瘤体积。完成后，将肿瘤切除、照相、称重、固定或保存在液氮中用于以后分析。如先前所述进行组织学分析(30-32)。
我们检查了MC的异种移植(MCF7)中NPB的体内效力。向具有预先形成的肿瘤(体积约150cm3)的随机分组的小鼠腹膜内注射载剂或者5mg/kg或20mg/kg的NPB。与用载剂处理的小鼠相比，在用NPB处理的小鼠中观察到肿瘤体积显著降低(图17A)。在此期间，各组之间的动物体重没有显著差异(图17A，下)。然而，与载剂处理的小鼠相比，经NPB处理的动物的肿瘤重量降低并且呈剂量依赖性(图17B)。我们使用WB分析进一步分析了NPB对肿瘤组织中hBAD Ser99磷酸化水平的影响(图17C)。与对照试样相比，NPB处理显著抑制了肿瘤中BAD的磷酸化(在Ser99处)。在经NPB处理与对照处理的肿瘤之间，未观察到BAD蛋白总水平的变化。
与经载剂处理的肿瘤相比，从用NPB处理的动物切除的肿瘤试样的组织学分析显示出显著降低的p-BAD(Ser99)(图17D)，而各组之间的BAD蛋白没有显著差异。与经载剂处理相比，用NPB处理的动物表现出肿瘤中的Ki67阳性细胞的百分比显著降低，并且TUNEL阳性显著提高(图17D)。
实施例8：
为了阐明NPB通过调节激酶活性降低hBAD Ser99磷酸化的可能性，我们使用来自R&D Systems的人磷酸化-激酶抗体阵列试剂盒评估了NPB对多种激酶的影响。尽管NPB抑制了相同提取物中的hBAD Ser99磷酸化，但与DMSO暴露的细胞相比，在暴露于NPB的MCF7细胞中未观察到激酶活性或磷酸化底物的显著变化(图18)。
实施例9：
我们还根据要求保护的化学模板产生了NPB的其他类似物(图19、20、21)，并且其可表现出比NPB更好的药代动力学谱。其结构和由IC50确定体外效力如图22中所示。
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Claims (21)

1.通式(I)化合物或者其可药用盐、溶剂合物或水合物或者其氘化或氚化变体，包括所有立体异构体：
其中：
每个R1独立地为卤素、OH、氰基、硝基、NR10R11、C(O)R10、C(O)OR10、C(O)NR10R11、-S(O)qNR10R11、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、-O(C1-6烷基)、-O(C1-6卤代烷基)、芳基、杂芳基、-O-芳基或-O-杂芳基，
其中
R10和R11各自独立地选自H或C1-6烷基，所述C1-6烷基任选地被选自OH、卤素、氰基、NH2、芳基或杂芳基的一个或更多个取代基取代；
烷基和卤代烷基R1任选地被选自以下的一个或更多个取代基取代：OH、氰基、-S(O)PNR4R5、-C(O)NR4R5、芳基、杂芳基、-O-芳基或-O-杂芳基、任选地被芳基取代的-O(C1-6烷基)、或-O(C1-6卤代烷基)；
芳基或杂芳基R1任选地被选自以下的一个或更多个取代基取代：卤素、OH、氰基、硝基、-NR4R5、-S(O)PNR4R5、-C(O)NR4R5、-C(O)R4、-C(O)OR4或者-C1-6烷基或-O(C1-6烷基)，其任一个任选地被选自OH、卤素、芳基、杂芳基、-O(C1-6烷基)、O(C1-6卤代烷基)、-O-芳基或-O-杂芳基)的一个或更多个取代基取代；
p为1或2；
R4和R5各自独立地选自H或C1-4烷基，或者R4和R5与它们所连接的氮原子一起可形成3或8元杂环环，所述杂环环任选地包含选自O、N和S的一个或更多个另外的杂原子；
n为0、1、2、3、4或5；
R2a和R2b各自独立地为C1-6烷基，所述C1-6烷基任选地被选自卤素、OH、芳基或杂芳基的一个或更多个取代基取代；或者
R2a和R2b与它们所连接的氮原子一起形成5或6元杂环环，所述杂环环任选地包含选自O、N或S的一个或更多个另外的杂原子，并且任选地被一个或更多个取代基R6取代；
每个R6独立地选自芳基、杂芳基、-O-芳基、-O-杂芳基、碳环基、杂环基、-O-碳环基，-O-杂环基、R12、OR12、C(O)R12、C(O)OR11、C(O)NR11R12、CN、OH，
R11和R12各自独立地为H或C1-4烷基，其任一个可被一个或更多个芳基或杂芳基取代，其中芳基和杂芳基被选自以下的一个或更多个取代基取代：卤素、OH、氰基、硝基、-NR4R5、-S(O)PNR4R5、-C(O)NR4R5、-C(O)R4、-C(O)OR4或者-C1-6烷基或-O(C1-6烷基)，其任一个任选地被选自OH、卤素、芳基、杂芳基、-O(C1-6烷基)、O(C1-6卤代烷基)、-O-芳基或-O-杂芳基)的一个或更多个取代基取代；
其中R4和R5如上所限定；或者R11和R12可与它们所连接的氮原子组合以形成3至8元杂环环，所述杂环环任选地包含选自O、N和S的一个或更多个另外的杂原子并且任选地被C1-4烷基、C1-4卤代烷基或卤素取代；
R3为芳基、杂芳基、碳环基或杂环基，其任一个任选地被一个或更多个取代基R7取代，所述R7选自卤素、任选地被芳基取代的-C1-4烷基、任选地被芳基取代的-O(C1-4烷基)、-C1-4卤代烷基、-O(C1-4卤代烷基)或-C(O)NR8R9；
R8和R9各自独立地选自H、C1-4烷基或C3-6环烷基，或者R8和R9与它们所连接的氮原子一起可形成5或6元杂环环，所述杂环环任选地包含选自O、N和S的一个或更多个另外的杂原子。
2.通式(IA)化合物或者其可药用盐、溶剂合物或水合物或者其氘化或氚化变体，包括所有立体异构体：
Figure FDA0002238817970000031
其中：
每个R1独立地为卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、芳基或杂芳基，其中芳基或杂芳基任选地被选自以下的一个或更多个取代基取代：卤素、OH、氰基、硝基、-S(O)PNR4R5、-C(O)NR4R5、任选地被芳基取代的-C1-6烷基、-C1-6卤代烷基、任选地被芳基取代的-O(C1-6烷基)、或-O(C1-6卤代烷基)；
p为0、1或2；
R4和R5各自独立地选自H或C1-4烷基，或者R4和R5与它们所连接的氮原子一起可形成5或6元杂环环，所述杂环环任选地包含选自O、N和S的一个或更多个另外的杂原子；
m为0、1、2、3或4；
R2a和R2b各自独立地为C1-6烷基，所述C1-6烷基任选地被选自卤素、OH、芳基或杂芳基的一个或更多个取代基取代；或者
R2a和R2b与它们所连接的氮原子一起形成5或6元杂环环，所述杂环环任选地包含选自O、N或S的一个或更多个另外的杂原子，并且任选地被一个或更多个取代基R6取代；
每个R6独立地选自芳基、杂芳基、-O-芳基、-O-杂芳基或者被一个或更多个芳基或杂芳基取代的C1-4烷基，其中芳基和杂芳基被选自卤素、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、-O(C1-4烷基)或-O(C1-4卤代烷基)的一个或更多个取代基取代；
R3为芳基、杂芳基、碳环基或杂环基，其任一个任选地被一个或更多个取代基R7取代，所述R7选自卤素、任选地被芳基取代的-C1-4烷基、任选地被芳基取代的-O(C1-4烷基)、-C1-4卤代烷基、-O(C1-4卤代烷基)或-C(O)NR8R9；
R8和R9各自独立地选自H、C1-4烷基或C3-6环烷基，或者R8和R9与它们所连接的氮原子一起可形成5或6元杂环环，所述杂环环任选地包含选自O、N和S的一个或更多个另外的杂原子。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中n为1或2，并且至少一个R1基团为OH；或者根据权利要求2所述的化合物，其中m为0或1。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的化合物，其中m不为0，并且R1为卤素或如权利要求2中所限定任选被取代的芳基或杂芳基。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中R1是任选地被以下取代的芳基或杂芳基：卤素、OH、氰基、硝基、-SO2NH2、-C(O)NR4R5、任选地被芳基取代的-C1-4烷基、-C1-4卤代烷基、任选地被芳基取代的-O(C1-4烷基)、或-O(C1-4卤代烷基)，其中R4和R5与它们所连接的氮原子一起形成哌啶或吡咯烷环。
6.根据权利要求5所述的化合物，其中R1是任选地被以下取代的芳基或杂芳基：氯、氟、甲基、乙基、三氟甲基、苄基、甲氧基、乙氧基、苄氧基、三氟甲氧基和哌啶-1-羰基。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中R2a和R2b与它们所连接的氮原子一起形成任选地被一个或更多个取代基R6取代的6元杂环环。
8.根据权利要求7所述的化合物，其中R2a和R2b与它们所连接的氮原子一起形成被单个R6取代基在哌嗪4-位取代的哌嗪环，使得通式(I)化合物为通式(IB)化合物：
Figure FDA0002238817970000041
其中R1、n、R3和R6如权利要求2中所限定。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的化合物，其中R6为苯基、杂芳基、-O-苯基、-O-杂芳基、苄基、-CH(苯基)2、-CH2-杂芳基和-CH(杂芳基)2，其中所述杂芳基选自吡啶基、吲哚基、异吲哚基、苯并
Figure FDA0002238817970000053
唑基和苯并异
Figure FDA0002238817970000054
唑基，并且上述R6基团中的任一个可如权利要求1中所限定进行取代。
10.根据权利要求1至9中任一项的化合物，其中R3为任选地被一个或更多个取代基R7取代的苯基，使得通式(I)化合物为通式(IC)化合物：
Figure FDA0002238817970000051
其中R1、n、R2a、R2b和R7如对于通式(I)所限定，并且z为0至5。
11.根据权利要求10所述的化合物，其中z为0、1或2，R7不存在(即，z为0)，或者R7为卤素、-C1-4烷基、苄基、-O(C1-4烷基)苄氧基、-C1-4卤代烷基、-O(C1-4卤代烷基)或-C(O)NR8R9，其中R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成哌啶基环或其中R8是H并且R9是C3-7环烷基。
12.根据权利要求1至10中任一项的化合物，其为通式(ID)化合物：
其中R1、n、R6、R7和z如上所限定。
13.根据权利要求1所述的化合物，其选自：
2-((2-氯苯基)(4-(4-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯酚(化合物1)；
2-((4-氯苯基)(4-(4-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯酚(化合物2)；
2-((4-(苄氧基)-3-氟苯基)(4-(4-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯酚(化合物3)；
(4-((2-羟基苯基)(4-(4-甲氧基苯基)哌嗪基)甲基)苯基)(哌啶-1-基)甲酮(化合物4)；
3-((5-氯-2-羟基苯基)(4-(4-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)甲基)-N-环戊基苯甲酰胺(化合物5)；
2-((4-(苄氧基)-3-氟苯基)(4-(4-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)甲基)-4-氯苯酚(化合物6)；
2-((4-(苄氧基)-3-氟苯基)(4-(6-氟苯并[d]异
Figure FDA0002238817970000061
唑-3-基)哌啶-1-基)甲基)苯酚(化合物7)；
2-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(邻甲苯基)甲基)苯酚(化合物8)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(2-羟基苯基)甲基)苯甲酰胺(化合物9，NPB)；
2-((4-(苄氧基)-3-氟苯基)(4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯酚(化合物10)；
2-((4-((4-氯苯基)(苯基)甲基)哌嗪-1-基)(苯基)甲基)苯酚(化合物11)；
2-((4-((4-氯苯基)(苯基)甲基)哌嗪-1-基)(对甲苯基)甲基)苯酚(化合物12)；
2-((4-氯苯基)(4-((4-氯苯基)(苯基)甲基)哌嗪-1-基)甲基)苯酚(化合物13)；
2-((4-((4-氯苯基)(苯基)甲基)哌嗪-1-基)(4-乙基苯基)甲基)苯酚(化合物14)；
(4-((4-((4-氯苯基)(苯基)甲基)哌嗪-1-基)(2-羟基苯基)甲基)苯基)(哌啶-1-基)甲酮(化合物15)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物16)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-羟基-2′-甲基-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物17)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-羟基-3′-甲基-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物18)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-羟基-4′-甲基-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物19)；
3-((2′-氯-4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)(4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)-N-环戊基苯甲酰胺(化合物20)；
3-((3′-氯-4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)(4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)-N-环戊基苯甲酰胺(化合物21)；
3-((4′-氯-4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)(4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)-N-环戊基苯甲酰胺(化合物22)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4′-乙基-4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物23)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-羟基-4′-(哌啶-1-羰基)-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物24)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-羟基-4′-甲氧基-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物25)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(2′-乙基-4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物26)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(2′-氟-4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物27)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(3′-氟-4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物28)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4′-氟-4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物29)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-羟基-3′-硝基-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物30)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-羟基-3′-氨磺酰基-[1，1′-联苯-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物31)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-羟基-2′-(三氟甲基)-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物32)；
N-环戊基-3-(((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-羟基-3′-(三氟甲基)-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物33)；
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-羟基-4′-(三氟甲基)-[1，1′-联苯]-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物34)；
3-((2′-氰基-4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)(4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)-N-环戊基苯甲酰胺(化合物35)；
3-((3′-氰基-4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)(4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)-N-环戊基苯甲酰胺(化合物36)
3-((4′-氰基-4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)(4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)-N-环戊基苯甲酰胺(化合物37)；
3-((2′-氯-4-羟基-4′-(三氟甲基)-[1，1′-联苯]-3-基)(4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)-N-环戊基苯甲酰胺(化合物38)；
N-环戊基-3-((2′，4′-二氯-4-羟基-[1，1′-联苯]-3-基)(4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯甲酰胺(化合物39)；
3-(((4′-氯-2′，4-二羟基-[1，1′-联苯]-3-基)(4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)-N-环戊基苯甲酰胺(化合物40)；
3-((4-(4-氯苯基)哌嗪-1-基)(2-羟基苯基)甲基)-N-环戊基苯甲酰胺(化合物41，NCK1)
2-((4-氯苯基)(4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯酚(化合物42，NCK2)
2-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(3-甲氧基苯基)甲基)苯酚(化合物43，NCK3)
1-(5-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(2-羟基苯基)甲基)噻吩-2-基)乙酮(化合物44，NCK4)
2-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(萘-1-基)甲基)苯酚(化合物45，NCK5)
5-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(2-羟基苯基)甲基)呋喃-2-甲醛(化合物46，NCK6)
2-((4-(5，6-二氯环己-1，5-二烯-1-基)哌嗪-1-基)(2-氟-3-甲基吡啶-4-基)甲基)苯酚(化合物47，NCK7)
2-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-(三氟甲基)苯基)甲基)苯酚(化合物48，NCK8)
2-((6-氯-5-甲基吡啶-3-基)(4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯酚(化合物49，NCK9)
2-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(吡啶-3-基)甲基)苯酚(化合物50，NCK10)
1-(5-((4-(4-氯苯基)哌嗪-1-基)(2-羟基苯基)甲基)噻吩-2-基)乙酮(化合物51，NCK14)
3-((4-(4-氯苯基)哌嗪-1-基)(4-(二乙氨基)-2-羟基苯基)甲基)-N-环戊基苯甲酰胺(化合物52，NCK16)
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(4-(二乙氨基)-2-羟基苯基)甲基)苯甲酰胺(化合物53，NCK18)
N-环戊基-3-((4-(2，3-二氯苯基)哌嗪-1-基)(2-羟基-4，6-二甲氧基苯基)甲基)苯甲酰胺(化合物54，NCK1 9)
2-((4-氯苯基)(4-(4-氯苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯酚(化合物55，NCK20)
2-((4-(4-氯苯基)哌嗪-1-基)(6-甲基吡啶-3-基)甲基)苯酚(化合物56，NCK21)
2-(邻甲苯基(4-(对甲苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯酚(化合物57，SG1)
2-((4-(对甲苯基)哌嗪-1-基)(4-(三氟甲基)苯基)甲基)苯酚(化合物58，SG2)
N-环戊基-4-((2-羟基苯基)(4-(对甲苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯甲酰胺(化合物59，SG3)
2-((4-氯苯基)(4-(对甲苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯酚(化合物60，SG4)
2-((3-甲氧基苯基)(4-(对甲苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯酚(化合物61，SG5)
5-((2-羟基苯基)(4-(对甲苯基)哌嗪-1-基)甲基)呋喃-2-甲醛(化合物62，SG6)
2-((6-甲基吡啶-3-基)(4-(对甲苯基)哌嗪-1-基)甲基)苯酚(化合物63，SG7)；
或者其可药用盐、溶剂合物或水合物或者其氘化或氚化变体，包括所有立体异构体。
14.用于制备根据权利要求1至13中任一项所述化合物的方法，所述方法包括：
在钯催化剂的存在下通过铃木偶联反应：
i.使通式(II)的醛与通式(III)化合物和通式(IV)的硼酸反应：
Figure FDA0002238817970000101
其中R1和n如权利要求1中所限定；
Figure FDA0002238817970000102
其中R2a和R2b如权利要求1中所限定；
Figure FDA0002238817970000103
其中R3如权利要求1中所限定；或者
ii.使其中R1为卤素的通式(I)化合物与通式(V)化合物反应：
Figure FDA0002238817970000104
其中R1a为任选地如权利要求1中对于R1所限定的进行取代的芳基或杂芳基；
以获得其中R1为R1a的通式(I)化合物。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的化合物，其用于药物。
16.根据权利要求1至13中任一项所述的化合物，其用于治疗癌症。
17.根据权利要求1至13中任一项的化合物在制备用于治疗癌症的药剂中的用途。
18.用于治疗癌症的方法，所述方法包括向有此治疗需要的患者施用有效量的根据权利要求1至13中任一项所述的化合物。
19.根据权利要求16至18中任一项所述应用的化合物、用途或方法，其中所述癌症是其中存在BAD磷酸化的癌症，例如其中BAD被磷酸化的乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肝癌、结肠癌、前列腺癌或胰腺癌、或任何其他上皮来源的癌症。
20.药物组合物，其包含根据权利要求1至13中任一项所述的化合物和可药用赋形剂。
21.根据权利要求20所述的药物组合物，其被配制成用于腹膜内施用、经肝门静脉施用、静脉内施用、关节内施用、经胰十二指肠动脉施用或肌内施用，或其任意组合。
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