JP2016530228A

JP2016530228A - 乳癌細胞の増殖を阻害する酵素阻害剤、その製造方法およびその使用

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Publication number: JP2016530228A
Application number: JP2016522895A
Authority: JP
Inventors: ヒルゲロートアンドレアス
Original assignee: Martin Luther Universitaet Halle Wittenberg
Current assignee: Martin Luther Universitaet Halle Wittenberg
Priority date: 2013-06-26
Filing date: 2014-08-21
Publication date: 2016-09-29
Also published as: WO2014207573A3; EP3110421A2; WO2014207573A2; US20160235723A1; DE102013010603A1; WO2014207573A8; US9901570B2

Abstract

２．１乳癌は、疫学的データによれば女性における最も多い癌疾患である。特に攻撃的な乳癌疾患は、浸潤挙動および転移形成挙動によって特徴付けられる。そのような攻撃的な乳癌疾患の治療は極めて問題が多く、かつ特異的抗体の使用により非常に高コストであり、これは組織化学的検査で複数回陽性となってからようやく行われる。本発明の課題は、酵素の阻害を組み合わせることによって、攻撃的な乳癌細胞の増殖に対して相乗的にも相加的にも抗する新規の酵素阻害剤を開発することである。２．２本発明により開発されたピリド縮合インドールは、ヒトキノームの２００を上回るキナーゼのスクリーニングにおいてナノモルないしピコモル濃度範囲で酵素ＨＥＲ２および／またはＢｒｋを選択的に阻害する作用を示す。本発明により開発された酵素阻害剤はナノモル濃度範囲で乳癌細胞の増殖を阻害し、その際に重大な毒性作用を示さない。４−クロロ−α−カルボリンの６位での誘導体化に副生成物不含で成功し、かつこの誘導体化は、アニリン誘導体を用いた４位での誘導体化と同様に高純度でかつ定量的な収率で行われる。２．３本発明は、攻撃的な乳癌疾患を治療するための医療分野／腫瘍学における使用にも関する。

Description

乳癌は、疫学的データによれば女性における最も多い癌疾患である（以下、文献１参照）。特に攻撃的な乳癌疾患は、浸潤挙動および転移形成挙動によって特徴付けられる（以下、文献２参照）。そのような攻撃的な乳癌疾患の治療は極めて問題が多く、かつ特異的抗体の使用により非常に高コストであり、これは組織化学的検査で複数回陽性となってからようやく行われる（以下、文献３参照）。

腫瘍の攻撃的な特性の原因は、細胞膜結合型受容体の過剰発現にある（以下、文献４参照）。過剰発現の際のこの受容体の作用とは、制御不能な細胞増殖の刺激や、制御された細胞死、すなわちアポトーシスの阻害である（以下、文献５、６参照）。

制御不能な細胞増殖の結果、急速に腫瘍が増殖する。特にクリティカルであるのは、それと同時に攻撃的な腫瘍細胞のアポトーシスが阻止されることである（以下、文献２参照）。

そのような乳癌疾患の際の生存の予後は、非常に短い（以下、文献３参照）。抗体トラスツズマブによる治療は高コストであるばかりでなく、こうした治療は、突然変異により変質したトラスツズマブに受容体ＨＥＲ２が結合した場合には機能しなくなる。その場合、この受容体は構成的に活性であり、かつこの抗体により阻害されることができない（以下、文献３、４参照）。

新たな知見によれば、攻撃的な乳癌疾患においては第２の要因がもう１つの重要な役割を担っている。それは酵素Ｂｒｋであり、これは攻撃的な腫瘍細胞、例えばＨＥＲ２において過剰発現される（以下、文献２、４、７参照）。これに関して、ＨＥＲ２の活性はＢｒｋによりさらに増強される（以下、２、７参照）。従って、Ｂｒｋは腫瘍細胞のＢｒｋの制御不能な増殖を増強するばかりでなく、そのアポトーシスをも阻害する（以下、文献２、８−１１参照）。転移形成が増強されることによって、腫瘍細胞の攻撃性はＢｒｋによりさらに高められる（以下、文献２参照）。これは、腫瘍細胞が腫瘍細胞集合体からのその剥離後に死滅せずに固有の腫瘍細胞集合体を形成することの結果である（以下、文献２参照）。

そのような攻撃的な乳癌疾患の唯一可能な治療法は、阻害剤を用いてのみ実現可能である。しかしながらこれまで、関連するＨＥＲ２阻害剤であるラパチニブは、疾患の限られた部分でしか効果を示していない（以下、文献４参照）。これまでに実施された阻害剤治療の断念は腫瘍細胞の抵抗性が原因であり、これは特にＨＥＲ２の変異により生じるものである。ＢｒｋおよびＨＥＲ２に対する阻害剤は、これまでに知られていない。

本発明の課題は、酵素の阻害を組み合わせることによって、攻撃的な乳癌細胞の増殖に対して相乗的にも相加的にも抗する新規の酵素阻害剤を開発することである。阻害剤に対する既存の耐性はこの新規の阻害剤によって克服され、治療の過程に出現する耐性は活性成分により阻止されうる。

本発明により開発されたピリド縮合インドールは、ヒトキノームの２００を上回るキナーゼのスクリーニングにおいてナノモルないしピコモル濃度範囲で酵素ＨＥＲ２および／またはＢｒｋを選択的に阻害する作用を示す。デュアル阻害の場合、これまでは耐性腫瘍の実現可能な治療法は与えられていなかった。さらに、耐性の発生が阻止される。

本発明により開発された酵素阻害剤はナノモル濃度範囲で乳癌細胞の増殖を阻害し、その際に重大な毒性作用を示さない。本発明により開発された酵素阻害剤は、この点で、他の治療薬、すなわち治療中も細胞毒性作用を伴って多くの副作用を示しかつそれによって相容性の低い他の治療薬と相違する。

４−クロロ−α−カルボリンの６位での誘導体化に副生成物不含で成功し、かつこの誘導体化は、アニリン誘導体を用いた４位での誘導体化と同様に高純度でかつ定量的な収率で行われる。

実施例
４−クロロ−α−カルボリン１当量を、還流冷却器およびガス排出部を備えた二口フラスコ中に装入し、かつ氷浴で冷却した。次いで塩化スルホン酸１．５ｍＬを撹拌下にゆっくりと滴加した。添加の完了後、氷浴を除去し、かつこの混合物を、ＴＬＣにより出発物質が認められなくなるまで室温で撹拌した。その後、冷却下に余剰の塩化スルホン酸を加水分解した。沈殿した固体を濾別し、冷水で洗浄し、かつ乾燥させた。次いで、この固体をＴＨＦ２５ｍＬ中に再懸濁させ、かつ当該アミン２０当量を撹拌下に混合した。この混合物を、ＴＬＣにより出発物質が認められなくなるまで室温で撹拌し、その後、溶媒を減圧下に除去し、残留物を水と混合した。沈殿した残渣を濾別し、かつ乾燥させた。

アニリンを用いた誘導体化を、無水Ｎ−メチルピロリドン中の４−クロロ−α−カルボリンの６−誘導体１当量を用いて脱気下に行い、次いで、ＴＬＣにより出発物質が認められなくなるまで還流下に沸騰させた。冷却後、さらなる後処理を行わずに、カラムクロマトグラフィーにより分離を行った。合一した生成物フラクションを氷水に注ぎ、その後、沈殿した生成物を濾別し、かつ乾燥させた。

酵素ＢｒｋおよびＨＥＲの阻害を、放射性標識されたＡＴＰで富化されたＡＴＰおよび基質ポリ（Ｇｌｙ、Ｔｙｒ）４：１を用いて、ＨＥＰＥＳバッファー溶液中で阻害剤の様々な濃度を用いて行った。酵素の阻害率を、測定される基質のリン酸化によって、シンチレーション測定により決定する。この阻害率から酵素阻害のＩＣ５０を算出した。これは、メタ−クロロ置換アニリン誘導体に関して、Ｂｒｋの阻害については５ｎＭであり、かつＨＥＲ２の阻害については６６ｎＭであった。

乳癌細胞増殖阻害作用を、スルホローダミンＢアッセイで測定した。この目的のために、種々の乳癌細胞株を、５％ウシ胎児血清および２ｎＭのＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。３７℃、空中湿度１００％でかつＣＯ₂雰囲気（５％）下に２４時間培養した後に、マイクロタイタープレート中で阻害剤の様々な濃度でインキュベートした。その後、接着細胞を５０％トリクロロ酢酸で固定した。再度インキュベーションした後に上清を除き、この細胞を酢酸中のスルホローダミンＢ溶液で洗浄した。再度インキュベーションした後に、洗浄し、かつトリスバッファーの添加下に溶解したスルホローダミンＢ色素を分光測定した。未処置の細胞株と阻害剤処理された細胞株とを比較して、色素量の相違によって増殖阻害を調べた。メタ−メトキシ置換されたアニリン誘導体に関しては、全ての乳癌細胞株においてナノモルの阻害剤濃度で５０％の増殖阻害が達成された。

Claims

一般式

［式中、
置換基Ｘ、ＹはＣであるか、またはＸはＣであってＹはＮであるか、またはＸはＮであってＹはＣであり、
Ｚは、ＮＨであり、
基Ｒ¹は、Ｐｈ−３−または４−ＣＯＮＨ−Ｒ³または４−ハロゲンまたは４−ＯＢｎ、−ＣＮ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｆ（−ハロゲン）、−ＯＨ、−ＣＨ₃、−ＯＣＨ₃、−ＯＣ₂Ｈ₅、−ＯＢｎ（−Ｏアルキル）、−ＣＦ₃、−ＮＯ₂、−ＮＨ₂、−ＮＨＣＯ−アルキル、−ＳＣＨ₃；
Ｐｈ−３−および４−ＣＯＮＨ−Ｒ³または４−ハロゲンまたは４−ＯＢｎ、−ＣＮ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｆ（−ハロゲン）、−ＯＨ、−ＣＨ₃、−ＯＣＨ₃、−ＯＣ₂Ｈ₅（−Ｏアルキル）、−ＣＦ₃、−ＮＯ₂、−ＮＨ₂、−ＮＨＣＯ−アルキル、−ＳＣＨ₃であり、
基Ｒ²は、Ｂｒ（−ハロゲン）、ＮＯ₂、ＮＨ₂であり、
基Ｒ³は、Ｈ、Ｂｒ（ハロゲン）、ヘテロアリール、ＮＨ₂、ＮＨＲ⁴、ＮＯ₂、ＣＮ、ＣＯＯＲ⁴、ＮＨＳＯ₂Ｒ⁴、ＮＨＣＯＲ⁴、ＮＨＣＯＯＲ⁴、ＮＨＣＯＮＨＲ⁴、ＣＯアルキル、ＳＯ₂ＮＨＲ⁴、ＮＨＣＯＮＲ⁵Ｒ⁶、ＳＯ₂ＮＲ⁵Ｒ⁶であり、
基Ｒ⁴は、アルキル、アミノアルキル、ピペラジノアルキル、Ｎ−モルホリノアルキル、ヒドロキシアルキルであり、
基Ｒ⁵、Ｒ⁶は、アルキル；−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｔ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−であり、
Ｔは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ⁴である］
の官能性ピリド縮合インドールおよびピリドピロールからなる、乳癌細胞の増殖を阻害する酵素阻害剤。
請求項１に記載の乳癌細胞の増殖を阻害する酵素阻害剤の製造方法であって、置換基Ｘ、ＹがＣであり、かつＺがＮＨである前記酵素阻害剤を、副生成物不含で高純度で位置選択的かつ定量的に製造することを特徴とする、前記方法。
請求項１に記載の乳癌細胞の増殖を阻害する酵素阻害剤において、前記乳癌細胞の増殖を阻害する酵素阻害剤が、ＢｒｋおよびＥｒｂＢ２の阻害剤として攻撃的な乳癌において相乗的な阻害活性を示し、かつ阻害剤耐性乳癌において選択的腫瘍細胞アポトーシス活性を示す酵素阻害剤として使用することができる、前記酵素阻害剤。