KR20100084926A

KR20100084926A - 염증, 알러지 질환 또는 성인병의 예방 또는 치료용 산약 추출물

Info

Publication number: KR20100084926A
Application number: KR1020090004334A
Authority: KR
Inventors: 장현욱; 손건호; 박상조; 이종길; 박영인; 조태형; 신은주
Original assignee: 주식회사 유니베라; 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2009-01-19
Filing date: 2009-01-19
Publication date: 2010-07-28

Abstract

　　　　　　　　본 발명은 항염증, 항알러지 및 항성인병 활성을 가지는 산약 추출물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 산약 추출물, 또는 그로부터 분리된 바타타신 I 및/또는 펜안스라퀴논 유도체를 포함하는 염증성 질환, 알러지성 질환 또는 성인병의 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 상기 질환의 증상 개선용 기능성 식품에 관한 것이다.

산약, 염증성 질환, 알러지성 질환, 성인병

Description

　　　　　　　　염증, 알러지 질환 또는 성인병의 예방 또는 치료용 산약 추출물 {Extract of Dioscorea batatas for preventing or treating inflammatory, allergic or adult diseases}

　　　　　　　　본 발명은 염증, 알러지 질환 또는 성인병의 예방 또는 치료용 산약 (Dioscorea batatas) 추출물, 및 산약 추출물 또는 이로부터 분리한 바타타신-I (Batatasin-I, 6-hydroxy-2,4,7-trimethoxyphenanthrene) 및/또는 펜안스라퀴논 유도체 (6-hydroxy-2,7-dimethoxy-1,4-phenanthraquinone)를 유효성분으로 포함하는 염증, 알러지 질환 및 성인병의 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 이들 증상의 개선용 기능성 식품에 관한 것이다.

염증이란 신체 국소에 일어나는 상해에 대하여 생체조직의 방어반응이다. 즉, 각종의 유해한 자극(stressor)에 응답하여, 자극에 의한 상해를 제거하여 원래의 상태로 회복하려는 생체방어반응이 염증반응이다. 염증의 자극에는, 감염 혹은 화학적, 물리적 자극 등이 있다. 염증반응에 관련된 생체구성인자는 자유라디칼(free radical), 단백질, 당질, 지질 등의 저분자나 고분자의 화학물질과, 혈장, 혈구, 혈관 및 결합조직 등이 있다. 염증은 보통 급성 및 만성 염증으로 나눌 수 있다. 급성 염증은 수일 이내의 단기적인 반응이며, 혈장성분이나 혈구 등이 미소순환계를 게재하여 이물제거에 관련한다. 만성 염증은 지속시간이 길며, 조직의 증식 등이 보여진다.

알러지성 질환은 대부분이 항원-항체 반응에 의해 활성화된 조직의 비만세포 및 혈액의 호염기성 세포 및 호산구에서 유리되는 매개체들 (주로 histamine, leukotrienes,　 TNFα, cytokines 등)에 의해서 야기된다. 현재 사용되는 알러지 치료 약물들은 단지 증상완화 효과를 나타내는 수준에 머무르고 있기 때문에 보다 근본적인 치료 약물의 개발이 절실히 요구된다. 최근, 부신피질호르몬계통의 약물은 염증을 치료하기 위한 가장 일반적인 약물의 하나이다. 이러한 부신피질 호르몬계 약물은 스테로이드계 호르몬으로서, 오랜 기간 사용시 부작용을 나타낸다.

성인병이란 중년 이후에 문제되는 병을 통틀어 이르는 말로써, 동맥 경화, 고혈압, 악성 종양, 당뇨병, 심근 경색증, 심장 질환, 허혈성 뇌질환, 알쯔하이머 병, 폐기종, 뼈의 퇴행성 변화 등이 있다.

염증 및 알러지성 질환을 유도하는 주요 매개물질로 알려진 프로스타글란딘류 (prostaglandines), 류코트리엔류 (leukotriens), 혈소판활성화인자 (PAF) 등은 포스포리파제 A2 (phospholipase A2), 사이클로옥시게나제 (cyclooxygenase) 및 리폭시게나제 (lipoxygenase)에 의하여 전구체인 아라키돈산 (arachidonic acid)으로부터 생성된다.

프로스타글란딘류 (prostaglandines)는 특이한 세포표면 수용체와 결합하여 사이클릭 아데노신 모노포스페이트 (cyclic Adenosine MonoPhosphate, cAMP; 경우 에 따라서 사이클릭 구아노신 모노포스페이트, cGMP)의 세포내 농도를 증가시키는 작용을 한다. cAMP의 증가에 의한 효과는 세포 종류에 따라 다르며 프로스타글란딘 A₂ (Prostaglandin A₂, PGA₂), 프로스타글란딘 B₂ (Prostaglandin B₂, PGB₂), 프로스타글란딘 C₂ (Prostaglandin C₂, PGC₂)는 혈압을 강하시키고, 프로스타글란딘 D₂(Prostaglandin D₂, PGD₂), 프로스타글란딘 E₁ (Prostaglandin E₁, PGE₁)은 혈소판 응집을 억제하고 동통, 발열 등의 염증과정에 관여한다고 알려져 있다. 프로스타글란딘 D₂는 특히 기관지 천식환자의 평활근을 수축시켜 천식을 악화시키는 물질로 알려져 있으며, 따라서 프로스타글란딘 D₂의 생성을 저해시키는 경우, 천식에 대해 치료효과를 나타낼 수 있다. 뿐만 아니라 프로스타글란딘 D₂의 생성저해 효과는 대장암, 당뇨병, 알쯔하이머병에 대해 치료효과를 나타낼 수 있다 (Cyclooxygenase-2 inhibitors in colorectal cancer prevention: point. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2008 Aug, 17(8):1852-1857; Inhibitory effects of prostaglandin D2 against the proliferation of human colon cancer cell lines and hepatic metastasis from colorectal cancer. Surg Today. 1998, 28(7):740-5; Diabetes, colorectal cancer and cyclooxygenase 2 inhibition, Int J Clin Pract. 2008 May, 62(5):810-5, Epub 2008 Mar 25; Cyclooxygenase-2 pathway as a potential therapeutic target in diabetic peripheral neuropathy. Curr Drug Targets. 2008 Jan, 9(1):68-76. Review; Role of COX-2 in inflammatory and degenerative brain diseases, Subcell Biochem. 2007, 42:127-41. Review; Inhibitor of cyclooxygenase-2 protects against amyloid beta peptide-evoked memory impairment in mice. Pharmacol Rep. 2007 Mar-Apr, 59(2):164-72).

류코트리엔은 아라키돈산 (arachidonic acid)으로부터 생체에서 생성되는 국소 작용성 호르몬 그룹을 구성하며, 중요한 류코트리엔으로는 류코트리엔 B₄(LTB₄), 류코트리엔 C₄(LTC₄), 류코트리엔 D₄(LTD₄) 및 류코트리엔 E₄(LTE₄)가 있다. 이들 류코트리엔의 생합성은 효소 5-리폭시게나제가 아라키돈산에 대하여 작용하여 류코트리엔 A₄로서 알려진 에폭시드 (epoxide)를 생성시킴으로써 시작되며, 이것은 연속적인 효소 반응 단계에 의해 다른 류코트리엔 (LTB₄, LTC₄, LTD₄, LTE₄)으로 전환된다. 류코트리엔은 폐동맥질환, 예를 들면, 천식, 만성 기관지염, 폐쇄성 기도 질환, 상기도염, 부비강염, 알러지성 비염, 접촉성 피부염, 알러지성 결막염 등의 알러지 및 알러지 반응, 관절염 또는 염증성 장 질환, 통증 등의 염증성 질환, 뿐만 아니라 급성 간질환, 동맥경화증, 허혈성 뇌질환, 심장질환 등과 같은 성인병과 관련되어 있는 것으로 알려져 있다 (Advances in upper airway diseases and allergen immunotherapy; J Allergy Clin Immunol. 2006 May;117(5):1047-53. Epub 2006 Mar 6. Review; Targeting cysteinyl leukotrienes in patients with rhinitis, sinusitis and paranasal polyps. Am J Respir Med. 2002;1(6):403-8. Review; Enhanced expressions and activations of leukotriene C4 synthesis enzymes in D-galactosamine/lipopolysaccharide-induced rat fulminant hepatic failure model. World J Gastroenterol. 2008 May 7;14(17):2748-56; The 5-lipoxygenase pathway in arterial wall biology and atherosclerosis. Biochim Biophys Acta. 2005 Sep 5;1736(1):30-7. Review; Promotor polymorphisms in leukotriene C4 synthase and risk of ischemic cerebrovascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2008 May;28(5):990-6. Epub 2008 Feb 14; Leukotrienes: potential therapeutic targets in cardiovascular diseases] Bull Acad Natl Med. 2006 Oct;190(7):1511-8; discussion 1518-21. Review. French).

최근 특히 알러지성 천식 치료제로서 주목을 받고 있는 약물들은 히스타민 유리 억제, 류코트리엔 C₄ 생성억제, 혈소판 활성화인자 생성억제 활성을 동시에 가지는 약물들이다.

산약(山藥)은 마과에 속한 다년생 만생초본인 마 (Dioscorea batatas)의 괴경이다. 산약(마)의 끈적끈적한 물질인 뮤신(Mucin)은 당단백질(Glycoprotein)의 일종으로써, 글로불린(globulin) 단백질이 결합된 형태이며, 이러한 특유의 점성 당단백질은 옛부터 한방에서 정력을 높이는 자양강장제로 이용되었다.

산약은 전분 (15-20%) 단백질(1-1.5%), 비타민 C가 풍부가 풍부한 천연물이며, 동의치료에서 자양강장약으로 전신쇠약, 병후쇠약에 쓰였으며 지사제로도 사용 가능하고, 신장을 튼튼하게 하며 당뇨병에도 사용되고 있다.

산약에 포함된 성분으로는 뮤신 뿐만 아니라, 아밀로즈 (amylose), 콜린(cholin), 사포닌(saponin), 알란토인(allantoin), 아르기닌(arginine), 요노게 닌(yonogenin), 크립토게닌(kryptogenin) 및 디오게닌(diosgenin)이 있다.

산약의 효능으로는 산약에서 분리한 디오스코란 (Dioscorans) 유도체의 항 당뇨효과 (Hikino et al., Planta Medica 52, pp168-171, 1986); 산약에서 분리한 디오스코린 (Dioscorin)의 항산화효과 (Hou WC et al.,　 J. Agric. Food Chem. 49, pp4956-4960, 2001); 산약 추출물의 항콜린에스테라제 효과 (Oh MH et al., Phytomedicine, 11, pp544-548, 2004); 위궤양 치료 효과 (Jeon JR et al., Arch. Pharm. Res. 29, pp348-53, 2006); 산약에서 분리한 디오신 (Dioscin)의 성장호르몬 분비효과 (Lee HY et al., J. Biochem. Mol. Biol. 40, pp1016-1120, 2007) 등이 알려져 있다. 그러나, 상기 문헌 어디에도 산약 추출물이 염증, 알러지 및 천식 질환 등에 효과가 있다는 것에 대해서는 개시된 바가 없다.

본 발명자들은 종래의 항염증제, 항알러지제 또는 항성인병제보다 성능이 좋고, 독성이 적은 항염증, 항알러지, 또는 항성인병제의 개발을 위하여, 산약, 산약 알맹이 및 껍질 추출물, 산약 추출물로부터 분리된 바타타신-I 및 펜안스라퀴논 유도체가 시클로옥시게나제-2 의존적인 PGD₂ 생성, 5-리폭시게나제 의존적인 LTC₄생성을 억제하며, 비만세포에서 탈과립 반응을 억제하고, 항원-항체반응에 의해 유도되는 알러지 동물모델에서 알러지 억제 효능이 있음을 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 염증, 알러지 질환 또는 성인병의 예방 또는 치료용 산약(山藥) 추출물을 제공하는 것을 기술적 과제로 한다. 또한, 본 발명은 산약 추출물, 이로부터 분리된 바타타신 I 또는 펜안스라퀴논 유도체 또는 바타타신 I 및 펜안스라퀴논 유도체 양자 모두를 유효성분으로 포함하는 염증, 알러지 질환 또는 성인병의 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 상기 질환의 증상 개선용 기능성 식품을 제공하는 것을 또 다른 기술적 과제로 한다.

　　　　　　　　본 발명에 따르면, 염증, 알러지 질환 또는 성인병의 예방 또는 치료용 산약 추출물이 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 측면에 따르면, 산약 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증, 알러지 질환 또는 성인병의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 산약 추출물로부터 분리된 바타타신 I 또는 펜안스라퀴논 유도체, 또는 양자 모두를 유효성분으로 포함하는 염증, 알러지 질환 또는 성인병의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공되며, 바타타신 I (화학식 (1))및 펜안스라퀴논 유도체 (화학식 (2))는 하기와 같은 구조를 갖는다.

화학식 (1)

화학식 (2)

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 산약 추출물, 이로부터 분리된 바타타신 I 및/또는 펜안스라퀴논 유도체를 유효성분으로 포함하는 염증, 알러지 질환 또는 성인병의 증상 개선용 기능성 식품이 제공된다.

본 명세서에 기재된 "염증 질환"에는 바람직하게는 기관지 천식, 만성 기관지염, 폐쇄성 기도질환, 상기도염, 부비강염, 관절염, 류마티스 관절염, 염증성 장질환, 급성 간질환, 염증성 통증, 급성 통증, 만성 통증, 관절통 및 신경병적 통증이 포함되지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에 기재된 "알러지 질환"에는 바람직하게는 알러지성 천식, 알러지성 기관지염, 알러지성 비염, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 두드러기, 고초열, 알러지성 위염, 알러지성 설사, 알러지성 구내염, 알러지성 결막염 및 알러지성 각막염이 포함되지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에 기재된 "성인병"에는 바람직하게는 당뇨병, 동맥경화증, 고혈압, 허혈성 뇌질환, 알쯔하이머병, 심근경색, 심장 질환, 폐기종, 뼈의 퇴행성 변화, 대장암 및 악성 종양이 포함되지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어 "치료"란 본 명세서에서 언급한 질병에 걸린 환자에게 제약 조성물등을 투여하여 해당 질병을 치료하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "예방"이란 대상에게 제약 조성물과 같은 제제를 예방적으로 투여하여 본 명세서에서 언급한 질병 및 증상의 발병을 방지하는 것을 의미하며, 보다 구체적으로는 특히 염증 질환, 알러지 질환 또는 성인병의 전단계에 있는 대상에게 그러한 제제를 예방적으로 투여하는 것을 의미한다.

한편, 복수의 질병에 대한 병용 제제 또는 제약 조성물과 같은 조합 제제를 해당 질병의 일부를 앓고 있는 환자에게 투여하여 다른 질병 및 증상의 발병을 방지하는 것 또한 상기 예방의 범주에 포함된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "증상 개선"이란 본 명세서에서 언급한 질병에 따른 제증상을 경감시키기 위하여 그 대상이 식품 조성물등을 섭취하는 것을 의미한다.

　　 본 발명의 산약 추출물은 물, 메탄올, 에탄올 등과 같은 극성용매 및 이들의 혼합용매에 가용한 산약 추출물을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면 물, 극성용매 또는 이들의 혼합용매를 추출용매로 사용하여 산약으로부터 유효성분을 추출한 후 여과하거나, 경우에 따라 이를 농축하여 사용할 수 있다. 이때, 추출용매로는 물, C_1-4 저급 알코올 등을 사용할 수 있다. 상기 저급 알코올은 에탄올, 메탄올, 부탄올, 프로판올 및 이소프로판올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올을 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 바람직하게는 조성물 총 중량에 대하여 상기 산약 추출물을 0.1 내지 50 중량% 로 포함한다.

일반적으로 본 발명에 따른 항염증, 항알러지, 항성인병 조성물은 임상 투여시 경구 투여가 가능하며, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 경구용 조성물은 제약상 허용되는 담체, 희석제, 충진제, 가용화제 또는 유화제 및 당업계에 널리 공지된 염을 비롯한 불활성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 당업계에 널리 공지된 고형 담체를 사용하는 통상적인 방법에 따라 정제형태로 제형화 될 수 있고, 다르게는 젤라틴 또는 셀룰로즈 유도체와 같은 임의의 제약상 허용되는 물질을 사용해 캡슐제 형태로 제조할 수도 있다.

실제 사용에 있어서, 본 발명의 산약 추출물, 또는 그로부터 분리한 바타타신-I 및/또는 펜안스라퀴논 유도체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 통상적 인 제약 조제 기술에 따른 제약 담체와 조합될 수 있다. 담체는, 예를 들어 경구 또는 (정맥내 투여를 비롯한) 비경구 투여에 바람직한 제조에 따라 광범위하게 다양한 형태를 지닐 수 있다.

본 발명의 산약 추출물, 또는 그로부터 분리한 바타타신-I 및/또는 펜안스라퀴논 유도체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 염증 질환, 알러지 질환 또는 성인병의 치료에 유용하며, 이들 목적을 위해, 본 발명의 조합 제제는 통상적인 무독성의 제약상 허용되는 담체, 보조제 및 전달체(vehicle)를 포함하는 투여 단위 제형의 형태로 경구적으로, 또는 (피하 주사, 정맥 주사, 근육내 주사, 흉골내 주사 또는 주입 등) 비경구적으로, 또는 직장내로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 각각의 경구용 조성물은 제약상 허용되는 담체를 비롯한 불활성 성분을 추가로 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "제약상 허용된 담체"란 조성물, 구체적으로 의약 조성물의 활성 물질을 제외한 성분을 지칭하는 용어이다. 제약상 허용되는 담체의 예로는 결합제, 붕해제, 희석제, 충진제, 활택제, 가용화제 또는 유화제 및 염이 포함된다.

또한, 본 발명의 산약 추출물, 또는 그로부터 분리한 바타타신-I 및/또는 펜안스라퀴논 유도체를 식품에 첨가하여, 염증, 알러지 또는 성인병의 증상 개선용 기능성 식품을 제조할 수 있다. 이 경우, 기능성 식품이라 함은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 가능한 식품을 말하며, 상기 항염증, 항알러지 또는 항천식 유효성분을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 각종 드링크제, 차, 음료수, 비타민 복합제 등이 있 고, 유효 성분의 양은 그의 사용 목적 (예방, 증상 완화, 또는 치료보조적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 기능성 식품은 염증, 알러지 질환 또는 성인병의 증상 개선 목적으로 식품 총 중량에 대하여 산약 추출물을 0.01 내지 95 중량%, 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함할 수 있다. 본 발명의 기능성 식품의 제조에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 식품제조방법등 어느 것이라도 그대로 또는 적절히 변형하여 적용할 수 있다.

본 발명을 통하여 산약, 산약 알맹이 및 껍질 추출물, 또는 산약 추출물로부터 분리된 바타타신-I 및 펜안스라퀴논 유도체가 시클로옥시게나제-2의존적인 PGD₂ 생성, 5-리폭시게나제 의존적인 LTC₄의생성을 억제하며, 비만세포에서 탈과립 반응을 억제하고, 항원-항체반응에 의해 유도되는 알러지 동물모델에서 알러지를 억제하는 효능을 나타냄이 밝혀졌다. 따라서 염증 및 대장암, 당뇨병, 알쯔하이머병을 일으키는 PGD₂의 생성을 억제하고, 알러지 질환 및 천식 질환 뿐만 아니라 급성 간질환, 동맥경화, 허혈성 뇌질환, 심장질환을 일으키는 원인이 되는 LTC₄의 생성을 억제하며, 비만세포에서의 탈과립 반응 및 동물 알러지 모델에서 알러지를 억제함으로써, 염증 질환, 알러지 질환 또는 성인병을 예방 또는 치료하거나 그 증상을 개선하는 데에 효과적으로 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 자세히 설명한다. 그러나 본 발명의 실시예는 본 발명의 권리범위를 한정하는 것이 아니며, 본 발명의 권리범위는 청구범위에 의하여 정하여진다.

실시예 1. 산약 조추출물 제조

1-1. 전체 조추출물 제조예 1

산약 [마 (Dioscorea batatas) 의 덩이뿌리] (경북 안동) 9.5 ㎏ (건조 중량)을 실온에서 메탄올 10ℓ에 3일간 3회 (10ℓX 3) 추출하고, 수득된 메탄올 추출물을 감압 농축 (Vacuum rotary evaporator; 일본 EYELA사, N-1000) 및 건조하여 산약 추출물 631g을 얻었다.

1-2. 껍질 조추출물 제조예 1

산약 [마 (Dioscorea batatas) 의 덩이뿌리]의 껍질 0.9Kg (건조중량)을 에탄올 2ℓ를 60℃로 가온하여 3시간씩 3회 (2ℓX 3) 추출하고, 수득된 에탄올 추출물을 감압 농축 (Vacuum rotary evaporator; 일본 EYELA사, N-1000) 및 건조하여 산약 껍질 추출물 32.24g을 얻었다.

1-3. 알맹이 조추출물 제조예

산약 [마 (Dioscorea batatas) 의 덩이뿌리]의 껍질을 제거하여 건조시킨 산약 알맹이 3Kg을 에탄올 2ℓ를 60℃로 가온하여 3시간씩 3회 (2ℓX 3) 추출하고, 수득된 에탄올 추출물을 감압 농축 (Vacuum rotary evaporator; 일본 EYELA사, N-1000) 및 건조하여 산약 알맹이 추출물 88.79g을 얻었다.

실시예 2. 바타타신-I 및 펜안스라퀴논 유도체의 분리

2-1. 산약 헥산 가용추출물의 분획

상기 실시예 1-1의 산약 전체 추출물 631g을 증류수(7.5L)에 현탁하고 동량의 메틸렌클로라이드(7.5L)와 부탄올(7.5L)로 순차적으로 분획한 후 이를 감압 농축하여 메틸렌클로라이드 분획(39.7g)과 부탄올 분획(50.2g)을 얻었다. 메틸렌클로라이드 분획 39.7g을 동량의 실리카겔 (Merck사)에 흡착시킨 후 실리카겔 컬럼크로마토그래피(10× 90㎝)를 시간당 1000㎖로 수행하였다. 이때 전개용매로서 n-헥산:에틸아세테이트 혼합용매를 초기 용매로 하여 점점 극성을 증가시키면서(n-헥산:에틸아세테이트 10:0→3:7) 용매조건으로 용출시켜 최종적으로 6개의 분획으로 나누었다.

각각의 분획에 대해 실리카겔크로마토그래피 및 재결정을 반복적으로 행하여 하기 2개의 화합물을 얻었다 (도 1 참조).

2-2. 바타타신-I의 분리 및 구조확인

실시예 2-1의 메틸렌클로라이드 분획을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(10 x 9O㎝, 전개용매; n-헥산:에틸아세테이트10:0→ 3:7)의 용매조건으로 시간당 1000㎖로 수행하여 얻어진 6개 분획물 중 2번째 분획물(1.1g)을 다시 상기 조건으로 n-헥산:에틸아세테이트96:4→ 94:6) 용매 그래디언트로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(2 x 9O㎝)를 시간당 300㎖로 수행하여 하기 화학식 (1)의 바타타신-I (batatasin-I) 0.3 g을 수득하였다.

화학식 (1)

상기 화학식 (1)의 화합물의 물성 및 NMR 데이터는 하기와 같다:

2-3. 펜안스라퀴논 유도체의 분리 및 구조 확인

실시예 2-1의 6개 분획물 중 3번째 분획물(2.0g)을 n-헥산:에틸아세테이트(9:1) 용매조건으로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(3 x 9O㎝)를 시간당 350㎖로 수행하여 얻어진 3개의 분획물 중 2번째 분획물을 재결정시켜 펜안스라퀴논 유도체인 하기 화학식 (2)의 구조를 갖는 6-히드록시-2,7-디메톡시-1,4-펜안스라퀴논 화합물을 수득하였다.

화학식 (2)

화합물의 물성 및 NMR 데이터는 하기와 같다:

참고예 1. 실험재료의 준비

　　　　　　　　세포 배양액인 RPMI-1640, MEM (Modifed Eagle's Medium), 비필수아미노산 용액 (non-essential amino acids solution), FBS (fetal bovine serum), 스트렙토마이신 (streptomycine), 페니실린 (penicillin) 등의 세포배양용 시약들은 Gibco BRL사 (Grand Island, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 SCF, LPS, IL-10, 오브알부민 (ovalbumin, OVA), 알룸 (Alum), PBS등은 Sigma사 (St. Louis, USA)에서 구입하였다. PGD₂ 및 LTC₄의 EIA 키트는 Cayman사(Ann Arbor, USA) 에서 구입하였다.

참고예 2. 실험용 세포 배양

쥐 골수 유래 비만세포 (BMMC, mouse bone marrow-derived mast cells)를 실험용 흰 마우스 (BALB/C mouse)로부터 무라카미 등의 방법 (Murakami et al. J. Biol. Chem., 269, pp22269-22275, 1994)으로 골수에서 분리하여, 인터루킨-3 (IL-3) 생산 세포인 WEHI-3 세포 (일본 쇼와(Showa) 대학 약학부 쿠도 이치로 교수 제공)의 배양 상등액을 함유한 50% WEHI-3 배지 (conditioned medium, 10% 우태아혈청 (FBS) 함유)에서 배양하였다.

실험예 1. 산약 추출물, 바타타신-I 및 펜안스라퀴논 유도체의 LTC ₄ 억제 효과

　　　　　　　　실시예 1-1 내지 1-3에서 제조된 산약 추출물(ILC)이 LTC₄ 생성에 미치는 영향을 검토하기 위하여 하기의 방법으로 실험을 실시하였다 (Chang HW et al.. Planta. Medica., 70(5), pp 474-476, 2004).

참고예 2의 BMMC 배양 3주 후 비만세포에 산약 추출물을 농도별로 미리 30분간 전처리 한 후 SCF 자극제 (Sigma 사, S9915)를 15분간 처리하였다. 세포 자극 후의 상층액의 LTC₄ 정량은 LTC₄ EIA (Enzyme linked immuno assay, Cayman 사, product no. 520211) 키트를 이용하여 측정하였다.

산약 각 추출물 (최종 농도 100 μg/ml)을 15분간 전처리 한 후 자극제를 가하여 생성되는 프로스타글란딘 D₂(PGD₂) 및류코트리엔 C₄(LTC₄)의 생성량의 측정결과 및 탈과립반응 억제 결과는 표1에 도시된 바와 같다.

하기 표 1의 결과를 통해 알 수 있는 바와 같이 산약 전체, 껍질 및 알맹이 추출물 모두 프로스타글란딘 D₂, 류코트리엔 C₄ 생성을 저해하였으며, 또한 탈과립반응의 지표인 β-헥소사미니다제 (hexosaminidase, β-Hex)의 유리를 억제하였다.

알러지, 천식 질환 유발 물질로 알려진 류코트리엔 C₄(LTC₄) 생성에 대한 산약 추출물의 저해 효과를　검토한 결과, IC₅₀ 값은 산약 전체 추출물이 53.44 μg/ml, 알맹이 추출물이 91.46 μg/ml이었으며, 껍질 추출물의 경우 IC₅₀ 값은 6.2 μg/ml로, 가장 강한 저해활성을 나타내었다. 이때 양성 대조군으로는 AA861을 사용하였다 (도 2, 3 및 4 참조).

또한 산약에서 분리한 단일 물질인 바타타신-I 및 펜안스라퀴논 유도체도 농도 의존적으로 LTC₄의 생성을 억제하였으며, 바타타신-I의 IC₅₀ 값은 1.56 μM 이었고 (도 7 참조), 펜안스라퀴논 유도체의 IC₅₀ 값은 32.2 nM (0.0322 μM)로 측정되었다 (도 10 참조).

실험예 2. 산약 추출물의 COX-2 의존적인 PGD ₂ 생성 억제 효과

　　　　　　본 발명의 실시예들에서 수득한 산약 유래의 각 추출물들의 각종 염증성 질환에 대한 저해 효과를 확인하기 위해 프로스타글란딘 D₂(PGD₂)의 생성량을 PGD₂ EIA 키트 (Cayman, PGD₂-MOX EIA kit, product no. 512011)를 사용하여 측정하였다.

참고예 2의 BMMC 배양 3주 후 세포농도 2Ｘ10⁵cells에 상기 실시예 1, 2, 3 에서 수득한 산약 추출물을 30분간 전 처리한 후 100ng/ml의 SCF, 100ng/ml의 LPS 및 100 U/ml의 IL-10 혼합자극제(Sigma 사)를 처리한 다음, 세포 자극 8시간 후의 상층액의 PGD₂를 PGD₂ 분석 키트(Cayman 사)를 이용하여 EIA(Enzyme linked immuno assay)로 측정하였다. 이때 COX-1(시클로옥시게나제-1)에 의해서 생성되는 PGD₂의 생성을 억제시키기 위하여 BMMC에 아스피린(aspirin) 10㎍/㎖을 1시간 전에 미리 전 처리한 후 사용하였다. 세정완충용액(washing buffer)으로 4회 세정하고 기질용액 (substrate solution)을 200 ㎕씩 처리하여 5-20분간 반응시킨 후, 50 ㎕의 반응정지 용액 (stop solution)을 처리한 후에 450 nm에서 흡광도를 ELx800(BIO-TEK, Instrument, Inc, USA)으로 측정하였다.

실험 결과 껍질 추출물의 경우, 농도 의존적으로 PGD₂의 생성이 억제됨을 확인할 수 있었으며 (도 3 참조), IC₅₀은 37.9 ㎍/㎖ 이었다. 또한 산약에서 분리한 단일 물질인 바타타신-I 및 펜안스라퀴논 유도체도 농도 의존적으로 PGD₂의 생성을 억제하였으며, 바타타신-I의 IC₅₀ 값은 1.78 μM 이었으며 (도 6 참조), 펜안스라퀴논 유도체의 IC₅₀ 값은 87 nM (0.087 μM)을 나타냈다 (도 9 참조).

[표 1] 산약추출물의 PGD₂, LTC₄ 생성 억제율 및 탈과립반응 억제율

실험예 3. 비만세포에서 탈과립 억제반응 측정

참고예 2의 BMMC 배양 3주 후 세포농도 2Ｘ10⁵세포에 산약의 각 부위별 추출물 및 바타타신-I을 처리하여 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 30분간 전배양 (preincubation)한 후 KL (c-kit ligand, 100ng/ml)로 자극하여 15분간 배양하고 3000rpm, 4℃ 에서 5분간 원심분리 하였다. 상층 액을 b-hex 기질 [100mM citrate buffer (citric acid 0.955%, sodium citrate dihydrate 1.478%, pH 4.5), 1.3mg/ml p-nitrophenyl-N-acetyl-b-D-glucosaminide] 과 1:2의 비율로 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 반응 시킨 후 0.2 M 글리신 (glycine, pH 10.7)으로 반응을 정지시켜 ELASA를 사용하여 405nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그 측정값을 방출 (release) %로 환산하였다. 그 결과 표1에서처럼 각 추출물 모두 강한 탈과립 반응 억제 작용을 나타내었으며, 바타타신-I도 농도 의존적으로 탈과립 반응을 억제하였고, IC₅₀ 값은 1.94 μM 이었다 (도 8참조).

실험예 4. 동물모델에서의 항알러지 효과

상기 실시예 산약 추출물에 대한 대한 생체 (in vivo)의 항알러지 효능 측정을 위하여 하기의 실험을 실시하였다.

실험군 당 5마리씩 웅성 스프라그-도올리 랫트 (Splague-Dawley rat, 효창사이언스)를 이용하여 대표적인 Ⅰ형 알러지 모델인 랫트에 대한 수동피부 감작 아나필락시스 (passive cutaenous anaphylaxis)법 [Katayama S, Shionoya H and Ohtake S, Microbiol Immunol 22: 89-101, (1978)]으로 검정하였다.

스프라그-도올리 랫트에 단일클론 항 DNP 마우스 IgE (Monoclonal anti DNP mouse IgE, Sigma 사, 100㎕, 1000 배 희석한 용액)를 48시간 전에 투여한 후, 항원 (DNP, Sigma 사) 투여 30분 전에 산약 추출물 (CMC에 녹임)을 400 ㎎/㎏/100㎕를 경구로 투여하였다. 그 다음 1 mg DNP-BSA(항원용액)/1% 에반스 블루(Evans blue) 용액을 꼬리 정맥으로 주사하였다. 30분 후 피부에 유출된 색소를 측정하여 그 결과를, [도 11]에 나타내었으며, 억제율은 표 II에 나타내었다.

[도 11]에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 물질은 생체내의 알러지 모델에서도 유의성 있는 항알러지 효능을 나타냈다.

[표 2]

　　　　　　도1 은 산약으로부터 유효성분의 추출과정을 도시한 것이고,

　　　　　 도 2는 산약 추출물의 기관지 천식 및 알러지 반응을 일으키는 류코트리엔 C₄ (leukotriene C₄, LTC₄)의 합성에 관여하는 5-리폭시게나제에 대한 저해활성을 도시한 것이며,

　　　　　　　도 3은 산약 알맹이 추출물의 기관지 천식 및 알러지반응을 일으키는 류코트리엔 C₄ (leukotriene C₄, LTC₄)의 합성에 관여하는 5-리폭시게나제에 대한 저해활성을 도시한 것이고,

　　　　　 도 4는 산약 껍질 추출물의 기관지 천식 및 알러지 반응을 일으키는 류코트리엔 C₄ (leukotriene C₄, LTC₄)의 합성에 관여하는 5-리폭시게나제에 대한 저해활성을 도시한 것이며,

　　　　 도 5는 각종 염증질환반응을 일으키는 프로스타타글란딘 D2 (prostaglandin D2, PGD2)의 합성에 관여하는 시클로옥시게나제-2 (cyclooysgenase-2, COX-2) 에 대한 산약 껍질 추출물의 저해활성을 도시한 것이고,

　　　　　　 도 6은 산약추출물에서 분리한 바타타신-I (Batatasin-I)의 각종 염증질환반응을 일으키는 프로스타타글란딘 D2 (prostaglandin D2, PGD2)의 합성에 관여하는 시클로옥시게나제-2 (cyclooysgenase-2, COX-2) 에 대한 저해활성을 도시한 것이며,

　　　　　　 도 7은 산약추출물에서 분리한 바타타신-1 (Batatasin-I)의 기관지 천식 및 알러지반응을 일으키는 류코트리엔 C₄ (leukotriene C₄, LTC₄)의 합성에 관여하는 5-리폭시게나제에 대한 저해활성을 도시한 것이고,

　　　　　　 도 8은 산약추출물에서 분리한 바타타신-I (Batatasin-I)의 기관지 천식 및 알러지반응을 일으키는 비만세포 (mast cell)에서의 탈과립반응에 대한 저해활성을 도시한 것이며,

　　　　　 도 9는 산약추출물에서 분리한 펜안스라퀴논 유도체의 각종 염증질환반응을 일으키는 프로스타타글란딘 D2 (prostaglandin D2, PGD2)의 합성에 관여하는 시클로옥시게나제-2 (cyclooysgenase-2, COX-2) 에 대한 저해활성을 도시한 것이고,

　　　　　 도 10는 산약추출물에서 분리한 펜안스라퀴논 유도체의 기관지 천식 및 알러지 반응을 일으키는 류코트리엔 C₄ (leukotriene C₄, LTC₄)의 합성에 관여하는 5-리폭시게나제에 대한 저해활성을 도시한 것이며,

도 11은　 산약 각 추출물에 대한 생체 (in vivo)의 항알러지 효능 측정을 위하여 대표적인 Ⅰ형 알러지 모델인 렛트에 대한 수동피부 감작 아나필락시스 (passive cutaenous anaphylaxis) 억제 반응 실험 결과를 도시한 것이다.

Claims

염증, 알러지 질환 또는 성인병의 예방 또는 치료용 또는 이들 증상의 개선용 산약 추출물.
제1항에 있어서, 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 구성된 그룹에서 선택되는 용매를 사용하여 마의 덩이뿌리, 그의 껍질을 제거한 알맹이, 또는 그의 껍질로부터 추출되는 것을 특징으로 하는 산약 추출물.
제1항에 있어서, 화학식 (1) 화합물 또는 화학식 (2) 화합물, 또는 양자 모두를 포함하는 산약 추출물:

화학식 (1),

화학식 (2).
유효성분으로서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 산약 추출물을 포함하는 염증, 알러지 질환 또는 성인병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제4항에 있어서, 염증 질환은 기관지 천식, 만성 기관지염, 폐쇄성 기도질환, 상기도염, 부비강염, 관절염, 류마티스 관절염, 염증성 장질환, 급성 간질환, 염증성 통증, 급성 통증, 만성 통증, 관절통 및 신경병적 통증으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제4항에 있어서, 알러지 질환은 알러지성 천식, 알러지성 기관지염, 알러지성 비염, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 두드러기, 고초열, 알러지성 위염, 알러지성 설사, 알러지성 구내염, 알러지성 결막염 및 알러지성 각막염으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제4항에 있어서, 성인병은 당뇨병, 동맥경화증, 고혈압, 허혈성 뇌질환, 알쯔하이머병, 심근경색, 심장 질환, 폐기종, 뼈의 퇴행성 변화, 대장암 및 악성 종양으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제4항에 있어서, 천식 질환의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제4항에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여 산약 추출물을 0.1 내지 50 중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 산약 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증, 알러지 질환 또는 성인병의 증상 개선용 기능성 식품.
제10항에 있어서, 염증 질환은 기관지 천식, 만성 기관지염, 폐쇄성 기도질환, 상기도염, 부비강염, 관절염, 류마티스 관절염, 염증성 장질환, 급성 간질환, 염증성 통증, 급성 통증, 만성 통증, 관절통, 및 신경병적 통증으로 구성된 그룹에서 선택되고, 알러지 질환은 알러지성 천식, 알러지성 기관지염, 알러지성 비염, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 두드러기, 고초열, 알러지성 위염, 알러지성 설사, 알러지성 구내염, 알러지성 결막염, 및 알러지성 각막염으로 구성된 그룹에서 선택되며, 성인병은 당뇨병, 동맥경화증, 고혈압, 허혈성 뇌질환, 알쯔하이머병, 심근경색, 심장 질환, 폐기종, 뼈의 퇴행성 변화, 대장암, 및 악성 종양으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 기능성 식품.
제10항에 있어서, 식품 총 중량에 대하여 산약 추출물을 0.01 내지 95 중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 식품.