CN112236158A - 用于预防或治疗呼吸系统疾病的生药组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含山药(Dioscoreae Rhizoma)、蒲公英(Taraxaci Herba)及荆芥(Schizonepetae Spica)的混合提取物作为有效成分的用于预防或治疗呼吸系统疾病的药剂学组合物及用于预防或改善呼吸系统疾病的食品组合物。本发明的包含山药、蒲公英及荆芥的混合提取物的组合物具有预防呼吸系统疾病及改善症状的效果，不仅可恢复肺组织的损伤，还具有抑制微尘诱导的炎症、氧化应激及老化反应的功效。尤其，期望本发明的组合物增加延伸端粒的长度的端粒酶的表达，由此，与以往的症状缓解剂不同地，从根本上治疗微尘诱导的退行性呼吸系统疾病。

Description

用于预防或治疗呼吸系统疾病的生药组合物
技术领域
本申请要求于2018年3月16日提交且申请号为第10-2018-0031150号的韩国专利申请、于2019年3月13日提交且申请号为第10-2019-0028956号的韩国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
本发明涉及用于预防或治疗呼吸系统疾病的生药组合物，具体地，涉及包含山药(Dioscoreae Rhizoma)、蒲公英(Taraxaci Herba)及荆芥(Schizonepetae Spica)的提取物的用于预防、治疗或改善呼吸系统疾病的组合物。
背景技术
呼吸系统疾病为与肺及呼吸道相关的疾病，主要由于免疫力降低、炎症作用、细菌或病毒感染、微尘或吸烟等而吸入有害粒子及老化等原因导致。代表性的呼吸系统疾病包括肺炎(pneumonia)、鼻炎、哮喘(asthma)及支气管炎(bronchitis)、结核病(tuberculosis)、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)等。尤其，最近，微尘的增加及吸烟等引起的慢性阻塞性肺疾病患者呈增加趋势。慢性阻塞性肺疾病还称为肺气肿(emphysema)和慢性支气管炎(chronic bronchitis)。
这种呼吸系统疾病的治疗剂主要以抗炎作用或呼吸道扩张效果为目标研发。具有抗炎或呼吸道扩张效果的呼吸系统疾病治疗剂的例具有糖皮质激素类药物(glucocorticoid steroid drug)、β2肾上腺素能受体激动剂(beta2-adrenergicreceptor agonist)、白三烯受体拮抗剂(leukotriene receptor antagonist)及磷酸二酯酶(IV)抑制剂(phosphodiesterase-4inhibitor，PDE4 inhibitor)等。但是，这种以往的呼吸系统疾病治疗剂仅限用于治疗幼儿或小儿过敏性哮喘及吸烟者的慢性阻塞性肺疾病(COPD)。并且，上述治疗剂的大部分仅用于缓解症状，对于去除呼吸系统疾病的根本原因来缓解或阻止疾病的发展具有局限。并且，大多数的呼吸系统疾病具有复合性原因和症状，因此，利用单一成分、单一治疗机制的以往的治疗剂无法进行适当的治疗。因此，迫切需要研发以更多样化且复合的方式预防及治疗呼吸系统疾病的新治疗剂。
现有技术文献
专利文献
1.韩国专利公开公报第10-2017-0115852号
2.韩国专利授权公报第10-1569876号
发明内容
技术问题
为了克服如上所述的以往的呼吸系统疾病治疗剂的局限，本发明人努力研究研发具有新的治疗机制的呼吸系统疾病治疗剂。结果，本发明人确认山药、蒲公英、荆芥的复合生药提取物(混合提取物)具有抑制肺组织的损伤、微尘诱导的炎症、氧化应激及老化作用的功效，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供用于预防或治疗呼吸系统疾病的药剂学组合物，包含山药、蒲公英及荆芥的混合提取物；以及药剂学上可接受的载体作为有效成分。
本发明的另一目的在于，提供包含山药、蒲公英及荆芥的混合提取物作为有效成分的用于预防或改善呼吸系统疾病的食品组合物。
解决问题的方案
根据本发明的一实施方式，本发明提供用于预防或治疗呼吸系统疾病的药剂学组合物，包含：(a)山药、蒲公英及荆芥的混合提取物；以及(b)药剂学上可接受的载体作为有效成分。
在本说明书中，山药为去除薯蓣(Dioscorea batatas Decaisne)或日本薯蓣(Dioscorea japonica Thunberg)的表皮的根茎(根支体)，晒干或烘干。此药的原料的原产地为中国，还自生或种植在韩国、日本。山药为根茎，呈圆柱形或不均匀的圆柱形。通常，在秋季采集根茎并去外皮后在阴凉处晒干来使用。
在本说明书中，蒲公英为蒲公英(Taraxacum platycarpum H.Dahlstedt)、药用蒲公英(Taraxacum officinale Weber)、蒙古蒲公英(Taraxacum mongolicum Handel-Mazzetti)、朝鲜蒲公英(Taraxacum coreanum Nakai)的全草，据说东医宝鉴记载化热毒，消恶肿，散结，解食毒，散滞气。
在说明书中，荆芥为荆芥(chizonepeta tenuifolia Briquet)的花軸(花穗)。荆芥为花穗，呈细长的大麦穗状，长5～10cm，带有紫色的绿棕色或绿棕色。附有小唇形花，有时附有具有果实的萼筒。并且，可在全株观察到乳白色的短毛。众所周知，荆芥为性微温、无毒、味辛。
本发明中利用的上述山药、蒲公英及荆芥的提取物可购买或直接从生药提取并获取。上述提取可将各个生药以适当的大小切割或粉碎后执行。
在将本发明的组合物中利用的上述提取物直接从山药、蒲公英及荆芥的生药提取并获取的情况下，可利用如极性溶剂或非极性溶剂的多种提取溶剂。
适合用作极性溶剂的包括(i)水、(ii)C1至C6的低级醇(具体地，甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、1-戊醇、2-丁氧基乙醇或乙二醇)、(iii)乙酸、(iv)二甲基甲酰胺(DMFO，dimethyl formamide)以及(v)二甲基亚砜(DMSO，dimethylsulfoxide)。适合用作非极性溶剂的包括丙酮、乙腈、乙酸乙酯、乙酸甲酯、氟代烷、戊烷、己烷、2，2，4-三甲基戊烷、癸烷、环己烷、环戊烷、二异丁烯、1-戊烯、1-氯丁烷、1-氯戊烷、o-二甲苯，二异丙醚、2-氯丙烷、甲苯、1-氯丙烷、氯苯、苯、二乙醚、二乙硫醚、氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、苯胺、二乙胺、醚、四氯化碳及四氢呋喃(THF，Tetrahydrofuran)。
上述提取溶剂的量可根据所要提取的山药、蒲公英及荆芥的量不同，具体地，可以为山药、蒲公英及荆芥或它们的混合物的重量的1倍至20倍体积，具体地，可以为5倍至15倍的体积，更具体地，可以为5倍至12倍的体积或7倍至12倍的体积。最具体地，可以为山药、蒲公英、荆芥或它们的混合物重量的10倍体积。
本发明的提取物的提取温度并无特殊限制，例如，可以为0℃至120℃，具体地，可以为15℃至95℃。在本发明的一实例中，本发明的提取温度为常温。
本发明的提取物的提取时间并无特殊限制，例如，可以为1小时至10日，具体地，可以为1小时至72小时、1小时至48小时、1小时至36小时、1小时至24小时、1小时至12小时、1小时至10小时、1小时至6小时。更具体地，上述提取时间可以为2小时至72小时、2小时至48小时、2小时至36小时、2小时至24小时、2小时至12小时、2小时至10小时、2小时至6小时、3小时至72小时、3小时至48小时、3小时至36小时、3小时至24小时、3小时至12小时、3小时至10小时、5小时至48小时、5小时至36小时、5小时至24小时、5小时至12小时、5小时至10小时、6小时至12小时或6小时至10小时，最具体地，可以为8小时。
本发明的提取物可通过公知的天然物提取法提取。例如，可通过冷浸提取法、热水提取法、超声波提取法、回流冷却提取法、加热提取法提取，具体地，可通过冷浸提取法提取，可反复提取以1次至10次，更具体地，可反复提取2次至7次。
根据本发明的一实例，本发明中利用的山药、蒲公英及荆芥的提取物可利用有机溶剂、水或它们的混合溶剂提取。上述有机溶剂具有C1至C6的低级醇、石油醚、己烷、苯、氯仿、亚甲基氯、醚、乙酸乙酯及丙酮等。
上述C1至C6的低级醇、石油醚、己烷、苯、氯仿、亚甲基氯、醚、乙酸乙酯及丙酮等有机溶剂的浓度可以为1％(v/v)至100％(v/v)，具体地，可以为10％(w/w)至100％(w/w)、20％(w//w)至100％(w/w)、30％(w/w)至100％(w/w)、40％(w/w)至100％(w/w)、50％(w/w)至100％(w//w)、60％(w/w)至100％(w/w)、70％(w/w)至100％(w/w)、80％(w/w)至100％(w/w)，更具体地，可以为10％(w/w)至90％(w/w)、10％(w/w)至80％(w/w)、10％(w/w)至70％(w/w)、10％(w/w)至60％(w/w)、10％(w/w)至50％(w/w)、10％(w/w)至40％(w/w)、10％(w/w)至30％(w/w)，更加具体地，可以为20％(w/w)至80％(w/w)、20％(w/w)至70％(w/w)、20％(w/w)至60％(w/w)、20％(w/w)至50％(w/w)、20％(w/w)至40％(w/w)、20％(w/w)至30％(w/w)，最具体地，可以为25％(w/w)，但并不局限于此。
并且，根据本发明的另一实例，本发明的上述山药、蒲公英及荆芥的提取物可利用如上所述的水、C1至C6的低级醇或它们的混合溶剂提取，或者在提取及(减压)浓缩后可利用选自由如上所述的石油醚、己烷、苯、氯仿、亚甲基氯、醚、乙酸乙酯、丙酮组成的组中的有机溶剂追加提取或分馏来制备。
另一方面，本发明中利用的山药、蒲公英及荆芥的提取物的混合提取物可将山药、蒲公英及荆芥的个别提取物相混合来制备，或者还可利用提取溶剂对山药、蒲公英及荆芥生药的混合物进行处理来制备。
在本发明中，山药、蒲公英及荆芥的提取物可利用通过溶剂提取的粗(crude)提取物形态，还可纯化为高纯度来使用。
本说明书中使用的术语“提取物”具有如上所述的本领域通常用作粗提取物(crude extract)的含义，但是，广义上，还包括对提取物进行追加分馏(fractionation)的分馏物。即，白山药、蒲公英、荆芥的提取物不仅包括通过利用如上所述的提取溶剂而获取的，还包括对此追加适用纯化过程而获取的。例如，通过将上述提取物通过具有规定分子量截留值的超滤膜来获取的分馏、通过各种层析仪(为了根据大小、电荷、疏水性和亲和性的分离而制备的层析仪)的分离等追加实施的多种纯化方法获取的分馏也包括于本发明的山药、蒲公英、荆芥的提取物。本发明中利用的山药、蒲公英、荆芥提取物可通过如减压蒸馏及冷冻干燥或喷雾干燥等的追加过程制备为粉末状态。
根据本发明的具体实例，上述山药、蒲公英、荆芥在清洗及干燥之后，分别以规定重量比混合并向混合物重量(g)的1倍数～20倍数体积(ml)的提取溶剂投入，之后，在15～95℃的温度条件下搅拌1小时～48小时并提取。之后，过滤提取液，在50～65℃的温度条件下进行减压浓缩后，进行冷冻干燥来获取粉末状态的复合生药提取物(混合提取物)。
根据本发明的另一实例，将山药、蒲公英、荆芥分别向各个重量(g)的1倍数～20倍数体积(ml)的提取溶剂投入，之后，在15～95℃的温度条件下搅拌1小时～48小时并提取。之后，过滤各个提取液，在50～65℃的温度条件下进行减压浓缩后，进行冷冻干燥来获取粉末状态的生药提取物，并以规定重量比混合各个生药提取物来获取粉末状态的复合生药提取物(混合提取物)。
根据本发明的特定实例，以1∶1∶1的重量比混合上述山药、蒲公英、荆芥后，添加重量10倍数的乙醇，并在常温条件下提取8小时。在50～65℃的温度条件下减压浓缩提取液后，冷冻干燥浓缩液来获取山药、蒲公英、荆芥的复合生药提取物。
本发明中利用的上述山药、蒲公英及荆芥的3种混合提取物可分别以1～10∶1～10∶1～10、1∶1～10∶1～10、1～10∶1∶1～10、1～10∶1～10∶1、1∶1∶1～10、1∶1～10∶1或1～10∶1∶1的重量比包含山药、蒲公英及荆芥的生药提取物，或者可分别以1～5∶1～5∶1～5、1∶1～5∶1～5、1～5∶1∶1～5、1～5∶1～5∶1、1∶1∶1～5、1∶1～5∶1、1～5∶1∶1的重量比包含山药、蒲公英及荆芥的生药提取物，或者可分别以1～4∶1～4∶1～4、1∶1～4∶1～4、1～4∶1∶1～4、1～4∶1～4∶1、1∶1∶1～4、1∶1～4∶1、1～4∶1∶1的重量比包含山药、蒲公英及荆芥的生药提取物，或者可分别以1～3∶1～3∶1～3、1∶1～3∶1～3、1～3∶1∶1～3、1～3∶1～3∶1、1∶1∶1～3、1∶1～3∶1，1～3∶1∶1或1∶1∶1的重量比包含山药、蒲公英及荆芥的生药提取物。
本说明书中记载的上述生药成分你之间的混合比例以去除溶剂的固体成分重量(在生药提取物的混合物的情况下)或生药自身重量(在混合生药的提取物的情况下)为基准计算。
如在本说明书中使用，在两个树脂之间记载的术语“至”或“～”意味着包含前后记载的数值的上述数值之间段。
本发明的组合物可制备为药剂学组合物。
根据本发明的具体实例，本发明的组合物为如下的药剂学组合物，包含(a)如上所述的山药、蒲公英及荆芥的混合提取物；以及(b)药剂学上可接受的载体作为有效成分。
在本说明书中，术语“药剂学有效量”意味着如上所述的山药、蒲公英及荆芥的混合提取物实现呼吸系统疾病的治疗功效或预防功效所需的充分量。本发明为包含从天然植物材料的山药、蒲公英及荆芥提取的提取物的组合物，即使过量给药也对人体无副作用，因此，普通技术人员可在适当范围内选择并实施包含于本发明的组合物的上述提取物的量的上限。
在本说明书中，术语“呼吸系统疾病”包括选自由感冒、鼻炎、咽炎、喉炎、咽喉炎、急性或慢性肺炎、急性或慢性支气管炎、哮喘及慢性阻塞性肺疾病组成的组中的呼吸系统疾病，但并不限定于此。
如下述实施例所证明，本发明的山药、蒲公英及荆芥复合生药提取物(混合提取物)的给药在肺气肿小鼠模型中示出显著减少肺组织的损伤的效果。
并且，本发明的复合生药提取物显著抑制微尘诱导的肺上皮细胞株的活性氧生成、细胞凋亡及老化，以浓度依赖性增加用于延伸端粒的长度的端粒酶的表达程度。
并且，本发明的复合生药提取物抑制经脂多糖(LPS)处理的小鼠巨噬细胞株的一氧化氮(NO)生成，示出优秀的抗炎效果。
并且，本发明的复合生药提取物抑制经脂多糖处理的小鼠巨噬细胞株所表达的炎症因子(白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS))的表达来示出优秀的抗炎效果。
并且，本发明的复合生药提取物在经脂多糖处理的小鼠巨噬细胞株中增加作为抗氧化因子的血红素加氧酶1(HO-1)的表达来示出优秀的抗氧化效果，当以多种比例处理包含生药的复合生药提取物时，也增加作为抗氧化因子的血红素加氧酶1的表达，由此，在多种生药比例范围中也示出优秀的抗氧化效果。
并且，当利用多种浓度的提取溶剂(乙醇)提取时，本发明的复合生药提取物抑制炎症因子(诱导型一氧化氮合酶)的表达来示出优秀的抗炎效果，在使提取溶剂的浓度及种类不同的情况下，增加作为抗氧化因子的血红素加氧酶1的表达来示出优秀的抗氧化效果。
而且，相比于单一生药提取物，本发明的复合生药提取物显著抑制利用脂多糖诱导的肺炎小鼠模型的肺组织中的炎症因子(白细胞介素-6、白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α))的表达，相比于单一生药提取物，在抗炎效果中示出协同效应(synergisticeffect)。
如上所述的实施例的结果表示，包含本发明的复合生药提取物的组合物可用于预防、改善或治疗如肺炎、支气管炎、慢性阻塞性肺疾病、哮喘的炎症及老化引起的呼吸系统疾病，可用作现有的呼吸系统疾病治疗剂的代替剂。
在本发明的组合物制备为药剂学组合物的情况下，本发明的药剂学组合物可包含药剂学上接受的载体。作为制剂时通常利用的成分，上述药剂学上接受的载体包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁或矿物油等，但并不限定于此。除了上述成分之外，本发明的药剂学组合物还可包含保湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。在雷氏药学大全(Remington'sPharmaceutical Sciences)(19th ed.，1995)详细记载适合的药剂学上接受的载体及制剂。
本发明的药剂学组合物可口服给药或非口服给药，在非口服给药的情况下，可通过静脉给药、皮下给药、皮内给药、肌肉给药、鼻腔给药、粘膜给药、硬膜给药、腹腔给药、眼球给药等给药，具体地，可口服给药。
本发明的药剂学组合物的适合剂量根据如制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、症状程度、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应敏感性的因素的不同，通常熟练的医生可容易确定并处方对于所目的的治疗或预防有效的剂量。根据本发明的具体实例，本发明的药剂学组合物的1日剂量为0.001～1000mg/kg。例如，上述本发明的药剂学组合物的1日剂量可以为0.1～1000mg/kg、0.1～900mg/kg、0.1～800mg/kg、0.1～700mg/kg、0.1～600mg/kg、0.1～500mg/kg、0.1～400mg/kg、0.1～300mg/kg、0.1～200mg/kg、0.1～100mg/kg、0.1～50mg/kg、0.1～30mg/kg、0.1～20mg/kg、0.1～10mg/kg、0.1～7mg/kg、0.1～5mg/kg，可以为1～1000mg/kg、1～900mg/kg、1～800mg/kg、1～700mg/kg、1～600mg/kg、1～500mg/kg、1～400mg/kg、1～300mg/kg、1～200mg/kg、1～100mg/kg、1～50mg/kg、1～30mg/kg、1～20mg/kg、1～10mg/kg、1～7mg/kg、1～5mg/kg，更具体地，可以为1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg。并且，在另一实例中，例如，上述本发明的药剂学组合物的1日剂量可以为100～900mg/kg、100～800mg/kg、100～700mg/kg、100～600mg/kg、100～500mg/kg、100～400mg/kg、100～300mg/kg、100～200mg/kg，可以为200～900mg/kg、200～800mg/kg、200～700mg/kg、200～600mg/kg、200～500mg/kg、200～400mg/kg、200～300mg/kg，可以为300～900mg/kg、300～800mg/kg、300～700mg/kg、300～600mg/kg、300～500mg/kg、300～400mg/kg，可以为400～900mg/kg、400～800mg/kg、400～700mg/kg、400～600mg/kg、400～500mg/kg，更具体地，可以为100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg、400mg/kg、500mg/kg、600mg/kg、700mg/kg、800mg/kg、900mg/kg或1000mg/kg，但并不限定于此。
本发明的药剂学组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员容易实时的方法利用药剂学上接受的载体和/或赋形剂来制剂化，能够以单位容量形态制备或向多容量容器装入来制备。此时，剂型可以为油或水性媒介物中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者还可以为浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，还可包含分散剂或稳定化剂。
本发明的药剂学组合物可与具有预防及治疗呼吸系统疾病或呼吸系统疾病相关症状的效果的公知化合物或药剂学组合物一同给药。
根据本发明的再一实施方式，本发明提供包含山药、蒲公英及荆芥的混合提取物作为有效成分的用于预防或改善呼吸系统疾病的食品组合物。上述食品组合物可用作保健功能食品或添加于各种食品。
本发明还提供包含上述食品组合物的保健功能食品。上述保健功能食品可以为饮料类、肉类、巧克力、食品类、饼干类、披萨、泡面、其他面类、口香糖类、雪糕类、酒精饮料类、维生素复合剂或健康辅助食品类。
可根据食品的形态、所希望的用途等适当调节包含于上述食品组合物的本发明的混合提取物的含量，并无特殊限制。例如，混合提取物的的含量可以为总食品重量的0.001重量百分至30重量百分比或0.01重量百分至20重量百分比，在健康饮料组合物的情况下，以100ml为基准，可以为0.001g至15g、0.02g至10g或0.3g至1g，但并不限定于此。
在将本发明的包含山药、蒲公英及荆芥的混合提取物的组合物制备为食品组合物的情况下，不仅包含上述提取物作为有效成分，还可包含制备食品时通常所添加的成分作为有效成分。例如，上述添加成分包括蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养成分、调味剂及香味剂。如上所述的碳水化合物可例举如单糖、二糖、多糖等的常规糖以及如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等的糖醇，上述单糖如葡萄糖、果糖等，上述二糖如麦芽糖、蔗糖、寡糖等，上述多糖如糊精、环糊精等。香味剂可使用天然香味剂[索马甜、甜叶菊提取物(例如，莱苞迪甙A、甘草甜素等)]以及合成香味剂(糖精、阿斯巴甜等)。例如，在本发明的食品组合物制备为饮料剂的情况下，除本发明的上述提取物之外，还可包含柠檬酸、液态果糖、砂糖、葡萄糖、醋酸、苹果酸、果汁、杜仲提取液、大枣提取液、甘草提取液等。
与如上所述的“用于预防或治疗呼吸系统疾病的药剂学组合物”相同地，本发明的用于预防或改善呼吸系统疾病的食品组合物包含山药、蒲公英及荆芥的混合提取物作为有效成分，因此，为了避免本说明书过于重复，将省略两个发明之间的相同事项的记载。
并且，根据本发明的另一实施方式，本发明提供呼吸系统疾病的预防或治疗方法，包括向对象体(subject)给药如上所述的本发明的包含山药、蒲公英及荆芥的混合提取物作为有效成分的药剂学组合物的步骤。
并且，根据本发明的还有一实施方式，本发明提供呼吸系统疾病的预防或改善方法，包括向对象体给药如上所述的本发明的包含山药、蒲公英及荆芥的混合提取物作为有效成分的食品组合物的步骤。
作为本发明的治疗方法或改善方法的对象疾病的呼吸系统疾病的定义与作为上述药剂学组合物的治疗对象疾病的呼吸系统疾病的定义相同。
本说明书中使用的术语“给药”或“给药……”意味着将本发明的组合物的治疗或改善有效量对患有呼吸系统疾病的对象体(个体)直接给药来在对象体的体内形成相同量。
上述组合物的“治疗有效量”意味着向所要给药组合物的对象体提供治疗或预防效果的组合物的充分量，因此，为包含“预防有效量”的含义。并且，本说明书中使用的术语“对象体”为包括人类、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪、猴、猩猩、狒狒及猕猴等的哺乳类。最具体地，本发明的对象体为人类。
本发明的上述呼吸系统疾病的预防、改善或治疗方法为包括本发明的一实施方式的用于预防或治疗呼吸系统疾病的药剂学组合物或者用于预防或改善呼吸系统疾病的食品组合物的给药步骤的方法，为了避免本说明书过于重复，将省略与重复的内容有关的记载。
发明的效果
本发明的特征及优点如下：
(a)本发明涉及包含山药、蒲公英及荆芥的混合提取物的用于预防或治疗呼吸系统疾病的药剂学组合物及用于预防或改善呼吸系统疾病的食品组合物。
(b)本发明的包含山药、蒲公英及荆芥的混合提取物的组合物具有预防呼吸系统疾病并改善症状的效果，具有不仅恢复肺组织的损伤，还抑制微尘诱导的炎症、氧化应激及老化作用的功效。尤其，可期待本发明的组合物增加延伸端粒的长度的端粒酶的表达，与以往的症状缓解剂不同地，可根治微尘诱导的退行性呼吸系统疾病。
附图说明
图1为示出为了确认本发明的复合生药提取物的肺组织损伤抑制效果而通过显微镜观察利用猪胰弹性蛋白酶(PPE)诱导的肺气肿小鼠模型的肺组织的图。
图2为示出为了确认本发明的复合生药提取物对于活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)生成的抑制功效而比较微尘诱导的肺上皮细胞株的活性氧生成程度的曲线图。
图3为示出为了确认本发明的复合生药提取物的细胞凋亡抑制功效而处理微尘的各个肺上皮细胞株的复合生药提取物的处理浓度(100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml)的细胞存活率的曲线图。
图4为示出为了确认本发明的复合生药提取物的抗老化功效而在肺上皮细胞株处理微尘后的β-半乳糖苷酶染色(senescence beta-galactosidase staining)结果的图。
图5为示出为了确认本发明的复合生药提取物的抗老化功效而通过免疫印记比较各个肺上皮细胞株的复合生药提取物处理浓度(100μg/ml、200μg/ml)端粒酶表达程度的图。
图6为示出为了确认本发明的复合生药提取物的抗炎功效而通过各个复合生药提取物的处理浓度(0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml)比较经脂多糖处理的小鼠巨噬细胞株的一氧化氮(NO，Nitric Oxide)生成程度的曲线图。
图7a至图7c为示出为了确认本发明的复合生药提取物的抗炎功效而对于经脂多糖处理的小鼠巨噬细胞株的炎症因子(白细胞介素-6、白细胞介素-1β及诱导型一氧化氮合酶)表达的本发明的复合生药提取物的表达抑制效果的曲线图。
图8为示出为了确认本发明的复合生药提取物的抗氧化功效而通过各个复合生药提取物的处理浓度(0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml)比较经脂多糖处理的小鼠巨噬细胞株中的作为抗氧化因子的血红素加氧酶1的表达量的曲线图。
图9为示出为了确认本发明的复合生药提取物根据混合比例的抗氧化功效而按照多种生药比例比较经脂多糖处理的小鼠巨噬细胞株中的作为抗氧化因子的血红素加氧酶1的表达量的曲线图。
图10为示出为了确认本发明的复合生药提取物根据提取方法(热水提取法)及提取溶剂(乙醇)浓度的抗炎及抗氧化功效而以提取方法(热水提取法，0％)及按照提取溶剂(乙醇)的浓度(25％、50％、70％、90％)比较的经脂多糖处理的小鼠巨噬细胞株中的炎症因子(诱导型一氧化氮合酶)的表达量及作为抗氧化因子的血红素加氧酶1的表达量的曲线图。
图11a至图11c为示出为了确认单一生药提取物及复合生药提取物的肺炎抑制功效而比较利用脂多糖诱导的肺炎小鼠模型中的单一生药提取物(山药、蒲公英、荆芥)和复合生药提取物处理的炎症因子(白细胞介素-1β、白细胞介素-6及肿瘤坏死因子-α)的表达量的曲线图。
具体实施方式
以下，通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例仅用于更具体地说明本发明，根据本发明的主旨，本发明的范围并不局限于这些实施例，这对普通技术人员而言是显而易见的。
实施例
在本说明书全文中，在未另行提及的情况下，为了表示特定物质的浓度而使用的“％”为固体/固体为(重量/重量)％、固体/液体为(重量/体积)％及液体/液体为(体积/体积)％。
制备例
制备例1：制备复合生药提取物(混合提取物)
将清洗及干燥的山药、蒲公英、荆芥用于实验。以1∶1∶1的重量比混合上述山药、蒲公英、荆芥生药使其的总重量成为60g后，添加10倍的25％(v/v)乙醇水溶液来在常温条件下很好地搅拌8小时并提取。过滤提取液并在50～65℃的温度条件下减压浓缩后，进行冷冻干燥来获取粉末状态的复合生药提取物(混合提取物)。收率约为12～13％。
制备例2：制备各个生药混合比例的复合生药提取物(混合提取物)
将清洗及干燥的山药、蒲公英、荆芥用于实验。以在表1中记载的重量比(w/w)混合上述山药、蒲公英、荆芥的生药来使其的总重量成为30g后，添加10倍的25％(v/v)乙醇水溶液来在常温条件下很好地搅拌8小时并提取。过滤提取液并在50～65℃的温度条件下减压浓缩后，进行冷冻干燥来总共获取了7种复合生药提取物粉末，它们的收率如表1。
表1
分类 山药 蒲公英 荆芥 收率(％)
制备例2-1 1 1 1 11.95
制备例2-2 2 1 1 13.17
制备例2-3 4 1 1 14.81
制备例2-4 1 2 1 11.84
制备例2-5 1 4 1 10.83
制备例2-6 1 1 2 10.49
制备例2-7 1 1 4 10.27
制备例3：制备按照多种提取溶剂(乙醇)浓度的复合生药提取物(混合提取物)
将清洗及干燥的山药、蒲公英、荆芥用于实验。以制备例2-1的重量比(w/w)混合上述山药、蒲公英、荆芥的生药来使其的总重量成为30g后，添加10倍的25％、50％、70％、90％乙醇水溶液来在常温条件下很好地搅拌8小时并提取。过滤提取液并在50～65℃的温度条件下减压浓缩后，进行冷冻干燥来总共获取了4种复合生药提取物粉末，它们的收率如表2。
表2
分类 乙醇水溶液的浓度(％) 收率(％) 备注
制备例3-1 25 12.37 与制备例2-1相同的制备方法
制备例3-2 50 13.71 －
制备例3-3 70 9.84 －
制备例3-4 90 5.23 －
制备例4：制备通过热水提取法的复合生药提取物(混合提取物)
将清洗及干燥的山药、蒲公英、荆芥用于实验。以制备例2-1的重量比(w/w)混合上述山药、蒲公英、荆芥的生药使其的总重量成为30g后，添加10倍的蒸馏水来在90℃的温度条件下回流提取3小时。过滤提取液并在50～65℃的温度条件下减压浓缩后，进行冷冻干燥来获取了复合生药提取物粉末，其的收率约为13.30％。
比较例1：制备单一生药提取物
将清洗及干燥的山药、蒲公英、荆芥用于实验。向30g的上述山药、蒲公英、荆芥的生药分别添加10倍的25％(v/v)乙醇水溶液来在常温条件下很好地搅拌8小时并提取。过滤提取液并在50～65℃的温度条件下减压浓缩后，进行冷冻干燥来总共获取3种单一生药提取物粉末，它们的收率如表3。
表3
分类 生药的种类 收率(％)
比较例1-1 山药 19.86
比较例1-2 蒲公英 12.52
比较例1～3 荆芥 7.84
实验例
实验例1：利用猪胰弹性蛋白酶诱导的肺气肿小鼠模型中的复合生药提取物的肺组织损伤抑制功效
为了确认在制备例1中准备的本发明的复合生药提取物的肺组织损伤抑制功效，执行了如下的实验。
将7周龄雄性C57BL/6小鼠(RaonBio，韩国)驯化饲育一周以上后，分为(1)正常组、(2)肺气肿诱导及复合生药提取物给药组(实验组)、(3)肺气肿诱导及蒸馏水给药组(阴性对照组)。为了诱导实验组和阴性对照组的肺气肿，向小鼠的器官中单次点滴给药1U的猪胰弹性蛋白酶(porcine pancreatic elastase，PPE，Millipore，USA)。在正常组的情况下，向小鼠的器官中单次点滴给药磷酸盐缓冲液(PBS，phosphate buffered saline)。
在实验组中，在猪胰弹性蛋白酶给药1周之前，将溶解于蒸馏水的复合生药提取物以200mg/kg的容量1次/日口服给药2周。对正常组及阴性对照组仅口服给药蒸馏水。最后给药复合生药提取物或蒸馏水后，利用二氧化碳麻醉小鼠并摘取肺组织。将所摘取的肺组织固定在福尔马林并执行苏木精伊红(H&E)染色(hematoxylin and eosin staining)。通过光学显微镜(×100)观察肺组织并在图1示出所拍摄的照片。
如图1所示，利用猪胰弹性蛋白酶诱导肺气肿的结果，相比于正常组，阴性对照组的肺泡扩张及肺组织的损伤显著增加2.2倍左右。并且，相比于肺气肿诱导组(阴性对照组)，给药本发明的复合生药提取物的实验组抑制肺组织的损伤。
因此，可确认，本发明的复合生药提取物示出抑制肺气肿小鼠模型中的肺组织的损伤的效果。
实验例2：对于微尘诱导的肺上皮细胞株的活性氧生成的复合生药提取物的抑制功效
为了确认在制备例1中准备的本发明的复合生药提取物的活性氧生成抑制功效，执行了如下的实验。
利用包含10％的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的RPMI培养基(Corning，USA)在37℃、5％的CO2培养基中培养作为人肺上皮细胞株的NCI-H292细胞(ATCC，USA)。以每孔1×104的细胞数在96孔板准备上述细胞，并稳定化24小时。稳定化之后，去除细胞的上清液，以100μg/ml的浓度处理制备例1的复合生药提取物后培养1小时。之后，在上述细胞追加处理200μg/ml的微尘(particulate matter 10，PM10)(NIST，USA)(实验组)。在正常组中未处理复合生药提取物及微尘，在阴性对照组中仅处理微尘。3小时后，通过使用DCF-DA分析法(美国西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich，USA))来确认上述细胞中的活性氧的生成量。
如图2所示，相对于正常组，微尘诱导组(阴性对照组)的活性氧约增加125％，这被复合生药提取物抑制约61％。因此，可知，本发明的复合生药提取物示出优秀的抗氧化效果。
实验例3：对于微尘诱导的细胞凋亡的复合生药提取物的抑制功效
与实验例2相同地，以每孔1×104的细胞数在96孔板准备NCI-H292细胞并稳定化。24小时后，去除细胞的上清液，以100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL的浓度分别处理制备例1的复合生药提取物。1小时后，在上述细胞追加处理50μg/mL的微尘(PM10)。在正常组中未处理复合生药提取物及微尘，在阴性对照组中仅处理微尘。24小时后，通过WST-1检测法(YOUNG IN FRONTIER，韩国)确认细胞的存活率。
如图3所示，在肺上皮细胞处理微尘的结果，由于细胞凋亡，相对于正常组，细胞存活率约为63.6％(阴性对照组)。相反，在以100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL的浓度处理复合生药提取物的实验组的情况下，分别示出67.5％、69.9％、77.2％、89％的细胞存活率，浓度依赖性地抑制细胞凋亡。因此，可知，本发明的复合生药提取物示出优秀的细胞凋亡抑制效果。
实验例4：对于微尘诱导的肺上皮细胞株的细胞老化的复合生药提取物的抗老化功效
如实验例2，以每孔1×104的细胞数在96孔板准备NCI-H292细胞并稳定化。24小时后，去除细胞的上清液，以200μg/mL的浓度处理制备例1的复合生药提取物。1小时后，在上述细胞追加处理50μg/mL的微尘(PM10)。在正常组中未处理复合生药提取物及微尘，在阴性对照组中仅处理微尘。5日后，利用福尔马林固定上述细胞后，通过β-半乳糖苷酶染色确认了细胞的老化程度。
如图4所示，相比于阴性对照组，处理复合生药提取物的实验组的经微尘处理诱导的细胞老化显著减少。因此，可知，本发明的复合生药提取物示出优秀的抗老化效果。
实验例5：对于复合生药提取物的肺上皮细胞株的端粒酶表达增加功效(抗老化功效)
以1×106的细胞数在
Figure GDA0002831141190000111
板准备NCI-H292细胞并稳定化。24小时后，在上述细胞以100μg/ml、200μg/ml的浓度处理制备例1的复合生药提取物。24小时后，回收上述细胞并提取蛋白质后，通过使用作为端粒酶的催化剂亚单位的人端粒酶逆转录酶(hTERT，humantelomerase reverse transcriptase)的抗体(ab32020，Abcam，USA)来执行免疫印迹实验。
如图5所示，在肺上皮细胞株以100μg/ml、200μg/ml的浓度处理复合生药提取物的结果，相比于未处理组(对照组)，人端粒酶逆转录酶的表达浓度依赖性地分别增加1.6倍、2.2倍。因此，可知，本发明的复合生药提取物示出优秀的抗老化效果。
实验例6：对于脂多糖诱导的巨噬细胞株的一氧化氮生成的复合生药提取物的抑制功效(抗炎功效)
利用包含10％的胎牛血清的RPMI培养基(Invitrogen，USA)在37℃、5％的CO2培养基中培养作为小鼠的巨噬细胞株的Raw264.7细胞(ATCC，USA)。以每孔2.5×105的细胞数在24孔板准备上述细胞并使其稳定化。24小时后，去除细胞的上清液后，在上述细胞以0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL的浓度处理制备例1的复合生药提取物。1小时后，在上述细胞追加处理100ng/mL的脂多糖。24小时后，回收细胞的上清液，并实施用于测定一氧化氮的生成变化的格里斯试验(Griess test)，利用NaNO2(亚硝酸钠(Sodium Nitrite))的各个浓度标准曲线来计算一氧化氮的浓度(图6)。
如图6所示，由于脂多糖的处理，巨噬细胞中的炎症因子一氧化氮的生成增加至12μM水平(阴性对照组)。在与脂多糖处理一同以0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、4mg//ml浓度处理复合生药提取物的实验组中，一氧化氮的浓度分别为13.6μM、9.4μM、3.6μM、3μM，示出浓度依赖性减少。因此，可知，本发明的复合生药提取物示出优秀的抗炎功效。
实验例7：对于脂多糖诱导的巨噬细胞株的炎症因子的表达的复合生药提取物抑制功效(抗炎功效)
利用包含10％的胎牛血清的RPMI培养基(Invitrogen，USA)在37℃、5％的CO2培养基中培养作为小鼠的巨噬细胞株的Raw264.7细胞(ATCC，USA)。以每孔2.5×105的细胞数在24孔板准备上述细胞并使其稳定化。24小时后，去除细胞的上清液后，在上述细胞以0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL的浓度处理100ng/mL的脂多糖(Sigma，US)和制备例1的复合生药提取物。24小时后，去除细胞的上清液后，通过使用TRIzol(Invitrogen，USA)从细胞分离核糖核酸(RNA)。之后，使用通过执行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)来获取的互补脱氧核糖核酸(cDNA)来执行了利用对于白细胞介素-6、白细胞介素-1β及诱导型一氧化氮合酶炎症因子特异性的引物和SYBR绿色探针(SYBR green)(Takara，Japan)的实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶信使核糖核酸(GAPDH mRNA)为标准基因，以相对于无处理组的相对变化量显示从实时荧光定量聚合酶链式反应获取的核糖核酸的表达变化值(图7a至图7c)。在表4示出用于实验的小鼠基因的引物序列。
表4
Figure GDA0002831141190000121
如图7a至图7c所示，由于脂多糖的处理，Raw264.7巨噬细胞中的炎症因子白细胞介素-6、白细胞介素-1β及诱导型一氧化氮合酶的生成显著增加(阴性对照组)，在与脂多糖处理一同以0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml的浓度处理制备例1的3种复合生药提取物的实验组中，白细胞介素-6、白细胞介素-1β、诱导型一氧化氮合酶的表达量均浓度依赖性地显著减少。因此，可知，本发明的3种复合生药提取物示出优秀的抗炎功效。
实验例8：脂多糖处理的巨噬细胞株中的复合生药提取物的抗氧化因子表达增加功效(抗氧化功效)
本发明人为了在脂多糖诱导的巨噬细胞株中确认本发明的复合生药提取物对于作为抗氧化因子的血红素加氧酶1的表达的影响，利用对于血红素加氧酶1(hemeoxygenase-1)基因特异性的引物和SYBR绿色探针(Takara，Japan)来执行实时荧光定量聚合酶链式反应，除此之外，通过与实验例7相同的方法执行了实验。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶信使核糖核酸为标准基因，以相对于无处理组的相对变化量显示从实时荧光定量聚合酶链式反应结果获取的核糖核酸的表达变化值(图8)。在表5示出用于实验的小鼠基因的引物序列。
表5
Figure GDA0002831141190000131
如图8所示，在与脂多糖处理一同以0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml的浓度处理制备例1的复合生药提取物的实验组中，血红素加氧酶1的表达量浓度依赖性地显著增加。因此，可知本发明的复合生药提取物示出优秀的抗氧化功效。
实验例9：脂多糖处理的巨噬细胞株中的各个生药比例的复合生药提取物的抗氧化因子表达增加功效(抗氧化功效)
为了在脂多糖诱导的Raw264.7巨噬细胞株中确认制备例2的各个混合比例的复合生药提取物的抗氧化功效，利用对于血红素加氧酶1基因特异性的引物和SYBR绿色探针(Takara，Japan)执行了实时荧光定量聚合酶链式反应。详细实验过程与实验例8相同，用于试验的小鼠基因的引物序列如表5。
如图9所示，在与脂多糖处理一同以2mg/ml的浓度处理制备例2的复合生药提取物的实验组中，作为抗氧化因子的血红素加氧酶1的表达量均显著增加，由此，可知，示出优秀的抗氧化功效。
实验例10：脂多糖处理的巨噬细胞株中的各个提取溶剂(乙醇)浓度的复合生药提取物的抗炎及抗氧化功效
为了在脂多糖处理的巨噬细胞株中确认制备例3的各个提取溶剂(乙醇)浓度的复合生药提取物及制备例4的热水复合生药提取物的抗炎及抗氧化功效，利用对于诱导型一氧化氮合酶、血红素加氧酶1基因特异性的引物和SYBR绿色探针(Takara，Japan)执行了实时荧光定量聚合酶链式反应。以2mg/ml的浓度处理各个提取物。详细实验过程与实验例7及实验例8相同，在表4及表5示出用于试验的小鼠基因的引物序列。
如图10所示，在制备例3中制备的各个提取溶剂(乙醇)浓度的复合生药提取物显著减少经脂多糖处理增加的诱导型一氧化氮合酶的表达，由此，可知，示出优秀的抗炎功效。并且，制备例3及制备例4的复合生药提取物均线束增加作为抗氧化因子的血红素加氧酶1的表达量，由此，可知，示出优秀的抗氧化功效。
实验例11：脂多糖诱导的肺炎小鼠模型中的单一生药提取物和复合生药提取物的抗炎功效
为了确认单一生药提取物及复合生药提取物的肺炎抑制功效，执行了如下的实验。将7周龄雄性C57BL/6小鼠(RaonBio，韩国)驯化饲育一周以上后，分为(1)正常组、(2)脂多糖诱导及蒸馏水给药组(阴性对照组)、(3)～(5)脂多糖诱导及单一生药提取物给药组、(6)脂多糖诱导及复合生药提取物给药组。
在(3)～(6)的实验组中，将溶解于蒸馏水的制备例1的复合生药提取物及比较例1的3种单一生药提取物分别以500mg/kg的容量1次/日口服给药5日，在正常组及阴性对照组中，仅口服给药蒸馏水。
在实验结束24小时之前，通过向小鼠器官中单次点滴给药溶解于50μl的磷酸盐缓冲液的50μg的脂多糖(Sigma，US)的方法执行实验组与阴性对照组的急性肺炎反应诱导。在正常组的情况下，向小鼠器官中单次点滴给药磷酸盐缓冲液。
在最后给药生药提取物或蒸馏水后，利用二氧化碳牺牲小鼠后分离肺组织，并利用TRIzol(Invitrogen，USA)提取核糖核酸。之后，使用通过执行逆转录聚合酶链式反应来获取的互补脱氧核糖核酸来执行了利用对于作为炎症因子的白细胞介素-1β、白细胞介素-6及肿瘤坏死因子-α特异性的引物和SYBR绿色探针(Takara，Japan)的实时荧光定量聚合酶链式反应。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶信使核糖核酸为标准基因，以相对于无处理组的相对变化量显示从实时荧光定量聚合酶链式反应获取的核糖核酸的表达变化值。在表6示出用于试验的小鼠基因的引物序列。
表6
Figure GDA0002831141190000141
如图11a至图11c所示，由于脂多糖，肺组织中的作为炎症因子的白细胞介素-1β、白细胞介素-6及肿瘤坏死因子-α的表达增加。在分别给药3种单一生药提取物的情况下，示出与阴性对照组相似程度的炎症因子的表达。相反，在复合生药提取物的情况下，相对于阴性对照组，显著减少炎症因子的表达，对于抗炎功效，示出协同效应(synergisticeffect)。
序列表
<110> VIROMED CO., LTD.
<120> 用于预防或治疗呼吸系统疾病的生药组合物
<130> PP190004
<150> KR 10-2018-0031150
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<160> 12
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于GAPDH的正向引物
<400> 1
agcctcgtcc cgtagacaa 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于GAPDH的反向引物
<400> 2
aatctccact ttgccactgc 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于IL-6的反向引物
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tagtccttcc taccccaatt tcc 23
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<211> 21
<212> DNA
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<223> 用于IL-1β的正向引物
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tgtgcaagtg tctgaagcag c 21
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<212> DNA
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<220>
<223> 用于IL-1β的反向引物
<400> 6
tggaagcagc ccttcatctt 20
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<211> 19
<212> DNA
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<223> 用于iNOS的正向引物
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<212> DNA
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<220>
<223> 用于iNOS的反向引物
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tgagcctata ttgctgtggc t 21
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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aagcctgtag cccacgtcgt a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于TNF-α的反向引物
<400> 12
ggcaccacta gttggttgtc tttg 24

Claims (6)

1.一种用于预防或治疗呼吸系统疾病的药剂学组合物，其包含：(a)山药、蒲公英及荆芥的混合提取物；以及(b)药剂学上可接受的载体作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的药剂学组合物，其中所述提取物利用有机溶剂、水或它们的混合溶剂提取。
3.根据权利要求2所述的药剂学组合物，其中所述有机溶剂选自：C1至C6的低级醇、石油醚、己烷、苯、氯仿、亚甲基氯、醚、乙酸乙酯及丙酮。
4.根据权利要求1所述的药剂学组合物，其中所述呼吸系统疾病为选自下列的呼吸系统疾病：感冒、鼻炎、咽炎、喉炎、咽喉炎、肺炎、急性或慢性支气管炎、哮喘及慢性阻塞性肺疾病。
5.一种用于预防或改善呼吸系统疾病的食品组合物，其包含山药、蒲公英及荆芥的混合提取物作为有效成分。
6.一种保健功能食品，其包含权利要求5所述的食品组合物作为有效成分。
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