KR20190109277A

KR20190109277A - 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 생약 조성물

Info

Publication number: KR20190109277A
Application number: KR1020190028956A
Authority: KR
Inventors: 손미원; 배민정; 이원우; 이두석
Original assignee: 주식회사 헬릭스미스
Priority date: 2018-03-16
Filing date: 2019-03-13
Publication date: 2019-09-25
Also published as: EP3766509A4; KR102210566B1; US20210000905A1; CN112236158A; JP7255901B2; KR20210011468A; US11541097B2; JP2022163181A; US20230218704A1; JP2021516690A; EP3766509A1

Abstract

본 발명은 산약(Dioscoreae Rhizoma), 포공영(Taraxaci Herba), 및 형개(Schizonepetae Spica)의 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 산약, 포공영 및 형개의 혼합추출물을 포함하는 조성물은 호흡기 질환의 예방 및 증상을 개선하는 효과가 있고, 폐조직의 손상을 회복할 뿐만 아니라 미세먼지에 의해 유도되는 염증, 산화적 스트레스 및 노화반응을 억제하는 효능이 있다. 특히 본 발명의 조성물은 텔로미어의 길이를 연장하는 텔로머레이즈의 발현을 증가시킴으로써 종래의 증상 완화제와 달리 미세먼지에 의해 유도되는 퇴행성 호흡기 질환을 근본적으로 치료할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

호흡기 질환의 예방 또는 치료용 생약 조성물{Herbal Composition for Preventing or Treating Respiratory Disease}

본 특허출원은 2018년 3월 16일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허 출원 제10-2018-0031150호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명은 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 생약 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 산약(Dioscoreae Rhizoma), 포공영(Taraxaci Herba) 및 형개(Schizonepetae Spica)의 추출물을 포함하는 호흡기 질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

호흡기 질환은 폐 및 기도와 관련된 질환으로, 주로 면역력 저하, 염증 작용, 세균이나 바이러스의 감염, 미세먼지 또는 흡연 등으로 인한 유해입자의 흡입 및 노화 등의 원인으로 발생할 수 있다. 대표적인 호흡기 질환은 폐렴(pneumonia), 비염, 천식(asthma) 및 기관지염(bronchitis), 결핵(tuberculosis), 만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD) 등을 포함한다. 특히 최근에는 미세먼지의 증가 및 흡연 등으로 인한 만성폐쇄성폐질환 환자가 증가하고 있는추세이다. 만성폐쇄성폐질환은 폐기종(emphysema)과 만성기관지염(chronic bronchitis)으로 불리우기도 한다.

이러한 호흡기 질환의 치료제는 주로 항염증 작용이나 기도 확장 효과를 타깃으로 개발되고 있다. 항염증 또는 기도 확장 효과를 나타내는 호흡기 질환 치료제의 예로는 당질코르티코이드 스테로이드 약물(glucocorticoid steroid drug), 베타2-아드레날린 수용체 효능제(beta₂-adrenergic receptor agonist), 항류코트리엔제(leukotriene receptor antagonist) 및 포스포디에스테라아제-4 억제제(phosphodiesterase-4 inhibitor, PDE4 inhibitor) 등이 있다. 그러나 이러한 기존의 호흡기 질환 치료제들은 치료목적이 유아 또는 소아 대상의 알레르기성 천식 및 흡연자 대상의 만성폐쇄성폐질환(COPD)에 한정되어져 있었다. 또한 상기 치료제들은 대부분 증상의 완화만을 목적으로 하며, 호흡기 질환의 본질적인 원인을 제거하여 병의 진행을 늦추거나 멈추지 못하는 한계가 있었다. 또한 대다수의 호흡기 질환은 그 원인과 증상이 복합적으로 나타나므로 단일 성분, 단일 치료기전을 이용한 종래의 치료제로는 적합한 치료가 불가능한 실정이다. 따라서, 보다 다각적이면서 복합적으로 호흡기 질환을 예방 및 치료하기 위한 새로운 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

대한민국 특허공개공보 제10-2017-0115852호 대한민국 특허등록공보 제10-1569876호

본 발명자들은 상술한 종래의 호흡기 질환 치료제의 한계점을 극복하기 위하여 새로운 치료기전을 가진 호흡기 질환 치료제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 본 발명자들은 산약, 포공영, 형개의 복합 생약 추출물(혼합추출물)이 폐 조직의 손상뿐만 아니라, 미세먼지에 의해 유도되는 염증, 산화적 스트레스 및 노화 작용을 억제하는 효능이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 유효성분으로 산약(Dioscoreae Rhizoma), 포공영(Taraxaci Herba) 및 형개(Schizonepetae Spica)의 혼합추출물; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 산약(Dioscoreae Rhizoma), 포공영(Taraxaci Herba) 및 형개(Schizonepetae Spica)의 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 유효성분으로 산약(Dioscoreae Rhizoma), 포공영(Taraxaci Herba) 및 형개(Schizonepetae Spica)의 혼합추출물; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 산약(Dioscoreae Rhizoma)은 마(Dioscorea batatas Decaisne) 또는 참마(Dioscorea japonica Thunberg)의 주피를 제거한 뿌리줄기(담근체)로서 그대로 또는 쪄서 말린 것이다. 이 약의 원료는 중국이 원산지이지만 한국, 일본, 대만에서도 자생하거나 재배되고 있다. 산약은 뿌리 줄기로 원주형 또는 고르지 않은 원주형이다. 보통 뿌리 줄기를 가을에 채취하여 겉껍질을 벗긴 후 그늘에서 말려 사용한다.

본 명세서에서 포공영(Taraxaci Herba)은 민들레(Taraxacum platycarpum H. Dahlstedt), 서양민들레(Taraxacum officinale Weber), 털민들레(Taraxacum mongolicum Handel-Mazzetti), 흰민들레(Taraxacum coreanum Nakai)의 전초(全草)를 가리키는 것으로, 동의보감에는 열독을 풀고 악창을 삭히며 멍울을 헤치고 식독을 풀며 체기를 없애는데 좋은 효과를 나타낸다고 기재되어 있다.

본 명세서에서 형개(Schizonepetae Spica)는 형개(Schizonepeta tenuifolia Briquet)의 꽃대(꽃 이삭, 花穗)이다. 형개는 꽃이삭으로 가늘고 긴 보리이삭 모양이고 길이 5-10 cm이며 보라색을 띤 녹갈색에서 녹갈색이다. 작은 순형화(脣形花)와 때로는 열매를 가지는 꽃받침 통이 붙어 있다. 또한 전주(全株)에 유백색의 짧은 털을 볼 수 있다. 형개(Schizonepetae Spica)는 성미는 성온(性溫) 무독(無毒)하고 신미(辛味)하다고 알려져 있다.

본 발명에서 이용되는 상기 산약, 포공영, 및 형개의 추출물은 구입하거나 또는 생약으로부터 직접 추출하여 얻을 수 있다. 상기 추출은 각각의 생약을 적절한 크기로 절단 또는 분쇄한 후 수행될 수 있다.

본 발명의 조성물에서 이용되는 상기 추출물을 산약, 포공영, 및 형개의 생약으로부터 직접 추출하여 얻는 경우에는, 극성 용매 또는 비극성 용매와 같은 다양한 추출용매가 이용될 수 있다.

극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) C1 내지 C6의 저급 알코올(구체적으로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethylsulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF(Tetrahydrofuran)를 포함한다.

상기 추출용매의 양은 추출하고자 하는 산약, 포공영 및 형개의 양에 따라 달라질 수 있으며, 구체적으로는 산약, 포공영, 형개 또는 이들의 혼합물의 중량의 1배 내지 20배의 부피, 구체적으로는 5배 내지 15배의 부피, 보다 구체적으로는 5배 내지 12배의 부피 또는 7배 내지 12배의 부피일 수 있다. 가장 구체적으로는 산약, 포공영, 형개 또는 이들의 혼합물 중량의 10배 부피이다.

본 발명의 추출물의 추출온도는 특별히 제한되지 아니하고, 예를 들어 0℃ 내지 120℃일 수 있으며, 구체적으로는 15℃ 내지 95℃일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서 본 발명의 추출온도는 상온이다.

본 발명의 추출물의 추출시간은 특별히 제한되지 아니하며, 예를 들어 1시간 내지 10일 일 수 있으며, 구체적으로는 1시간 내지 72시간, 1시간 내지 48시간, 1시간 내지 36시간, 1시간 내지 24시간, 1시간 내지 12시간, 1시간 내지 10시간, 1시간 내지 6시간일 수 있다. 상기 추출시간은 보다 구체적으로는 2시간 내지 72시간, 2시간 내지 48시간, 2시간 내지 36시간, 2시간 내지 24시간, 2시간 내지 12시간, 2시간 내지 10시간, 2시간 내지 6시간, 3시간 내지 72시간, 3시간 내지 48시간, 3시간 내지 36시간, 3시간 내지 24시간, 3시간 내지 12시간, 3시간 내지 10시간, 5시간 내지 48시간, 5시간 내지 36시간, 5시간 내지 24시간, 5시간 내지 12시간, 5시간 내지 10시간, 6시간 내지 12시간, 또는 6시간 내지 10시간일 수 있으며, 가장 구체적으로는 8시간이다.

본 발명의 추출물은 공지의 천연물 추출법으로 추출될 수 있다. 예를 들어 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출, 가열 추출법으로 추출할 수 있고, 구체적으로는 냉침추출법으로 추출할 수 있으며, 1회 내지 10회, 보다 구체적으로는 2회 내지 7회 반복 추출할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 산약, 포공영 및 형개의 추출물은 유기용매, 물, 또는 이들의 혼합용매로 추출이 가능하다. 상기 유기용매에는 C1 내지 C6의 저급 알코올, 석유 에테르, 헥산, 벤젠, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에테르, 에틸아세테이트, 및 아세톤 등이 있다.

상기 C1 내지 C6의 저급 알코올, 석유 에테르, 헥산, 벤젠, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에테르, 에틸아세테이트, 및 아세톤 등 유기용매의 농도는 1 내지 100%(v/v), 구체적으로는 10 내지 100%(w/w), 20 내지 100%(w/w), 30 내지 100%(w/w), 40 내지 100%(w/w), 50 내지 100%(w/w), 60 내지 100%(w/w), 70 내지 100%(w/w), 80 내지 100%(w/w)일 수 있고, 보다 구체적으로는 10 내지 90%(w/w), 10 내지 80%(w/w), 10 내지 70%(w/w), 10 내지 60%(w/w), 10 내지 50%(w/w), 10 내지 40%(w/w), 10 내지 30%(w/w), 보다 더 구체적으로는 20 내지 80%(w/w), 20 내지 70%(w/w), 20 내지 60%(w/w), 20 내지 50%(w/w), 20 내지 40%(w/w), 20 내지 30%(w/w)일 수 있으며, 가장 구체적으로는 25%(w/w) 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 산약, 포공영 및 형개의 추출물은 상술한 물, C1 내지 C6의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하거나, 추출 및 (감압)농축한 후 상술한 석유 에테르, 헥산, 벤젠, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에테르, 에틸아세테이트, 아세톤으로 이루어진 군으로부터 선택된 유기용매로 추가 추출 또는 분획되어 제조될 수 있다.

한편, 본 발명에서 이용되는 산약, 포공영 및 형개의 추출물의 혼합추출물은 산약, 포공영, 및 형개의 개별 추출물을 서로 혼합하여 제조할 수 있고, 또는 산약, 포공영 및 형개 생약의 혼합물에 추출용매를 처리하여 제조할 수도 있다.

본 발명에서 산약, 포공영 및 형개의 추출물은 용매에 의해 추출된 조(crude)추출물 형태를 이용할 수 있으며, 고순도로 정제하여 사용할 수도 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '추출물'은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 산약, 포공영, 형개의 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 산약, 포공영 및 형개의 추출물에 포함되는 것이다. 본 발명에서 이용되는 산약, 포공영 및 형개 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 산약(Dioscoreae Rhizoma), 포공영(Taraxaci Herba), 형개(Schizonepetae Spica)는 세척 및 건조된 후 각각 일정 중량비로 혼합한 뒤 혼합물 중량(g)의 1-20 배수 부피(ml)의 추출용매에 투입한 후 15-95℃에서 1-48시간 동안 잘 교반시키며 추출한다. 다음으로 추출액을 여과하고 50-65℃에서 감압농축한 뒤, 동결건조하여 분말 상태의 복합 생약 추출물(혼합추출물)을 수득한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 산약, 포공영, 형개를 각각 각 중량(g)의 1-20 배수 부피(ml)의 추출용매에 투입한 후 15-95℃에서 1-48시간 동안 잘 교반시키며 추출한다. 다음으로 각각의 추출액을 여과하고 50-65℃에서 감압농축한 뒤, 동결건조하여 분말 상태의 생약 추출물을 수득한 뒤, 각 생약 추출물을 일정 중량비로 혼합하여 분말 상태의 복합 생약 추출물(혼합추출물)을 수득한다.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 산약, 포공영, 형개를 1:1:1의 중량비로 혼합한 후 중량의 10 배수의 에탄올을 투입한 후 상온에서 8시간 동안 추출한다. 추출액을 50-65℃에서 감압농축한 후, 농축액을 동결 건조하여 산약, 포공영, 형개의 복합 생약 추출물을 얻는다.

본 발명에서 이용되는 상기 산약, 포공영 및 형개의 3종 혼합추출물은 각각 산약, 포공영 및 형개의 생약 추출물을 1-10:1-10:1-10, 1:1-10:1-10, 1-10:1:1-10, 1-10:1-10:1, 1:1:1-10, 1:1-10:1, 또는 1-10:1:1의 중량비로 포함하거나, 1-5:1-5:1-5, 1:1-5:1-5, 1-5:1:1-5, 1-5:1-5:1, 1:1:1-5, 1:1-5:1, 1-5:1:1의 중량비로 포함하거나, 1-4:1-4:1-4, 1:1-4:1-4, 1-4:1:1-4, 1-4:1-4:1, 1:1:1-4, 1:1-4:1, 1-4:1:1의 중량비로 포함하거나, 1-3:1-3:1-3, 1:1-3:1-3, 1-3:1:1-3, 1-3:1-3:1, 1:1:1-3, 1:1-3:1, 1-3:1:1 또는 1:1:1의 중량비로 포함할 수 있다.

본 명세서에 기재된 상기 생약 성분 간의 혼합 비율은 용매가 제거된 고형분 중량(생약 추출물의 혼합물의 경우) 또는 생약 자체의 중량 (혼합 생약의 추출물의 경우)을 기준으로 산정된 것이다.

본 명세서에 사용된 바로서, 두 수치 사이에 기재된 용어 '내지' 또는 '-'는 앞뒤에 기재된 수치를 포함하는 상기 수치 사이 구간을 의미한다.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 유효성분으로 상술한 산약, 포공영 및 형개의 혼합추출물; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.

본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 산약, 포공영 및 형개의 혼합추출물의 호흡기 잘환의 치료 효능 또는 예방 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다. 본 발명은 천연식물재료인 산약, 포공영, 및 형개로부터 추출한 추출물을 포함하는 조성물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물에 포함된 상기 추출물들의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "호흡기 질환"은 감기, 비염, 인두염, 후두염, 인후두염, 급성 또는 만성 폐렴, 급성 또는 만성 기관지염, 천식, 및 만성폐쇄성폐질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 호흡기 질환을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 산약, 포공영 및 형개 복합 생약 추출물(혼합추출물)의 투여는 폐기종 마우스 모델에서 폐조직의 손상을 현저하게 감소시키는 효과를 나타낸다.

또한, 본 발명의 복합 생약 추출물은 미세먼지에 의해 유도된 폐 상피세포주의 활성산소 생성, 세포사멸, 및 노화를 현저하게 억제하고, 텔로미어의 길이를 연장시키는 텔로머레이즈의 발현정도를 농도 의존적으로 증가시킨다.

또한 본 발명의 복합 생약 추출물은 LPS를 처리한 마우스 대식세포주의 NO 생성을 억제하여 우수한 항염증 효과를 나타낸다.

또한 본 발명의 복합 생약 추출물은 LPS를 처리한 마우스 대식세포주가 발현하는 염증인자(IL-6, IL-1β, iNOS)의 발현을 억제하여 우수한 항염증 효과를 나타낸다.

또한 본 발명의 복합 생약 추출물은 LPS를 처리한 마우스 대식세포주에서 항산화 인자인 HO-1의 발현을 증가시켜 우수한 항산화 효과를 나타내며, 다양한 비율로 생약을 포함하는 복합 생약 추출물을 처리하였을 때에도 항산화 인자인 HO-1의 발현을 증가시켜 다양한 생약 비율 범위에서도 우수한 항산화 효과를 나타낸다.

또한, 본 발명의 복합 생약 추출물은 다양한 농도의 추출용매(에탄올)로 추출하였을 때에도 염증인자(iNOS)의 발현을 억제하여 우수한 항염증 효과를 나타내고, 추출용매의 농도 및 종류를 달리하는 경우에도 항산화 인자인 HO-1의 발현을 증가시켜 우수한 항산화 효과를 나타낸다.

뿐만 아니라, 본 발명의 복합 생약 추출물은 단일 생약 추출물과 비교하여 LPS로 유도한 폐염증 마우스 모델의 폐조직에서의 염증인자(IL-6, IL-1β, TNF-α)의 발현을 현저하게 억제하여, 단일 생약 추출물에 비하여 항염증 효과에 있어서 상승적 효과(synergistic effect)를 나타낸다.

위와 같은 실시예의 결과는 본 발명의 복합 생약 추출물을 포함하는 조성물이 폐렴, 기관지염, 만성폐쇄성폐질환, 천식과 같은 염증 및 노화에 따른 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료에 이용될 수 있으며, 종래 호흡기 질환 치료제의 대체제로 이용될 수 있음을 나타내는 것이다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 근육내 투여, 비강내 투여, 점막내 투여, 경막 내 투여, 복강내 투여, 안구내 투여 등으로 투여할 수 있으며, 구체적으로는 경구 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-1000 ㎎/㎏이다. 상기 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 예컨대 0.1-1000 mg/kg, 0.1-900 mg/kg, 0.1-800 mg/kg, 0.1-700 mg/kg, 0.1-600 mg/kg, 0.1-500 mg/kg, 0.1-400 mg/kg, 0.1-300 mg/kg, 0.1-200 mg/kg, 0.1-100 mg/kg, 0.1-50 mg/kg, 0.1-30 mg/kg, 0.1-20 mg/kg, 0.1-10 mg/kg, 0.1-7 mg/kg, 0.1-5 mg/kg 일 수 있고, 1-1000 mg/kg, 1-900 mg/kg, 1-800 mg/kg, 1-700 mg/kg, 1-600 mg/kg, 1-500 mg/kg, 1-400 mg/kg, 1-300 mg/kg, 1-200 mg/kg, 1-100 mg/kg, 1-50 mg/kg, 1-30 mg/kg, 1-20 mg/kg, 1-10 mg/kg, 1-7 mg/kg, 1-5 mg/kg 일 수 있고, 보다 구체적으로는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 mg/kg 일 수 있다. 또한 다른 일 구현예에 있어서, 상기 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 예컨대 100-900 mg/kg, 100-800 mg/kg , 100-700 mg/kg , 100-600 mg/kg, 100-500 mg/kg, 100-400 mg/kg, 100-300 mg/kg, 100-200 mg/kg 일 수 있고, 200-900 mg/kg, 200-800 mg/kg , 200-700 mg/kg , 200-600 mg/kg, 200-500 mg/kg, 200-400 mg/kg, 200-300 mg/kg 일 수 있고, 300-900 mg/kg, 300-800 mg/kg, 300-700 mg/kg , 300-600 mg/kg, 300-500 mg/kg, 300-400 mg/kg 일 수 있고, 400-900 mg/kg, 400-800 mg/kg , 400-700 mg/kg , 400-600 mg/kg, 400-500 mg/kg 일 수 있고, 보다 구체적으로는 100 mg/kg, 200 mg/kg, 300 mg/kg, 400 mg/kg, 500 mg/kg, 600 mg/kg, 700 mg/kg, 800 mg/kg, 900 mg/kg, 또는 1000 mg/kg 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 호흡기 질환 또는 호흡기 질환 관련 증상의 예방 및 치료의 효과를 가지는 공지의 화합물 또는 약제학적 조성물과 병행하여 투여할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 산약(Dioscoreae Rhizoma), 포공영(Taraxaci Herba) 및 형개(Schizonepetae Spica)의 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품 조성물은 건강기능 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 식품 조성물을 포함하는 건강기능 식품을 제공한다. 상기 건강기능 식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 또는 건강보조식품류일 수 있다.

상기 식품 조성물에 함유된 본 발명의 혼합추출물의 함량은 식품의 형태, 소망하는 용도 등에 따라 적절하게 조절될 수 있고 특별한 제한이 없다. 예컨대, 혼합추출물의 함량은 전체 식품 중량의 0.001 내지 30 중량% 또는 0.01 내지 20 중량%일 수 있고, 건강 음료 조성물의 경우 100 ml을 기준으로 0.001 내지 15 g, 0.02 내지 10 g, 또는 0.3 내지 1 g일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 산약(Dioscoreae Rhizoma), 포공영(Taraxaci Herba) 및 형개(Schizonepetae Spica)의 혼합추출물을 포함하는 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 상기 추출물 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 상기 첨가 성분은 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등)] 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 상기 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 호흡기 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물은 상술한 "호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물"과 동일하게 유효성분으로서 산약, 포공영 및 형개의 혼합추출물을 포함하기 때문에, 양 발명 간에 공통된 사항은 본 명세서의 과도한 중복성을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

또한 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 산약, 포공영 및 형개의 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 대상체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 산약, 포공영 및 형개의 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 대상체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선방법을 제공한다.

본 발명의 치료방법, 또는 개선방법의 대상 질병인 호흡기 질환은 상기 약제학적 조성물의 치료 대상 질병인 호흡기 질환과 관련하여 정의한 것과 같다.

본 명세서에서 사용된 용어, "투여" 또는 "투여하다"는 본 발명의 조성물의 치료적, 또는 개선적 유효량을 호흡기 질환을 겪는 대상체(개체)에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.

상기 조성물의 "치료적 유효량"은 조성물을 투여하고자 하는 대상체에게 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 조성물의 함량을 의미하며, 이에 "예방적 유효량"을 포함하는 의미이다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어, "대상체"는 인간, 마우스, 랫트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 및 붉은털 원숭이 등을 포함하는 포유류이다. 가장 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.

본 발명의 상기 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료방법은, 본 발명의 일 양태인 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 또는 예방 또는 개선용 식품조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서의 과도한 중복성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 산약, 포공영, 및 형개의 혼합추출물을 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

(b) 본 발명의 산약, 포공영 및 형개의 혼합 추출물을 포함하는 조성물은 호흡기 질환의 예방 및 증상을 개선하는 효과가 있고, 폐조직의 손상을 회복할 뿐만 아니라 미세먼지에 의해 유도되는 염증, 산화적 스트레스 및 노화 작용을 억제하는 효능이 있다. 특히 본 발명의 조성물은 텔로미어의 길이를 연장하는 텔로머레이즈의 발현을 증가시킴으로써 종래의 증상 완화제와 달리 미세먼지에 의해 유도되는 퇴행성 호흡기 질환을 근본적으로 치료할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 복합 생약 추출물의 폐 조직 손상 억제 효과를 확인하기 위하여 PPE로 유도한 폐기종 마우스 모델의 폐 조직을 현미경으로 관찰하여 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 복합 생약 추출물의 활성산소(reactive oxygen species, ROS) 생성에 대한 억제 효능을 확인하기 위하여 미세먼지에 의해 유도된 폐 상피세포주의 활성산소 생성 정도를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 복합 생약 추출물의 세포 사멸 억제 효능을 확인하기 위하여 미세먼지를 처리한 폐 상피세포주의 복합 생약 추출물의 처리 농도별(100, 200, 400, 800 μg/ml) 세포생존율을 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 복합 생약 추출물의 항노화 효능을 확인하기 위하여 폐 상피세포주에 미세먼지를 처리한 후 β-갈락토시다제의 염색(senescence beta-galactosidase staining) 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 복합 생약 추출물의 항노화 효능을 확인하기 위하여 폐 상피세포주의 복합 생약 추출물 처리 농도별(100, 200 μg/ml) 텔로머레이즈 발현 정도를 웨스턴 블롯으로 비교하여 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 복합 생약 추출물의 항염증 효능을 확인하기 위하여 LPS를 처리한 마우스 대식세포주의 NO(Nitric Oxide) 생성 정도를 복합 생약 추출물의 처리 농도별(0.5, 1, 2, 4 mg/ml)로 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 7a 내지 도 7c는 본 발명의 복합 생약 추출물의 항염증 효능을 확인하기 위하여 LPS를 처리한 마우스 대식세포주의 염증인자(IL-6, IL-1β, 및 iNOS) 발현에대한 본 발명의 복합 생약 추출물의 발현 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 복합 생약 추출물의 항산화 효능을 확인하기 위하여 LPS를 처리한 마우스 대식세포주에서 항산화 인자인 HO-1의 발현량을 복합 생약 추출물의 처리 농도별(0, 0.5, 1, 2 mg/ml)로 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 복합 생약 추출물의 혼합비율에 따른 항산화 효능을 확인하기 위하여 LPS를 처리한 마우스 대식세포주에서 항산화 인자인 HO-1의 발현량을 다양한 생약 비율별로 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 복합 생약 추출물의 추출방법(열수 추출) 및 추출 용매(에탄올)의 농도에 따른 항염증 및 항산화 효능을 확인하기 위하여 LPS를 처리한 마우스 대식세포주에서 염증인자(iNOS)의 발현량 및 항산화 인자인 HO-1의 발현량을 추출방법(열수 추출, 0%) 및 추출용매(에탄올)의 농도별(25, 50, 70, 90%)로 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 11a 내지 도 11c는 단일 및 복합 생약 추출물의 폐 염증 억제 효능을 확인하기 위하여 LPS로 유도한 폐 염증 마우스 모델에서 단일 생약 추출물(산약, 포공영, 형개)과 복합 생약 추출물 처리에 따른 염증 인자(IL-1β, IL-6 및 TNF-α)의 발현량을 비교하여 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

제조예

제조예 1: 복합 생약 추출물(혼합추출물)의 제조

세척 및 건조된 산약(Dioscoreae Rhizoma), 포공영(Taraxaci Herba), 형개(Schizonepetae Spica)를 실험에 사용하였다. 상기 산약, 포공영, 형개 생약을 1:1:1의 중량비로 총 60 g이 되도록 혼합한 뒤 10배의 25%(v/v) 에탄올 수용액을 가하여 상온에서 8시간 동안 잘 교반시키며 추출하였다. 추출액을 여과하고 50-65℃에서 감압농축한 뒤, 동결건조하여 분말 상태의 복합 생약 추출물(혼합추출물)을 수득하였다. 수율은 약 12~13%였다.

제조예 2: 생약 혼합비율별 복합 생약 추출물(혼합추출물)의 제조

세척 및 건조된 산약(Dioscoreae Rhizoma), 포공영(Taraxaci Herba), 형개(Schizonepetae Spica)를 실험에 사용하였다. 상기 산약, 포공영, 형개의 생약을 표1에 기재된 중량비(w/w)로 총 30 g이 되도록 혼합한 뒤 10배의 25%(v/v) 에탄올 수용액을 가하여 상온에서 8시간 동안 잘 교반시키며 추출하였다. 추출액을 여과하고 50-65℃에서 감압농축한 뒤, 동결건조하여 총 7가지 종류의 복합 생약 추출물 분말을 수득하였고, 이들의 수율은 표 1과 같다.

분류	산약	포공영	형개	수율(%)
제조예 2-1	1	1	1	11.95
제조예 2-2	2	1	1	13.17
제조예 2-3	4	1	1	14.81
제조예 2-4	1	2	1	11.84
제조예 2-5	1	4	1	10.83
제조예 2-6	1	1	2	10.49
제조예 2-7	1	1	4	10.27

제조예 3: 다양한 추출 용매(에탄올) 농도별 복합 생약 추출물(혼합추출물)의 제조

세척 및 건조된 산약(Dioscoreae Rhizoma), 포공영(Taraxaci Herba), 형개(Schizonepetae Spica)를 실험에 사용하였다. 상기 산약, 포공영, 형개의 생약을 제조예 2-1의 중량비(w/w)로 총 30 g이 되도록 혼합한 뒤 10배의 25, 50, 70, 90% 에탄올 수용액을 가하여 상온에서 8시간 동안 잘 교반시키며 추출하였다. 추출액을 여과하고 50-65℃에서 감압농축한 뒤, 동결건조하여 총 4가지 종류의 복합 생약 추출물 분말을 수득하였고, 이들의 수율은 표2과 같다.

분류	에탄올 수용액의 농도(%)	수율(%)	비고
제조예 3-1	25	12.37	제조예 2-1과 동일한 제조방법
제조예 3-2	50	13.71	-
제조예 3-3	70	9.84	-
제조예 3-4	90	5.23	-

제조예 4: 열수 추출을 통한 복합 생약 추출물(혼합추출물)의 제조

세척 및 건조된 산약(Dioscoreae Rhizoma), 포공영(Taraxaci Herba), 형개(Schizonepetae Spica)를 실험에 사용하였다. 상기 산약, 포공영, 형개의 생약을 제조예2-1의 중량비(w/w)로 총 30 g이 되도록 혼합한 뒤 10배의 증류수를 가하여 90℃의 온도에서 3시간 동안 환류추출하였다. 추출액을 여과하고 50-65℃에서 감압농축한 뒤, 동결건조하여 복합 생약 추출물 분말을 수득하였고, 이의 수율은 약 13.30%이다.

비교예 1 : 단일 생약 추출물의 제조

세척 및 건조된 산약(Dioscoreae Rhizoma), 포공영(Taraxaci Herba), 형개(Schizonepetae Spica)를 실험에 사용하였다. 상기 산약, 포공영, 형개의 각 생약 30g에 10배의 25%(v/v) 에탄올 수용액을 가하여 상온에서 8시간 동안 잘 교반시키며 추출하였다. 추출액을 여과하고 50-65℃에서 감압농축한 뒤, 동결건조하여 총 3가지 종류의 단일 생약 추출물 분말을 수득하였고, 이들의 수율은 표3과 같다.

분류	생약의 종류	수율(%)
비교예 1-1	산약	19.86
비교예 1-2	포공영	12.52
비교예 1-3	형개	7.84

실험예

실험예 1: PPE로 유도한 폐기종 마우스 모델에서 복합 생약 추출물의 폐조직 손상 억제 효능

제조예 1에서 준비한 본 발명의 복합 생약 추출물의 폐조직 손상 억제 효능을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

7주령 웅성 C57BL/6 마우스(라온바이오, 대한민국)를 일주일 이상 순화 사육한 후, (1) 정상군, (2) 폐기종 유도 및 복합 생약 추출물 투여군(실험군) (3) 폐기종 유도 및 증류수 투여군(음성대조군)으로 분류하였다. 실험군과 음성대조군의 폐기종을 유도하기 위해 돼지 췌장 엘라스타제(porcine pancreatic elastase, PPE, Millipore, USA) 1U를 마우스의 기관 내 단회 점적 투여 하였다. 정상군의 경우, PBS(phosphate buffered saline)를 마우스의 기관 내 단회 점적 투여 하였다.

실험군에는 증류수에 녹인 복합 생약 추출물을 PPE 투여 1주 전부터, 2주간 200 mg/kg의 용량으로 1회/일 경구투여 하였다. 정상군 및 음성대조군에는 증류수만을 경구 투여하였다. 복합 생약 추출물 또는 증류수의 마지막 투여 후 마우스를 이산화탄소로 마취하여 폐조직을 적출하였다. 적출한 폐조직을 포르말린에 고정하여 H&E 염색(hematoxylin and eosin staining)을 수행하였다. 광학현미경(X100)으로 폐조직을 관찰하여 촬영한 사진을 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, PPE로 폐기종을 유도한 결과, 음성대조군의 폐포 확장 및 폐 조직의 손상은 정상군에 비하여 2.2배 가량 유의미하게 증가하였다. 또한 본 발명의 복합 생약 추출물을 투여한 실험군에서는 폐 조직의 손상이 폐기종 유도군(음성대조군)에 비해 억제되었다.

따라서 본 발명의 복합 생약 추출물은 폐기종 마우스 모델에서 폐 조직의 손상을 억제하는 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 미세먼지에 의해 유도된 폐 상피세포주의 활성산소 생성에 대한 복합 생약 추출물의 억제 효능

제조예 1에서 준비한 본 발명의 복합 생약 추출물의 활성산소 생성 억제 효능을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

사람의 폐 상피세포주인 NCI-H292 세포(ATCC, USA)를 10%의 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함하는 RPMI 배지(Corning, USA)를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 상기 세포를 웰당 1x10⁴ 세포수로 96웰-블랙 플레이트에 준비하고 24시간 동안 안정화 시켰다. 안정화 후, 세포의 상등액을 제거하고 제조예 1의 복합 생약 추출물을 100 μg/mL의 농도로 처리한 후 1시간 동안 배양하였다. 다음으로 상기 세포에 미세먼지(particulate matter 10, PM10) (NIST, USA) 200 μg/mL를 추가로 처리하였다(실험군). 정상군에는 복합 생약 추출물 및 미세먼지를 모두 처리하지 않았고, 음성대조군에는 미세먼지만 처리하였다. 3시간 후, 상기 세포에서의 활성산소의 생성량을 DCF-DA 분석법(시그마 알드리치, USA)을 사용하여 확인하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 미세먼지 유도군(음성대조군)은 정상군 대비 활성산소가 약 125% 증가하였으며, 이는 복합 생약 추출물에 의해 약 61% 억제되었다. 따라서 본 발명의 복합 생약 추출물은 우수한 항산화 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실험예 3. 미세먼지에 의해 유도된 세포사멸에 대한 복합 생약 추출물의 억제 효능

실험예 2와 마찬가지로, NCI-H292 세포를 웰당 1x10⁴ 세포수로 96웰-플레이트에 준비하고 안정화시켰다. 24시간 후, 세포의 상등액을 제거한 후 제조예 1의 복합 생약 추출물을 각각 100, 200, 400, 800 μg/mL의 농도로 처리하였다. 1시간 후 미세먼지(PM10) 50 μg/mL을 상기 세포에 추가로 처리하였다. 정상군에는 복합 생약 추출물 및 미세먼지를 모두 처리하지 않았고, 음성대조군에는 미세먼지만 처리하였다. 24시간 후, 세포의 생존율을 WST-1 검사법(영인프런티어, 대한민국)을 통해 확인하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 폐 상피세포에 미세먼지를 처리한 결과, 세포 사멸에 의해 세포 생존율이 정상군 대비 약 63.6%로 나타났다(음성대조군). 반면 100, 200, 400, 800 μg/mL 농도로 복합 생약 추출물을 처리한 실험군의 경우, 각각 67.5%, 69.9%, 77.2%, 89%의 세포 생존율을 보여 농도 의존적으로 세포사멸이 억제되었다. 따라서 본 발명의 복합 생약 추출물은 우수한 세포사멸 억제 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실험예 4. 미세먼지에 의해 유도된 폐 상피세포주의 세포노화에 대한 복합 생약 추출물의 항노화 효능

실험예 2와 같이, NCI-H292 세포를 웰당 1x10⁴ 세포수로 96웰-플레이트에 준비하고 안정화시켰다. 24시간 후, 세포의 상등액을 제거한 후 제조예 1의 복합 생약 추출물을 200 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 1시간 후, 상기 세포에 미세먼지(PM10) 50 μg/mL을 추가로 처리하였다. 정상군에는 복합 생약 추출물 및 미세먼지를 모두 처리하지 않았고, 음성대조군에는 미세먼지만 처리하였다. 5일 후, 상기 세포를 포르말린으로 고정한 후 β-갈락토시다제 염색(senescence beta-galactosidase staining)을 통해 세포의 노화 정도를 확인하였다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 복합 생약 추출물을 처리한 실험군에서는 미세먼지 처리에 의해 유발되는 세포 노화가 음성대조군에 비해 현저하게 감소하였다. 따라서 본 발명의 복합 생약 추출물은 우수한 항노화 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실험예 5. 복합 생약 추출물의 폐 상피세포주에 대한 텔로머레이즈 발현 증가 효능(항노화 효능)

NCI-H292 세포를 1x10⁶ 세포수로 100 파이(φ) 플레이트에 준비하고 안정화시켰다. 24시간 후, 상기 세포에 제조예 1의 복합 생약 추출물을 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 24시간 후에 상기 세포를 수거하여, 단백질을 추출한 후 텔로머레이즈의 촉매 소단위인 hTERT(human telomerase reverse transcriptase)의 항체(ab32020, Abcam, USA)를 사용하여 웨스턴 블롯 실험을 수행하였다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 폐 상피세포주에 복합 생약 추출물을 100, 200 ㎍/㎖ 농도로 처리한 결과, hTERT의 발현이 미처리군(대조군)에 비해 각각 1.6배, 2.2배로 농도 의존적으로 증가하였다. 따라서 본 발명의 복합 생약 추출물은 우수한 항노화 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실험예 6. LPS에 의해 유도된 대식세포주의 NO(Nitric Oxide) 생성에 대한 복합 생약 추출물의 억제 효능(항염증 효능)

마우스의 대식세포주인 Raw264.7 세포(ATCC, USA)를 10%의 FBS가 포함되어 있는 RPMI 배지(Invitrogen, USA)을 이용하여, 37℃ 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 상기 세포를 웰 당 2.5x10⁵ 세포수로 24웰-플레이트에 준비하고 안정화시켰다. 24시간 후, 세포의 상등액을 제거한 후 제조예 1의 복합 생약 추출물을 상기 세포에 0.5, 1, 2, 4 mg/mL의 농도로 처리하였다. 1시간 후 LPS 100 ng/mL을 상기 세포에 추가로 처리하였다. 24시간 후 세포의 상등액을 수거하여, NO의 생성 변화를 측정하기 위한 그리스 분석(Griess test)을 실시하였으며, NaNO₂ (Sodium Nitrite)의 농도별 표준곡선을 이용하여 NO의 농도를 산출하였다(도 6).

도 6에 나타낸 바와 같이, LPS의 처리에 의해 대식세포에서 염증인자 NO의 생성이 12 μM 수준으로 증가하였다(음성대조군). LPS 처리와 함께 복합 생약 추출물을 0.5, 1, 2, 4 mg/ml 농도로 처리한 실험군에서는 NO의 농도가 각각 13.6, 9.4, 3.6, 3 μM 으로 나타나 농도의존적인 감소를 나타내었다. 따라서 본 발명의 복합 생약 추출물은 우수한 항염증 효능을 나타냄을 알 수 있었다.

실험예 7. LPS에 의해 유도된 대식세포주의 염증인자 발현에 대한 복합 생약 추출물의 억제 효능(항염증 효능)

마우스의 대식세포주인 Raw264.7 세포(ATCC, USA)를 10%의 FBS가 포함되어 있는 RPMI 배지(Invitrogen, USA)을 이용하여, 37℃ 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 상기 세포를 웰 당 2.5x10⁵ 세포수로 24웰-플레이트에 준비하고 안정화시켰다. 24시간 후, 세포의 상등액을 제거한 후 상기 세포에 LPS (Sigma, US) 100 ng/mL과 제조예 1의 복합 생약 추출물을 0.5, 1, 2 mg/mL의 농도로 처리하였다. 24시간 후 세포의 상등액을 제거한 후, 세포로부터 TRIzol(Invitrogen, USA)을 사용하여 RNA를 분리하였다. 그 후 RT-PCR을 수행하여 얻은 cDNA를 사용하여 IL-6, IL-1β, 및 iNOS 염증 인자들에 특이적인 프라이머와 SYBR green 프로브(Takara, Japan)를 이용한 qPCR을 수행하였다. qPCR로부터 얻은 RNA의 발현 변화 값은 GAPDH mRNA를 표준 유전자로 하여 무처리군 대비 상대적인 변화량으로 표시하였다(도 7a 내지 도 7c). 시험에 사용된 마우스 유전자에 대한 프라이머 서열은 표 4에 나타내었다.

유전자	방향	염기서열(5' to 3')	서열번호(SEQ ID NO)
GAPDH	정방향	AGCCTCGTCCCGTAGACAA	1
GAPDH	역방향	AATCTCCACTTTGCCACTGC	2
IL-6	정방향	TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC	3
IL-6	역방향	TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC	4
IL-1β	정방향	TGTGCAAGTGTCTGAAGCAGC	5
IL-1β	역방향	TGGAAGCAGCCCTTCATCTT	6
iNOS	정방향	CGAAACGCTTCACTTCCAA	7
iNOS	역방향	TGAGCCTATATTGCTGTGGCT	8

도 7a 내지 도 7c에 나타낸 바와 같이, LPS의 처리에 의해 Raw264.7 대식세포에서 염증 인자 IL-6, IL-1β, 및 iNOS의 생성이 유의미하게 증가하였으며(음성대조군), LPS 처리와 함께 제조예 1의 3종 복합 생약 추출물을 0.5, 1, 2 mg/ml 농도로 처리한 실험군에서는 IL-6, IL-1β, iNOS의 발현량이 모두 농도의존적으로 유의미한 감소를 나타내었다. 따라서 본 발명의 3종 복합 생약 추출물은 우수한 항염증 효능을 나타냄을 알 수 있었다.

실험예 8. LPS 처리된 대식세포주에서 복합 생약 추출물의 항산화 인자 발현 증가 효능(항산화 효능)

본 발명자들은 LPS에 의해 유도된 대식세포주에서 본 발명의 복합 생약 추출물이 항산화 인자인 HO-1 (heme oxygenase-1)의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, HO-1 유전자에 특이적인 프라이머와 SYBR green 프로브(Takara, Japan)를 이용하여 qPCR을 수행한 점을 제외하고는 실험예 7과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. qPCR 결과로부터 얻은 RNA의 발현 변화 값은 GAPDH mRNA를 표준 유전자로 하여 무처리군 대비 상대적인 변화량으로 표시하였다(도 8). 시험에 사용된 마우스 유전자에 대한 프라이머 서열은 표 5에 나타내었다.

유전자	방향	염기서열(5' to 3')	서열번호(SEQ ID NO)
GAPDH	정방향	AGCCTCGTCCCGTAGACAA	1
GAPDH	역방향	AATCTCCACTTTGCCACTGC	2
HO-1	정방향	CAGGTGATGCTGACAGAGGA	9
HO-1	역방향	GAGAGTGAGGACCCACTGGA	10

도 8에 나타낸 바와 같이, LPS 처리와 함께 제조예 1의 복합 생약 추출물을 0.5, 1, 2 mg/ml 농도로 처리한 실험군에서는 HO-1의 발현량이 농도의존적으로 유의미한 증가를 나타내었다. 따라서 본 발명의 복합 생약 추출물은 우수한 항산화 효능을 나타냄을 알 수 있었다.

실험예 9. LPS 처리된 대식세포주에서 생약 비율별 복합 생약 추출물의 항산화 인자 발현 증가 효능(항산화 효능)

LPS에 의해 유도된 Raw264.7 대식세포주에서 제조예 2의 혼합비율별 복합 생약 추출물의 항산화 효능을 확인하기 위하여, HO-1 유전자에 특이적인 프라이머와 SYBR green 프로브(Takara, Japan)를 이용하여 qPCR을 수행하였다. 세부 실험 과정은 실험예 8과 동일하게 수행하였으며, 시험에 사용된 마우스 유전자에 대한 프라이머 서열은 표 5와 같았다.

도 9에 나타낸 바와 같이, LPS 처리와 함께 제조예 2의 복합 생약 추출물들을 2 mg/ml 농도로 처리한 실험군 모두에서 항산화 인자인 HO-1의 발현량이 유의미하게 증가하여 우수한 항산화 효능을 나타냄을 알 수 있었다.

실험예 10. LPS 처리된 대식세포주에서 추출 용매(에탄올) 농도별 복합 생약 추출물의 항염증 및 항산화 효능

LPS 처리된 대식세포주에서, 제조예 3의 추출 용매(에탄올) 농도별 복합 생약 추출물 및 제조예 4의 열수 복합 생약 추출물의 항염증 및 항산화 효능을 확인하기 위하여, iNOS, HO-1 유전자에 특이적인 프라이머와 SYBR green 프로브(Takara, Japan)를 이용하여 qPCR을 수행하였다. 각 추출물은 2 mg/ml의 농도로 처리하였다. 세부 실험 과정은 실험예 7 및 실험예 8과 동일하게 수행하였으며, 시험에 사용된 마우스 유전자에 대한 프라이머 서열은 표 4 및 표 5에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 제조예 3에서 제조한 추출 용매(에탄올) 농도별 복합 생약 추출물은 LPS 처리에 의해 증가된 iNOS의 발현을 유의미하게 감소하여 우수한 항염증 효능을 나타냄을 알 수 있었다. 또한 제조예 3 및 제조예 4의 복합 생약 추출물들 모두 항산화 인자인 HO-1의 발현량을 유의미하게 증가시켜 우수한 항산화 효능을 나타냄을 알 수 있었다.

실험예 11. LPS로 유도한 폐 염증 마우스 모델에서 단일 생약 추출물과 복합 생약 추출물의 항염증 효능

단일 및 복합 생약 추출물의 폐 염증 억제 효능을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 7주령 웅성 C57BL/6 마우스(라온바이오, 대한민국)를 일주일 이상 순화 사육한 후, (1) 정상군, (2) LPS 유도 및 증류수 투여군(음성대조군), (3)~(5) LPS 유도 및 단일 생약 추출물 투여군, (6) LPS 유도 및 복합 생약 추출물 투여군으로 분류하였다.

(3)~(6)의 실험군에는 증류수에 녹인 제조예 1의 복합 생약 추출물 및 비교예 1의 3종의 단일 생약 추출물을 각 500 mg/kg의 용량으로 5일간 1회/일 경구 투여 하였으며, 정상군 및 음성대조군에는 증류수만을 경구 투여 하였다.

실험군과 음성대조군의 급성 폐 염증 반응 유도는 실험 종료 24시간 전에 50 μl의 PBS(phosphate buffered saline)에 녹인 LPS(Sigma, US) 50 μg 을 마우스 기관 내 단회 점적 투여하는 방법으로 시행하였다. 정상군의 경우, PBS(phosphate buffered saline)를 마우스의 기관 내 단회 점적 투여하였다.

생약 추출물 또는 증류수의 마지막 투여 후, 마우스를 이산화탄소로 희생시킨 후, 폐조직을 분리하여 TRIzol(Invitrogen, USA)를 이용해 RNA를 추출하였다. 그 후 RT-PCR을 수행하여 얻은 cDNA를 사용하여 염증인자인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α에 특이적인 프라이머와 SYBR green 프로브(Takara, Japan)를 이용한 qPCR을 수행하였다. qPCR로부터 얻은 RNA의 발현 변화 값은 GAPDH mRNA를 표준 유전자로 하여 무처리군 대비 상대적인 변화량으로 표시하였다. 시험에 사용된 마우스 유전자에 대한 프라이머 서열은 표 6에 나타내었다.

유전자	방향	염기서열(5' to 3')	서열번호(SEQ ID NO)
GAPDH	정방향	AGCCTCGTCCCGTAGACAA	1
GAPDH	역방향	AATCTCCACTTTGCCACTGC	2
IL-6	정방향	TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC	3
IL-6	역방향	TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC	4
IL-1β	정방향	TGTGCAAGTGTCTGAAGCAGC	5
IL-1β	역방향	TGGAAGCAGCCCTTCATCTT	6
TNF-α	정방향	AAGCCTGTAGCCCACGTCGTA	11
TNF-α	역방향	GGCACCACTAGTTGGTTGTCTTTG	12

도 11a 내지 도 11c에 나타낸 바와 같이, LPS에 의해 폐조직 내 염증인자인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 발현이 증가되었다. 3종의 단일 생약 추출물을 각각 투여한 경우 음성대조군과 유사한 정도의 염증 인자들의 발현을 보였다. 반면 복합 생약 추출물의 경우 음성대조군 대비 유의한 수준으로 염증 인자들의 발현을 감소시켜 항염증 효능에 있어서 상승적 효과(synergistic effect)를 나타내었다.

<110> VIROMED CO., LTD. <120> Herbal Composition for Preventing or Treating Respiratory Disease <130> PN180062P <150> KR 10-2018-0031150 <151> 2018-03-16 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for GAPDH <400> 1 agcctcgtcc cgtagacaa 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for GAPDH <400> 2 aatctccact ttgccactgc 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for IL-6 <400> 3 ttggtcctta gccactcctt c 21 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for IL-6 <400> 4 tagtccttcc taccccaatt tcc 23 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for IL-1beta <400> 5 tgtgcaagtg tctgaagcag c 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for IL-1beta <400> 6 tggaagcagc ccttcatctt 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for iNOS <400> 7 cgaaacgctt cacttccaa 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for iNOS <400> 8 tgagcctata ttgctgtggc t 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for HO-1 <400> 9 caggtgatgc tgacagagga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for HO-1 <400> 10 gagagtgagg acccactgga 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for TNF-alpha <400> 11 aagcctgtag cccacgtcgt a 21 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for TNF-alpha <400> 12 ggcaccacta gttggttgtc tttg 24

Claims

(a) 유효성분으로 산약(Dioscoreae Rhizoma), 포공영(Taraxaci Herba) 및 형개(Schizonepetae Spica)의 혼합추출물; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 유기용매, 물 또는 이들의 혼합용매로 추출된 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 유기용매는 C1 내지 C6의 저급 알코올, 석유 에테르, 헥산, 벤젠, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에테르, 에틸아세테이트, 및 아세톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 감기, 비염, 인두염, 후두염, 인후두염, 폐렴, 급성 또는 만성 기관지염, 천식, 및 만성폐쇄성폐질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 호흡기 질환인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
산약(Dioscoreae Rhizoma), 포공영(Taraxaci Herba) 및 형개(Schizonepetae Spica)의 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제 5 항의 식품 조성물을 유효성분으로 포함하는 건강기능 식품.