CN105748979B - 一种抗rsv病毒的中药复方提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗RSV病毒的中药复方提取物及其制备方法和用途，所述中药复方提取物包括金银花提取物、蒲公英提取物、大青叶提取物、板蓝根提取物、赤勺提取物、秦艽提取物、荆芥提取物、淡竹叶提取物、甘草、薄荷和连翘。所述中药复方提取物具有良好的抗RSV病毒性能，从而可以用来治疗和/或预防因RSV病毒导致的各种呼吸道疾病，在临床上具有广阔的研究价值和应用前景。

Description

一种抗RSV病毒的中药复方提取物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种中药活性成分及其制备方法和用途，更具体地涉及一种抗RSV病毒的中药复方提取物及其制备方法和用途，属于中药提取及应用技术领域。
背景技术
经过研究发现，呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV病毒)是婴幼儿下呼吸道感染的最主要的病原，也老年人以及免疫缺陷人群下呼吸道感染的主要因素。在该感染中，RSV主要损伤细支气管上皮细胞，导致小气道障碍、过度充气以及肺不张，可引起间质性肺炎及毛细支气管炎。
为了控制该病毒，疫苗通常是最有效的预防手段。然而，RSV疫苗的研制已有40多年的历史，尤其是近年对RSV亚单位疫苗的研究已取得较大进展，但由于存在RSV疫苗导致Th1/Th2平衡紊乱等问题，目前仍然没有研发出有效RSV疫苗。
因此，获得高效低毒的抗RSV药物成为防治该病毒扩散传播的主要任务。但迄今为止，也没有专门针对RSV感染的有效治疗药物，虽然广谱抗病毒药物利巴韦林是唯一可应用于RSV的小分子化学药物，由于存在作用机制不明、疗效不显著和毒副作用等问题，其在临床上的应用十分有限，而抗体药物RSV中和抗体起不到治疗作用，仅可以用于预防，很难普及应用。
随着研究的深入和技术的进展，目前已有为数不多的专门针对RSV感染的候选药物处于临床试验阶段，包括抑制RSV包膜与宿主细胞膜融合过程的小分子药物GS-5806、siRNA药物ALN-RSV01、核苷抑制剂ALS-8176和N蛋白抑制剂RSV604等，但前景并不明朗。
此外，人们仍对该病毒的有效抑制和/或防治进行了大量的深入研究，并取得了一定的成果，例如：
WO2006097534A公开了一种作为呼吸道合胞病毒复制抑制剂的1,3-二氢-苯并咪唑-2-亚基胺类化合物，该化合物可以有效抑制RSV病毒，具有良好的生物活性和应用前景。
WO2006136562A公开了一种可作为RSV复制抑制剂的杂环基氨基烷基取代的苯并咪唑及其合成方法，该化合物可用来抑制RSV复制，从而可治疗呼吸道疾病。
CN10126323A公开了一种呼吸道合胞病毒疫苗、制备方法和应用，可用于人体或动物预防接种，抵抗呼吸道合胞病毒的感染。所述呼吸道合胞病毒亚单位疫苗，含有截短的呼吸道合胞病毒RSV膜蛋白G。进一步还含有无毒型大肠杆菌热不稳定肠毒素LT佐剂。疫苗是截短的呼吸道合胞病毒RSV膜蛋白G包含原G蛋白上aa130-230之间的氨基酸，并且将aa182-186之间的氨基酸CAWIC替换为RSV M蛋白上的氨基酸YLEKESIYY(CTL表位)，形成G蛋白，对预防人类呼吸道合胞病毒的感染具有重要的现实意义。
CN101850043A公开了一种白颖苔草在制备抗呼吸道合胞病毒的药物中的应用：经实验证明，白颖苔草对HSV-1、HSV-2、HCMV、RSV等均有显著的抑制作用，这提示白颖苔草在治疗多种病毒感染性疾病领域存在潜在的应用价值，对疱疹科病毒(HSV-1、HSV-2、HCMV)感染性疾病的治疗意义尤为重大，为白颖苔草临床用于治疗病毒感染性疾病提供实验依据，对研制抗HSV-1、HSV-2、HCMV病毒的药物提供了一定的指导意义，具有重要的参考价值。
CN103550596A公开了一种安儿宁颗粒在制备治疗病毒性肺炎药物中的应用，其中所述的安儿宁颗粒由下述原料药组成：红花53.3重量份、白檀香66.7重量份、甘草53.3重量份、高山辣根菜53.3重量份、岩白菜53.3重量份、天竺黄66.7重量份、短管兔儿草66.7重量份、唐古特乌头66.7重量份、人工牛黄5.3重量份。该安儿宁颗粒对呼吸道合胞病毒、流感病毒引起的病毒性肺炎疗效显著，能够显著降低肺指数，且呈量效关系。安儿宁颗粒还可保护呼吸道合胞病毒(RSV)造成的实验动物死亡，并且对于RSV引起的脾指数、胸腺指数降低有显著的抑制作用，表明安儿宁颗粒也能降低病毒性肺炎造成的动物死亡，显著保护实验动物的免疫功能。
CN103623076A公开了一种金莲花提取物在制备治疗病毒性疾病药物中的应用。所述金莲花提取物的纯度为：金莲花提取物总黄酮含量大于50％。所述的金莲花提取物，是从含有该成分的植物、中药材及中药饮片中提取出来的，其可以制备治疗呼吸道合胞病毒RSV药物，做为一个天然的抗病毒剂，具有无成瘾性、用量小的特点。
CN105078934A公开了一种白皮杉醇在制备抑制细菌和/或病毒感染的药物中的应用，其证明白皮杉醇对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌有抗菌作用；对甲型流感病毒和RSV有抑制作用，效果优于白藜芦醇。
如上所述，虽然现有技术中公开了多种可用来防治RSV的化合物或中药抗病毒剂，但对于新型的、可用来治疗RSV引发的呼吸道疾病的中药复方提取物及其制备方法仍存在继续研究的必要，这一方面可以充分利用中药的安全、无毒副作用等特点，另一方面还可以进一步挖掘和拓展中药的应用领域和潜力，从而在实际治疗和工业化生产中具有良好的应用潜力和价值。所有的这些，都是本发明得以完成的动力所在和基础所倚。
发明内容
为获得治疗RSV疾病的新型中药复方提取物及其制备方法和应用，本发明人对此进行了大量的深入研究，在付出了充分的创造性劳动后，从而完成了本发明。
本发明主要涉及一种抗RSV病毒的中药复方提取物及其制备方法和用途，更具体而言，主要涉及如下几个方面。
第一个方面，本发明涉及一种抗RSV病毒的中药复方提取物，所述中药复方提取物包括金银花提取物、蒲公英提取物、大青叶提取物、板蓝根提取物、赤勺提取物、秦艽提取物、荆芥提取物、淡竹叶提取物、甘草、薄荷和连翘。
需要注意的是，在本发明的所述中药复方提取物中，涉及组成的所有“包括”，既包含了开放式的“包括”、“包含”等及其类似含义，也包含了封闭式的“由…组成”等及其类似含义。
在本发明的所述中药复方提取物中，以重量份计，所述中药复方提取物的具体组分含量如下：
在本发明的所述中药复方提取物中，所述金甘草、薄荷和连翘的形式，以及制备所述“金银花提取物、蒲公英提取物、大青叶提取物、板蓝根提取物、赤勺提取物、秦艽提取物、荆芥提取物、淡竹叶提取物”所使用的“金银花、蒲公英、大青叶、板蓝根、赤勺、秦艽、荆芥和淡竹叶”的形式都没有严格的限定，例如可为中药药店出售的本身形式，例如为小块、粉末等形式，或者使用进行粉碎后得到的微粉形式。
在本发明的所述中药复方提取物中，所述金银花提取物的重量份数为0.2-0.3份，如为0.2份、0.25份或0.3份。
其中，所述金银花提取物是按照如下步骤制得的：
A1：将金银花充分粉碎，过100目筛，得到金银花粉末；
A2：将金银花粉末加入到10倍重量的去离子水中，在85℃下搅拌浸提40-50分钟，过滤，得浸提液；
A3：将浸提液浓缩至原体积的1/8，得到浓缩液；向浓缩液中加入等体积的石油醚，充分振荡萃取，分离出石油醚相和水相；向水相中加入2倍体积的正己烷，充分振荡萃取，分离出正己烷相和水相；将正己烷相减压浓缩完全，得到残留物，并溶解在适量的乙醇中，得到乙醇液；
A4：将乙醇液上300-400目的硅胶柱，以体积比为1:3的C1-3醇与乙醚的混合液为淋洗液，收集洗脱液，真空浓缩，将所得粘稠残留物冷冻干燥，研磨，过200目筛，即得所述金银花提取物。
其中，在所述步骤A3中，溶解残留物的乙醇的用量为适量，例如可为恰恰将残留物溶解的量，或者稍微多一些的量，如此可以降低后续步骤A4中的淋洗压力，本领域技术人员可进行合适的选择，这属于常规技术能力，在此不再进行详细描述。
其中，在所述步骤A4中，所述C1-3醇例如可为甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇，最优选为异丙醇。
其中，所述步骤A3中的残留物与步骤A4中的硅胶柱的硅胶的质量比为1:50-60，例如可为1:50、1:55或1:60。
在本发明的所述中药复方提取物中，所述蒲公英提取物的重量份数为0.1-0.2份，如为0.1份、0.15份或0.2份。
其中，所述蒲公英提取物是按照如下步骤制得的：
B1：将蒲公英粉末加入到乙醇中，再通入CO2，密封，使CO2压力为5-5.5MPa，形成膨胀溶剂体系，并升温至55℃，在该温度下搅拌提取40-50分钟；最后泻压至常压，并自然冷却至室温，过滤，得到滤液；
B2：将滤液减压浓缩完全，得到浸膏；将浸膏用适量乙醇溶解，并上300目的氧化铝柱色谱，先用为柱体积3倍体积的丙酮冲洗，再用为柱体积1倍体积的石油醚冲洗，最后用为柱体积2倍体积的混合溶剂进行洗脱，收集所述混合溶剂的洗脱液，减压浓缩，残留物真空干燥完全，粉碎，过100目筛，即得所述蒲公英提取物。
其中，在所述步骤B1中，蒲公英粉末与乙醇的质量比为1:7-8，例如可为1:7、1:7.5或1:8。
其中，在所述步骤B2中，所述适量乙醇的量为将所述浸膏恰恰溶解的量，如此可方便后续的柱色谱分离操作。
其中，在所述步骤B2中，浸膏与氧化铝柱色谱中的氧化铝的质量比为1:50-60，例如可为1:50、1:55或1:60。
其中，在所述步骤B2中，所述混合溶剂为乙酸乙酯、丙酮和乙醇的混合物，其中乙酸乙酯、丙酮和乙醇的体积比为2:3:1-2，例如可为2:3:1、2:3:1.5或2:3:2。
在本发明的所述中药复方提取物中，所述大青叶提取物的重量份数为0.4-0.6份，如为0.4份、0.5份或0.6份。
其中，所述大青叶提取物是按照如下步骤制得的：
C1：将大青叶粉碎成粉末，并在质量百分比浓度为5％的NaHCO3水溶液中，于45-50℃下浸泡2-3小时，然后过滤，并用去离子水冲洗过滤后所得的粉末，最后充分干燥，得到处理后粉末；
C2：将处理后粉末加入到乙醇与水的混合溶剂中，在索氏抽提仪中于回流下抽提50-60分钟，结束后，自然冷却，得到抽提处理液；
C3：向抽提处理液中加入等体积的石油醚，充分振荡萃取，分层，得有机层和水层，分离出有机层I；将水层再次用等体积的乙酸乙酯充分萃取，分离出有机层II；最后将有机层II减压浓缩，得到粘稠残留物，将其充分干燥，研磨过100目筛，即得所述大青叶提取物。
其中，在所述步骤C1中，所述质量百分比浓度为5％的NaHCO3水溶液的用量并没有特别的限定，只要其能够将大青叶粉末充分浸泡完全即可。
其中，在所述步骤C2中，构成所述混合溶剂的乙醇与水的体积比为1:3-4，例如可为1:3、1:3.5或1:4。
在本发明的所述中药复方提取物中，所述板蓝根提取物的重量份数为1-1.4份，如为1份、1.2份或1.4份。
其中，所述板蓝根提取物是按照如下步骤制得的：
D1：将充分干燥的板蓝根粉碎后过100目筛，将其加入到质量百分比浓度为30-40％的乙醇水溶液中，滴入盐酸使体系的pH值为5.8-6.2，然后于超声装置中以0.5W/cm的功率密度提取20-30分钟，结束后，离心分离，分出上清液；
D2：将上清液减压浓缩完全，得膏状物，将其用适量乙醇溶解，上D101大孔树脂，以质量百分比浓度为70％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥，粉碎并研磨过100目筛，即得所述板蓝根提取物。
其中，在所述步骤D2中，膏状物与D101大孔树脂的质量比为1:50-60，例如可为1:50、1:55或1:60。
在本发明的所述中药复方提取物中，所述赤勺提取物的重量份数为0.15-0.25份，如为0.15份、0.2份或0.25份。
其中，所述赤勺提取物是按照如下步骤制得的：
E1：将粉末状赤勺加入到10重量倍的去离子水中，煎煮60-80分钟，过滤，将得到的滤液用乙醚振荡萃取，分出有机层，减压浓缩完全，得到残留物；
E2：将残留物用适量乙醇溶解，上300-400目的硅胶柱色谱，分别用均为2倍柱体积的质量百分比浓度为70％的乙醇水溶液、质量百分比浓度为30％的乙醇水溶液和质量百分比浓度为50％的乙醇水溶液进行冲洗，收集质量百分比浓度为50％的乙醇水溶液的洗脱组分，减压浓缩至无醇味为止，将得到的残留物干燥、粉碎，研磨过100目筛，即得所述赤勺提取物。
其中，在所述步骤E2中，残留物与硅胶柱色谱中的硅胶的质量比为1:50。
在本发明的所述中药复方提取物中，所述秦艽提取物的重量份数为0.2-0.3份，如为0.2份、0.25份或0.3份。
其中，所述秦艽提取物是按照如下步骤制得的：
F1：称取干燥完全的秦艽，粉碎研磨，过100目筛，得到秦艽粉末；
F2：将秦艽粉末加入到20倍重量的质量百分比浓度为75％的乙醇水溶液中，加热回流提取40-50分钟，趁热过滤，得滤液；
F3：将滤液加入到等体积的乙酸乙酯中，振荡萃取，静置分层，分出有机乙酸乙酯相和水相；
F4：将水相加入到等体积的四氯化碳中，充分振荡、萃取，分离出四氯化碳相，将其减压浓缩完全，所得粘稠膏状物冷冻干燥，研磨，过200目筛，即得所述秦艽提取物。
在本发明的所述中药复方提取物中，所述荆芥提取物的重量份数为0.06-0.12份，如为0.06份、0.08份、0.1份或0.12份。
其中，所述荆芥提取物是按照如下步骤制得的：
G1：将荆芥加入到无水乙醇中，使用200W的微波功率在60℃下微波提取60-70分钟，然后过滤，将滤液浓缩完全得到膏状物；
G2：将300-400目硅胶用四氯化碳浸泡，直至其完全溶胀，然后装柱，并沉积过夜，得到硅胶柱；
G3：将所述膏状物用适量无水乙醇溶解，得到溶解液，并上所述硅胶柱；
G4：以体积比为1:1.5:2的乙酸乙酯、丙酮和石油醚的混合物进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，将所得残留物充分干燥，研磨，过100目筛，即得所述荆芥提取物。
其中，在所述步骤G1中，无水乙醇的用量并没有特别的限定，只要其能够将荆芥进行完全提取即可，例如可为能将荆芥完全浸泡的量，本领域技术人员可进行合适选择与确定。
其中，步骤G3中的膏状物与步骤G2中的300-400目硅胶(未浸泡前)的质量比为1:40-50，例如可为1:40、1:45或1:50。
其中，在所述步骤G1中，无水乙醇的用量并没有特别的限定，只要其方便于后续操作即可，例如可为将所述膏状物恰恰溶解的量，本领域技术人员可进行合适选择与确定。
在本发明的所述中药复方提取物中，所述淡竹叶提取物的重量份数为0.12-0.2份，如为0.12份、0.16份或0.2份。
其中，所述淡竹叶提取物是按照如下步骤制得的：
H1：将淡竹叶粉碎，得到粉末；
H2：将粉末用质量百分浓度为50％的乙醇水溶液回流提取50-60分钟，自然冷却，过滤，得到滤液；
H3：向滤液中加入等体积的丙酮，充分振荡萃取，分离，得有机相I和无机相，将无机相用等体积的乙酸乙酯充分振荡萃取，再次分离，得到有机相II；合并有机相I和有机相II，并减压浓缩完全，残留物充分干燥，研磨过100目筛，即得所述淡竹叶提取物。
其中，在步骤H2中，粉末与质量百分浓度为50％的乙醇水溶液的质量比为1:6-8，例如可为1:6、1:7或1:8。
在本发明的所述中药复方提取物中，所述甘草的重量份数为0.3-0.4份，如为0.3份、0.35份或0.4份。
在本发明的所述中药复方提取物中，所述薄荷的重量份数为0.1-0.18份，如为0.1份、0.12份、0.14份、0.16份或0.18份。
在本发明的所述中药复方提取物中，所述连翘的重量份数为0.5-0.7份，如为0.5份、0.6份或0.7份。
如上所述，本发明提供了一种中药复方提取物，发明人发现，通过对该中药复方提取物中各个组分的具体提取方法，使得最终的复方提取物具有安全无毒、优异的抗RSV病毒等性能，从而可应用在呼吸道感染和疾病等的预防和/或治疗中，在临床治疗和应用上具有良好的潜力和前景。
第二个方面，本发明涉及上述中药复方提取物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
S1：分别称取各个组分；
S2：将甘草、薄荷和连翘进行粉碎研磨，分别过100目筛，得到甘草粉末、薄荷粉末和连翘粉末；
S3：将甘草粉末、薄荷粉末、连翘粉末与上述各个制备方法得到的银花提取物、蒲公英提取物、大青叶提取物、板蓝根提取物、赤勺提取物、秦艽提取物、荆芥提取物和淡竹叶提取物进行充分混合，从而得到所述中药复方提取物。
其中，在所述步骤S1中，“各个组分”即为该中药复方提取物的所有构成组分，也即银花提取物、蒲公英提取物、大青叶提取物、板蓝根提取物、赤勺提取物、秦艽提取物、荆芥提取物、淡竹叶提取物、甘草、薄荷和连翘。
其中，可根据实际需求和服用方便等考虑，可将所述中药复方提取物进一步制备成不同的剂型，例如胶囊剂、糖浆剂、丸剂、片剂、水蜜丸、口服液等，为了得到这些剂型，本领域技术人员可将所述中药复方提取物与药学领域中的可药用辅料进行常规加工，所述可药用辅料例如可为赋形剂、甜味剂等，这些都是本领域中的常规技术手段，在此不再进行详细描述。
第三个方面，本发明涉及上述中药复方提取物在制备抗RSV病毒药物中的用途。
通过研究发现，本发明的所述中药复方提取物具有良好的抗RSV性能，从而可以用来治疗和/或预防因RSV病毒导致的各种呼吸道疾病，在临床上具有广阔的研究价值和应用前景。
综合上述，本发明提供了一种中药复方提取物及其制备方法和用途，所述中药复方提取物具有优良的抗RSV病毒性能，从而可用来治疗各种呼吸道疾病和/或感染，在医药领域具有良好的应用前景和工业化潜力。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
其中，在所有实施例和对比例中，所使用的各种提取物均为各个制备例中的相应提取物。
制备例1：金银花提取物的制备
A1：将金银花充分粉碎，过100目筛，得到金银花粉末；
A2：将金银花粉末加入到10倍重量的去离子水中，在85℃下搅拌浸提45分钟，过滤，得浸提液；
A3：将浸提液浓缩至原体积的1/8，得到浓缩液；向浓缩液中加入等体积的石油醚，充分振荡萃取，分离出石油醚相和水相；向水相中加入2倍体积的正己烷，充分振荡萃取，分离出正己烷相和水相；将正己烷相减压浓缩完全，得到残留物，并溶解在适量的乙醇中，得到乙醇液；
A4：将乙醇液上300-400目的硅胶柱(其中，步骤A3中的残留物与该步骤中硅胶柱的硅胶的质量比为1:55)，以体积比为1:3的异丙醇与乙醚的混合液为淋洗液，收集洗脱液，真空浓缩，将所得粘稠残留物冷冻干燥，研磨，过200目筛，即得金银花提取物，将其命名为JYH。
对比制备例1-1至于1-3：金银花提取物的制备
对比制备例1-1：除将制备例1的步骤A4中的异丙醇替换为甲醇外，其它操作均不变，重复进行制备例1，将所得到的金银花提取物命名为JYH1。
对比制备例1-2：除将制备例1的步骤A4中的异丙醇替换为乙醇外，其它操作均不变，重复进行制备例1，将所得到的金银花提取物命名为JYH2。
对比制备例1-3：除将制备例1的步骤A4中的异丙醇替换为正丙醇外，其它操作均不变，重复进行制备例1，将所得到的金银花提取物命名为JYH3。
制备例2：蒲公英提取物的制备
B1：将蒲公英粉末加入到7.5倍质量的乙醇中，再通入CO2，密封，使CO2压力为5.3MPa，形成膨胀溶剂体系，并升温至55℃，在该温度下搅拌提取45分钟；最后泻压至常压，并自然冷却至室温，过滤，得到滤液；
B2：将滤液减压浓缩完全，得到浸膏；将浸膏用适量乙醇溶解，并上300目的氧化铝柱色谱(其中，浸膏与氧化铝柱色谱中的氧化铝的质量比为1:55)，先用为柱体积3倍体积的丙酮冲洗，再用为柱体积1倍体积的石油醚冲洗，最后用为柱体积2倍体积的混合溶剂(为体积比2:3:1.5的乙酸乙酯、丙酮和乙醇的混合物)进行洗脱，收集所述混合溶剂的洗脱液，减压浓缩，残留物真空干燥完全，粉碎，过100目筛，即得蒲公英提取物，命名为PGY。
对比制备例2-1至2-3：蒲公英提取物的制备
对比制备例2-1：除将制备例2的步骤B2中氧化铝柱色谱仅仅用柱体积6倍体积的丙酮冲洗外，其它操作均不变，重复进行制备例2，将所得到的蒲公英提取物命名为PGY1。
对比制备例2-2：除将制备例2的步骤B2中氧化铝柱色谱仅仅用柱体积6倍体积的石油醚冲洗外，其它操作均不变，重复进行制备例2，将所得到的蒲公英提取物命名为PGY2。
对比制备例2-3：除将制备例2的步骤B2中氧化铝柱色谱仅仅用柱体积6倍体积的所述混合溶剂冲洗外，其它操作均不变，重复进行制备例2，将所得到的蒲公英提取物命名为PGY3。
制备例3：大青叶提取物的制备
C1：将大青叶粉碎成粉末，并在质量百分比浓度为5％的NaHCO3水溶液中，于48℃下浸泡2.5小时，然后过滤，并用去离子水冲洗过滤后所得的粉末，最后充分干燥，得到处理后粉末；
C2：将处理后粉末加入到体积比为:3.5的乙醇与水的混合溶剂中，在索氏抽提仪中于回流下抽提55分钟，结束后，自然冷却，得到抽提处理液；
C3：向抽提处理液中加入等体积的石油醚，充分振荡萃取，分层，得有机层和水层，分离出有机层I；将水层再次用等体积的乙酸乙酯充分萃取，分离出有机层II；最后将有机层II减压浓缩，得到粘稠残留物，将其充分干燥，研磨过100目筛，即得大青叶提取物，将其命名为DQY。
对比制备例3-1：大青叶提取物的制备
除未进行步骤C1外(即未使用NaHCO3水溶液进行浸泡处理)，其它操作均不变，重复进行制备例3，将所得到的大青叶提取物命名为DQY1。
制备例4：板蓝根提取物的制备
D1：将充分干燥的板蓝根粉碎后过100目筛，将其加入到质量百分比浓度为35％的乙醇水溶液中，滴入盐酸使体系的pH值为6.0，然后于超声装置中以0.5W/cm的功率密度提取25分钟，结束后，离心分离，分出上清液；
D2：将上清液减压浓缩完全，得膏状物，将其用适量乙醇溶解，上D101大孔树脂(其中，膏状物与D101大孔树脂的质量比为1:55)，以质量百分比浓度为70％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥，粉碎并研磨过100目筛，即得板蓝根提取物，将其命名为BLG。
对比制备例4-1：板蓝根提取物的制备
除步骤D1中未进行pH值调节外(即提取体系本身pH值)，其它操作均不变，重复进行制备例4，将所得到的板蓝根提取物命名为BLG1。
制备例5：赤勺提取物的制备
E1：将粉末状赤勺加入到10重量倍的去离子水中，煎煮70分钟，过滤，将得到的滤液用乙醚振荡萃取，分出有机层，减压浓缩完全，得到残留物；
E2：将残留物用适量乙醇溶解，上300-400目的硅胶柱色谱(其中，残留物与硅胶柱色谱中的硅胶的质量比为1:50)，分别用均为2倍柱体积的质量百分比浓度为70％的乙醇水溶液、质量百分比浓度为30％的乙醇水溶液和质量百分比浓度为50％的乙醇水溶液进行冲洗，收集质量百分比浓度为50％的乙醇水溶液的洗脱组分，减压浓缩至无醇味为止，将得到的残留物干燥、粉碎，研磨过100目筛，即得赤勺提取物，将其命名为CS。
对比制备例5-1至5-3：赤勺提取物的制备
对比制备例5-1：除将制备例5的步骤E2中的冲洗液替换为6倍柱体积的质量百分比浓度为70％的乙醇水溶液外，其它操作均不变，重复进行制备例5，将所得到的赤勺提取物命名为CS1。
对比制备例5-2：除将制备例5的步骤E2中的冲洗液替换为6倍柱体积的质量百分比浓度为30％的乙醇水溶液外，其它操作均不变，重复进行制备例5，将所得到的赤勺提取物命名为CS2。
对比制备例5-3：除将制备例5的步骤E2中的冲洗液替换为6倍柱体积的质量百分比浓度为50％的乙醇水溶液外，其它操作均不变，重复进行制备例5，将所得到的赤勺提取物命名为CS3。
制备例6：秦艽提取物的制备
F1：称取干燥完全的秦艽，粉碎研磨，过100目筛，得到秦艽粉末；
F2：将秦艽粉末加入到20倍重量的质量百分比浓度为75％的乙醇水溶液中，加热回流提取45分钟，趁热过滤，得滤液；
F3：将滤液加入到等体积的乙酸乙酯中，振荡萃取，静置分层，分出有机乙酸乙酯相和水相；
F4：将水相加入到等体积的四氯化碳中，充分振荡、萃取，分离出四氯化碳相，将其减压浓缩完全，所得粘稠膏状物冷冻干燥，研磨，过200目筛，即得秦艽提取物，将其命名为QJ。
制备例7：荆芥提取物的制备
G1：将荆芥加入到无水乙醇中，使用200W的微波功率在60℃下微波提取65分钟，然后过滤，将滤液浓缩完全得到膏状物；
G2：将300-400目硅胶用四氯化碳浸泡，直至其完全溶胀，然后装柱，并沉积过夜，得到硅胶柱；
G3：将所述膏状物用适量无水乙醇溶解(其中，膏状物与步骤G2中的300-400目硅胶(未浸泡前)的质量比为1:45)，得到溶解液，并上所述硅胶柱；
G4：以体积比为1:1.5:2的乙酸乙酯、丙酮和石油醚的混合物进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，将所得残留物充分干燥，研磨，过100目筛，即得荆芥提取物，将其命名为JJ。
对比制备例7-1：荆芥提取物的制备
除省略掉步骤G2外，其它操作均不变，重复进行制备例7，将所得到的荆芥提取物命名为JJ1。
制备例8：淡竹叶提取物的制备
H1：将淡竹叶粉碎，得到粉末；
H2：将粉末用质量百分浓度为50％的乙醇水溶液回流提取55分钟，自然冷却，过滤，得到滤液；
H3：向滤液中加入等体积的丙酮，充分振荡萃取，分离，得有机相I和无机相，将无机相用等体积的乙酸乙酯充分振荡萃取，再次分离，得到有机相II；合并有机相I和有机相II，并减压浓缩完全，残留物充分干燥，研磨过100目筛，即得淡竹叶提取物，将其命名为DZY。
实施例1
S1：分别称取0.2重量份金银花提取物JYH、0.2重量份蒲公英提取物PGY、0.4重量份大青叶提取物DQY、1.4重量份板蓝根提取物BLG、0.15重量份赤勺提取物CS、0.3重量份秦艽提取物QJ、0.06重量份荆芥提取物JJ、0.2重量份淡竹叶提取物DZY、0.3重量份甘草、0.18重量份薄荷和0.5重量份连翘；
S2：将甘草、薄荷和连翘进行粉碎研磨，分别过100目筛，得到甘草粉末、薄荷粉末和连翘粉末；
S3：将甘草粉末、薄荷粉末、连翘粉末与步骤S1中的银花提取物、蒲公英提取物、大青叶提取物、板蓝根提取物、赤勺提取物、秦艽提取物、荆芥提取物和淡竹叶提取物进行充分混合，从而得到所述中药复方提取物，将其命名为Z1。
实施例2
S1：分别称取0.3重量份金银花提取物JYH、0.1重量份蒲公英提取物PGY、0.6重量份大青叶提取物DQY、1重量份板蓝根提取物BLG、0.25重量份赤勺提取物CS、0.2重量份秦艽提取物QJ、0.12重量份荆芥提取物JJ、0.12重量份淡竹叶提取物DZY、0.4重量份甘草、0.1重量份薄荷和0.7重量份连翘；
S2：将甘草、薄荷和连翘进行粉碎研磨，分别过100目筛，得到甘草粉末、薄荷粉末和连翘粉末；
S3：将甘草粉末、薄荷粉末、连翘粉末与步骤S1中的银花提取物、蒲公英提取物、大青叶提取物、板蓝根提取物、赤勺提取物、秦艽提取物、荆芥提取物和淡竹叶提取物进行充分混合，从而得到所述中药复方提取物，将其命名为Z2。
实施例3
S1：分别称取0.25重量份金银花提取物JYH、0.15重量份蒲公英提取物PGY、0.5重量份大青叶提取物DQY、1.2重量份板蓝根提取物BLG、0.2重量份赤勺提取物CS、0.25重量份秦艽提取物QJ、0.08重量份荆芥提取物JJ、0.16重量份淡竹叶提取物DZY、0.35重量份甘草、0.14重量份薄荷和0.6重量份连翘；
S2：将甘草、薄荷和连翘进行粉碎研磨，分别过100目筛，得到甘草粉末、薄荷粉末和连翘粉末；
S3：将甘草粉末、薄荷粉末、连翘粉末与步骤S1中的银花提取物、蒲公英提取物、大青叶提取物、板蓝根提取物、赤勺提取物、秦艽提取物、荆芥提取物和淡竹叶提取物进行充分混合，从而得到所述中药复方提取物，将其命名为Z3。
对比例1-3
除分别将其中的金银花提取物替换为下表中的提取物外，其他操作均不变，从而按照实施例1-3的相同方法进行了对比例1-3，所使用的提取物、对应关系和所得中药复方提取物如下表1所示。
表1
对比例4-6
除分别将其中的蒲公英提取物替换为下表中的提取物外，其他操作均不变，从而按照实施例1-3的相同方法进行了对比例1-3，所使用的提取物、对应关系和所得中药复方提取物如下表2所示。
表2
对比例7-9
除分别将实施例1-3中的大青叶提取物DQY替换为DQY1外，其他操作均不变，从而分别按照实施例1-3的相同方法进行了对比例7-9，将所得到的中药复方提取物顺次命名为DZ7、DZ8和DZ9。
对比例10-12
除分别将实施例1-3中的板蓝根提取物BLG替换为BLG1外，其他操作均不变，从而分别按照实施例1-3的相同方法进行了对比例10-12，将所得到的中药复方提取物顺次命名为DZ10、DZ11和DZ12。
对比例13-15
除分别将其中的赤勺提取物替换为下表中的提取物外，其他操作均不变，从而按照实施例1-3的相同方法进行了对比例1-3，所使用的提取物、对应关系和所得中药复方提取物如下表3所示。
表3
对比例16-18
除分别将实施例1-3中的荆芥提取物JJ替换为JJ1外，其他操作均不变，从而分别按照实施例1-3的相同方法进行了对比例16-18，将所得到的中药复方提取物顺次命名为DZ16、DZ17和DZ18。
抗RSV病毒性能测试
所用药物：本发明实施例及对比例所制得的中药复方提取物。
细胞株：Hep-2(人喉癌细胞)。
病毒株：RSV A2。
病毒培养方法
(1)细胞的复苏及培养
将RSV病毒冻存管从液氮罐取出，立即投入37-42℃的温水中融化，在超净工作台内将冻存管中液体移入离心管中，以1000r/min离心5min，弃冻存液，加入8mL浓度质量百分比浓度为10％的RPMI1640细胞培养液，轻轻将下层沉淀细胞吹打混匀，用移液管转移到培养瓶内，在37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养。待细胞长成单层后进行传代。
(2)病毒的扩增
将RSV病毒接种于己经长成单层的Hep-2细胞上，加1640维持液8mL并置于37℃、5％CO2的病毒培养箱中培养，并设细胞对照，逐日观察。待细胞出现80％以上的病变时，反复冻融3次，用吸管轻轻吹打，以1000r/min离心5min，取上清液定量分装于小青瓶中，胶布封口，放于-80℃冰箱冻存备用。
(3)药物对细胞毒性的测定
将本发明得到的中药复方提取物用1640维持液按二倍比稀释10个浓度梯度，依次接种于己经长成单层的Hep-2细胞的96孔板中，并设4个复孔及细胞对照孔；在37℃、5％CO2培养箱中培养，逐日观察细胞病变，连续观察3天，细胞出现病变者判为药物毒性，用中性红染色，用酶标仪在540mn波长测定OD值，应用Reed-Muench公式计算药物半数毒性浓度(TC50)，并确定最小无毒浓度。
(4)抗RSV病毒测试
将本发明得到的中药复方提取物从最小无毒浓度起用1640维持液二倍比系列稀释10个浓度，每孔50μL接种于已长成单层Hep-2细胞的96板孔中，每孔再加入50μL RSV病毒液，在5％CO2培养箱中培养，观察细胞病变，待病毒对照出现90％以上的病变时，用1％中性红染色，并用酶标仪在540nm波长测定OD值，应用Reed-Muench方法计算药物半数有效浓度(EC50)，进而计算出治疗指数(TI)。
其中，治疗指数(TI)＝半数毒性浓度(TC50)/半数有效浓度(EC50)。
其中，对于步骤(3)-(4)中的浓度梯度而言，本领域技术人员可以进行合适确定，以能得出各个目标参数为目的，这是本领域技术人员在阅读本发明后应该具备的技术能力，在此不再进行详细描述。
此外，以常用的治疗RSV病毒的利巴韦林作为对照组。
结果见下表4：
表4
由此可见，本发明得到的中药复方提取物具有良好的抗RSV病毒能力，其治疗指数要显著高于利巴韦林，从而在临床治疗上具有良好的应用前景。
为了考察组分的不同制备方法对于最终药物活性性能的影响，按照上述相同的方法对不同的中药复方组合物进行了相同的测试，结果见下表5，为了更直观地进行对比，一并列出Z1-Z3的治疗数据。
表5
其中，当所用物质与治疗指数分开表示时，则表示之间存在着唯一的对应关系，以DZ1、DZ2、DZ3为例，其与治疗指数TI的对应关系是，DZ1的TI为14.73、DZ2的TI为14.25、DZ3的TI为14.31，其它相同表示方法的中药复方提取物与TI的对应关系也是如此，在此不再一一赘述。
由此可见：1、在金银花提取物过程中，步骤A4的淋洗液中醇的种类对于最终结果有显著的影响，其中异丙醇能够取得最好的效果，即便是与其非常类似的正丙醇，效果也有显著的降低(降低为14.31)；2、在蒲公英提取物的制备过程中，步骤B2中的冲洗步骤特别重要，只有采用丙酮-石油醚-混合溶剂的冲洗顺序，才能得到最好的抗病毒效果，而当仅仅使用单一冲洗顺序时，则均导致活性有显著的降低，尤其是仅仅使用石油醚进行冲洗时，其活性与对照组相差无几；3、在大青叶提取物的制备方法中，当首先使用NaHCO3水溶液进行浸泡处理时，则可以进一步提高最终产品的活性；4、在板蓝根提取物的制备方法中，步骤D1中对于pH值的调节非常重要，当将其调节至本发明的限定范围内时，可以显著提高最终产品的抗病毒效果；5、在赤勺提取物的制备方法中，步骤E2中的冲洗液的选择以及洗脱顺序非常重要，只有顺次使用质量百分比浓度为70％、30％和50％的乙醇水溶液进行洗脱并收集最终的50％洗脱液，才能取得最好的技术效果，当只使用任何一种单一浓度乙醇水溶液进行洗脱时，则均导致最终的活性有明显降低(尤其是DZ14)；6、在荆芥提取物的制备方法中，硅胶进行四氯化碳浸泡溶胀能够显著地提高最终的产物活性，而当省略掉该处理时，活性有明显的降低。
综合表4-表5的数据可见，只有当使用本发明的综合处理方法时，才能得到抗RSV病毒最为优异的最终产物，而当改变其中的某些提取步骤和/或要素和/或技术特征时，都将导致最终的抗病毒性能有明显甚至是显著的降低。
应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种抗RSV病毒的中药复方提取物，所述中药复方提取物包括金银花提取物、蒲公英提取物、大青叶提取物、板蓝根提取物、赤勺提取物、秦艽提取物、荆芥提取物、淡竹叶提取物、甘草、薄荷和连翘；
以重量份计，所述中药复方提取物的具体组分含量如下：
所述金银花提取物是按照如下步骤制得的：
A1：将金银花充分粉碎，过100目筛，得到金银花粉末；
A2：将金银花粉末加入到10倍重量的去离子水中，在85℃下搅拌浸提40-50分钟，过滤，得浸提液；
A3：将浸提液浓缩至原体积的1/8，得到浓缩液；向浓缩液中加入等体积的石油醚，充分振荡萃取，分离出石油醚相和水相；向水相中加入2倍体积的正己烷，充分振荡萃取，分离出正己烷相和水相；将正己烷相减压浓缩完全，得到残留物，并溶解在适量的乙醇中，得到乙醇液；
A4：将乙醇液上300-400目的硅胶柱，以体积比为1:3的C1-3醇与乙醚的混合液为淋洗液，收集洗脱液，真空浓缩，将所得粘稠残留物冷冻干燥，研磨，过200目筛，即得所述金银花提取物；
所述蒲公英提取物是按照如下步骤制得的：
B1：将蒲公英粉末加入到乙醇中，再通入CO2，密封，使CO2压力为5-5.5MPa，形成膨胀溶剂体系，并升温至55℃，在该温度下搅拌提取40-50分钟；最后泻压至常压，并自然冷却至室温，过滤，得到滤液；
B2：将滤液减压浓缩完全，得到浸膏；将浸膏用适量乙醇溶解，并上300目的氧化铝柱色谱，先用为柱体积3倍体积的丙酮冲洗，再用为柱体积1倍体积的石油醚冲洗，最后用为柱体积2倍体积的混合溶剂进行洗脱，收集所述混合溶剂的洗脱液，减压浓缩，残留物真空干燥完全，粉碎，过100目筛，即得所述蒲公英提取物；
所述大青叶提取物是按照如下步骤制得的：
C1：将大青叶粉碎成粉末，并在质量百分比浓度为5％的NaHCO3水溶液中，于45-50℃下浸泡2-3小时，然后过滤，并用去离子水冲洗过滤后所得的粉末，最后充分干燥，得到处理后粉末；
C2：将处理后粉末加入到乙醇与水的混合溶剂中，在索氏抽提仪中于回流下抽提50-60分钟，结束后，自然冷却，得到抽提处理液；
C3：向抽提处理液中加入等体积的石油醚，充分振荡萃取，分层，得有机层和水层，分离出有机层I；将水层再次用等体积的乙酸乙酯充分萃取，分离出有机层II；最后将有机层II减压浓缩，得到粘稠残留物，将其充分干燥，研磨过100目筛，即得所述大青叶提取物；
所述板蓝根提取物是按照如下步骤制得的：
D1：将充分干燥的板蓝根粉碎后过100目筛，将其加入到质量百分比浓度为30-40％的乙醇水溶液中，滴入盐酸使体系的pH值为5.8-6.2，然后于超声装置中以0.5W/cm的功率密度提取20-30分钟，结束后，离心分离，分出上清液；
D2：将上清液减压浓缩完全，得膏状物，将其用适量乙醇溶解，上D101大孔树脂，以质量百分比浓度为70％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥，粉碎并研磨过100目筛，即得所述板蓝根提取物；
所述赤勺提取物是按照如下步骤制得的：
E1：将粉末状赤勺加入到10重量倍的去离子水中，煎煮60-80分钟，过滤，将得到的滤液用乙醚振荡萃取，分出有机层，减压浓缩完全，得到残留物；
E2：将残留物用适量乙醇溶解，上300-400目的硅胶柱色谱，分别用均为2倍柱体积的质量百分比浓度为70％的乙醇水溶液、质量百分比浓度为30％的乙醇水溶液和质量百分比浓度为50％的乙醇水溶液进行冲洗，收集质量百分比浓度为50％的乙醇水溶液的洗脱组分，减压浓缩至无醇味为止，将得到的残留物干燥、粉碎，研磨过100目筛，即得所述赤勺提取物；
所述秦艽提取物是按照如下步骤制得的：
F1：称取干燥完全的秦艽，粉碎研磨，过100目筛，得到秦艽粉末；
F2：将秦艽粉末加入到20倍重量的质量百分比浓度为75％的乙醇水溶液中，加热回流提取40-50分钟，趁热过滤，得滤液；
F3：将滤液加入到等体积的乙酸乙酯中，振荡萃取，静置分层，分出有机乙酸乙酯相和水相；
F4：将水相加入到等体积的四氯化碳中，充分振荡、萃取，分离出四氯化碳相，将其减压浓缩完全，所得粘稠膏状物冷冻干燥，研磨，过200目筛，即得所述秦艽提取物；
所述荆芥提取物是按照如下步骤制得的：
G1：将荆芥加入到无水乙醇中，使用200W的微波功率在60℃下微波提取60-70分钟，然后过滤，将滤液浓缩完全得到膏状物；
G2：将300-400目硅胶用四氯化碳浸泡，直至其完全溶胀，然后装柱，并沉积过夜，得到硅胶柱；
G3：将所述膏状物用适量无水乙醇溶解，得到溶解液，并上所述硅胶柱；
G4：以体积比为1:1.5:2的乙酸乙酯、丙酮和石油醚的混合物进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，将所得残留物充分干燥，研磨，过100目筛，即得所述荆芥提取物；
所述淡竹叶提取物是按照如下步骤制得的：
H1：将淡竹叶粉碎，得到粉末；
H2：将粉末用质量百分浓度为50％的乙醇水溶液回流提取50-60分钟，自然冷却，过滤，得到滤液；
H3：向滤液中加入等体积的丙酮，充分振荡萃取，分离，得有机相I和无机相，将无机相用等体积的乙酸乙酯充分振荡萃取，再次分离，得到有机相II；合并有机相I和有机相II，并减压浓缩完全，残留物充分干燥，研磨过100目筛，即得所述淡竹叶提取物。
2.权利要求1所述中药复方提取物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
S1：分别称取各个组分；
S2：将甘草、薄荷和连翘进行粉碎研磨，分别过100目筛，得到甘草粉末、薄荷粉末和连翘粉末；
S3：将甘草粉末、薄荷粉末、连翘粉末与所述银花提取物、蒲公英提取物、大青叶提取物、板蓝根提取物、赤勺提取物、秦艽提取物、荆芥提取物和淡竹叶提取物进行充分混合，从而得到所述中药复方提取物。
3.权利要求1所述的中药复方提取物在制备抗RSV病毒药物中的用途。
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