CN105560362B - 一种细锥香茶菜有效组分的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细锥香茶菜有效成分的提取方法,属中草药提取制备领域。该方法依次经过石油醚提取、80%乙醇提取、乙醇提取乙酸乙酯萃取和乙醇提取正丁醇萃取;分别得到石油醚提取物、乙醇提取乙酸乙酯萃取物、乙醇提取正丁醇萃取物;这三种提取物均有较好的抗肿瘤效果,可用于制备抗肿瘤药物,同时有利于我国细锥香茶菜资源开发利用。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗肿瘤疾病中药提取方法,具体地说涉及从细锥香茶菜中提取有效组分的方法,属中草药提取制备领域。
背景技术
恶性肿瘤是危害人类生命健康的严重疾病之一,据《2012中国肿瘤登记年报》发布,肿瘤发病率呈逐年上升趋势,在2009年全国每分钟就有6个人确诊为恶性肿瘤,全国每年因癌症死亡的病例达270万,也就是说平均每天约有7300死于肿瘤,寻找恶性肿瘤有效的防治方法迫在眉睫。化学药物治疗是当今治疗肿瘤的主要手段之一,但化疗药物在作用于靶细胞时往往累及正常细胞,产生免疫功能低下、骨髓抑制、脏器受损等毒副作用,严重的副作用和多药耐药等问题使其应用受到很大的限制。因此寻找高效低毒的治疗药物是当今抗肿瘤药物研发亟待解决的重要问题。在这种情况下出现了回归自然、使用天然药物的潮流,所以从天然动植物中寻找毒性低、疗效高的抗肿瘤活性成分已成为国内外科学工作者研究的热点之一。从植物中提取并研究具有抗肿瘤作用的有效成分用于治疗肿瘤是目前国家重点支持的领域之一。
细锥香茶菜是我国民间广泛使用的草药,细锥香茶菜为多年生草本或半灌木,根茎木质,向下密生纤维状的须根。广泛分布在我国滇西北(福贡、维西)、滇西(景东、临沧、保山)、滇南(景洪、西双版纳)、滇中南(元江)、滇东南(屏边、西畴、金平)。我国西藏、四川、贵州、湖南、广西、广东亦产。尼泊尔,印度,缅甸,老挝,越南也有分布。
近年来,随着中药研究技术的发展,人们对香茶菜属植物的活性成分做了大量研究,从该属植物中分离出1000多种二萜类化合物单体。香茶菜属植物中主要富含对映贝壳杉烷类二萜化合物,而现代研究表明,从香茶菜属植物中分离得到的对映贝壳杉烷型结构的二萜类化合物,已被证实具有较好的抗肿瘤功效,其活性中心也已确定为环外亚甲基环戊酮结构,这无疑为该属植物的化学成分研究工作提供了理论支持。细锥香茶菜是唇形科香茶菜属植物,其药理活性作用广泛,主要具有发表散风、和中化湿、止血功效,主治风寒感冒、呕吐等症。该植物中二萜化合物结构类型丰富,由于其多样的生理活性,长期以来,一直吸引着广大天然药物化学家的兴趣。对于细锥香茶菜,已有人对不同产地的细锥香茶菜作了二萜生理活性成分的研究。我国学者对该种植物研究最多,共发现了 30 个化合物,主要是二萜类,其次是有机酸、酯、醇、和黄酮类。李麒麟通过体外筛选发现四川天全产的细锥香茶菜的乙醇提取物具有血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性(浓度为 10 mg/ml 时,其 ACE抑制率为 70.96%)。(李麒麟,瓦山安息香和细锥香茶菜的活性成分研究,中国科学院成都生物研究所,博士论文)。
目前对细锥香茶菜这种植物的研究主要在化学成分的提取分离上,还没有从细锥香茶菜中找到有抗癌活性的有效部位和单体化合物。
发明内容
本发明的目的是提供一种细锥香茶菜有效组分的新提取方法,通过该方法获得新的有效组分,实现对癌细胞的高度选择性。
为实现本发明目的,技术方案如下:具体通过以下步骤实现:
步骤1、石油醚提取:采取细锥香茶菜原药材的地上部分,自然阴干,用粉碎机粉粹,用石油醚加热回流,提取药液,用滤纸常温常压下过滤,减压浓缩得暗黄色提取物浸膏,即为石油醚提取物;
步骤2、80%乙醇提取:石油醚提取后的残渣在常温下使石油醚挥发完全;在残渣中加入体积百分比80%乙醇浸泡并进行加热回流,然后常温常压下过滤,得到浸取液;将浸取液减压浓缩得绿色浸膏,即为80%乙醇提取物;
步骤3、80%乙醇提取乙酸乙酯萃取物:将步骤2所得80%乙醇提取物减压浓缩,回收乙醇,然后加入蒸馏水加热,使乙醇提取物完全溶解,用乙酸乙酯萃取,合并乙酸乙酯萃取液,减压浓缩,回收乙酸乙酯,得到墨绿色浸膏,即为80%乙醇提取乙酸乙酯萃取物。
步骤4、80%乙醇提取正丁醇萃取物:在步骤(3)残渣中继续加正丁醇萃取,合并正丁醇萃取液,减压浓缩,回收正丁醇,得到绿色的浸膏,即为80%乙醇提取正丁醇萃取物。
石油醚、体积百分比80%乙醇、乙酸乙酯和正丁醇用量为淹没药材为准,过滤的滤纸为中速102或者快速101的定性滤纸。
步骤1中减压浓缩的条件为水温温度30℃-40℃,压强在0.07-0.1MPa。
优选压强为0.09MPa。
步骤1所述加热回流时间为2h-3h,提取药液3-4次。
步骤2所述浸泡时间为4h-5h,加热回流时间为1.5h-2h。
步骤2中减压浓缩的压强为0.07-0.1MPa,水温温度为60℃-70℃。优选压强为0.09MPa
步骤3中减压浓缩压强为0.07-0.1MPa,水温温度为45℃-55℃。
优选压强为0.09MPa。
步骤4中减压浓缩压强为0.07-0.1MPa,水温温度为85-95℃。
优选压强为0.09MPa。
本发明有益效果是:此提取方法提取出来的细锥香茶菜提取物对癌细胞有高度选择性,可以预防或治疗癌症。对抑制人肝癌细胞SMMC-7721、人食管癌细胞EC-9706,人淋巴瘤细胞SUDHL-4生长有较好的活性。为下一步开发新型、具有高度选择性国家一类抗肿瘤药物提供了物质基础。我国细锥香茶菜资源丰富,目前尚未得到充分开发利用,一旦从中开发出预期的有高度选择性的抗癌新药,其市场是非常广阔的,可产生巨大的经济效益。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明:
本发明所述细锥香茶菜有效组分的提取方法具体通过以下步骤实现:
实施例1
步骤1、石油醚提取:采取细锥香茶菜原药材(地上部分),自然阴干,取原药材0.5kg,用粉碎机粉粹,用石油醚加热回流2小时(石油醚的用量为:石油醚要淹没药材为准),共提取3次,用中速102或者快速101(中速和快速为本领域的常用术语)的定性滤纸常温常压下过滤,在水温温度30℃-40℃,压强在0.07-0.1MPa的条件下,减压浓缩得黄褐色提取物浸膏,即为石油醚提取物。
其中,提取物中有大量的酯类化合物,选用快速101滤纸;压强为0.07-0.1MPa这个范围内旋转蒸发仪最好控制,石油醚可以快速回收。
步骤2、80%乙醇提取:石油醚提取后的残渣倒入干净的搪瓷盘中在常温下把石油醚挥发完全,直到无石油醚味为好,然后把残渣装入一个5L球形烧瓶里,加入体积百分比80%乙醇浸泡4-5h,加热回流1.5h-2h,然后常温常压下过滤,其中,滤纸采用定性滤纸(中速102,快速101);然后得到提取液,在压强为0.07-0.1MPa,水温温度为60℃-70℃的条件下,减压浓缩得墨绿色浸膏80%乙醇提取物。
其中,浸泡时间范围为4-5个小时,时间太长,溶剂容易挥发且浪费时间;加热回流时间为1.5-3小时,最佳2小时,在这个时间范围内能完全提出80%乙醇提取物的有效部位且节约能源,节省时间;滤纸采用定性滤纸(中速102,快速101),提取物中有大量的糖类化合物和叶绿素,比较黏稠,因此,选用快速101比较好;减压浓缩的条件采用压强0.07-0.1MPa,在这个范围内旋转蒸发仪最好控制,乙酸乙酯可以快速回收。
步骤3、80%乙醇提取乙酸乙酯萃取:
将步骤2所得乙醇提取物减压浓缩,回收乙醇,用蒸馏水加热使乙醇提取物完全溶解,用等量的乙酸乙酯萃取3次,合并萃取液,减压浓缩,回收乙酸乙酯,得到乙酸乙酯萃取物。其中,减压浓缩条件:压强为0.07-0.1MPa,水温温度为45℃-55℃。
步骤4、80%乙醇提取正丁醇萃取物:在步骤(3)残渣中继续加适量的正丁醇萃取3次,合并正丁醇萃取液,减压浓缩,回收正丁醇,得到绿色的浸膏,即为80%乙醇提取正丁醇萃取物,其中,减压浓缩条件:压强为0.07-0.1MPa,所述水温温度为85-95℃。
实施例2
所述细锥香茶菜有效组分的提取方法,具体通过以下步骤实现:
1、石油醚提取物:采取细锥香茶菜原药材(地上部分),自然阴干,取阴干后的原药材0.5kg,用粉碎机粉粹,用石油醚2000ml加热回流2小时, (石油醚的用量为:石油醚要淹没药材为准),共提取3次,用快速101的定性滤纸常温常压下过滤,在水温温度39℃,压强在0.09MPa的条件下,减压浓缩得墨绿色提取物浸膏,得石油醚提取物16g。
2、80%乙醇提取:石油醚提取后的残渣倒入干净的搪瓷盘中在常温下把石油醚挥发完全,直到无石油醚味为好,然后把残渣装入一个5L球形烧瓶里,加入2000ml体积百分比80%乙醇,浸泡4h,加热回流2h,然后常温常压下过滤,其中,滤纸采用快速101定性滤纸;然后得到1500ml的浸取液,减压浓缩得墨绿色浸膏,得80%乙醇提取物25g,其中,减压浓缩的条件为水温温度在65℃,压强0.09MPa。
3、80%乙醇提取乙酸乙酯萃取: 将步骤2所得乙醇提取物减压浓缩,回收乙醇,用一定量的热水使乙醇提取物完全溶解,冷却到常温,用等量的乙酸乙酯萃取,共萃取三次,合并乙酸乙酯,减压浓缩,用旋转蒸发仪回收乙酸乙酯,得到乙醇提取乙酸乙酯萃取物9克,减压浓缩的条件为水温温度在52℃,压强0.09MPa。
4、80%乙醇提取正丁醇萃取物:在步骤(3)残渣中取等量的正丁醇继续萃取,萃取3次,合并正丁醇,减压浓缩,回收正丁醇得到乙醇提取正丁醇萃取物6克,减压浓缩的条件为水温温度在90℃,压强0.09MPa。
80%乙醇提取乙酸乙酯萃取物定性实验:
80%乙醇提取正丁醇萃取物定性实验:
下面结合实施例2所得三种细锥香茶菜提取物体外抗肿瘤活性筛选实验来说明本发明的有益效果:
1、供试细胞
人肝癌细胞SMMC-7721、人食管癌细胞EC-9706、人淋巴瘤细胞SUDHL-4均为普通市售商品。
2、主要仪器与耗材
生物安全柜,力康发展有限公司,HFsafe-1200TE;
CO2培养箱,力康发展有限公司,HF160W;
倒置生物显微镜,奥林巴斯,BDS200;
恒温振荡器,国华,ZD-85型;
EXL800uv全自动酶标仪,Bio-Rad(美国)公司,168-1000XC;
精密可调微量移液器,Eppendorf(德国)公司;
96孔细胞培养板, LabServ
细胞培养瓶, LabServ
3、主要试剂
优级胎牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司;
胰蛋白酶,Sigma公司;
RPMI1640培养基、DMSO和四甲基偶氮唑蓝( methylthiazolyl tetrazolium,MTT),美国Solarbio 公司。
Cell Counting kit-8(CCK-8),日本同仁化学研究所
4、主要试剂配制
PBS缓冲液配制(PH7.4):NaCl 8.0g,KCl 0.20g,Na2HPO4 3.48g,KH2PO4 0.20g,溶于1000ml超纯水中,高压蒸汽灭菌,4℃保存备用;
MTT配制:称取10mg MTT,加2ml PBS(PH7.4)搅拌30 min,用0.22μm微孔滤器过滤除菌,分装4℃避光保存,两周内有效;
胰蛋白酶消化液:用PBS溶液溶解胰酶,配置成质量百分浓度为0.25%的胰酶溶液,调PH值为7.4左右,过滤除菌,分装-20℃保存。
台盼蓝:称取 0.4g 台盼蓝粉,溶于 100ml 超纯水中,过滤除菌分装后,-4℃ 保存备用。使用时,用超纯水稀释至质量百分浓度为0.04%。
5、方法
5.1 细胞培养
人肝癌细胞SMMC-7721、人食管癌细胞EC-9706为贴壁细胞,人淋巴瘤细胞SUDHL-4为悬浮细胞,均使用含体积百分浓度10% 胎牛血清的RPMI 1640培养基,在37℃饱和湿度、5% CO2培养箱中常规培养;每2-3d换液1次。实验过程中用台盼蓝染色法检测细胞活性。
SMMC-7721、EC-9706细胞消化传代方法:倒掉原培养基,加入PBS缓冲液润洗两次,向培养瓶加1ml胰蛋白酶,在倒置显微镜下观察,至细胞变圆、有间隙时将胰蛋白酶倒出,加入含体积百分浓度10%胎牛血清RPMI1640培养基1ml,反复吹打细胞使其脱壁直至散开成单个,分装到新培养瓶中,加入含体积百分浓度10%胎牛血清的培养基中培养。
SUDHL-4细胞消化传代方法:将培养瓶中培养液连同细胞一起倒入离心管中,1000rpm/min离心5min,弃去上清,加入2ml新鲜培养液重悬细胞,向两个培养瓶中各吸取1ml细胞悬液,并分别加入适量新鲜的培养液进行传代培养。
5.2 MTT/CCK-8法体外筛选抗肿瘤药物
5.2.1 原理
MTT全称为3-(4,5-二甲基噻唑-2)- 2,5-二苯基四氮唑溴盐,简称噻唑蓝。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氧酶能够使MTT还原为不溶于水的蓝紫色针状结晶甲瓚,并沉积在细胞中,而死细胞则没有该功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓚颗粒,使细胞着色,用酶标仪在490mn波长处测定其吸光度(A),根据A值大小分析活细胞多少,A值可间接反映活细胞数量。
Cell Counting Kit简称CCK8。CCK8是利用了一种基于水溶性四唑盐WST-8(化学名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐),它在电子载体1-Methoxy PMS存在的情况下能够被还原成水溶性的甲臢燃料。悬浮细胞用MTT法时必须经离心后才能吸出上清再加DMSO ,操作比较不方便,CCK-8法对于悬浮细胞增殖实验更具优势。WST-8被细胞内脱氢酶氧化还原后生成的橙黄色甲臢燃料能够溶解在组织培养基中,生成的甲臢量与活细胞数量成正比。
5.2.2 实验方法
MTT(SMMC-7721、EC-9706细胞):收集对数生长期细胞,用细胞计数板计数,调整细胞悬液浓度为5×104个/ml,,96孔细胞培养板中每孔加入100μl,每个浓度设四个复孔,细胞培养箱(5% CO2,37℃)中孵育24h,待细胞贴壁后,小心吸去上清,加入含有不同药物浓度的培养基100μl,并设阴性对照孔、空白孔及阳性对照孔。连续培养48h后,每孔加入20μlMTT溶液(5mg/ml),继续培养4h后,小心吸去孔内培养基,每孔加入DMSO 150μl,置摇床上低速避光振荡10min,使结晶物充分溶解,酶标仪(检测波长490nm参考波长630nm)测定,并读取各孔吸光度(A)值。实验重复三次,按以下公式求取细胞增殖抑制率,用SPSS软件计算其IC50值。抑制率(%)= (1-给药孔A值/阴性对照孔A值)×100%
CCK-8(SUDHL-4细胞):收集对数期SUDHL-4细胞,1000rpm离心5min,弃上清,调节细胞悬液浓度为8×104个/ml,每孔100μL接种于96孔板中。实验孔加入含有不同药物浓度的培养基各100μl,每个浓度设4个复孔,并设阴性对照孔、空白孔及阳性对照孔。置37℃,5%CO2孵育72小时后,每孔加入20 ul CCK-8溶液,继续培养4 h。取出96孔板,在酶联免疫检测仪450nm处测量各孔的吸光值。实验重复三次,按以下公式求取细胞增殖抑制率,用SPSS软件计算其IC50值。抑制率(%)= (1-给药孔A值/阴性对照孔A值)×100%
6、结果
本研究以SMMC-7721、EC-9706和SUDHL-4细胞株为模型,对三种细锥香茶菜提取物的体外抗肿瘤活性进行筛选,结果见表1、表2、表3。结果显示细锥香茶菜石油醚提取物对SMMC-7721、EC-9706和SUDHL-4的IC50分别为 101.41μg/ml、56.65μg/ml、 69.69μg/ml;80%乙醇提取乙酸乙酯萃取物对上述三种人癌细胞的IC50分别为37.56μg/ml、14.92μg/ml、16.58μg/ml;80%乙醇提取正丁醇萃取物对上述三种人癌细胞的IC50分别为69.33μg/ml、28.08μg/ml、29.87μg/ml。根据该结果可知,细锥香茶菜石油醚提取物、80%乙醇提取乙酸乙酯萃取物、80%乙醇提取正丁醇萃取物均具有不同程度的体外抗肿瘤活性,其中80%乙醇提取乙酸乙酯萃取物的抗肿瘤活性最强,80%乙醇提取正丁醇萃取物的作用次之,提示可用于制备抗肿瘤药物。
表1 细锥香茶菜石油醚提取物对各细胞系72h体外抑制活性结果
表2 细锥香茶菜80%乙醇提取乙酸乙酯萃取物对各细胞系72h体外抑制活性结果
表3 细锥香茶菜80%乙醇提取正丁醇萃取物对各细胞系72h体外抑制活性结果
体外实验表明:细锥香茶菜80%乙醇提取乙酸乙酯萃取物、80%乙醇提取正丁醇萃取物均具有较好的抗肿瘤效果。
对比例1 通常对细锥香茶菜提取方法如下:
步骤1、乙醚提取:采取细锥香茶菜原药材的地上部分,自然阴干,用粉碎机粉粹,用无水乙醚浸泡21天,用滤纸常温常压下过滤,减压浓缩得黄绿色提取物浸膏,即为乙醚提取物;
步骤2、乙酸乙酯提取:乙醚提取后的残渣在常温下把乙醚挥发完全;在残渣中加入乙酸乙酯浸泡并进行加热回流,乙酸乙酯的用量为乙酸乙酯淹没药材为准,然后常温常压下过滤,得到浸取液;将浸取液减压浓缩得墨绿色浸膏,即为乙酸乙酯提取物;
步骤3、乙醇提取:乙酸乙酯提取过的残渣晾干无乙酸乙酯味,在乙酸乙酯提取过的残渣中加乙醇溶液浸泡并加热回流,然后常温常压下过滤,得到浸取液,将浸取液进行减压浓缩得墨绿色浸膏,即为乙醇提取物;
以EC9706细胞株为模型,三种提取物的IC50分别为56.00μg/ml、78.23μg/ml、116.19μg/ml。
Claims (3)
1.一种细锥香茶菜有效组分的提取方法,其特征在于,具体通过以下步骤实现:
步骤1、石油醚提取:采取细锥香茶菜原药材的地上部分,自然阴干,用粉碎机粉粹,用石油醚加热回流,提取药液,用滤纸常温常压下过滤,减压浓缩得浸膏,即为石油醚提取物;
步骤2、80%乙醇提取:石油醚提取后的残渣在常温下使石油醚挥发完全;在残渣中加入体积百分比80%乙醇浸泡并进行加热回流,然后常温常压下过滤,得到浸取液;将浸取液减压浓缩得浸膏,即为80%乙醇提取物;
步骤3、80%乙醇提取乙酸乙酯萃取物:将步骤2所得80%乙醇提取物减压浓缩,回收乙醇,然后加入蒸馏水加热,使乙醇提取物完全溶解,用乙酸乙酯萃取,合并乙酸乙酯萃取液,减压浓缩,回收乙酸乙酯,得浸膏,即为80%乙醇提取乙酸乙酯萃取物;
步骤4、80%乙醇提取正丁醇萃取物:在步骤(3)的残渣中继续加正丁醇萃取,合并正丁醇萃取液,减压浓缩,回收正丁醇,得浸膏,即为80%乙醇提取正丁醇萃取物;
步骤1中减压浓缩条件为水温温度30℃-40℃,压强0.07-0.1MPa;
步骤1所述加热回流时间为2h-3h,提取药液3-4次;
步骤2所述浸泡时间为4h-5h,加热回流时间为1.5h-2h;
步骤2中减压浓缩条件为压强0.07-0.1MPa,水温温度为60℃-70℃;
步骤3中减压浓缩条件为压强0.07-0.1MPa,水温温度为45℃-55℃;
步骤4中减压浓缩条件为压强0.07-0.1MPa,水温温度为85-95℃。
2.如权利要求1所述的细锥香茶菜有效组分的提取方法,其特征在于,步骤1-4所述减压浓缩条件中压强选0.09MPa。
3.如权利要求1或2所述的细锥香茶菜有效组分的提取方法,其特征在于,石油醚、体积百分比80%乙醇、乙酸乙酯和正丁醇用量为淹没药材为准,过滤的滤纸为102或者101定性滤纸。
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