KR20130026221A

KR20130026221A - 사인 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물

Info

Publication number: KR20130026221A
Application number: KR1020110089710A
Authority: KR
Inventors: 손창규
Original assignee: 대전대학교 산학협력단
Priority date: 2011-09-05
Filing date: 2011-09-05
Publication date: 2013-03-13
Also published as: KR101327343B1

Abstract

본 발명은 사인 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 사인 추출물만을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 간 섬유화 또는 간경화의 예방 또는 치료용 조성물로서, 상기 본 발명에 따른 조성물은 인체에 무해하고 상기 유효성분 단독만으로도 간의 빌리루빈 대사능력과 간세포 손상을 유의성 있게 개선시키고, 간조직의 지질 과산화와 섬유화 및 경화를 효과적으로 억제하며, 간의 염증이나 섬유화와 관련된 TNF-α, iNOS, INF-γ, TGF-β, PDGF, CTGF, 및 α-SMA 유전자의 발현을 효과적으로 억제시킴으로써 항산화 또는 간 섬유화 또는 간경화의 예방 또는 치료에 유용하게 이용할 수 있는 장점이 있다.

Description

사인 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물{Amomum xanthoides extract and composition containing the extract as effective ingredient}

본 발명은 사인 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 사인 추출물만을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 간 섬유화 또는 간경화의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

간장 질환의 다양한 패턴과 병의 진행에 있어서 임상적으로 환자의 경과에 가장 중요한 단계는 간 섬유화(fibrosis)나 간경화(cirrhosis)의 발생을 억제하거나, 간경화가 이미 시작된 경우에는 그 진행을 억제하는 것이다. 따라서 간장 질환의 치료를 연구하는 대부분의 수많은 연구자들은 간경변의 예방 또는 치료제의 개발에 노력을 기울여 왔다. 그럼에도 불구하고, 아직까지 만족할만한 효과를 거둘 수 있는 치료법이나 치료약물이 없는 실정이다.

일반적으로, 과도한 알코올의 섭취나 독성 물질에 의한 간세포의 손상, 또는 만성 바이러스성 간염으로 지속적으로 간세포가 파괴되면 간조직을 구성하고 있는 간세포의 숫자는 점차 줄어들고, 비타민 A를 저장하고 있는 간성상세포(Hepatic stellate cells)가 섬유질을 만드는 섬유아세포(fibroblasts)로 형질전환(transformation) 되면서 간조직 내에 섬유질의 양이 증가하게 된다. 따라서 섬유아세포의 활성화나 섬유질 생성의 억제가 간경화의 억제 또는 치료나 이를 위한 약물의 개발에 중요한 수단이 되고 있다.

최근에, 이러한 간섬유화 과정을 촉발하고 진행시키는 기전으로 활성산소(reactive oxygen species, ROS)의 과도한 발생과 이를 제거하는 방어기전인 글루타티온 시스템(glutathione system), 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase, SOD), 카탈라아제(catalase)의 부족 등이 보고되어 있다. 이러한 상황은 세포막을 포함한 세포내 분자들을 산화시키고, 지질 과산화(lipid peroxidation)의 정도를 측정함으로써 조사될 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한 세포가 파괴되는 과정에서는 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α), 유도성 질산화물 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS), 혈소판유래성장인자-베타(Platelet drived growth factor-beta, PDGF-β), 결합조직성장인자(Connective tissue growth factor, CTGF), 형질전환 성장인자-베타(transforming growth factor-beta, TGF-β)와 같은 관련 유전자들이 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다.

지금까지 오미자(五味子) 유래된 DDB(Dimethyl Dimethoxy Biphenyl Dicarboxylate), 대계(大)에서 실리마린(silymarin)과 같은 한약재에서 추출한 여러 가지 단일성분이나, 시호(柴胡), 황금, 인삼(人蔘), 반하(半夏), 감초(甘草), 생강(生薑), 대추(大棗)를 달여 만든 소시호탕(小柴胡湯)과 같은 복합처방이 간세포를 보호하고 상기한 지질 과산화나 염증관련 유전자들의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있으며, 실제 임상에서도 많이 사용되고 있다.

그러나 이러한 약물들은 간의 염증 개선에서는 일정한 유효성을 보여주고 있지만 간의 섬유화나 경화의 진행을 억제하는 효과를 뚜렷하게 보이기 어렵다. 한의학 오랫동안 임상경험을 바탕으로 현대 과학적인 실험을 통해 유효성분을 추출함으로써 보다 간편하고 우수한 효능을 갖는 약물을 개발할 수 있을 것으로 기대되고 있다.

한국등록특허 제0626724호는 인진, 창출, 후박, 진피, 저령, 택사, 백출, 복령, 나복자, 생강, 반하, 대복피, 삼릉, 봉출, 청피 및 감초를 포함하는 혼합 생약재로부터 열탕 추출한 간섬유화 억제 추출물 및 이를 포함하는 약학적 조성물을 개시하고 있다. 또한, 한국등록특허 제0604354호는 인진, 백출, 운지, 와송 및 저령 추출물을 필수적으로 함유하는 간질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 개시하고 있다. 또한, 한국등록특허 제0682045호는 위모 3 내지 5 중량부, 모려분 3 내지 5 중량부, 백렴 3 내지 5 중량부, 제조 3 내지 5 중량부, 인진 1 내지 3 중량부, 택사 1 내지 3 중량부, 섬수 1 내지 3 중량부, 사간 1 내지 3 중량부, 편축 0.5 내지 1.5 중량부, 나복자 0.5 내지 1.5 중량부, 울금 0.5 내지 1.5 중량부, 승마 0.5 내지 1.5 중량부, 백복령 0.5 내지 1.5 중량부, 비파엽 0.5 내지 1.5 중량부, 감초 0.5 내지 1.5 중량부, 정력자 0.1 내지 1 중량부 및 고백반 0.1 내지 1 중량부의 17종의 복합 생약 분말을 용매로 추출하여 제조되는 간섬유화의 예방 및 치료용 한약 추출물을 개시하고 있다. 또한, 한국등록특허 제0867320호는 별갑 5 중량부, 나복자 5 중량부, 인진 5 중량부, 백출 3 중량부, 백복령 3 중량부, 택사 3 중량부, 창출 3 중량부, 단삼 3 중량부, 저령 2 중량부, 사인 2 중량부, 지실 2 중량부, 감초 1 중량부 및 목향 1 중량부의 13종의 복합 생약을 수추출하여 제조되는 간보호, 간섬유화와 간경화의 예방 또는 치료용 한약 조성물을 개시하고 있다.

그러나 이들 조성물은 본 발명과 같이 사인 단독만을 사용한 것이 아니며, 조성물의 조합이 항산화이나 간보호 및 항 간섬유화에 효과가 있다고 주장하고 있으나, 이들 조성물의 제조 및 취급이 용이하지 않을 뿐 아니라 효능 면에서도 여전히 개선의 여지를 안고 있다.

KR 10-0626724 B1 2005년 10월 20일 KR 10-0604354 B1 2005년 12월 8일 KR 10-0682045 B1 2005년 10월 9일 KR 10-0867320 B1 2008년 10월 14일

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명은 항산화기전을 통하여 간세포를 보호하고 간 손상에 의한 간 섬유화의 발생과 간경화의 진행을 억제할 수 있는 식물 추출물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 인체에 무해하고 항산화 또는 간 섬유화 또는 간경화의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 사인(Amomum xanthoides) 추출물만을 유효성분으로 하는 항산화 또는 간 섬유화 또는 간경화의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 사인(砂仁, Amomi Fructus)은 비경(脾經),위경(胃經), 심경(心經), 신경(腎經) 에 작용하고 성미(性味)가 신온(辛溫)하여, 성미(性味)는 산(散)하고, 온성(溫性)은 통하게 하며, 방향(芳香)과 화습(化濕)하는 작용이 있어 화습(化濕).행기(行氣).온중(溫中)시키는데 성(性)이 온(溫)하면서도 조열(燥熱)하지 않고, 행기(行氣)하되 파기(破氣)하지 않은 장점이 있다. 성비개위(醒脾開胃)하므로 중초(中焦)에 습사(濕邪)가 조체(阻滯)하거나 비위에 기체(氣滯) 및 비위가 허(虛)한 모든 증(證)에 적용하여 치료하는 한약재이다.

본 발명에 있어서, 상기 사인 추출물은 열수 추출물 또는 저급알코올 추출물인 것으로, 상기 저급알코올은 메틸알코올이 바람직하다.

보다 상세하게는 상기 사인 추출물은 1) 세척한 사인에 저급 알코올, 물 또는 이들의 혼합 용매를 첨가하여 추출한 후 상등액만을 회수하는 단계;

2) 상기 상등액에 비극성용매을 첨가하여 물 불용성 층과 물 가용성 층으로 분리하는 단계;

3) 상기 물 가용성 층을 여과 및 원심 분리하는 단계;

4)상기 분리된 여과액을 농축한 후 동결건조하여 사인 추출물을 수득하는 단계로 추출되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 단계 1)에서 사인과 저급 알코올, 물 또는 이들의 용매는 1:2 내지 5 (w/v)의 비율로 혼합하는 것으로, 보다 바람직하게는 1:3 내지 4(w/v)의 비율로 혼합하여 사용한다.

본 발명에 있어서, 상기 단계 1)의 저급알코올은 에틸알코올(ethyl alcohol) 또는 메틸알코올(methyl alcohol)인 것으로, 보다 바람직하게는 에틸알코올을 사용한다.

본 발명에 있어서, 상기 단계 2)에서 상기 상등액과 비극성용매는 1: 0.5 내지 3(v/v)의 비율로 혼합하는 것으로, 보다 바람직하게는 1:1(v/v)의 비율로 혼합하여 사용하며, 상기 비극성용매는 석유 에테르(Petroleum ether)인 것을 특징으로 한다.

상기의 방법으로 제조된 것을 사인 추출물이라 할 수 있으며, 이후 상기 사인 추출물에 유기용매를 가하여 분획하여 분획물 형태로 제조할 수도 있다.

본 발명에서는 일실시예로, 사인 추출물은 약 1.12%의 사인 열수 건조 추출물 또는 약 6.62%의 사인 메틸알코올 건조 추출물을 제조하여 사용하였으며, 사인 추출물에 의한 효능을 확인하였다.

상기 사인 추출물은 단독 추출물만으로도 간의 빌리루빈 대사능력과 간세포 손상을 유의성 있게 개선시키고, 간조직의 지질 과산화와 섬유화 및 경화를 효과적으로 억제하며, 간의 염증이나 섬유화와 관련된 TNF-α, iNOS, INF-γ, TGF-β, PDGF, CTGF, 및 α-SMA 유전자의 발현을 효과적으로 억제시킴으로써 항산화 또는 간 섬유화 또는 간경화의 예방 또는 치료에 매우 유용함을 확인하였다.

본 발명에 따른 사인 추출물은 항산화 또는 간 섬유화 또는 간경화의 예방 또는 치료용 조성물로 사용가능하므로. 본 발명은 사인 추출물만을 유효성분으로 하는 항산화 또는 간 섬유화 또는 간경화의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 사인 추출물만을 단독으로 포함할 수 있으며, 그 외 약리학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다.

조성물 내 사인 추출물의 유효함량은 0.01 내지 40 중량%가 바람직하다. 사인 추출물이 0.01 미만인 경우 사인 추출물에 의한 항산화 또는 간 섬유화 또는 간경화의 예방 또는 치료 효과가 미비하여 다량의 투여량을 처리해야하며, 30 중량%를 초과할 경우 효과대비 비경제절일 수 있다. 그러나 가장 바람직한 사인 추출물의 유효함량은 항산화 또는 간 섬유화 또는 간경화 치료제의 사용방법 및 목적에 따라 적절히 조절하는 것이 좋다.

본 발명의 조성물을 약학적 제제의 형태로 제조하는 경우, 유효성분을 약제학적으로 허용되는 통상적인 담체와 함께 배합하여 투여 목적에 따라, 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 츄잉정, 분말제, 액제나 현탁제와 같은 경구 투여용 제제 또는 주사가능한 액제나 현탁제, 비강세척제 등과 같은 비경구 투여용 제제의 형태로 제형화할 수 있다.

경구 투여의 목적으로 본 발명의 유효성분을 정제, 캅셀제, 츄잉정, 분말제, 액제, 현탁제 등의 제제로 제형화하는 경우에는, 아라비아 고무, 옥수수 전분, 미세결정질 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 인산이칼슘 또는 락토오즈와 같은 부형제, 알긴산, 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 붕해제, 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제, 슈크로오즈 또는 사카린과 같은 감미제 및 페퍼민트, 메틸 살리실산염 또는 과일향과 같은 향미제가 포함될 수 있다. 단위 투여형이 캅셀제인 경우에는 상기 성분외에도 폴리에틸렌 글리콜 또는 지방유와 같은 액상 담체가 포함될 수도 있다.

또한, 비경구 투여를 위한 용액 또는 현탁액 형태의 주사제는 비경구적으로, 예를 들면 피하, 정맥내, 근육내 또는 복강내로 투여될 수 있다. 일반적으로, 주사가능한 용액 또는 현탁액은 물, 염수, 수성 덱스트로스 및 관련된 설탕 용액제, 비휘발성 오일, 에탄올, 글리세린, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜류 등의 약제학적으로 허용되는 액상 담체 중에 유효량의 활성성분을 균질하게 혼합시켜 제조할 수 있다. 이외에도 필요에 따라 항세균제, 킬레이트제, 완충제, 보존제와 같은 보조제를 포함시킬 수도 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체로는 약제학적으로 순수하고, 실질적으로 무독성이며, 활성성분의 작용을 저해하지 않는 임의의 모든 보조제를 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기한 약학적 제제 외에도, 기존의 청량 음료, 미네랄 워터, 알코올 음료 등의 음료 제품 또는 츄잉껌이나 캐러멜 제품, 캔디류, 빙과류, 과자류 등에 적당량 배합하거나, 비타민이나 미네랄 등을 포함한 건강식품이나 건강보조식품, 또는 식품 첨가제 등에 포함시켜 식품 또는 식품 보조제의 형태로 제조할 수도 있다.

본 발명에 따른 조성물은 통상 건조 추출물 기준으로 1 일 50~500 ㎎/㎏, 바람직하게는 100 내지 200 ㎎/㎏의 용량으로 투여될 수 있지만, 이는 투여대상의 연령, 성별, 식이, 건강상태, 질환의 중증도, 투여방법, 투여시간, 약제혼합 등에 따라 적의 증감될 수 있다.

본 발명에 따른 사인 추출물은 인체에 무해하고 단독 추출물만으로도 간의 빌리루빈 대사능력과 간세포 손상을 유의성 있게 개선시키고, 간조직의 지질 과산화와 섬유화 및 경화를 효과적으로 억제하며, 간의 염증이나 섬유화와 관련된 TNF-α, iNOS, INF-γ, TGF-β, PDGF, CTGF, 및 α-SMA 유전자의 발현을 효과적으로 억제시킴으로써 항산화 또는 간 섬유화 또는 간경화의 예방 또는 치료에 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 사인 열수 추출물의 공정과정을 도식화 한 것이고,
도 2는 본 발명에 따른 사인 메틸알코올 추출물의 공정과정을 도식화 한 것이며,
도 3은 본 발명의 사인 추출물에 대한 핑거프린트(fingerprint) 분석 결과이고,
(A: 메틸알코올 추출물, B: 열수 추출물)
도 4는 14주간 TAA처리에 의해 유도된 만성 간 손상 동물 모델을 대상으로 본 발명의 사인 메틸알코올 추출물의 처리에 따른 간의 조직형태학적 분석결과를 보여주는 것이며,
(A: 전체적인 외관, B: 간의 조직학적 변화, C: 간의 섬유질 염색결과, D: 간 조직에서 활성화된 간성상세포의 염색결과)
도 5는 14주간 TAA처리에 의해 유도된 만성 간 손상 동물 모델을 대상으로 본 발명의 사인 메틸알코올 추출물의 처리에 따른 간 섬유화 관련 유전자의 발현정도를 확인한 결과이고,
(A: ELISA 분석결과, B: RT-PCR 분석결과)
도 6은 쥐의 간성상세포주(T-6 cell)를 대상으로 본 발명의 사인 메틸알코올 추출물의 처리에 따른 간 섬유화 관련 유전자의 발현정도를 확인한 결과이며,
도 7은 3주간 DMN처리에 의해 유도된 만성 간 손상 동물 모델을 대상으로 본 발명의 사인 열수 추출물의 처리에 따른 간의 조직형태학적 분석결과를 보여주는 것이다.
(A: 간의 조직학적 변화, B: 간의 섬유질 염색결과, C: 간 조직에서 활성화된 간성상세포의 염색결과)

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하지만 이들에 의해 본 발명의 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

[제조예 1] 사인 열수 추출물의 제조

사인(砂仁, Amomi Fructus)을 증류수로 세척 후 초음파 세척기를 이용하여 한 번 더 세척한 다음 60℃ 드라이오븐에서 완전히 건조시킨다. 상기 건조된 사인 4 ㎏에 증류수 4 ℓ을 첨가한 후, 약탕기를 이용하여 2시간 열수 추출하였다. 상기 추출한 전탕액을 여과와 원심분리를 거친 후에 동결건조하여 최종적으로 전탕 전의 건조중량 대비 약 1.12% 의 사인 열수 건조 추출물(이하, 'WAX'(Water extract of Amomum xanthoides)라 칭함)을 회수하였다.

상기 사인 열수 건조 추출물의 품질관리를 위해, 추출물 내 주요성분에 대해 지표성분(reference components)을 이용하여 HPTLC(High Performance Thin Layer Chromatography)에 의해 지문(fingerprint)을 확인하였다. 그 결과를 도 3의 B에 나타내었다. 도 3의 B 그림 내 표시된 A는 Borneol(10 mg/mL)를, B는 WAX(100mg/mL)를 각각 나타낸 것이다.

[제조예 2] 사인 메틸알코올 추출물의 제조

사인를 증류수로 세척 후 초음파 세척기를 이용하여 한 번 더 세척한 다음 60℃ 드라이오븐에서 완전히 건조시킨다. 건조된 사인은 분쇠기를 이용하여 분말 형태로 만들어 4.2 ㎏의 분말에 메틸알코올 12 ℓ를 첨가하여 통상의 방법으로 7일 이상 추출하였다. 상기 추출하여 얻어진 상층액(이하, 'MAX': methanol extract of Amomum xanthoides라 칭함)을 여과와 원심분리를 거친 후 수득된 추출액 총 부피에 대해 10%의 물을 첨가하였고, 상기 최종부피에 대해 1:1 비율로 석유 에테르(Petroleum ether)를 섞은 뒤 분리된 에테르층과 메틸알코올층 중 메틸알코올층만을 여과 및 원심분리를 거친 후에 농축 건조하여 최종적으로 전의 건조중량 대비 약 6.62%의 사인 메틸알코올 건조 추출물(이하, 'MFAX':methanol soluble fraction of Amomum xanthoides 라 칭함)을 회수하였다.

상기 사인 메틸알코올 건조 추출물의 품질관리를 위해, 추출물 내 주요성분에 대해 지표성분(reference components)을 이용하여 HPTLC에 의해 핑거프린트(fingerprint)를 확인하였다. 그 결과를 도 3의 A에 나타내었다. 도 3의 A 그림 내 I는 Borneol(10 mg/mL)을 II는 MAX (100 mg/mL)를; III는 MFAX (100 mg/mL)를 각각 나타낸다.

[실험예 1] 만성 간 손상 동물 모델에서 사인 추출물의 효능 검증 실험 I

(1) 14주간 TAA처리에 의해 유도된 만성 간 손상 쥐를 대상

SPF(Specific Pathogene Free)급 6 주령 웅성 SD(Sprague-Dawley) 쥐 45 마리를 오리엔트바이오(경기도)로부터 구입하여 1 주간 적응기간을 두고 22±2℃, 55±10% 상대습도 및 12 시간 명암주기에서 고형사료(오리엔트바이오)와 수돗물을 자유롭게 섭취하도록 하였다.

평균체중 200±10 g의 쥐를 무작위로 그룹 당 9 마리로 하여 하기 그룹으로 나누었다.

정상군(Normal): 무처리군

대조군(TAA): 14 주간 TAA 처리 중 7 주간 증류수 투여군

약물 투여군: 14 주간 TAA 처리 중 7 주간 MFAX 25 ㎎/㎏ 또는 50 ㎎/㎏ 또는 100 ㎎/㎏ 투여군

상기 TAA(Thioacetamide)는 식염수에 희석시켜 대조군, 약물 투여군(MFAX 25, MFAX 50 및 MFAX 100 그룹)에 대해 매주 2회 체중 ㎏당 200 ㎎/2 ㎖로 복강 내 주사하였다. 모든 그룹들은 14 주 마지막 TAA 처리 후에 희생시켰다. 상기 대조군 및 약물 투여군에는 TAA 처리 7주부터 시작하여 7 주간 매일 MFAX(일일 25 또는 50 또는 100 mg/kg) 또는 대조군에는 증류수를 투여하였다.

모든 동물의 체중 변화를 실험기간 전체를 통해 매주 기록하고, 동물을 실험 마지막 날 희생시키고 간과 비장을 적출하여 칭량하였다.

그 결과를 상기 표 1 에서도 확인할 수 있듯이, 14 주간 TAA를 처리한 TAA 14주 처리군에서는 무처리한 실험군에 비해 간 무게가 감소된 반면, 비장 무게를 증가된 것을 확인할 수 있었다. 반면 TAA 처리 7주부터 시작하여 7주 동안 MFAX(사인 메틸알코올 건조 추출물) 처리 특히, MFAX의 고농도 처리군(100 mg/kg)의 경우 TAA 14주 처리군에 비해 간 무게를 현저히 증가되었고, 비장 무게는 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

간장(肝臟)의 조직형태학적 평가를 위해, 간조직의 일부를 보우인 용액(Bouin's solution)에 고정시킨 후 파라핀에 포매시킨 간을 잘라내고(4 ㎛ 두께) 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색 , 메이슨 트리콤(Masson's trichome) 염색 및 간 성상세포 마커인 α-SMA(alpha-smooth muscle actin)면역염색을 시행하였다. 괴사나 염증성 세포 침윤 및 섬유화와 같은 대표적인 조직병리학적 특징을 현미경 하에서 조사하였다.

도 4의 A에 육안으로 관찰한 간의 전체적인 외관을, 도 4의 B에 간의 조직학적 검사결과를, 도 4의 C에 간의 콜라겐 검사결과를, 도 4의 D에 간 조직내의 α-SMA 사이토카인 면역학적 겸사결과를 나타내었다. 도 4의 A에서도 확인할 수 있듯이, TAA 처리는 간을 위축시키고 부분적으로 불규칙한 함몰이 있으며 표면은 조잡하게 결절을 유발시키는 것으로 나타난 반면 MFAX 처리한 약물 투여군에서는 상기 변화를 회복시키는 것을 확인할 수 있었다.

도 4의 B 및 C에서도 확인할 수 있듯이, 14 주간의 TAA 처리는 심각한 조직의 괴사, 염증성 세포 침윤, 출혈, 일부 간 소정맥이 없어짐 및 넓은 범위 섬유화를 유발시켰으나 7주간의 MFAX 투여를 통해 상기의 현상들을 현저히 회복시키는 것을 확인할 수 있었다(파랑색: 섬유질 부분). 또한, 도 4의 D에서도 확인할 수 있듯이, 14 주간의 TAA 처리는 간성상세포의 활성화를 많이 유발시켰으나 7주간의 MFAX 투여가 상기 간성세포의 활성화를 현저히 억제하는 것을 확인할 수 있었다(갈색: 활성화된 간 성상세포 부분).

상기 모든 그룹의 쥐를 14주 후 전체 실험의 마지막 날에 에테르로 마취한 후 복부 대동맥을 통해 채혈하였다. 혈액으로부터 혈청을 분리하고, 혈청 중 총 단백질, 알부민, 총 빌리루빈 (Bilirubin), 알칼라인 포스파타아제(ALP), 아스파테이트 트랜스아미나아제(AST), 및 알라닌 트랜스아미나아제(ALT)를 오토 케미스트리 애널라이저(Auto Chemistry Analyzer)(카이런사(Chiron Ltd.), USA)를 이용하여 측정하였 상기 표 1에 나타내었다.

상기 표 1에서도 확인할 수 있듯이, 14 주간의 TAA 처리는 총 빌리루빈, ALP, AST 및 ALT의 상승과 함께 총 단백질 및 알부민의 감소를 포함한, 간 기능부전을 유도하였으나, 7주간의 MFAX 투여가 상기 생화학적 지수를 부분적으로 회복시켰으며 특히, 빌리루빈 농도는 유의성 있게 감소시켰다.

간 조직에서 섬유질 정량하기 위해서 하이드록시프롤린(Hydroxyproline) 농도를 측정하였다. 즉, -70℃에서 보관된 간 조직(200 mg)을 2 ㎖의 6 N 염산(HCl)에서 균질화시킨 후 110℃에서 24시간동안 인큐베이션하였다. 여과지를 이용하여 산 가수분해물을 여과한 후, 6 N HCl 중 50 ㎕의 샘플과 표준 하이드록시프롤린을 인큐베이션하여 HCl을 건조 제거하고, 50 ㎕의 메탄올, 1.2 ㎖의 50% 이소프로판올, 및 200 ㎖의 클로라민 T 용액을 순차적으로 가한 후 실온에서 10 분간 인큐베이션하였다. 그 후, 3 ㎖의 에를리히 용액(Ehrlich's solution)을 혼합물에 가하고 50 ℃에서 90 분간 더 인큐베이션하였다. 반응혼합물의 흡광도를 558 ㎚에서 측정하였다. 표준곡선을 0~1.0 ㎎/50 ㎕의 하이드록시프롤린 용액을 이용하여 제작하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

상기 표 2에서도 확인할 수 있듯이, 14 주간의 TAA 처리는 하이드록시프롤린을 급격하게 증가시켰으나, MFAX 투여가 처리농도 의존적으로 현저하게 하이드록시프롤린을 억제시킴을 확인할 수 있었다.

간 조직에서 지질 과산화를 티오바비튜르산 반응성 물질(thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)의 방법을 이용하여 측정하였다. TBARS의 농도를 표준물질로서 1,1,3,3-테트라에톡시프로판(TEP)을 이용하여 조직 g 당 말론디알데히드(MDA)의 μM로 나타내었다. 즉, 200 mg의 간 조직을 2 ㎖의 11.5 g/ℓ KCl에서 균질화하고 0.13 ㎖의 균질물을 0.08 ㎖의 인산(燐酸) 및 0.26 ㎖의 0.67% 티오바비튜르산(TBA)과 혼합하였다. 혼합물을 100℃에서 45분간 가열한 후, 1.03 ㎖의 n-부탄올을 가한 후 격렬하게 혼합하고 15 분간 원심 분리하였다. 상층액의 흡광도를 분광광도계로 535 및 520 ㎚에서 측정하고 표준물질로서 신선하게 제조된 TEP의 값과 비교하였다. 그 결과를 상기 표 2에 나타내었다. 상기 표 2에서도 확인할 수 있듯이, 14 주간의 TAA 처리는 지질 과산화를 현저히 발생시키는 것을 확인할 수 있었으나, MFAX 투여가 처리 농도 의존적으로 지질 과산화를 유의성 있게 저하시킴을 확인할 수 있었다.

간 조직에서 항산화 펩티드 과 효소, 활성산소(ROS: Reactive oxygen species) 등 측정하였다. 그 결과를 상기 표 2에 나타내었다. 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 4 주간의 TAA 처리는 Glutathione(GSH) 의 농도를 현저히 감소시켰으며, GSH peroxidase, Gatalase와 Superoxide dismutase(SOD)의 활성을 뚜렷하게 저하시켰고 활성산소의 양을 2배 이상 증가시키는 것을 확인할 수 있었으나, MFAX 투여를 통해 GSH 농도를 회복시키고, GSH peroxidase, Gatalase와 Superoxide dismutase (SOD)의 활성을 증가시키며, 활성산소의 양을 정상 수준으로 감소시킴을 확인할 수 있었다.

또한, 항 섬유화 효능의 기전을 밝히기 위해 섬유화 관련 유전자 발현을 분석하였다. 총 RNA를 간 조직 샘플로부터 트리졸(인비트로젠(Invitrogen), USA), RNAlater(Ambion, Inc., USA) 및 RNA 이지 칼럼(Qiagen, Inc., USA)을 이용하여 추출하였다. 상보적 DNA(cDNA)를 10 pmol의 올리고 dT 및 10 pmol/ℓ의 랜덤 헥사머(바이오니아, 한국)를 이용하여 합성하고, PCR PreMix kit(바이오니아, 대전)를 이용하여 RT-PCR를 수행하였다. 사용된 프라이머는 하기 표 3과 같았다.

그 결과를 도 5의 B에 나타내었다. 도 5의 B에서도 확인할 수 있듯이, MFAX는 세포 파괴와 염증 및 간섬유화의 과정에서 중요한 역할을 담당하는 TNF-α, iNOS, INF-γ, TGF-β, PDGF, CTGF,α-SMA 유전자의 발현을 억제시키는 것을 확인할 수 있었다.

ELISA 방법 이용하여 간 조직에서 간 섬유화 관련된 사이토카인들을 분석하였다. 그 결과를 도 5의 A에 나타내었다. 도 5의 A에 나타난 바와 같이, 14 주간의 TAA 처리는 PDGF, CTGF의 농도를 현저히 증가시켰으나 MFAX 투여를 통해 처리 농도 의존적으로 PDGF, CTGF의 농도가 감소되었고, 간 조직에 TGF-β의 농도의 경우는 각 그룹간에 큰 차이 없었다.

정량적 실시간 PCR방법을 이용하여 MFAX 간성상세포에서 활성화 및 Collagen생성 관련 유전자들을 분석하였다. 간 섬유화 형성과정 중 주용 역할 갖고 있는 간 성상세포에서 기전을 더 밝히기 위해서 정량적 실시간 PCR를 시행하였다. HSC-T6세포(5×10⁵ cell/mL)에 MFAX를 6시간 처리하였다. 총 RNA를 HSC-T6세포 샘플로부터 트리졸(인비트로젠(Invitrogen), USA), RNAlater(Ambion, Inc., USA) 및 RNA 이지 칼럼(Qiagen, Inc., USA)을 이용하여 추출하였다. 상보적 DNA(cDNA)를 10 pmol의 올리고 dT 및 10 pmol/ℓ의 랜덤 헥사머(바이오니아, 한국)를 이용하여 합성하고, 정량적 실시간 PCR을 SYBR 그린 슈퍼믹스 시약(바이오-래드(Bio-Rad), USA)을 이용하여 수행하였다. 사용된 프라이머는 하기 표 4에 나타내었다.

반응을 12.5 ㎕의 iQ SYBR 그린 슈퍼믹스, 1 ㎕의 10 pmol/ℓ 프라이머 쌍, 10.5 ㎕의 증류수, 및 1 ㎕의 cDNA를 이용하여 수행하였다. 각 PCR 런을 아래 조건 하에서 수행하였다: 95℃에서 5 분간 최초 변성, 95℃ 1 분 변성, 58℃ 40초 어닐링, 및 72℃ 40초 연장을 포함하는 40 증폭 주기 후 단일 형광 측정하였다.

그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서도 확인할 수 있듯이, MFAX는 세포 콜라겐의 형성과정에서 중요한 역할을 담당하는 α-SMA, proCOL T1, proCOL T3 유전자의 발현을 억제시키는 것을 확인할 수 있었다.

(2) 3주간 DMN처리에 의해 유도된 만성 간섬유화 쥐를 대상

SPF(Specific Pathogene Free)급 6 주령 웅성 SD(Sprague-Dawley) 쥐 32 마리를 오리엔트바이오(경기도)로부터 구입하여 1 주간 적응기간을 두고 22±2℃, 55±10% 상대습도 및 12 시간 명암주기에서 고형사료(오리엔트바이오)와 수돗물을 자유롭게 섭취하도록 하였다.

평균체중 200±10 g의 쥐를 무작위로 그룹 당 8 마리를 하기 그룹으로 나누었다.

정상군: 무처리군,

대조군: 3 주간의 DMN 처리 중 3 주간 증류수 투여군

약물 투여군: 3 주간 DMN 처리 중 3 주간 WAX 50 또는 100 ㎎/㎏ 투여군

상기 DMN(Dimethylnitrosamine)는 생리식염수에 희석시킨 후, 3 주간 대조군, 약물 투여군(WAX 50 및 WAX 100 그룹)에 대해 매주 연속으로 3일간 10 ㎎/kg로 복강 내 주사하였다.

모든 그룹들은 3 주 뒤에 희생시켰다. 대조군 및 약물 투여군(WAX 50 및 WAX 100 그룹)에는 3 주간 매일 WAX(일일 50 또는 100 mg/kg) 또는 대조군에는 증류수를 투여하였다.

모든 동물의 체중 변화를 실험기간 전체를 통해 매주 기록하고, 동물을 실험 마지막 날 희생시키고 간과 비장을 적출하여 칭량하여 하기 표 5에 나타내었다.

상기 표 5에서도 확인할 수 있듯이, 3 주간의 DMN 처리(대조군)는 무처리군에 비해 몸무게, 간 무게 및 비장무게를 모두 감소시키는 반면, 약물 투여군(WAX 100 mg/kg)에서는 몸무게의 증가 및 간의 무게를 현저히 증가시시는 것을 확인할 수 있었으나 비장 무게를 큰 변화가 없는 것을 확인할 수 있었다.

3주 뒤에 쥐를 에테르로 마취한 후 복부 대동맥을 통해 채혈하였다. 혈액으로부터 혈청을 분리하고, 혈청 중 총 단백질, 알부민, 총 빌리루빈(Bilirubin), 알칼라인 포스파타아제(ALP), 아스파테이트 트랜스아미나아제(AST), 및 알라닌 트랜스아미나아제(ALT)를 오토 케미스트리 애널라이저(Auto Chemistry Analyzer)(카이런사(Chiron Ltd.), USA)를 이용하여 측정하였다.

그 결과 상기 표 5에 나타내었다. 상기 표 3에서도 확인할 수 있듯이, 3주간 DMN의 처리는 총 단백질, 알부민에는 영향을 주지 않았으나 총 빌리루빈, ALP, AST 및 ALT의 상승을 포함한 간 기능부전을 유도시켰다. 그러나 약물 투여군(WAX 100 mg/kg)에서 대조군 비해서 이들 생화학적 전반적으로 회복되었으나 특히, AST, ALT, ALP, 빌리루빈 수치를 유의성 있게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.

도 7의 A는 간의 조직학적 검사결과를, 도 7의 B는 간의 콜라겐 검사결과를, 도 7의 C는 간 조직 내의 α-SMA 사이토카인 면역학적 겸사결과를 나타내었다.

도 7의 A에서 확인할 수 있듯이, DMN 처리는 간을 위축시킨 반면 WAX 처리 특히 고농도(100 mg/kg)에서 이들 변화를 회복시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 7의 A와 B에서 확인할 수 있듯이, 3 주간의 DMN 처리는 간 조직의 심각한 괴사, 염증성 세포 침윤, 출혈, 일부 간 소정맥이 없어짐 및 콜라겐을 유발시키는 것을 확인할 수 있었고, 3주간 WAX 투여를 통해 이들 현상을 현저한 회복시키는 것을 확인할 수 있었다(파랑색: 섬유질 부분). 또한, 도 7의 C에서 확인할 수 있듯이, 3 주간의 DMN 처리는 간성상세포의 활성화를 많이 유발시켰고, 3 주간 WAX 투여를 통해 이들 현상을 현저한 억제시킴을 확인할 수 있었다(갈색: 활성화된 간 성상세포 부분).

간 조직에서 섬유질 정량하기 위해서 하이드록시프롤린(Hydroxyproline) 농도를 측정하였다. 즉, -70℃에서 보관된 간 조직(200 mg)을 2 ㎖의 6 N 염산(HCl)에서 균질화시킨 후 110℃에서 24시간동안 인큐베이션하였다. 여과지를 이용하여 산 가수분해물을 여과한 후, 6 N HCl 중 50 ㎕의 샘플과 표준 하이드록시프롤린을 인큐베이션하여 HCl을 건조 제거하고, 50 ㎕의 메탄올, 1.2 ㎖의 50% 이소프로판올, 및 200 ㎖의 클로라민 T 용액을 순차적으로 가한 후 실온에서 10 분간 인큐베이션하였다. 그 후, 3 ㎖의 에를리히 용액(Ehrlich's solution)을 혼합물에 가하고 50 ℃에서 90 분간 더 인큐베이션하였다. 반응혼합물의 흡광도를 558 ㎚에서 측정하였다. 표준곡선을 0~1.0 ㎎/50 ㎕의 하이드록시프롤린 용액을 이용하여 제작하였다. 그 결과를 상기 표 5에 나타내었다.

상기 표 5에서 확인할 수 있듯이, DMN 처리는 하이드록시프롤린을 급격하게 증가시켰으며, WAX 투여를 통해 하이드록시프롤린을 농도 의존적으로 현저하게 억제됨을 확인할 수 있었다.

간 조직에서 지질 과산화를 티오바비튜르산 반응성 물질(thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)의 방법을 이용하여 측정하였다. TBARS의 농도를 표준물질로서 1,1,3,3-테트라에톡시프로판(TEP)을 이용하여 조직 g 당 말론디알데히드(MDA)의 μM로 나타내었다. 즉, 200 mg의 간 조직을 2 ㎖의 11.5 g/ℓ KCl에서 균질화하고 0.13 ㎖의 균질물을 0.08 ㎖의 인산(燐酸) 및 0.26 ㎖의 0.67% 티오바비튜르산(TBA)과 혼합하였다. 혼합물을 100℃에서 45 분간 가열한 후, 1.03 ㎖의 n-부탄올을 가한 후 격렬하게 혼합하고 15 분간 원심 분리하였다. 상층액의 흡광도를 분광광도계로 535 및 520 ㎚에서 측정하고 표준물질로서 신선하게 제조된 TEP의 값과 비교하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.

상기 표 5에서 확인할 수 있듯이, 3 주간의 DMN 처리는 지질 과산화를 현저히 증가시키는 반면, WAX 투여를 통해 지질 과산화를 농도 의존적으로 유의하게 저하됨을 확인할 수 있었다.

간 조직에서 항산화 펩티드 과 효소, TAC(총 항산화능력,total antioxidant capacity) 등 측정하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다. 상기 표 5에서도 확인할 수 있듯이, 3 주간의 DMN 처리는 TAC를 현저히 감소시키는 반면 WAX 투여를 통해 농도 의존적으로 유의성 있게 회복되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 3 주간의 DMN 처리는 Glutathione(GSH)의 농도를 현저히 감소시켰고, Gatalase와 Superoxide dismutase(SOD)의 활성을 뚜렷하게 저하시키는 것을 확인할 수 있었다. 이에 비해 WAX 투여군은 감소된 GSH 농도를 회복시켰고 Gatalase와 Superoxide dismutase(SOD)의 활성이 현저히 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

상기의 결과는 본 발명의 사인(Amomum xanthoides) 추출물이 단독 사인 추출물만으로도 간의 빌리루빈 대사능력과 간세포 손상을 유의성 있게 개선시키고, 간조직의 지질 과산화와 섬유화 및 경화를 효과적으로 억제하며, 간의 염증이나 섬유화와 관련된 TNF-α, iNOS, INF-γ, TGF-β, PDGF, CTGF, 및 α-SMA 유전자의 발현을 효과적으로 억제시킴으로써 항산화 또는 간 섬유화 또는 간경화의 예방 또는 치료에 유용하게 이용할 수 있음 확인한 결과이기도 하다.

Claims

사인(Amomum xanthoides) 추출물만을 유효성분으로 하는 항산화 또는 간 섬유화 또는 간경화의 예방 또는 치료용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 사인(Amomum xanthoides) 추출물은 열수 추출물 또는 저급알코올 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 저급알코올은 메틸알코올인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 사인 추출물은
1) 세척한 사인에 저급 알코올, 물 또는 이들의 혼합 용매를 첨가하여 추출한 후 상등액만을 회수하는 단계;
2) 상기 상등액에 비극성용매을 첨가하여 물 불용성 층과 물 가용성 층으로 분리하는 단계;
3) 상기 물 가용성 층을 여과 및 원심 분리하는 단계;
4)상기 분리된 여과액을 농축한 후 동결건조하여 사인 추출물을 수득하는 단계로 추출되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 단계 1)에서 사인과 저급 알코올, 물 또는 이들의 용매는 1:0.5 내지 5 (w/v)의 비율로 혼합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 단계 1)의 저급알코올은 에틸알코올(ethyl alcohol) 또는 메틸알코올(methyl alcohol)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 단계 2)에서 상기 상등액과 비극성용매는 1: 0.5 내지 3(v/v)의 비율로 혼합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 7항에 있어서,
상기 단계 2)의 비극성용매는 석유 에테르(Petroleum ether)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 내지 제 8항 중 선택되는 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 TNF-α, iNOS, INF-γ, TGF-β, PDGF, CTGF, 및 α-SMA 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.