KR20100030984A

KR20100030984A - 박테리오신을 생산하는 유산균주 및 이를 함유하는 가축용 복합 생균제 조성물

Info

Publication number: KR20100030984A
Application number: KR1020080089987A
Authority: KR
Inventors: 김경수; 신명수; 이완규
Original assignee: (주)오비티
Priority date: 2008-09-11
Filing date: 2008-09-11
Publication date: 2010-03-19
Also published as: KR101068531B1

Abstract

본 발명은 박테리오신을 생산하는 유산균주 및 이를 함유하는 가축용 복합생균제 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서는 돼지와 개의 소화기관, 그리고 전통발효식품인 김치로부터 각각 유래되고 항균물질을 생산하는 3개의 균주, 락토바실러스 AP 116 (Lactobacillus sp. AP 116, KACC 91396P), 엔테로코커스 패슘 CB 712 (Enterococcus faecium CB 712, KACC 91395P), 페디오코커스 펜토사시우스 K23-2 (Pediococcus pentosaceus K23-2, KACC 91397P)가 분리, 동정된다. 또, 본 발명에서는 이들을 이용한 복합 생균제 조성물이 제공된다.

양돈, 축산, 유산균, 박테리오신, 항균물질, 프로바이오틱스, 생균제

Description

박테리오신을 생산하는 유산균주 및 이를 함유하는 가축용 복합 생균제 조성물 {Novel bacteriocin-producing lactic acid bacteria and mixed microbial composition using it for livestocks}

본 발명은 병원성 유해세균을 억제하는 항균물질을 생산균주 및 이를 이용한 생균제 조성물에 관한 것으로, 특히 박테리오신을 생산하는 유산균주 및 이를 함유하는 가축용 복합생균제 조성물에 관한 것이다.

1928년 항생제(antibiotics)가 발견된 이후로, 1950년대부터 가축의 치료 및 성장촉진을 목적으로 항생제가 광범위하게 가축사양에 사용되어 왔다. 준치료적 수준의 낮은 농도의 항생제를 축산업에 사용하면서, 가축의 질병방제, 성장촉진, 사료효율 개선 등의 생산성이 향상되었으며, 양축농가의 소득 증가에 기여하였다. 그러나 1960년 이후부터 항생제에 대한 문제점이 대두되기 시작하여, 최근에는 항생제의 오남용으로 인한 내성균주의 출현과 축산물 내 잔류 항생물질로 인한 안전성 문제가 야기되면서 항생물질의 사용이 점차 규제되고 있는 추세이다. 우리나라의 축산용 항생제의 사용량은 2006년 현재 1,458톤이며, 외국의 선진 축산국가와 육류 생산량 당 항생제 사용량을 비교하였을 때, 상당히 많은 양을 사용하고 있으 며, 사용되는 항생제의 40% 이상이 질병치료 목적이외의 성장촉진을 목적으로 사용되고 있다. 특히 축종별 항생제의 사용량을 비교하였을 때, 돼지(57%)와 닭(19%)에 주로 사용되었다. EU에서는 2006년부터 가축의 성장촉진을 목적으로 하는 항생제의 사용을 전면 금지한 바 있으며, 우리나라에서도 2005년부터 사료에 첨가할 수 있는 항생제의 종류를 52종에서 25종으로 감소시켰다. 이러한 축산환경의 변화 외에도 축산물의 안전성에 대한 소비자들의 관심과 무항생제 사용 축산물에 대한 요구가 높아짐에 따라 항생제 대체물질의 개발 필요성은 더욱 커지고 있다.

항생제 대체물질로는 생균제(probiotics), 산성화제(acidifer), 면역조절 및 증강 물질, 사료첨가용 복합효소제, 기능성 천연추출물 등이 있으나, 이중 장내미생물의 균형을 개선하여 숙주동물에게 유익한 작용을 하는 생균제가 가장 각광을 받고 있다. 가축용 생균제로서 사용되고 있는 미생물로는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius), 엔테로코커스 패슘(Enterococcus faecium), 페디오코커스속 미생물(Pediococcus sp.), 비피도박테리움속 미생물(Bifidobacterium sp.)과 같은 유산균과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae) 및 효모류가 있다. 좋은 가축용 생균제의 조건으로는, 첫째, 생균제를 적용할 가축의 장내미생물로부터 분리함으로써 안전성 및 장내 정착 등에 도움을 주어야하며, 둘째, 내산성 및 내담즙산성을 지니고 있어서 음용 시 장내에 도착하여 그 효능을 발휘할 수 있어야하고, 셋째, 병원성미생물에 대한 항균물질(유기산, 과산화수소, 박테리오신 등)을 생산 하여야 하며, 넷째, 제조과정 및 유통기간 내에 생균수로 생존할 수 있는 안정성을 보유하여야 한다. 가축용 생균제의 주요 기작은, 장내 병원성 미생물들에 대하여 유기산, 과산화수소(H2O2), 박테리오신(bacteriocin) 같은 항병성 인자의 생성과 경쟁적 배제(competitive exclusion) 등을 통하여 장내 유해세균 및 부패 관련 균주들을 감소시킴으로써 가축의 성장촉진 및 사료효율 상승효과를 유발하는 것이다. 또한 분뇨 배설량 감소 및 악취성 유해가스 발생의 억제를 통하여 가축의 사육환경을 개선하기도 한다.

박테리오신은 세포 외로 분비되는 단백질 또는 펩타이드계 항균물질로서 생산균주와 근연관계에 있는 미생물을 죽이거나 생육을 억제하는 물질이라고 알려져 있다. 또한 소화기계의 여러 단백질 분해효소에 의해 분해 되므로 인체에 무해하고 잔류성이 없는 장점이 있다. 따라서 최근에는 천연의 식품보존제로서 활용하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 현재, 산업적으로 실용화되고 있는 유일한 박테리오신인 니신(nisin)은 약 50개국에서 가공치즈, 야채, 과일의 통조림, 발효유 제품 등에 식품보존제로서 사용되고 있다. 국내에서도 전통발효식품(김치, 젓갈)에서 유래한 유산균들이 생산하는 박테리오신의 식품부패 관련 병원성균주들에 대한 억제효과 등이 보고 되고 있다(Kwon 등, 2002).

가축 질병치료에 적용된 박테리오신으로는, 발효유식품에서 분리한 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)에 의해 생산된 락티신(lacticin) 3147을 젖소의 유방염 치료에 효과적으로 사용한 예가 있으며(Ryan 등, 1998), 대장균(E. coli)에 의해 생산되는 박테리오신인 콜리신(colicin)과 마이크로신(microcin)을 가금류 또 는 소에 투여하여 살모넬라(Salmonella) 및 대장균(E. coli)O157:H7의 생육을 억제한 보고가 있다(Gillor 등, 2004; Diez-Gonzalez, 2007). 그 밖에 돼지(박경준 등, 1995; Rodriguez 등, 2003), 가금류(Halami 등, 1999; Poeta 등, 2006) 등으로부터 박테리오신을 분리 및 확인한 보고도 있다.

그러나, 아직까지는 가축으로부터 박테리오신을 생산하는 유산균들을 분리하여 특성 및 작용기작을 밝히고, 박테리오신 또는 박테리오신 생산 유산균주를 이용하여 가축용 생균제를 개발하고자 하는 연구들은 찾아보기 어렵다.

본 발명에서는 박테리오신을 생산하는 유산균을 분리하여 제공하고자 하며, 아울러 이를 이용한 생균제 조성물을 제공하고자 한다.

가축용 생균제로 사용되고 있는 미생물로는 바실러스(Bacillus), 엔테로코커스(Enterococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 페디오코커스(Pediococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 이스트(yeast) 등이 있으나, 생균제 선발기준인 장내부착, 정착성, 안전성 등을 고려한다면 사용하고자 하는 축종으로부터 분리한 미생물을 이용하여 생균제를 제조하는 것이 바람직한 방법이다. 축산용 생균제, 특히 양돈용 생균제를 개발하기 위하여 돼지의 분변 및 소화기관으로부터 내산성 및 내담즙산성을 지닌 유산균을 분리하기도 하였으나(이미성 등, 2006; 유자영 등, 2002; 홍종욱 등, 2002; 변재원 등, 2000), 박테리오신 생산 미생물을 이용하여 병원성 세균에 대하여 광범위한 항균효과를 지닌 생균제를 개발한 예는 거의 없는 실정이다. 본 발명에서는 특히 돼지로부터 유용 미생물인 박테리오신 생산 유산균주를 분리하여 제공하고자 하며, 특히 클로스트리디움 퍼프린진스(Clostridium perfringens)와 리스테리아속 미생물(Listeria sp.)에 대하여 강력한 항균능을 지닌 박테리오신 생산균주를 제공하고자 한다. 본 발명에서 제공하는 상기 박테리오신 생산 균주들은 유기산을 생산하여 그람음성균인 살모넬라속 미생물(Salmonella sp.), 대장균(E. coli) 등에도 항균효능을 지닌다.

가축의 장내에는 400여종의 다양한 미생물들이 생태계를 이루면서 상호생존 하고 있기 때문에, 동일 속의 다른 미생물 또는 다른 속의 미생물들로 이루어진 복합생균제를 사용하는 것이 단일 미생물로 이루어진 생균제보다 가축의 장내 생존에 유리하며, 성장률 및 폐사율에서 개선효과가 있었다고 보고 되어 있다(Timmerman 등, 2004). 본 발명에서는 돼지로부터 분리된 박테리오신 생산 유산균주를 주축으로 하여 유래가 다른 박테리오신 생산 균주 및 이들이 생산하는 여러 종류의 박테리오신을 조합한 복합생균제를 제공하고자 하며, 특히 돼지 사육에 적합하고 항생제를 대체할 수 있는 복합생균제를 제공하고자 한다.

이를 위해 본 발명에서는, 돼지 및 개의 소화기관과 김치로부터 박테리오신을 생산하는 미생물을 분리, 동정하였으며, 박테리오신의 특성 및 프로바이오틱스의 요건 등을 확인하였다. 이러한 실험결과를 토대로 본 발명에서는, 돼지 및 개의 소화기관과 김치로부터 유래되고, 항균물질을 생산하는 3개의 균주, 락토바실러스 AP 116 (Lactobacillus sp. AP 116, KACC 91396), 엔테로코커스 패슘 CB 712 (Enterococcus faecium CB 712, KACC 91395), 페디오코커스 펜토사시우스 K23-2 (Pediococcus pentosaceus K23-2, KACC 91397) 및 이를 이용한 생균제 조성물을 제공한다.

단일 박테리오신을 사용하는 것 보다 여러 개의 박테리오신을 조합하여 사용하는 것이 더 폭넓은 항균범위를 나타내고, 박테리오신에 저항하는 미생물의 숫자를 줄임으로써 응용 범위도 더욱 확대할 수 있다. 나아가 단일종이 아닌 다른 종으로부터 유래된 유산균종 및 유래가 다른 유산균을 사용함으로써 가축의 장내에서 발휘되는 생균제의 역할에 상호 시너지효과를 기대할 수 있다. 본 발명에서는 서로 시너지 효과를 발휘할 수 있는 미생물 및 박테리오신을 선택하여 복합생균제를 구성하고, 최종적으로 자돈사양실험을 통하여 복합 생균제의 효과를 확인한다. 본 발명의 복합 생균제 조성물은 유효성분으로 상기 균주들을 함유하거나, 또는 상기 균주들의 배양물을 함유하거나, 또는 상기 균주들이 생산하는 박테리오신을 함유하며, 상기 배양물은 균체를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

본 발명에서는 가축에서 질병을 일으키는 클로스트리디움 퍼프린진스(Clostridium perfringens), 리스테리아 모노사이진스(Listeria monocytogenes) 등에 강력한 항균효능을 지닌 새로운 박테리오신 생산균주들을 분리, 동정하여 복합생균제로 제조하였으며, 본 발명에 따른 복합생균제는 자돈 사양시험을 통해 확인되는 바와 같이 일당증체량과 사료요구율이 개선되었으며, 병원성 세균에 대한 억제능력이 우수하여 돼지를 포함한 가축사육에서 항생제 대체물질로서 큰 활용이 기대된다.

본 발명에서는 항생제 대체물질로서 가축용, 특히 양돈용 생균제를 개발하기 위하여, 먼저 돼지의 소화기관으로부터 장내 병원성 세균들에 대해 강력한 항균활성을 지닌 박테리오신을 생산하는 미생물들을 선발하고 동정하였다. 또한, 본 발명에서는 더욱 효과적인 생균제를 개발하기 위하여, 즉 병원성 세균에 대한 억제능 력을 향상시킬 수 있도록 서로 시너지 효과를 발휘할 수 있는 미생물 및 박테리오신을 찾기 위해, 개의 소화기관 및 김치로부터 장내 병원성 세균들에 대해 강력한 항균활성을 지닌 박테리오신을 생산하는 미생물들을 선발하고 동정하였다. 본 발명에서 새롭게 분리, 동정된 박테리오신 생산 유산균은, 장내 병원성 유해세균을 억제하고 프로바이오틱스 특성을 지닌 락토바실러스 AP 116 (Lactobacillus sp. AP 116, KACC 91396P), 엔테로코커스 패슘 CB 712 (Enterococcus faecium CB 712, KACC 91395P), 페디오코커스 펜토사시우스 K23-2 (Pediococcus pentosaceus K23-2, KACC 91397P)이며, 한국농업미생물자원센터 농업생명공학연구원(KACC)에 2008년 7월 31일자로 기탁되었다.

본 발명에서는 상기 균주들이 생산하는 박테리오신 자체의 생화학적 특성, 선발된 미생물의 배양최적화 작업 등 균주특성을 조사하였다. 그리고 이러한 결과를 토대로, 박테리오신을 생산하는 Lactobacillus sp. AP 116, Ent. faecium CB 712, Ped. pentosaceus K23-2를 혼합하여 생균제로 사용한다면 Listeria, Clostridium에 대하여 항균작용을 하는 박테리오신과 그람 음성균에 억제활성을 나타내는 높은 유기산 등으로 인하여 가축에서 발견되는 병원성 세균의 감소에 적합할 것으로 판단하고, 복합생균제 조성물을 제조하였으며, 또한 자돈 사양시험을 통해 그 효과를 확인하였다.

본 발명의 복합 생균제 조성물은 유효성분으로 상기 균주들을 함유하거나, 또는 상기 균주들의 배양물을 함유하거나, 또는 상기 균주들이 생산하는 박테리오신을 함유한다. 상기 배양물은 균체를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 본 명 세서에서 “배양물”은 균주를 배지에 접종하고 일정시간 배양하여 얻은 결과물로서 특별히 한정하지 않는 한 균체와 그 생산물을 모두 포함하는 의미이다.

본 발명의 복합 생균제 조성물은 바람직하게는 다음과 같이 제조한다. 먼저 상기 3종의 선발균주를 10㎖의 MRS 액체배지에서 하룻밤 동안 배양한 것을 대량생산용 종균으로 사용한다. 대량생산용 배지로는 0.5∼3% 소이펩톤 또는 동물성 단백질, 0.1∼2.0% 이스트 추출물, 0.5∼5% 포도당 또는 유당, 0.1∼0.5%의 완충용 시약, 그리고 0.001∼0.01%의 미네랄(마그네슘, 칼슘, 망간 등)을 사용하며, 배양조건으로는 30∼37℃, 혐기적인 상태에서 16∼20시간 동안 각각 배양한다. 배양이 완료된 후, 신속하게 원심분리하여 균체를 회수한 다음, 동결보호제 (0.5∼5%, 탈지분유, 말토덱스트린, 트레할로스, 유당, 만니톨, 사이클로덱스트린 등 함유)와 1:1 비중으로 혼합한 후 동결건조를 실시한다. 본 발명의 복합 생균제 조성물은 바람직하게는 각각 동결건조하여 완료된 미생물동결건조 원말들을 1.0×10⁶ cfu/g∼1.0×10¹⁰ cfu/g 수준으로 포함하며, 더욱 바람직하게는 1.0×10⁹ cfu/g 수준으로 포함한다.

본 발명의 생균제 조성물은 양돈 사료에 첨가되어 급이되거나 돼지에 직접 급이될 수 있으며, 항생제의 사용을 대체할 수 있다. 본 발명의 생균제 조성물은 특히 양돈 사육에 적합하나, 용도가 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 생균제 조성물은 닭을 포함하는 다양한 가금류에도 사용될 수 있으며, 반추동물, 애완동물, 수산용 양식어류 등에도 사용 가능하다. 또, 나아가 본 발명의 생균제 조성 물은 본 발명에서 밝혀진 항균작용에 따라 식품 등에 항생제 대체물질 또는 생균제로도 활용될 수 있다.

이하 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 다음의 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능한 것은 물론이다.

실시예 1

미생물의 분리 및 선발

돼지의 도축 생산라인에서 돼지의 장관 부위를 수거하고 냉장상태로 실험실로 옮겨온 후, 즉시 박테리오신 생산균주 분리실험에 사용하였다. 소장 및 대장 부위를 절단한 다음, 1g 정도의 내용물을 혐기성 희석액에 넣고 적당량 희석한 후, MRS 또는 BHI 한천배지에 도말하고, 37℃에서 호기적으로 48시간 배양하였다. 각 배지에서 성장한 집락들을 무작위로 1㎖의 MRS 또는 BHI 액체배지가 담긴 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 접종하고, 1∼2일 간 배양한 다음, 10㎕의 배양액을 MRS 또는 BHI 고체배지에 점적하여 1시간 동안 건조하였다. 그리고 지시균이 접종된 BHI 또는 MRS soft agar(0.7%)를 첨가한 다음, 1일 정도 배양 후, 상기 배지 위에 나타난 clear zone을 확인함으로써 병원성 균주 억제능을 지닌 균주를 1차 선발하였다. 이때 사용한 지시균으로는 E. coli KCTC 1467, Salmonella typhymurium KCTC 2515, Staphylococcus aureus KCTC 1621, Listeria monocytogenes KCTC 3569, 그리고 Lactobacillus sake KCCM 40264를 사용하였다. 돼지의 소화기관으로부터 1,000여주의 미생물을 분리하였으며, 5개의 지시균에 대하여 하나 이상의 저해능을 지닌 5개의 균주를 1차로 선발하였다. 유산균이 생성하는 다양한 항균물질(유기산, 아세틸, H2O2 등) 중에서 유산(lactic acid)에 의한 항균효과를 제거하기 위하여, 1차 선발된 균주들에 대하여 약간 변형된 spot-on-lawn 방법(Mayr 등, 1972)을 실시하여 2차 선발과정을 실시하였다. 즉, 1차 선발된 균주들의 배양액을 원심분리하고, 0.22μm 필터를 이용하여 제균한 다음, 10N NaOH를 사용하여 cell-free supernatant를 pH 6.5 정도로 중화시겼다. 상기 여액을 지시균이 1.0 X 10⁷ cfu/㎖로 첨가된 soft agar 위에 떨어뜨린 후, 지시균의 배양조건(대략 37℃, 1일 배양)에서 배양한 다음, clear zone 형성여부를 관찰함으로써 박테리오신 생성균주를 선발하였다. 최종적으로 박테리오신을 생산하는 1개의 균주가 선발되었다.

또한, 동일한 방법으로 개의 분변 및 전통발효식품인 김치로부터 박테리오신 생성균주 선발하였다. 개의 분변으로부터는 940여주의 미생물을 분리하였으며, 최종적으로 박테리오신을 생산하는 1개의 균주를 선발하였다. 전통발효식품인 김치로부터 1,310주의 미생물을 분리하였으며, 박테리오신을 생산하는 1개의 균주를 최종선발하였다.

돼지의 소화기관, 개의 분변 및 김치로부터 선발된 3 균주는 각각 다른 항균범위를 나타냈다.

실시예 2

미생물의 동정

박테리오신 생산균주를 동정하기 위하여 형태학적, 생화학적 특성을 Bergey's Manual of Determinative bacteriology에 따라 조사하였다(Holt 등, 1994). 그람염색, 운동성, 카탈라제 테스트, CO₂ 생성 유무 및 API 50 CHL kit(BioMerieux, France)를 사용한 탄수화물 발효 양상 등을 조사하였으며, 최종적인 균주 동정을 위해서 분리균의 16S rDNA 염기배열을 결정하여 알려진 균주들의 염기배열과 비교하였다.

2차 선발된 3주 미생물들은 그람양성, 카탈라제(catalase) 음성, 비운동성 등의 특성을 지니고 있었으며, 당발효 실험결과, 유산균으로 분류되었다. 또한 선발 미생물의 16S rDNA 염기배열을 유전자은행(GeneBank)에 등록된 여러 유산균들과의 상동성을 비교한 결과, 각각의 균주들이 97%이상의 상동성을 나타내었으며, 최종적으로 각 균주들은 락토바실러스 AP 116 (Lactobacillus sp. AP 116, KACC 91396P), 엔테로코커스 패슘 CB 712 (Enterococcus faecium CB 712, KACC 91395P), 페디오코커스 펜토사시우스 K23-2 (Pediococcus pentosaceus K23-2, KACC 91397P)으로 동정되었다. 다음의 표 1 또는 2는 분리균주의 탄수화물 발효 결과이다. 도 1은 선발된 균주들의 세포 모양을 전자현미경으로 촬영한 사진이다.

실시예 3

Cell - free 상층액의 제조

선발된 박테리오신 생산균주를 MRS broth에 접종하여 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 본 배양액을 3,000Xg에서 20분간 원심분리하여 균체를 제거하고, 얻어진 상등액을 1N NaOH를 이용하여 최종 pH 6.5로 조정한 후에, 여과막(0.2μm pore size)으로 여과하여 박테리오신 활성을 측정하기 위한 cell-free 상층액을 조제하였다.

실시예 4

박테리오신의 부분 정제

박테리오신 생산균주들을 MRS 액체배지에서 20-40시간 배양한 다음, 배양액을 4℃에서 원심분리하고, 상등액을 황산암모늄(ammonium sulfate) 50%로 포화시켜 천천히 저으면서 4℃에서 하룻밤 동안 정치한 후, 원심분리하여 침전물을 얻었다. 침전물은 멸균된 증류수 또는 10mM 인산염완충액(pH 7.0)에 용해시킨 후, dialysis tube (molecular weight cut off 1,000 Spectrum Medical Industries, USA)를 이용하여 4℃에서 24시간 이상 투석하였다. 상기 시료를 조박테리오신(crude bacteriocin)으로 실험에 사용하였다. 상기 방법으로 제조한 조박테리오신을 hydrophobicv interaction column chromatography (HIC)인 Octyl-sepharose 4 fast flow (Sigma)를 이용하여 정제하였다. 1.7M 황산 암모니움으로 컬럼을 equilibration한 후, 멸균 정제수로 점차 linear gradient를 주었으며, 다시 에탄올을 농도별로 70%까지 gradient를 실시함으로써 박테리오신을 분리, 정제하였다. 각 fraction별로 spot-on-lawn 방법을 이용하여 박테리오신 활성을 확인하였으며, 활성이 있는 fraction은 진공건조기를 이용하여 건조시킴으로써 농축된 박테리오신을 제조하였다.

실시예 5

항균범위 조사

선발된 박테리오신 생산균주에 대한 항균범위를 확인하기 위하여 deferred antagonism 방법과 항균물질 중 유기산에 의한 억제효과를 제거하기 위하여 spot-on-lawn 방법을 이용하였다. deferred antagonism 방법은 배양액을 지시균이 함유된 soft agar에 떨어뜨린 후 지시균의 최적 성장온도에서 하룻밤 배양한 다음, 억제환 생성 유무를 조사하였다. spot-on-lawn 방법은 cell-free supernatant를 지시균(1.0 X 10⁷ cfu/㎖)이 함유된 soft agar에 떨어뜨린 후, 지시균의 최적 성장온도에서 하룻밤 배양한 다음, 억제환 생성 유무를 조사하였다.

Deferred antagonism 방법에서는 선발균주 (AP 116, CB 712, K23-2)에서 생산되는 유기산을 포함하는 항균물질로 인하여 대부분의 음성 세균, 즉 E. coli, Salmonella sp. 및 Staphylococcus aureus 등의 생육이 억제되었다.

그리고 spot-on-lawn 방법에서는 선발된 대부분의 유산균들이 L. monocytogenes 생육에 대하여 강한 억제활성을 나타냈다. 특히, Lactobacillus sp. AP 116과 Ent. faecium CB 712의 경우, Clostridium perfringens에 대하여 억제활성을 나타내었다. Ped. pentosaceus K23-2는 유산균보다는 L. monocytogenes, Staph. aureus와 같은 식품부패 및 병원성관련 미생물들의 생육을 억제하는 특성을 나타내었다. Clostridium sp.와 Listeria sp., 그리고 그람음성 세균(대장균, Salmonella 등)들은 가축의 장내병원성 세균으로 상존하며, 사람의 장염에도 관여되는 것으로 알려져 있다. 또한 축산업 생산에서의 낮은 생산성, 폐사율 증가 등에 주요한 원인이 되며, 도축 공정에서의 오염원으로 작용되고 있다. 따라서, 상기 결과를 종합해 보면 박테리오신을 생산하는 Lactobacillus sp. AP 116, Ent. faecium CB 712, Ped. pentosaceus K23-2를 혼합하여 생균제로 사용한다면, Listeria, Clostridium에 대하여 항균작용을 하는 박테리오신과 그람 음성균에 억제활성을 나타내는 높은 유기산 등으로 인하여 가축에서 발견되는 병원성 세균의 감소에 적합할 것으로 판단된다.

상기 결과를 바탕으로, 3개의 선발균주, 즉 Lactobacillus sp. AP 116, Ent. faecium CB 712, Ped. pentosaceus K23-2에 대한 항균물질의 특성 및 생균제로서의 적용여부에 대한 실험을 진행하였다. 다음 표 3 내지 5에 최종 선발균주의 병원성 세균에 대한 억제 효과를 나타내었다.

실시예 6

박테리오신의 이화학적 특성 조사

박테리오신의 pH에 대한 안정성을 조사하기 위하여, cell-free supernatant를 10N NaOH와 10N HCl로 pH 2.0에서 10.0까지 조정한 후 상온에서 1시간 방치한 다음, 박테리오신의 활성을 spot-on-lawn 방법으로 측정하였다. 열안정성은 상기 액을 60℃에서 30분, 95℃에서 30분, 그리고 121℃에서 15분 동안 각각 처리한 후, 박테리오신 활성을 측정하였다. 효소처리에 따른 박테리오신의 활성변화를 측정하기 위하여 각각의 효소를 최종농도가 1 ㎎/㎖이 되도록 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시키고, 80℃에서 10분간 열처리하여 효소활성을 중지시킨 다음 박테리오신 활성을 측정하였다. 효소로는 프로테이나제 K(proteinase K), 프로테아제(protease), 펩신(pepsin), 트립신(trypsin), α-아밀라제(α-amylase), β-아밀라제(β-amylase), 그리고 카탈라제 등을 사용하였다. 유기용매 처리가 박테리오신 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, cell-free supernatant와 유기용매를 동량 혼합한 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 박테리오신 활성을 측정하였다. 이때 사용한 유기용매의 종류는 에탄올, 메탄올, 클로로포름, 아세톤, 아세토니트릴, 헥산(hexane), 에틸 아세테이트, 아세테이트 등이었다.

선발된 3 균주로부터 생산된 항균물질에 대해 여러 효소 처리, 열처리, pH 및 유기용매 처리를 하여 이에 대한 박테리오신의 안정성을 조사한 결과를 다음 표 6에 나타내었다. 각기 균주에서 생산되는 대부분의 박테리오신 활성은 단백질 분해효소 (proteinase, trypsin 등)를 처리한 결과, 지시균에 대한 항균 효능이 상실되었으나, α-amylase, β-amylase, 그리고 catalase 등에 의해서는 영향을 받지 않았다. 이것은 상기 선발균주들의 항균물질이 당성분이 포함되지 않은 순수한 단백질로 이루어진 박테리오신이며, H₂O₂ 등이 아님을 증명해준다. 또한 3균주에서 생산되는 박테리오신은 95℃에서 30분간 처리하였을 때에도 높은 항균활성을 유지하고 있었으며, 50%의 유기용매에도 어떠한 영향을 받지 않았으며, 대부분 pH 2∼10 범위에서 항균활성이 안정하였다.

실시예 7

Jar-fermenter을 이용한 배양최적화 작업

5L Jar-fermenter를 이용하여 MRS 액체배지에서 선발균주들을 1% 접종하면서, 온도, pH 조건 등을 변경하면서 36-72시간 동안 배양하면서, 일정시간 간격으로 샘플링하면서 생균수 및 박테리오신의 활성 변화를 측정하였다.

AP 116 균주를 배양 중에 pH 조절 없이 성장곡선을 작성해 보면, 대수기 (exponential growth phase) 중반부터 박테리오신이 생산되기 시작하여 정체기에 최고의 활력 (2,400 AU/ml)을 보인 후, 급격하게 박테리오신 활력이 저하되었다. 36시간 동안 배양하면서 배양액의 pH는 6.5에서 4.1로 떨어졌다. 생균수 및 박테리오신 활성이 최고조에 달한 pH 조건은 6.0이었으며, pH 7.0에서는 생균수 및 박테리오신 활성이 24시간 이후부터 급격히 감소하는 현상을 보였다. pH 6.0으로 조정하면서 배양온도별 생균수 및 박테리오신 활성을 비교한 결과, 34℃에서 배양했을 때, 3.4 x 10⁹ cfu/㎖의 생균수와 6,400 AU/㎖의 박테리오신 활성이 최고로 높았다. 상기와 동일한 방법으로 CB 712 균주에 대한 배양최적화 실험을 실시한 결과, pH 6.0으로 조절하였을 때, 1.0 x 10⁹ cfu/㎖의 생균수와 6,400 AU/㎖의 박테리오신 활성을 확인하였다. K23-2의 경우에는 배양 최적화 조건으로, pH 7.0으로 조정하면서 배양했을 때, 7.5 x 10⁹ cfu/㎖ 이상의 생균수를 회수할 수 있었으나, 박테리신 생성은 매우 미미하였으나, pH 5.0 이하에서는 6,400 AU/㎖ 이상의 박테리오신 활력을 확인할 수 있었다.

실시예 8

생균제 제조 및 안정성

상기 3종의 선발균주를 10㎖의 MRS 액체배지에서 하룻밤 동안 배양한 것을 대량생산용 종균으로 사용하였다. 대량생산용 배지 조성은 다음 표 7과 같으며, 37℃에서 혐기적인 상태에서 16시간 동안 각각 배양하였다. 배양이 완료된 후, 신속하게 원심분리하여 균체를 획수한 다음, 동결보호제와 1:1 비중으로 혼합한 후 동결건조를 실시하였다. 동결건조 미생물원말의 생균수를 측정한 결과, Lactobacillus sp. AP 116은 2.0 x 10¹² cfu/g, Ent . faecium CB 712는 7.0 x 10¹² cfu/g 그리고 Ped . pentosaceus K23-2는 2.0 x 10¹² cfu/g 이었다. 사용된 동결보호제의 조성은 다음 표 8과 같다. 각각 동결건조하여 완료된 미생물동결건조 원말들을 1.0 x 10⁹ cfu/g 수준으로 혼합하여 생균제를 제조하였다. 이렇게 제조된 생균제는 하기 실시예 10에서 이유자돈 사양시험용 생균제로 사용되었다.

박테리오신 생산균주가 함유된 복합박테리오신 생균제 시제품을 4℃ 및 상온에서 보관하면서 일정기간 간격으로 꺼내어 MRS 배지에 적당량 도말하여 생균수를 측정하였다. 단, 박테리오신 활력 측정인 경우에는 생균이 제외된 제품을 따로 제조한 후, 일정기간 간격으로 박테리오신 활력을 spot-on-lawn 방법으로 측정하였다. 복합박테리오신의 생균제 시제품 내에 있는 미생물은 3개월 기간 동안 거의 1.0 x 10⁹ cfu/g의 수준을 유지하였으며, 박테리오신의 활력에도 어떠한 변화도 없었다(도 4). 실온에서 시제품을 3개월 동안 보관한 결과, 생균수는 50% 이상 감소하였으나, 박테리오신의 활성은 그대로 유지되었다(도 5). 일반적으로 생균제 제품내의 수분함량이 10% 이상이 되면 실온에서 1개월이 지난 후에는 제품 내 생균수가 1 order (1 log-scale) 정도 감소하는 경향이 있다.

실시예 9

복합박테리오신의 급성독성실험

박테리오신의 생산균주(AP 116, CB 712, K23-2) 및 생산된 박테리오신에 대한 안전성을 검증하기 위하여, 실험동물을 대상으로 급성독성실험을 실시하였다. 실험동물은 5주령의 Sprague-Dawley (SD)계 랫드 암수 각각 42마리, 총 84마리를 코아텍(경기도 평택)으로부터 구입한 후, 1주일간의 순화과정을 거쳐 실험에 사용하였다. 사료는 (주)퓨리나의 실험동물용 사료를 구입하여, 실험기간 동안 자유급식하였으며, 음수는 멸균 수돗물을 자유롭게 섭취시켰다. 박테리오신 생산균주들은 시험 당일 동결건조된 실험물질을 1.0 x 10⁹ cfu/㎖로, 박테리오신은 3,200 AU/㎖로 실험물질의 투여농도를 일정하게 하고, 1㎖ / 랫드에 1회 경구투여하였다. 모든 실험동물에 대한 임상증상은 시료투여 당일에는 투여후, 1,2,3,4,8 시간에, 투여 1일부터 부검일 까지는 1일 1회씩 14일간 관찰하였다. 박테리오신 생산균주 및 박테리오신을 투여한 후, 모든 대조군 및 투여군에서 폐사율을 관찰할 수 없었으며, 또한 특이적인 임상증상을 나타내는 개체를 관찰할 수 없었다. 또한 투여 후 14일간의 체중변화를 관찰한 결과, 투여군과 대조군 사이에 통계학적으로 유의적인 차이를 발견할 수 없었다. 그리고 실험 종료일에 실시한 부검소견 결과, 모든 개체의 랫드에서 외관 및 내부 장기의 육안적 변화가 관찰되지 않았다.

실시예 10

이유자돈 사양시험

본 발명의 박테리오신 함유 복합생균제의 효능을 검증하기 위하여, 일반 양돈 농가에서 개시체중 5.61± 0.66의 3원 교잡종([Landrace x Yorkshire] x Duroc) 이유자돈 60두(25일령)를 공시하여 42일간 사양시험을 실시하였다. 시험구는 3처리, 3반복으로 돈방당 5두씩 거세돈을 완전 임의배치하였으며, 처리구는 생균제의 사료내 첨가 수준에 따라 대조구 1 (생균제와 항생제 무첨가), 대조구 2 (항생제만 첨가)와 재조구 2 사료내에 생균제를 0.3%와 0.5% 첨가하였다. 본 사양시험에 사용한 생균제의 미생물 조성은 박테리오신 생산균주들(AP 116, CB 712, K23-2)이 각각 1.0 x 10⁹ cfu/g 이상 함유되었다. 체중 및 사료섭취량은 시험 종료 시까지 측정하여 일당증체량, 일당사료섭취량 및 사료효율을 각각 계산하였으며, 사양시험 종료후, 대조군과 처리군에서 각각 6두씩으로부터 신선한 분변 1g을 무균적으로 수거한 다음 아래 표 9에 나타낸 조건에 따라 장내미생물의 변화를 측정하였다. 이유자돈에서의 사양시험 결과를 다음 표 10에 나타내었으며, 사양시험 결과 대조군과 처리군 간의 장내미생물변화는 다음 표 11에 나타내었다.

사양시험 결과, 생균제 처리구는 대조구(control)와 항생제 처리구(antibiotics)에 비해 일당증체량과 사료요구율이 개선되는 경향을 보였으나, 통계적으로 유의적인 차이는 없었다. 즉, 일당증체량은 0.5% 생균제 처리구가 0.442± 0.06으로 가장 높았으며, 무항생제 대조구가 0.386± 0.12으로 가장 낮았다. 사료요구율도 0.5%와 0.3% 생균제 처리구가 각각 1.75와 1.80으로 무항생제 대조구의 1.88보다 상대적으로 낮게 나타났다.

사양시험에 따른 분변미생물의 변화를 측정한 결과, 유산균의 경우 0.5% 복합박테리오신 생균제를 처리한 군이 무항생제군보다 유익한 유산균인 lactobacilli와 enterococci의 균수가 유의적으로 증가하였다 (P<0.05). 항생제 처리군의 경우, 무항생제 대조군과 유해성 미생물의 균수를 비교해 본 결과, 유해성 미생물인 staphylococci의 증식을 억제하는 것으로 나타났으며 (P<0.05), 생균제 처리군도 유해미생물을 약간 감소시키는 경향을 보였다.

본 발명에 따른 박테리오신 함유 복합생균제는 병원성 세균에 대한 억제능력이 우수하고, 가축(돼지, 개)의 소화기관 및 전통발효식품인 김치로부터 분리되어 가축에 적용시 장내 부착성, 정착성, 안전성 또한 우수할 것으로 기대된다. 따라서 본 발명의 복합생균제 조성물은 가축의 성장촉진 목적으로 사용되는 항생제를 대체할 수 있는 복합박테리오신 생균제로서 산업적으로 크게 활용될 수 있으며, 박테리오신의 연구 및 축산분야에서 친환경 사양기술에의 응용성이 확대될 것으로 기대된다.

도 1은 락토바실러스 AP 116의 전자현미경사진이다.

도 2는 엔테로코커스 패슘 CB 712의 전자현미경사진이다.

도 3은 페디오코커스 펜토사시우스 K23-2의 전자현미경사진이다.

도 4는 저온 보관중인 시제품 내 생균수 및 박테리오신 활력의 변화를 보여주는 그래프이다.

도 5는 실온 보관중 시제품 내 생균수 및 박테리오신 활력의 변화를 보여주는 그래프이다.

Claims

(a) 락토바실러스 AP 116 (Lactobacillus sp. AP 116, KACC 91396); 상기 균주의 균체를 포함하는 배양물; 상기 균주의 균체를 포함하지 않는 배양물; 및 상기 균주가 생산하는 박테리오신 중 어느 하나 이상과,

(b) 엔테로코커스 패슘 CB 712 (Enterococcus faecium CB 712, KACC 91395); 상기 균주의 균체를 포함하는 배양물; 상기 균주의 균체를 포함하지 않는 배양물; 및 상기 균주가 생산하는 박테리오신 중 어느 하나 이상과,

(c) 페디오코커스 펜토사시우스 K23-2 (Pediococcus pentosaceus K23-2, KACC 91397); 상기 균주의 균체를 포함하는 배양물; 상기 균주의 균체를 포함하지 않는 배양물; 및 상기 균주가 생산하는 박테리오신 중 어느 하나 이상을 포함하는 가축용 복합 생균제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 균주들을 각각 1.0×10⁶ cfu/g∼1.0×10¹⁰ cfu/g으로 포함하는 것을 특징으로 하는 가축용 복합 생균제 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 가축은 돼지인 것을 특징으로 하는 가축용 복합 생균제 조성물.
돼지의 소화기관으로부터 유래되고 박테리오신을 생산하는 락토바실러스 AP 116 (Lactobacillus sp. AP 116, KACC 91396P).
락토바실러스 AP 116 (Lactobacillus sp. AP 116, KACC 91396P), 또는 상기 균주의 균체를 포함하거나 포함하지 않는 배양물, 또는 상기 균주가 생산하는 박테리오신을 함유하는 생균제 조성물.
개의 소화기관으로부터 유래되고 박테리오신을 생산하는 엔테로코커스 패슘 CB 712 (Enterococcus faecium CB 712, KACC 91395P).
엔테로코커스 패슘 CB 712 (Enterococcus faecium CB 712, KACC 91395P), 또는 상기 균주의 균체를 포함하거나 포함하지 않는 배양물, 또는 상기 균주가 생산하는 박테리오신을 함유하는 생균제 조성물.
김치로부터 유래되고 박테리오신을 생산하는 페디오코커스 펜토사시우스 K23-2 (Pediococcus pentosaceus K23-2, KACC 91397P).
페디오코커스 펜토사시우스 K23-2 (Pediococcus pentosaceus K23-2, KACC 91397P), 또는 상기 균주의 균체를 포함하거나 포함하지 않는 배양물, 또는 상기 균주가 생산하는 박테리오신을 함유하는 생균제 조성물.