KR20090124203A

KR20090124203A - 약물전달체

Info

Publication number: KR20090124203A
Application number: KR1020080050271A
Authority: KR
Inventors: 권순창
Original assignee: 권순창
Priority date: 2008-05-29
Filing date: 2008-05-29
Publication date: 2009-12-03
Also published as: KR101078302B1; WO2009145594A3; JP2011521945A; WO2009145594A2; EP2319503A4; US20110136722A1; CN102088960A; EP2319503A2

Abstract

본 발명은 (a) 생체 적합성 중합체; 및 (b) 상기 중합체에 컨쥬게이션된 소수성기를 포함하는 약물전달체에 관한 것이다. 본 발명에 의해 제조된 소수성기가 컨쥬게이션된 생체 적합성 중합체로 이루어진 약물 전달체는 물에 대한 용해도가 매우 낮은 합성 약물의 흡착에 유용하게 사용될 수가 있다. 또한 본 발명에 의한 약물 전달체는 고분자 물질에 컨쥬게이션된 소수성 기의 함량 조절을 통해서 흡착된 약물의 방출 속도 등을 조절할 수 있는 장점이 있다. 따라서 본 발명은 향후 새로이 개발되는 소수성 합성 약물이나 이미 개발이 완료되었으나 낮은 생체 이용률 문제로 인해 개발의 어려움을 겪고 있는 약물들을 대상으로 적용이 가능한 범용적 기반 기술(broad-spectrum platform technology)을 제공한다. 본 발명에 의한 약물 전달체는 생체 이용률이 낮은 소수성 약물을 약물 전달체와 흡착시켜 체내로 전달이 가능케 함과 동시에 체내에서 약물의 서방출성 특성을 가짐으로써 장차 환자들에게 상당한 치료 편의성을 제공해 줄 수가 있다.

본 발명에 의한 약물 전달체는 단백질 의약품에도 적용이 가능하다. 매일 혹은 2-3일에 1회씩 주사 투여를 받아야 하는 특허가 만료된 1세대 단백질 약물은 그 동안 환자 편의성 개선을 위해 노력한 결과, 최근에는 1주에 1회 내지는 한 달에 1~2회로 투여하는 2세대 주사 제형까지 개발되어 시판되고 있다. 본 특허상의 1세대 단백질 이라 함은 유전자 재조합 기법으로 제조되어 상업화된 천연형 단백질에 기반을 둔 생물의약품을 의미하며 2세대 단백질이라 함은 이러한 1세대 단백질 의 체내 반감기 증가 또는 서방출을 통한 치료기간의 연장효과 등의 목적으로 제형기술 혹은 분자구조의 변형을 통해 개선된 생물의약품(Biopharmaceuticals)을 의미한다. 본 발명은 단백질 자체의 변형이나 특별한 분자 구조의 도입을 요구하는 기존 기술과는 달리 1세대 또는 2세대 단백질 약물을 약물 전달체와 단순 혼합 및 흡착해 사용함으로써 이러한 목적을 쉽게 달성할 수 있는 강력한 수단을 제공하고 있다. 따라서 본 발명에 의한 기술을 단백질 약물에 적용할 경우 차세대 약물 개발 기간이 상당히 단축될 수 있을 것이며 소수성 합성 약물의 이용가치 제고에도 효과적으로 기여할 수 있다. 궁극적으로는 본 발명의 기술은 제품 경쟁력 있는 서방출형 단백질 및 합성 의약품 등의 신약 개발에 매우 유용하게 적용될 수 있다.

약물전달체, 생체적합성, 중합체, 소수성, 약물, 단백질, 펩타이드

Description

약물전달체{Drug Delivery System}

본 발명은 약물전달체에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 단백질, 펩타이드 및 소수성 약물을 운반하기 위한 약물전달체에 관한 것이다.

합성 의약, 특히 물에 대한 용해도가 극히 낮은 소수성의 합성 약물들은 그 자체의 약효성은 매우 우수하나 생체 이용률은 극히 저조하여 이를 생체 내로 효과적으로 전달하면서 동시에 체내 이용률을 높이고자 제약업계 및 학계에서는 많은 노력을 기울여 왔다.

예를 들면, 1967년 Research Triangle Institute (RTI)에서 최초로 발견한 파클리탁셀(paclitaxel)은 폐암, 유방암, 난소암 및 진전된 카포시 육종 등에 대한 광범위 항암제로 사용되었으며, 1992년 미국에서 판매를 승인 받은 대표적인 항암제이다. 상품명 탁솔로서도 잘 알려진 이 항암제는 주목 나무의 껍질에서 발견되는 천연 항암물질로서 암세포의 베타-튜뷰린(ß-tubulin)에 결합하여 암세포 내 미세 섬유(microtubules)의 결합 및 해리 활동을 방해함으로써 암세포의 증식 활동을 억제한다. 우수한 항암성을 지니고 있음에도 불구하고 파클리탁셀은 물에 대한 용해도가 극히 낮아(0.3 g/mL) 주사제로 개발하는데 많은 어려움을 겪어 왔다.

상기의 문제점을 극복하기 위하여, 최근 개발된 방법은 약물을 크레모포어(cremophore) EL과 에탄올의 50:50 혼합물에 분산하고 이를 생리 식염수로 희석해 정맥 투여하는 것이다. 그러나 수용액으로 희석된 파클리탁셀은 물리적 안정성이 12-24시간에 지나지 않아 결국에는 침전화가 진행 됨으로써 생체이용율이 매우 낮아지게 된다. 이와 같이 항암제를 포함하여 일부 합성 약물이 나타내는 높은 소수성은 성공적인 의약품 개발에 큰 장애 요소로 작용하게 된다(Biomolecules 8: 202-208(2007)).

한편 소수성 항암제 같은 합성 약물에 비해 상대적으로 높은 수용성을 지닌 단백질 의약품은 물에 대한 용해도 개선보다는 환자의 편의성 증대 관점에서 약물 전달체의 도입을 적극 추진해 왔다. 즉, 이는 빈번히 주사를 맞아야 하는 불편성을 개선하는 것으로서 매일 주사 또는 2-3일마다 1회 주사하는 형태에서 궁극적으로 주 1회 이상 또는 월 1-2회 방식으로 변경하는 등 최종 약물 사용자의 편의성 개선에 목표를 두고 있다. 또한 제형 관점에서는 주사 직후 약물의 초기 과다 방출을 제한시킴으로써 약물의 과다 방출(initial burst)로 인한 부작용을 최소화하는 기술이 요구되고 있는 상황이다.

최근 이러한 기술적 목적을 달성하기 위해서 여러 신기술들이 개발되었는데 이들을 살펴보면 1) 단백질 약물 자체의 아미노산 서열을 일부 변형하여 적용하는 기술, 2) 단백질 약물에 PEG 또는 항체의 Fc 부위 등을 컨쥬게이션시켜 체내에서의 반감기를 연장하는 기술, 3) 단백질 결정화 기술을 통해 체내에서 서방출을 구현하는 기술, 4) 신규 단백질 제형을 통해 궁극적으로 단백질 약물의 서방출 효과를 유 도하는 기술, 5) 코, 구강 점막 또는 경구 투여를 통해 체내 흡수를 유도하는 기술 등이 단백질 의약품 개발에 적용되어 왔다.

특히 이러한 목적을 달성하기 위한 연구 개발 방향으로서 생분해성 또는 생체 적합성이 우수한 고분자 물질을 이용하여 약물 전달에 응용하고자 하는 노력은 꾸준히 전개되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 약물 자체의 소수성으로 인해 물에 대한 용해도가 낮아 약물로서의 이용가치가 낮은 합성 의약의 이용가치를 높이면서, 동시에 수용성인 단백질 의약품에 대해서 매우 안정적으로 체내에 약물을 전달하는 약물전달체(DDS)를 개발하고자 노력하였다. 특히 치료 목적상 약물이 빈번히 주사되어야 하는 경우에 있어서 본 발명은 주사 빈도를 단축시키면서 체내에서 장기간 약물의 서방출 효과를 유도하는 약물전달체를 개발하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 생체적합성 고분자에 소수성기를 도입시켜 약물전달체를 제조하고 여기에 약물을 탑재하는 경우에는 약물전달체에 높은 효율로 약물이 흡착되어 운반되고, 약물의 서방성이 달성됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 약물전달체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 생체 적합성 중합체; 및 (b) 상기 중합체에 컨쥬게이션된 소수성기를 포함하는 약물전달체를 제공한다.

본 발명자들은 약물 자체의 소수성으로 인해 물에 대한 용해도가 낮아 약물로서의 이용가치가 낮은 합성 의약의 이용가치를 높이면서, 동시에 수용성인 단백질 의약품에 대해서 매우 안정적으로 체내에 약물을 전달하는 약물전달체(DDS)를 개발하고자 노력하였다. 특히 치료 목적상 약물이 빈번히 주사되어야 하는 경우에 있어서 본 발명은 주사 빈도를 단축시키면서 체내에서 장기간 약물의 서방출 효과를 유도하는 약물전달체를 개발하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 생체적합성 고분자에 소수성기를 도입시켜 약물전달체를 제조하고 여기에 약물을 탑재하는 경우에는 약물전달체에 높은 효율로 약물이 흡착되어 운반되고, 약물의 서방성이 달성됨을 확인하였다.

본 발명의 약물전달체는 생체 적합성 중합체; 및 상기 중합체에 컨쥬게이션된 소수성기를 포함한다.

본 발명에서 이용될 수 있는 생체적합성 중합체(biocompatible polymer)는 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 생체적합성 중합체도 포함한다.

바람직하게는, 본 발명에 적합한 생체 적합성 중합체는 합성 중합체 또는 천연 중합체이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생체 적합성 중합체로서의 합성 중합체는 폴리에스테르, 폴리하이드록시알카노에이트(PHAs), 폴리(α-하이드록시액시드), 폴리(β-하이드록시액시드), 폴리(3-하이드로식부티레이트-co-발러레이트; PHBV), 폴리(3-하이드록시프로프리오네이트; PHP), 폴리(3-하이드록시헥사노에이트; PHH), 폴리(4-하이드록시액시드), 폴리(4-하이드록시부티레이트), 폴리(4-하이드록시발러레이트), 폴리(4-하이드록시헥사노에이트), 폴리(에스테르아마이드), 폴리카프로락톤, 폴리락타이드, 폴리글리코라이드, 폴리(락타이드-co-글리코라이드; PLGA), 폴리디옥사논, 폴리오르토에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리(글리콜산- co-트리메틸렌 카보네이트), 폴리포스포에스테르, 폴리포스포에스테르 우레탄, 폴리(아미노산), 폴리사이아노아크릴레이트, 폴리(트리메틸렌 카보네이트), 폴리(이미노카보네이트), 폴리(타이로신 카보네이트), 폴리카보네이트, 폴리(타이로신 아릴레이트), 폴리알킬렌 옥살레이트, 폴리포스파젠스, PHA-PEG, 에틸렌 비닐 알코올 코폴리머(EVOH), 폴리우레탄, 실리콘, 폴리에스테르, 폴리올레핀, 폴리이소부틸렌과 에틸렌-알파올레핀 공중합체, 스틸렌-이소브틸렌-스틸렌 트리블록 공중합체, 아크릴 중합체 및 공중합체, 비닐 할라이드 중합체 및 공중합체, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 메틸 에테르, 폴리비닐리덴 할라이드, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리비닐리덴 클로라이드, 폴리플루오로알켄, 폴리퍼플루오로알켄, 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐 케톤, 폴리비닐 아로마틱스, 폴리스틸렌, 폴리비닐 에스테르, 폴리비닐 아세테이트, 에틸렌-메틸 메타크릴레이트 공중합체, 아크릴로니트릴-스틸렌 공중합체, ABS 수지와 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체, 폴리아마이드, 알키드 수지, 폴리옥시메틸렌, 폴리이미드, 폴리에테르, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트 또는 폴리아크릴산-co-말레산이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생체 적합성 중합체로서의 합성 중합체는 생분해성/생체적합성 중합체이며, 이는 폴리에스테르, 폴리하이드록시알카노에이트(PHAs), 폴리(α-하이드록시액시드), 폴리(β-하이드록시액시드), 폴리(3-하이드로식부티레이트-co-발러레이트; PHBV), 폴리(3-하이드록시프로프리오네이트; PHP), 폴리(3-하이드록시헥사노에이트; PHH), 폴리(4-하이드록시액시드), 폴리(4-하이드록시부티레이트), 폴리(4-하이드록시발러레이트), 폴리(4-하이드록시헥 사노에이트), 폴리(에스테르아마이드), 폴리카프로락톤, 폴리락타이드, 폴리글리코라이드, 폴리(락타이드-co-글리코라이드; PLGA), 폴리디옥사논, 폴리오르토에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리(글리콜산-co-트리메틸렌 카보네이트), 폴리포스포에스테르, 폴리포스포에스테르 우레탄, 폴리(아미노산), 폴리사이아노아크릴레이트, 폴리(트리메틸렌 카보네이트), 폴리(이미노카보네이트), 폴리(타이로신 카보네이트), 폴리카보네이트, 폴리(타이로신 아릴레이트), 폴리알킬렌 옥살레이트, 폴리포스파젠스 및 PHA-PEG를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생체 적합성 중합체로서의 천연 중합체는 키토산, 덱스트란, 셀룰로오스, 헤파린, 히알루론산, 알기네이트, 이눌린, 녹말 또는 글리코겐이고, 보다 바람직하게는 키토산 또는 셀룰로오스이며, 가장 바람직하게는 키토산이다.

본 발명에서 생체 적합성 중합체를 표현하기 위하여 사용되는 용어는 그의 유도체를 포괄한다. 예를 들어, 용어 “셀룰로오스” 및 “덱스트란”은 그의 유도체인 카복시메틸 셀룰로오스 및 카복시메틸 덱스트란을 포괄하는 의미를 갖는다.

본 발명에서 이용되는 생체 적합성 중합체는 특히 제한된 분자량을 갖지 않으며, 바람직하게는 1,000 kDa 이하, 보다 바람직하게는 300 kDa 이하, 가장 바람직하게는 100 kDa 이하의 평균 분자량을 갖는다. 각 고분자 물질의 특성 및 흡착하고자 하는 단백질 또는 합성 약물의 물성 등을 고려하여 최종 목적에 맞게 선택하여 약물전달체를 제조할 수 있다.

본 발명의 가장 큰 특징은, 약물전달체로 이용되는 생체적합성 중합체에 소 수성 특성을 갖는 그룹을 컨쥬게이션 시키는 것이다.

본 발명에 적합한 소수성기는 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 탄소수 4개 이상의 지방족 화합물 또는 방향족 화합물이다.

탄소수 4개 이상의 지방족 화합물이 소수성기로 이용되는 경우, 바람직하게는, 탄소수 5개 이상의 지방족 화합물, 보다 바람직하게는 탄소수 5-30개, 가장 바람직하게는 탄소수 5-20개의 지방족 화합물이 이용된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 소수성기는 1-3개(바람직하게는 1-2개)의 페닐기를 갖는 방향족 화합물이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 중합체에 컨쥬게이션된 소수성기는 탄소수 4개 이상의 알킬, 탄소수 4개 이상의 알케닐, 탄소수 3개 이상의 사이클로알킬, 탄소수 4개 이상의 알콕시, 아릴, 카복시아릴, 아릴포스페이트, 아릴아민, 헤테로아릴, 아릴알킬, 아릴알케닐 또는 알킬아릴이다.

용어 “알킬”은 지정된 탄소수를 갖는 직쇄 또는 분쇄 포화 탄화수소기를 의미한다. 용어, “알케닐”은 지정된 탄소수를 갖는 직쇄 또는 분쇄 불포화 탄화수소기를 나타낸다. 용어 “사이클로알킬”은 지정된 탄소수를 갖는 사이클릭 탄화수소 라디칼을 의미하며, 바람직하게는 “C₃-C₈ 사이클로알킬”이고, 이는 사이클로프로필, 사이클로부틸 및 사이클로펜틸을 포함한다. 용어, “알콕시”는 -O알킬기를 의미한다.

용어 “아릴”은 전체적으로 또는 부분적으로 불포화된 치환 또는 비치환된 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄소 고리를 의미하며, 예컨대 모노아릴 또는 비아릴이다. 모노아릴은 탄소수 5-6을 갖는 것이 바람직하며, 비아릴은 탄소수 9-10을 갖는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 상기 아릴은 치환 또는 비치환된 페닐이다. 모노아릴, 예컨대, 페닐이 치환되는 경우에는, 다양한 위치에서 다양한 치환체에 의해 치환이 이루어질 수 있으나, 예컨대, 할로, 히드록시, 니트로, 시아노, C₁-C₄ 치환 또는 비치환된 직쇄 또는 가지쇄 알킬, C₁-C₄ 직쇄 또는 가지쇄 알콕시, 알킬 치환 설파닐, 페녹시, C₃-C₆ 사이클로헤테로알킬 또는 치환 또는 비치환 아미노기에 의해 치환될 수 있다. 비아릴, 예컨대, 바이페닐(다이페닐) 또는 나프틸은 다양한 위치에서 다양한 치환체에 의해 치환이 이루어질 수 있고, 바람직하게는, 할로, 히드록시, 니트로, 시아노, C₁-C₄ 치환 또는 비치환된 직쇄 또는 가지쇄 알킬, C₁-C₄ 직쇄 또는 가지쇄 알콕시, 또는 치환 또는 비치환 아미노기에 의해 치환될 수 있으며, 보다 바람직하게는 알킬기 치환 아미노기에 의해 치환될 수 있다.

용어, “헤테로아릴”은 헤테로사이클릭 방향족기로서, 헤테로원자로서 N, O 또는 S를 포함하는 것이다. 바람직하게는, 헤테로아릴은 헤테로원자로서 N을 포함하는 헤테로비아릴이다.

용어, “아릴알킬 (아랄킬)”은 하나 또는 그 이상의 알킬기에 의한 구조에 결합된 아릴기를 의미하며, 바람직하게는 벤질기이다. 용어, “알킬아릴“은 하나 또는 그 이상의 아릴기로 이루어진 구조에 결합된 알킬기를 의미한다. 용어, “아릴알케닐”은 하나 또는 그 이상의 알킬기에 의한 구조에 결합된 아릴기를 의미하며, 예컨대 페닐 에테닐기이다.

보다 바람직하게는, 중합체에 컨쥬게이션된 소수성기는 아릴, 카복시아릴, 아릴포스페이트, 아릴아민, 헤테로아릴, 아릴알킬, 아릴알케닐 또는 알킬아릴이고, 보다 더 바람직하게는 아릴, 가장 바람직하게는 모노아릴 또는 비아릴이다.

본 발명의 약물전달체를 다른 방식으로 표현하면, 생체 적합성 중합체는 아미노기를 가지고 있으며, 상기 소수성기는 상기 아미노기에 아마이드(amide) 결합되어 있고, 상기 약물전달체는 다음 화학식 I로 표시된다:

화학식 I

R₁-NH-CO-R₂

상기 화학식에서, R₁은 생체 적합성 중합체의 주골격을 나타내고; R₂는 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 아릴알케닐 또는 알킬아릴인 것을 특징으로 하는 약물전달체.

생체 적합성 중합체에 컨쥬게이션되어 있는 아미노기는 중합체가 원래 가지고 있던 작용기이거나 또는 다른 물질(예컨대, 링커)에 의해 도입된 작용기일 수 있다. 소수성기에 있는 C=O는 소수성기로부터 유래된 것이거나 또는 다른 물질(예컨대, 링커)에 의해 도입된 것일 수 있다.

선택적으로, 생체 적합성 중합체는 카복실기를 가지고 있으며, 상기 소수성기는 상기 카복실기에 아마이드(amide) 결합되어 있고, 상기 약물전달체는 다음 화 학식 Ⅱ로 표시된다:

화학식 Ⅱ

R₁-CO-NH-R₂

화학식 Ⅱ에서 생체 적합성 중합체에 컨쥬게이션되어 있는 N-H는 소수성기로부터 유래된 것이거나 또는 다른 물질(예컨대, 링커)에 의해 도입된 것일 수 있다. 소수성기에 있는 아미노기는 중합체가 원래 가지고 있던 작용기이거나 또는 다른 물질(예컨대, 링커)에 의해 도입된 작용기일 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예를 몇 가지 물질에 한정하여 반응식 1을 참조하여 설명하면 다음과 같다:

반응식 1

본 발명의 약물전달체의 제조에 적용이 가능한 양이온성(아민기) 생체 적합성 천연 고분자는 키토산(chitosan) 및 키토올리고당(chitooligosaccharide) 물질 이 사용될 수 있다.

본 발명에 의한 고분자에 컨쥬게이션되는 소수성 결합기는 모노 페닐기 또는 다이페닐기(C₆H₅-C₆H₅)를 갖는 공여체(donor)가 사용될 수 있다. 소수성 결합기의 선택 및 컨쥬게이션은 고분자의 구조적 특징이나 흡착시키고자 하는 약물의 특성 그리고 최종적으로 제조된 약물전달체의 전반적인 물성 등을 고려하여 약물 전달체의 구성에 따라 다르게 선택 조합하여 사용될 수가 있다(참조: 반응식 1).

아민기를 지닌 고분자 물질에 컨쥬게이션될 수 있는 적합한 소수성 결합기는 벤조산(benzoic acid), 디페닐포스페이드(diphenyl phosphate), 3,3-디페닐프로리오닉산(3,3-diphenylpropionic acid), 2-페닐아세트산(2-phenylacetic acid), 디페닐아세트산(diphenylacetic acid) 등이 사용될 수 있다.

카복실기를 지닌 고분자에 컨쥬게이션될 수 있는 적합한 소수성 결합기는 2,2-디페닐에틸아민(2,2-diphenylethylamine), 1,2-디페닐에틸아민(1,2-diphenylethylamine), 3,3-디페닐프로필아민(3,3-diphenylpropylamine), 2-아미노바이페닐(2-aminobiphenyl), 아미노디페닐메탄(aminodiphenylmethane), 벤질아민(benzylamine), 디페닐아민(diphenylamine), 페닐벤질아민(N-phenylbenzylamine) 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용하는 고분자 물질과 소수성기의 컨쥬게이션에는 카보디이미드(carbodiimides)를 사용한다. 컨쥬게이션 반응에 사용되는 카보디이미드로서는 EDC (or EDAC; 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride), EDC/sulfo-NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide), CMC (1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl) carbodiimide)와 같은 수용성 물질 외에 DCC(dicyclohexyl carbodiimide), DIC (diisopropyl carbodiimide)와 같은 비 수용성 물질들이 단독으로 또는 적절한 조건하에서 수용성/비 수용성 물질의 적절한 조합을 통해 사용될 수 있다.

이상과 같이 본 발명에서의 고분자 사슬에 컨쥬게이션될 수 있는 선택적인 소수성 결합기는 체내에서 고분자가 분해되거나 컨쥬게이션 부위가 가수분해 되어 소수성 결합기가 유리되었을 때 체내에서 심각한 독성을 나타내지 않는 물질 등으로 구성된다.

고분자 물질에 결합되는 소수성 기는 바람직하게는 10 mM-300 mM 범위로 결합되며 보다 바람직하게는 20mM-200mM 범위로 결합됨을 특징으로 하는 방법

본 발명의 약물전달체는 단백질, 펩타이드 및 비친수성 화학약물을 운반하는 데 특히 적합하다.

본 발명의 약물전달체에 의해 운반되는 단백질 또는 펩타이드는 특별하게 제한되지 않으며, 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄항체, 결합단백질 또는 그 결합도메인, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자 , 혈액 응고 인자 및 백신 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 상세하게는, 본 발명의 약물전달체에 의해 운반되는 단백질 또는 펩타이드는 인슐린, IGF-1(insulin-like growth factor 1), 성장호르몬, 에리쓰로포이에틴, G-CSFs (granulocyte-colony stimulating factors), GM-CSFs (granulocyte/macrophage-colony stimulating factors), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨-1 알파 및 베타, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 인터루킨-2, EGFs (epidermal growth factors), 칼시토닌(calcitonin), ACTH (adrenocorticotropic hormone), TNF (tumor necrosis factor), 아토비스반(atobisban), 부세레린(buserelin), 세트로렉릭스(cetrorelix), 데스로레린(deslorelin), 데스모프레신(desmopressin), 디노르핀 A (dynorphin A) (1-13), 엘카토닌(elcatonin), 엘레이도신(eleidosin), 엡티피바타이드(eptifibatide), GHRH-II(growth hormone releasing hormone-II), 고나도레린(gonadorelin), 고세레린(goserelin), 히스트레린(histrelin), 류프로레린(leuprorelin), 라이프레신(lypressin), 옥트레오타이드(octreotide), 옥시토신(oxytocin), 피트레신(pitressin), 세크레틴(secretin), 신칼라이드(sincalide), 테르리프레신(terlipressin), 티모펜틴(thymopentin), 티모신(thymosine) α1, 트리프토레린(triptorelin), 바이발리루딘(bivalirudin), 카르베토신(carbetocin), 사이클로스포린, 엑세딘(exedine), 란레오타이드(lanreotide), LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone), 나파레린(nafarelin), 부갑상선 호르몬, 프람린타이드(pramlintide), T-20 (enfuvirtide), 타이말파신(thymalfasin) 및 지코노타이드를 포함한다.

본 발명의 약물전달체에 의해 운반되는 단백질 또는 펩타이드는 특별하게 제한되지 않으며, 예를 들어, 아시바이신, 아클라루비신, 아코다졸, 아크로나이신, 아도젤레신, 알라노신, 알데스루킨, 알로푸리놀 소듐, 알트레타민, 아미노글루테티 미드, 아모나파이드, 암플리겐, 암사크린, 안드로겐스, 안구이딘, 아피디콜린 글리시네이트, 아사레이, 아스파라기나아제, 5-아자시티딘, 아자티오프린, 바실러스 칼메테-구에린(BCG), 베이커스 안티폴, 베타-2-디옥시티오구아노신, 비스안트렌 HCl, 블레오마이신 설페이트, 불서판, 부티오닌 설폭시민, BWA 773U82, BW 502U83/HCl, BW 7U85 메실레이트, 세라세미드, 카르베티머, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 클로로퀴녹살린-설포나미드, 클로로조토신, 크로모마이신 A3, 시스플라틴, 클라드리빈, 코르티코스테로이드, 코리너박테리움 파르붐, CPT-11, 크리스나톨, 사이클로사이티딘, 사이클로포스파미드, 사이타라빈, 사이템베나, 다비스 말리에이트, 데카르바진, 닥티노마이신, 다우노루바이신 HCl, 디아자유리딘, 덱스라족산, 디언하이드로갈락티톨, 디아지쿠온, 디브로모둘시톨, 디데민 B, 디에틸디티오카르바메이트, 디클라이코알데하이드, 다이하이드로-5-아자사이틴, 독소루비신, 에치노마이신, 데다트렉세이트, 에델포신, 에플롤니틴, 엘리옷스 용액, 엘사미트루신, 에피루비신, 에소루비신, 에스트라머스틴 포스페이트, 에스트로겐, 에타니다졸, 에티오포스, 에토포사이드, 파드라졸, 파자라빈, 펜레티나이드, 필그라스팀, 피나스테라이드, 플라본 아세트산, 플록스유리딘, 플루다라빈 포스페이트, 5-플루오로우라실, Fluosol™, 플루타미드, 갈륨 나이트레이트, 겜사이타빈, 고세레린 아세테이트, 헤프설팜, 헥사메틸렌 비스아세트아미드, 호모하링토닌, 하이드라진 설페이트, 4-하이드록시안드로스테네디온, 하이드로지우레아, 이다루비신 HCl, 이포스파미드, 4-이포메아놀, 이프로플라틴, 이소트레티노인, 류코보린 칼슘, 류프로라이드 아세테이트, 레바미솔, 로머스틴, 로니다민, 마이탄신, 메클로레타민 하이드로클로라이 드, 멜팔란, 메노가릴, 메르바론, 6-머캅토푸린, 메스나, 바실러스 칼레테-구에린의 메탄올 추출물, 메토트렉세이트, N-메틸포름아미드, 미페프리스톤, 미토구아존, 마이토마이신-C, 미토탄, 미톡산트론 하이드로클로라이드, 모노사이트/마크로파아지 콜로니-자극 인자, 나빌론, 나폭시딘, 네오카르지노스타틴, 옥트레오타이드 아세테이트, 오르마플라틴, 옥살리플라틴, 파크리탁셀, 팔라, 펜토스타틴, 피페라진디온, 피포브로만, 피라루비신, 피리트렉심, 피록산트론 하이드로클로라이드, PIXY-321, 플리카마이신, 포르피머 소듐, 프레드니무스틴, 프로카르바진, 프로게스틴스, 파이라조푸린, 라족산, 사르그라모스팀, 세무스틴, 스피로게르마늄, 스피로무스틴, 스트렙토나이그린, 스트렙토조신, 술로페너르, 수라민 소듐, 타목시펜, 탁소레레, 테가푸르, 테니포사이드, 테레프탈아미딘, 테록시론, 티오구아닌, 티오테파, 티미딘 인젝션, 티아조푸린, 토포테칸, 토레미펜, 트레티노인, 트리플루오페라진 하이드로클로라이드, 트리플루리딘, 트리메트렉세이트, 우라실 머스타드, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 빈데신, 비노렐빈, 빈졸리딘, Yoshi 864 및 조루비신이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 생체 적합성 중합체 및 소수성기 사이의 컨쥬게이션은 링커에 의해 이루어진다.

본 발명에서 이용되는 링커는 당업계에서 링커로 이용되는 어떠한 화합물도 가능하며, 단백질 또는 펩타이드에 있는 작용기 종류에 따라 적합한 링커를 선택할 수 있다. 예를 들어, 링커는 N-숙시니미딜 요오도아세테이드 (N-succinimidyl iodoacetate), N-히드록시숙시니미딜 브로모아세테이트(N-Hydroxysuccinimidyl Bromoacetate), m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), m-말레이미도벤조일-N-히드록시설포숙신이미드 에스테르 (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester), N-말레이미도부티릴옥시숙신아미드 에스테르 (N-Maleimidobutyryloxysuccinamide ester), (N-Maleimidobutyryloxysulfosuccinamide ester), E-말레이미도카프로산 히드라지드ㆍHCl (E-Maleimidocaproic acid hydrazideㆍHCl), [N-말레이디도카프로일옥시-숙신아미드] ([N-(E-maleimidocaproyloxy)-succinamide]), [N-말레이미도카프로일옥시)-설포숙신아미드] ([N-(E-maleimidocaproyloxy)-sulfosuccinamide]), 말레이미도프로피온산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (Maleimidopropionic Acid N-Hydroxysuccinimide Ester), 말레이미도프로피온산 N-히드록시설포숙신이미드 에스테르 (Maleimidopropionic Acid N-Hydroxysulfosuccinimide Ester), 말레이미도프로피온산 히드라지드ㆍHCl (Maleimidopropionic Acid HydrazideㆍHCl), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate), N-숙시니미딜-4-(요오도아세틸)아미노벤조에이트 (N-Succinimidyl-(4-iodoacetyl) aminobenzoate), 숙시니미딜-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (Succinimidyl-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylate), 숙시니미딜-4-(말레이미도페닐)부틸레이트(Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrate), 설포숙시니미딜-(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트 (Sulfosuccinimidyl-(4-iodoacetyl)aminobenzoate), 설포숙시니미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (Sulfosuccinimidyl-4-(N- maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), 설포숙시니미딜-4-(p-말레이미도페닐)부틸레이트 (Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrate), m-말레이미도벤조산 히드라지드ㆍHCl (m-Maleimidobenzoic acid hydrazide HCl), 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실산 히드라지드ㆍHCl (4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylic acid hydrazideㆍHCl), 4-(4-N-말레이미도페닐)부티르산 히드라지드ㆍHCl (4-(4-N-maleimidophenyl)butyric acid hydrazideㆍHCl), N-숙시니미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate), 비스(설포숙시니미딜)수베레이트(Bis(sulfosuccinimidyl)suberate), 1,2-디[3’-(2’-피리딜디티오)프로피온아미도] 부탄(1,2-Di[3’-(2’pyridyldithio)propionamido] Butane), 디숙시니디밀 수베레이트(Dissuccinimidyl Suberate), 디숙시니미딜 타르타레이트(Dissuccinimidyl Tartarate), 디설포숙시니미딜 타르타레이트 (Disulfosuccinimdiyl Tartarate), 디티오-비스-(숙시니미딜 프로피오네이트) (Dithio-bis-(succinimidyl propionate)), 3,3‘-디티오-비스-(설포숙시니미딜-프로피오네이트)(3,3'-Dithio-bis-(sulfosuccinimidyl-propionate)), 에틸렌 글리콜 비스(숙시니미딜숙시네이트 (Ethylene Glycol bis(Succinimidylsuccinate)) 및 에틸렌 글리콜 비스(설포숙시니미딜숙시네이트)(Ethylene Glycol bis(Sulfosuccinimidylsuccinate))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

링커를 이용하는 본 발명의 구현예를 반응식 2를 참조하여 예시하면 다음과 같다:

반응식 2

본 발명의 목적을 달성하는데 있어서, 전술한 카복실기 또는 아민기를 지닌 고분자 물질의 각 반응기 위치에 직접 소수성 결합기와 카보디이미드(carbodiimides, zero-length cross-linkers)를 사용하여 화학적으로 컨쥬게이션된 약물 전달체를 제조할 수 있다. 그러나 본 발명은 본 발명의 목적에 사용될 수 있는 고분자 물질의 선택적 활용도를 증가시키기 위해서 고분자가 지닌 반응기의 변경을 통해서도 본 발명의 목적을 달성할 수 있다. 예를 들면, 아민기를 갖는 키토산 고분자에 적절한 스페이서(spacer) 또는 링커(linker)를 컨쥬게이션시켜서 키토산의 아민기를 말단 카복실기로 변경한 다음 이에 적절한 결합기를 반응시켜 본 발명의 목적에 맞게 제조할 수 있으며(참조: 반응식 2), 그 반대의 경우인 카복실기를 갖는 카복시메틸셀룰로오스에 적절한 스페이서 또는 링커를 컨쥬게이션시켜 말단 아민기를 지닌 카복시메틸셀룰로오스를 제조하여 본 발명에 사용할 수가 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약물전달체는 상기 운반하는 약물을 서방출(sustained release) 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 소수성기는 생체 적합성 중합체 1 중량을 기준으로 하여 0.5-20 중량, 보다 바람직하게는 1-12 중량이 중합체에 결합된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약물전달체는 (i) 생체 적합성 중합체에 결합되는 소수성기 종류; (ⅱ) 생체 적합성 중합체에 결합되는 소수성기의 결합량; (ⅲ) 약물을 흡착하는 약물 전달체의 함량 또는 이들의 조합에 따라 약물의 서방출성을 다양하게 조절할 수 있다.

본 발명의 약물전달체는 약제학적 조성물로 제조될 수 있으며, 이 경우 약제학적으로 허용되는 담체를 이용한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 전략에 따라 중합체의 사슬에 컨쥬게이션된 소수성기, 예컨대, 모노 또는 다이페닐기는 저분자성 합성 의약품이나 단백질 의약품(biopharmaceuticals)에 대해서 소수성(hydrophobic) 상호작용에 근거하여 컨쥬게이션하며, 이에 물에 대한 용해도가 낮은 약물들에 대해서는 흡착력을 증가시켜 체내로의 투입량을 큰 폭으로 향상시킬 수가 있고 동시에 중합체 사슬 전체에 걸쳐 폭넓게 컨쥬게이션된 소수성기의 작용으로 인해 해당 약물들의 분산성을 크게 향상시켜 균일하게 약물이 중합체 물질에 골고루 흡착되게 하는 장점이 있다.

이상의 중합체 물질과 해당 약물간의 흡착 증진 및 균일한 분산 효과 외에 본 발명에 의한 이차적 효과는 약물이 흡착된 약물전달체가 체내에 투여되었을 때 해당 약물의 서방출을 유도하는 것이다. 이는 체내에 존재하는 분해 효소 시스템에 의해서 중합체 물질이 매우 느리게 분해되기 때문인데 생체 적합성 고분자가 분해되면서 중합체 사슬에 흡착된 약물이 시간이 지나면서 서서히 방출되기 때문이다.

본 발명에 의한 약물전달체의 제조에 있어서 생체 적합성 천연 또는 합성 고 분자와 소수성을 갖는 결합기는 각각의 종류가 매우 다양하며 그들이 컨쥬게이션되는 조합에 따라서 최종적으로 나타나는 약물전달체의 물리 화학적 성질이 각기 다르기 때문에 사용자가 목적하는 바에 따라 선택하여 제조하며 사용할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

본 발명에 의해 제조된 소수성기가 컨쥬게이션된 생체 적합성 중합체로 이루어진 약물 전달체는 물에 대한 용해도가 매우 낮은 합성 약물의 흡착에 유용하게 사용될 수가 있다. 또한 본 발명에 의한 약물 전달체는 고분자 물질에 컨쥬게이션된 소수성 기의 함량 조절을 통해서 흡착된 약물의 방출 속도 등을 조절할 수 있는 장점이 있다. 따라서 본 발명은 향후 새로이 개발되는 소수성 합성 약물이나 이미 개발이 완료되었으나 낮은 생체 이용률 문제로 인해 개발의 어려움을 겪고 있는 약물들을 대상으로 적용이 가능한 범용적 기반 기술(broad-spectrum platform technology)을 제공한다. 본 발명에 의한 약물 전달체는 생체 이용률이 낮은 소수성 약물을 약물 전달체와 흡착시켜 체내로 전달이 가능케 함과 동시에 체내에서 약물의 서방출성 특성을 가짐으로써 장차 환자들에게 상당한 치료 편의성을 제공해 줄 수가 있다.

본 발명에 의한 약물 전달체는 단백질 의약품에도 적용이 가능하다. 매일 혹은 2~3일에 1회씩 주사 투여를 받아야 하는 특허가 만료된 1세대 단백질 약물은 그 동안 환자 편의성 개선을 위해 노력한 결과, 최근에는 1주에 1회 내지는 한 달에 1~2회로 투여하는 주사 제형까지 개발되어 시판되고 있다. 본 발명은 단백질 자체의 변형이나 특별한 분자 구조의 도입을 요구하는 기존 기술과는 달리 1세대 단백질 약물을 약물 전달체와 단순 혼합 및 흡착해 사용함으로써 이러한 목적을 쉽게 달성할 수 있는 강력한 수단을 제공하고 있다. 따라서 본 발명에 의한 기술을 단백질 약물에 적용할 경우 차세대 약물 개발 기간이 상당히 단축될 수 있을 것이며 소수성 합성 약물의 이용가치 제고에도 효과적으로 기여할 수 있다. 궁극적으로는 본 발명의 기술은 제품 경쟁력 있는 서방출형 단백질 및 합성 의약품 등의 신약 개발에 매우 유용하게 적용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1 : 키토산-벤조산 컨쥬게이트의 제조

생체 적합성 고분자 물질인 키토산을 원료 물질로 사용하였다. 제조에 사용된 키토산의 규격은 탈 아세틸화도가 84.5% 이었고 분자량 크기는 20-50 kD의 수용성 키토산이다(미래바이오텍, 한국). 주사용 증류수에 용해된 0.2% 수용성 키 토산 용액을 준비한 후, 용기 A와 B에 각각 40 ㎖씩 분주하고, 10% 벤조산(시그마) 용액을 최종 농도가 각각 15 mM 및 30 mM이 되도록 A와 B용기에 분주하였다. 키토산 고분자 사슬에 존재하는 아민기와 첨가해 준 벤조산을 공유 결합시키기 위해 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, EDC(시그마)를 사용하였다. 컨쥬게이션 반응은 10 mM MES 완충용액(pH 5.5)에서 진행하였다. 반응 용액에 첨가한 EDC는 벤조산이 충분히 컨쥬게이션될 수 있도록 A에는 30 mM, B에는 50 mM의 농도로 첨가하였다. 각각의 반응 용기에 EDC 및 MES 완충용액을 첨가하기 전, 각 용액의 pH는 1 mM 또는 5 mM의 염산 또는 가성소다를 첨가하여 각 용액의 pH를 5.0-5.5가 되도록 조절하였다. 컨쥬게이션 반응은 실온에 각 용기를 보관하면서 최소 10시간 이상 진행하였다. 컨쥬게이션 반응이 완료된 직후 A 용기 내의 용액은 pH가 약 6.6, B 용기 내의 용액은 pH가 약 7.0이었다. 탁상용 원심 분리기를 사용해 상등액을 제거한 다음 침전물을 50% 에탄올 용액으로 세척한 후, 동일 조건에서 다시 원심 분리하여 반응 잔여물을 제거한 침전물을 얻었다. 각 침전물의 용기에 주사용 증류수를 40 ㎖를 첨가하고 충분히 분산한 후, 원심 분리를 통해 상등액을 제거하고 침전물을 회수하였다. 각 침전물이 포함된 용기에 증류수 40 ㎖를 첨가하여 다시 분산하고, 빙초산 50 ℓ을 첨가하여 용액의 pH를 4.3-4.4로 맞춘 후, 냉장 보관하였다.

실시예 2: 키토산-벤조산 컨쥬게이트의 단백질 흡착도 측정

실시예 1에서 제조한 15 mM의 벤조산이 컨쥬게이션된 키토산 고분자 물질 2 ㎎(약물 전달체 A, 1 ㎖)씩 취하여 각각 별도의 용기에 넣고 표 1과 같이 처리하였다. 표 1에 따른 각 제조 용액을 원심 분리하여 침전물을 회수한 다음 상등액을 SDS-PAGE로 분석하여 상등액에 존재하는 단백질 양을 결정하였다. 본 실시예의 평가용 단백질은 인간 성장 호르몬을 사용하였다.

실험 결과, 실시예 1에 의해 제조된 약물 전달체의 경우, 키토산 고분자 2 ㎎ 기준당 약 0.4 ㎎의 단백질을 흡착할 수 있음을 확인하였고, 동일한 방식으로 30 mM 벤조산이 컨쥬게이션된 시료 B를 평가한 결과, 시료 A보다 더 우수한 단백질 흡착능력을 지니고 있음을 확인하였다. 이는 고분자 사슬에 컨쥬게이션되는 소수성기의 함량이 증가할수록 흡착되는 단백질의 양도 증가될 수 있음을 의미한다.

약물 전달체 A(㎖)	단백질 첨가량(㎎)	TPP^*(㎖)	상등액 내 단백질 함량(㎎)
1	0.4	0.4	~ 0.02
1	0.6	0.4	~ 0.2
1	0.8	0.4	~ 0.4
1	1.0	0.4	~ 0.6
물 1 ㎖	0.4	0.4	~ 0.4

^*TPP: Tripolyphosphate

실험예 1: 키토산-벤조산에서 소수성기의 단백질 흡착 확인 실험

시료 A와 B의 단백질 흡착력은 소수성기인 벤조산이 컨쥬게이션된 키토산 고분자로부터 유래되고 있음을 확인하고자 벤조산이 컨쥬게이션된 키토산과 벤조산이 컨쥬게이션하지 않은 원료 키토산을 사용하여 동등 조건하에서 비교 평가를 실시하였다. 표 2의 키토산은 실시예 1에서 사용한 것과 동일한 원료 물질이며 벤조산이 컨쥬게이션된 키토산은 실시예 1에서 제조된 시료 A를 사용하였다. 표 2의 내용에 따른 각 용액을 원심 분리하여 침전물을 회수하고, 상등액에 존재하는 단백질을 SDS-PAGE로 분석하여 상등액에 존재하는 단백질 함량의 변화를 평가하였다. 본 실험예의 평가용 단백질은 인 성장 호르몬을 사용하였다.

도 1의 1-5번 및 6-10번의 밴드를 비교해보면, 3-5번에서 뚜렷한 단백질 함량 변화를 확인할 수 있고, 이를 통해 단백질을 흡착하는 능력은 키토산-벤조산의 컨쥬게이트 자체이며, 비교 평가한 원료 키토산에 의한 단백질 흡착은 전혀 없음을 확인하였다. 따라서 본 단백질 흡착성 실험에서의 주요 흡착 능력은 고분자 물질에 컨쥬게이션된 소수성기에 의해 제공되고 있음을 확인하였다.

번호	키토산-벤조산 컨쥬게이트(㎖)	0.2% 키토산(㎖)	TPP(㎖)	단백질 첨가량(㎎)	최종 부피(㎖)
1	1	-	0	0.4	1
2	1	-	0.1	0.4	1.1
3	1	-	0.2	0.4	1.2
4	1	-	0.3	0.4	1.3
5	1	-	0.4	0.4	1.4
6	-	1	0	0.4	1
7	-	1	0.1	0.4	1.1
8	-	1	0.2	0.4	1.2
9	-	1	0.3	0.4	1.3
10	-	1	0.4	0.4	1.4

실험예 2: 키토산-벤조산 컨쥬게이트에서 키토산 고분자에 컨쥬게이션되는 결합기의 구조적 특징에 따른 단백질의 흡착 능력 확인

키토산 고분자 물질에 컨쥬게이션되는 결합기를 벤조산에서 4-설포벤조산(4-sulfobenzoic acid)으로 변경하여 실험예 1에서와 동일한 방법으로 제조한 다음 단백질 흡착 능력을 조사하였다. 그 결과를 보면, 15 mM 4-설포벤조산이 컨쥬게이션된 키토산 고분자는 단백질 흡착력이 전혀 없음을 확인하였다. 이를 통해 실험예 1의 단백질을 흡착하는 주된 능력은 키토산 고분자에 컨쥬게이션되는 결합기의 구조적 특징과 매우 관련이 있으며 그 주된 흡착력은 결합기가 제공하는 소수성임을 확인하였다.

실험예 3: 단백질이 컨쥬게이션된 키토산-벤조산에서 단백질의 서방성 방출 분석

실시예 1에서 제조한 15 mM의 벤조산이 컨쥬게이션된 키토산 고분자 물질 1 ㎖에 대해 200 ㎍의 인 성장 호르몬 및 0.4 ㎖ TPP(1 ㎎/㎖)를 첨가하여 단백질을 키토산-벤조산 컨쥬게이트에 흡착시킨 다음, 원심 분리를 통해 컨쥬게이트를 침전물로 회수하였다. 5 ㎖ PBS로 채워진 용기를 다수 준비한 다음, 회수한 각각의 침전을 1 ㎖ PBS로 충분히 분산하고, 5 ㎖ PBS로 채워진 용기에 각각의 침전물 분산액 1 ㎖씩 넣어주고 충분히 혼합하였다. 키토산-벤조산 컨쥬게이트에 흡착된 단백질이 PBS 용액 내에서 어떤 방출 패턴을 보이는지를 규명하기 위해서 상온에서 6일간 장기 노출시키면서 주기적으로 컨쥬게이트로부터 용액상으로 방출된 단백질 양을 측정하였다. 단백질 함량 분석은 BSA를 표준품으로 하고 발색 시약은 브래드포드(Bradford) 용액을 사용하였으며 초기에 투입한 단백질 총량(200 ㎍)에 대비하여 각 분석 시점에서의 정량된 단백질 양을 비율로 환산하였다.

표 3의 인 비트로 단백질 방출 시험 결과에서 확인할 수 있듯이, PBS 용액 내에서 3일까지는 방출량이 증가되지만 3일 이후로는 초기 투입량의 약 60% 정도가 여전히 컨쥬게이트에 흡착되어 방출이 지연되고 있음을 보여주고 있다.

측정 일자	(상등액 내 단백질 총량/200 ㎍) × 100
0	0
1	21.5
2	29.4
3	39.5
5	40.0
6	41.8

또한, 실시예 1에서의 제조 방법에 의해 25 mM의 벤조산이 컨쥬게이션된 키토산 고분자 물질을 제조하고, 초기에 흡착시킨 단백질의 양은 100 ㎍으로 낮추어 관찰 시간은 약 90시간까지 단축한 경우, 단백질 방출은 주어진 용액 내에서 1시간 내로 23.5%까지 즉시 방출이 되었고 이후로는 거의 일정한 수준을 유지하였다(표 4). 본 결과는 약 90시간이 경과한 시점에서 초기 투입량 대비 약 75% 이상의 단백질이 25 mM의 벤조산이 컨쥬게이션된 키토산 고분자 물질에 여전히 흡착되어 있음을 보여주고 있다. 이는 컨쥬게이션된 벤조산의 함량이 증가됨에 따라 전체적인 약물 전달체의 소수성도 함께 증가되며, 그로 인해 시간에 따라 방출되는 단백질의 비율은 크게 감소되고 있음을 보여준다.

측정 시간	(상등액 내 단백질 총량/100 ㎍) × 100
0	0
1	23.5
2	24.3
4	21.2
8	25.9
16	21.2
24	24.3
51	25.9
68	22.8
89	27.8
평균	24.1

실험예 4: 키토산-벤조산 컨쥬게이트에 대한 BSA 의 흡착성 및 방출 패턴 조사

실험예 3에서 사용한 25 mM 벤조산이 컨쥬게이션된 키토산 고분자 물질을 사용하여 BSA의 흡착성 평가 및 시간에 따른 시험관 내에서의 BSA 단백질 방출 패턴을 조사하였다. 각 컨쥬게이트 1 ㎖ 상당의 침전물에 대해 100 ㎍의 BSA 단백질을 가하여 약물 전달체에 흡착시키는 단계를 거친 후, 이를 5 ㎖씩 준비한 각각의 방출 시험 용액(PBS 완충용액)에 첨가하여 충분히 교반하여, 인 비트로 방출 평가를 실시하였다. 본 평가는 실온에서 실시하였고 관찰 기간은 총 4일이었으며 주기적으로 브래드포드 용액을 이용한 단백질 정량 분석법을 통해 약물 전달체로부터 방출된 BSA 단백질 양을 측정하였다. 방출 시험 용액의 pH에 따른 BSA 방출 패턴의 변화를 관찰하기 위해 5 ㎖ 방출 시험 용액은 60 mM의 소듐 아세테이트(pH 5.2), PBS 및 50 mM Tris(pH 8.5)의 세 가지로 구성해 평가하였다. 표 5의 결과에서 볼 때, 각 시험 용액의 pH에 따라 BSA 단백질의 방출 패턴에 차이가 있었으며, 한 시간이 경과하면서 방출량은 지속적으로 증가되고 있음을 보여주었다. 또한, 시험 2일차 이후에는 세 가지 용액에서 모두 50% 이상 단백질이 방출되었음을 확인하였다(도 2).

일자	60 mM 소듐 아세테이트(pH 5.2)	PBS(pH 7.4)	50 mM Tris(pH 8.5)
0	0	0	0
1	55	49	46
2	74	65	54
4	74	70	82

실시예 3: 소듐 카복시메틸셀룰로오스 - 디페닐아민 컨쥬게이트 또는 히아루론산- 디페닐아민 컨쥬게이트를 이용한 약물 전달체의 제조

대표적인 음이온성 생체 적합성 고분자 물질인 소듐 카복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose sodium) 및 히아루론산(hyaluronic acid)을 대상으로 실시예 1에서의 유사한 방법으로 약물 전달체를 제조하였다. 즉, 소듐 카복시메틸셀룰로오스 25 ㎎을 물에 녹이고, 최종 농도가 20 mM이 되게 디페닐아민(diphenylamine)을 적당량 첨가하여 충분히 교반하였다. 최종 농도 50 mM의 MES 완충용액(pH 5.2-5.5)의 하에서 최종 농도가 20 mM이 되도록 카보디이미드(carbodiimide, EDC)를 첨가하였다. 반응 용액의 최종 부피는 50 ㎖이었으며, 본 혼합액을 실온에서 24시간 이상 방치하여 약물 전달체를 제조하였다. 컨쥬게이션 반응이 완료된 약물 전달체는 원심 분리를 통해 침전물을 회수하고, 침전물 세척 과정을 통해 최종적으로 약물 전달체를 제조하였다. 또한, 동일한 조건 및 방법으로 히아루론산에 50 mM 디페닐아민이 컨쥬게이션된 약물 전달체를 추가 제조하였다.

실험예 5: 키토산-벤조산 컨쥬게이트의 고압 멸균 처리 시 단백질 흡착 능력에 대한 영향 조사

실시예 1에서와 유사한 제조 방법을 사용하여 0.2%의 수용성 키토산 용액 50 ㎖에 대해 20 mM의 벤조산, 30 mM의 벤조산 또는 50 mM의 벤조산이 컨쥬게이션된 약물 전달체를 제조하였다. 또한, 0.2%의 키토올리고당 용액 50 ㎖에 대해서 50 mM 벤조산이 컨쥬게이션된 약물 전달체를 추가 제조하였다. 제조된 각각의 약물 전달체를 PBS 완충용액에 충분히 분산시킨 후, 각 용액을 1 ㎖씩 에펜돌프 튜브(eppendorf tube)에 분주하고 고압 증기 멸균을 실시하였다. 고압 멸균 처리된 각각의 시료는 상온에서 일정 시간 방치하여 식힌 다음 원심 분리를 통해 약물 전달체를 침전으로 회수하였다. 회수된 침전물에 200 ㎍의 인 성장 호르몬을 첨가하여 충분히 흡착시킨 다음 원심 분리하여 상등액을 취하였다. 상등액 내 존재하는 단백질을 정량하여 초기 투입량 대비 단백질 함량 비율을 구하였다. 단백질 흡착은 PBS (pH 7.2)조건에서 실시하였음.

표 6의 결과에서 볼 때, 키토올리고당 컨쥬게이트를 제외하고는 모두 오차 범위 내에서 고압 멸균 처리가 약물 전달체의 단백질 흡착 능력에 큰 영향을 주지 않음을 확인하였다.

시료 처리	평가 시료	상등액 내 단백질 비율 (정량값/200 ㎍) X 100
고압 증기 멸균	20 mM 키토산-벤조산 컨쥬게이트	16.5%
	30 mM 키토산-벤조산 컨쥬게이트	9.5%
	50 mM 키토산-벤조산 컨쥬게이트	1.05%
	50 mM 키토올리고당-벤조산 컨쥬게이트	21%
상온 보관	20 mM 키토산-벤조산 컨쥬게이트	17.5%
	30 mM 키토산-벤조산 컨쥬게이트	8%
	50 mM 키토산-벤조산 컨쥬게이트	0.9%
	50 mM 키토올리고당-벤조산 컨쥬게이트	2.65%

실험예 6: 소듐 카복시메틸셀룰로오스 -벤질아민 컨쥬게이트의 단백질 흡착성 조사

실시예 1에서의 약물 전달체 제조 방법에 따라 0.1% 소듐 카복시메틸셀룰로오스 용액 50 ㎖에 대해서 50 mM의 벤질아민을 화학적으로 컨쥬게이션시켜 약물 전달체를 제조하였다. 본 약물 전달체를 사용하여 인 성장 호르몬 및 백혈구 성장 촉진 인자에 대한 단백질 흡착성을 비교 평가하였다. 흡착은 약물 전달체 1 ㎖의 침전물에 대해 각 단백질을 200 ㎍씩 첨가하였고, 인 성장 호르몬은 PBS 완충용액(pH 7.2), 백혈구 성장 촉진 인자는 10 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 4.0)에서 각각 흡착 및 단백질 정량을 실시하였다. 각 시료에 대한 단백질 흡착 비율 결과, 본 실시예의 약물 전달체는 인 성장 호르몬에 대해서는 전혀 흡착을 보이지 않았으나 백혈구 성장 촉진 인자 단백질에 대해서는 초기 투입량 대비 약 4.5%가 상등액에 존재하는 것으로 볼 때 약 95.5%가 약물 전달체에 흡착이 되었음을 확인하였다.

실험예 7: 키토산-벤조산 컨쥬게이트의 인 비트로 방출 시험 및 약물 동력학 시험

실시예 1에서의 약물 전달체 제조 방법에 따라 0.2% 키토산 용액 50 ㎖에 대해서 각각 15 mM, 20 mM, 25 mM 또는 30 mM 농도의 벤조산을 화학적으로 컨쥬게이션시켜 약물 전달체를 제조하였다. 이를 사용하여 백혈구 성장 촉진 인자 단백질을 대상으로 인 비트로 방출 시험을 실시하였고, 그 결과를 바탕으로 체내 약물 동력학(pharmacokinetics)시험을 실시하였다.

실험예 8: 백혈구 성장 촉진 인자 단백질을 대상으로 한 인 비트로 방출 시험

15 mM, 20 mM, 25 mM 또는 30 mM의 벤조산이 컨쥬게이션된 각각의 약물 전달체 0.5 ㎖를 원심 분리하여 침전물을 회수하고, 본 침전물에 200 ㎍의 백혈구 성장 촉진 인자 단백질을 넣고 10 mM 소듐 아세테이트(pH 4.0)로 최종 0.5 ㎖이 되게 조절하였다. 각각의 용액을 균일하게 분산시킨 다음 실온에서 약 1-2분간 방치하여 단백질이 약물 전달체에 충분히 흡착되도록 하였다. 이후 원심 분리를 실행하여 상등액을 취한 다음 용액 내 단백질 정량 분석을 실시하였다. 단백질 정량 분석의 표준품은 시험과 동일한 백혈구 성장 촉진 인자 단백질을 사용하였으며 약물 전달체에 흡착되지 않고 상등액에 존재하는 단백질의 양을 초기 투입량 대비 비율로 환산하여 표 7에 나타내었다.

약물 전달체	비 흡착 비율 [(상등액 단백질 함량/200 ㎍ 단백질) × 100]
15 mM 컨쥬게이트	~100%
20 mM 컨쥬게이트	55.0%
25 mM 컨쥬게이트	9.4%
30 mM 컨쥬게이트	2.3%

실험예 9: 키토산-벤조산 컨쥬게이트의 약물 동력학 분석

상기 실험에서의 20 mM 벤조산 컨쥬게이트 및 단백질이 포함된 시료 0.5 ㎖를 준비하여 8주령 SD 래트에 피하 주사로 투여하고 일자 별로 혈액을 채취하여 혈액 내 존재하는 백혈구 성장 촉진 인자 단백질의 함량을 효소-결합 면역흡착 방법(ELISA)으로 분석하였다(Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; 및 Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984). 25 mM 및 30 mM 벤조산 컨쥬게이트에 대해서도 동일한 과정을 통해 생체 내 약물 동력학 분석을 실시하였다. 실험 결과, 도 3 및 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 생체 내의 결과와 생체 외의 결과가 경향적으로 일치하고 있음을 확인하였고, 25 mM 이상의 벤조산 컨쥬게이트의 경우에는 체내에서 1일차에 이어서 6일차에도 단백질 방출을 보이고 있음을 확인하였다.

실험예 10: 키토산-벤조산 컨쥬게이트 , 키토올리고당 -벤조산 컨쥬게이트 및 두 컨쥬게이트의 혼합액의 단백질 흡착성 비교

실시예 1에서의 제조 방법에 따라서 0.2% 키토산 50 ㎖ 및 0.2% 키토올리고당 50 ㎖ 용액에 대해서 각각 50 mM 벤조산을 컨쥬게이션시키고 최종적으로 얻은 각각의 약물 전달체를 가지고 다음의 평가를 실시하였다.

본 실험예에서 제조된 키토산-50 mM 벤조산 컨쥬게이트 1 ㎖(CTS-50로 표기), 키토올리고당-50 mM 벤조산 컨쥬게이트 1 ㎖(OCTS-50로 표기) 및 이 두 컨쥬게이트의 혼합액 2 ㎖(MIX-50로 표기)을 별개의 용기에 여러 개 준비하고 원심 분리하여 침전물을 회수하였다. 각 침전물에 PBS에 용해된 200 ㎍/㎖의 BSA을 1 ㎖씩 첨가하고 분산하여 단백질을 약물 전달체에 흡착시켰다. 각 용기는 냉장 보관하면서 1,3,5 및 7일차에 시료를 취한 다음 원심 분리하여 얻은 상등액 내 단백질 함량을 측정하였고 초기 투입량 대비 측정된 단백질 함량 비율을 구하여 표 8에 나타내었다.

실험 결과를 볼 때, OCTS-50는 CTS-50보다 단백질 흡착성이 더 우수한 것으로 나타났고, MIX-50은 상대적으로 높은 단백질 흡착성을 보였다. 한편, 시간에 따른 약물 전달체로부터의 단백질 누적 방출량은 OCTS-50를 제외하고 모두 서서히 증가하는 추세를 보였다.

일자	상등액 내 단백질 누적 방출량(%)
일자	OCTS-50	MIX-50	CTS-50
1	1.5	5.6	30.0
3	1.2	6.3	35.1
5	1.2	6.8	37.6
7	1.2	7.1	38.4

실험예 11: 약물 전달체의 총 함량과 방출되는 단백질의 양적 관계

상기 실험에서 제조된 키토산-50 mM 벤조산 컨쥬게이트를 각각 1 ㎖, 2 ㎖ 및 3 ㎖씩 별도의 용기에 여러 개 준비하고 원심 분리하여 각각의 침전물을 얻었다. 준비된 각 침전물에 PBS에 용해된 200 ㎍/㎖의 BSA을 1 ㎖씩 첨가하고 분산하여 단백질을 침전된 약물 전달체에 흡착시켰다. 각 용기는 냉장 보관하면서 1,2,3 및 4일차에 각 시료를 원심 분리하여 얻은 상등액 내 단백질 함량을 측정하여 초기 투입량 대비 방출된 단백질 함량 비율을 구하여 표 9에 나타내었다.

도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 주어진 단백질 양에 대비하여 처리된 약물 전달체의 총 함량이 증가할수록 시험관 내에서 방출되는 단백질의 양은 줄어드는 경향을 보였다.

측정 일자	0	1	2	3	4
1 ㎖ 침전물(%)	8.5	22.3	24.7	25.9	26.6
2 ㎖ 침전물(%)	1.2	13.1	13.2	14.4	15.0
3 ㎖ 침전물(%)	0.8	11.8	12.3	13.1	14.0

실시예 4: 키토산-벤질아민 컨쥬게이트의 제조

100 ㎎의 키토산 분말을 적절한 양의 에탄올 또는 메탄올이 첨가된 100 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 6.0) 또는 인산 완충용액(pH 6.0-6.3)에 충분히 용해시킨 후, 최종 농도가 50 mM 이상의 숙시닉 안하이드라이드(succinic anhydride)용액이 되게 적절한 양의 숙시닉 안하이드라이드 분말을 첨가한다. 용액의 pH는 6 전후로 유지 조절하면서 실온에서 24시간 이상 반응을 진행하였다. 반응이 완료된 다음 반응기가 변형된 키토산은 투석을 통해 회수하였다. 순수한 물에 충분히 투석한 이후 얻어진 키토산은 실시예 1의 방법에 근거하여 30 mM 벤질아민을 컨쥬게이션시킴으로써 약물 전달체를 제조하였다.

실험예 12: 키토산-벤조산 컨쥬게이트의 단백질 흡착력에 대한 pH 영향 평가

본 발명에 의한 키토산-벤조산으로 구성된 약물 전달체가 단백질과 흡착하는 최적의 pH조건을 조사하기 위해서 각각 20 mM, 30 mM 및 40 mM 키토산-벤조산 컨쥬게이트를 실시예 1의 방법에 따라 제조하였다. 각 경우에 있어서 키토산 함량 기준으로 2 ㎎ 상당의 약물 전달체에 대해서 인 성장 호르몬 200 ㎍ 및 BSA 200 ㎍을 각각 pH 5.2와 pH 7.2의 조건에서 흡착시키고 상등액의 단백질 함량을 조사하였다(도 6). 본 실시에서는 단백질 흡착 시 TPP를 처리하지 않고 실시하였다. 방출 시험 용액은 20 mM 소듐 아세테이트(pH 5.2)와 20 mM의 Tris(pH 7.5)를 사용하였다.

도 8 및 도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, 각 단백질마다 약물 전달체에 흡착하는데 있어서 흡착되는 용액의 pH에 따라 흡착 결과의 차이를 보이고 있음을 확인하였다. 인 성장 호르몬은 산성 및 약 알칼리 조건에서 비교적 잘 흡착되었으며 BSA는 약물 전달체에 대해서 산성에서는 흡착이 잘 안되었고 약 알칼리 조건에서는 흡착력이 비교적 우수하였다.

실험예 13: 키토산-벤조산 컨쥬게이트의 자체 독성 평가

키토산-벤조산 간의 화학적 컨쥬게이션으로 구성된 약물 전달체구성물의 자체 독성을 평가하기 위해서 생후 5주령 암컷 ICR 마우스를 군당 5마리씩으로 나누어 A군 및 B군을 준비하였다. 실시예 1에서의 방법에 따라 제조된 100 mM의 벤조산이 컨쥬게이션된 키토산-벤조산 컨쥬게이트를 1.6 ㎖씩 원심 분리해서 얻어진 침전물에 각각 생리 식염수 0.5 ㎖를 첨가하여 골고루 분산하고, A군의 각 마우스에 피하 주사로 접종하였다. 동일한 원액을 사용하여 키토산-벤조산 컨쥬게이트 3.3 ㎖씩 원심 분리해서 얻어진 각각의 침전물에 생리 식염수 0.5 ㎖씩을 첨가하여 균일하게 분산한 다음 B군의 각 마우스에 피하 주사로 접종하였다. 마우스 체중 관찰은 시험 개시 후 7일간까지 진행하였으며 각 평가군의 체중을 측정하여 표 10에 나타내었다. 실험 결과, A군(137 ㎎ 키토산/㎏ BW, 835 ㎎ 벤조산/㎏ BW, 총합 972 ㎎ 솔리드/㎏ BW) 및 B군(282 ㎎ 키토산/㎏ BW, 1,723 ㎎ 벤조산/㎏ BW; 총합 2,005 ㎎ 솔리드/㎏ BW)의 체중 변화는 과량 접종이 되었음에도 불구하고 7일간 각 평가군의 평균 체중 증가는 일반적인 마우스의 체중 증가 대비 특이한 차이점을 보이지 않았다. 참고로 동종 마우스의 정상적인 체중은 5주령 암컷이 21-25 g 정도이고 6주령 암컷은 23-28 g 정도이다. 이를 통해 본 발명에 의한 약물 전달체의 자체 독성은 거의 없음을 확인하였다.

측정 일자	투여 직전의 평균 체중(g)	1일 후 평균 체중(g)	2일 후 평균 체중(g)	7일 후 평균 체중(g)
투여군 A	23.36	23.78	25.08	26.66
표준 편차	1.4	1.3	1.4	1.7
대조군의 %	100.0%	101.8%	107.4%	114.1%
투여군 B	21.74	22.04	23.26	25.34
표준 편차	0.6	0.7	0.6	1.3
대조군의 %	100.0%	101.4%	107.0%	116.6%

실험예 14: 키토산-벤조산 컨쥬게이트의 소수성 물질에 대한 흡착성 평가

실시예 1에서 제조된 15 mM의 약물 전달체를 사용하여 대표적인 합성 소수성 물질인 BBR-250(Brilliant Blue R-250)을 모델로 하여 흡착성을 평가하였다. BBR-250을 에탄올에 적절히 용해하여 최종 2.4 ~ 120 μM 사이의 정량 가능한 구간 내에서 흡착성 평가를 실시하였다. 벤조산이 컨쥬게이션되지 않은 원료 키토산 물질(키토산 함량으로서 2 ㎎)과 15 mM 키토산-벤조산 컨쥬게이트(키토산 함량으로서 2 ㎎)을 준비하고 각각에 대해 120 μM/㎖의 BBR-250 1 ㎖를 첨가하여 약물 전달체에 BBR-250을 흡착시킨 다음, 원심 분리를 통해 각각의 약물 전달체를 회수하고 상등액에 남아있는 BBR-250의 함량을 조사하였다. 실험 결과, 원료 키토산을 처리한 시료의 상등액은 81 μM/㎖의 BBR-250 함량을 나타냈고, 키토산-벤조산 컨쥬게이트를 처리한 상등액은 7.2 μM/㎖의 BBR-250 함량을 나타내었다. 따라서, 본 발명에 의한 약물 전달체는 저 분자량이면서 소수성 물질의 대표적 모델인 BBR-250을 대부분 흡착하고 있음을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 아민기를 갖는 고분자 물질 또는 카복실기를 지닌 고분자 물질과 소수성 결합기가 EDC에 의해 컨쥬게이션 반응이 일어나는 반응 도식을 보여준다.

도 2는 아민기를 갖는 고분자 물질에 링커(linker)를 컨쥬게이션시켜서 고분자 물질의 아민기를 말단 카복실기로 변경하고, 말단 카르복실기로 변경된 고분자 물질과 소수성 결합기가 EDC에 의해 컨쥬게이션 반응이 일어나는 반응 도식을 보여준다.

도 3은 SDS-PAGE 결과를 통하여 15 mM의 벤조산이 컨쥬게이션된 키토산-벤조산 컨쥬게이트의 단백질 흡착 능력을 보여준다. 도면에서 1-5번은 키토산-벤조산 컨쥬게이트의 단백질 흡착 능력을, 6-10번은 키토산의 단백질 흡착 능력을 나타낸다.

도 4는 25 mM의 벤조산이 컨쥬게이션된 키토산-벤조산 컨쥬게이트를 사용하여 BSA의 시간에 따른 시험관 내에서의 단백질 방출 패턴을 나타낸다.

도 5는 20 mM의 벤조산이 컨쥬게이션된 키토산-벤조산 컨쥬게이트의 G-CSF 약물 동력학 패턴을 보여주는 그래프를 나타낸다.

도 6은 25 mM의 벤조산이 컨쥬게이션된 키토산-벤조산 컨쥬게이트(적색 그래프) 및 30 mM의 벤조산이 컨쥬게이션된 키토산-벤조산 컨쥬게이트(청색 그래프)의 G-CSF 약물 동력학 패턴을 보여주는 그래프를 나타낸다.

도 7은 50 mM의 벤조산이 컨쥬게이션된 키토산-벤조산 컨쥬게이트의 함량과 시험관 내에서 방출되는 단백질의 양적 관계를 보여주는 그래프를 나타낸다.

도 8은 SDS-PAGE 결과를 통하여 키토산-벤조산 컨쥬게이트의 pH에 따른 인 성장 호르몬 단백질의 흡착 능력을 보여준다. 도면에서 1, 4번은 20 mM의 벤조산이 컨쥬게이션된 키토산-벤조산 컨쥬게이트, 2, 5는 30 mM의 벤조산이 컨쥬게이션된 키토산-벤조산 컨쥬게이트, 3, 6은 40 mM의 벤조산이 컨쥬게이션된 키토산-벤조산 컨쥬게이트를 사용하였다.

도 9은 SDS-PAGE 결과를 통하여 키토산-벤조산 컨쥬게이트의 pH에 따른 BSA 단백질의 흡착 능력을 보여준다. 도면에서 1, 4번은 20 mM의 벤조산이 컨쥬게이션된 키토산-벤조산 컨쥬게이트, 2, 5는 30 mM의 벤조산이 컨쥬게이션된 키토산-벤조산 컨쥬게이트, 3, 6은 40 mM의 벤조산이 컨쥬게이션된 키토산-벤조산 컨쥬게이트를 사용하였다.

Claims

(a) 생체 적합성 중합체; 및 (b) 상기 중합체에 컨쥬게이션된 소수성기를 포함하는 약물전달체.
제 1 항에 있어서, 상기 생체 적합성 중합체는 합성 중합체 또는 천연 중합체인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
제 2 항에 있어서, 상기 생체 적합성 중합체로서의 합성 중합체는 폴리에스테르, 폴리하이드록시알카노에이트(PHAs), 폴리(α-하이드록시액시드), 폴리(β-하이드록시액시드), 폴리(3-하이드로식부티레이트-co-발러레이트; PHBV), 폴리(3-하이드록시프로프리오네이트; PHP), 폴리(3-하이드록시헥사노에이트; PHH), 폴리(4-하이드록시액시드), 폴리(4-하이드록시부티레이트), 폴리(4-하이드록시발러레이트), 폴리(4-하이드록시헥사노에이트), 폴리(에스테르아마이드), 폴리카프로락톤, 폴리락타이드, 폴리글리코라이드, 폴리(락타이드-co-글리코라이드; PLGA), 폴리디옥사논, 폴리오르토에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리(글리콜산-co-트리메틸렌 카보네이트), 폴리포스포에스테르, 폴리포스포에스테르 우레탄, 폴리(아미노산), 폴리사이아노아크릴레이트, 폴리(트리메틸렌 카보네이트), 폴리(이미노카보네이트), 폴리(타이로신 카보네이트), 폴리카보네이트, 폴리(타이로신 아릴레이트), 폴리알킬렌 옥살레이트, 폴리포스파젠스, PHA-PEG, 에틸렌 비닐 알코올 코폴리머(EVOH), 폴리우레탄, 실리콘, 폴리에스테르, 폴리올레핀, 폴리이소부틸렌과 에틸렌-알파올레핀 공중합체, 스틸렌-이소브틸렌-스틸렌 트리블록 공중합체, 아크릴 중합체 및 공중합체, 비닐 할라이드 중합체 및 공중합체, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 메틸 에테르, 폴리비닐리덴 할라이드, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리비닐리덴 클로라이드, 폴리플루오로알켄, 폴리퍼플루오로알켄, 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐 케톤, 폴리비닐 아로마틱스, 폴리스틸렌, 폴리비닐 에스테르, 폴리비닐 아세테이트, 에틸렌-메틸 메타크릴레이트 공중합체, 아크릴로니트릴-스틸렌 공중합체, ABS 수지와 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체, 폴리아마이드, 알키드 수지, 폴리옥시메틸렌, 폴리이미드, 폴리에테르, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트 또는 폴리아크릴산-co-말레산인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
제 2 항에 있어서, 상기 생체 적합성 중합체로서의 천연 중합체는 키토산, 덱스트란, 셀룰로오스, 헤파린, 히알루론산, 알기네이트, 이눌린, 녹말 또는 글리코겐인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
제 1 항에 있어서, 상기 중합체에 컨쥬게이션된 소수성기는 탄소수 4개 이상 의 지방족 화합물 또는 방향족 화합물인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
제 5 항에 있어서, 상기 중합체에 컨쥬게이션된 소수성기는 1-3개의 페닐기를 갖는 방향족 화합물인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
제 5 항에 있어서, 상기 중합체에 컨쥬게이션된 소수성기는 탄소수 4개 이상의 알킬, 탄소수 4개 이상의 알케닐, 탄소수 3개 이상의 사이클로알킬, 탄소수 4개 이상의 알콕시, 아릴, 카복시아릴, 아릴포스페이트, 아릴아민, 헤테로아릴, 아릴알킬, 아릴알케닐 또는 알킬아릴인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
제 7 항에 있어서, 상기 중합체에 컨쥬게이션된 소수성기는 아릴, 카복시아릴, 아릴포스페이트, 아릴아민, 헤테로아릴, 아릴알킬, 아릴알케닐 또는 알킬아릴인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
제 1 항에 있어서, 상기 생체 적합성 중합체는 아미노기를 가지고 있으며, 상기 소수성기는 상기 아미노기에 아마이드(amide) 결합되어 있고, 상기 약물전달 체는 다음 화학식 I로 표시되는 것을 특징으로 하는 약물전달체:

화학식 I

R₁-NH-CO-R₂

상기 화학식에서, R₁은 생체 적합성 중합체의 주골격을 나타내고; R₂는 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 아릴알케닐 또는 알킬아릴인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
제 1 항에 있어서, 상기 생체 적합성 중합체는 카복실기를 가지고 있으며, 상기 소수성기는 상기 카복실기에 아마이드(amide) 결합되어 있고, 상기 약물전달체는 다음 화학식 Ⅱ로 표시되는 것을 특징으로 하는 약물전달체:

화학식 Ⅱ

R₁-CO-NH-R₂

상기 화학식에서, R₁은 생체 적합성 중합체의 주골격을 나타내고; R₂는 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 아릴알케닐 또는 알킬아릴인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
제 1 항에 있어서, 상기 약물전달체는 상기 소수성기에 흡착되어 운반되는 단백질, 펩타이드 및 비친수성 화학약물로 구성된 군으로부터 선택되는 약물을 추가적으로 포함하는 약물전달체.
제 1 항에 있어서, 상기 생체 적합성 중합체는 30만 이하의 평균 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 약물전달체.
제 11 항에 있어서, 상기 약물전달체는 상기 운반하는 약물을 서방출(sustained release)하는 것을 특징으로 하는 약물전달체.
제 1 항에 있어서, 상기 소수성기는 생체 적합성 중합체 1 중량을 기준으로 하여 0.5-20 중량이 중합체에 결합되는 것을 특징으로 하는 약물전달체.
제 1 항에 있어서, 상기 약물전달체는 (i) 생체 적합성 중합체에 결합되는 소수성기 종류; (ⅱ) 생체 적합성 중합체에 결합되는 소수성기의 결합량; (ⅲ) 약물을 흡착하는 약물 전달체의 함량 또는 이들의 조합에 따라 약물의 서방출성을 조절할 수 있는 것을 특징으로 하는 약물전달체.
제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 적합성 중합체 및 소수성기 사이의 컨쥬게이션은 링커에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 약물전달체.