KR20090108088A

KR20090108088A - 자기면역질환 예방제

Info

Publication number: KR20090108088A
Application number: KR1020097017223A
Authority: KR
Inventors: 히로시 카와카미
Original assignee: 유키지루시 뉴교 가부시키가이샤
Priority date: 2007-02-08
Filing date: 2008-02-07
Publication date: 2009-10-14
Also published as: JP2008189637A; EP2119445A4; AU2008212212A1; WO2008096826A1; EP2119445A1; CN101631555A; CA2677233A1; CN101631555B; US20100316621A1

Abstract

본 발명은, 젖유래의 염기성단백질 분획, 락토퍼옥시다아제(lactoperoxidase) 및 락토페린을 유효 성분으로 하는 자기면역질환 예방제이다. 일상적으로 섭취할 수 있고, 장기간에 걸쳐 섭취하여도 안전성이 높으며, 종래의 방법에서는 유효하게 예방 혹은 치료할 수 없었던 1형 당뇨병이나 관절 류머티즘 등의 자기면역질환을 예방할 수 있다.

Description

자기면역질환 예방제{PROPHYLACTIC AGENT FOR AUTOIMMUNE DISEASE}

본 발명은, 젖유래의 염기성단백질 분획을 유효 성분으로 하는 자기면역질환 예방제에 관한 것이다. 또한, 젖유래 염기성단백질이, 락토퍼옥시다아제 및/또는 락토페린인 것을 특징으로 하는 자기면역질환 예방제이다. 또한, 젖유래의 염기성단백질 분획, 락토퍼옥시다아제 및/또는 락토페린을 유효 성분으로 하고, 자기면역질환이 1형 당뇨병 또는 관절 류머티즘인 것을 특징으로 하는 자기면역질환 예방제이다. 본 발명에 따른 젖유래의 염기성단백질 분획, 락토퍼옥시다아제, 및 락토페린을 경구적으로 섭취함으로써, 종래의 방법에서는 유효하게 예방 혹은 치료할 수 없었던 1형 당뇨병이나 관절 류머티즘 등의 자기면역질환을 예방할 수 있다.

생체는 항상 「자기(self)」와 「비자기(non-self)」를 흉선 내에서 식별하고, 「자기」에 대해서는 지나친 면역응답이 일어나지 않도록 조절하고 있다. 흉선 중에서 「자기」에 반응하는 클론이 사멸하고, 「비자기」와 반응하는 클론만이 살아남는 것을 클론 선택이라고 부르고, 생체가 「자기」에 반응하지 않게 된 상태를 자기 관용(self tolerance)이라고 한다. 그러나, 자기에 대한 면역응답은 전혀 일어나지 않는 것은 아니고, 정상의 개체에 있어서도, 항상 미량의 자기항체(autoantibody)나 자기항원(autoantigen)을 인식하는 감작림프구는 존재하고 있 다. 이러한 반응을 자기면역(autoimmunity)이라고 부른다. 즉, 자기면역이란 생체내에서 항상 일어나고 있는 생리적인 반응이다. 한편, 유전적 요인이나 환경 요인 등에 의해 자기관용이 파괴되면, 자기에 대한 지나친 면역응답이 일어나고, 이 때문에 대량의 자기항체가 생산된다. 또한, 자기 감작림프구 클론의 증폭이 일어나, 병적 상태가 야기된다. 이와 같이, 면역 조절 기구가 교란되는 것에 의해 생긴 병의 용태가 자기면역질환이다.

자기면역질환 중, 문제의 자기항원이 특정한 장기 혹은 조직·세포에 국한하여 존재하는 것과 같은 경우에는, 그 장기만이 상해되는 것으로 되고 장기 특이적 자기면역질환이라고 한다. 한편, DNA 등 전신에 보편적인 자기항원에 대한 자기항체가 증명되어, 혈관염 등 전신성의 병변이 생기고 있는 것은 전신적 자기면역질환이라고 한다. 장기 특이적 자기면역질환의 예로서는, 자기면역성 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 돌발성 혈소판 감소성 자반병(idiopathic thrombocytopenic purpura), 자기면역성 갑상선염(autoimmune thyroiditis), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 1형 당뇨병(type 1 diabetes mellitus) 등의 질환을 들 수 있다. 이들의 질환에서는, 병변 장기의 항원 성분에 대한 자기항체가 확인되고, 병리 조직학적으로는 림프구, 형질세포, 조직구의 침윤, 배 중심의 형성 등이 보여진다. 전신적 자기면역질환으로서는, 전신성 에리테마토데스(systemic lupus erythematosus; SLE), 만성 관절 류머티즘(rheumatoid arthritis; RA) 등을 들 수 있고, SLE에서는 항핵(DNA)항체, RA에서는 류마토이드 인자가 출현한다. 류마토이드 인자는, IgG의 Fc 부분에 대한 자기 항체이다.

자기면역에 따른 1형 당뇨병의 배경기술에 대해 진술한다. 당뇨병의 치료에도 이용되고 있는 인슐린은, 혈당치의 항상성 유지에 중요한 호르몬이고, 췌장의 랑게르한스 섬에서 생산된다. 인간 자기면역 1형 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM)은, 자기 반응성 T세포 및 항체에 의한 랑게르한스 섬에 있어서의 췌장 β세포의 진행성 자기면역 파괴에 의해 특징지어진다. 이 파괴 과정은, 말초 관용의 파괴 또는 결함성의 클론 소실 기구를 통해 생긴다고 생각되어진다. 비비만성 당뇨병(NOD) 마우스는, 인간 IDDM과 유사한 면역 병리학적 프로필을 갖는 자기면역 1형 IDDM을 자연스럽게 발증하는 고전적 마우스 모델이다. (비특허 문헌 1 참조). 마우스 및 인간의 양쪽에 있어서의 IDDM의 발증은, 폴리 유전자의 제어 하에 있다. IDDM은, CD4, CD8, 및 대식세포 매개 췌도세포(β세포) 파괴에 의해 초래된다(비특허 문헌 2, 3, 4 참조). 또한, β세포의 파괴는, MHC 의존성 세포 장해성에 의해 매개되고, β세포 자기항원 특이적 T세포가, IDDM의 병의 원인에 관계가 있다고 하는 보고도 되어 있다(비특허 문헌 5, 6, 7 참조). T세포 자기 반응성은, 현재, 흉선의 결함 및/또는 시토킨의 생산이 변화된 후의 조절 T세포의 말초 활성화에 의한다고 추정되고 있다(비특허 문헌 8, 9, 10, 11, 12 참조).

인간 및 NOD 마우스에 있어서의 IDDM에의 감수성은, 제57위의 통상의 아스파라긴산 잔기(Asp-57)가 결여된 MHC 클래스 IIβ쇄의 발현과 강하게 결부되어 있다 (비특허 문헌 13 참조). 사실, Asp-57을 포함하는 트렌스제닉 클래스 IIβ쇄의 발현은, NOD 마우스를 IDDM의 자연 발증으로부터 보호한다고 보고되어 있다(비특허 문헌 14, 15, 16, 17, 18 참조). 조절 T세포 유도는, 급성의 증상 발현으로부터의 회복 후에 발증하는, 실험적으로 유도된 자기면역성 뇌염(EAE)에 대한 내성에 관계있다고도 하고(비특허 문헌 19, 20 참조), 억제유전자 집단이 Th1형이라고 시사하고 있는 지견도 있다(비특허 문헌 21 참조). 그러나, 이들 세포의 정확한 형 및 성질에 대해서는 미해명인 부분이 많다. 광범위한 면역 억제를 매개하는 시토킨의 전신성 투여에 의해 상기와 같은 조절 T세포의 유도를 가져오고자 하는 시도가 이루어져 왔지만, 그와 같은 치료는 너무나도 비특이적이고, 그리고 종종 유해한 부작용을 수반한다.

자기면역에 의해 관절염도 발증한다. 래트에 있어서의 아쥬반트 관절염은, 여러 가지의 마이코 박테리아를 이용한 접종에 의해 유도된다. 이와 같이 유도된 관절염은, 소 결핵균(Mycobacterium bovis), 즉 BCG의 hsp65(64 kD 항원 A라고도 불림)의 투여에 의해 억제할 수 있다(특허 문헌 1, 2 참조). BCGhsp65는, 아미노산 서열이 인간 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 hsp65(비특허 문헌 22 참조)와 동일하고, 이 단백질을 이용한 「관절염타입 자기면역질환」의 치료 또는 예방 방법이 개시되어 있다. 즉, NOD 마우스의 IDDM의 치료에 있어서의 인간 결핵균 hsp65(hsp60라고도 불림)의 사용이 보고되어 있다(특허 문헌 2, 비특허 문헌 23 참조). 그러나, 이 보고는, 하나의 독특한 자기항원에 대응하는 것으로서의 hsp65의 연구에 한정되어 있고, 면역조절제로서의 연구가 아니다. 또한, 이 방법은, 다른 스트레스 단백질에 적용 가능하지 않은 것이 확인되어 있다(비특허 문헌 23 참조). 인간hsp60의 단편이고, 또한 인간결핵균 hsp65의 중요한 에피도프에 대응하는 에피 도프를 포함하는 것이 제기된 펩티드 p277을 이용한 한층 더한 연구가 보고되었다(특허 문헌 3, 비특허 문헌 24 참조). 이 특허 문헌 3에서는, 인간hsp60 단백질은 IDDM의 치료에 「치료적으로 이용할 수 있다」라고 제안되어 있지만, 인간hsp60단백질을 이용한 데이터는 전혀 제시되어 있지 않다. 특정 질환의 자기항원에 대한 관용을 유도하는 시도에 부수되는 일반적인 문제는, 그와 같은 관용을 달성하기 전에, 또는 그와 같은 관용을 달성하는 대신에, 자기항원의 투여는, 표적 조직에 대한 파괴적 면역응답을 증대시키는 것에 의해 해당 질환을 유도할 가능성이 있다는 것이다. 예컨대, 인간결핵균 hsp65 또는 p277의 투여는, 보호에 앞서서 일과성의 일상성 고혈당증을 가져올 수 있다(특허 문헌 3, 비특허 문헌 25 참조). 따라서, 그와 같은 자기항원의 투여에 연유되는, 질환의 적어도 짧은 기간의 악화라고 하는 위험이 존재하고, 그 이용성에는 문제가 있다. 또한, IDDM 자기면역응답의 표적인 적어도 12의 특정한 자기항원 및 그 펩티드가 존재한다(비특허 문헌 26 참조). p 277을 단독으로 이용한 치료는, 다른 자기항원과도 관련되는 질환을 처리할 수 없다고 생각된다. 면역원으로서 펩티드 자기항원을 이용하는 효과적인 요법은, 특정한 IDDM 환자의 표적인 특정한 항원 또는 항원 세트의 확인을 필연적으로 포함한다고 생각된다. 따라서, 이들의 연구가 논하고 있는 어프로치는, 가장 최선의 것이라도, 실천적이고 효과적인 자기면역질환의 치료를 제공하기에는, 너무나 일반적이거나(예컨대, 시토킨의 전신성 투여), 또는 너무나 특이적이다.

그 외의 자기면역질환의 치료에는, 부신피질 스테로이드약, 면역 억제약, 모노크로날항체(항CD3항체, 항TNF-a항체 등), 가용화형시토킨수용체(가용화형 TNF-α 수용체) 등이 사용되고 있다(비특허 문헌 27 참조). 부신피질 스테로이드약은, IL-1, TNF-α 등의 염증성시토킨생산을 억제하는 외에, T세포의 증식 반응, B세포로부터의 항체 생산을 강하게 억제한다. 또한, E-셀렉틴이나 ICAM-1 등의 접착 분자 발현 억제를 통해 염증성 세포 침윤도 강하게 억제한다. 항생 물질 중, 시클로스포린과 타클로리무스는 모두 임노피린으로 총칭되는 세포 내의 수용체와 결합한다. 임노피린과 결합한 약제는, 또한 칼슘 의존성 포스파타아제인 칼시뉴린과 복합체를 형성함으로써, 그 포스파타아제 활성을 저해한다. 그 결과, 전사인자인 NFAT(nuclear factor of activated T cell)가 탈인산화할 수 없게 되고, NFAT는 세포 내로부터 핵 내로 이행할 수 없게 되어, IL-2 등의 시토킨 유전자의 전사가 저해된다. 항TNF-α모노크로날항체는, 만성관절 류머티즘 및 크론병(Crohn's disease)의 국소 병변에 있어서 염증 반응에 관한 시토킨인 TNF-α를 중화함으로써 염증 반응을 억제한다. 또한 RA에 있어서의 환자의 기능적 예후를 좌우하는 관절의 뼈파괴의 진행을 억제한다. 가용화형 TNF-α 수용체는, TNF-α 수용체의 p75 분자의 세포외 영역과 인간 IgG1의 Fc 부분을 융합시켜, 2량체로서 CHO(Chinese hamster ovary) 세포에서 발현시킨 생물학적 제제이며, 항TNF-α 모노크로날항체와 동일하게 TNF-α를 표적으로 한 치료에 사용되고 있다.

그러나, 이들의 물질은 의약 그 자체이고, 전술한 자기항원의 투여와 동일하게 안전성이 높다고는 결코 말할 수 없다. 전술한 바와 같은 자기면역질환을 예방, 또는 치료하기 위해서는, 이들의 약품을 섭취하기보다는, 일상적으로 섭취할 수 있고, 장기간에 걸쳐 섭취하여도 문제가 없으며, 식품 소재로서도 사용 가능한 것으 로부터 얻어지는, 안온한 자기면역질환 예방제의 개발이 강하게 요구된다.

[특허 문헌 1] 미국 특허 제5,354,691호

[특허 문헌 2] 미국 특허 제5,268,170호

[특허 문헌 3] 미국 특허 제5,578,303호

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[비특허 문헌 27] 최신의학, 61권, 5호, 917-1009,2006년

본 발명은, 일상적으로 섭취할 수 있고, 장기간에 걸쳐 섭취하여도 안정성이 높은 자기면역질환의 예방 작용을 갖는 물질을 얻는 것을 과제로 한다. 또한, 종래의 방법에서는 유효하게 예방 혹은 치료할 수 없었던 1형 당뇨병이나 관절 류머티즘등의 자기면역에 의해 생기는 질환을 예방 혹은 치료하는 물질을 얻는 것을 과제로 한다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자 등은, 자기면역질환을 예방 혹은 치료하는 물질을 얻기 위해, 젖 중에 존재하는 자기면역질환 예방 작용을 갖는 물질을 계속해서 탐색해 왔다. 그 결과, 젖 중에 미량으로 밖에 존재하지 않는 염기성단백질에, 자기면역질환예방 작용을 갖는 효과가 있는 것을 발견했다. 그리고, 이 젖유래 염기성단백질 분획을 자기면역질환 예방제의 유효 성분으로서 이용할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하는 것에 이르렀다.

즉, 본 발명은, 젖유래의 염기성단백질 분획을 유효 성분으로 하는 자기면역질환 예방제에 관한 것이다. 또한, 젖유래 염기성단백질이, 락토퍼옥시다아제 및/또는 락토페린인 자기면역질환 예방제이다. 또한, 젖유래의 염기성단백질 분획, 락토퍼옥시다아제 및/또는 락토페린을 유효 성분으로 하고, 자기면역질환이 1형 당뇨병 또는 관절 류머티즘인 것을 특징으로 하는 자기면역질환 예방제이다. 본 발명에 따른 젖유래의 염기성단백질 분획, 락토퍼옥시다아제, 및 락토페린을 경구적으로 섭취함으로써, 종래의 방법에서는 유효하게 예방 혹은 치료할 수 없었던 1형 당뇨병이나 관절 류머티즘 등의 자기면역질환을 예방할 수 있다.

[발명의 효과]

본 발명의 자기면역질환 예방제는, 이것을 투여함으로써 자기면역질환을 예방할 수 있기 때문에, 자기면역에 의한, 1형 인슐린 의존성 당뇨병이나 관절 류머티즘 등의 질환의 치료 및 예방에 유용하다.

본 발명의 자기면역질환 예방제의 특징은, 젖유래의 염기성단백질 분획을 유효 성분으로 하는 것에 있다. 또한, 젖유래 염기성단백질이 락토퍼옥시다아제 및/또는 락토페린인 것을 특징으로 한다. 또한, 젖유래의 염기성단백질 분획, 락토퍼옥시다아제 및/또는 락토페린을 유효 성분으로 하고, 자기면역질환이 1형 당뇨병 또는 관절 류머티즘인 것을 특징으로 하는 자기면역질환 예방제이다.

본 발명의 젖유래의 염기성단백질 분획, 락토퍼옥시다아제 및 락토페린은, 포유류의 젖으로부터 조제한다. 급원으로서는, 소, 물소, 인간, 돼지, 양, 염소, 말 등의 젖을 들 수 있다.

본 발명의 자기면역질환 예방제의 유효 성분인 젖유래의 염기성단백질 분획을 얻는 방법으로서는, 젖 또는 젖유래의 원료를 양이온 교환체에 접촉시켜 염기성단백질을 흡착시킨 후, 이 양이온 교환체에 흡착된 염기성단백질 분획을, pH 5를 넘고, 이온 강도 0.5를 넘는 용출액으로 용출하여 얻는 방법(일본 특허 공개 평성 5-202098호 공보), 알긴산겔을 이용하여 얻는 방법(일본 특허 공개 소화61-246198호 공보), 무기의 다공성 입자를 이용하여 유청으로부터 얻는 방법(일본 특허 공개 평성 1-86839호 공보), 황산화에스테르화합물을 이용하여 젖으로부터 얻는 방법(일본 특허 공개 소화 63-255300호 공보) 등이 알려져 있고, 본 발명에서는, 이러한 방법에 의해 얻어진 젖유래의 염기성단백질 분획을 이용할 수 있다.

본 발명의 젖유래의 염기성단백질 분획은, 다음 성질을 갖고 있다.

1) 나트륨 도데실 설페이트(Sodium dodecyl sulfate)-폴리아크릴아미드겔 전 기 영동(SDS-PAGE)에 의하면 분자량 3,000∼80,000의 범위의 여러 종류의 단백질로 이루어진다.

2) 95 중량% 이상이 단백질로서, 기타 소량의 지방, 재분을 포함한다.

3) 단백질은 주로 락토페린 및 락토퍼옥시다아제로 이루어진다.

4) 단백질의 아미노산 조성은, 리신, 히스티딘, 아르기닌 등의 염기성아미노산을 15 중량% 이상 함유한다.

본 발명의 자기면역질환 예방제의 유효 성분인 락토퍼옥시다아제 및 락토페린은, 공지의 물질로서, 시판되고 있는 것이지만, 그것을 제조하기 위해서는, 공지의 방법, 예컨대 술폰화담체를 이용하여 락토퍼옥시다아제 및 락토페린을 정제하는 방법(일본 특허 공개 평성 3-109400호 공보)을 공업적으로 유리하게 이용할 수 있다.

본 발명의 자기면역질환 예방제를 투여하는 것에 있어서는, 유효 성분의 젖유래의 염기성단백질 분획, 락토퍼옥시다아제 및 락토페린을 그 상태로 이용할 수도 있지만, 통상법에 따라, 분말제, 과립제, 정제, 캡슐제, 드링크제 등에 제제화하여 이용할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 분말제, 과립제, 정제, 캡슐제 등의 경구제는, 예컨대, 전분, 젖당, 백당, 만니톨, 카르복시메틸셀룰로오스, 콘스타치, 무기염류 등을 이용하여 통상법에 따라 제제화된다. 이 종류의 제제에는, 상기 부형제 외에, 결합제, 붕괴제, 계면활성제, 활택제, 유동성 촉진제, 착색료, 향료 등을 적절하게 사용할 수 있다.

나아가서는, 이들의 락토페린이나 락토페린 분해물을 그대로 혹은 제제화한 후, 이것을 영양제나 음식품 등에 첨가하여, 자기면역질환 예방을 도모할 수도 있다. 또, 젖유래의 염기성단백질 분획은, 비교적 열에 대해 안정하기 때문에, 젖유래의 염기성단백질 분획을 포함하는 원료를 통상 행해지는 것과 같은 조건으로 가열 살균하는 것도 가능하다.

본 발명의 자기면역질환 예방제의 투여량은, 연령, 치료 효과 및 병의 용태 등에 의해 상이하지만, 마우스를 이용한 동물 실험의 결과에 따르면, 자기면역질환 예방 효과를 나타내기 위해서는 젖유래 염기성단백질 분획을, 마우스 체중 1 kg 환산으로 20 mg 이상 투여해야 하는 것을 알 수 있었다. 이러한 점에서, 외부 삽입법(야스하라 하지메, 고바야시 신이치 저, 속 의약품의 개발, 제8권, 7∼18, 히로카와쇼텐, 1991)에 따르면, 인간에서의 유효 투여량은, 성인 한사람당 하루 20 mg 이상이 되기때문에, 이 필요량을 확보할 수 있도록 투여하면 좋다.

다음으로, 실시예 및 시험예를 나타내어 본 발명을 상세하게 설명하지만, 이들은 단순히 본 발명의 실시형태를 예시할 뿐이고, 본 발명은 이들에 의해 하등 한정되지 않는다.

실시예 1

양이온 교환 수지의 술폰화키토펄(후지보세키사 제조) 400 g을 충전한 컬럼(직경 5 cm× 높이 30 cm)를 탈이온물로 충분히 세정한 후, 이 컬럼에 미살균탈지유 40 l(pH 6.7)을 유속 25 ml/분으로 통과시켰다. 통과 후, 이 컬럼을 탈이온물로 충분히 세정하고, 0.98 M 염화나트륨을 포함하는 0.02 M 탄산완충액(pH 7.0)으로 수지에 흡착한 염기성단백질 분획을 용출했다. 그리고, 이 용출액을 역침투(RO)막에 의해 탈염하여, 농축한 후, 동결 건조하여, 본 발명의 자기면역질환 예방제의 유효 성분인 젖유래의 염기성단백질 분획 분말 21 g을 얻었다.

[시험예 1]

실시예 1에서 얻어진 젖유래의 염기성단백질 분획에 대해, 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드겔 전기 영동(SDS-PAGE)에 의해 측정한 바, 분자량은 3,000∼80,000의 범위에 분포하고 있었다.

[시험예 2]

실시예 1에서 얻어진 젖유래의 염기성단백질 분획에 대해, 성분 조성을 분석했다. 그 결과를 표 1에 나타낸다. 이 표에 나타내는 바와 같이, 이 분획의 대다수는 단백질이다.

[표 1]

수분 1.06(중량%)

단백질 96.5

지방 0.56

재분 0.27

기타 1.61

[시험예 3]

실시예 1에서 얻어진 젖유래의 염기성단백질 분획에 대해, 6 N 염산으로 110℃, 24시간 가수 분해한 후, 아미노산 분석 장치(L-8500형, 히타치세이사쿠쇼 제 조)로 그 아미노산 조성을 분석했다. 그 결과를 표 2에 나타낸다. 이 젖유래의 염기성단백질 분획에는, 아미노산 조성 중 15 중량% 이상의 염기성 아미노산이 포함되어 있다.

[표 2]

아스파라긴산 10.1 (중량%)

세린 5.3

글루타민산 12.3

프롤린 4.7

알라닌 5.7

류신 10.2

리신 8.4

히스티딘 2.6

아르기닌 7.2

기타 33.5

실시예 2

양이온 교환 수지인 술폰화키토펄(후지보세키사 제조) 400 g을 충전한 컬럼(직경 5 cm× 높이 30 cm)을 탈이온물로 충분히 세정한 후, 이 컬럼에 미살균탈지유 40 l(pH 6.7)를 유속 25 ml/min로 통과시켰다. 통과 후, 컬럼을 탈이온물로 충분히 세정하고, 2.0 M 염화나트륨을 포함하는 0.02 M 탄산완충액(pH 7.0)으로 용출했다. 그리고 락토퍼옥시다아제를 함유하는 용출분획을 S-Sepharose FF 컬럼(애머 셤 바이오사이언스사 제조)에 흡착시켜, 탈이온물로 충분히 세정하고, 10 mM 인산완충액(pH 7.0)으로 평형화한 후, 0∼2.0 M 염화나트륨의 리니어 그라디언트로 흡착한 분획을 용출하여, 락토퍼옥시다아제를 포함하는 분획을 회수했다. 그리고, 락토퍼옥시다아제를 포함하는 분획을 HiLoad 16/60 Superdex 75pg(애머셤 바이오사이언스사 제조)를 이용한 겔 여과 크로마토그래피에서 처리하고, 락토퍼옥시다아제 3.0 g을 얻었다.

또, 이와 같이 하여 얻어진 락토퍼옥시다아제의 순도는 94%이고, 그대로 자기면역질환 예방제로서 사용 가능하다.

실시예 3

양이온교환 수지인 술폰화키토펄(후지보세키사 제조) 400 g을 충전한 컬럼(직경 5 cm× 높이 30 cm)을 탈이온물로 충분히 세정한 후, 이 컬럼에 미살균탈지유 40 l(pH 6.7)을 유속 25 ml/min로 통과시켰다. 통과 후, 컬럼을 탈이온물로 충분히 세정하고, 2.0 M 염화나트륨을 포함하는 0.02 M 탄산완충액(pH 7.0)으로 용출했다. 그리고 락토페린을 함유하는 용출분획을 S-Sepharose FF 컬럼(애머셤 바이오사이언스사 제조)에 흡착시켜, 탈이온물로 충분히 세정하고, 10 mM 인산완충액(pH 7.0)으로 평형화한 후, 0∼2.0 M 염화나트륨 리니어 그라디언트로 흡착한 분획을 용출하여, 락토페린을 포함하는 분획을 회수했다. 그리고, 락토페린을 포함하는 분획을 HiLoad 16/60 Superdex 75pg(애머셤 바이오사이언스사 제조)를 이용한 겔 여과 크로마토그래피로 처리하고, 락토페린 8.0 g을 얻었다. 또, 이와 같이 하여 얻어진 락토페린의 순도는 96%이고, 그대로 자기면역질환 예방제로서 사용 가능하다.

[시험예 4]

(인슐린 의존성 당뇨병의 발증을 유도하는 자기면역질환의 발증 억제 효과)

1형 당뇨병 모델(NOD) 마우스를 이용하여, 젖유래의 염기성단백질 분획, 락토페린 및 락토퍼옥시다아제의, 인슐린 의존성 당뇨병의 발증을 유도하는 자기면역응답에 대한 억제 효과를 검토했다.

NOD 마우스(니혼크레아, 4주령)를 일반 배합 사료 MF 식(오리엔탈코보고교사 제조)로 일주일 사육한 후, 4군(7마리씩)으로 나누어, 대조군(MF 표준식), 시험군 T(MF 식에 실시예 1에서 얻어진 젖유래의 염기성단백질 분획을 0.1% 배합한 시험식), 시험군 LP(MF 식에 실시예 2에서 얻어진 락토퍼옥시다아제를 0.1% 배합한 시험식) 및 시험군 LF(MF 식에 실시예 3에서 얻어진 0.1% 락토페린을 배합한 시험식)으로 사육했다. 38일간 사육한 10주령 시에, 1군당 7마리를 이용하여, 뇨 중의 당농도를 측정하고, 뇨중 포도당값이 정상값인 20 mg/dl을 기준치로 하여, 이것을 넘는 것을 양성으로 했다. 뇨 중의 당 농도를 측정하여, 당뇨병이 발증하는지의 여부를 확인한 결과를 표 3에 나타낸다.

[표 3]

뇨당값 양성수(개체수/전체수)

대조군 7/7

시험군 T 1/7

시험군 LP 0/7

시험군 LF 5/7

표 3에서 보여지는 바와 같이, 대조군 및 시험군 LF에서는, 7마리 중 7마리 및 7마리 중 5마리의 뇨 당농도가 기준치를 넘어, 당뇨병을 발증한 데 비해, 시험군 T에서는 7마리 중 1마리밖에 발증하지 않았고, 시험군 LP에서는 7마리가 전부 발증하지 않았다. 시험 기간 동안의 사료 섭취량 및 체중 변화에 대해서는, 각 군 사이에 유의차는 없었다. 이러한 점에서, 젖유래의 염기성단백질 분획 및 락토퍼옥시다아제에는, 인슐린 의존성 당뇨병의 발증을 유도하는 자기면역응답에 대한 억제 효과를 갖는 것이 명확해졌다.

[시험예 5]

(종창 발증을 유도하는 자기면역질환의 발증 억제 효과)

자연 발증형 관절 류머티즘 모델(SKG) 마우스를 이용하여, 젖염기성 단백질 분획, 락토페린 및 락토퍼옥시다아제의, 종창 발증을 유도하는 자기면역응답에 대한 억제 효과를 검토했다.

자연발증성 관절 류머티즘 모델(SKG) 마우스(니혼크레아, 4주령)를 일반 배합 사료 MF식(오리엔탈코보고교사 제조)로 일주일 사육한 후, 4군(5마리씩)으로 나누어, 대조군(MF 표준식), 시험군 T(MF 식에 실시예 1에서 얻어진 젖염기성단백질 분획을 0.1% 배합한 시험식), 시험군 LP(MF 식에 실시예 2에서 얻어진 락토퍼옥시다아제를 0.1% 배합한 시험식) 및 시험군 LF(MF 식에 실시예 3에서 얻어진 락토페린을 0.1% 배합한 시험식)으로 사육했다. 38일간 사육한 10주령 시에, 라미나린(시그마사 제조 L9634)을 복강 투여한 후의 관절 류머티즘의 발증 빈도를 측정했다. 관절 류머티즘의 발증의 평가는, 지간골 관절의 종창 1개소에 대해 0.1, 손관절, 발관절의 중등도의 종창을 0.5, 고도의 종창을 1.0으로 한 스코어에 의해 행했다. 종창을 측정하여, 1개체당의 평균 종창 스코어를 구하여 관절 류머티즘의 발증빈도를 확인한 결과를 표 4에 나타낸다.

[표 4]

평균 종창 스코어(1개체당)

대조군 4.6±1.4

시험군 T 1.8±0.4

시험군 LP 1.1±0.6

시험군 LF 1.5±0.9

표 4에서 보여지는 바와 같이, 대조군으로서는 종창이 전예로 발증하고, 1개체당의 평균 종창 스코어가 4.6인 것에 비해, 시험군 T, 시험군 LP 및 시험군 LF에서는 종창이 1∼2예에서 밖에 확인되지 않았으며, 1개체당의 평균 스코어도 약 1.1∼1.8였다. 시험 기간 동안의 사료 섭취량 및 체중 변화에 대해서는, 각 군간에 유의차는 없었다. 이러한 점에서, 젖유래의 염기성단백질 분획, 락토페린 및 락토퍼옥시다아제는, 관절 류머티즘의 발증을 유도하는 자기면역응답에 대한 억제 효과를 갖는 것이 명확해졌다.

실시예 4

실시예 1에서 얻어진 젖유래 염기성단백질 분획 분말에 대해, 통상법에 따라 표 5에 나타내는 조성의 자기면역질환 예방제를 제조했다.

[표 5]

함수 결정 포도당 81.1 (중량%)

대두 단백질 12

미네랄 혼합 5

슈거 에스테르 1

향료 0.5

염기성 단백질 획분 분말(실시예 1) 0.4

실시예 5

실시예 2에서 얻어진 락토퍼옥시다아제 분말에 대해, 통상법에 따라 표 6에 나타내는 조성의 관절 류머티즘의 발증을 유도하는 자기면역응답에 대한 억제 효과를 갖는 자기면역질환 예방제를 제조했다.

[표 6]

함수 결정 포도당 80.3 (중량%)

대두 단백질 13

미네랄 혼합 5

슈거 에스테르 1

향료 0.5

락토퍼옥시다아제 분말(실시예 2) 0.2

실시예 6

실시예 3에서 얻어진 락토페린 분말에 대해, 통상법에 따라 표 7에 나타내는 조성의 자기면역질환 예방제를 제조했다.

[표 7]

함수 결정 포도당 80.3 (중량%)

대두 단백질 13

미네랄 혼합 5

슈거 에스테르 1

향료 0.5

락토페린 분말(실시예 3) 0.2

Claims

젖유래의 염기성단백질 분획을 유효 성분으로 하는 자기면역질환 예방제.
제1항에 있어서, 젖유래의 염기성단백질이 락토퍼옥시다아제 및/또는 락토페린인 것을 특징으로 하는 자기면역질환 예방제.
젖유래의 염기성단백질 분획을 유효 성분으로 하고, 자기면역질환이 1형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 자기면역질환 예방제.
제3항에 있어서, 젖유래의 염기성단백질이 락토퍼옥시다아제인 자기면역질환이 1형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 자기면역질환 예방제.
젖유래의 염기성단백질 분획을 유효 성분으로 하고, 자기면역질환이 관절 류머티즘인 것을 특징으로 하는 자기면역질환 예방제.
제5항에 있어서, 젖유래의 염기성단백질이 락토퍼옥시다아제 및/또는 락토페린인 자기면역질환이 관절 류머티즘인 것을 특징으로 하는 자기면역질환 예방제.