KR101712695B1

KR101712695B1 - Ｐｉｎｋ 1 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101712695B1
Application number: KR1020130057659A
Authority: KR
Inventors: 조미라; 임향숙; 이선영; 문영미; 손혜진; 양은지; 김은경
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2013-05-22
Filing date: 2013-05-22
Publication date: 2017-03-07
Also published as: KR20140137145A; US20160114007A1; WO2014189201A1; US9585945B2

Abstract

본 발명은 PINK 1 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질은 Th17의 활성을 억제시키거나, 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진시키며, Treg세포에서 자가소화작용(autophage)를 증가시켜 과도한 면역반응을 조절하는 기작을 통해 이루어지므로 관절염 등 각종 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물 또는 면역 억제제로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

ＰＩＮＫ 1 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for treatment or prevention of autoimmune diseases comprising PTEN-induced kinase 1 protein or nucleotide}

본 발명은 PINK 1 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

면역은 생체 조직으로 침입하거나 주입되는 모든 외부 고분자물질(항원)에 대한 생체의 자기보호 체계의 하나이다. 면역체계의 주요한 구성성분으로 림프구가 있는데, 이는 골수에서 만들어져서 혈액을 따라 림프 조직이나 기관, 주로 림프절·비장·편도 등으로 순환하는 백혈구다. 면역반응에 관여하는 세포로서, B세포는 적절한 항원에 의해 자극되면 빠르게 증식하여, 그 항원을 중화시킬 특별한 항체(면역글로불린)를 만들어내는 클론을 형성하며, B세포가 생성하는 항체는 체액에서 순환하면서 체액성면역을 수행한다. 또한, T세포는 흉선에서 생성되어 림프 조직으로 이동하는데, 항원을 직접 공격하는 세포매개성면역을 담당한다.

한편, 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 많은 비자기(non-self) 항원에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다는 것이다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라 한다.

이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하면서 다발성 경화증(multiple sclerosis), 1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염 등의 자가면역질환이 발생하게 되며, 뿐만아니라 이식과 같은 시술 이후 면역거부 반응이 발생하게 된다.

구체적으로 자가면역질환은 자기 세포에 대한 이상 반응으로 나타나는 질병이므로 치료는 주로 자기면역 기능을 억제하는 약물이 사용되고 있다. 그러나 부작용이 많아 지속적으로 사용하기 곤란하고 재발을 충분히 막지 못하여 완치를 위한 치료에는 한계가 있다. 다발성경화증의 경우 베타인터페론이 사용되고 있으나 부작용이 덜한 대신 치료비가 비싸고 평생동안 주사를 맞아야 하는 불편함이 있고 재발을 막는 효과가 미미 하다. 또한 CD40 리간드에 항체 투여 등으로 세포간의 상호작용을 억제하는 방법이 사용되었으나 그다지 성공적이지 않다. 기타 여러 가지 면역요법들이 있으나 아직 확실한 치료효능을 보이는 방법으로 인정된 사례는 없다.

따라서 자가면역질환을 효과적으로 치료할 수 있으며 인체에 무해하고 부작용이 없는 치료제에 대한 연구가 필요한 실정이다.

유럽등록특허 제01669089호 유럽등록특허 제01709202호

이에 본 발명자들은 자가면역질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 새로운 치료방법을 연구하던 중, PINK 1 단백질이 Th17의 활성을 억제시키고, 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진시키며, Treg세포에서 자가소화작용(autophage)를 증가시켜 Treg 기능을 조절할 수 있어 자가면역질환을 효과적으로 치료할 수 있다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하도록 연결된 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서 상기 PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질은 Th17의 활성을 억제 또는 감소시키거나, 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진 또는 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질은 파골세포 분화를 감소시키거나, 염증성세포의 침윤을 억제하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하도록 연결된 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 자가면역질환은 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 소화기 당뇨병, 아토피 피부염, 자가면역성 뇌척수염, 천식 및 크론씨병으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질은 Th17의 활성을 억제시키거나, 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진시키며, Treg세포에서 자가소화작용(autophage)를 증가시켜 과도한 면역반응을 조절하는 기작을 통해 이루어지므로 관절염 등 각종 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물 또는 면역 억제제로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라서 관절염 유도 동물모델에 PINK1 단백질을 주입한 뒤 관절염지수 및 림프절에서 분리된 세포에서 T세포의 활성을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라서 관절염 유도 동물모델에 PINK1 단백질을 처리한 군과 대조군으로 처리하지 않은 군의 연골 파괴 및 염증세포의 침윤을 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신(Eosin) 염색 및 톨루이딘 블루(Toluidin blue)와 사프라닌 O (Safranin O) 염색으로 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라서 관절염 유도 동물모델에 PINK1 단백질을 처리하였을 때와 대조군으로 처리하지 않은 군의 비장세포에서 Foxp3과 IL-17을 발현하는 세포를 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라서 관절염 유도 동물모델에 PINK1 단백질을 처리한 군과 대조군으로 처리하지 않은 군을 대상으로 Th17와 Treg세포에서 발현되는 자가소화작용을 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.

본 발명은 PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함을 그 특징으로 한다.

PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질은 autosomal recessive familiar PD의 유전자로써 신경세포와 신경교세포 모두에서 발현하며, 암, 1형 당뇨병 등의 질병을 예방해 주는 효과가 있다고 알려져 있으나, 아직까지 자가면역질환의 치료에 사용된다는 문헌은 전혀 알려진 바가 없다.

이에 본 발명자들은 PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질이 Treg세포에서 자가소화작용(autophage)를 증가시켜 Treg 기능을 조절할 수 있는 효과가 있음을 최초로 규명하였다.

이러한 결과는 본 발명의 일실시예에 의해 확인할 수 있었는데 PINK1 단백질에 관절염의 예방 및 치료 효과가 있는지를 알아보기 위하여 먼저 관절염 모델을 제작한 뒤 관절염지수를 측정한 결과, PINK1 단백질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 본 발명의 PINK1 단백질을 투여한 실험동물군에서 관절염 지수가 억제되었음을 알 수 있었으며, PINK1 주입 군의 림프노드 세포에서 T세포의 증식 활성이 억제되어 있음을 알 수 있었다(도 1 참조).

다른 일실시예에 따르면, PINK1 단백질 처리에 따른 관절염 개선 정도를 분석하기 위하여 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신(Eosin) 염색, 톨루이딘 블루(Toluidin blue)와 사프라닌 O (Safranin O) 염색으로 조직학적 검사를 실시한 결과, PINK1 단백질을 처리하지 않은 대조군의 관절은 파괴되어 있고 염증성 세포들이 침윤되어 있었으나 본 발명의 PINK1 단백질을 주입한 실험동물군은 대조군 대비 파괴가 억제되어 있었으며, 염증성 세포의 침윤도 억제되었음을 확인할 수 있었다(도 2 참조).

다른 일실시예에 따르면, 마우스의 비장에서 분리된 세포 1× 10⁶에 anti-CD4 PerCP Ab를 가지고 surface 항원 염색 후 세포 내 사이토카인 IL-17, IFN-r과 Foxp3 Ab로 염색하여 세포내 Th17세포와 Treg세포의 population을 공초점 현미경을 이용하여 확인한 결과, 대조군인 관절염 실험동물에 비해 PINK1 단백질을 처리한 마우스의 비장에서 면역조절 세포인 Foxp3+Treg의 세포가 증가되어 있으며, 병인세포인 Th17 세포는 감소되어 있음을 알 수 있었다(도 3 참조).

나아가 또 다른 일실시예에 따르면, 마우스의 비장세포에 PINK1를 주입한 군과 PINK1를 주입하지 않은 대조군에서 Th17와 Treg세포에서 발현되는 자가소화작용(autophage)을 공초점 현미경으로 관찰한 결과, Th17세포와 비교하여 PINK1를 주입한 마우스의 비장 Treg세포에서 LC3의 발현이 증가됨을 알 수 있었다(도 4 참조).

따라서 이와 같은 공지의 사실과 함께 본 발명의 일실시예를 통해 확인된 사실에 기초하여, 본 발명의 PINK1(PTEN-induced kinase 1)가 Treg세포에서 자가소화작용(autophage)를 증가시켜 Treg 기능을 조절하여 자가면역질환을 예방 또는 치료하는데 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명의 PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 Treg세포에서 자가소화작용(autophage)를 증가시키는 활성을 가지고 있어 조절 T 세포(Treg)의 활성 또는 증폭을 촉진 또는 증가시키는 작용을 통해 자가면역질환을 예방 또는 치료하는 특징이 있다.

본 발명에서 상기 “활성”이란 생체 내에서 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg), 즉, 자연성(natural) Treg 와 적응성(adaptive) Treg 세포를 모두 포함하는 Treg 세포가 가지는 모든 기작이 촉진 또는 증진되는 것을 말하며, 생체 내의 면역반응이 정상상태를 유지하도록 면역조절작용, 예컨대 면역억제반응이 촉진 또는 증진되는 것을 말한다.

또한, 상기 “증폭(expansion)”이란 미분화 T 세포가 조절 T 세포로 분화 및 증식되는 것을 말하는 것으로서, '분화(differentiation)'는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말하며, '증식(proliferation)' 은 세포가 분열되어 동질의 것이 불어나는 것으로서 보통 다세포생물의 체내에서 세포수가 증가되어 가는 것을 말한다.

본 발명에 따른 상기 PINK1(PTEN-induced kinase 1)는 바람직하게 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다.

또한, 상기 본 발명의 PINK1(PTEN-induced kinase 1)은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 기능적 동등물일 수 있다. 상기 “기능적 동등물”이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 PINK1(PTEN-induced kinase 1)와 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, “실질적으로 동질의 활성”이란 상기에서 기재한 PINK1(PTEN-induced kinase 1)의 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함될 수 있다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환일 수 있으며, 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 PINK1(PTEN-induced kinase 1)의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치할 수 있다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 PINK1(PTEN-induced kinase 1)의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 다른　단백질과　융합으로 만들어진　융합단백질　등이 이에 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 병적세포인 Th17 세포를 감소 또는 억제시킬 수 있고, 반면 조절 T 세포의 활성 또는 증폭을 촉진 또는 증진시키는 작용을 통해 자가면역질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명에서 상기 “자가면역질환”은 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 의미한다. 또한, 본 발명에서 상기 자가면역질환의 종류로는 이에 제한되지는 않으나 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 소화기 당뇨병, 아토피 피부염, 자가면역성 뇌척수염, 천식 및 크론씨병으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

본 발명에서 상기 '치료'란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.

본 발명에 따른 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적조성물은 약학적으로 유효한 양의 PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 자가면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 자가면역질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 “약학적으로 허용되는” 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 자가면역질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적조성물을 제공할 수 있으며, 나아가 본 발명은 PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역억제제를 제공할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

PINK 1 처리에 따른 관절염 개선 정도 측정 및 T세포 활성 정도 분석

본 발명자들은 PINK1이 관절염의 예방 및 치료 효과가 있는지를 알아보기 위하여 먼저 DBA1/J 마우스에 type II collagen을 주입하여 관절염 모델을 제작하였으며, 상기 동물모델에 PINK1 DNA 벡터를 주입한 뒤 관절염지수를 측정하였다.

먼저, 본 발명자들은 type II collagen 100ug/CFA (Complete Freund's Adjuvant )를 마우스의 꼬리 피하에 주입하고, 유도 2주 후 type II collagen 100ug/IFA (incomplete Freund's Adjuvant)을 꼬리 피하에 재 주입하였다. 100ug의 PINK DNA벡터는 관절염 유도 후 일주일 후 정맥 주사하였으며, 관절염 유도 후 18일에 100ug의 PINK DNA 벡터를 마우스 다리 근육에 전기 자극으로 벡터를 주입하였다. PINK1은 human cDNA로 부터 증폭시켰고 이는 pcDNA3.1(Invitrogen)에 Hindlll와 EcoR1으로 잘라서 삽입하였으며, 삽입된 PINK1의 발현은 COS세포에 형질도입하여 얻은 단백질 용해물을 이용해 웨스턴 블롯팅(western blot)으로 과발현 여부를 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 PINK1이 T 세포 활성에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 관절염 모델 마우스의 림프절로부터 T 세포를 분리하여 각 마우스군의 비장 T 세포 증식반응을 평가하고자, 분리된 T 세포를 3일 동안 anti-CD3 자극하여 T 세포를 활성 시켰으며, 또한, 활성 된 T 세포에 3H 동위원소를 처리하여, 증식 활성정도를 평가하였다.

그 결과, PINK1 단백질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 본 발명의 PINK1 단백질을 투여한 실험동물군에서는 관절염 지수가 70% 가까이 감소되었음을 알 수 있었으며, PINK1 주입 군의 림프절 세포에서 T세포의 증식 활성이 90%까지 억제되는 것을 알 수 있었다.

또한, PINK1 주입 군에서 T세포에서 증식반응 지수인 CPM이 낮아져서 PINK1 단백질을 투여 시 T세포 증식 활성이 억제됨을 확인할 수 있었다. (도 1 참조).

< 실시예 2>

PINK1 이 관절 조직의 관절 파괴 정도에 미치는 영향 분석

본 발명자들은 PINK1 처리에 따른 관절염 개선 정도를 분석하기 위하여 관절염 마우스 동물모델의 관절 조직에 대한 조직학적 검사를 실시하였다.

먼저, PINK 가 투여된 동물과 대조군을 관절염 유도 후 56일에 각 마우스 군의 뒷발을 10% 포르말린으로 고정시키고 뼈에서 석회질을 제거한 후 파라핀으로 블록을 제조하였다. 이로부터 관절 절편(7um)을 준비하고 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신(Eosin)으로 관절 절편을 염색하였다. 또한, 연골파괴 정도를 확인하기 위하여 톨루이딘 블루(Toluidin blue)와 사프라닌 O (Safranin O) 염색을 하였다.

상기와 같은 실험 후 실험동물군의 관절 내 연골 및 염증도를 관찰한 결과, PINK1 단백질을 처리하지 않은 대조군의 관절은 파괴되어 있고 염증성 세포들이 침윤되어 있었으나 본 발명의 PINK1 단백질을 주입한 실험동물군은 대조군 대비 파골 세포 분화가 감소되어 있었으며, 염증성 세포의 침윤도 억제되었음을 확인할 수 있었다(도 2 참조).

< 실시예 3>

관절염 동물모델에서 PINK1 단백질 처리에 의한 Treg 세포 증가 및 Th17 세포 억제 효과

본 발명자들은 본 발명의 PINK1 단백질 처리가 Th17 및 Treg에 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위하여 마우스의 비장에서 분리된 세포(1× 10⁶)를 anti-CD4 PerCP 항체를 이용하여 표면 항원을 염색하고, IL-17과 Foxp3 항체로 추가 염색하여 Th17세포와 Treg세포의 발현양을 공초점 현미경을 이용하여 확인하였다.

그 결과, 대조군인 관절염 실험동물에 비해 PINK1 단백질을 처리한 마우스의 비장에서 면역조절 세포인 Foxp3+Treg의 세포가 약 50% 정도 증가되어 있으며, 병인세포인 Th17 세포는 약 30% 정도 감소되어 있음을 알 수 있었다(도 3 참조).

< 실시예 4>

관절염 동물모델에서 PINK1 단백질 처리에 의한 자가소화작용( Autophage )의 활성 분석

본 발명자들은 상기 실시예 3에서 관찰된 Treg 세포의 증가와 Th17 세포의 감소와 관련된 기작을 좀 더 명확히 이해하고자 PINK1이 자가소화작용(autophage)을 활성화시키는지 여부와 그러한 기작으로 실제로 Treg 세포가 증가하고 Th17 세포가 감소되는지 확인해 보고자 하였다.

이를 위하여 본 발명자들은 마우스의 비장세포를 anti-CD4 PerCP 항체를 이용하여 표면항원을 염색하고 세포 내 사이토카인을 Foxp3 항체로 염색하여 세포내 Treg세포의 population을 공초점 현미경을 이용하여 확인하였다.

PINK1를 주입한 군과 PINK1를 주입하지 않은 대조군에서 Treg세포에서 발현되는 자가소화작용(autophage)을 공초점 현미경으로 관찰한 결과, PINK1를 주입한 마우스의 비장 Treg세포에서 LC3의 발현이 2배 가까이 증가되어 PINK1은 자가소화작용(autophage)를 활성화시킴으로써 Treg의 발현양을 증가시키는 것을 알 수 있었다(도 4 참조).

상기와 같은 실시예 1, 2, 3, 4에 따르면 PINK1은 Treg 세포의 활성을 증진시키고, Th17의 활성을 억제시킴으로써, 관절조직의 관절 파괴를 완화시키고, 관절염을 억제하는 효과가 탁월한 바, 본 발명의 PINK1은 관절염을 비롯한 자가면역질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 활용 가능하다는 것을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for treatment or prevention of autoimmune diseases comprising PTEN-induced kinase 1 protein or nucleotide <130> PN1304-142 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 580 <212> PRT <213> PTEN-induced kinase 1 protein <400> 1 Met Ala Val Arg Gln Ala Leu Gly Pro Gly Leu Gln Leu Gly Arg Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Arg Phe Ala Pro Lys Pro Gly Pro Leu Phe Gly Trp Gly 20 25 30 Lys Pro Gly Pro Ala Ala Ala Trp Gly Arg Gly Glu Arg Pro Gly Gln 35 40 45 Val Val Ser Pro Gly Ala Gln Pro Arg Pro Val Gly Leu Pro Leu Pro 50 55 60 Asp Arg Tyr Arg Phe Phe Arg Gln Ser Val Ala Gly Leu Ala Ala Arg 65 70 75 80 Ile Gln Arg Gln Phe Met Val Arg Ala Arg Gly Gly Ala Gly Pro Cys 85 90 95 Gly Arg Ala Val Phe Leu Ala Phe Gly Leu Gly Leu Gly Leu Ile Glu 100 105 110 Glu Lys Gln Ala Glu Gly Arg Arg Ala Ala Ser Ala Cys Gln Glu Ile 115 120 125 Gln Ala Ile Phe Thr Gln Lys Thr Lys Arg Val Ser Asp Pro Leu Asp 130 135 140 Thr Arg Cys Trp Gln Gly Phe Arg Leu Glu Asp Tyr Leu Ile Gly Gln 145 150 155 160 Ala Ile Gly Lys Gly Cys Asn Ala Ala Val Tyr Glu Ala Thr Met Pro 165 170 175 Thr Leu Pro Gln His Leu Glu Lys Ala Lys His Leu Gly Leu Ile Gly 180 185 190 Lys Gly Pro Asp Val Val Leu Lys Gly Ala Asp Gly Glu Gln Ala Pro 195 200 205 Gly Thr Pro Thr Phe Pro Phe Ala Ile Lys Met Met Trp Asn Ile Ser 210 215 220 Ala Gly Ser Ser Ser Glu Ala Ile Leu Ser Lys Met Ser Gln Glu Leu 225 230 235 240 Val Pro Ala Ser Arg Val Ala Leu Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Val Thr 245 250 255 Tyr Arg Arg Ser Arg Asp Gly Pro Lys Gln Leu Ala Pro His Pro Asn 260 265 270 Ile Ile Arg Val Phe Arg Ala Phe Thr Ser Ser Val Pro Leu Leu Pro 275 280 285 Gly Ala Leu Ala Asp Tyr Pro Asp Met Leu Pro Pro His Tyr Tyr Pro 290 295 300 Glu Gly Leu Gly His Gly Arg Thr Leu Phe Leu Val Met Lys Asn Tyr 305 310 315 320 Pro Cys Thr Leu Arg Gln Tyr Leu Glu Glu Gln Thr Pro Ser Ser Arg 325 330 335 Leu Ala Thr Met Met Thr Leu Gln Leu Leu Glu Gly Val Asp His Leu 340 345 350 Val Gln Gln Gly Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser Asp Asn Ile Leu 355 360 365 Val Glu Trp Asp Ser Asp Gly Cys Pro Trp Leu Val Ile Ser Asp Phe 370 375 380 Gly Cys Cys Leu Ala Asp Gln His Val Gly Leu Arg Leu Pro Phe Asn 385 390 395 400 Ser Ser Ser Val Glu Arg Gly Gly Asn Gly Ser Leu Met Ala Pro Glu 405 410 415 Val Ser Thr Ala His Ser Gly Pro Ser Ala Val Ile Asp Tyr Ser Lys 420 425 430 Ala Asp Thr Trp Ala Val Gly Ala Ile Ala Tyr Glu Ile Phe Gly Leu 435 440 445 Ala Asn Pro Phe Tyr Gly Gln Gly Ser Ala His Leu Glu Ser Arg Ser 450 455 460 Tyr Gln Glu Ala Gln Leu Pro Glu Met Pro Glu Ser Val Pro Pro Glu 465 470 475 480 Ala Arg Arg Leu Val Arg Ser Leu Leu Gln Arg Glu Ala Ser Lys Arg 485 490 495 Pro Ser Ala Arg Leu Ala Ala Asn Val Leu His Leu Ser Leu Trp Gly 500 505 510 Glu His Leu Leu Ala Leu Lys Asn Leu Lys Leu Asp Lys Met Ile Ala 515 520 525 Trp Leu Leu Gln Gln Ser Ala Ala Thr Leu Leu Ala Asp Arg Leu Arg 530 535 540 Glu Lys Ser Cys Val Glu Thr Lys Leu Gln Met Leu Phe Leu Ala Asn 545 550 555 560 Leu Glu Cys Glu Ala Leu Cys Gln Ala Ala Leu Leu Leu Ser Ser Trp 565 570 575 Arg Ala Ala Pro 580 <210> 2 <211> 1741 <212> DNA <213> PTEN-induced kinase 1 nucleotide <400> 2 atggcggtgc gacaggcact gggcccaggc ctgcagctgg gtcgggcgct gctgctgcgc 60 ttcgcgccca agcccggccc gctgttcggc tgggggaagc ccggccccgc ggcggcctgg 120 ggccgcggag agcgcccagg ccaggtcgta agccccggag cacagcctcg gccggtcggg 180 ctccccctcc cggaccgcta ccgcttcttc cgccagtcgg tagctgggct ggcggcgcgg 240 atccagaggc agttcatggt gcgggcccgg ggcggcgcag gcccttgcgg ccgagcggtc 300 ttcctggcct tcgggctggg gctggggctg atcgaggaga agcaggcgga aggccggagg 360 gccgcctcgg cctgtcagga gatccaggca atttttacac agaaaaccaa gcgcgtgtct 420 gacccactgg acactcgatg ctggcagggc ttccgtctgg aggattatct gatagggcaa 480 gccattggca agggttgcaa tgccgctgtg tatgaagcca ccatgcccac gctgccccag 540 cacctggaaa aggccaaaca ccttggcctt ataggaaagg gcccggatgt cgtcctgaag 600 ggagcagacg gggagcaggc tccagggact cccacctttc cctttgccat caagatgatg 660 tggaatatct cggcaggttc ctccagcgaa gccatcttaa gcaaaatgag ccaggagctg 720 gtcccggcaa gccgcgtggc tttggctgga gagtatggag cagttactta cagaagatcc 780 agagatggtc ccaagcagct tgccccacac cctaacatca tccgggtttt ccgcgccttc 840 acctcatctg tgcccctcct gccgggggcc ctggctgact atcctgatat gctgccccca 900 cactactacc cagaaggcct gggccacggt cgcacactgt tcctcgttat gaagaactac 960 ccctgtaccc tgcgccagta ccttgaggag cagactccca gttctcgcct ggctaccatg 1020 atgaccttgc agttgctgga gggcgtggac catctggttc agcagggcat tgcccatcgg 1080 gatctcaagt ccgacaacat ccttgtggag tgggactcag atggctgtcc ctggctagtg 1140 atctcagact ttggctgctg cctggctgac cagcatgttg gcctgcggct gcctttcaac 1200 agctccagtg tagagcgtgg tggcaatggc tccctgatgg cccctgaggt gtccacagcc 1260 cattctggcc ccagtgcggt aattgactac agcaaagccg atacctgggc tgtgggggcc 1320 atcgcctatg aaatctttgg gcttgccaat cccttctatg gccaaggcag tgcccacctc 1380 gagagccgca gctaccagga agctcagctg cctgagatgc ctgagtcggt gcctccagag 1440 gcaagacggc tggtgaggtc actgctccag cgagaggcca gcaagagacc gtctgcacgc 1500 ttagctgcaa atgtgctgca cttaagcctc tggggcgagc atcttctagc cctgaagaac 1560 ctgaaattgg acaagatgat cgcctggctc ttgcagcagt cagcagccac tctgctggct 1620 gacaggctga gagagaagag ctgcgtggag acaaagctgc agatgctgtt tctggctaac 1680 ctggagtgtg aggctctctg ccaggcagcc ctcctcctct cttcctggag ggcagcccca 1740 t 1741

Claims

PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 또는 크론씨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 또는 크론씨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질은 Th17의 활성을 억제 또는 감소시키거나, 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진 또는 증가시키는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 또는 크론씨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질은 파골세포 분화를 감소시키거나, 염증성세포의 침윤을 억제하는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 또는 크론씨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 또는 크론씨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 또는 크론씨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하도록 연결된 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 또는 크론씨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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