이하, 실시예, 제조예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들 실시예 등은 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 화합물 615의 합성
N-(4-(3-(1H-1,2,4-
트리아졸
-1-일)-4-(3,4,5-
트리메톡시벤조일
)
페닐
)티아졸-2-일)-2-
아미노아세트아마이드의
합성
Fmoc-글라이신(0.94 g, 3.16 mmol), N,N-다이메틸포름아마이드(1 방울)를 메틸렌클로라이드(5 mL)에 녹이고 실온에서 티오닐 클로라이드(SOCl2)(0.3 mL)를 넣은 후 1 시간 동안 환류 교반하였다. 반응 종료 후 실온으로 낮추고 감압 건조하여 용매를 제거한 후 얻어진 화합물(1 g)을, 메틸렌클로라이드(10 mL)와 피리딘(0.13 mL)에 용해되어 있는 화합물 516(0.45 g, 1.07 mmol)에 가한 후 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 반응 종료 후 감압 건조하여 용매를 제거한 후 얻어진 생성물을 관 크로마토그래피(SiO2; MC/MeOH 40/1∼10/1)로 정제하여 고체 형태의 화합물 (0.54 g, 71.6%)을 얻었다. 얻어진 화합물(0.46 g, 0.64 mmol)을 N,N-다이메틸포름아마이드(3 mL)에 녹이고 실온에서 피페리딘(piperidine)(76 μL)을 넣은 후 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후 감압 건조하여 용매를 제거한 후 얻어진 생성물을 관 크로마토그래피(SiO2; MC/MeOH 20/1∼5/1)로 정제하여 흰색 고체 형태의 화합물 615(246.6 ㎎, 77.9%)을 얻었다.
1H NMR (400MHz, 아세톤) δ 8.790 (s, 1H), 8.372 (d, J = 1.48 Hz, 1H), 8.315 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 1H), 7.969 (s, 1H), 7.893 (s, 1H), 7.775 (d, J = 8.12 Hz, 1H), 3.829-3.815 (s, 9H), 3.711 (s, 2H). (MS (ESI) m/z 495 (M+ + H).
실시예
2: 화합물 624의 합성
(S)-N-(4-(3-(1H-1,2,4-
트리아졸
-1-일)-4-(3,4,5-
트리메톡시벤조일
)
페닐
)티아졸-2-일)-2-아미노-3-
메틸부탄아마이드의
합성
상기 화합물 615의 합성과 동일한 공정에 따라 흰색 고체 형태의 화합물 624(2.25 g, 53.2%)을 얻었다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 8.338 (s, 1H), 8.172 (d, J = 1.52 Hz, 1H), 8.035 (dd, J = 8.08, 1.40 Hz, 1H), 7.937 (s, 1H), 7.653 (d, J = 8.08 Hz, 1H), 7.381 (s, 1H), 6.985 (s, 2H), 3.819 (s, 6H), 3.556 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 2.481 (m, 1H), 1.092 (d, J = 6.96 Hz, 3H), 0.909 (d, J = 6.92 Hz, 3H). MS (ESI) m/z 537 (M+ + H).
실시예
3: 화합물 625의 합성
(S)-N-(4-(3-(1H-1,2,4-
트리아졸
-1-일)-4-(3,4,5-
트리메톡시벤조일
)
페닐
)티아졸-2-일)-2-아미노-3-
페닐프로판아마이드의
합성
화합물 615의 합성과 동일한 공정에 따라 흰색 고체 형태의 화합물 625(13.6 ㎎, 21.2%)을 얻었다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 8.333 (s, 1H), 8.165 (d, J = 1.52 Hz, 1H), 7.935 (dd, J = 8.04, 1.52 Hz, 1H), 7.654 (d, J = 8.04 Hz, 1H), 7.405-7.245 (m, 6H), 6.985 (s, 2H), 3.903 (m, 4H), 3.819 (s, 6H), 3.389 (dd, J = 13.8, 3.72 Hz, 1H), 2.827 (m, 1H). MS (ESI) m/z 585 (M+ + H).
실시예
4: 화합물 631의 합성
N-(4-(3-(1H-1,2,4-
트리아졸
-1-일)-4-(3,4,5-
트리메톡시벤조일
)
페닐
)티아졸-2-일)-2-(
다이메틸아미노
)
아세트아마이드의
합성
N,N-디메틸글라이신(446.8 ㎎, 4.33 mmol), N,N-다이메틸포름아마이드(1 방울)를 메틸렌클로라이드(5 mL)에 녹이고 실온에서 티오닐클로라이드(SOCl2)(0.41 mL)를 넣은 후 70 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 실온으로 낮추고 감압 건조로 용매를 제거하여 중간체인 화합물 5를 얻었다. 화합물 516(94.6 ㎎, 0.22 mmol)을 메틸렌클로라이드(5 mL), 피리딘(pyridine)(26.2 μL)에 녹인 후 화합물 5(68.3 ㎎)를 넣고 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 감압 건조하여 용매를 제거한 후 얻어진 생성물을 관 크로마토그래피(SiO2, MC/MeOH 40/1∼5/1)로 정제하여 갈색의 화합물 631(24.1 ㎎, 21.3%)을 얻었다.
1H NMR (400MHz, 아세톤) δ 8.760 (s, 1H), 8.302 (d, J = 1.28 Hz, 1H), 8.231 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 1H), 7.871 (s, 2H), 7.718 (d, J = 8.12 Hz, 1H), 6.995 (s, 2H), 3.796 (s, 6H), 3.785 (s, 3H), 3.000 (s, 2H), 2.430 (s, 6H). MS (ESI) m/z 523 (M+ + H).
실시예
5: 화합물 646의 합성
(S)-N-(4-(3-(1H-1,2,4-
트리아졸
-1-일)-4-(3,4,5-
트리메톡시벤조일
)
페닐
)티아졸-2-일)
피롤리딘
-2-
카복사마이드의
합성
화합물 615의 합성과 동일한 공정에 따라 흰색 고체 형태의 화합물 646(7.8 ㎎, 25.1%)을 얻었다.
1H NMR (400MHz, MeOD) δ 8.817 (s, 1H), 8.268 (m, 2 H), 7.940 (s, 1H), 7.845 (s, 1H), 7.744 (m, 1H), 6.970 (s, 2H), 4.068-4.037 (m, 1H), 3.826 (s, 3H), 3.789 (s, 6H), 3.181 (m, 1H), 2.686-2.617 (m, 1H), 2.344-2.263 (m, 1H), 2.344 (m, 1H), 2.005-1.841 (m, 3H). MS (ESI) m/z 535 (M+ + H).
실시예
6: 화합물 647의 합성
(S)-N-(4-(3-(1H-1,2,4-
트리아졸
-1-일)-4-(3,4,5-
트리메톡시벤조일
)
페닐
)티아졸-2-일)-2-아미노-4-
메틸펜탄아마이드의
합성
화합물 615의 합성과 동일한 공정에 따라 흰색 고체 형태의 화합물 647(8.5 ㎎, 23.6 %)을 얻었다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 8.311 (s, 1H), 8.105-8.055 (m, 2H), 7.942 (s, 1H), 7.649 (d, J = 7.96 Hz, 1H), 7.439 (s, 1H), 6.978 (s, 2H), 3.892 (s, 3H), 3.814 (s, 6H), 3.742-3.725 (m, 1H), 1.999-1.925 (m, 2H), 1.508-1.462 (m, 1H), 1.018 (t, J = 5.96 Hz, 6H). MS (ESI) m/z 551 (M+ + H).
실시예
7: 화합물 648의 합성
(S)-N-(4-(3-(1H-1,2,4-
트리아졸
-1-일)-4-(3,4,5-
트리메톡시벤조일
)
페닐
)티아졸-2-일)-2-아미노-3-
사이클로헥실프로판아마이드의
합성
화합물 615의 합성과 동일한 공정에 따라 흰색 고체 형태의 화합물 648(46.8 ㎎, 36%)을 얻었다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 8.305 (s, 1H), 8.099-8.049 (m, 2H), 7.936 (s, 1H), 7.643 (d, J = 8.04 Hz, 1H), 7.434 (s, 1H), 7.257 (s, 1H), 6.972 (s, 2H), 3.886 (s, 3H), 3.783-3.748 (m, 7H), 2.044-1.309 (m, 13H). MS (ESI) m/z 631 (M+ + 40).
실시예
8: 화합물 652의 합성
N-(4-(3-(1H-1,2,4-
트리아졸
-1-일)-4-(3,4,5-
트리메톡시벤조일
)
페닐
)티아졸-2-일)-2-아미노-3-
메틸부탄아마이드의
합성
위 화합물 615의 합성과 동일한 공정에 따라 Fmoc-발린(라세믹 이성체)를 이용하여 흰색 고체 형태의 화합물 652(258.2 ㎎, 63.1%)을 얻었다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 8.338 (s, 1H), 8.172 (d, J = 1.52 Hz, 1H), 8.035 (dd, J = 8.08, 1.40 Hz, 1H), 7.937 (s, 1H), 7.653 (d, J = 8.08 Hz, 1H), 7.381 (s, 1H), 6.985 (s, 2H), 3.819 (s, 6H), 3.556 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 2.481 (m, 1H), 1.092 (d, J = 6.96 Hz, 3H), 0.909 (d, J = 6.92 Hz, 3H). MS (ESI) m/z 537 (M+ + H).
실시예
9: 화합물 653의 합성
(R)-N-(4-(3-(1H-1,2,4-
트리아졸
-1-일)-4-(3,4,5-
트리메톡시벤조일
)
페닐
)티아졸-2-일)-2-아미노-3-
메틸부탄아마이드의
합성
위 화합물 615의 합성과 동일한 공정에 따라 Fmoc-D-발린을 이용하여 흰색 고체 형태의 화합물 653(2.25 g, 53.2%)을 얻었다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 8.338 (s, 1H), 8.172 (d, J = 1.52 Hz, 1H), 8.035 (dd, J = 8.08, 1.40 Hz, 1H), 7.937 (s, 1H), 7.653 (d, J = 8.08 Hz, 1H), 7.381 (s, 1H), 6.985 (s, 2H), 3.819 (s, 6H), 3.556 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 2.481 (m, 1H), 1.092 (d, J = 6.96 Hz, 3H), 0.909 (d, J = 6.92 Hz, 3H). MS (ESI) m/z 537 (M+ + H).
시험예
1: 물에서의 용해도 측정
본 발명 화합물들은 화합물 516의 동물 실험결과 낮은 용해도로 인하여 발생하는 장기 침착의 독성을 극복하고자 개발된 것이므로, 이들의 수용액에서의 용해도를 측정하였다.
(1) 실험방법
① 검량선 작성
화합물 농도가 1 ㎎/㎖로 되도록 아세토니트릴에 녹인 후, 이동상으로 희석하여 5, 12.5, 25, 50, 100 ㎍/㎖의 농도가 되도록 이동상으로 희석.
② 검액 제조
1. 각각의 검체 농도가 10 ㎎/㎖로 되도록 정제수에 넣고 항온 교반기(25 ℃, 200 rpm)에서 약 7 일간 교반한 후 여과하여 적정농도가 되도록 이동상으로 희석하여 분석.
2. 각각의 검체 농도가 10 ㎎/㎖로 되도록 정제수에 넣고 30 분간 초음파 처리(sonication) 후 5 분간 교반하고, 다시 30 분간 초음파 처리 후 적정 농도가 되도록 이동상으로 희석하여 분석.
(2) HPLC 분석 조건
UV: 215 ㎚
유속: 1 mL/mL
주입량: 10 ㎕
컬럼 온도: 25 ℃
컬럼: Kromasil C8(4.6×150 ㎜, 5 ㎛)
이동상: 20 mM 암모늄 아세테이트 pH 5.0/ACN (60/40)
(3) 용해도 결과
화합물 516과 비교한 본 발명 화합물들에 대한 용해도 측정 결과를 다음 표 2에 나타낸다.
|
화합물516 |
화합물615 |
화합물624 |
화합물625 |
화합물631 |
화합물646 |
화합물647 |
화합물648 |
용해도(mg/mL) |
0.5 |
23.3 |
14.9 |
11.0 |
25.4 |
29.1 |
12.1 |
12.5 |
위 표 2에서 보듯이, 화합물 516은 0.5 ㎎/㎖의 매우 낮은 용해도 값을 보인 반면, 본 발명에 따른 다른 화합물의 용해도는 10 ㎎/㎖ 이상으로, 현재 개발되고 있는 대조약물 AC7700과 동등 이상의 용해도를 갖는 것을 알 수 있다(참조: Anticancer Drug Des. 1999, Dec; 14(6): 539-48).
시험예
2: 본 발명 화합물의 마우스에 대한 약제학적 효과
(1) 실험 동물
사람 암종 유래 종양 이식 연구 시험에 사용된 수컷 BALB/c 누드마우스(4 주령)을 중앙실험동물(주)로부터 입수하여 사용하였으며, 격리된 무균 사육시설에서 멸균사료 및 음수를 자유롭게 공급하였고, 사육실내온도는 23±0.5 ℃를 유지하였다.
(2) 세포주
종양 이식 연구에 필요한 사람의 암세포주인 CX-1(human colon adenocarcinoma)은 DKFZ(German Cancer Research Center)로부터 입수하였으며, HCT-15(human colorectal adenocarcinoma, CCL-225) 및 A549(human lung carcinoma, CCL-185)는 ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)로부터 입수하여 사용하였다. 사람의 암세포 중 MKN45(human gastric adenocarcinoma, #80103)와 calu-6(human lung carcinoma, #30056)는 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다.
CX-1은 10% heat-inactivated fetal bovine serum(Gibco)과 1% Antibiotics-Antymycotics(Gibco)를 첨가한 DMEM(Gibco) 배지를 사용하여 37 ℃, 5% CO2, 95% 세포배양기(air incubator)에서 배양하였다. 이 외의 다른 세포주의 배양을 위해서는 10% heat-inactivated fetal bovine serum(Gibco)과 1% Antibiotics-Antymycotics(Gibco)를 첨가한 RPM1640(Gibco BRL) 배지를 사용하여 37 ℃, 5% CO2, 95% 세포배양기(air incubator)에서 배양하였다.
(3) in vivo 항암 활성
사람 유래 암종 in vivo 종양 이식 연구는 다음과 같이 실시하였다. in vitro 에서 증식한 사람 유래 암 세포주(CX-1, HCT-15, A549, MKN45, calu-6)를 BALB/c 누드마우스의 견갑부 피하에 주사하여 체내에서 증식하도록 한 후, 20∼25 일째 경추 탈구법으로 치사시켜 각각의 마우스에서 증식된 고형 암을 무균적으로 분리하여 결합 또는 괴사조직, 피부 등을 제거한 신선한 암 조직을 취하였다. 암 조직을 무균 상태에서 50 ㎎으로 나눈 후 16 게이지의 트로카(trocar)에 끼워 마우스 견갑부의 피하에 이식하였다.
사람 유래 암 세포주를 BALB/c 누드마우스에 이식하고 15∼30 일 경과 후 일정한 크기로 증식된 마우스만을 선택하여 실험에 사용하였으며, 각각의 실험군은 암 이식 후 종양 크기가 100∼200 ㎣ 이상 성장하였을 때 각각의 투여 스케줄에 맞추어 약물을 마우스 10 g 당 0.1 ㎖의 용량으로 주사하였다.
그리고 종료와 함께 측정하는 항종양효과는 마지막 날의 종양 부피를 대조군과 비교하여 나타내는 종양 부피(tumor volume)의 항암활성억제비율(inhibition rate, IR%)로 판정하였다. 대조약물로는 임상 Ⅲ상이 진행 중인 사노피-아벤티스사(Sanofi-Aventis)의 AC7700을 이용하여 평가하였다.
종양의 크기 = (단경)2 × (장경)/2
I.R.(%) = [1-(약물투여군의 평균종양크기)/(대조군의 평균종양크기)]×100
① 사람 유래 대장암 세포주(CX-1)를 이용한 화합물 516의 약효실험 결과를 다음 표 3과 도 1에 나타낸다. 도 1은 화합물 516의 투여 일자별 종양 부피를 나타낸 그래프이다.
실험군(n=6) |
용량/일 |
투여방법 |
체중변화(%) |
IR(%) |
사망 동물수 |
대조군 |
- |
- |
+18.4 |
- |
0/6 |
AC7700 |
100 ㎎/㎏ |
q4d×4 (i.p.) |
+13.2 |
48 % |
2/6 |
화합물 516 |
5 ㎎/㎏ |
q4d×4 (i.p.) |
+15.2 |
36 % |
2/6 |
위 표 3과 도 1에서 보듯이, CX-1 세포주에 대한 실험 결과, 화합물 516은 대조약물 AC7700 대비 유의성 있는 약효를 보였으나, 생체내 강한 독성으로 6, 7일째 각각 1수가 사망하여 안전역이 매우 좁은 약물로 판단되었다.
② 사람 유래 대장암 세포주(CX-1)를 이용한 화합물 624, 625 및 631의 약효실험 결과를 다음 표 4 및 도 2에 나타낸다. 도 2는 화합물 624, 625 및 631의 투여 일자별 종양 부피를 나타낸 그래프이다.
실험군(n=6) |
용량/일 |
투여방법 |
체중변화(%) |
IR(%) |
사망 동물수 |
대조군 |
- |
- |
+24.5 |
- |
0/6 |
AC7700 |
100 ㎎/㎏ |
q4d×4 (i.p.) |
+22.8 |
34 % |
0/6 |
화합물 624 |
5 ㎎/㎏ |
q4d×4 (i.p.) |
+25.7 |
28 % |
0/6 |
10 ㎎/㎏ |
+14.7 |
64 % |
화합물 625 |
5 ㎎/㎏ |
q4d×4 (i.p.) |
+28.9 |
21 % |
0/6 |
10 ㎎/㎏ |
+24.5 |
43 % |
화합물 631 |
5 ㎎/㎏ |
q4d×4 (i.p.) |
+24.8 |
23 % |
0/6 |
10 ㎎/㎏ |
+26.7 |
20 % |
20 ㎎/㎏ |
+20.9 |
37 % |
위 표 4 및 도 2에서 보듯이, CX-1 세포주에 대한 실험 결과, 본 발명의 화합물 624, 625 및 631은 대조약물 AC7700 대비 동등 이상의 약효를 보였으며, 화합물 516과 비교하여 체중변화도 없었으며 사망 동물도 없어 현저히 독성이 개선된 것으로 사료된다. 특히, 화합물 624는 대조약물 대비 두 배의 약효를 나타내었다.
③ 사람 유래 대장암 세포주(HCT-15)를 이용한 화합물 624의 약효실험 결과를 다음 표 5 및 도 3에 나타낸다. 도 3은 화합물 624의 투여 일자별 종양 부피를 나타낸 그래프이다.
실험군(n=6) |
용량/일 |
투여방법 |
체중변화(%) |
IR(%) |
사망 동물수 |
대조군 |
- |
- |
-3.4 |
- |
0/6 |
AC7700 |
80 ㎎/㎏ |
q4d×4 (i.p.) |
+5.5 |
66 % |
1/6 |
화합물 624 |
5 ㎎/㎏ |
q4d×4 (i.p.) |
+1.8 |
12 % |
0/6 |
7.5 ㎎/㎏ |
+3.2 |
63 % |
0/6 |
10 ㎎/㎏ |
+6.6 |
69 % |
0/6 |
위 표 5 및 도 3에서 보듯이, 추가적으로 실시한 사람 유래 대장암 세포주 HCT-15에서도 역시 본 발명의 화합물 624는 대조약물 대비 우수한 약효를 나타내었다.
④ 사람 유래 폐암 세포주(A549)를 이용한 화합물 624의 약효실험 결과를 다음 표 6 및 도 4에 나타낸다. 도 4는 화합물 624의 투여 일자별 종양 부피를 나타낸 그래프이다.
실험군(n=7) |
용량/일 |
투여방법 |
체중변화(%) |
IR(%) |
사망 동물수 |
대조군 |
- |
- |
+5.4 |
- |
0/7 |
AC7700 |
80 ㎎/㎏ |
q4d×4 (i.p.) |
+2.6 |
64 % |
0/7 |
화합물 624 |
5 ㎎/㎏ |
q4d×4 (i.p.) |
-1.7 |
39 % |
0/7 |
7.5 ㎎/㎏ |
+1.7 |
61 % |
0/7 |
10 ㎎/㎏ |
-1.2 |
71 % |
0/7 |
위 표 6 및 도 4에서 보듯이, 추가적으로 실시한 사람 유래 폐암 세포주 A549에서도 역시 본 발명의 화합물 624는 대조약물 대비 우수한 약효를 나타내었다.
⑤ 사람 유래 위암 세포주(MKN45)를 이용한 화합물 624의 약효실험 결과를 다음 표 7 및 도 5에 나타낸다. 도 5는 화합물 624의 투여 일자별 종양 부피를 나타낸 그래프이다.
실험군(n=6) |
용량/일 |
투여방법 |
체중변화(%) |
IR(%) |
사망 동물수 |
대조군 |
- |
- |
-15.3 |
- |
0/6 |
AC7700 |
80 ㎎/㎏ |
q4d×4 (i.p.) |
+7.8 |
55 % |
0/6 |
화합물 624 |
5 ㎎/㎏ |
q4d×4 (i.p.) |
-11.8 |
21 % |
0/6 |
7.5 ㎎/㎏ |
+2.9 |
46 % |
0/6 |
10 ㎎/㎏ |
+4.3 |
68 % |
0/6 |
위 표 7 및 도 5에서 보듯이, 추가적으로 실시한 사람 유래 위암 세포주 MKN45에서도 역시 본 발명의 화합물 624는 대조약물 대비 우수한 약효를 나타내었다.
⑥ 사람 유래 비소세포폐암 세포주(calu-6)를 이용한 화합물 624의 약효실험 결과를 다음 표 8 및 도 6에 나타낸다. 도 6는 화합물 624의 투여 일자별 종양 부피를 나타낸 그래프이다.
실험군(n=6) |
용량/일 |
투여방법 |
체중변화(%) |
IR(%) |
사망 동물수 |
대조군 |
- |
- |
+30.0 |
- |
0/6 |
AC7700 |
80 ㎎/㎏ |
q4d×4 (i.p.) |
+22.4 |
80 % |
0/6 |
화합물 624 |
5 ㎎/㎏ |
q4d×4 (i.p.) |
+26.2 |
41 % |
0/6 |
7.5 ㎎/㎏ |
+26.0 |
73 % |
0/6 |
10 ㎎/㎏ |
+20.6 |
82 % |
0/6 |
위 표 8 및 도 6에서 보듯이, 추가적으로 실시한 사람 유래 비소세포폐암 세포주 calu-6에서도 역시 본 발명의 화합물 624는 대조약물 대비 우수한 약효를 나타내었다.