KR20090099491A - 기능적 색소화 피부 대체물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하나 이상의 표피 대체물 및 하나 이상의 진피 대체물을 포함하고, 멜라닌을 구조적으로 생성하는 멜라닌형성세포 및 섬유모세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 시험관내 피부 대체물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 피부 대체물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
피부 대체물

Description

기능적 색소화 피부 대체물 {FUNCTIONAL PIGMENTED SKIN EQUIVALENT}
본 발명은 구조적 색소화 (constitutive pigmentation) 를 갖는 재건 피부 (reconstructed skin) 에 관한 것이며, 피부 색소화 현상의 평가 방법에서 이의 용도에 관한 것이다; 따라서, 이는 이러한 색소화가 구조적인 것인지 또는 유도된 것인지의 여부에 관계없이, 이를 조정할 수 있는 작용제를 평가하는 방법에 관한 것이다. 이는 또한 이러한 피부 모델을 제조하는 방법에 관한 것이다.
피부색은 표피 내 색소, 멜라닌의 존재에 주로 기인한다. 멜라닌은 표피의 기저층에 위치하는 특정 수지상 세포인, 멜라닌형성세포에 의해 합성된다. 멜라닌생성은 소기관, 멜라노솜에서 일어나고, 멜라닌이 로딩된 멜라노솜은 수상돌기를 통해 이웃의 표피 세포, 각질형성세포로 이송된다.
이러한 색소화는 물리적 인자, 예컨대 UV 복사, 또는 화학적 인자, 예컨대 탈색소화 (depigmenting) 또는 예비색소화 (propigmenting) 제품에 의해, 및/또는 피부 기능화의 생리적 또는 병적 변형 동안 조정될 수 있다.
그러므로, 한편으로는 기계적 면 및 생리적 면의 둘 다에서 피부의 역할을 더 잘 이해하는데 필요한 연구를 수행하는 것을 가능하게 하고, 다른 한편으로는 미용 및/또는 약학적 활성제의 활성도 또는 대안적으로는 경구 투여되는 국소 성분 또는 작용제의 부작용의 예고성 시험을 구축하는 모델을 갖는 것이 요구된다.
요즘에는, 색소화의 조정을 평가하기 위한 시험관내 모델이 존재한다. 특히 하기와 같은 모델이 있다:
- 재조합 인간 또는 진균 타이로시나아제의 인튜보 (in tubo) 억제 (단독 생화학적, 비세포성 모델) (Virador Analytical Biochem 1999);
- 정상 멜라닌형성세포 또는 멜라닌종 유래의 멜라닌형성세포의 단일층 단일배양액 (Virador Analytical Biochem 1999, Ni-komatsu JID 2007);
- 정상 또는 무한증식 인간 멜라닌형성세포-각질형성세포의 단일층 합동배양액 (Regnier Cell Mol Biol 1999, Yoon Pigment Cell Res 2003);
- 죽은 탈-표피화 진피 상에서의 또는 불활성 폴리카르보네이트 필터상에서의 색소화된 재건 표피: 멜라닌형성세포 및 각질형성세포만으로 구성된 3D 모델.
한편으로는 기계적 면 및 생리적 면의 둘 다에서 피부의 역할을 더 잘 이해하는데 필요한 연구를 수행하는 것을 가능하게 하고, 다른 한편으로는 미용 및/또는 약학 활성제의 활성도 또는 대안적으로는 국소 성분의 부작용의 예고성 시험을 구축하는 재건 피부 모델을 개발하기 위한 노력이 수년간 이루어져 왔다.
예를 들어, EP 285471 은 모낭의 초 (sheath) 로부터 유래되는 각질형성세포의 배양액으로부터 피부 대체물을 제조하는 방법을 기재하고 있다; 진피 대체물 상에 파종함으로써, 분화된 표피 (이의 구조는 인간 표피의 구조에 근접함) 를 수득했다.
다양한 피부 대체물이 이어서 제안되었고, 멜라닌형성세포를 이들 모델에 도입하는 것이 제안되었다.
특허 FR 2 689904 및 WO 95/10600 은 각질형성세포 및 멜라닌형성세포를 포함하는 표피 대체물의 제조, 및 일광욕 시험에서의 이의 용도를 기재하고 있다. 그러나, 이들 표피 대체물은, 진피와의 생리적 상호 작용을 재현하지 않고, 섬유모세포 또는 매트릭스 환경을 포함하지 않는 불활성 지지체 상에서 수득된다. 더욱이, 종양 촉진제 (TPA 또는 PMA) 를 사용하기 때문에 배양 조건이 멜라닌형성세포를 정상 표현형으로 유지시키는 것이 불가능하다.
그러나, 이들 모델 중 아무것도 생 진피를 포함하지 않기 때문에 진피의 참여자 (섬유모세포, 세포외 매트릭스, 진피-표피 이음부 성분) 에 의한 색소화의 조종에 대한 이해를 얻을 수 없다.
생 섬유모세포를 포함하는 인간 기관형적 모델이 개발된 경우에도, 이들이 생리적 맥락에서 색소화의 조정을 평가하는 것이 불가능한데, 이는 기능 결핍 (구조적 색소화, 또는 특히 UV 노광에 의해 유도될 수 있는 색소화의 부재) 을 갖기 때문이다.
색소화 피부의 모델이, 섬유모세포에 의해 재식민화 (recolonized) 된 스폰지 (콜라겐 + GAG 의 매트릭스) 상에서 또는 탈-표피화된 죽은 진피 상에서 개발되었다. 그러나, 그 내부에서의 멜라닌형성세포의 국소화 (localization) 가 종종 불완전하며, 이들 모델은 기능 결핍을 나타낸다. 상세하게는, 이들은 구조적 색소화를 거의 또는 전혀 나타내지 않고, 또한 이들 모델에서는 UV 복사에 의하 거나 또는 생리적 예비색소화 작용제에 의한 색소화의 자극이 관찰되지 않는다.
자유형 콜라겐 (팽팽하지 않음) 을 갖는 매트릭스에 포매된 섬유모세포가 또한 색소화 피부의 재건에 사용되었다. 그러나, 이들 모델은 이들이 색소화의 조정을 평가하는 데 사용되는 것을 불가능하게 하는 단점을 갖는다.
Bertaux 등 (Br J Dermatol 1988) 은 피부 생검을 진피 대체물에 도입하여 표피 세포가 표피에서 이탈해 격자의 표면 상에서 증식하도록 함으로써 색소화 피부의 모델을 개발했다. 이러한 기술의 단점 중, 표피 세포의 조절이 부족하다는 것과 생검을 통해 1 회의 피부 재건만 가능하다는 사실 (그러므로, 서로 비교할 수 있는 실험이 없음 (재현성 없음)) 이 언급될 수 있다. 더욱이, Haake 및 Scott (Scott and Haake, J. Invest Dermatol 1991) 에 의해 개발된 모델과 같이, 이 모델은 어떠한 실제적 기능성도 나타내지 않고; 멜라닌이 구조적으로뿐 아니라 유도적으로도 존재하지 않는 것이 관찰되었다.
Archambault 등 (J Invest Dermatol. 1995) 에 의한 모델에서는, UVB 복사 후 멜라닌생성 자극이 유도되지만, 그러나, 생리적 맥락에 근접한 시험관내 맥락에서 색소화 및 이의 조정을 연구할 수 있는 것에 대하여 완전히 허용불가능한 조건을 이루는 표피 변성 (세포독성 용량) 을 유도하는 용량에 대하여 유도된다.
최근, 색소화된 재건 피부의 재건에 대한 그 밖의 시도가 자유형 격자 지지체 (free lattice support) 상에서 이루어졌다; 그러나, 얻어진 모델은 정상 인간 피부의 모델에 상응하지 않는데, 이는 마우스 멜라닌형성세포가 이용되어 이들이 만들어지거나 (Yoshimura J Dermatol Sci 2001), 또는 종양 전환을 유도하는 조건 하에서 TPA 의 존재 하에서 멜라닌형성세포가 배양되기 때문이다 (Liu Cell Biol Int 2007). Martinhao Sauto 등에 의해 개발된 모델 (Sao Paulo Med J 2006) 에서는, 멜라닌형성세포가 존재하지 않거나, 또는 표피에 나타나지 않는다.
그러므로, 피부 및 이의 손상에 대한 지식을 얻을 수 있고 인간 피부의 생리적 상호 작용을 재현할 수 있는 모델을 얻는 것에 대한 필요성이 존재한다.
피부 색소화 및 이의 손상과 관련된 모든 메카니즘의 관련 지식을 얻을 수 있고, 인간 피부의 생리적 상호 작용을 재현할 수 있는, 피부 색소화의 조정을 평가하는 방법을 얻는 것에 대한 필요성 또한 존재한다.
특히, 생 섬유모세포를 갖는 진피 구획 및 인간 피부에 존재하는 것과 유사한 국소화를 갖는 기능적 생 멜라닌형성세포를 포함하는 피부 대체물에 대한 필요성이 존재한다.
이러한 이유로, 본 발명의 주제는 하나 이상의 표피 대체물 및 하나 이상의 진피 대체물을 포함하고, 멜라닌 (이 멜라닌은 각질형성세포로 이송됨) 을 구조적으로 합성하는 멜라닌형성세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 시험관내 피부 대체물이다. 본 발명에 따른 피부 대체물은 또한 생 섬유모세포를 포함한다.
그러므로, 본 발명에 따른 피부 대체물은 구조적 색소화, 즉, UV 복사에 의하거나 또는 예비색소화 활성제에 의한 임의의 자극의 부재 하에서의 색소화를 나타낸다. "구조적 색소화" 란 용어는 자극되지 않은 기저 상태에서 멜라닌을 생성하는 멜라닌형성세포의 능력을 의미하는 것으로 의도된다. 이러한 색소화는, 생리적 조건 하에서 멜라노솜 내부에 성숙한 멜라닌을 생성시키는 멜라닌형성세포가 존재하는 것에 상응하는 것인데; 멜라닌은 멜라닌형성세포의 수상돌기를 통해 각질형성세포로 이송되며, 이는 표피 대체물 내에서 색소화의 균질한 분포를 제공한다. 멜라닌형성세포 및 이웃의 각질형성세포 내의 멜라닌 과립의 존재는 구조적 색소화의 증거가 된다.
본 발명은 더욱 특히 인간 피부 대체물이다.
특히, 본 발명은 정상 인간 멜라닌형성세포, 각질형성세포 및 섬유모세포 및 매트릭스 환경을 포함하는 전반적 및 기능적 색소화 단위 (또는 복합체) 에 관한 것으로서; 상기 단위 (또는 복합체) 는 하나 이상의 표피 대체물 및 하나 이상의 진피 대체물을 포함하고, 구조적 및 기능적 색소분비성 성분 (생리적 조건 하에서의 유도될 수 있으며, 구조적인 색소화) 을 포함한다.
본 발명의 주제는 또한 색소화를 조정하는 작용제의 능력을 평가하는 방법으로서, 하기를 특징으로 하는 방법이다:
(a) 멜라닌을 구조적으로 생성시키는 멜라닌형성세포를 포함하는 하나 이상의 표피 대체물 및 생 섬유모세포를 포함하는 하나 이상의 진피 대체물을 포함하는 시험관내 피부 대체물에 상기 작용제를 적용함, 및
(b) 평가될 작용제가 적용된 시험관내 피부 대체물의 색소화 (i) 를, 작용제가 적용되지 않은 대조군 피부 대체물의 색소화 (ii) 와 비교함.
본 명세서에 걸쳐, 단수로 표시된 작용제란 표현은 달리 지시되지 않는 한 " 하나 이상" 임을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
비교의 목적을 위해, 넓은 의미에서의 색소화의 조정을 정량적으로 및 정성적으로 평가할 수 있다. 하기를 분석하는 임의의 방법을 이용할 수 있다:
- 피부 대체물의 색소화 및/또는 색상 및 멜라닌의 양 및 성질, 및 이의 각질형성세포로의 이송 및 각질형성세포 내에서의 분해; 예로서, 직접 또는 간접 분광비색법 (spectrocolorimetry)(휘도 및 ITA 의 측정) 에 의한 방법, 선택적 분광학 (색차계 측정) 에 의한 방법, 시아스코피 (siascopy) 에 의한 방법, 고성능 액체 크로마토그래피 HPLC 측정 (DHI-멜라닌, DHICA 멜라닌, 페오멜라닌의 측정) 에 의한 방법, 솔루엔 또는 수산화나트륨을 이용한 피부의 용해 후 가시광선 분광법에 의한 방법, 폰타나-메이슨 (Fontana-Masson) 을 이용한 멜라닌의 염색 후 화상 분석에 의한 방법, 동일초점 및 다광자 화상에 의한 방법, 전자 상자성 공명에 의한 방법, 투과형 전자 현미경에 의한 방법이 언급될 수 있음;
- 멜라닌형성세포에서 생성되어 각질형성세포로 이송되고/되거나 각질형성세포 내에서 분해되는 멜라노솜의 수, 형상 및 성숙도;
- 예를 들어, pmel-17, 타이로시나아제, TRP-1, TRP-2 (DCT), MATP, 단백질 P MART-1, SCL117A, SLC24A5 (nckx5), OA1 과 같은 멜라노솜의 단백질의 양, 성숙도 및/또는 효소 활성도;
- 멜라닌형성세포의 수, 분포, 형태 (수지상 (dendricity));
- 멜라닌생성 경로, 수상돌기에서의 이송 경로 및 각질형성세포로의 멜라닌 및 멜라노솜의 이송 경로에 참여하는, 맴브레인, 세포질 및 핵 수준에서의, 수용 체, 분자, 전사 인자의 양, 성숙도 및/또는 효소 활성도. 예로서, MC1-R, m-KIT, ETB-R, ETA-R, MITF, USF-1, SOX10, 마이오신 Va, Rho, Rac, Rab27A, 멜라노필린이 언급될 수 있음.
사용되는 방법은 단백질 및 이의 인코딩 유전자의 발현의 양 및 활성도를 평가하는 방법, 예컨대 도파 반응, 면역조직화학법, 조직구조적 염색, 화상 분석, 분자 생물학 (PCR), 생화학 (WB, ELISA 효소 면역분석), 등의 기술일 수 있다.
상기 방법은 더욱 특히 인간 피부 대체물, 특히 적어도 인간 피부 유래의 멜라닌형성세포 및/또는 각질형성세포 및/또는 섬유모세포, 유리하게는 적어도 인간 피부 유래의 멜라닌형성세포를 포함하는 피부 대체물을 이용한다.
특히, 상기 방법은 이에 따라 정상 인간 멜라닌형성세포, 각질형성세포 및 섬유모세포 및 매트릭스 환경을 포함하는 전반적 및 기능적 색소화 단위 (또는 복합체) 에 적용되는데; 상기 단위는 하나 이상의 표피 대체물 및 하나 이상의 진피 대체물을 포함하고, 구조적 및 기능적 색소분비성 성분 (생리적 조건 하에서의 유도될 수 있으며, 구조적인 색소화) 을 포함한다.
사실상, 앞서 요약한 필요성을 만족시키며 하기 특징을 갖는 모델을 본 발명을 통해 얻을 수 있다는 것을 알아내었다:
- 이는 색소화에 관여하는 주 세포 참여자, 즉, 멜라닌형성세포뿐 아니라 이의 주요 세포 협력자: 각질형성세포 및 섬유모세포를 포함함.
- 이는 세포 협력자, 진피-표피 이음부 및 세포외 매트릭스 사이에서 자연적으로 존재하는 접촉 및 영향을 방해하지 않고, 이를 가능하게 하기 위해 피부의 3 차원 조직을 재현함.
- 이는 생리적 현상을 재현하는 조건 하에서, 기능적이며, 즉 기저 상태 (구조적 색소화) 에서 착색되어 있고, UV 복사에 의해 및/또는 예비색소화 작용제에 의해 자극될 수 있음.
본 발명에 따른 모델은, 피부에 존재하고 색소화에 관여하는 세 주요 세포 유형을 피부의 구조와 근접한 구조로서 포함하고, 이에 따라 멜라닌형성세포 및 이의 세포 협력자 및 세포외 매트릭스에 의한 색소화의 제어를 재현할 수 있다.
사실상, 피부에서, 색소분비성 세포는 이웃의 표피 및 진피 세포에 근접하게 연결되어 있다. 기저층에서의 이의 국소화에 의해, 표피-진피 계면에서, 물리적 및 화학적 연결이 멜라닌형성세포 및 각질형성세포 사이에 그리고 또한 멜라닌형성세포 및 섬유모세포 사이에 존재한다. 이들 두 세포 유형과의 이들 상호 작용의 기능은 멜라닌형성세포 및 색소화의 제어이다.
각질형성세포에 의해 방출되는 파라크린 (paracrine) 인자를 통해 그리고 E-카드헤린에 의해 확립되는 직접적 물리절 연결에 의해, 각질형성세포가 멜라닌형성세포의 부착, 성장 및 생존, 그리고 생성되는 멜라닌의 양 및 질을 제어하는 것이 인정된다. 이러한 인자들 중, 예를 들어, 알파 멜라닌형성세포 자극 호르몬 (MSH), 엔도텔린 1 (ET1), 줄기 세포 인자 (SCF), 프로스타글란딘 E2 및 F2α (PGE2, PGF2α), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF) 또는 신경 성장 인자 (NGF) 가 언급될 수 있다.
이와 유사하게, 색소화에서 섬유모세포가 수행하는 역할은 이제 명백하다: 각질형성세포, 예컨대 bFGF, SCF 또는 간세포 성장 인자 (HGF) 또는 다른 인자들, 예컨대 dickkopf1 및 매트릭스 단백질에 의해 생성되는 것과 동일한 인자를 분비함으로써 섬유모세포는 멜라닌형성세포의 전개, 성장, 형태 및 분화를 조정한다.
더욱이, 진피-표피 이음부의 성분, 진피 세포외 매트릭스 (ECM) 의 분자가 또한 멜라닌형성세포 및 색소화에 영향을 준다. 이는 멜라닌형성세포가 인테그린 및 수용체를 통해 기저 맴브레인의 분자에, 특히 라미닌 및 콜라겐 IV 에 부착하고, 기저 맴브레인의 분자의 존재가 멜라닌형성세포의 정확한 기저 위치를 위해 필요하기 때문이다. 진피-표피 이음부 (또는 DEJ) 의 질, 즉, 섬유모세포 및 각질형성세포 사이의 상호 작용으로부터 야기되는 성분 및 이들의 국소화는 DEJ 에서의 고정 (anchoring)(인테그린) 의 유형에 영향을 준다.
섬유모세포 유래의 ECM 단백질의 조정은 또한 정상 멜라닌형성세포의 증식, 형태 및 멜라닌형성 활성도에 영향을 준다. 특히, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 섬유결합소 및 라미닌은 타이로시나아제 활성도를 자극하고, 멜라닌형성세포의 수지상 및 이의 증식을 조정한다.
더욱이, 조절 세포 루프가 존재한다: 각질형성세포는 멜라닌형성세포 상에 직접적으로 작용하거나 또는 섬유모세포 상에 간접적으로 작용할 수 있고, 결국 멜라닌형성세포를 조정할 것이다: 예를 들어, 각질형성세포에 의한 IL-1α 및 TNF-α 의 분비는 섬유모세포에 의한 HGF 및 SCF 의 생성을 자극할 것이고, 결국 멜라닌형성세포를 활성화시킨다. 이와 유사하게, 섬유모세포는 각질형성세포 (예를 들어, KGF) 를 자극하는 사이토킨을 방출할 수 있다. 이들 각질형성세포는 결국 색소화 조정 인자를 생성시킬 것이다.
태양광으로의 피부의 노광은 색소화의 자극을 유도한다는 것이 또한 알려져 있다; 이는 썬텐으로서, 멜라닌형성세포의 전이적 활성화 및 멜라닌 합성의 증가를 야기한다.
이러한 반응은 주로 협력자 세포, 각질형성세포 및 섬유모세포의 파라크린 인자의 기여로부터 비롯되는데, 상기 파라크린 인자의 생성은 UV 복사에 의해 증가된다. 본 발명에 따른 모델은 예상외로 이러한 현상을 재현하고, 이에 따라, 피부 색소화를 개질할 수 있는 물질 또는 자극물을 시험하는 것을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 평가 방법은 이러한 모든 현상을 고려하고, 이에 따라, 피부 색소화를 조정할 수 있는 물질 또는 자극물의 능력을 직접적으로 및/또는 간접적으로 평가하는 것을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 피부 대체물 (또는 재건 피부) 는 하나 이상의 표면층 및 하나 이상의 기저층을 포함하는 층상화 (stratified) 분화된 표피 대체물을 갖는다. 유리하게는, 각질형성세포가 생체 내 표피의 특징, 즉, 진피 대체물과 접촉하는 기저층을 갖는 층상화 다중층 상피를 재현하는데, 이의 상부층은 분화를 반영하며, 깊은 곳으로부터 주변까지 표피의 기저상층 (또는 가시 세포 층), 과립형층 (과립층) 및 뿔형층 (각질층) 을 재현한다. 표피 대체물의 표면층은 기저상층, 과립형층 또는 뿔형층에 해당하는 하나 이상의 층을 의미하는 것으로 이해된다.
표피 대체물에 사용되는 각질형성세포는 선행 기술에서의 임의의 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 예로서, 정상 또는 병적 피부 샘플 기원으로부터 분리된 표피로부터의 배양이 언급될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따르면, 사용되는 각질형성세포를, 특히 문헌 [Rheinwald 및 Green, Cell, vol. 6, 331-344, 1975] 에 기재된 방법에 따라, 정상 또는 병적 인간 피부 샘플 기원으로부터 분리된 표피로부터 제조한다. 이는 코카시아인, 아시아인 또는 아프리카인 피부로부터, 다양한 해부학적 부위 (예컨대, 특히, 등, 안면, 가슴, 손등, 손바닥, 등) 로부터, 태양광에 노광되었거나 또는 노광되지 않은 영역으로부터 유래된 것일 수 있다. 정상 피부 기원의 각질형성세포를 사용할 수 있다. 본 발명의 한 특정 구현예에 따르면, 예를 들어, 검버섯 (광선 흑색점 (actinic lentigo)), 기미, 백반증, 모반, 색소성 피부건조증 또는 멜라닌종과 같은 피부 병상 기원의 각질형성세포를 사용할 수도 있다. 이는 또한 유전자 조작된 각질형성세포 과도발현 또는 과소발현 특정 유전자일 수 있다.
본 발명에 따라 멜라닌형성세포를 표피에 통합시키고, 표피 대체물의 기저층에 국소화시킨다. 이들 멜라닌형성세포는 표피 대체물 내에서 균질하게 분포하여, 즉 이들의 분포 밀도는 상기 진피 대체물의 표면에 대한 평행면에서 실질적으로 일정하며, 인간 피부에서 발견되는 것과 실질적으로 유사하다. 따라서, 모든 멜라닌형성세포가 본 발명에 따라 표피 대체물의 기저층에 있으며, 표피 대체물의 기저상층 및 각질층에 말라노사이트가 부재한 것은 재건의 질의 증거가 된다.
멜라닌형성세포는 성인, 어린이 또는 신생아 인간 피부, 특히 성인 인간 피부 기원의 멜라닌형성세포이다. 이러한 멜라닌형성세포는 모낭의 멜라닌형성세포와 달리 TRP-2 효소를 발현한다. 그러므로, 합성된 멜라닌의 성질이 다르다: 표피 내 멜라닌형성세포는 DHI-멜라닌 및 DHICA-멜라닌으로 이루어지는 유멜라닌을 생성하는 반면, 모발 내 멜라닌형성세포는 TRP-2 발현의 부재에 기인하여 주로 DHI-멜라닌만을 생성한다.
더욱이, 피부 멜라닌형성세포의 주된 생리적 자극은, 멜라닌생성 및 멜라닌의 재분포를 활성화시킴으로써 피부의 갈변, 썬텐을 유도하는 UV 복사이다. 이러한 생리적 기능성은 모발 멜라닌형성세포 (이의 색소화는 UV 복사에 의해 유도되지 않음) 와는 관계가 없다.
멜라닌형성세포는 코카시아인, 아시아인 또는 아프리카인 피부로부터, 다양한 해부학적 부위 (예컨대, 특히, 등, 안면, 가슴, 손등, 손바닥, 등) 로부터, 태양광에 노광되었거나 또는 노광되지 않은 영역으로부터 유래된 것일 수 있다. 정상 피부 기원의 멜라닌형성세포를 사용할 수 있다. 본 발명의 한 특정 구현예에 따르면, 예를 들어, 검버섯 (광선 흑색점), 기미, 백반증, 모반, 색소성 피부건조증 또는 멜라닌종과 같은 피부 병상 기원의 멜라닌형성세포를 사용할 수도 있다. 이는 또한 유전자 조작된 멜라닌형성세포 과도발현 또는 과소발현 특정 유전자일 수 있다.
기저층에 국소화한 멜라닌형성세포는 멜라노솜 및 멜라닌을 생성하고, 이는 이웃의 각질형성세포로 이송된다. 따라서, 멜라닌형성세포의 유형과 관련된 다소 강한 구조적 색소화를 갖는 피부의 표현형이 재현될 수 있다. 구조적 색소화는 색소화 또는 멜라닌의 양을 측정하는 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 분광비색법 (휘도의 측정) 에 의한 방법, 고성능 액체 크로마토그래피 HPLC 측정에 의한 방법, 솔루엔 또는 수산화나트륨을 이용한 피부의 용해 후 가시광선 분광법에 의한 방법, 또는 폰타나-메이슨을 이용한 멜라닌의 염색 후 화상 분석에 의한 방법, 동일초점 화상 및 다광자 화상에 의한 방법에 의해 정량화할 수 있다.
유리하게는, 본 발명에 따른 피부 대체물이 UV 복사 및/또는 예비색소화 작용제에 대한 어떠한 노출도 없을 때에 80 이하의 휘도 [Chardon 등 (In Biological responses to ultraviolet A radiation, Ed Urbach 1992) 의 기술에 따라 측정] 를 갖는다. 이 값은, 특히 아프리카인 피부 대체물의 경우, 더 낮을 수 있고, 매우 밝은색 내지 검정색 범위의 표현형에 대하여 특히 +80 내지 -40 의 범위일 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 색소화된 재건 피부는 임의의 UV 조사의 부재 하에서 멜라닌형성세포를 포함하지 않는 재건 피부와 비교하여 휘도의 차이 (Delta L) 가 1.5 이상이다.
본 발명에 따른 진피 대체물은 섬유모세포를 포함하는데, 이의 주축들은 둘 이상의 수직 방향으로 배향된다. 유리하게는, 진피 대체물의 표면에 대해 길이방향으로 배향된 섬유모세포의 백분율이 50 % 미만이다.
진피 대체물은 자유형 콜라겐 매트릭스 또는 격자 (이는 모든 방향에서 수축성을 가지며, 생검 없이, 균질함); 섬유모세포를 포함하고, 진피의 적절한 기타 세포의 경우, 연속적 콜라겐 겔 내에 분포된다.
진피 대체물은 섬유모세포가 분포되어 있는 콜라겐 유형 I 의 하나 이상의 매트릭스를 포함한다. 이는 또한 기타 세포외 매트릭스 구성체를 포함할 수 있다. "세포외 매트릭스 구성체" 라는 용어는 특히 콜라겐, 특히 콜라겐 IV, 라 미닌, 엔탁틴, 섬유결합소, 프로테오글라이칸, 글라이코스아미노글라이칸 또는 히알루론산과 같은 분자를 지칭한다. 본 발명의 구현예 중 하나에 따르면, 진피 대체물은 적어도 콜라겐 IV 및 라미닌을 포함하고; 바람직하게는, 또한 엔탁틴을 포함한다. 이들 다양한 구성체의 농도는 당업자에 의해 조정될 수 있고, 예를 들어, 라미닌에 대하여는, 최종 부피의 1% 내지 15%, 콜라겐 IV 에 대하여는, 최종 부피의 0.3% 내지 4.5%, 엔탁틴에 대하여는, 최종 부피의 0.05% 내지 1% 일 것이다.
사용되는 콜라겐은 소 기원, 레트 꼬리로부터 또는 어류로부터, 또는 천연 콜라겐 또는 유전 공학에 의해 생성된 콜라겐 중 임의의 다른 기원의 콜라겐일 수 있는데, 이는 섬유모세포의 존재 하에서 수축한다.
매트릭스는, 섬유모세포의 바람직한 조직을 포함하지 않고, 수평 및 수직으로의 수축에 의해 수득된, 팽팽하지 않은 콜라겐의 겔이다. "자유형" 이라고도 칭하는 이러한 매트릭스는 지지체에 부착되어 있지 않고, 이의 부피가 제한 없이 변화될 수 있어서 다양한 두께 및 지름이 제공된다; 진피 대체물의 두께는 일반적으로 0.05 cm 이상, 특히 대략 0.05 내지 2 cm 이지만, 본 발명에 따른 피부 대체물의 유리한 특성에 손상을 주지 않는 한 증가될 수 있다; 이와 유사하게, 이의 두께가 당업자에 의해 대략 3 mm 내지 20 cm 또는 그 이상으로 조정될 것이다.
생 섬유모세포를 포함하는 진피 구획 및 다중층상화 표피 대체물의 사이에서 접촉은 직접적이며, 구조적 관점 및 생화학적 관점의 둘 다에서 생체 내에 존재하는 것과 유사한 진피-표피 이음부를 구성한다. 생화학적 관점에서, 이는 기저 맴브레인; 치밀판, 투명판 및 기저하 구역의 성분, 예컨대, 그 중에서도 특히, 콜라겐 IV, 콜라겐 VII, 라미닌 5, 엔탁틴 또는 섬유결합소를 포함한다.
본 발명에 따른 평가 방법에 사용되는 피부 대체물은 또한 내피 세포, 진피 유두 세포, 면역계 세포, 예컨대 림프구, 수지상 세포, 포식 세포 또는 랑게르한스 세포, 지방 세포, 신경 세포 및 이의 혼합물을 포함할 수 있다.
앞서 나타낸 바와 같이, 피부 대체물은 구조적 색소화를 나타내며, 색소화는 또한 예비색소화 작용제 및/또는 UV 복사로의 노출에 의해 증가될 수 있다.
특히, 생리적 조건 하의 개별 인간 피부에, 일일 또는 천정 복사에 대해 등량인 UV 복사 자극이 가해지면, 본 발명에 따른 모델의 섬유모세포는 색소화 및/또는 이의 조정에 참여하는 사이토용해성 (cytosoluble) 인자 예컨대 사이토킨 또는 성장 인자를 생성한다.
더욱이, 기저층 내 멜라닌형성세포의 수는 UV 복사에 의한 자극 후 증가하는데, 특히 1.5 배 이상 증가하고, 상기 멜라닌형성세포의 형태가 변경된다: 이들은 수상돌기의 수의 증가 및 또한 이의 확대를 통해 수지상에서 현저한 증가를 보인다; 멜라닌의 양 또한 합성에 의해 그리고 표피층으로의 이송 증가에 의해 1.5 배 이상 증가한다.
색소화에서의 증가는 피부 휘도의 변화를 측정하거나 또는 멜라닌을 정량화하는 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피 HPLC 를 이용한 측정에 의해, 솔루엔 또는 수산화나트륨을 이용한 피부의 용해 후 가시광선 분광법에 의해, 또는 폰타나-메이슨을 이용한 멜라닌의 염색 후 화상 분석에 의해, 또는 동일초점 및 다광자 화상에 의해 평가한다.
그러므로, UV 복사 후 본 발명에 따른 모델의 생리적 기능성은 하기 매개변수에서의 변화에 의해 나타내어진다:
- 거시적 색상: UV 복사에 노광된 피부는 노광되지 않은 피부보다 훨씬 더 어두움: 색소화의 이러한 거시적 자극은 휘도 감소에 의해 정량화됨 (△L = 4.38).
- 멜라닌형성세포 밀도: UV 복사 후 멜라닌형성세포 밀도는 정상 피부에서의 밀도 보다 증가함.
- 멜라닌의 양: UV 복사 후 색소화가 쉽게 자극됨: 멜라닌의 양이 증가되고, 이러한 증가는 폰타나-메이슨 염색 (멜라닌 과립을 드러내기 위한 염색) 후의 화상 분석에 의하거나 또는 솔루엔 또는 수산화나트륨을 이용한 추출 후의 검정에 의해 정량화함.
본 발명의 주제는 또한 이러한 피부 대체물을 제조하는 방법이다. 상기 방법은 특히 하기 단계 a), b), c) 를 포함한다:
a) 섬유모세포 및 콜라겐 용액을 접촉시킨 후, 진피 대체물을 구성하는 수축된 콜라겐 매트릭스 (여기에 섬유모세포가 분포되어 있음) 를 수득하기에 충분한 기간 동안 인큐베이션하는 단계.
b) 상기 a) 에서 수득된 진피 대체물에 각질형성세포 및 멜라닌형성세포의 혼합물을 파종하고, 액체 매질 중에서 침지 배양하는 단계,
c) 상기 b) 에서 수득된 전체 배양액 (진피 대체물 상에 파종된 각질형성세포 및 멜라닌형성세포) 의 노출 (emersion) 시키고, 피부 대체물을 구성하고 있는 콜라겐 매트릭스 중에 섬유모세포를 포함하는 진피 대체물 상에서, 멜라닌형성세포를 포함하는 다중층상화 표피 대체물이 수득될 때까지 공기-액체 계면에서 배양을 계속하는 단계.
바람직하게는, 표피 대체물이 뿔형층을 형성하고, 멜라닌형성세포가 기저층 상에 국소화된다.
이렇게 얻어진 피부 대체물은 다양한 평가 방법에서 제거되거나 또는 이의 지지체 상에서 사용될 수 있다.
단계 a 는 균질한 현탁액 중에서, 특히, 소 기원의 콜라겐 유형 I, 또는 콜라겐 I 및 III 의 혼합물 (격자의 최종 부피에 대해 대략 30%) 을 이용해 수행할 수 있다. 유리하게는, 여기에 기타 구성체, 예컨대 라미닌 (특히, 최종 부피에 대해 1% 내지 15%), 콜라겐 IV (특히, 최종 부피에 대해 0.3% 내지 4.5%) 및/또는 엔탁틴 (특히, 최종 부피에 대해 0.05% 내지 1%) 을 첨가하여 균질한 현탁액을 수득되도록 한다.
섬유모세포는 인간 피부로부터, 유리하게는 성인 피부로부터 수득된다. 이들은 코카시아인, 아시아인 또는 아프리카인 피부 유래의, 다양한 해부학적 부위 (예컨대, 특히, 등, 안면, 가슴, 손등, 손바닥, 등) 유래의, 태양광에 노광되었거나 또는 노광되지 않은 영역 유래의, 단독 또는 임의 비율의 혼합물로서의 유두상 및/또는 망상 섬유모세포일 수 있다. 한 특정 구현예에서, 예를 들어, 검버섯 (광선 흑색점), 기미, 백반증, 모반, 멜라닌종 또는 색소성 피부건조증과 같은 피부 병상 기원의 섬유모세포를 사용한다. 이는 또한 유전자 조작된 섬유모세포 과도발현 또는 과소발현 특정 유전자일 수 있다.
이는 당업자에게 공지된 적절한 매질 중에서 배양된 후, 현탁된 다음, 콜라겐 및 성장 인자의 현탁액과 혼합된다. 혼합물은 1 내지 6 일 동안, 바람직하게는 4 또는 5 일 동안 대략 37 ℃, 일반적으로 36 ℃ 내지 37.5 ℃ 의 온도에서 인큐베이션한다. 유리하게는, 상기 혼합물의 부착을 허용하지 않는 지지체, 특히 혼합물이 지지체의 모서리에 부착되는 것이 방지되는 지지체 상에서 상기 혼합물을 인큐베이션한다; 이러한 지지체는 특히 이의 표면의 사전 처리에 의해, 예를 들어, 상기 표면을 소 알부민 또는 혈청으로 코팅함으로써 수득할 수 있다. 영양 매질을 방출하면서 여러 방향에서 자유롭게 수측되며, 섬유모세포가 포매되어 있는 콜라겐 겔이 이와 같이 수득된다.
단계 b 를 수행하기 위해, 인간 피부 기원의, 바람직하게는 성인 인간 피부 기원의 각질형성세포를 사용한다. 이들은 코카시아인, 아시아인 또는 아프리카인 피부로부터, 다양한 해부학적 부위 (예컨대, 특히, 등, 안면, 가슴, 손등, 손바닥, 등) 로부터, 태양광에 노광되었거나 또는 노광되지 않은 영역으로부터 유래될 수 있다. 한 특정 구현예에서는, 예를 들어, 검버섯 (광선 흑색점), 기미, 백반증, 모반 또는 멜라닌종과 같은 피부 병상 기원의 각질형성세포를 사용한다. 이는 또한 유전자 조작된 각질형성세포 과도발현 또는 과소발현 특정 유전자일 수 있다.
각질형성세포의 표본은 통상적 세포 배양 방법에 따라 수득될 수 있다. 특히, 개인으로부터 취해진 피부 외식편을 이용하여 하기 절차를 수행할 수 있다:
- 작은칼을 이용해 피하 조직을 제거함;
- 항생제 치료 (예를 들어: 겐타마이신) 에 의해 피부 샘플을 정화함:
- 단백질분해 치료 (예를 들어: 트립신 및 디스파아제) 및 이후 박리에 의해 진피를 표피로부터 분리함;
- 이후, 0.05% 트립신 및 0.02% EDTA 의 용액의 존재 하에서 세포의 해리가 촉진됨; 10% 혈청 함유 DMEM 배양 매질을 첨가함으로써 트립신의 효과를 중화시킴;
- Rheinwald 및 Green (Cell, 1975) 의 기술에 따라 세포 현탁액을 균질화한 후, 각질형성세포 배양 매질 중에서 세정함.
각질형성세포는, Rheinwald 및 Green (Cell, vol. 6, 331-344, 1975) 의 기술에 따라 파종 이전, 당업자에게 공지된 적절한 매질 중에서 3T3 섬유모세포로 구성되는 공급기 지지체 상에서의 배양에 의해 성장 인자, 특히 아미노산, 혈청, 콜레라 독소, 인슐린, 트리요오도타이로닌 및 pH 완충용액의 존재 하에서 증식된다. 특히, 이러한 배양 매질은 특히 각질형성세포에 대한 하나 이상의 분열촉진 성장 인자 (예를 들어, 표피 성장 인자 (EGF) 및/또는 각질형성세포 성장 인자 (KGF), 특히 KGF), 인슐린, 하이드로코르티손 및, 임의로는, 항생제 (예를 들어: 겐타마이신, 암포테리신 B) 를 포함할 수 있다.
유리하게는, 상기 매질이 또한, 예를 들어, 소 기원의 혈청 또는 뇌하수체 추출물, 에피네프린, 트란스페린 및/또는 비필수 아미노산을 포함할 수 있다.
멜라닌형성세포는 어린이 또는 성인 인간 피부 기원, 코카시아인, 아시아인 또는 아프리카인 피부 유래, 다양한 해부학적 부위 (등, 안면, 가슴, 포피, 손등, 손바닥, 등) 유래, 태양광에 노광되었거나 또는 노광되지 않은 영역 유래의 멜라닌형성세포이다. 한 특정 구현예에서, 예를 들어, 검버섯 (광선 흑색점), 기미, 백반증, 모반 또는 멜라닌종과 같은 피부 병상 기원의 멜라닌형성세포를 사용한다. 이는 또한 유전자 조작된 멜라닌형성세포 과도발현 또는 과소발현 특정 유전자일 수 있다.
이는 포르볼 에스테르의 부재 하에서 염기성 매질, 예컨대 DMEM/F12 또는 MCDB153 을 포함하고 멜라닌형성세포-특이적 성장 인자 (예를 들어, bFGF, SCF, ET-1, ET3 또는 αMSH) 가 보충되어 있는 적절한 매질 중에서의, 특히 M2 매질 (Promocell) 중에서의 또는 M254 (Cascades BiologicsTM) 와 같은 기타 매질 중에서의 배양에 의해 증식된다.
멜라닌형성세포 및 각질형성세포의 세포 현탁액이 이들 배양액으로부터 제조되고, 혼합되어 혼합된 각질형성세포/멜라닌형성세포 현탁액이 수득된다. 멜라닌형성세포/각질형성세포 비율은 1:10 내지 2:1 일 수 있고, 일반적으로 대략 1:1 이다.
그러므로, 본 발명에 따른 피부 대체물의 제조 방법에서는, 이에 포함된 단계들이 수행되는 동안, 각질형성세포 및 멜라닌형성세포가 이들 각각의 성장 매질 중에서 별도로 증식된다. 이후, 세포들을 탈착시키고, 정의된 밀도 및 정의된 비율로 진피 대체물 상에 직접적으로 함께 심는다.
이 방법은 증식 동안 그리고 진피 대체물 상으로의 표피 세포의 파종 동안 세포 유형 각각의 가능한 조절 및 융통성이 더욱 크다. 파종된 세포 유형 각각의 양 및 또한 비율에서의 상기 조절은 재현성 및 표피 재건의 조절 면에서 산업적 응용에 대하여 장점을 나타낸다.
그러므로 본 발명의 변형에 따르면, 정상 피부로부터의 각질형성세포 및 멜라닌형성세포가 사용될 수 있고, 또 다르게는 피부 병상 기원의 멜라닌형성세포 및 각질형성세포가 사용될 수 있고, 또는 심지어 피부 병상 기원의 두 세포 유형 중 하나 및 건강한 정상 세포에 해당하는 기타의 것이 사용될 수 있다는 것을 알 수 있다.
이러한 혼합 현탁액을 진피 대체물 상에 침적시키는데; 진피 대체물을 유리하게는 생물학적 재료를 통해 지지체, 예컨대 콜라겐에 부착시킨다. 멜라닌형성세포/각질형성세포 현탁액을, 경계가 정해진 표면 부분 상에 유지시키기 위해 고리 또는 임의의 대등한 수단 내에 침적시킨다. 액체 영양 매질은 세포의 혼합물을 덮도록 첨가된다; 이 매질은 당업자에게 공지된 성장 인자, 특히 EGF 및/또는 KGF 를 포함한다. 매질은 규칙적으로 교환될 것이고, 배양은 침지로서, 일반적으로 2 내지 10 일, 특히 5 내지 8 일, 및 대략 7 일의 기간 동안 계속된다. 매질은 유리하게는 침지 2 일째부터 KGF 를 포함하고, 이상적으로는 침지 4 일째부터 포함한다.
앞서 나타낸 바와 같이, 진피 대체물은 정상 섬유모세포 및/또는 병적 기원의 섬유모세포를 포함할 수 있다. 진피의 이들 다양한 유형을, 앞서 기술된 다양한 변형예에 따라, 정상 또는 병적 각질형성세포/멜라닌형성세포 혼합물로부터 제조된 표피 대체물과 조합할 수 있다.
이후, 피부를, 알려진 방식 그대로, 침지되어 있던 곳으로부터 빼내어 각질형성세포의 분화 및 층상화 표피 대체물의 형성이 이루어지도록 한다. 공기-액체 계면으로 노출시켜 배양하는 것에 해당하는 이 단계 c 는, 분화된 구조가 얻어질 때까지 일반적으로 대략 7 일 동안 계속된다. 그러나, 단계 c 는 더 긴 기간 동안, 예를 들어 대략 28 일 동안 계속될 수 있는데, 그 동안 상기 본문에서 구체화된 피부 대체물의 유리한 특징이 계속 보존된다. 영양 배양 매질은 정기적으로 새로이 보충될 것이다. 이후, 피부 대체물을 꺼내어 필요한 시험을 수행한다.
상기 제조 방법은 돌연변이유발성 물질, 예컨대 TPA 또는 PMA 를 사용하지 않고, 세포는 종양 유형의 어떠한 변형도 나타내지 않는다.
본 발명에 따라 수득될 수 있는 피부 모델은 구조적 색소화, 및 유도적 색소화를 가능케 하는 기능성을 나타내는데, 이는 더욱 완전한 생물 상으로의 어떠한 이식도 없는 시험관내 모델에 대한 사례이다.
본 발명에 따른 피부 모델은 모든 각도에서 멜라닌생성 제어 경로를 이해하는 것을 가능케 한다. 이는 멜라닌형성세포 상에서의 직접적 활성도에 의해 반영될뿐 아니라 각질형성세포, 섬유모세포, 전체 3차원 컨텍스트(context) 및 미세환경의 영향에 의해 매개되는 (예비색소화 또는 항색소화 (antipigmenting)) 활성도에 의해 반영될 수 있다.
이는 특히 다양한 평가 방법에서 유용하다.
본 발명에 따른 방법의 실시에서 평가할 작용제는 색소화를, 직접적으로 또는 간접적으로, 조절할 수 있거나 또는 조절할 수도 있는 임의의 화학적 또는 생물학적 물질 또는 화합물, 또는 임의의 물리적 처치 또는 현상일 수 있다.
본 발명에 따라 평가될 수 있는 물리적 처치의 예로서, 광 복사, 예를 들어 UV 또는 IR 복사, 특히 LED (발광 다이오드) 처치가 이용된 것이 언급될 수 있다.
"피부 대체물로의 작용제의 적용" 이란 표현은, 직접 접촉에 의하거나 또는 임의의 기타 수단에 의하거나에 상관없이, 평가될 작용제 및 피부 대체물의 한 부분 이상 사이의 상호 작용의 유도라는 사실을 의미하는 것으로 의도된다.
본 발명은 특히 색소화를 조정할 수 있는 작용제에 대한 선별 방법에 관한 것으로서, 상기 작용제는 특히 화학적 합성에 의하거나 또는 식물 또는 세균/효모 기원의 출발 재료로부터의 추출에 의해 수득되는 화합물, 또는 화합물들의 혼합물인 것이 가능하다. 상기 방법은 특히 미용 분야에 사용되는 활성제의 선별 및 동정에 사용될 것이다. 따라서, 작용제는 표피, 진피 또는 이음부 구획에 영향을 줄 수 있는 임의의 분자, 성장 인자, 레티노산 유도체, 호르몬 또는 식물 추출물일 수 있다. 조정자는 siRNA 또는 안타고미르 (antagomir) 일 수 있다.
상기 방법은 약학 분야, 특히 피부과학에서 사용되는 활성제의 색소화 조정의 평가에 사용될 수 있다.
또다른 양태에 따르면, 본 발명에 따른 방법은, 색소화-조정 작용제가 적용될 때, 관련되는 다양한 인자의 변경의 평가를 가능하게 할 것이다.
"색소화 조정" 이란 용어는, 본 발명에 따르면, 피부의 구성적 또는 유도적 색소화의 수준을 직접적으로 또는 간접적으로 증가시키거나, 또는 감소시키거나 또는 억제함으로써 변경시키는 것을 의미하는 것으로 의도된다.
본 발명에 따른 방법에서, 대조군 피부 대체물은 평가될 작용제가 적용된피부 대체물의 조건과 동일한 조건 하에서 제조 및 저장될 것이고, 색소화의 측정은 평가될 작용제가 적용된 것과 대조군 피부 대체물 상에서 동일한 시기에 수행될 것이다.
한 구현예에 따르면, 평가될 작용제는 피부 대체물의 한 부분 이상과의 직접 접촉에 의해 적용된다. 또다른 구현예에 따르면, 작용제는 또한 상기 피부 대체물의 배양 매질 중에서 적용할 수 있고, 또는 심지어 피부 대체물의 구성체 중 하나와 작용제의 간접적 상호 작용을 일으킬 수단을 이용해 적용할 수 있다. 피부 대체물로의 작용제 적용의 비제한적 대안적 방법으로서, 특히 주사, 메조테라피 또는 이온삼투요법이 언급될 수 있다.
평가될 작용제는 특히 색소분비성 장애, 예컨대 검버섯 (광선 흑색점) 으로부터 비롯되는 적어도 섬유모세포 및/또는 각질형성세포 및/또는 멜라닌형성세포를 포함하는 피부 대체물에 적용될 수 있다.
상기 방법의 구현예 중 하나에 따르면, 평가될 작용제가 색소화-억제제이고, 이의 탈색소 및/또는 항색소화 활성도는 측정하기에 바람직하다. 상기 방법은 특히 색소분비성 점 및/또는 기타 색소분비성 장애의 방지, 감속 또는 감소용 제품의 효과의 평가를 가능하게 한다.
이의 양태 중 하나에 따르면, 상기 방법은 탈색소 작용제의 평가, 즉 구성적 또는 유도적 색소화를 감소시키는 상기 작용제의 능력의 평가를 가능하게 한다.
또다른 양태에 따르면, 상기 방법은 항색소화 작용제의 평가, 즉 유도적 색소화를 방지 및/또는 감소시키는 상기 작용제의 능력을 시험하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 평가될 제품이 상기 본문에 기술된 바와 같은 병적 모델, 예를 들어 과색소화 또는 저색소화된 장애, 예컨대 백반증, 멜라닌종, 모반, 광선 흑색점, 기미, 등의 병적 모델 (상기 병상으로부터 단리되거나 또는 유전자 조작 (침묵, 과도발현, 등) 된 세포 (멜라닌형성세포뿐 아니라 각질형성세포 또는 섬유모세포) 를 이용) 에 적용될 것이다.
본 발명에 따른 방법의 또다른 구현예에 따르면, 평가될 작용제는, 단독으로 또는 UV 복사와 조합으로, 색소화를 촉진하는 작용제이다.
한 특정 구현예에 따르면, 피부 대체물에 또한 UV 복사가 가해지는데, UV 복사는 평가될 작용제의 적용 이전, 이와 동시 및/또는 이후에 적용되거나, 또는 대조군 피부 대체물에 대한 것과 동등한 기간 동안 적용된다.
본 발명에 따른 방법은 특히 일광차단제의 평가에 사용될 것이다.
본 발명은 또한 색소화-조정 작용제의 광보호력 (photoprotective power) 의 평가를 가능하게 한다. 이는, 작용제의 색소화 자극 또는 억제 이전 또는 이후의 UV 노광에 의해 유도된 손상 수준을, 특히 일광화상 세포의 형성, DNA 손상, 산화성 스트레스 등에 관하여 비교하는 것을 포함할 것이다.
앞서 나타낸 바와 같이, 피부 대체물은 구조적 색소화를 나타내는데, 색소화 는 또한 예비색소화 작용제 및/또는 UV 복사로의 노출에 의해 증가될 것이다.
특히, 생리적 조건 하의 개별 인간 피부에, 일일 또는 천정 복사에 대해 등량인 UV 복사 자극이 가해지면, 본 발명에 따른 모델의 섬유모세포는 색소화 및/또는 이의 조정에 참여하는 사이토용해성 인자 예컨대 사이토킨 또는 성장 인자를 생성한다.
더욱이, 기저층 내 멜라닌형성세포의 수는 UV 자극 이후 증가하는데, 특히 1.5 배 이상 증가하고, 상기 멜라닌형성세포의 형태가 변경된다: 이들은 수상돌기의 증가 및 또한 이의 확대를 통해 수지상에서 현저한 증가를 보인다; 멜라닌의 양 또한 증가하는데, 표피층으로의 이송 증가를 통해 1.5 배 이상 증가한다.
색소화에서의 증가는 피부 휘도의 변화를 측정하거나 또는 멜라닌을 정량화하는 임의의 기타 방법에 의해, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피 HPLC 측정에 의해, 솔루엔 또는 수산화나트륨을 이용한 피부의 용해 후 가시광선 분광법에 의해, 폰타나-메이슨을 이용한 멜라닌의 염색 후 화상 분석에 의해, 또는 동일초점 및 다광자 화상에 의해 평가한다.
본 발명에 따른 방법은 멜라닌형성세포에 직접적으로 작용하고/하거나 각질형성세포에 간접적으로 작용할 수 있고, 결국 멜라닌형성세포 (멜라닌생성, 또는 멜라닌형성세포 증식 또는 응착에 대한 작용) 를 활성화시키는 UV 복사의, 색소화에 대한 효과의 평가를 가능하게 한다.
이는 또한 하기와 같이 작용할 수 있는 UV 복사의 색소화에 대한 영향력의 평가를, 유례 없이, 가능하게 한다:
Figure 112009015796629-PAT00001
섬유모세포, 세포외 매트릭스 단백질 및 진피-표피 이음부의 요소에 대해 작용. 이에 따라, 이들 유도 인자 또는 변경은 멜라닌형성세포를 직접적으로 자극하고/하거나 각질형성세포를 간접적으로 자극할 수 있고, 결국 멜라닌형성세포를 자극할 것임;
Figure 112009015796629-PAT00002
각질형성세포에 작용, 이는 결국 섬유모세포, 세포외 매트릭스 단백질, 및 진피-표피 이음부 요소, 및 결과적으로 색소화를 조정할 것임.
이는 또한 구조적 색소화 또는 태양광에 의해 유도되는 색소화 (썬텐) 를 방해하며 하기를 국소적으로 또는 전신적으로 감속, 억제 또는 자극하는 생성물 또는 분자의 시험을 가능하게 한다:
- 탈색소 작용제, 항색소화 작용제
- 예비색소화 작용제 (색소화 단독 또는 UV 복사로 인한 색소화의 활성화제).
본 발명에 따른 평가 방법의 한 변형예에 따르면, 또다른 측정군은 색소화-촉진 활성도 또는, 반대로, 색소화-억제 활성도에 대하여 알려진 기준 생성물을 이용해 수행한다.
이 변형예에서, 평가될 작용제가 적용된 시험관내 피부 대체물의 색소화 (i) 는 또한 색소화-촉진 또는 색소화-억제 기준 물질이 적용된 피부 대체물의 색소화 (iii) 와 비교된다.
예를 들어, 색소화-촉진제의 경우, 색소화가 기준 물질에서 관찰되는 것보다 적어도 그 이상인 작용제를 보유하도록 선택하는 것이 가능하다. 반대로, 탈색 소 작용제의 경우, 색소화가 기준 물질에서 얻어지는 것 이하인 작용제를 보유하도록 하는 것이 가능할 것이다.
한편으로는, 평가될 작용제가 적용된 피부 대체물 및 대조군 피부 대체물 (i)-(ii), 및 다른 한편으로는, 기준 물질이 적용된 피부 대체물 및 대조군 피부 대체물 (iii)-(ii) 의 사이에서 측정된 색소화에서의 변화를 비교하는 것이 또한 가능할 것이다; 선택된 작용제는 색소화의 조정이 기준 물질에 대하여 측정된 것보다 적어도 그 이상인 것들일 것이다.
한 특정 구현예에 따르면, 시험관내 피부 대체물은 적어도 각질형성세포, 멜라닌형성세포 및/또는 섬유모세포를 포함하는데, 이는 shRNA 를 이용한 발현 또는 siRNA 기술에 따라, dsRNA 를 이용 또는 점 돌연변이유발 (site-directed mutagenesis) 을 통한 유전자 켄칭에 의해, cDNA 가, 특히 과도 발현에 의해, 유전자 조작을 받은 것이다.
또다른 구현예에 따르면, 진피 대체물은 세포외 매트릭스 대체물을 포함하며, 상기 세포외 매트릭스 대체물의 구성체는 적어도 콜라겐 유형 I 를 포함하고, 상기 구성체는 건강한 어린이 피부로부터의 세포외 매트릭스 대체물과 비교하여 하나 이상의 변형을 경험한 것이다. 이는, 예를 들어, 진피 대체물을 구성하고 있는 거대 분자의 성질, 양 또는 비율의 변형, 및/또는 화학적 변형을 포함할 수 있다. 진피 대체물의 조성, 및/또는 존재하는 특히 콜라겐 IV, 라미닌, 엔탁틴, 섬유결합소, 프로테오글라이칸, 글라이코스아미노글라이칸 및/또는 히알루론산의 비율은 따라서 통상 사용되는 상기 본문에서 지시된 바와 같은 농도를 넘어서 다양할 수 있다. 세포외 매트릭스 대체물의 구성체는 특히 글리케이션 (glycation), 가교 및 산화로부터 선택되는 화학적 변형을 경험한 것일 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 모든 각도에서 멜라닌생성 제어 경로를 이해하는 것을 가능케 한다. 이는 멜라닌형성세포 상에서의 직접적 활성도에 의해 반영될뿐 아니라 각질형성세포, 섬유모세포, 전체 3차원 컨텍스트 및 미세환경의 영향에 의해 매개되는 (예비색소화 또는 항색소화) 활성도에 의해 반영될 수 있다.
이는 또한 하기와 같이 작용할 수 있는 작용제의 색소화에 대한 영향력의 평가를 가능케 한다:
Figure 112009015796629-PAT00003
섬유모세포, 세포외 매트릭스의 단백질, 및 진피-표피 이음부의 요소에 대해 작용. 이에 따라, 이들 유도 인자 또는 변형은 멜라닌형성세포를 직접적으로 자극하고/하거나 각질형성세포를 간접적으로 자극할 수 있고, 결국 멜라닌형성세포를 자극할 것임;
Figure 112009015796629-PAT00004
각질형성세포에 작용, 이는 결국 섬유모세포, 세포외 매트릭스의 단백질, 및 진피-표피 이음부 요소, 및 결과적으로 색소화를 조정할 것임.
따라서, 상기 방법은 하기에 유용할 수 있다:
Figure 112009015796629-PAT00005
과색소화 또는 저색소화된 장애, 예컨대 백반증, 멜라닌종, 모반, 광선 흑색점, 기미, 등으로부터 유래된 세포 (상기 병상으로부터 단리되거나 또는 유전자 조작 (침묵, 과도발현, 등) 된 세포 (멜라닌형성세포뿐 아니라 각질형성세포 또는 섬유모세포) 를 이용) 의 색소화에 대한 영향력 시험;
Figure 112009015796629-PAT00006
색소화에 대한 각질형성세포 또는 섬유모세포 손상 (병적 각질형성세포 또는 섬유모세포) 의 영향력 연구;
Figure 112009015796629-PAT00007
색소화 (글리케이션, 다리화 (가교)), 세포외 매트릭스의 거대분자의 산화, 또는 거대분자의 성질, 양 및 비율의 변화에 대한 세포외 매트릭스의 손상의 영향력 연구.
본 발명은 또한 진피 지지체, 멜라닌형성세포 및 각질형성세포, 및 또한 상기 매질를 포함하는 재건 피부의 제조용 키트에 관한 것이다.
본 발명은 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명될 것이다. 이들 실시예에서는 첨부된 도를 참고할 것이다.
실시예 1: 피부 대체물의 제조
격자의 제조 (D-4)
진피 대체물을 소 콜라겐 I 및 진피 유래의 인간 섬유모세포로부터 제조했다.
진피 대체물을 Asselineau 등, 1985 (Exp Cell Res. vol. 159, 536-539) 및 Bernerd 및 Asselineau 1997 (Dev Biol, vol. 183, 123-138) 에 의해 기재된 기술에 따라 소 콜라겐 I 및 진피 유래의 인간 섬유모세포로부터 제조했다. 10% 의 혈청을 포함하는 MEM 으로 페트리 접시를 예비코팅했다.
세포를 포함하고 있는 콜라겐 제제를 붓기 전, 라미닌 (3%/최종 부피), 콜라겐 IV (1.5%/최종 부피) 및 엔탁틴 (0.35%/최종 부피) 의 용액을 혼합물에 첨가하고, 격렬하게 교반했다. 이 현탁액을 인큐베이터 (37 ℃-5% CO2) 에 두고, 격자 가 수축하도록 했다.
각질형성세포 및 멜라닌형성세포의 파종 (D0)
격자의 수축 후 각질형성세포 및 멜라닌형성세포를 진피 대체물 상에 파종했다.
이를 위하여, 세포를 파종 전 7 일 동안 이들의 각각의 성장 매질 내에서 증식시켰다:
멜라닌형성세포는 임의의 포르볼 에스테르의 부재 하에서 멜라닌형성세포에 대한 배양 매질, M2 매질 (Promocell) 중에서 증식시켰다.
각질형성세포를 3T3 섬유모세포로 구성되는 공급기 지지체 상에서의 배양에 의해 문헌 [Rheinwald 및 Green, Cell, vol. 6, 331-344, 1975] 의 기술에 따라 증식시켰다.
진피 대체물 상으로의 각질형성세포 및 멜라닌형성세포의 파종을 위하여, 우선 격자를 콜라겐-기재 제제 (두 격자에 대하여, 0.46 ml 의 1.76X MEM + 0.09 ml 의 FCS + 0.05 ml 의 0.1N NaOH + 0.1 ml 의 MEM Hepes 10% FCS + 0.3 ml 의 투석된 콜라겐) 를 이용하여 접시의 바닥에 부착시켰다.
멜라닌형성세포 및 각질형성세포를 트립신처리하고, 세포 현탁액을 200,000 세포/ml 의 농도로 조정했는데, 각각 (매질 포함) 은 MEM 10% FCS + 2 mM L-글루타민 + 1 mM 나트륨 피루베이트 + 1X 비필수 아미노산 + 0.2% 페니실린/스트렙토마이신 + 0.1% 항진균 항생제 + 10 ng/ml EGF, 10-10 M 콜레라 독소 + 0.4 μg/ml 하이 드로코르티손 + 0.625 μl/ml 의 보충 혼합물 (Promocell) = PRP 매질로 구성되었다.
멜라닌형성세포 및 각질형성세포의 혼합 현탁액을 0.25 ml 의 각질형성세포 현탁액 및 0.25 ml 의 멜라닌형성세포 현탁액으로 제조했다. 이에 따라 50,000 각질형성세포 및 50,000 멜라닌형성세포를 포함하는 최종 현탁액을, 부착된 격자 상에 위치한 고리 (지름: 14 mm) 의 내부에 침적시켰다. 6 ml 의 PRP 매질을 고리 주위에 첨가했다.
접시는 37 ℃-5% CO2 의 인큐베이터 내에 두었다. 2 시간 후, 고리를 제거했다. 동일한 배양 매질로 2 일 후에 새로 교체했다.
파종 4 일 후, PRP 매질의 EGF (10 ng/ml) 를 KGF (10 ng/ml) 로 교체했다.
색소화된 재건 피부의 노출-배양 (D7)
침지-배양의 7 일 후, 피부를 스크린 (공기-액체 계면) 상으로 노출 (emersion) 시켰다. 매질을 2 일마다 교체했다.
노출 7 일 후, 정상 인간 피부에 매우 근접한 형태를 나타내는 피부를 제거하고 분석할 준비를 하거나 또는 매질을 2 일 마다 교환하면서 다양한 실험에 대하여 더 긴 기간 동안 배양을 유지할 수 있었다.
실시예 2: 멜라닌형성세포, 각질형성세포 및 섬유모세포의 세 가지 세포 유형을 포함하는 색소화된 재건 인간 피부 (도 1)
노출 7 일 후, 피부는 인간 피부에 근접한 조직구조 및 3차원 구조를 나타냈 다.
다양한 세포층 (기저, 가시-세포, 과립형) 및 뿔형층으로 만들어진 층상화 및 분화 표피를 가졌다.
진피는 콜라겐 매트릭스에 포매된 생 섬유모세포를 포함했다 (도 1A).
멜라닌형성세포를 표피에 통합시켰는데, 이는 정상 피부와 유사한 형태 및 밀도를 나타냈다 (도 1C, 분리 표피에 대한 DOPA 반응). 이들은 명확히 기저층에 국소화되고 (도 1B, TRP1 면역표지, 백색 점선은 진피-표피 이음부를 나타냄), 멜라노솜 및 멜라닌을 생성하고, 이들은 이웃의 각질형성세포로 이송된다 (도 1D, 폰타나-메이슨을 이용한 멜라닌의 염색).
실시예 3: 멜라닌형성세포 유형과 연관된 구조적 색소화를 갖는 색소화된 재건 인간 피부 (도 2)
모델은 가장 덜 색소화된 것으로부터 가장 색소화된 것까지 다양한 멜라닌형성세포 세포주를 통합시킬 수 있고 (온전한 모델), 다소 색소화된 재건 피부의 표현형은 사용된 멜라닌형성세포 유형 (생리기능 유지) 에 상응한다: 사실상, 멜라닌형성세포 세포주가 더욱 착색될 수록 (M03 으로부터 M504 까지), 피부의 거시적 색상이 더욱 강해지고, 절편 상에서 볼 수 있는 멜라닌의 양이 많아진다. 이러한 거시적 색소화는 휘도의 감소에 의해 반영된다 (도 2, 휘도).
실시예 4: 색소화된 재건 피부에서의 UV 복사에 의한 색소화의 유도 (도 3)
노출 7 일째부터 재건 피부에 태양 UV 복사를 가하여, 색소화를 유도했다. 태양 시뮬레이터를 사용했다: 이는 태양에서와 유사한 스펙트럼을 갖는 UVB 복사 및 UVA 복사를 전달했다 (UVB/UVA 비율: 14). 2 일에 1 회씩 총 3 회 피부에 UVB 복사를 가했다. 최종 노광 48 시간 후, 피부를 제거했다. 대조군 조건은 태양 시뮬레이터로의 노광이 없이 수행했다.
UV 복사가 가해진 피부에 멜라닌형성세포가 여전히 존재했고, 명백히 기저층에 위치했다 (도 3, TRP1 면역표지. 백색 점선은 진피-표피 이음부를 나타냄). 이들은 UV 복사에 의해 활성화되었다: 노광되지 않은 피부보다 더 많고 (도 3, 멜라닌형성세포 밀도 그래프), 더욱 수지상이고, 더욱 도파-반응-반응성이다. 대조군 피부와 비교하여 노광된 피부에서의 폰타나-메이슨 염색 후의 멜라닌의 양의 증가를 측정했다 (×1.8)(도 3, 멜라닌의 양). UV 복사에 의한 색소화의 이러한 자극은 휘도 (L*) 를 측정함으로써 정량화했다: 휘도의 감소 (△L = 4.38) 는 UV-노광 피부가 노광되지 않은 피부에 비해 더욱 어둡다는 것을 나타낸다 (도 3, 휘도).
실시예 5: 색소화된 재건 피부에서의 예비색소화 작용제로 인한 색소화의 유도 (도 4)
노출상으로부터 출발한 매질 중에 50 nM 의 농도로 배치된 공지된 예비색소화 작용제 αMSH 의 존재 하에서, 18 일 후 취해진 피부는 거시적으로 더욱 착색되어 있었다. 휘도 측정은 이러한 갈변을 확인시켜 주었다: 처리되지 않은 피부 및 αMSH 로 처리된 피부 사이에서 6.7 점 감소했다 (도 4, 휘도).
aMSH의 존재 하에서 멜라닌형성세포는 더욱 수지상이었고, 폰타나-메이슨 표지에 의해 볼 수 있는 멜라닌을 더욱 더 많이 생성시켰다 (도 4, 폰타나-메이슨 염 색).
도 1: 색소화된 재건 인간 피부.
도 2: 멜라닌형성세포의 유형과 관련된 구조적 색소화를 갖는 색소화된 재건 인간 피부.
도 3: 색소화된 재건 피부에서의 UV 복사로 인한 색소화의 유도.
도 4: 색소화된 재건 피부에서의 알파-MSH 로 인한 색소화의 유도.

Claims (19)

  1. 하나 이상의 기저층 및 하나 이상의 표면층을 형성하는 각질형성세포를 포함하는 하나 이상의 표피 대체물 및 하나 이상의 진피 대체물을 포함하는 시험관내 피부 대체물로서, 상기 피부 대체물은 멜라닌을 구조적으로 생성하는 멜라닌형성세포 및 생 섬유모세포를 포함하고, 모든 멜라닌형성세포는 표피 대체물의 기저층에 있는 것을 특징으로 하는 시험관내 피부 대체물.
  2. 제 1 항에 있어서, 진피 대체물에서, 진피 대체물의 표면에 대하여 길이 방향으로 배향된 섬유모세포의 백분율이 50% 미만인 것을 특징으로 하는 시험관내 피부 대체물.
  3. 제 1 항에 있어서, 진피 대체물이, 섬유모세포가 분포되어 있는 콜라겐 유형 I 의 매트릭스를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 시험관내 피부 대체물.
  4. 제 1 항에 있어서, 멜라닌형성세포가 인간 피부 기원의 멜라닌형성세포인 시험관내 피부 대체물.
  5. 제 1 항에 있어서, 이의 색소화가 예비색소화 (propigmenting) 작용제 및/또는 UV 복사로의 노광에 의해 증가되는 것을 특징으로 하는 시험관내 피부 대체물.
  6. 제 1 항에 따른 피부 대체물을 제조하는 방법으로서, 하기 단계 a), b), c) 를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 섬유모세포 및 콜라겐 용액을 접촉시킨 후, 진피 대체물을 구성하는 수축된 콜라겐 매트릭스 (여기에 섬유모세포가 분포되어 있음) 를 수득하기에 충분한 기간 동안 인큐베이션하는 단계.
    b) 상기 a) 에서 수득된 진피 대체물에 각질형성세포 및 멜라닌형성세포의 혼합물을 파종하고, 액체 매질 중에서 침지 배양하는 단계,
    c) 상기 b) 에서 수득된 진피 대체물 상에서의 각질형성세포 및 멜라닌형성세포의 배양액을 노출시키고, 피부 대체물을 구성하고 있는 콜라겐 매트릭스 중에 섬유모세포를 포함하는 진피 대체물 상에서, 멜라닌형성세포를 포함하는 다중층상화 표피 대체물이 수득될 때까지 공기-액체 계면에서 배양을 계속하는 단계.
  7. 제 6 항에 있어서, 멜라닌형성세포가 성인 피부로부터 수득되어 사전에 증식되는 인간 멜라닌형성세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 각질형성세포 및 섬유모세포가 성인 인간 피부로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 6 항에 있어서, 단계 a) 가 콜라겐 IV, 라미닌 및/또는 엔탁틴의 존재 하 에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 색소화를 조정하는 작용제의 능력을 평가하는 방법으로서, 하기를 특징으로 하는 방법:
    (a) 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 시험관내 피부 대체물, 또는 제 6 항 내제 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 피부 대체물에 상기 작용제를 적용함,
    (b) 평가될 작용제가 적용된 시험관내 피부 대체물의 색소화 (i) 와 작용제가 적용되지 않은 대조군 피부 대체물의 색소화 (ii) 를 비교함.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 작용제가 상기 피부 대체물의 한 부분 이상과의 직접 접촉에 의해 피부 대체물에 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 피부 대체물이 색소분비성 장애 기원의 적어도 섬유모세포 및/또는 각질형성세포 및/또는 멜라닌형성세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 평가 방법.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 작용제가 색소화-억제제인 것을 특징으로 하는 평가 방법.
  14. 제 10 항에 있어서, 평가될 작용제가 과색소화를 나타내는 피부 대체물의 영역에 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 10 항에 있어서, 상기 평가될 작용제가 색소화-촉진제인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 10 항에 있어서, 피부 대체물이 또한 UV 복사로의 노광에 적용되며, UV 복사는 평가될 작용제의 적용 이전, 이와 동시 및/또는 이후에 적용되거나, 또는 대조군 피부 대체물에 대한 것과 동등한 기간 동안 적용되는 것을 특징으로 하는 평가 방법.
  17. 제 10 항에 있어서, 평가될 작용제가 적용된 시험관내 피부 대체물의 색소화 (i) 를 또한 색소화-촉진 또는 색소화-억제 기준 물질이 적용된 피부 대체물의 색소화 (iii) 와 비교하는 것을 특징으로 하는 평가 방법.
  18. 제 10 항에 있어서, 평가될 작용제가 각질형성세포, 섬유모세포, 세포외 매트릭스의 구성체 및/또는 진피-표피 이음부에 대한 작용을 통해 적어도 부분적으로 색소화를 조정하는 것을 특징으로 하는 평가 방법.
  19. 제 16 항에 있어서, 평가될 작용제가 하나 이상의 일광차단제를 포함하는 것 을 특징으로 하는 평가 방법.
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