KR20090009204A - 길항제 항-ｃｄ40 항체 제약 조성물 - Google Patents

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Abstract

치료적 또는 예방적 활성 성분으로서 길항제 항-CD40 항체를 포함하는 안정한 액체 제약 조성물 및 이들의 제조에 유용한 방법이 제공된다. 이들 조성물은 길항제 항-CD40 항체, 조성물의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0으로 유지하기 위한 완충제, 및 액체 조성물을 거의 등장성으로 만들기에 충분한 양의 아르기닌-HCl을 포함한다. 본 발명의 안정한 액체 길항제 항-CD40 항체-함유 제약 조성물은 증식성 질환 및 자가면역 및/또는 염증 성분을 갖는 질환을 치료하는 방법에서 유용하다.
Figure 112008073008134-PCT00015
액체 조성물, 길항제, 항-CD40 항체, 아르기닌, 완충액, 시트레이트, 자가면역 질환, 염증 질환, 증식성 질환, 치료

Description

길항제 항-ＣＤ40 항체 제약 조성물{ANTAGONIST ANTI-CD40 ANTIBODY PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS}
본 발명은 제약 제제의 분야에 관한 것이며, 더 구체적으로 증식성 질환 및 자가면역 또는 염증 성분을 갖는 질환의 치료에서 사용하기 위한 길항제 항-CD40 항체를 포함하는 안정한 액체 제약 조성물에 관한 것이다.
유전조작 기술의 개발에 있어 최근의 진보는 다양한 생물학적 활성 폴리펩티드를 약물로서 사용할 수 있을 만큼 충분히 다량으로 제공하였다. 그러나, 폴리펩티드는 변성 및 가용성 응집물과 불용성 응집물의 형성을 비롯한 물리적 불안정성, 그리고 가수분해, 산화 및 탈아미드화 같은 다양한 화학적 불안정성의 결과로서 생물학적 활성을 잃을 수 있다. 액체 제약 제제 중에서 폴리펩티드의 안정성은, 예를 들어 pH, 이온강도, 온도, 반복되는 냉동-해동 주기, 및 가공처리 동안 일어나는 것 같은 기계적 전단력에의 노출 등의 요인들에 의해 영향받을 수 있다. 또한, 응집물 형성 및 생물학적 활성의 상실은 물리적 흔들림 및 용액 중에서 그리고 저장 바이알 내의 액체-공기 계면에서 일어나는 폴리펩티드 분자들의 상호작용의 결과로서 일어날 수 있다. 더 나아가, 수송 동안의 흔들림이나 다른 원인으로 인한 계면의 축소-확장 동안 공기-액체 및 고체-액체 계면에 흡착되는 폴리펩티드에서는 입체형태적 변화가 일어날 수 있다. 이러한 흔들림은 단백질을 뒤얽히게 하고, 응집시키고, 입자를 형성하고, 궁극적으로는 다른 흡착된 단백질과 함께 침전시킬 수 있다. 단백질 제약의 안정성에 대한 일반적 고찰을 위해서는, 예를 들어 Manning et al. (1989) Pharm. Res. 6:903-918, 및 Wang and Hanson (1988) J. Parenteral Sci. Tech. 42:S14를 참조한다.
폴리펩티드-함유 액체 제약 제제의 불안정성은 이들 제제를 복원을 위한 적합한 액체 매질과 함께 동결건조 형태로 패키지함으로써 촉진되었다. 동결건조는 조성물의 저장 안정성을 개선하지만, 건조 상태로 저장되는 동안이나(Pikal (1990) Biopharm. 27:26-30), 또는 액체 제제로서 복원시 응집물 형성이나 촉매 활성의 상실로 인해(예를 들어, Carpenter et al. (1991) Develop. Biol. Standard 74:225-239; Broadhead et al.(1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 75:1169-1206; Mumenthaler et al.(1994) Pharm. Res. 11:12-20; Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25: 459-470; 및 Roser (1991) Biopharm. 4:47-53 참조) 많은 폴리펩티드가 감소된 활성을 나타낸다. 첨가제의 사용이 건조 단백질의 안정성을 개선하였지만, 많은 재수화된 제제는 여전히 허용되지 않거나 바람직하지 않은 양의 불활성 응집 단백질을 가졌다(예를 들어, Townsend and DeLuca (1983) J. Pharm. Sci. 80:63-66; Hora et al. (1992) Pharm. Res. 9:33-36; Yoshiaka et al. (1993) Pharm. Res, 70:687-691 참조). 또한, 복원의 필요는 불편한 일인 동시에 투약량이 부정확할 가능성을 도입한다.
제약학적으로 유용한 폴리펩티드는 재조합적으로 생산된 모노클로날 항체를 포함한다. 이 부류의 치료제 중에서도, TNF 과의 수용체 구성원 CD40를 표적으로 하는 길항제 항-CD40 항체가 B-세포 관련 악성질환 및 비-혈액성 악성질환뿐만 아니라 자가면역 및/또는 염증 성분을 갖는 질환의 치료에 대단히 유망하다. CD40 수용체는 정상 및 신생물성 인간 B 세포, 수지상 세포, 단핵구, 대식세포, CD8+ T 세포, 내피세포, 단핵구 상피세포, 일부 상피암종, 그리고 폐암, 유방암, 난소암, 방광암 및 결장암을 비롯한 많은 고상 종양의 표면에서 나타나는 50-55 kDa 세포-표면 항원이다. 또한, CD40 항원은 활성화 T 세포, 활성화 혈소판, 염증 혈관 평활근 세포, 호산구, 류마티스 관절염에서 윤활막, 진피 섬유아세포, 및 기타 비-림프양 세포 타입 상에도 발현된다. CD40을 발현하는 세포의 타입에 따라서, 리게이션은 세포간 유착, 분화, 활성화, 및 증식을 유도할 수 있다.
예를 들어, CD40과 그 동족 리간드 CD40L(CD154로도 명명됨)의 결합은 B 세포의 증식과 혈장 세포로의 분화, 항체 생산, 이소타입 전환, 및 B 세포 기억 생성을 자극한다. CD40은 B 세포의 분화 동안 전구-B 세포 상에 발현되지만 혈장 세포로의 분화시에 상실된다. APC 상에서 CD40의 발현은 이들 세포의 활성화에 있어서 중요한 공-자극 역할을 한다. 예를 들어, 작동성 항-CD40 모노클로날 항체(mAb)들은 B 세포 활성화에 있어서 T 헬퍼 세포의 효과를 의태하는 것으로 나타났다. FcγRII를 발현하는 유착 세포 상에 나타났을 때 이들 항체는 B 세포 증식을 유도한다(Banchereau et al. (1989) Science 251:70). 또한, 작동성 항-CD40 mAb는 IL-4의 존재하에 IgM, IgG 및 IgE의 분비를 위한 T 헬퍼 신호를 대신할 수 있다(Gascan et al. (199I) J. Immunol. 147:8). 더욱이, 작동성 항-CD40 mAb는 림프절에서 분 리된 B 세포의 프로그램된 세포사(아폽토시스)를 방지할 수 있다.
이들 및 다른 관찰 결과들은 CD40과 CD40L의 상호작용이 체액 및 세포-매개 면역반응의 조절에 있어서 중추적 역할을 한다는 현재의 이론을 뒷받침한다. 더욱 최근의 연구들은 여러 생리학적 및 병리학적 과정에서 CD40/CD40L 상호작용의 훨씬 광범한 역할을 밝혀내었다.
따라서, CD40L에 의한 CD40의 연계와 그에 따른 CD40 신호화의 활성화는 정상적인 면역반응을 위한 필수적인 단계이다; 그러나, CD40 신호화의 조절장애는 질환을 초래할 수 있다. CD40 신호화 경로는 자가면역 질환에 연루되는 것으로 나타났다(Ichikawa et al. (2002) J. Immunol. 169:2781-2787 및 Moore et al. (2002) J. Autoimmun. 19:139-145 참조). 추가하여, CD40/CD40L 상호작용은 염증 과정에서도 중요한 역할을 한다. 예를 들어, CD40와 CD40L은 양자 모두 인간 및 실험용 죽상경화증 병소에서 과발현된다. CD40 자극은 내피세포, 평활근 세포, 및 대식세포 같은 죽종-유관 세포 타입에서 바탕질-변성 효소의 발현 및 조직인자 발현을 유도한다. 더 나아가, CD40의 자극은 IL-1, IL-6 및 IL-8 같은 전염증성 사이토카인의 생산과 ICAM-1, E-셀렉틴 및 VCAM의 생산을 유도한다. CD40/CD40L 상호작용의 억제는 동물 모델에서 죽종발생을 방지한다. 이식조직 모델에서 CD40/CD40L 상호작용의 차단은 염증을 방지한다. CD40/CD40L 결합은 알츠하이머 아밀로이드-베타 펩티드와 함께 상조적으로 작용하여 소교세포 활성화를 촉진하고, 이로써 신경독성을 초래하는 것으로 나타났다. 류마티스 관절염(RA) 환자에서는 관절 연골세포 상에서 CD40 발현이 증가되며, 이로써 CD40 신호화가 손상 사이토카인 및 바탕질 메 탈로프로테이나제의 생산에 기여하는 것 같다. Gotoh et al.(2004) J. Rheumatol. 31:1506-1512 참조.
유사하게, B 세포 계통의 종양 타입에서 유래하는 악성 B 세포가 CD40을 발현하는데, 이것은 생존 및 증식을 위한 CD40 신호화에 의존한다고 드러났다. 저등급 및 고등급 B 세포 림프종, B 세포 급성 림프모구 백혈병, 다발성 골수종, 만성 림프구성 백혈병, 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증, 및 호지킨병 환자로부터의 형질전환된 세포가 CD40을 발현한다. 또한, CD40 발현은 급성 골수모구 백혈병 증례의 2/3와 AIDS-관련 림프종의 50%에서 검출된다.
또한, 많은 암종 및 육종에서 CD40 발현이 높은 수준으로 나타나지만, 이들 암세포 상에서 CD40 발현과 관련된 CD40 신호화의 역할은 그다지 잘 이해되지 않고 있다. CD40-발현 암종은 방광암종(Paulie et al.(1989) J. Immunol. 142:590-595; Braesch-Andersen et al. (1989) J. Immunol. 142:562-567), 유방암종(Hirano et al.(1999) Blood 93:2999-3007; Wingett et al. (1998) Breast Cancer Res. Treat. 50:27-36), 전립선암(Rokhlin et al. (1997) Cancer Res. 57:1758-1768), 신장세포암종(Kluth et al. (1997) Cancer Res. 57:891-899), 미분화 비인두암종(UNPC)(Ag-athanggelou et al.(1995) Am. J. Pathol. 147:1152-1160), 편평세포암종(SCC)(Amo et al. (2000) Eur. J. Dermatol. 10:438-442; Posner et al. (1999) Clin. Cancer Res. 5:2261-2270), 갑상선 유두암종(Smith et al. (1999) Thyroid 9:749-755), 피부 악성 흑색종(van den Oord et al. (1996) Am. J. Pathol. 149:1953-1961), 위암종(Yamaguchi et al. (2003) Int. J. Oncol. 23(6):1697-702), 및 간암종(예를 들 어, Sugimoto et al. (1999) Hepatology 30(4):920-26 참조, 인간 간세포암종에 대해 논의)을 포함한다. CD40-발현 육종에 관해서는, 예를 들어 인간 골육종 및 유잉육종에 대해 논의하고 있는 Lollini et al. (1998) Clin. Cancer Res.4(8):1843-849을 참조한다.
다양한 암 및 자가면역/염증 질환에서 CD40L-매개 CD40 신호화를 조절하는데 있어서 길항제 항-CD40 항체의 잠재적인 치료적 이점과 이들 폴리펩티드 제조의 과제를 생각한다면, 이들 항체를 포함하는 안정한 제약 조성물이 필요하다.
발명의 간략한 개요
치료적 또는 예방적 활성 성분으로서 길항제 항-CD40 항체를 포함하는 안정한 액체 제약 조성물과 이들의 제조에 유용한 방법이 제공된다. 이 조성물은 길항제 항-CD40 항체, 조성물의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0으로 유지하기 위한 완충제, 및 액체 조성물을 거의 등장성으로 만드는 충분한 양의 아르기닌-HCl을 포함한다. 어떤 구체예에서, 완충제는 시트레이트/시트르산 버퍼이고, 길항제 항-CD40 항체는 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이며, 조성물은 등장제로서 아르기닌-HCl을 포함하고, 조성물은 더 나아가 추가 안정제로서 비이온성 계면활성제 및/또는 L-메티오닌을 포함한다. 본 발명의 안정한 액체 길항제 항-CD40 항체-함유 제약 조성물은 증식성 질환 및 자가면역 및/또는 염증 성분을 갖는 질환을 치료하는 방법에서 용도를 찾는다.
도면의 간단한 설명
도 1은 25℃에서 3개월 또는 5개월 동안 저장된 mAb CHIR-12.12 제제의 순도에 대한 버퍼 종들의 영향을 나타내며, SEC-HPLC 분석에 의해 측정한 것이다.
도 2는 25℃에서 3개월 또는 5개월 동안 저장된 여러 항체 제제 내에서 mAb CHIR-12.12의 응집물 형성에 대한 버퍼 종들의 영향을 나타내며, SEC-HPLC 분석에 의해 측정한 것이다.
도 3은 25℃에서 3개월 또는 5개월 동안 저장된 여러 항체 제제 내에서 mAb CHIR-12.12의 단편화에 대한 버퍼 종들의 영향을 나타내며, SEC-HPCL 분석에 의해 측정한 것이다.
도 4는 40℃에서 3개월 또는 5개월 동안 저장된 mAb CHIR-12.12 제제의 순도에 대한 버퍼 종들의 영향을 나타내며, SEC-HPLC 분석에 의해 측정한 것이다.
도 5는 40℃에서 3개월 또는 5개월 동안 저장된 여러 항체 제제 내에서 mAb CHIR-12.12의 응집물 형성에 대한 버퍼 종들의 영향을 나타내며, SEC-HPLC 분석에 의해 측정한 것이다.
도 6은 40℃에서 3개월 또는 5개월 동안 저장된 여러 항체 제제 내에서 mAb CHIR-12.12의 단편화에 대한 버퍼 종들의 영향을 나타내며, SEC-HPCL 분석에 의해 측정한 것이다.
도 7은 NaCl 또는 L-아르기닌-HCL을 등장제로 함유하는 제제에서 mAb CHIR-12.12에 대한 차등 주사 열량분석 써모그램을 나타낸다.
도 8은 25℃에서 2, 4, 또는 6개월 동안 저장되었을 때 NaCl 또는 L-아르기닌-HCl을 등장제로 함유하는 제제 중에서 잔류한 모노머 형태 mAb CHIR-12.12의 퍼센트를 나타내며, SEC-HPLC에 의해 측정한 것이다.
도 9는 25℃에서 2, 4, 또는 6개월 동안 저장되었을 때 NaCl 또는 L-아르기닌-HCl을 등장제로 함유하는 제제 중에서 mAb CHIR-12.12 응집물의 퍼센트를 나타내며, SEC-HPLC에 의해 측정한 것이다.
도 10은 25℃에서 2, 4, 또는 6개월 동안 저장되었을 때 NaCl 또는 L-아르기닌-HCl을 등장제로 함유하는 제제 중에서 mAb CHIR-12.12 단편의 퍼센트를 나타내며, SEC-HPLC에 의해 측정한 것이다.
도 11은 40℃에서 2 또는 4개월 동안 저장되었을 때 NaCl 또는 L-아르기닌-HCl을 등장제로 함유하는 제제 중에서 잔류한 모노머 형태 mAb CHIR-12.12의 퍼센트를 나타내며, SEC-HPLC에 의해 측정한 것이다.
도 12는 40℃에서 2 또는 4개월 동안 저장되었을 때 NaCl 또는 L-아르기닌-HCl을 등장제로 함유하는 제제 중에서 mAb CHIR-12.12 응집물의 퍼센트를 나타내며, SEC-HPLC에 의해 측정한 것이다.
도 13은 40℃에서 2 또는 4개월 동안 저장되었을 때 NaCl 또는 L-아르기닌-HCl을 등장제로 함유하는 제제 중에서 mAb CHIR-12.12 단편의 퍼센트를 나타내며, SEC-HPLC에 의해 측정한 것이다.
도 14는 25℃에서 2, 4, 또는 6개월 동안 저장되었을 때 NaCl 또는 L-아르기닌-HCl을 등장제로 함유하는 제제 중에서 mAb CHIR-12.12의 순도 퍼센트를 나타내며, CIEX-HPLC에 의해 측정한 것이다.
도 15는 25℃에서 2, 4, 또는 6개월 동안 저장되었을 때 NaCl 또는 L-아르기닌-HCl을 등장제로 함유하는 제제 중에서 mAb CHIR-12.12의 산성 변형체 퍼센트를 나타내며, CIEX-HPLC에 의해 측정한 것이다.
도 16은 25℃에서 2, 4, 또는 6개월 동안 저장되었을 때 NaCl 또는 L-아르기닌-HCl을 등장제로 함유하는 제제 중에서 mAb CHIR-12.12의 염기성 변형체 퍼센트를 나타내며, CIEX-HPLC에 의해 측정한 것이다.
발명의 상세한 설명
이제 본 발명을 본 발명의 일부 구체예들을 도시한 첨부된 도면을 참조하여 더욱 충분히 설명할 것이다. 사실, 본 발명은 많은 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 여기 제시된 구체예에 제한되지 않아야 한다; 오히려, 이들 구체예는 본 명세서가 적용되는 법률적 요건을 만족하도록 하기 위해 제공된다.
본원에 제시된 본 발명의 많은 변형 및 다른 구체예가 전술한 설명 및 관련 도면에 제시된 교시에 의하여 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 떠오를 것이다. 따라서, 본 발명이 개시된 특정 구체예에 제한되지 않으며, 변형 및 다른 구체예들도 첨부된 청구항의 범위 내에 포함된다는 것이 이해되어야 한다. 특정한 용어들이 본원에서 사용되었지만, 이들은 일반적이고 설명적인 의미로서만 사용되며 제한하려는 취지는 아니다.
본 발명은 치료적 또는 예방적 활성 성분으로서 하나 이상의 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하는 안정한 액체 제약 조성물, 및 이들의 제조에 유용한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 취지에 따르면, 제약 조성물 또는 제제와 관련하여 용어 "액체"는 용어 "수성"을 포함하는 의미이다. "치료적 또는 예방적 활성 성분"은 제약 조성물이 피험자에 투여되었을 때 피험자에서 질환 또는 상태의 치료, 예방, 또는 진단과 관련하여 원하는 치료적 또는 예방적 반응을 야기하도록 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이 조성물에 특정하게 조합된다는 의미이다.
"안정한"은 본 발명의 제약 조성물이 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편에 물리적 및/또는 화학적 안정성을 제공한다는 의미이다. 즉, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 본질적으로 그것의 물리적 및/또는 화학적 안정성을 보유하며, 바람직한 생물학적 활성, 즉 본원 다른 곳에서 정의된 길항제 활성들 중 한 가지 이상을 가지는데, 이들 활성은 제한은 아니지만, T 세포에 의해 자극되는 정상 인간 말초 B 세포에 의한 면역글로불린 분비의 억제; Jurkat T 세포에 의해 자극되는 정상 인간 말초 B 세포의 생존 및/또는 증식의 억제; CD40L-발현 세포 또는 가용성 CD40 리간드(sCD40L)에 의해 자극되는 정상 인간 말초 B 세포의 생존 및/또는 증식의 억제; sCD40L 또는 고상 CD40L에 의해 자극되는 어떤 세포에서 "생존" 항-아폽토틱 세포내 신호의 억제; sCD40L 또는 고상 CD40L과의 리게이션시 어떤 세포에서 CD40 신호전달의 억제; 인간 악성 B 세포 증식 억제; 제한은 아니지만, T 세포 및 B 세포를 비롯한 CD40-보유 표적 세포 또는 CD40 동족 리간드 보유 세포의 결실, 무반응 및/또는 내성 유도; CD4+CD25+ 조절 T 세포의 확장 또는 활성화 유도(예를 들어, donor alloantigen-specific tissue rejection via CD40-CD40L interference, van Maurik et al. (2002) J. Immunol. 169:5401-5404 참조); 어떤 메커니즘에 의한 세포독성(제한은 아니지만, 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), 보체-의존성 세포독성(CDC), 증식 하향-조절, 및/또는 표적 세포에서의 아폽토시스를 포함한다); 표적 세포 사이토카인 분비 및/또는 세포 표면 분자 발현의 조정; 및 이들의 조합을 포함한다.
단백질 안정성을 모니터하는 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, Jones (1993) Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90; Lee, ed.(1991) Peptide and Protein Drug Delivery (Marcel Dekker, Inc., New York, New York); 및 하기 개시된 안정성 분석평가법들을 참조한다. 단백질 안정성은 일반적으로 선택된 온도에서 특정된 기간 동안 측정된다. 바람직한 구체예에서, 안정한 항체 제약 조성물은 실온(약 25℃)에 저장되었을 때 1개월 이상, 3개월 이상, 또는 6개월 이상 동안 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편에 안정성을 제공하며, 및/또는 약 2-8℃에서 6개월 이상, 9개월 이상, 12개월 이상, 18개월 이상, 24개월 이상 동안 안정하다.
항체 같은 단백질은 제약 조성물로 조제되었을 때 그 제약 조성물 중에서 침전, 응집, 및/또는 변성의 가시적인 징후(즉, 변색 또는 투명성의 상실)나 측정가능한 징후(예를 들어, 크기-배제 크로마토그래피(SEC) 또는 UV 광 산란을 이용)가 나타나지 않는다면 주어진 시점에서 그것의 물리적 안정성을 보유한다고 간주된다. 화학적 안정성과 관련해서는, 항체 같은 단백질은 제약 조성물로 조제되었을 때 화학적 안정성의 측정에 의해 단백질(즉, 항체)이 그 제약 조성물에서 해당 생물학적 활성을 보유한다는 것이 시사된다면 주어진 시점에서 그것의 화학적 안정성을 보유한다고 간주된다. 화학적 안정성의 변화를 모니터하는 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있으며, 제한은 아니지만, 예를 들어 SDS-PAGE, SEC, 및/또는 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화/비행 시간 질량분광기를 이용하여 클리핑 등에 의한 단백질의 화학적 변형태를 검출하는 방법; 및 예를 들어 이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 분자 전하의 변화와 관련된 변성(예를 들어, 탈아미드화와 관련된 것)을 검출하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 하기 개시된 방법들을 참조한다.
길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 제약 조성물로 조제되었을 때, 바람직한 생물학적 활성에 대한 적합한 분석평가법에 의해 측정되었을 때, 주어진 시간에서 바람직한 생물학적 활성이 제약 조성물이 제조된 시간에서 나타난 바람직한 생물학적 활성의 약 30% 이내, 바람직하게는 약 20% 이내인 경우, 주어진 시점에서 바람직한 생물학적 활성을 보유한다고 간주된다. 본원에 개시된 길항제 항-CD40 항체, 및 그것의 항원-결합 단편의 바람직한 생물학적 활성을 측정하기 위한 분석은 2003년 11월 4일, 2003년 11월 26일, 및 2004년 4월 27일자 제출되어 미국특허출원 제60/517,337호(대리인 사건번호 No. PP20107.001(035784/258442)), 제60/525,579호(대리인 사건번호 No. PP20107.002(035784/271525)) 및 제60/565,710호(대리인 사건번호 No. PP20107.003(035784/277214))를 각각 배정받은 가 출원들 발명의 명칭 "길항제 항-CD40 모노클로날 항체 및 그 사용 방법"; 및 2004년 11월 4일자 제출되어 WO 2005/044854로 공개된 국제특허출원 제PCT/US2004/037152호(대리인 사건번호 No. PP20107.004(035784/282916)) 발명의 명칭 "길항제 항-CD40 모노클로날 항체 및 그 사용 방법"에 설명된 대로 수행될 수 있으며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 참고자료로 본원에 포함된다. 또, 2005년 12월 9일자 제출되어 미국특허출원 제60/749,285호(대리인 사건번호 No. PP028035.0002(035784/304312))를 배정받은 가 출원 발명의 명칭 "CD40 신호화에 의해 매개되는 증식성 장애의 진단 및 치료 방법", 및 2006년 5월 18일자 제출되어 WO 2006/125143로 공개된 대응 국제특허출원 제PCT/US2006/019414호; 그리고 2005년 12월 9일자 제출되어 미국특허출원 제60/749,336호(대리인 사건번호 No. PP028062.0002(035784/304311))를 배정받은 가 출원 발명의 명칭 "자가면역 및/또는 염증 성분을 갖는 질환의 진단 및 치료 방법", 및 2006년 5월 18일자 제출되어 WO 2006/125117로 공개된 대응 국제특허출원 제PCT/US2006/019325호(대리인 사건번호 No. PP028062.0003(035784/311608))에 설명된 분석평가법들을 또한 참조하며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 참고자료로 본원에 포함된다. 또한, Schultze et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:8200-8204; Denton et al. (1998) Pediatr. Transplant. 2:6-15; Evans et al. (2000) J. Immunol. 164:688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49:17-22; Lederman et al. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3:77-86; Coligan et al. (1991) Current Protocols in Immunology 13:12; Kwekkeboom et al.(1993) Immunology 79: 439-444; 그리고 미국특허 제5,674,492호 및 제5,847,082호에 설명된 분석평가법들을 참조하며, 이들은 참고자료로 본원에 포함된다.
본 발명의 방법에 따라서 조제될 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 본 분야에 공지된 어떤 방법을 이용하여 제조될 수 있으며, 이들 방법에는 본원 다른 곳에서 개시된 방법들이 포함된다. 한 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체, 예를 들어 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9 모노클로날 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편은 하기 설명된 대로 CHO 셀라인에서 재조합적으로 생산된다.
제조 및 정제 후에, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 본원에 제시된 방식으로 액체 제약 조성물로 조제될 수 있다. 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이 조제 전에 저장되어야 하는 경우, 그것은, 예를 들어 -20℃에서 냉동된 다음, 추가의 조제를 위해 실온에서 해동될 수 있다.
본 발명의 액체 제약 조성물은 치료적 또는 예방적 유효량의 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함한다. 제제 중에 존재하는 항체 또는 그것의 항원- 결합 단편의 양은 투여 경로 및 원하는 용량 부피를 고려한다.
이 방식에 의해, 본 발명의 액체 제약 조성물은 길항제 항-CD40 항체, 예를 들어 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편을 약 0.1 mg/ml 내지 약 50.0 mg/ml, 약 0.5 mg/ml 내지 약 40.0 mg/ml, 약 1.0 mg/ml 내지 약 35.0 mg/ml, 약 1.0 mg/ml 내지 약 30.0 mg/ml, 약 5.0 mg/ml 내지 약 25.0 mg/ml, 약 5.0 mg/ml 내지 약 20.0 mg/ml, 약 10.0 mg/ml 내지 약 35.0 mg/ml, 또는 약 15.0 mg/ml 내지 약 25.0 mg/ml의 농도로 포함한다. 어떤 구체예에서, 액체 제약 조성물은 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 약 0.1 mg/ml 내지 약 5.0 mg/ml, 약 5.0 mg/ml 내지 약 10.0 mg/ml, 약 10.0 mg/ml 내지 약 15.0 mg/ml, 약 15.0 mg/ml 내지 약 20.0 mg/ml, 약 20.0 mg/ml 내지 약 25.0 mg/ml, 약 25.0 mg/ml 내지 약 30.0 mg/ml, 약 30.0 mg/ml 내지 약 35.0 mg/ml, 약 35.0 mg/ml 내지 약 40.0 mg/ml, 약 40.0 mg/ml 내지 약 45.0 mg/ml, 또는 약 45.0 mg/ml 내지 약 50.0 mg/ml의 농도로 포함한다. 다른 구체예에서, 액체 제약 조성물은 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 약 15.0 mg/ml, 약 16.0 mg/ml, 약 17.0 mg/ml, 약 18.0 mg/ml, 약 19.0 mg/ml, 약 20.0 mg/ml, 약 21.0 mg/ml, 약 22.0 mg/ml, 약 23.0 mg/ml, 약 24.0 mg/ml, 약 25.0 mg/ml, 약 26.0 mg/ml, 약 27.0 mg/ml, 약 28.0 mg/ml, 약 29.0 mg/ml, 약 30.0 mg/ml, 약 31.0 mg/ml, 약 32.0 mg/ml, 약 33.0 mg/ml, 약 34.0 mg/ml, 또는 약 35.0 mg/ml의 농도로 포함한다.
본 발명에 따라서, 길항제 항-CD40 항체, 예를 들어 하기 설명되는 모노클로날 항체 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9, 또는 그것의 항원-결합 단편은 제약 조성물의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0의 범위로 유지하는 버퍼, 및 조성물을 거의 등장성으로 만들기에 충분한 양의, 본원에서 아르기닌-HCl라고 한, 산성 형태 아르기닌과 함께 조제된다. "거의 등장성"은 수성 제제가 약 240 내지 약 360 mmol/kg, 바람직하게 약 240 내지 약 340 mmol/kg, 더 바람직하게 약 250 내지 약 330 mmol/kg, 더욱 바람직하게 약 260 내지 약 320 mmol/kg, 더더욱 바람직하게 약 270 내지 약 310 mmol/kg의 삼투농도를 가진다는 의미이다. 어떤 구체예에서, 액체 제약 조성물은 약 295 mmol/kg의 삼투농도를 가진다. 용액의 등장성을 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, Setnikar et al.(1959) J. Am. Pharm. Assoc. 48:628 참조.
아르기닌-HCl은 등장제로 기능할 뿐만 아니라, 본 발명의 액체 제약 조성물의 저장 동안 입체형태적 변화, 응집물 형성, 단편화, 및/또는 탈아미드화에 대해 항체를 안정시키는 작용을 한다. "저장 동안"은 일단 제조된 액체 제약 조성물 또는 제제가 피험자에게 즉시 투여되지 않는다는 의미이다. 오히려, 액체 제약 조성물은 제조 후 저장을 위해 액체 형태, 냉동 상태, 또는 액체 형태나 피험자 투여에 적합한 기타 다른 형태로의 추후 복원을 위한 건조 형태로 패키지된다. "건조 형태"는 액체 제약 조성물 또는 제제가 냉동건조(즉, 동결건조; 예를 들어, Williams and Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 35:48-59 참조), 분무건조(Masters (1991) Spray-Drying Handbook(5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; 및 Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11:12-20 참조), 또는 공기건조 (Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; 및 Roser (1991) Biopharm. 4:47-53 참조)에 의해 건조된다는 의미이다. 액체 제약 조성물의 저장 동안 항체의 입체형태적 변화, 응집물 형성, 단편화, 및/또는 탈아미드화는 항체의 생물학적 활성에 부정적인 영향을 미칠 수 있으며, 그 결과 제약 조성물의 치료 효능이 상실될 수 있다. 더욱이, 응집물 형성은 항체-함유 제약 조성물이 주입 시스템을 이용하여 투여될 때 관, 멤브레인 또는 펌프 막힘 같은 다른 문제를 일으킬 수도 있다.
아르기닌이 산성 형태, 즉 아르기닌-HCl로 존재하기만 하면, 아르기닌의 어떤 부분입체이성질체(즉, L, D, 또는 DL 이성질체), 또는 이들 부분입체이성질체의 조합이 본 발명의 제약 조성물에 존재할 수 있다. L-부분입체이성질체가 사용되는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 조성물은 이 아미노산의 유사체와 함께 조제될 수도 있다. "아미노산 유사체"는 조성물을 거의 등장성으로 만들 뿐만 아니라, 본 발명의 액체 제약 조성물의 저장 동안 폴리펩티드의 응집물 형성, 단편화, 및/또는 탈아미드화를 감소시키는 바람직한 효과를 야기하는 자연 발생 아미노산의 유도체를 의미한다. 적합한 아르기닌 유사체는, 예를 들어 아미노구아니딘 및 N-모노에틸 L-아르기닌을 포함한다. 아르기닌과 마찬가지로 아미노산 유사체도 산성 형태로 조성물에 조합된다.
제약 조성물 중 아르기닌-HCl의 농도는 다른 성분들이 장성에 기여하는 정도에 의존할 것이다. 어떤 구체예에서, 아르기닌-HCl의 농도는 약 50 mM 내지 약 300 mM, 약 50 mM 내지 약 250 mM, 약 50 mM 내지 약 200 mM, 약 50 mM 내지 약 175 mM, 약 50 mM 내지 약 150 mM, 약 75 mM 내지 약 175 mM, 약 75 mM 내지 약 150 mM, 약 100 mM 내지 약 175 mM, 약 100 mM 내지 약 200 mM, 약 100 mM 내지 약 150 mM, 약 125 mM 내지 약 175 mM, 약 125 mM 내지 약 150 mM, 약 130 mM 내지 약 170 mM, 약 130 mM 내지 약 160 mM, 약 135 mM 내지 약 155 mM, 약 140 mM 내지 약 155 mM, 또는 약 145 mM 내지 약 155 mM이다. 한 이러한 구체예에서, 아르기닌-HCl의 농도는 약 125 mM, 약 150 mM, 또는 약 175 mM이다.
액체 항체-함유 제약 조성물의 pH는 거기 함유된 항체의 안정성에 영향을 미치며, 이것은 주로 폴리펩티드 응집물 형성에 대한 영향을 통해서 이루어진다. 따라서, 본 발명의 제약 조성물에 존재하는 완충제의 양은 해당하는 특정 길항제 항-CD40 항체의 안정성을 위한 최적 pH에 따라서 변할 것이다. 이 최적 pH의 결정은 본 분야에서 일반적으로 활용되는 방법들을 이용하여 달성될 수 있으며, 예를 들어 입체형태적 안정성을 평가하는 차등 주사 열량법(DSC); 응집 및 단편화를 평가하는 SDS-PAGE 및 크기-배제 크로마토그래피(SEC-HPLC); 및 전하 변화-관련 변성을 평가하는 양이온-교환 HPLC(CIEX-HPLC) 분석을 포함한다. 본 발명의 액체 제약 조성물을 위한 바람직한 pH는 약 pH 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 및 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0 범위 내의 다른 이러한 값들이다. 어떤 구체예에서, 완충제는 제약 조성물의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.5, 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.0, 약 pH 5.0 내지 약 pH 5.5, 약 pH 5.5 내지 약 7.0, 약 pH 5.5 내지 약 pH 6.5, 또는 약 pH 5.5 내지 약 pH 6.0의 범위로 유지한다.
항체의 물리화학적 안정성과 바람직한 생물학적 활성이 상기 주지된 대로 보유되기만 하면, 액체 길항제 항-CD40 항체 제약 조성물의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0의 범위로 유지하는 어떤 적합한 완충제라도 제제에 사용될 수 있다. 적합한 완충제는 제한은 아니지만, 종래의 산 및 그 염들을 포함하며, 여기서 반대이온은, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 마그네슘일 수 있다. 액체 제약 조성물을 완충하는데 사용될 수 있는 종래의 산 및 그 염들의 예는 제한은 아니지만, 시트르산 또는 시트레이트, 숙신산 또는 숙시네이트, 아세트산 또는 아세테이트, 타르타르산 또는 타르타레이트, 인산 또는 포스페이트, 글루콘산 또는 글루코네이트, 글루탐산 또는 글루타메이트, 아스파르트산 또는 아스파레이트, 말레산 또는 말레에이트, 및 말산 또는 말레이트 버퍼를 포함한다. 완충제가 산과 산의 염 형태의 혼합물일 수 있음이 인정되며, 예를 들어 시트르산과 시트레이트의 혼합물(본원에서 시트레이트/시트르산 버퍼라고 한다), 숙신산과 숙시네이트의 혼합물(본원에서 숙시네이트/숙신산 버퍼라고 한다), 아세트산과 아세테이트의 혼합물(본원에서 아세테이트/아세트산 버퍼라고 한다), 및 전술한 산/산 염 쌍 각각에 대한 것들이 있다. 완충제의 농도는 약 1 mM 내지 약 50 mM, 예를 들어 약 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 50 mM 범위 내의 다른 이러한 값들일 수 있다. 어떤 구체예에서, 완충제의 농도는 약 5 mM 내지 약 15 mM, 예를 들어 약 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 15 mM 범위 내의 다른 이러한 값들이다.
본 발명의 어떤 구체예에서, 액체 제약 조성물은 바람직한 농도(즉, 상기 주지된 대로 약 0.1 mg/ml 내지 약 50.0 mg/ml)의 본원에 설명된 길항제 항-CD40 항체, 예를 들어 모노클로날 항체 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9, 또는 그것의 항원-결합 단편, 조성물을 거의 등장성을 만드는 양의 아르기닌-HCl, 및 시트레이트/시트르산 버퍼인 완충제를 포함하며, 여기서 완충제의 농도는 제약 조성물의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0의 범위, 바람직하게 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.5의 범위, 예를 들어 약 pH 5.0, 5.5, 6.0, 및 6.5로 유지하는 농도이다. "시트레이트"는 시트르산의 염을 포함하는 버퍼를 의미한다. 바람직한 구체예에서, 시트레이트 반대이온은 나트륨 양이온이며, 이에 따라 시트레이트 버퍼 성분은 나트륨 시트레이트이다. 그러나, 어떤 양이온도 유효하다고 예상된다. 다른 가능한 시트레이트 양이온은 제한은 아니지만, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 및 마그네슘을 포함한다. 상기 주지된 대로, 시트레이트/시트르산 버퍼는 산(즉, 시트르산)과 산의 염 형태(즉, 시트레이트)의 혼합물을 포함하며, 산의 염 형태에서 반대이온은 어떤 적합한 양이온일 수 있다. 한 이러한 구체예에서, 산의 염 형태를 위한 반대이온은 나트륨 양이온이며, 이에 따라 완충제는 시트르산과 나트륨 시트레이트의 혼합물을 포함한다. 상기 주지된 대로, 시트레이트/시트르산 버퍼의 농도는 약 1 mM 내지 약 50 mM, 예를 들어 약 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 50 mM 범위 내의 다른 이러한 값들일 수 있다. 어떤 구체예에서, 시트레이트/시트르산 버퍼 농도는 약 5 mM 내지 약 15 mM, 예를 들어 약 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 또는 약 15 mM이다.
다른 구체예에서, 액체 제약 조성물은 약 0.1 mg/ml 내지 약 50.0 mg/ml, 약 5.0 mg/ml 내지 약 35.0 mg/ml, 약 10.0 mg/ml 내지 약 35.0 mg/ml, 또는 약 10.0 mg/ml 내지 약 20.0 mg/ml 농도의 모노클로날 항체 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9 같은 길항제 항-CD40 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편; 조성물을 거의 등장성으로 만드는 양의 아르기닌-HCl; 및 약 1 mM 내지 약 20 mM, 약 5 mM 내지 약 15 mM, 바람직하게 약 10 mM 농도의 시트레이트/시트르산 버퍼인 완충제를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 액체 제약 조성물은 약 0.1 mg/ml 내지 약 50.0 mg/ml, 약 5.0 mg/ml 내지 약 35.0 mg/ml, 약 10.0 mg/ml 내지 약 35.0 mg/ml, 또는 약 10.0 mg/ml 내지 약 20.0 mg/ml 농도의 모노클로날 항체 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9 같은 길항제 항-CD40 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편; 조성물을 거의 등장성으로 만드는 양의 아르기닌-HCl; 및 약 1 mM 내지 약 20 mM, 약 5 mM 내지 약 15 mM, 바람직하게 약 10 mM 농도의 나트륨 시트레이트/시트르산 버퍼인 완충제를 포함한다.
어떤 바람직한 구체예에서, 액체 제약 조성물은 길항제 항-CD40 항체, 예를 들어 모노클로날 항체 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9, 또는 그것의 항원-결합 단편; 제약 조성물의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0의 범위로 유지하는 완충제; 및 약 100 mM 내지 약 200 mM 농도의 아르기닌-HCl을 포함한다. 이들 구체예의 일부에서, 완충제는 약 5 mM 내지 약 15 mM 농도의 나트륨 시트레이트/시트르산 버퍼이며, 액체 제약 조성물은 길항제 항-CD40 항체, 예를 들어 모노클로날 항체 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9, 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하고, 제약 조성물의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0, 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.5, 또는 약 pH 5.5 내지 약 pH 6.0이다. 다른 구체예에서, 액체 제약 조성물은 약 0.1 mg/ml 내지 약 50.0 mg/ml, 약 5.0 mg/ml 내지 약 35.0 mg/ml, 또는 약 10.0 mg/ml 내지 약 35.0 mg/ml, 예를 들어 약 10.0 mg/ml, 약 15.0 mg/ml, 약 20.0 mg/ml, 약 25.0 mg/ml, 약 30.0 mg/ml, 또는 약 35.0 mg/ml 농도의 길항제 항-CD40 항체, 예를 들어 모노클로날 항체 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9, 또는 그것의 항원-결합 단편; 약 150 mM 아르기닌-HCl; 및 약 10 mM 나트륨 시트레이트/시트르산 버퍼인 완충제를 포함하며, 이 경우 제제의 pH는 약 pH 5.5이다.
본 발명의 액체 제약 제제의 가공처리 동안 냉동-해동 또는 기계적 전단으로 인한 단백질 변성은 제제에 계면활성제를 조합하여 용액-공기 계면에서의 표면장력을 저하시킴으로써 억제될 수 있다. 따라서, 어떤 구체예에서, 액체 제약 조성물은 길항제 항-CD40 항체, 예를 들어 모노클로날 항체 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9, 또는 그것의 항원-결합 단편; 제약 조성물의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0의 범위로 유지하기 위한 완충제; 액체 제약 조성물을 거의 등장성으로 만드는 양의 아르기닌-HCl을 포함하고, 추가하여 계면활성제를 포함한다. 다른 구체예에서, 액체 제약 조성물은 길항제 항-CD40 항체, 예를 들어 모노클로날 항체 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9, 또는 그것의 항원-결합 단편; 제약 조성물의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0의 범위로 유지하기 위한 완충제; 약 50 mM 내지 약 300 mM, 또는 약 100 mM 내지 약 200 mM 농도의 아르기닌-HCl를 포함하고; 추가하여 계면활성제를 포함한다.
사용되는 전형적인 계면활성제는 비이온성 계면활성제이며, 이들은 폴리옥시에틸렌 소르비탈 에스테르류, 예를 들어 폴리소르베이트 80(Tween 80) 및 20(Tween 20); 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 에스테르류, 예를 들어 Pluronic F68; 폴리옥시에틸렌 알코올류, 예를 들어 Brij 35; 시메티콘; 폴리에틸렌글리콜, 예를 들어 PEG400; 리소포스파티딜콜린; 및 폴리옥시에틸렌-p-t-옥틸페놀, 예를 들어 Triton X-100을 포함한다. 계면활성제나 유화제에 의한 고전적 제약 안정화는, 예를 들어 본원에 참고자료로 포함되는 Levine et al. (1991) J. Parenteral Sci. Technol. 45(3):160-165에 설명된다. 본 발명의 실시에 사용되는 바람직한 계면활성제는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 계면활성제가 포함되는 경우, 그것은 전형적으로 약 0.001% 내지 약 1.0%, 약 0.001% 내지 약 0.5%, 약 0.001% 내지 약 0.4%, 약 0.001% 내지 약 0.3%, 약 0.001% 내지 약 0.2%, 약 0.005% 내지 약 0.5%, 약 0.005% 내지 약 0.2%, 약 0.01% 내지 약 0.5%, 약 0.01% 내지 약 0.2%, 약 0.03% 내지 약 0.5%, 약 0.03% 내지 약 0.3%, 약 0.05% 내지 약 0.5%, 또는 약 0.05% 내지 약 0.2%의 양으로 첨가되며, 여기서 퍼센테이지는 중량/부피(w/v) 기준이다.
따라서, 어떤 구체예에서, 액체 제약 조성물은 길항제 항-CD40 항체, 예를 들어 모노클로날 항체 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9, 또는 그것의 항원-결합 단편; 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 5 mM 내지 약 25 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 15 mM 농도의 시트레이트/시트르산 버퍼, 예를 들어 나트륨 시트레이트/시트르산 버퍼인 완충제; 약 50 mM 내지 약 300 mM, 약 100 mM 내지 약 200 mM, 또는 약 50 mM 내지 약 150 mM의 농도로 존재하는 아르기닌-HCl을 포함하고; 제약 조성물은 계면활성제, 예를 들어 폴리소르베이트 20을 약 0.001% 내지 약 1.0% (w/v), 또는 약 0.001% 내지 약 0.5% (w/v)의 양으로 추가로 포함하며; 이 경우 조성물의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0, 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.5, 또는 약 pH 5.5 내지 약 pH 6.0이다. 다른 구체예에서, 액체 제약 조성물은 약 0.1 mg/ml 내지 약 50.0 mg/ml, 약 5.0 mg/ml 내지 약 35.0 mg/ml, 또는 약 10.0 mg/ml 내지 약 35.0 mg/ml, 예를 들어 약 10.0 mg/ml, 약 15.0 mg/ml, 약 20.0 mg/ml, 약 25.0 mg/ml, 약 30.0 mg/ml, 또는 약 35.0 mg/ml 농도의 길항제 항-CD40 항체, 예를 들어 모노클로날 항체 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9, 또는 그것의 항원-결합 단편; 50 mM 내지 약 200 mM 아르기닌-HCl, 예를 들어 약 150 mM 아르기닌-HCl; 약 5 mM 내지 약 20 mM, 예를 들어 약 10 mM 농도의 나트륨 시트레이트/시트르산 버퍼인 완충제를 포함하고; 제약 조성물은 계면활성제, 예를 들어 폴리소르베이트 20을 약 0.001% 내지 약 1.0% (w/v), 예를 들어 약 0.001% 내지 약 0.5% (w/v), 약 0.01% 내지 약 0.25% (w/v), 약 0.025% 내지 약 0.2% (w/v), 약 0.025% 내지 약 0.1% (w/v), 또는 약 0.05% 내지 약 0.2% (w/v)의 양으로 선택적으로 포함하며; 이 경우 액체 제약 조성물의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0, 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.0, 약 pH 5.0 내지 약 pH 5.5, 약 pH 5.5 내지 약 pH 6.5, 약 pH 5.5 내지 약 pH 6.0, 또는 약 pH 5.5이다.
액체 제약 조성물은 본질적으로 어떤 보존제 및 기타 다른 담체, 부형제, 또는 안정제로부터 자유로울 수 있다. 또는 달리, 제약 조성물은 본원에 설명된 한 가지 이상의 보존제, 예를 들어 항균제, 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정제를 이들이 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 물리화학적 안정성에 부정적인 영향을 미치지 않는 한에서 선택적으로 포함할 수 있다. 허용가능한 담체, 부형제, 및 안정제의 예는 제한은 아니지만, 추가 완충제, 보조-용매, 계면활성제, 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제, EDTA 등의 킬레이트화제, 금속착물(예를 들어, Zn-단백질 착물), 및 폴리에스테르 같은 생분해 폴리머를 포함한다. 본원에 참고자료로 포함되는 Remington 's Pharmaceutical Sciences(18th ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990)에서 제약학적으로 허용되는 담체, 안정제, 및 이소몰라이트의 조제 및 선택에 관한 충분한 논의를 찾을 수 있다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체-함유 액체 제약 조성물은 항체 폴리펩티드 사슬 내의 산화성 아미노산 잔기의 산화를 억제하기 위한 아미노산 메티오닌을 추가하여 포함한다. "억제하다"는 시간에 따른 산화 종들의 축적을 최소화하는 것을 의미한다. 산화를 억제한 결과 길항제 항-CD40 항체는 그것의 적합한 분자 형태로 더 오래 동안 유지된다. 메티오닌의 어떤 부분입체이성질체(L, D, 또는 DL 이성질체) 또는 이들의 조합이 사용될 수 있다. 첨가량은 산화된 종들의 양이 규제당국에 의해 승인될 수 있는 정도로 산화성 아미노산 잔기의 산화를 억제하기에 충분한 양이어야 한다. 이것은 전형적으로 조성물이 약 10% 내지 약 30% 이하의 산화 산물을 함유한다는 의미이다. 일반적으로, 이것은 메티오닌 잔기에 대해 첨가되는 메티오닌의 비가 약 1:1 내지 약 1000:1, 가장 바람직하게 10:1 내지 약 100:1의 범위이도록 메티오닌을 첨가함으로써 달성될 수 있다.
바람직한 메티오닌 첨가량은 메티오닌 농도를 다르게 하여 해당 길항제 항-CD40 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 제조하고, 예를 들어 분자 종들의 크로마토그래피 분리 및 폴리펩티드 분자량 표준물질을 사용한 확인에 의해, 예를 들어 하기 실시예 1에 설명된 RP-HPLC, 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)을 사용하여, 폴리펩티드 산화 종들의 형성에 대한 상대적 효과를 측정함으로써 실험적으로 쉽게 결정될 수 있다. 항체 응집의 아미노산-관련 억제에 대한 불리한 영향 없이 산화성 아미노산 잔기의 산화 억제를 최대화하는 메티오닌 농도가 항체 안정성을 더욱 개선할 수 있는 조성물에 첨가되는 메티오닌 첨가량으로 표시될 것이다.
따라서, 본 발명의 어떤 구체예에서, 액체 제약 조성물은 길항제 항-CD40 항체, 예를 들어 모노클로날 항체 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9, 또는 그것의 항원-결합 단편; 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 5 mM 내지 약 25 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 15 mM 농도의 시트레이트/시트르산 버퍼, 예를 들어 나트륨 시트레이트/시트르산 버퍼인 완충제; 약 50 mM 내지 약 300 mM, 약 100 mM 내지 약 200 mM, 또는 약 50 mM 내지 약 150 mM 농도로 존재하는 아르기닌-HCl; 약 0.001% 내지 약 1.0% (w/v) 또는 약 0.001% 내지 약 0.5% (w/v)의 양으로 존재하는 계면활성제, 예를 들어 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하고; 제약 조성물은 메티오닌을 약 0.5 mM 내지 약 20.0 mM, 약 0.5 mM 내지 약 10.0 mM, 약 1.0 mM 내지 약 20.0 mM, 약 1.0 mM 내지 약 10.0 mM, 약 1.0 mM 내지 약 7.0 mM, 약 2.0 mM 내지 약 6.0 mM, 또는 약 2.5 mM 내지 약 5.0 mM의 양으로 추가로 포함하며; 이 경우 제약 조성물의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0, 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.5, 또는 약 pH 5.5 내지 약 pH 6.0이다. 다른 구체예에서, 액체 제약 조성물은 약 0.1 mg/ml 내지 약 50.0 mg/ml, 약 5.0 mg/ml 내지 약 35.0 mg/ml, 또는 약 10.0 mg/ml 내지 약 35.0 mg/ml, 예를 들어 약 10.0 mg/ml, 약 15.0 mg/ml, 약 20.0 mg/ml, 약 25.0 mg/ml, 약 30.0 mg/ml, 또는 약 35.0 mg/ml 농도의 길항제 항-CD40 항체, 예를 들어 모노클로날 항체 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9, 또는 그것의 항원-결합 단편; 약 50 mM 내지 약 200 mM 아르기닌-HCl, 예를 들어 약 150 mM 아르기닌-HCl; 약 5 mM 내지 약 20 mM, 예를 들어 약 10 mM 농도의 나트륨 시트레이트/시트르산 버퍼; 선택적으로 약 0.001% 내지 약 1.0% (w/v), 예를 들어 약 0.001% 내지 약 0.5% (w/v), 약 0.01% 내지 약 0.25% (w/v), 약 0.025% 내지 약 0.2% (w/v), 약 0.025% 내지 약 0.1% (w/v), 또는 약 0.05% 내지 약 0.2% (w/v) 양의 계면활성제, 예를 들어 폴리소르베이트 20; 및 선택적으로, 예를 들어 약 0.5 mM 내지 약 10.0 mM, 약 1.0 mM 내지 약 7.0 mM, 약 2.0 mM 내지 약 6.0 mM, 또는 약 2.5 mM 내지 약 5.0 mM, 예를 들어 약 2.0 mM, 약 2.5 mM, 약 3.0 mM, 약 3.5 mM, 약 4.0 mM, 약 4.5 mM, 약 5.0 mM, 또는 약 5.5 mM 농도의 메티오닌을 포함하며; 이 경우 액체 제약 조성물의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0, 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.0, 약 pH 5.0 내지 약 pH 5.5, 약 pH 5.5 내지 약 pH 6.5, 약 pH 5.5 내지 약 pH 6.0, 또는 약 pH 5.5이다.
또 다른 구체예에서, 액체 제약 조성물은 약 0.1 mg/ml 내지 약 50.0 mg/ml, 약 5.0 mg/ml 내지 약 35.0 mg/ml, 또는 약 10.0 mg/ml 내지 약 35.0 mg/ml, 예를 들어 약 10.0 mg/ml, 약 15.0 mg/ml, 약 20.0 mg/ml, 약 25.0 mg/ml, 약 30.0 mg/ml, 또는 약 35.0 mg/ml 농도의 모노클로날 항체 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9, 또는 그것의 항원-결합 단편; 약 100 mM 내지 약 200 mM 아르기닌-HCl, 예를 들어 약 150 mM 아르기닌-HCl; 약 5 mM 내지 약 20 mM, 예를 들어 약 10 mM 농도의 나트륨 시트레이트/시트르산 버퍼; 선택적으로 약 0.025% 내지 약 0.1% (w/v) 양의 계면활성제, 예를 들어 폴리소르베이트 20; 및 선택적으로, 예를 들어 약 2.0 mM 내지 약 5.5 mM, 예를 들어 약 5.0 mM 농도의 메티오닌을 포함하며; 이 경우 액체 제약 조성물의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.0, 예를 들어 약 pH 5.5이다.
상기 개시된 물질들에 더하여, 액체 제약 조성물의 안정성을 더욱 강화하기 위해 기타 다른 안정제, 예를 들어 알부민, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 또는 이나트륨 EDTA 같은 그 염들 중 한 가지가 선택적으로 첨가될 수 있다. 바람직한 경우, 알부민의 양은 약 1.0% w/v 이하의 농도로 첨가될 수 있다. EDTA는 많은 산화 반응을 촉매한다고 알려진 금속 이온들의 스캐빈저로서 작용하며, 따라서 추가적인 안정제를 제공한다. 바람직한 경우, EDTA의 양은 약 0.1 내지 약 5.0 mM의 농도로 첨가될 수 있다.
바람직한 경우, 당 또는 당 알코올이 본 발명의 안정한 액체 길항제 항-CD40 항체-함유 제약 조성물에 포함될 수 있다. 일당류, 이당류, 또는 다당류, 또는 수용성 글루칸류와 같은 어떤 당, 예를 들어 프럭토스, 글루코오스, 만노스, 소르보스, 크실로스, 말토스, 락토스, 수크로오스, 덱스트란, 풀룰란, 덱스트린, 시클로덱스트린, 가용성 녹말, 히드록시에틸 녹말 및 카르복시메틸셀룰로오스-Na가 사용될 수 있다. 수크로오스가 가장 바람직한 당 첨가제이다. 당 알코올은 -OH 기를 갖는 C4-C8 탄화수소로서 정의되며, 예를 들어 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 갈락시티톨, 둘시톨, 크실리톨 및 아라비톨을 포함하며, 만니톨이 가장 바람직한 당 알코올 첨가제이다. 상기 언급된 당 또는 당 알코올은 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 당 또는 당 알코올이 액체 제제에 가용성이고 본 발명의 방법을 사용하여 달성되는 안정화 효과에 불리한 영향을 미치지 않는다면, 사용량은 제한적으로 고정되지 않는다. 당 또는 당 알코올 농도는 바람직하게 약 1.0% 내지 약 15.0% (w/v), 더 바람직하게 약 2.0% 내지 약 10.0% (w/v)이다.
본원에 설명된 액체 제약 조성물이 제조된 후, 조성물은 변성을 방지하기 위해 동결건조될 수 있다. 액체 조성물을 동결건조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 조성물은 사용 직전 멸균 희석제(예를 들어, 링거액, 증류수, 또는 멸균 식염수)를 사용하여 복원될 수 있으며, 희석제는 추가 성분을 포함할 수도 있다. 조성물은 복원시 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 피험자에게 투여되는 것이 바람직하다.
본 발명의 액체 길항제 항-CD40 항체-함유 제약 조성물은 안정하며, 따라서 등장제로서 염화나트륨을 포함하는 완충 용액 중에 제조된 길항제 항-CD40 항체 조성물에 비해 증가된 저장 안정성을 가진다. 이론에 결부되지는 않지만, 이 증가된 저장 안정성은 추후 사용 형태로 직접 저장되든, 냉동 상태로 저장되어 사용 전에 해동되든, 또는 동결건조, 공기건조 또는 분무건조 형태 등의 건조 형태로 제조되어 사용 전에 액체 형태 또는 기타 다른 형태로 추후 복원되든 관계없이 액체 제제에서 관찰된다고 생각된다. 바람직하게, 본 발명의 조성물은 액체 형태에서 증가된 저장 안정성을 갖는다는 편리함, 복원 없이 투여되는 용이성, 및 사전-충전형의 즉시 사용가능한 주사기 내에 제제를 공급하거나, 또는 제제가 정균제와 상용성인 경우 다회-용량 제제로서 공급할 수 있는 능력을 충분히 이용하기 위하여 액체 형태로 직접 저장된다.
본 발명의 조성물은 등장제로서 아르기닌-HCl의 사용과 완충제로서 산과 산의 염 형태의 혼합물, 예를 들어 나트륨 시트레이트/시트르산 혼합물의 사용이 액체 길항제 항-CD40 항체-함유 제약 조성물의 저장 안정성을 염화나트륨과 개별 완충제를 사용하에 제조된 액체 길항제 항-CD40 항체-함유 제약 조성물에 비해 증가시킨다는 발견과 관련된다. 조성물의 증가된 저장 안정성은 치료적으로 활성인 길항제 항-CD40 항체의 안정성에 대한 산성 형태 아르기닌의 영향을 통해, 더 구체적으로는 액체 제제 중에서 저장되는 동안 폴리펩티드 응집, 단편화, 및 탈아미드화에 대한 영향을 통해 달성된다. 더욱이, 본원에 제시된 방식으로 완충된 액체 길항제 항-CD40 항체 조성물 중에 등장제로서 아르기닌-HCl의 조합은 염화나트륨 같은 추가의 등장제를 포함시키지 않고도 액체 제약 조성물을 거의 등장성으로 만든다.
본 발명의 안정한 액체 제약 조성물에 조합된 산성 형태 아르기닌은 치료적으로 활성인 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 물리화학적 변화에 대해 보호하며, 이로써 조성물의 저장 동안 항체의 안정성이 증가된다. "안정성의 증가"는 액체 제약 조성물의 저장 동안 항체에 의한 응집물 형성, 단편화, 및 탈아미드화 중 한 가지 이상이 이런 특정한 등장 및 안정제가 부재한다는 것을 제외하면 길항제 항-CD40 항체 및 동일한 제제 성분들을 포함하는 액체 제약 조성물의 저장 동안 관찰된 것에 비해 감소된다는 의미이다. 액체 조성물 중에서 저장되는 동안 길항제 항-CD40 항체 응집에 대한 아르기닌-HCl의 효과는 용액 중에서 가용성 항-CD40 항체의 시간에 따른 변화를 측정함으로써 쉽게 측정될 수 있다. 용액 중에서 가용성 항-CD40 항체의 양은 해당 항체의 검출에 맞게 개조된 많은 분석적 분석평가법으로 정량될 수 있다. 이러한 분석은, 예를 들어 역상(RP)-HPLC, 크기-배제(SEC)-HPLC, 및 UV 흡광도를 포함한다. 또한, SDS-PAGE를 이용하여 응집현상이 모니터될 수 있다. 하기 실시예를 또한 참조한다.
응집의 경우, 본 발명의 안정한 제약 조성물을 얻기 위해 길항제 항-CD40 항체-함유 액체 제약 조성물에 조합될 수 있는 아르기닌-HCl의 유효량은 시간에 따른 응집물 형성을 감소시키고, 이로써 용액 중에서 안정한 길항제 항-CD40 항체가 응집되지 않은 생물학적으로 활성인 분자 형태로 더 오래 동안 유지되는 양으로서 간주될 것이다. 따라서, 예를 들어 길항제 항-CD40 항체가 하기 실시예에 설명된CHIR-12.12 모노클로날 항-CD40 항체인 경우, 본 발명의 안정한 조성물을 제조하는데 사용되는 아르기닌-HCl의 유효량은 CHIR-12.12 항체를 그것의 모노머 분자 형태로 더 오래 동안 유지시키는 양일 것이다.
이론에 결부되지는 않지만, 본 발명의 안정한 액체 길항제 항-CD40 항체-함유 조성물의 증가된 저장 안정성은 또한 저장 동안 항체 단편화 및/또는 치료적으로 활성인 항체 내의 글루타민 및/또는 아스파라긴 잔기의 탈아미드화에 대한 아르기닌-HCl의 억제 효과와 관련될 수 있다. 항체 단편화에 대한 아르기닌-HCl의 효과는, 예를 들어 SDS-PAGE 및/또는 SEC-HPLC 분석을 이용하여 제제 중에서 시간에 따른 분자 종들의 변화를 모니터함으로써 쉽게 측정될 수 있다; 하기 실시예를 참조한다. 액체 조성물 중에서 저장되는 동안 항-CD40 항체 폴리펩티드의 탈아미드화에 대한 아르기닌-HCl의 효과는 탈아미드화 형태로 존재하는 길항제 항-CD40 항체의 양을 시간에 따라 모니터함으로써 쉽게 측정될 수 있다. 용액상에 존재하는 폴리펩티드의 분자 종들, 즉 천연 또는 탈아미드화 종들을 측정하는 방법은 본 분야에 일반적으로 공지되어 있다. 이러한 방법은 분자 종들의 크로마토그래피 분리 및 폴리펩티드 분자량 표준물질을 이용한 확인을 포함하며, 예를 들어 하기 실시예에 설명된 RP-HPLC, 또는 양이온-교환 크로마토그래피(CIEX-HPLC)을 사용한다.
본 발명의 안정한 액체 길항제 항-CD40 항체-함유 제약 조성물은 아르기닌-HCl에 의해 달성된 일차적인 안정화 효과에 부정적인 영향을 미치지만 않는다면 치료적 활성 성분으로 기능하는 해당 길항제 항-CD40 항체의 유효성을 증가시키거나 바람직한 특질을 촉진하는 다른 화합물을 함유할 수 있다. 조성물은 선택된 경로에 의한 투여에 있어서 안전해야 하며, 멸균되어야 하고, 바람직한 치료적 활성을 보유해야 한다.
본 발명의 제약 조성물은, 예를 들어 안정 및 완충제, 그리고 어떤 다른 부형제들을 미리 혼합한 다음, 해당 길항제 항-CD40 항체를 조합함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물을 더욱 안정시키기 위해 첨가될 수 있는 어떤 추가의 부형제들은, 본원에 개시된 신규 조성물을 얻기 위해 사용되며, 또한 완충제와 더 조합되는, 일차적인 등장 및 안정제, 즉 아르기닌-HCl의 안정화 효과에 부정적인 효과를 미치지 않아야 한다. 아르기닌-HCl을 첨가하여 해당 길항제 항-CD40 항체의 거의 등장성 및 증가된 안정성을 달성한 후, 액체 조성물의 pH가 완충제를 사용하여, 바람직하게는 본원에 개시된 범위 내로, 더 바람직하게는 해당 길항제 항-CD40 항체를 위한 최적 pH로, 예를 들어 모노클로날 항체 CHIR-12.12에 대해 약 pH 5.0 내지 pH 7.0, 바람직하게 약 pH 5.5의 pH로 조정된다. 조성물에 길항제 항-CD40 항체를 첨가한 후 pH가 조정될 수도 있지만, 폴리펩티드를 첨가하기 전에 pH가 조정되는 것이 폴리펩티드의 변성 위험을 감소시킬 수 있기 때문에 바람직하다. 다음에, 적합한 기계 장치를 사용하여 구성성분들을 적절히 혼합한다.
따라서, 본 발명은 액체 제약 조성물 중에서 길항제 항-CD40 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편의 안정성을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편과 제약 조성물의 pH를 약 pH 5.0 내지 pH 7.0으로 유지하는 완충제, 및 조성물을 거의 등장성으로 만드는 충분한 양의 아르기닌-HCl을 조합하는 단계를 포함한다. 어떤 구체예에서, 완충제는 시트레이트/시트르산 버퍼이며, 완충제의 농도는 약 5 mM 내지 약 50 mM이고, 아르기닌-HCl의 양은 조성물에서 이 등장제의 농도가 약 50 mM 내지 약 300 mM 아르기닌-HCl이 되는 양이다. 다른 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체는 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편이고; 완충제는 약 5 mM 내지 약 25 mM 나트륨 시트레이트/시트르산 버퍼이고; 조성물에서 아르기닌-HCl의 농도는 약 150 mM이고; 조성물의 pH는 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 또는 약 6.5이다.
해당 길항제 항-CD40 항체, 예를 들어 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9 모노클로날 항체 같은 길항제 항-CD40 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하는 안정화된 액체 제약 조성물은 단위 투약량으로 조제되어야 하며, 용액, 현탁액, 또는 에멀젼 같은 주사가능 또는 주입가능 형태일 수 있다. 이미 주지된 대로, 조성물은 냉동 상태로 저장될 수도 있고, 또는 동결건조 분말 같은 건조 형태로 제조될 수도 있으며, 동결건조 분말은 경구 또는 비경구 투여 경로를 비롯한 여러 방법 중 어느 것에 의한 투여 전에 액체 용액, 현탁액, 또는 에멀젼으로 복원될 수 있다. 바람직하게, 조성물은 하기 개략되는 본 발명의 방법에 따라서 달성되는 증가된 저장 안정성을 이용하여 액체 제제로 저장된다. 안정화된 제약 조성물은 멤브레인 여과에 의해 멸균되어 밀봉 바이알이나 앰풀 같은 단위-용량 또는 다회-용량 용기에 저장되는 것이 바람직하다. 상기 설명되고 개시된 바람직한 안정 및 완충제의 유리한 효과에 부정적인 영향을 미치지만 않는다면, 본 분야에 일반적으로 공지된 제약 조성물 조제에 있어서의 추가적인 방법을 사용하여 본원에 개시된 액체 제약 조성물의 저장 안정성을 더욱 강화할 수 있다. 본원에 참고자료로 포함되는 Remington's Pharmaceutical Sciences (1990)(18th ed., Mack Pub. Co., Eaton, Pennsylvania)에서 제약학적으로 허용되는 담체, 안정제 등의 조제 및 선택에 관한 충분한 논의를 찾을 수 있다.
이 방식에 의해, 본 발명은 본 발명의 안정한 액체 길항제 항-CD40 항체-함유 제약 조성물을 보유한 용기를 포함하며, 선택적으로 사용설명서를 포함하는 제조 물품을 제공한다. 적합한 용기는, 예를 들어 바이알, 병, 및 주사기를 포함한다. 용기는 플라스틱이나 유리 등의 다양한 재료로 형성될 수 있다. 한 구체예에서, 용기는 3-50 cc 일회용 유리 바이알이다. 또는 달리, 즉시 사용가능한 제제에 대해서, 용기는, 예를 들어 3-100 cc 유리 바이알이다. 용기는 제제를 보유하며, 용기 상의 또는 용기에 부수하는 라벨이 사용법을 나타낼 수 있다. 제조 물품은 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료들을 더 포함할 수 있으며, 이들은 기타 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용설명서가 있는 패키지 삽입물을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물 중 항-CD40 항체
본 발명의 제약 조성물은 CD40 수용체를 표적으로 하며, ADCC를 조정하거나, CD40 신호화, 특히 CD40과 CD40 리간드(CD40L)의 상호작용에 의해서 매개되는 CD40 신호화 경로를 방해하거나, 또는 두 작용을 모두 하는 항-CD40 항체, 특히 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함한다. "CD40 항원", "CD40 세포-표면 항원", "CD40 수용체", 또는 "CD40"은 종양괴사인자(TNF) 수용체 과에 속하는 경막 당단백질을 의미한다(예를 들어, 미국특허 제5,674,492호 및 제4,708,871호; Stamenkovic et al. (1989) EMBO 8:1403; Clark (1990) Tissue antigens 36:33; Barclay et al.(1997) The Leucocyte antigen Facts Book(2d ed.; Academic Press, San Diego) 참조). 이 유전자의 선택적 스플라이스된 전사 변이체에 의해 암호화되는 인간 CD40의 2개 동형이 확인되었다. 제1 동형("장 동형" 또는 "동형 1")은 SEQ ID NO:11(GenBank Accession No. X60592 및 No. NM_001250)에 의해 암호화되어 277-아미노산 전구체 폴리펩티드(SEQ ID NO:12(GenBank Accession No. CAA43045로 최초로 기록되었고, GenBank Accession No. NP_001241에 동형 1로 확인되었다)로서 발현되며, 처음 19개 잔기로 표시되는 신호서열을 가진다. 제2 동형("단 동형" 또는 "동형 2")은 SEQ ID NO:9(GenBank Accession No. NM_152854)에 의해 암호화되어 203-아미노산 전구체 폴리펩티드(SEQ ID NO:10(GenBank Accession No. NP_690593)로서 발현되며, 역시 처음 19개 잔기로 표시되는 신호서열을 가진다. 인간 CD40의 이들 2개 동형의 전구체 폴리펩티드는 처음 165개 잔기(즉, SEQ ID NO:10와 SEQ ID NO:12의 잔기 1-165)를 함께 공유한다. 단 동형(SEQ ID NO:10에 표시됨)의 전구체 폴리펩티드는 코딩 세그먼트가 없는 전사 변이체(SEQ ID NO:9)에 의해 암호화되며, 이로써 번역 프레임이 이동된다; 결과의 CD40 동형은 CD40의 장 동형(SEQ ID NO:12의 잔기 166-277에 나타낸 C-말단)에 함유된 것과 구별되는 더 짧은 C-말단(SEQ ID NO:10의 잔기 166-203)을 함유한다. 본 발명의 취지에 따르면, 용어 "CD40 항원", "CD40 세포-표면 항원", "CD40 수용체", 또는 "CD40"은 CD40의 단 동형과 장 동형을 모두 포괄한다.
CD40 항원은 본원에 설명된 대로 다양한 세포 타입의 표면에 출현한다. "표면 출현" 및 "표면 발현"은 CD40 항원의 전체 또는 일부분이 세포 외부에 노출되어 있다는 의미이다. 출현한 또는 발현된 CD40 항원은 완전히 또는 부분적으로 글리코실화될 수 있다.
"작동제 활성"은 물질이 작동제로서 기능한다는 의미이다. 작동제는 세포 상의 수용체와 함께 수용체의 천연 리간드에 의해 개시되는 것과 유사하거나 동일한 반응 또는 활성을 개시한다. 제한은 아니지만, CD40의 작동제는 다음 반응들 모두 또는 일부를 유도한다: B 세포 증식 및 분화, 항체 생산, 세포간 유착, B 세포 기억 생성, 이소타입 전환, MHC II형 및 CD80/86 세포 표면 발현의 상향조절, 및 IL-8, IL-12, 및 TNF 같은 전염증성 사이토카인의 분비. "길항제 활성"은 물질이 길항제로서 기능한다는 의미이다. CD40의 길항제는 CD40 수용체와 작동제 리간드, 특히 CD40L의 결합에 의해 유도되는 반응들 중 어느 것의 유도를 방지하거나 감소시킨다. 길항제는 작동제 결합에 대한 반응들 중 어느 한 가지 이상의 유도를 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 바람직하게 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 더 바람직하게 70%, 80%, 85%, 가장 바람직하게 90%, 95%, 99%, 또는 100%까지 감소시킬 수 있다. CD40 리간드 결합 특이성 및 항-CD40 치료제, 예를 들어 항-CD40 항체의 길항제 활성을 측정하는 방법은 본 분야에 공지되어 있으며, 제한은 아니지만, 표준 경합 결합 분석, B 세포에 의한 면역글로불린 분비를 모니터하기 위한 분석, B 세포 증식 분석, Banchereau-형 B 세포 증식 분석, 항체 생산에 대한 T 세포 헬퍼 분석, B 세포 증식의 공-자극 분석, 및 B 세포 활성화 마커의 상향조절 분석을 포함한다. 예를 들어, 본원에 참고자료로 포함되는 WO 00/75348 및 미국특허 제6,087,329호에 개시된 이러한 분석평가법들을 참조한다. 또한, 2003년 11월 4일, 2003년 11월 26일, 및 2004년 4월 27일자 제출되어 미국특허출원 제60/517,337호(대리인 사건번호 No. PP20107.001(035784/258442)), 제60/525,579호(대리인 사건번호 No. PP20107. 002(035784/271525)) 및 제60/565,710호(대리인 사건번호 No. PP20107.003(035784/ 277214))를 각각 배정받은 가 출원들 발명의 명칭 "길항제 항-CD40 모노클로날 항체 및 그 사용 방법"; 그리고 2004년 11월 4일자 제출되어 WO 2005/044854로 공개된 국제특허출원 제PCT/US2004/037152호(대리인 사건번호 No. PP20107.004(035784/ 282916)) 발명의 명칭 "길항제 항-CD40 모노클로날 항체 및 그 사용 방법"을 참조하며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 참고자료로 본원에 포함된다.
"유의한" 작동제 활성은 B 세포 반응 분석에 의해 측정했을 때, 작동제 활성이 중성 물질 또는 음성 대조군에 의해 유도된 작동제 활성보다 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 이상이라는 의미이다. 바람직하게, "유의한" 작동제 활성은 B 세포 반응 분석에 의해 측정했을 때, 중성 물질 또는 음성 대조군에 의해 유도된 작동제 활성보다 적어도 2배 이상 또는 적어도 3배 이상인 작동제 활성이다. 따라서, 예를 들어 해당 B 세포 반응이 B 세포 증식인 경우, "유의한" 작동제 활성은 중성 물질 또는 음성 대조군에 의해 유도된 B 세포 증식 수준에 비해 적어도 2배 이상 또는 적어도 3배 이상의 B 세포 증식 수준을 유도할 것이다. 한 구체예에서, CD40과 결합하지 않는 비-특이적 면역글로불린, 예를 들어 IgG1이 음성 대조군으로 사용된다. "유의한 작동제 활성이 없는" 물질은 B 세포 반응 분석에 의해 측정했을 때, 중성 물질 또는 음성 대조군에 의해 유도된 작동제 활성보다 약 25% 이상을 넘지 않는, 바람직하게는 약 20% 이상, 15% 이상, 10% 이상, 5% 이상을 넘지 않는, 또는 심지어 약 0.1% 이상을 넘지 않는 작동제 활성을 나타낼 것이다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 안정한 액체 제약 조성물은 길항제 항-CD40 항체를 포함한다. 이러한 항체는 인간 세포 상의 CD40 항원과 결합했을 때 상기 주지된 유의한 작동제 활성이 없다. 본 발명의 한 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체는 한 가지 세포 반응에서 유의한 작동성 활성이 없다. 본 발명의 다른 구체예서, 길항제 항-CD40 항체는 한 가지 이상의 세포 반응(예를 들어, 증식 및 분화, 또는 증식, 분화, 및 B 세포에 대해 항체 생산)의 분석에서 유의한 작동제 활성이 없다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체는, 예를 들어 하기 주지된 대로 완전한 인간 모노클로날 항체 CHIR- 12.12 또는 CHIR-5.9, 또는 그것의 항원-결합 단편이다.
본 분야에 공지된 분석 중 어느 것을 사용하여 항-CD40 항체가 한 가지 이상의 B 세포 반응에 대한 길항제로서 작용하는지를 측정할 수 있다. 어떤 구체예에서, 항-CD40 항체는 B 세포 증식, B 세포 분화, 항체 생산, 세포간 유착, B 세포 기억 생성, 이소타입 전환, MHC II형 및 CD80/86 세포 표면 발현의 상향조절, 및 IL-8, IL-12, 및 TNF 같은 전염증성 사이토카인의 분비로 구성되는 군으로부터 선택된 한 가지 이상의 B 세포 반응에 대한 길항제로서 작용한다. 특히 관심있는 것은 인간 B 세포 표면 상의 인간 CD40 항원과 결합했을 때 B 세포 증식과 관련하여 유의한 작동제 활성을 나타내지 않는 길항제 항-CD40 항체이다.
한 이러한 구체예에서, 항-CD40 항체는 하기 실시예 4에 설명된 것과 같은 B 세포 증식 분석에 의해 측정했을 때 B 세포 증식에 대한 길항제이며, 이 길항제 항-CD40 항체는 중성 물질 또는 음성 대조군에 의해 유도된 B 세포 증식보다 약 25% 이상을 넘지 않는 수준으로, 바람직하게는 중성 물질 또는 음성 대조군에 의해 유도된 B 세포 증식보다 약 20% 이상, 15% 이상, 10% 이상, 5% 이상, 1% 이상, 0.5% 이상을 넘지 않는, 또는 심지어 약 0.1% 이상을 넘지 않는 수준으로 B 세포 증식을 자극한다.
다른 구체예에서, 항-CD40 항체는 하기 실시예 4에 설명된 것과 같은 B 세포 증식 분석에 의해 측정했을 때 다른 항-CD40 항체, 예를 들어 S2C6 항-CD40 항체에 의해 유도되는 B 세포 증식에 대한 길항제이며, 길항제 항-CD40 항체의 존재하에 다른 항-CD40 항체에 의해 자극되는 B 세포 증식의 수준은 길항제 항-CD40 항체의 부재하에 다른 항-CD40 항체에 의해 유도된 B 세포 증식의 약 25% 이하(즉, 75% 이상 억제), 바람직하게는 길항제 항-CD40 항체의 부재하에 다른 항-CD40 항체에 의해 유도된 B 세포 증식의 약 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0.5% 이하, 또는 심지어 약 0.1% 이하이다.
또 다른 구체예에서, 항-CD40 항체는 하기 실시예 4에 설명된 B 세포 활성화 분석에 의해 측정했을 때 셀라인 EL4B5에 의해 유도되는 B 세포 증식에 대한 길항제이며, 길항제 항-CD40 항체의 존재하에 EL4B5 셀라인에 의해 자극된 B 세포 증식의 수준은 길항제 항-CD40 항체의 부재하에 이 셀라인에 의해 유도된 B 세포 증식의 약 25% 이하(즉, 75% 이상 억제), 바람직하게는 길항제 항-CD40 항체의 부재하에 이 셀라인에 의해 유도된 B 세포 증식의 약 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0.5% 이하, 또는 심지어 약 0.1% 이하이다.
또 다른 구체예에서, 항-CD40 항체는 하기 실시예 4에 설명된 B 세포에 의한 항체 생산에 대한 인간 T 세포 헬퍼 분석에 의해 측정했을 때 인간 B 세포에 의한 인간 T 세포 유도 항체 생산에 대한 길항제이다. 이 방식에 의해, 길항제 항-CD40 항체의 존재하에 T 세포에 의해 자극된 B 세포에 의한 IgG 항체 생산, IgM 항체 생산, 또는 IgG와 IgM 항체 양자의 생산 수준은 길항제 항-CD40 항체의 부재하에 T 세포에 의해 자극된 B 세포에 의한 각각의 항체 생산의 약 50% 이하(즉, 75% 이상 억제), 바람직하게는 길항제 항-CD40 항체의 부재하에 T 세포에 의해 자극된 B 세포에 의한 각각의 항체 생산의 약 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0.5% 이하, 또는 심지어 약 0.1% 이하이다.
"CD40 리간드"는 하나 이상의 CD40 신호화 경로에 결합하여 그것을 활성화할 수 있는 어떤 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 의미한다. 따라서, "CD40 리간드"는 제한은 아니지만, 전장 CD40 리간드 단백질 및 CD40-발현 세포 상에서 CD40 신호화와 결합하여 그것을 자극하는 기능을 수행하기에 충분한 활성을 보유하는 그것의 변이체 및 단편을 포함한다. 자생 CD40 리간드, 예를 들어 인간 CD40 리간드 (CD40L; CD154라고도 알려졌다)에 대한 변형은 제한은 아니지만, 치환체, 결실체, 절단체, 확장체, 융합 단백질, 단편, 펩티드의태체 등을 포함한다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체의 생물학적 활성을 평가하기 위한 분석은 가용성 CD40L, 예를 들어 가용성 재조합 인간 CD40L(Alexis Corporation, Bingham, Nottinghamshire, UK)을 사용하여 CD40-발현 세포 상에서 CD40 신호화를 자극하는 것을 포함한다.
"CD40L-매개 CD40 신호화"는 세포-표면 수용체 CD40과 CD40 리간드 상호작용의 결과인 생물학적 활성들의 어느 것을 의미한다. CD40 신호화의 예는 CD40-발현 세포의 증식과 생존, 및 CD40-발현 세포에서 하나 이상의 CD40-신호화 경로의 자극을 가져오는 신호들이다. CD40 "신호화 경로" 또는 "신호전달 경로"는 CD40 수용체와 CD40 리간드, 예를 들어 CD40L 상호작용의 결과로서, 신호 경로를 통해서 전송되었을 때 신호화 연속단계에서 하나 이상의 하류 분자의 활성화를 가져오는 신호를 생성하는 적어도 하나의 생화학적 반응, 또는 일군의 생화학적 반응을 의미한다. 신호전달 경로는 세포 원형질막을 가로질러 하나 이상의 일련의 신호전달 분자를 지나, 세포의 세포질을 지나, 그리고 어떤 경우 세포의 핵으로까지 세포-표면 CD40 수용체로부터의 신호를 전송하는 다수의 신호전달 분자를 수반한다. CD40 신호전달 경로는, 예를 들어 AKT를 활성화하고, 마침내는 NF-κB 신호화 경로에 의해 NF-κB를 활성화하는 AKT 신호화 경로; 및 ERK 및 p38을 각각 활성화하는 MEK/ERK 및 MEK/p38 신호화 경로를 포함하는 미토겐-활성화 단백질 키나제(MAPK) 신호화 경로를 포함한다. 이들 신호화 경로의 활성화와 차단 사이의 균형에 따라 세포 생존이나 아톱토시스 중 어느 하나가 선호된다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 안정한 제약 조성물은 CD40L-매개 CD40 신호화를 차단하는 길항제 항-CD40 항체를 포함한다. CD40L-매개 CD40 신호화를 차단하는데 있어서 길항제 항-CD40 항체의 역할에 관한 더욱 상세한 설명은, 예를 들어 2003년 11월 4일, 2003년 11월 26일, 및 2004년 4월 27일자 제출되어 미국특허출원 제60/517,337호(대리인 사건번호 No. PP20107.001(035784/258442)), 제60/525,579호(대리인 사건번호 No. PP20107.002(035784/271525)), 및 제60/565,710호(대리인 사건번호 No. PP20107.003(035784/277214))를 각각 배정받은 가 출원들 발명의 명칭 "길항제 항-CD40 모노클로날 항체 및 그 사용 방법"; 및 2004년 11월 4일자 제출되어 WO 2005/044854로 공개된 국제특허출원 제PCT/US2004/037152호(대리인 사건번호 No. PP20107.004(035784/282916)) 발명의 명칭 "길항제 항-CD40 모노클로날 항체 및 그 사용 방법"을 참조하며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 참고자료로 본원에 포함된다. 또한, 2005년 12월 9일자 제출되어 미국특허출원 제60/749,285호(대리인 사건번호 No. PP028035.0002(035784/304312))를 배정받은 가 출원 발명의 명칭 "CD40 신호화에 의해 매개되는 증식성 장애의 진단 및 치료 방법", 및 2006년 5월 18일자 제출되어 WO 2006/125143로 공개된 대응 국제특허출원 제PCT/US2006/ 019414호; 그리고 2005년 12월 9일자 제출되어 미국특허출원 제60/749,336호(대리인 사건번호 No. PP028062.0002(035784/304311))를 배정받은 가 출원 발명의 명칭 "자가면역 및/또는 염증 성분을 갖는 질환의 진단 및 치료 방법", 및 2006년 5월 18일자 제출되어 WO 2006/125117로 공개된 대응 국제특허출원 제PCT/US2006/019325호(대리인 사건번호 No. PP028062.0003(035784/311608))을 참조하며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 참고자료로 본원에 포함된다.
본 발명의 안정한 액체 제약 조성물은 항-CD40 항체, 특히 길항제 항-CD40 항체 및/또는 그것의 항원-결합 단편을 포함한다. 다음의 용어 및 정의들이 이러한 항체에 적용된다.
"항체" 및 "면역글로불린"(Ig)은 동일한 구조적 특징을 갖는 당단백질이다. 이 용어들은 동의어로 사용된다. 어떤 경우, 면역글로불린의 항원 특이성이 알려질 수 있다.
용어 "항체"는 광범한 의미로 사용되며, 완전 조립 항체, 항원과 결합할 수 있는 단편(예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv, 단쇄 항체, 디아체, 항체 키메라, 하이브리드 항체, 이중특이적 항체, 인간화 항체 등), 및 전술한 것을 포함하는 재조합 펩티드들을 포괄한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체" 및 "mAb"는 실질적으로 동종성인 항체 집단으로부터 획득한 항체를 말하는데, 즉 이 집단을 구성하는 각 항체는 소량 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다.
"천연 항체" 및 "천연 면역글로불린"은 일반적으로 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머 당단백질로서, 2개의 동일한 경쇄(L)와 2개의 동일한 중쇄(H)로 이루어진다. 각 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되지만, 이황화 결합의 수는 상이한 면역글로불린 이소타입의 중쇄에 따라서 다양하다. 또한, 각 중쇄 및 경쇄는 규칙적 간격으로 사슬내 이황화 다리를 가진다. 각 중쇄는 한쪽 단부에 가변 도메인(VH)을 가지고, 여기에 다수의 불변 도메인이 이어진다. 각 경쇄는 한쪽 단부에 가변 도메인(VL)을 가지고, 다른쪽 단부에 불면 도메인을 가진다; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 첫번째 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기들이 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이의 경계면을 형성한다고 생각된다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 어떤 일부분이 항체에 따라서 그 서열이 광범하게 다르다는 사실을 말한다. 가변 영역이 항원-결합 특이성이 부여한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 균일하게 분포되지 않는다. 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에 있어서 상보성 결정 영역(CDR) 또는 초가변 영역이라고 불리는 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인에서 더욱 고도로 보존되는 부분은 프레임워크(FR) 영역이라고 한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR 영역을 포함하며, 이들은 대부분 β-플리트-시트 입체구조를 취하고 있고, 3개의 CDR에 의해 연결되어 β-플리트-시트 구조를 연결하고, 어떤 경우 이 구조의 일부를 형성하기도 하는 루프를 형성한다. 각 사슬 내의 CDR은 FR 영역에 의해 아주 근접하여 함께 고정되며, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(Kabat et al. (1991) NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669 참조). 불변 도메인은 항체와 항원의 결합에 직접 연루되지는 않지만, Fc 수용체(FcR) 결합, 항체-의존성 세포 독성에서 항체의 참여, 보체 의존성 세포독성의 개시, 및 비만세포 탈과립화 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "초가변 영역"은 항원-결합을 초래하는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"(즉, 경쇄 가변 도메인의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3) 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 31-35(H1), 50-65(H2), 95-102(H3); Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD)로부터의 아미노산 잔기 및/또는 "초가변 루프"로부터의 이들 잔기(즉, 경쇄 가변 도메인의 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 및 중쇄 가변 도메인의 (H1), 53-55(H2), 96-101(H3); Clothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol, 196:901-917)를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기라고 본원에서 간주된다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부분, 바람직하게는 무손상 항체의 항원-결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab, F(ab')2 및 Fv 단편; 디아체; 선형 항체(Zapata et al. (1995) Protein Eng. 10:1057-1062); 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편들로 형성된 다중-특이적 항체를 포함한다. 항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편이라고 하는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생산하며, 이것 각각은 단일 항원-결합 부위, 및 잔류 "Fc" 단편을 가지는데, "Fc"란 이름은 쉽게 결정화하는 능력을 반영하는 이름을 반영한다. 펩신 처리에 의해서는 2개의 항원-결합 부위를 가지며 여전히 항원과 교차결합할 수 있는 F(ab')2 단편이 산출된다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인의 밀착된 비-공유 결합 다이머로 구성된다. 이 입체구조에서는 각 가변 도메인의 3개의 CDR들이 상호작용하여 VH-VL 다이머의 표면에 항원-결합 부위를 한정한다. 전체적으로 6개의 CDR이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 반쪽 Fv)이라도 항원을 인식하여 결합하는 능력을 가질 수 있지만, 전체 결합 부위보다는 친화성이 저하된다.
또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 첫번째 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기가 첨가되기 때문에 Fab' 단편과는 다르다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 자유 티올기를 지니는 Fab'를 말한다. Fab' 단편은 F(ab')2 단편의 중쇄 이황화 다리를 환원시킴으로써 생산된다. 또한, 항체 단편들의 기타 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.
어떤 척추동물 종에서 유래하는 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파(κ) 및 람다(λ)라고 하는 2개의 분명히 구별되는 타입 중 하나를 배정받을 수 있다.
중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라서 면역글로불린은 상이한 부류에 배정될 수 있다. 인간 면역글로불린에는 5가지 주 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM가 있고, 이들 중 몇몇은 하위부류(이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 더 구분될 수 있다. 상이한 면역글로불린 부류에 대응하는 중쇄 불변 도메인을 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤라고 한다. 상이한 면역글로불린 부류의 서브유닛 구조와 3-차원 입체구조는 잘 공지되어 있다. 상이한 이소타입은 상이한 이펙터 기능을 가진다. 예를 들어, 인간 IgG1 및 IgG3 이소타입은 ADCC(항체-의존성 세포-매개 세포독성) 활성을 가진다.
본원에서 사용된 용어 "표지"는 "표지된" 항체를 생성하기 위하여 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 콘쥬게이트된 검출가능한 화합물 또는 조성물을 말한다. 표지는 자체적으로 검출될 수도 있고(예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우, 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매함으로써 검출될 수도 있다.
본원에서 사용된 "숙주 세포"는 재조합 벡터 또는 기타 다른 전달 폴리뉴클레오티드의 수용자로서 사용될 수 있거나 또는 사용되었던 단세포체로서 배양된 유기체 또는 진핵세포 또는 셀라인을 말하며, 트랜스펙션된 모 세포의 자손을 포함한다. 단일 세포의 자손이 자연적, 우연적 또는 계획적 돌연변이로 인해 원래 모 세포와 형태 면에서 또는 게놈 면에서 또는 총 DNA 보체 면에서 반드시 완전히 동일할 수는 없다는 것이 이해된다.
"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게, 이 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하며 항원-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초혈단핵세포(PBMC), 자연살상(NK) 세포, 단핵구, 대식세포, 호산구, 및 호중구를 포함하며, PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. ADCC 활성을 갖는 항체는 전형적으로 IgG1 또는 IgG3 이소타입을 가진다. IgG1 및 IgG3 항체의 분리에 더하여, 이러한 ADCC-매개 항체는 IgG1 또는 IgG3 이소타입 불변 영역에 맞게 비-ADCC 항체로부터의 가변 영역이나 가변 영역 단편을 조작함으로써 제조될 수 있다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"는 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명하기 위해 사용된다. 바람직한 FcR은 천연-서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG(감마 수용체) 항체에 결합하는 것으로서, FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 하위부류의 수용체들을 포함하며, 또한 이들 수용체의 대립형질 변이체 및 선택적 스플라이스 형태들도 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("억제 수용체")를 포함하며, 이들은 주로 세포질 도메인에서만 상이한 유사한 아미노산 서열을 가진다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프(ITIM)을 함유한다(Daeron (1997) Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 참조). FcR은 Ravetch and Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel et al. (1994) Immunomethods 4:25-34; 및 de Haas et al. (1995) J. Lab. Clin. Med. 126:330-341에서 고찰된다. 장치 확인될 것들을 포함하여 기타 다른 FcR들도 본원에서 사용되는 용어 "FcR"에 의해 포괄된다. 또한, 이 용어는 모체 IgG의 태아로의 전달을 초래하는 신생아 수용체인 FcRN도 포함한다(Guyer et al. (1976) J. Immunol. 117:587; 및 Kim et al. (1994) J. Immunol. 24:249 (1994)).
인간 항체를 제조할 수 있는 많은 방식이 있다. 예를 들어, 엡스타인-바 바이러스(EBV)로 감염시켜 분비 세포를 불멸화할 수 있다. 그러나, EBV-감염 세포는 클로닝이 어려우며, 일반적으로 상대적으로 낮은 수율의 면역글로불린을 생산할 뿐이다(James and Bell (1987) J. Immunol. Methods 100:5-40). 앞으로는 인간 B 세포의 불멸화가 아마도 형질전환 유전자의 한정적 조합의 도입에 의해서 달성될지도 모른다. 이러한 가능성은 SV40 대형 암단백질 및 H-ras의 암유발 대립형질과 함께 텔로머라제 촉매 서브유닛의 발현이 정상 인간 상피세포 및 섬유아세포의 종양형성성 전환을 야기했다는 최근 증명에 의해 강조되고 있다(Hahn et al. (1999) Nature 400:464-468). 이제는 내인성 면역글로불린의 생산 없이 일련의 인간 항체를 면역화시 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물(예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 가능하다(Jakobovits et al.(1993) Nature 362:255-258; Lonberg and Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93; Fishwild et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14:845-851; Mendez et al. (1991) Nat. Genet. 15:146-156; Green (1999) J. Immunol. Methods 231:11-23; Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727; Lit-tle et al.(2000) Immunol. Today 21:364-370에서 고찰됨). 예를 들어, 키메라 및 점라인 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역(JH) 유전자의 동종접합성 결실이 내인성 항체 생산을 완전히 억제한다는 것이 설명되었다(Jakobovits et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555). 이러한 점라인 돌연변이 마우스에 인간 점라인 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 시험감염시 인간 항체의 생산을 야기한다(Jakobovits et al. (1993) Nature 362:255-258). Mendez 등(Nature Genetics 15:146-156, 1997)은 항원으로 시험감염시켰을 때 높은 친화성의 완전한 인간 항체를 생성하는 일련의 트렌스제닉 마우스를 생성하였다. 이것은 상기 설명된 대로 내인성 JH 세그먼트에 결실을 가진 마우스에 메가베이스 인간 중쇄 및 경쇄 유전자좌를 점라인 통합시킴으로써 달성되었다. 이들 마우스(XenoMouse
Figure 112008073008134-PCT00001
II 기법(Abgenix; Fremont, California))는 대략 66개 VH 유전자, 완전한 DH 및 JH 영역, 및 3개의 상이한 불변 영역을 함유하는 1,020 kb의 인간 중쇄 유전자좌를 보유하며, 또한 32개 VK 유전자, JK 세그먼트, 및 CK 유전자를 함유하는 800 kb의 인간 K 유전자좌를 보유한다. 이들 마우스에서 생산된 항체는 유전자 재배열, 조립 및 레퍼토리를 포함한 모든 면이 인간에서 나타나는 것과 매우 비슷하다. 뮤린 유전자좌에 유전자 재배열을 방지하는 내인성 세그먼트의 결실로 인하여 내인성 항체에 비해 인간 항체가 우선적으로 발현된다. 이러한 마우스는 특정 해당 항원으로 면역화될 수 있다.
이러한 면역화된 동물의 혈청은 초기 항원에 대한 항체 반응성에 대해 스크리닝될 수 있다. 림프구가 림프절이나 비장세포로부터 분리될 수 있으며, CD138-음성 및 CD19-양성 세포를 선별함으로써 B 세포에 대해 더 선별될 수 있다. 한 양태에서, 이러한 B 세포 배양물(BCC)을 골수종 세포와 융합하여 상기 상세히 설명된 하이브리도마를 생성할 수 있다.
다른 양태에서, 이러한 B 세포 배양물은 바람직하게는 초기 항원에 대한 반응성에 대해 더 스크리닝될 수 있다. 이러한 스크리닝은 표적/항원 단백질을 사용한 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 해당 항원과 결합하는 기지 항체를 사용한 경합 분석, 및 표적 항원을 발현하는 일시적으로 트랜스펙션된 CHO 또는 다른 세포에 대한 시험관내 결합을 포함한다.
CD40에 대한 모노클로날 항체가 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Mc-Michael, ed.(1987; 1989) Leukocyte Typing III and IV(Oxford University Press, New York)에서 B-세포 항원에 관해 설명한 섹션들; 미국특허 제5,674,492호; 제5,874,082호; 제5,677,165호; 제6,056,959호; WO 00/63395; 국제공보 WO 02/28905 및 WO 02/28904; Gordon et al.(1988) J. Immunol. 140:1425; Valle et al. (1989) Eur. J. Immunol. 19:1463; Clark et al.(1986) PNAS 83:4494; Paulie et al(1989) J. Immunol. 142:590; Gordon et al. (1987) Eur. J. Immunol. 17:1535; Jabara et al. (1990) J. Exp. Med. 172:1861; Zhang et al. (199I) J. Immunol. 146:1836; Gascan et al.(199I) J. Immunol. 147:8; Banchereau et al.(1991) Clin. Immunol. Spectrum 3:8; 및 Banchereau et al. (1991) Science 251:70를 참조하며, 이들 모두는 본원에 참고자료로 포함된다. 기타 다른 항-CD40 모노클로날 항체는 제한은 아니지만, 뮤린 항-CD40 항체 SGN-14(Francisco et al.(2000) Cancer Res. 60:3225 -31)의 인간화 형태인 인간화 항-CD40 항체, 예를 들어 SGN-40(Tai et al. (2004) Cancer Res. 64:2846-52; 미국특허 제6,838,261호), 및 미국특허출원 공보 제2004/ 0120948에 개시된 작동제 및 길항제 항체들을 포함하며, 이들 문헌은 그 전문이 참고자료로 본원에 포함된다.
본 발명에서 특히 관심있는 것은 CD40L-매개 CD40 신호화를 차단하는 기능을 하고, 또한 예를 들어 하기 설명되는 CHIR-12.12 항체와 마찬가지로, ADCC를 조정할 수도 있는 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이다.
본 발명의 안정한 액체 제약 조성물에 사용되는 길항제 항-CD40 항체는 인간 세포의 표면에서 발현되는 인간 CD40 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함한다. 어떤 구체예에서, 안정한 액체 제약 조성물 중의 길항제 항-CD40 항체는 CD40 세포-표면 항원에 대한 강한 단일-부위 결합 친화성을 나타낸다. 이러한 모노클로날 항체는 Biacore™ 같은 표준 분석평가법에 의해 측정했을 때, 적어도 10-5 M, 적어도 3 X 10-5 M, 바람직하게 적어도 10-6 M 내지 10-7 M, 더 바람직하게 적어도 10-8 M 내지 약 10-12 M의 CD40에 대한 해리평형상수(KD)를 나타낸다. Biacore 분석은 본 분야에 공지되어 있으며, "BIA-applications handbook"에 상세히 설명된다. 결합 친화성은 WO 01/27160에 설명된 방법을 사용하여 조정될 수 있다.
특히 관심있는 것은 인간 세포 상의 CD40 항원에 결합했을 때, 특히 신생물성 인간 B 세포 상의 CD40 항원에 결합했을 때 상기 정의된 유의한 작동제 활성은 없지만 길항제 활성을 나타내는 길항제 항-CD40 항체이다. 본 발명의 한 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체는 한 가지 B 세포 반응에서 유의한 작동제 활성이 없다. 본 발명의 다른 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체는 한 가지 이상의 B 세포 반응(예를 들어, 증식 및 분화, 또는 증식, 분화, 및 항체 생산)의 분석에서 유의한 작동제 활성이 없다. 적합한 모노클로날 항-CD40 항체는 인간 불변 영역을 가진다; 이들은 또한 전체적으로 또는 부분적으로 인간화된 프레임워크 영역을 가지는 것이 바람직하다; 가장 바람직한 것은 완전한 인간 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이다. 이러한 모노클로날 항체의 예는 본원에서 CHIR-5.9 및 CHIR-12.12로서 명명된 항체들이다.
따라서, 어떤 구체예에서, 본 발명의 안정한 액체 제약 조성물에 존재하는 길항제 항-CD40 항체는 모노클로날 항체 CHIR-5.9 또는 CHIR-12.12이다. CHIR-5.9 및 CHIR-12.12 항체는 하이브리도마 셀라인 131.2F8.5.9(본원에서는 셀라인 5.9라고 한다) 및 153.8E2.D10.D6.12.12(본원에서는 셀라인 12.12라고 한다)로부터 생산된 IgG1 이소타입의 완전한 인간 항-CD40 모노클로날 항체이다. 이들 셀라인은 인간 IgG1 중쇄 유전자좌와 인간 κ 사슬 유전자좌를 함유하는 면역화된 제노타입 마우스로부터의 비장세포를 사용하여 만들었다(XenoMouse
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기법; Abgenix; Fremont, California). 비장세포를 마우스 골수종 SP2/0 세포(Sierra BioSource)와 융합시켰다. 결과의 하이브리도마를 여러번 하위 클로닝하여 안정한 모노클로날 셀라인 5.9 및 12.12를 만들었다. 본 발명의 다른 항체들도 인간 면역글로불린 유전자좌에 대한 트랜스제닉 마우스를 이용하여, 또는 본 분야에 공지되고 및/또는 본원에 설명된 다른 방법들에 의해 유사하게 제조될 수 있다.
CHIR-12.12 항체의 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 및 CHIR-5.9 항체의 가변 영역의 아미노산 서열이 본원에 개시된다. 더 구체적으로, mAb CHIR-12.12에 대한 경쇄 및 중쇄의 리더, 가변, 및 불변 영역의 아미노산 서열이 SEQ ID NO:2(mAb CHIR-12.12의 경쇄의 완전한 서열), SEQ ID NO:4(mAb CHIR-12.12의 중쇄의 완전한 서열), 및 SEQ ID NO:5(SEQ ID NO:4에 제시된 mAb CHIR-12.12의 중쇄의 변이체의 완전한 서열, 여기서 변이체는 SEQ ID NO:4의 위치 153에 알라닌 잔기 대신 세린 치환을 포함한다)에 제시된다. mAb CHIR-12.12의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1(mAb CHIR-12.12의 경쇄 코팅 서열) 및 SEQ ID NO:3(mAb CHIR-12.12의 중쇄 코딩 서열)에 제시된다. CHIR-5.9 mAb의 경쇄 및 중쇄의 리더, 가변, 및 불변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:6(mAb CHIR-5.9의 경쇄의 완전한 서열), SEQ ID NO:7(mAb CHIR-5.9의 중쇄의 완전한 서열), 및 SEQ ID NO:8(SEQ ID NO:7에 제시된 mAb CHIR-5.9의 중쇄의 변이체의 완전한 서열, 여기서 변이체는 SEQ ID NO:7의 위치 158에 알라닌 잔기 대신 세린 치환을 포함한다)에 제시된다. 또한, CHIR-5.9(마우스 하이브리도마 라인 131.2F8.5.9(CMCC#12047) 항체 및 CHIR-12.12(마우스 하이브리도마 라인 153.8E2.D10.D6.12.12(CMCC#12056) 항체를 발현하는 하이브리도마가 2003년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection; 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209 (USA))에 기탁되었고, 각각 PTA-5542 및 PTA-5543의 특허기탁명을 받았다.
길항제 활성에 더하여, 본 발명의 안정한 액체 제약 조성물에 사용되는 항-CD40 항체는 종양 세포에 대한 또 다른 작용 메커니즘을 가질 수도 있다. 예를 들어, 자생 CHIR-5.9 및 CHIR-12.12 항체는 ADCC 활성을 가진다. 또는 달리, CHIR-5.9 및 CHIR-12.12 항체의 가변 영역이 ADCC 활성을 갖는 또 다른 항체 이소타입 상에 발현될 수도 있다. 또한, 하기 주지된 대로, CHIR-5.9 또는 CHIR-12.12의 천연 형태, 재조합 형태, 또는 항원-결합 단편과 세포독소, 치료제, 또는 방사성 금속 이온 또는 방사성 동위원소를 콘쥬게이트하는 것도 가능하다.
유세포분석에 의해 측정했을 때, CHIR-5.9 및 CHIR-12.12 모노클로날 항체는 ELISA-타입 분석에서 가용성 CD40과 결합하고, 세포-표면 CD40과 CD40 리간드의 결합을 방지하고, 이미 결합되어 있는 CD40 리간드를 전위시킨다. 항체 CHIR-5.9와 CHIR-12.12는 CD40과의 결합에서 서로 경합하지만 15B8과는 경합하지 않는다. 15B8은 2000년 10월 2일자 제출된 미국 가 출원 제60/237,556호 발명의 명칭 "인간 항-CD40 항체", 및 2001년 10월 2일자 제출된 PCT 국제출원 제PCT/USO/30857호 발명의 명칭 "인간 항-CD40 항체"에 설명된 항-CD40 모노클로날 항체이며, 이들 문헌은 모두 그 전문이 본원에 참고자료로 포함된다. 정상 인간 피험자에서 유래하는 B 세포의 증식에 대한 효과를 시험관내 시험했을 때, CHIR-5.9와 CHIR-12.12는 길항제 항-CD40 항체로서 작용한다. 또한, CHIR-5.9와 CHIR-12.12는 정상 피험자에서 유래하는 인간 림프구의 강한 증식을 유도하지 않는다. 이들 항체는 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)에 의해 CD40-발현 표적 세포를 죽일 수 있다. Biacore™ 분석에 의해 측정했을 때, 인간 CD40에 대한 CHIR-5.9의 결합 친화성은 1.2 X 10-8 M이고, CHIR-12.12의 결합 친화성은 5 X 10-10 M이다.
상기 설명된 모노클로날 항체 CHIR-5.9 및 CHIR-12.12의 결합 특성을 공유하는 다른 길항제 항-CD40 항체는 제한은 아니지만 다음의 것들을 포함한다: (1) 각각 특허기탁번호 No. PTA-5542 및 No. PTA-5543로 ATCC에 기탁된, 131.2F8.5.9(본원에서는 셀라인 5.9라고 한다) 및 153.8E2.D10.D6.12.12(본원에서는 셀라인 12.12라고 한다)로 명명된 하이브리도마 셀라인에 의해 생산되는 모노클로날 항체; (2) SEQ ID NO:2에 나타낸 서열, SEQ ID NO:4에 나타낸 서열, SEQ ID NO:5에 나타낸 서열, SEQ ID NO:2와 SEQ ID NO:4에 나타낸 두 서열, 및 SEQ ID NO:2와 SEQ ID NO:5에 나타낸 두 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 모노클로날 항체; (3) SEQ ID NO:6에 나타낸 서열, SEQ ID NO:7에 나타낸 서열, SEQ ID NO:8에 나타낸 서열, SEQ ID NO:6과 SEQ ID NO:7에 나타낸 두 서열, 및 SEQ ID NO: 6과 SEQ ID NO:8에 나타낸 두 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 모노클로날 항체; (4) SEQ ID NO:1에 나타낸 뉴클레오티드 서열, SEQ ID NO:3에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 및 SEQ ID NO:1과 SEQ ID NO:3에 나타낸 두 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 모노클로날 항체; (5) 하이브리도마 셀라인 5.9 또는 하이브리도마 셀라인 12.12에 의해 생산되는 모노클로날 항체와 결합할 수 있는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체; (6) SEQ ID NO:10 또는 SEQ ID NO:12에 나타낸 아미노산 서열의 잔기 82-87을 포함하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체; (7) 경합 결합 분석에서 모노클로날 항체 CHIR-5.9 또는 CHIR-12.12와 경합하는 모노클로날 항체; 및 (8) CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9 모노클로날 항체 또는 선행하는 항목 (1)-(7)에서 전술한 모노클로날 항체의 항원-결합 단편인 모노클로날 항체, 여기서 단편은 인간 CD40 항원과 특이적으로 결합하는 능력을 보유한다.
당업자는 본원에 설명된 항체 및 이들의 항원-결합 단편이 본 분야에 잘 공지되어 있으며 하기 설명된 방법을 이용하여 재조합적으로 생산된 항체 및 그것의 항원-결합 단편을 포함한다는 것을 인정하며, 이것은, 예를 들어 재조합적으로 생산된 모노클로날 항체 모노클로날 항체 CHIR-5.9 및 CHIR-12.12를 포함한다.
추가의 길항제 항-CD40 항체는 ATCC Accession No. HB 11339, No. HB 12024 및 No. HB 11340를 갖는 하이브리도마에 의해 각각 분비되는 5D12, 3A8 및 3C6라고 하는 모노클로날 항체를 포함한다. 예를 들어, 본원에 그 전문이 참고자료로 포함되는 미국특허 제6,315,998호를 참조한다.
다른 길항제 항-CD40 항체들도 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 그 전문이 참고자료로 포함되는 미국특허출원 공보 제2002/0142358호 및 제2003 /0059427호에 개시된 F4-465로 명명된 하이브리도마에 의해 생산되는 인간 항-CD40 항체를 참조한다. F4-465는 HAC 마우스로부터 획득되었으며(Kuroiwa et al.(2000) Nature Biotech. 10:1086 (2000)), 따라서 인간 람다 경쇄를 발현한다.
본 발명의 제약 조성물을 위한 항체의 생산
본 발명의 제약 조성물에 사용하기 위한 항체, 예를 들어 본원에 개시된 길항제 항-CD40 항체는 당업자에게 공지된 어떤 항체 생산 방법을 이용해서도 생산될 수 있다. 따라서, 폴리클로날 혈청이 종래의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 먼저 해당 항원, 즉 CD40 항원을 함유하는 용액을 사용하여 적합한 동물, 바람직하게는 마우스, 래트, 토끼, 또는 염소를 면역화한다. 토끼나 염소가 획득할 수 있는 혈청 부피, 및 표지된 항-토끼 및 항-염소 항체의 활용성으로 인해 폴리클로날 혈청의 제조에 바람직하다.
폴리클로날 혈청은 트랜스제닉 동물, 바람직하게 인간 면역글로불린 유전자좌를 보유한 마우스에서 제조될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 해당 단백질, 예를 들어 CD40을 발현하는 Sf9 세포가 면역원으로 사용된다. 또한, 면역화는 식염수, 바람직하게 Freund 완전 애쥬번트 같은 애쥬번트 중에서 항원-함유 용액을 혼합 또는 유화하고, 혼합물 또는 유화물을 비경구(일반적으로 피하 또는 근육내) 주사함으로써 수행될 수 있다. 전형적으로 50-200 ㎍/주사 용량이 충분하다. 면역화는 일반적으로 2-6주 후에 식염수 중의 단백질을 1회 이상 주사하여 추가접종되며, 이때는 Freund 불완전 애쥬번트를 사용하는 것이 바람직하다. 또는 달리, 본 분야에 공지된 방법을 이용하여 시험관내 면역화에 의해 항체를 생성할 수 있으며, 본 발명의 취지에 따르면, 이것은 생체내 면역화와 동등하다고 간주된다. 유리나 플라스틱 용기에 면역화된 동물의 혈액을 채혈하고, 이 혈액을 25℃에서 1시간 인큐베이션한 다음, 이어서 4℃에서 2-18시간 인큐베이션함으로써 폴리클로날 항혈청이 획득된다. 혈청은 원심분리에 의해 회수되며(예를 들어, 1,000 x g 10분), 토끼로부터 채혈 당 약 20-50 ml가 획득될 수 있다.
Sf9(스포돕테라 프루지퍼다; Spodoptera frugiperda)의 생산에 관해서는 본원에 참고자료로 포함되는 미국특허 제6,004,552호에 개시된다. CD40의 경우, 간단히 말해서, 인간 CD40을 암호화하는 서열을 전달 벡터를 이용하여 배큘로바이러스에 재조합하였다. 플라스미드를 야생형 배큘로바이러스 DNA로 Sf9 세포에 트랜스펙션하였다. 재조합 배큘로바이러스-감염 Sf9 세포를 확인하고 클로닝 정제하였다.
항체는 본질상 모노클로날인 것이 바람직하다. "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종성인 항체 집단으로부터 획득한 항체를 의미하는데, 즉 이 집단을 구성하는 각 항체는 소량 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 이 용어는 항체의 종이나 출처에 관한 제한이 아니다. 이 용어는 전체 면역글로불린뿐만 아니라, Fab, F(ab')2, Fv, 및 항체의 항원-결합 기능을 보유하는 기타 단편들 같은 단편들을 포괄한다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원 부위를 향한다; 예를 들어, 항-CD40 항체의 경우는 CD40 세포-표면 항원이다. 더욱이, 전형적으로 상이한 결정소(에피토프)를 향하는 상이한 항체들을 포함하는 종래의 (폴리클로날) 항체 제제와는 반대로, 각 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정소를 향한다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동종성인 항체 집단으로부터 획득한 것이라는 항체의 성격을 암시하는 것이지, 어떤 특정한 방법에 의해 항체가 생산될 필요를 의미하는 것이 아니다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 모노클로날 항체는 Kohler et al. (1975) Nature 256:495에 최초로 설명된 하이브리도마 방법에 의해 제조되거나, 또는 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국특허 제4,816,567호 참조)에 의해 제조될 수 있다. 또한, "모노클로날 항체"는, 예를 들어 Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597; 및 미국특허 제5,514,548호에 설명된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수 있다.
"에피토프"는 항체가 생산되고 항체가 결합되는 항원 분자 부분을 의미한다. 에피토프는 선형 아미노산 잔기(즉, 에피토프 내의 잔기가 선형 방식으로 서로 순차적으로 정렬된다), 비선형 아미노산 잔기(본원에서는 "비선형 에피토프"라고 한다; 이들 에피토프는 순차적으로 정렬되지 않는다), 또는 선형 및 비선형 아미노산 잔기 양자 모두를 포함할 수 있다.
모노클로날 항체는 Kohler et al. (1975) Nature 256:495-496의 방법이나 이의 변형을 이용하여 제조될 수 있다. 전형적으로 마우스를 항원을 함유하는 용액으로 면역화한다. 면역화는 식염수, 바람직하게 Freund 완전 애쥬번트 같은 애쥬번트 중에서 항원-함유 용액을 혼합 또는 유화하고, 혼합물 또는 유화물을 비경구(일반적으로 피하 또는 근육내) 주사함으로써 수행될 수 있다. 본 분야에 공지된 어떤 면역화 방법도 본 발명의 모노클로날 항체를 얻는데 사용될 수 있다. 동물의 면역화 후, 비장(및 선택적으로 몇 개의 큰 림프절)을 제거하여 단일 세포로 분리한다. 해당 항원을 코팅한 플레이트 또는 웰에 세포 현탁액을 도포함으로써 비장세포가 스크리닝될 수 있다. 항원에 특이적인 B 세포 발현 막 결합 면역글로불린이 플레이트에 결합되며 이것은 세척시 제거되지 않는다. 다음에, 결과의 B 세포, 또는 모든 분리된 비장세포와 골수종 세포의 융합을 유도하여 하이브리도마를 형성하고 선택적 배지에서 배양한다. 결과의 세포를 연속 희석 방식으로 평판하고, 해당 항원과 특이적으로 결합하는(그리고 관련 없는 항원과는 결합하지 않는) 항체의 생산에 대해 분석한다. 다음에, 선별된 모노클로날 항체(mAb)-분비 하이브리도마를 시험관내(예를 들어, 조직 배양병 또는 중공 섬유 반응기에서), 또는 생체내(마우스 복수로서) 배양한다.
길항제 항-CD40 항체가 재조합 DNA 방법을 이용하여 제조되는 경우, 모노클로날 항체를 암호화하는 DNA는 종래 과정을 이용하여 쉽게 분리되어 서열화된다(예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한다). 본원에 설명된 하이브리도마 세포가 이러한 DNA의 바람직한 출처로서 사용된다. 일단 분리한 다음, DNA를 발현 벡터에 집어 넣고, 대장균(E. coli) 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 면역글로불린 단백질을 달리 생산하지 않는 골수종 세포 등의 숙주 세포에 트랜스펙션하여, 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 달성한다. 항체를 암호화하는 DNA의 박테리아 내 재조합 발현에 관한 검토 논문들로는 Skerra et al. (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5:256; 및 Phickthun (1992) Immunol. Revs. 130:151가 있다. 또는 달리, 항체는 CHO 셀라인 같은 셀라인에서 생산될 수 있으며, 이것에 관해서는 본원에 참고자료로 포함되는 미국특허 제5,545,403호; 제5,545,405호; 및 제5,998,144호에 개시된다. 간단히 말해서, 셀라인을 각각 경쇄 및 중쇄를 발현할 수 있는 벡터로 트랜스펙션한다. 별개의 벡터 상에서 이 2개의 단백질을 트랜스펙션함으로써 키메라 항체가 생산될 수 있다. 다른 이점으로는 항체의 정확한 글리코실화가 있다.
어떤 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체, 예를 들어 CHIR- 12.12 또는 CHIR-5.9 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편은 마커로서 글루타민 합성효소를 사용하는 GS 유전자 발현 시스템(Lonza Biologies, Portsmouth, New Hampshire)을 이용하여 CHO 세포에서 생산된다. 미국특허 제5,122,464호; 제5,591,639호; 제5,658,759호; 제5,770,359호; 제5,827,739호; 제5,879,936호; 제5,891,693호; 및 제5,981,216호를 또한 참조하며, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 참고자료로 포함된다.
추가하여, 본 발명의 제약 조성물에 사용되는 항체는 바람직한 결합 특성을 갖는 키메라 항체일 수 있다. 따라서, 예를 들어 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 키메라 항-CD40 항체는 본원에 설명된 CHIR-5.9 및 CHIR-12.12 모노클로날 항체의 결합 특성을 가질 수 있다. "키메라" 항체는 가장 바람직하게는 재조합 데옥시리보핵산 기술을 이용하여 유도되며, 인간(면역학적으로 "친족" 종들을 포함한다, 예를 들어 침팬지) 성분과 비-인간 성분을 모두 포함하는 항체를 의미한다. 따라서, 키메라 항체의 불변 영역은 천연 인간 항체의 불변 영역과 실질적으로 동일한 것이 가장 바람직하며, 키메라 항체의 가변 영역은 비-인간 출처로부터 유도되고, 해당 항원, 즉 CD40 항원에 대한 바람직한 항원 특이성을 가지는 것이 가장 바람직하다. 비-인간 출처는 인간 항원 또는 인간 CD40 항원을 포함하는 물질에 대한 항체를 생성하는데 사용될 수 있는 어떤 척추동물 출처일 수 있다. 이러한 비-인간 출처는 제한은 아니지만, 설치류(예를 들어, 토끼, 래트, 마우스 등; 예를 들어 본원에 참고자료로 포함되는 미국특허 제4,816,567호 참조) 및 비-인간 영장류(예를 들어, 구세계 원숭이, Ape 원숭이 등; 예를 들어 본원에 참고자료로 포함되는 미국특허 제5,750,105호 및 제5,756,096호 참조)를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "면역학적 활성"은, 예를 들어 키메라 항-CD40 항체와 관련하여 사용되었을 때는 인간 CD40과 결합하는 키메라 항체를 의미한다.
"인간화"는 비-인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 항체 형태를 의미한다. 대부분 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역(상보성 결정 영역 또는 CDR이라고도 한다)의 잔기들이 바람직한 특이성, 친화성, 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼, 또는 비-인간 영장류 등의 비-인간 종(공여자 항체)의 초가변 영역의 잔기들로 치환된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 용어 "상보성 결정 영역"은 함께 천연 면역글로불린 결합 부위의 천연 Fv 영역의 결합 친화성 및 특이성을 한정하는 아미노산 서열을 말한다. 예를 들어, Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Kabat et al. (1991) U.S. Dept. of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조). 용어 "불변 영역"은 이펙터 기능을 부여하는 항체 분자 부분을 말한다. 인간 질환의 치료에 사용하기 위한 비-면역원성 항체의 생산에 관한 이전 연구에서는 마우스 불변 영역이 인간 불변 영역으로 치환되었다. 피험자 인간화 항체의 불변 영역은 인간 면역글로불린에서 유래하였다. 그러나, 이들 인간화 항체는 여전히 인간에서 원치않는 잠재적으로 위험한 면역반응을 도출했으며 친화성의 손실이 있었다. 본 발명의 제약 조성물에 사용하기 위한 인간화 항체, 예를 들어 인간화 항-CD40 항체는 해당 모 항체, 예를 들어 본원에 설명된 CHIR-5.9 및 CHIR-12.12 모노클로날 항체에 의해 나타나는 것들과 유사한 결합 특성을 가진다.
인간화는 설치류 또는 돌연변이 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 상응하는 인간 항체 서열로 치환하는 것에 의해 본질적으로 Winter와 공동 연구자들의 방법(Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536)에 따라서 수행될 수 있다. 본원에 참고자료로 포함되는 미국특허 제5,225,539호; 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 제5,859,205호를 또한 참조한다. 어떤 경우에는, 인간 면역글로불린의 하나 이상의 가변 영역의 프레임워크 영역이 상응하는 비-인간 잔기로 치환되기도 한다(예를 들어, 미국특허 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 및 제6,180,370호 참조). 더욱이, 인간화 항체는 수용자 항체나 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이런 변형은 항체의 성능을 더욱 정교하게 만든다(예를 들어, 바람직한 친화성의 달성을 위해). 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전체를 포함할 것이며, 이 가변 도메인에서 초가변 영역의 전체 또는 실질적으로 전체는 비-인간 면역글로불린의 영역에 상응하고, 프레임워크 영역의 전체 또는 실질적으로 전체는 인간 면역글로불린 서열의 상응하는 영역이다. 또한, 인간화 항체는 선택적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부분, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 일부분을 포함할 것이다. 더 상세한 내용에 관해서는 Jones et al. (1986) Nature 331:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329; 및 Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596를 참조하며, 모두 본원에 참고자료로 포함된다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적은 영역이 비-인간 종들의 상응하는 서열로 치환된 항체를 포함할 수 있다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기와 가능하다면 일부 프레임워크 잔기가 설치류 항체에 있는 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다. 예를 들어, 미국특허 제5,225,539호; 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 제5,859,205호 참조. 또한, 미국특허 제6,180,370호 및 국제공보 WO 01/27160를 참조하며, 여기에 정해진 항원에 대한 개선된 친화성을 갖는 인간화 항체 및 인간화 항체 생산 기술의 개시된다.
또한, 본 발명은 불활성화 내인성 면역글로불린(Ig) 유전자좌를 특징으로 하는 비-인간 포유동물 숙주, 더 구체적으로 트랜스제닉 마우스에서 생산된 이종개체성 또는 변형된 항체를 사용하여 실시될 수 있다. 이러한 트랜스제닉 동물에서, 숙주 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄 서브유닛의 발현을 위한 적격 내인성 유전자는 기능하지 않게 되고, 유사한 인간 면역글로불린 유전자좌로 치환된다. 이들 트랜스제닉 동물은 경쇄 또는 중쇄 숙주 면역글로불린 서브유닛이 실질적으로 부재하는 인간 항체를 생산한다. 예를 들어, 본원에 그 전문이 참고자료로 포함되는 미국특허 제5,877,397호 및 제5,939,598호를 참조한다.
어떤 구체예에서, CD40에 대한 완전 인간 항체는, 예를 들어 트랜스제닉 마우스를 면역화함으로써 획득된다. 한 이러한 마우스는 XenoMouse
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기법(Abgenix; Fremont, California)을 이용하여 획득되며, 이 기술은 본원에 참고자료로 포함되는 미국특허 제6,075,181호, 제6,091,001호, 및 제6,114,598호에 개시된다. 본원에 개시된 항체를 생산하기 위해, 인간 IgG1 중쇄 유전자좌 및 인간 κ 경쇄 유전자좌에 대한 트랜스제닉 마우스를 인간 CD40을 발현하는 Sf9 세포로 면역했다. 또한, 마우스는 다른 이소타입에 대해서도 트랜스제닉일 수 있다. 본 발명의 안정한 액체 제약 조성물에 유용한 완전 인간 항-CD40 항체는 본원에 개시된 CHIR-5.9 및 CHIR-12.12 모노클로날 항체에 의해 나타나는 것들과 유사한 결합 특성을 특징으로 한다.
전장 항체의 바람직한 친화성을 보유하기만 하면, 해당 특정 항체, 예를 들어 길항제 항-CD40 항체를 비롯한 항-CD40 항체의 단편들도 본 발명의 안정한 액체 제약 조성물에 사용하는데 적합하다. 따라서, 예를 들어, 항-CD40 항체의 단편은 CD40 B 세포-표면 항원에 결합하는 능력을 보유할 것이다. 이러한 단편들은 상응하는 전장 항체와 유사한 특성들을 특징으로 한다. 따라서, 예를 들어, 전장 길항제 항-CD40 항체의 단편은 인간 세포의 표면 상에 발현되는 인간 CD40 항원과 특이적으로 결합할 것이며, 인간 CD40-발현 세포 상의 CD40 항원과 결합했을 때 길항제 활성은 나타내지만 유의한 작동제 활성은 나타내지 않는다. 이러한 단편들을 본원에서는 "항원-결합" 단편이라고 한다.
항체의 적합한 항원-결합 단편은 전장 항체의 일부분, 일반적으로 전장 항체의 항원-결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편들의 예는 제한은 아니지만, Fab, F(ab')2, 및 Fv 단편과 단쇄 항체 분자를 포함한다. "Fab"는 경쇄와 중쇄의 일부로 이루어진 면역글로불린의 1가 항원-결합 단편을 의미한다. F(ab')2는 양쪽 경쇄와 양쪽 중쇄의 일부를 함유하는 면역글로불린의 2가 항원-결합 단편을 의미한다. "단쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단편을 의미하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬로 존재한다. 예를 들어, 본원에 참고자료로 포함되는 미국특허 제4,946,778호, 제5,260,203호, 제5,455,030호, 및 제5,856,456호를 참조한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더 포함하며, 링커에 의해 sFv는 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성할 수 있게 된다. sFv에 관해서는 Pluckthun (1994) The Pharma-cology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, ed. Rosenburg and Moore (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315를 참조한다. 또한, 하기 설명되는 대로, 표적 암세포를 죽이기 위해 본원에 개시된 길항제 항-CD40 항체의 항원-결합 단편은 세포독소와 콘쥬게이트될 수 있다.
항체 또는 항체 단편은, 예를 들어 McCafferty et al.(1990) Nature 348:552 -554 (1990) 및 미국특허 제5,514,548호에 설명된 기술을 이용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. Clackson et al.(1991) Nature 352:624-628 및 Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597은 파지 라이브러리를 이용하여 뮤린 항체와 인간 항체를 각각 분리하는 것을 설명한다. 후속 간행물은 사슬 셔플링에 의한 고 친화성(nM 범위) 인간 항체의 생산(Marks et al. (1992) Bio/Techno-logy 10:779-783) 뿐만 아니라, 대규모 파지 라이브러리를 구성하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합(Waterhouse et al. (1993) Nucleic. Acids Res. 21:2265-2266)을 설명한다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체의 분리를 위한 전통적 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 생생한 대안이다.
항체 단편을 생산하기 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해성 소화에 의해 유래되었다(예를 들어, Morimoto et al. (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); 및 Brennan et al. (1985) Science 229:81 참조). 그러나, 이제 이들 단편은 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. 예를 들어, 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 항체 단편들이 분리될 수 있다. 또는 달리, E. coli로부터 Fab'-SH 단편이 직접 회수되고 화학 결합되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다(Carter et al. (1992) Bio/Technology 10:163-167). 또 다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 분리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 기타 다른 기술들로 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명의 안정한 액체 제약 조성물에 사용하기 위한 길항제 항-CD40 항체는 본원에 개시된 CHIR-5.9 및 CHIR- 12.12 모노클로날 항체뿐만 아니라, 이 항체와는 다르지만 CDR을 보유한 항체; 및 하나 이상의 아미노산 추가(들), 결실(들), 또는 치환(들)을 가진 항체를 포함하며, 이때 길항제 활성은 B 세포 증식 및/또는 분화의 억제에 의해 측정된다. 또한, 본 발명은 탈면역화 항체, 특히 탈면역화 길항제 항-CD40 항체로 포괄하며, 이들은, 예를 들어 본원에 참고자료로 포함되는 국제공보 WO 98/52976와 WO 0034317에 설명된 대로 생산될 수 있다. 이 방식에서, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 내의 잔기들은 인간 CD40-발현 세포에 대한 길항제 활성은 보유하면서 항체가 인간에 대해 비면역원성이거나 덜 면역원성으로 되도록 변형되며, 이때 이러한 활성은 본원 다른 곳에서 주지된 분석평가법에 의해 측정된다. 또한, 해당 항체, 예를 들어 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 단백질이 본 발명의 범위에 포함되며, 융합 단백질은 본 분야에 공지된 것과 마찬가지로 상응하는 폴리뉴클레오티드 벡터로부터 합성되거나 발현될 수 있다. 이러한 융합 단백질은 본원 다른 곳에서 주지된 항체의 콘쥬게이션과 관련하여 설명된다.
해당 결합 특이성을 갖는 어떤 공지된 항체도, 예를 들어 본원에 참고자료로 포함되는 특허공보 EP 0 983 303 A1, WO 00/34317, 및 WO 98/52976에 설명된 방법을 이용하여 만들어진 서열 변이를 가질 수 있다. 예를 들어, CDR 내의 서열은 항체를 MHC II형에 결합시켜 원치않는 헬퍼 T 세포 반응을 촉발시킬 수 있는 것으로 나타났다. 보존성 치환에 의하여 항체는 결합 활성을 보유하면서 원치않는 T 세포 반응을 촉발시키는 능력만을 상실할 수 있다. 어떤 이러한 보존성 또는 비-보존성 치환은 본원 다른 곳에서 주지된 것들과 같은 본 분야에서 인정된 방법을 이용하여 제조될 수 있으며, 결과의 항체도 역시 본 발명의 안정한 액체 제약 조성물에 사용될 수 있다. 변이체 항체는 특정 활성, 예를 들어 길항제 활성, 친화성, 및 특이성에 대해 본원에 설명된 방법을 이용하여 관례적으로 시험될 수 있다.
상기 설명된 방법 중 어느 것, 또는 본원에 개시되지 않은 어떤 다른 방법에 의해 생산된 길항제 항-CD40 항체는 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9 항체와 유사한 방식으로 사용될 수 있으며, 이 경우 항체는 다음의 생물학적 활성 중 하나 이상을 보유한다: T 세포에 의해 자극되는 정상 인간 말초 B 세포에 의한 면역글로불린 분비의 억제; Jurkat T 세포에 의해 자극되는 정상 인간 말초 B 세포의 생존 및/또는 증식의 억제; CD40L-발현 세포 또는 가용성 CD40 리간드(sCD40L)에 의해 자극되는 정상 인간 말초 B 세포의 생존 및/또는 증식의 억제; sCD40L 또는 고상 CD40L에 의해 자극되는 어떤 세포에서 "생존" 항-아폽토틱 세포내 신호의 억제; sCD40L 또는 고상 CD40L과의 리게이션시 어떤 세포에서 CD40 신호전달의 억제; 인간 악성 B 세포 증식 억제; 제한은 아니지만, T 세포 및 B 세포를 비롯한 CD40-보유 표적 세포 또는 CD40 동족 리간드 보유 세포의 결실, 무반응 및/또는 내성 유도; CD4+CD25+ 조절 T 세포의 확장 또는 활성화 유도(예를 들어, CD40-CD40L 간섭에 의한 공여자 동종항원-특이적 조직 거부 van Maurik et al. (2002) J. Immu-nol. 169:5401-5404 참조); 어떤 메커니즘에 의한 세포독성(제한은 아니지만, 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), 보체-의존성 세포독성(CDC), 증식 하향-조절, 및/또는 표적 세포에서의 아폽토시스를 포함한다); 표적 세포 사이토카인 분비 및/또는 세포 표면 분자 발현의 조정; 및 이들의 조합을 포함한다. 본원에 개시된 길항제 항-CD40 항체와 그것의 항원-결합 단편의 바람직한 생물학적 활성을 측정하기 위한 분석은 2003년 11월 4일, 2003년 11월 26일, 및 2004년 4월 27일자 제출되어 미국특허출원 제60/517,337호(대리인 사건번호 No. PP20107.001(035784/258442)), 제60/525,579호(대리인 사건번호 No. PP20107.002(035784/271525)), 제60/565,710호(대리인 사건번호 No. PP20107.003(035784/277214))를 각각 배정받은 가 출원들 발명의 명칭 "길항제 항-CD40 모노클로날 항체 및 그 사용 방법"; 및 2004년 11월 4일자 제출되어 WO 2005/044854로 공개된 국제특허출원 제PCT/US2004/037152호(대리인 사건번호 No. PP20107.004(035784/282916)) 발명의 명칭 "길항제 항-CD40 모노클로날 항체 및 그 사용 방법"에 설명된 대로 수행될 수 있으며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 참고자료로 본원에 포함된다. 또, 2005년 12월 9일자 제출되어 미국특허출원 제60/749,285호(대리인 사건번호 No. PP028035.0002(035784/304312))를 배정받은 가 출원 발명의 명칭 "CD40 신호화에 의해 매개되는 증식성 장애의 진단 및 치료 방법", 및 2006년 5월 18일자 제출되어 WO 2006/125143로 공개된 대응 국제특허출원 제PCT/US2006/019414호; 그리고 2005년 12월 9일자 제출되어 미국특허출원 제60/749,336호(대리인 사건번호 No. PP028062.0002(035784/304311))를 배정받은 가 출원 발명의 명칭 "자가면역 및/또는 염증 성분을 갖는 질환의 진단 및 치료 방법", 및 2006년 5월 18일자 제출되어 WO 2006/125117로 공개된 대응 국제특허출원 제PCT/US2006/019325호(대리인 사건번호 No. PP028062.0003(035784/311608))에 설명된 분석평가법들을 또한 참조하며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 참고자료로 본원에 포함된다. 또한, Schultze et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:8200-8204; Denton et al. (1998) Pediatr. Transplant. 2:6-15; Evans et al. (2000) J. Immunol. 164:688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49:17-22; Lederman et al. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3:77-86; Coligan et al. (1991) Current Protocols in Immunology 13:12; Kwekkeboom et al.(1993) Immunology 79: 439-444; 그리고 미국특허 제5,674,492호 및 제5,847,082호에 설명된 분석평가법들을 참조하며, 이들은 참고자료로 본원에 포함된다.
본원에서 확인된 CD40-항원 에피토프에 특이적인 길항제 항-CD40 항체를 검출하는 대표적인 분석은 "경합 결합 분석"이다. 경합 결합 분석은 미지 물질을 표지된 기지 리간드와 그것의 특이적 항체의 결합을 억제하는 그것의 능력에 의해 검출하고 정량하는 혈청학적 분석이다. 이것은 또한 경합 억제 분석이라고도 한다. 대표적인 경합 결합 분석에서 표지된 CD40 폴리펩티드는, 예를 들어 본 발명의 모노클로날 항체의 하나 이상의 에피토프에 대해 발생한 모노클로날 항체와 조합하여, 샘플 중에서 후보 항체에 의해 침전된다. 해당 에피토프와 특이적으로 반응하는 항-CD40 항체는 CD40 단백질 또는 해당 CD40 단백질의 특정 에피토프를 포함하는 단백질의 단편에 대해 제조된 일련의 항체를 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 예를 들어, 인간 CD40에 대해서, 해당 에피토프는 SEQ ID NO:9(GenBank Accession No. NM_152854 참조)에 제시된 서열에 의해 암호화되는 SEQ ID NO:10에 제시된 인간 CD40의 단 동형(GenBank Accession No. NP_690593 참조), 또는 SEQ ID NO:11 (GenBank Accession No. X60592 및 No. NM_001250 참조)에 제시된 서열에 의해 암호화되는 SEQ ID NO:12에 제시된 인간 CD40의 장 동형(GenBank Accession No. CAA 43045 및 No. NP_001241 참조)의 선형 및/또는 비선형 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프를 포함한다. 또는 달리, 이미 확인된 적합한 길항제 항-CD40 항체를 사용하는 경합 결합 분석을 사용하여 이미 확인된 항체에 필적하는 모노클로날 항체를 선별할 수도 있다.
이러한 면역분석에 사용되는 항체는 표지될 수도 표지되지 않을 수도 있다. 비-표지 항체는 응집에서 사용될 수 있고, 표지 항체는 광범한 분석들에 사용될 수 있으며, 광범한 표지가 사용된다. 해당하는 항-CD4-항체와 에피토프 사이에 항체-항원 복합체 형성의 검출은 항체에 검출가능한 물질을 부착함으로써 촉려될 수 있다. 적합한 검출 수단은 방사성핵종, 효소, 보조효소, 형광물질, 화학발광물질, 발색단, 효소 기질 또는 보조인자, 효소 억제제, 배합군 복합체, 자유 라디칼, 입자, 염료 등과 같은 표지의 사용을 포함한다. 적합한 효소의 예는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함한다; 적합한 배합군 복합체의 예는 스트렙토아비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴을 포함한다; 적합한 형광물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 염화단실 또는 피코에리트린을 포함한다; 발광물질의 예는 루미놀이다; 생물발광물질의 예는 루시페라제, 루시페린 및 에쿼린을 포함한다; 적합한 방사성활성 물질의 예는 125I, 131I, 35S, 또는 3H를 포함한다. 이러한 표지된 시약들은 방사성면역분석, 효소면역분석, 예를 들어 ELISA, 형광면역분석 등 잘 알려진 여러 분석들에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국특허 제3,766,162호; 제3,791,932호; 제3,817,837호; 및 제4,233,402호를 참조한다.
앞서 설명한 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편 중 어느 것도 본 발명의 제약 조성물에 사용하기 전에 콘쥬게이션될 수 있다. 콘쥬게이트 항체의 생산 방법은 본 분야에 공지되어 있다. 따라서, 항체는 간접 표지화 또는 간접 표지화 접근법을 이용하여 표지될 수 있다. "간접 표지화" 또는 "간접 표지화 접근법"은 킬레이트화제가 항체에 공유 부착되고 적어도 하나의 방사성핵종이 킬레이트화제에 삽입된다는 의미이다. 예를 들어, 본원에 그 전문이 참고자료로 포함되는 Srivagtava and Mease (1991) Nucl. Med. Bio. 18:589-603에 설명된 킬레이트화제와 방사성핵종을 참조한다. 적합한 표지는 플루오로포어, 크로모포어, 방사성활성 원자(특히 32P 및 125I), 전자 밀도가 높은 시약, 효소, 및 특이적 결합 파트너를 갖는 리간드를 포함한다. 효소는 전형적으로 활성에 의해 검출된다. 예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제는 일반적으로 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)를 청색 안료로 전환시키는 능력에 의해 검출되며, 이것은 분광광도계로 정량 가능하다. "특이적 결합 파트너"는 높은 특이성으로 리간드 분자와 결합할 수 있는 단백질을 말하며, 예를 들어 항원과 그것에 특이적인 모노클로날 항체가 있다. 기타 다른 특이적 결합 파트너는 바이오틴과 아비딘 또는 스트렙토아비딘, IgG과 단백질 A, 및 본 분야에 공지된 다수의 수용체-리간드 커플을 포함한다. 상기 설명이 다양한 표지들을 상이한 분류로 범주화하는 것을 의미하지 않음이 이해되어야 하며, 동일한 표지라도 몇몇 상이한 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 125I는 방사성활성 표지나 전자 밀도가 높은 시약으로 사용될 수 있다. HRP는 효소나 mAb에 대한 항원으로서 사용될 수 있다. 더 나아가, 바람직한 효과를 위해 다양한 표지들을 조합할 수도 있다. 예를 들어, mAb와 아비딘도 본 발명의 실시에 있어서 표지를 필요로 한다; 따라서, mAb가 바이오틴으로 표지될 수 있고, 그 존재는 125I로 표지된 아비딘으로 검출되거나, 또는 HRP로 표지된 항-바이오틴 mAb로 검출될 수 있다. 기타 다른 조합 및 가능성이 당업자게에 쉽게 자명할 것이며, 이들은 본 발명의 범위 내에서 등가물로서 고려된다.
또는 달리, 해당 길항제 항-CD40 항체는 "직접 표지화" 또는 "직접 표지화 접근법"을 이용하여 표지될 수 있는데, 이 경우 방사성핵종이 항체에 직접 공유 부착된다(전형적으로 아미노산 잔기에 의해). 바람직한 방사성핵종들이 Srivagtava and Mease (1991)(상동)의 문헌에 제공된다. 간접 표지화 접근법이 특히 바람직하다. 또한, 예를 들어, 링커를 사용하여 항체에 방사성활성 표지를 부착하고 있는 국제공보 WO 00/52031 및 WO 00/52473; 그리고 미국특허 제6,015,542호에 설명된 항-CD40 항체의 표지된 형태를 참조하며, 이들은 본원에 참고자료로 포함된다.
항체 변이체
본 발명의 제약 조성물은 본 분야에 공지된 길항제 항-CD40 항체의 변이체들을 이용하여 제조될 수 있다. 이러한 변이체는 모 항체의 바람직한 결합 특성을 보유할 것이다. 따라서, 예를 들어, 제조될 길항제 항-CD40 항체가 모 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9 항체의 변이체인 경우, 변이체 항체는 모 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9 항체의 결합 특성을 보유할 것이다. 항체 변이체의 제조 방법은 본 분야에서 일반적으로 입수할 수 있다.
예를 들어, 길항제 항-CD40 항체, 예를 들어 본원에 설명된 CHIR-5.9 또는 CHIR-12.12 모노클로날 항체의 아미노산 서열 변이체는 해당 항체를 암호화하는 클로닝된 DNA 서열에 있는 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이발생 및 뉴클레오티드 서열 변경 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, Walker and Gaastra, eds.(1983) Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Com-pany, New York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol. 154:367-382; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor, New York); 미국특허 제4,873, 192호; 및 여기 인용된 참고문헌들을 참조하며, 이들은 모두 본원에 참고자료로 포함된다. 해당 폴리펩티드의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적합한 아미노산 치환에 관한 길잡이는 본원에 참고자료로 포함되는 Dayhoff et al.(1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C)의 모델에서 찾을 수 있다. 보존성 치환, 예를 들어 한 아미노산을 유사한 특성을 가진 다른 아미노산으로 교환하는 것이 바람직할 수 있다. 보존성 치환의 예는 제한은 아니지만, Gly↔Ala, Val↔Ile↔Leu, Asp↔Glu, Lys↔Arg, Asn↔Gln, 및 Phe↔Trp↔Tyr를 포함한다.
해당 길항제 항-CD40 항체 폴리펩티드, 예를 들어 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9 항체의 변이체를 구성하는데 있어서, 변형들은 변이체가 바람직한 활성, 즉 유사한 결합 친화성을 계속해서 보유하도록, 그리고 길항제 항-CD40 항체의 경우 인간 세포의 표면 상에 발현되는 인간 CD40 항원과 특이적으로 결합할 수 있으며, 또한 인간 CD40-발현 세포 상의 CD40 항원과 결합했을 때 길항제 활성은 나타내지만 유의한 작동제 활성은 나타내지 않도록 만들어진다. 명백히 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 DNA에 만들어진 어떤 돌연변이도 그 서열이 리딩 프레임 밖에 위치되어서는 안되며, 2차 mRNA 구조를 생산할 수 있는 상보성 영역을 만들지 않는 것이 바람직하다. 유럽특허출원 공보 제75,444호를 참조한다.
추가하여, 길항제 항-CD40 항체의 불변 영역이 많은 방식으로 이펙터 기능이 변경되도록 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 미국특허 제6,737,056 B1호 및 미국특허출원 공보 제2004/0132101 A1호를 참조하는데, 여기서는 Fc 수용제와 결합하는 항체를 최적화한 Fc 돌연변이가 개시된다.
바람직하게, 기준 길항제 항-CD40 항체의 변이체는 기준 항체, 예를 들어 본원에 설명된 CHIR-5.9 또는 CHIR-12.12 모노클로날 항체의 아미노산 서열에 대해, 또는 기준 항체 분자의 더 짧은 부분에 대해 적어도 70% 또는 75%의 서열 동일성, 바람직하게 적어도 80% 또는 85%의 서열 동일성, 더 바람직하게 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진다. 더 바람직하게, 분자들은 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유한다. 본 발명의 취지에 따르면, 어파인 갭 서치를 이용하는 Smith-Waterman 상동성 조사 알고리즘을 이용하여 서열 동일성 퍼센트가 측정되며, 이때 갭 오픈 패널티는 12, 갭 익스텐젼 패널티는 2, BLOSUM 매트릭스는 62이다. Smith-Waterman 상동성 조사 알고리즘은 Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489에 교시된다. 변이체는, 예를 들어 기준 길항제 항-CD40 항체와 1 내지 15개 아미노산 잔기, 1 내지 10개 아미노산 잔기, 예를 들어 6-10개, 5개, 4개, 3개, 2개, 또는 심지어 1개 아미노산 잔기가 상이하다.
2개의 아미노산 서열의 최적 정렬과 관련하여, 변이체 아미노산 서열의 연속 세그먼트는 기준 아미노산 서열과 관련하여 추가의 아미노산 잔기나 결실된 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 기준 아미노산 서열과의 비교를 위해 사용되는 연속 세그먼트는 적어도 20개 연속 아미노산 잔기를 포함할 것이며, 30개, 40개, 50개, 또는 그 이상의 아미노산 잔기일 수도 있다. 보존성 잔기 치환 또는 갭과 관련하여 서열 동일성의 보정이 만들어질 수 있다(Smith-Waterman 상동성 조사 알고리즘 참조).
본 발명의 제약 조성물을 이용한 치료 방법
본 발명의 제약 조성물은 CD40-발현 세포와 관련되는 암 또는 전암성 상태를 가진 피험자를 치료하는데 있어서, 또는 CD40-발현 세포와 관련되는 염증질환 및/또는 자가면역질환의 치료에서 용도를 찾는다. 본원에서 "치료"는 피험자에 길항제 항-CD40 항체를 포함하는 제약 조성물의 적용 또는 투여, 또는 피험자로부터 분리된 조직이나 셀라인에 길항제 항-CD40 항체를 포함하는 제약 조성물의 적용 또는 투여로서 정의되며, 여기서 피험자는 질환, 질환의 증상, 또는 질환의 소인을 가지며, 치료 목적은 질환, 질환의 증상, 또는 질환의 소인을 회복, 치유, 완화, 경감, 변경, 구제, 개량, 개선, 또는 영향을 미치는 것이다.
"피험자"는 어떤 동물을 의미한다. 피험자는 포유동물인 것이 바람직하며, 인간 피험자가 가장 바람직하다. 인간 이외의 특히 중요한 포유동물은 제한은 아니지만, 개, 고양이, 소, 말, 양 및 돼지이다.
투여가 치료를 목적으로 할 때, 투여는 예방적 또는 치료적 목적을 가질 수 있다. 예방적으로 제공되는 경우, 제약 조성물은 어떤 증상에 앞서 제공된다. 제약 조성물의 예방적 투여는 어떤 후속 증상을 예방 또는 약화시키는 작용을 한다. 치료적으로 제공되는 경우, 제약 조성물은 증상의 개시시에(또는 바로 후에) 제공된다. 제약 조성물의 치료적 투여는 어떤 급성 증상을 약화시키는 작용을 한다.
전형적인 투여 경로는 제한은 아니지만, 경구 투여 및 비경구 투여를 포함하며, 예를 들어 정맥내, 근육내, 경막내, 비강내, 설하, 동맥내 및 복강내 주사 또는 주입, 그리고 피하 주사를 포함한다. 이런 투여를 달성하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 제약 조성물은 정맥내로 투여된다. 정맥내 투여는 투여될 길항제 항-CD40 항체에 따라 바람직하게 약 1 내지 약 10시간, 더 바람직하게 약 1 내지 약 8시간, 더욱 바람직하게 약 2 내지 약 7시간, 더더욱 바람직하게 약 4 내지 약 6시간의 기간에 걸쳐 주입에 의해 일어난다. 제약 조성물의 주입은 초기에는 약 4 내지 약 6시간의 기간에 걸쳐 제공될 수 있으며, 그후에는 더욱 빠르게 송달된다. 후속 주입은 약 1 내지 약 6시간, 예를 들어 약 1 내지 약 4시간, 약 1 내지 약 3시간, 또는 약 1 내지 약 2시간의 기간에 걸쳐 투여될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물의 제약학적 유효량이 피험자에게 투여된다. "제약학적 유효량"은 질환 또는 상태의 치료에 유용한 양을 의미하며, 여기서 치료는 상기 주지된 예방적 또는 치료적 목적을 위한 것일 수 있다. 이 방식에서, 조성물의 제약학적 유효량은 치료가 필요한 피험자에게 길항제 항-CD40 항체의 치료적 유효 용량 또는 유효량을 투여하는 것이다. "치료적 유효 용량 또는 유효량" 또는 "유효량"은 투여되었을 때 CD40-발현 세포를 포함하는 질환을 가진 환자의 치료와 관련하여 양성 치료반응을 야기하는 길항제 항-CD40 항체의 양을 의미한다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 길항제 항-CD40 항체, 예를 들어 모노클로날 항체 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9, 또는 그것의 항원-결합 단편의 치료적 유효 용량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 25 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg, 또는 약 7 mg/kg 내지 약 12 mg/kg의 범위이다. 치료 방법은 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 치료적 유효 용량의 단일 투여 또는 치료적 유효 용량의 다회 투여를 포함할 수 있다는 것이 인정된다.
본 발명의 제약 조성물은 항-CD40 치료제, 더 구체적으로 길항제 항-CD40 항체를 사용한 치료에 반응하는 암 또는 전암성 상태를 가진 어떤 피험자를 치료하는데서 용도를 찾는다. 항-CD40 항체 치료에 대한 암 또는 전암성 상태의 반응성을 측정하는 방법은 진단적 및 예후적 분석을 포함하는데, 예를 들어 공동 계류중이며 공동 소유인 2005년 12월 9일자 제출되어 미국특허출원 제60/749,285호(대리인 사건번호 No. PP028035.0002(035784/304312))를 배정받은 가 출원 발명의 명칭 "CD40 신호화에 의해 매개되는 증식성 장애의 진단 및 치료 방법", 및 2006년 5월 18일자 제출되어 WO 2006/125143로 공개된 대응 국제특허출원 제PCT/US2006/019414호에 설명된 분석평가법들이 있으며, 이들의 내용은 그 전문이 참고자료로 본원에 포함된다. 유사하게, 본 발명의 제약 조성물은 항-CD40 치료제, 특히 항-CD40 항체를 사용한 치료에 반응하는 염증질환 및/또는 자가면역질환을 가진 어떤 피험자를 치료하는데서 용도를 찾는다. 항-CD40 항체 치료에 대한 염증질환 및/또는 자가면역질환의 반응성을 측정하는 방법은 진단적 및 예후적 분석을 포함하는데, 예를 들어 공동 계류중이며 공동 소유인 2005년 12월 9일자 제출되어 미국특허출원 제60/749, 336(대리인 사건번호 No. PP028062.0002(035784/304311))를 배정받은 가 특허출원 발명의 명칭 "자가면역 및/또는 염증 성분을 가진 질환의 진단 및 치료 방법", 그리고 2006년 5월 18일자 제출되어 WO 2005/125117로 공개된 대응 국제특허출원 제PCT/US2006/019325호(대리인 사건번호 No. PP028062.0003(035784/311608))에 설명된 분석평가법들이 있으며, 이들 내용은 그 전문이 본원에 참고자료로 포함된다.
본원에서 사용된 "종양"은 악성이건 양성이건 관계없이 모든 신생물성 세포 성장 및 증식, 그리고 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 말한다. 본원에서 사용된 "신생물성"은 악성이건 양성이건 관계없이 비정상적 조직 성장을 가져오는 어떤 형태의 조절장애 또는 조절불능 세포 성장을 말한다. 따라서, "신생물성 세포"는 조절장애 또는 조절불능 세포 성장을 갖는 악성 및 양성 세포를 포함한다.
"항종양 활성"은 악성 CD40-발현 세포의 증식 또는 축적 속도의 감소와 그에 따른 기존 종양이나 치료 도중 생긴 종양의 성장 속도의 감퇴, 및/또는 기존 신생물성(종양) 세포 또는 새로 형성된 신생물성 세포의 파괴와 그에 따른 치료 도중의 전체 종양 크기의 감소를 의미한다. 본 발명의 길항제 항-CD40 항체-함유 제약 조성물을 사용한 치료는 인간 CD40-발현 세포 상에서의 CD40 신호화의 자극과 관련된 암 및 전암성 상태의 치료와 관련하여 유리한 생리학적 반응을 일으킨다.
용어 "암" 및 "암성"은 조절불능 세포 성장을 전형적인 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 말하거나 설명한다. 암의 예는 제한은 아니지만, 림프종과 백혈병, 그리고 고상 종양들을 포함한다. "B 세포-관련 암" 또는 "B 세포 계통 암"은 조절장애 또는 조절불능 세포 성장이 B 세포와 관련되는 어떤 암 타입을 의미한다.
암에 관해서 "난치성"은 특정 암이 특정 치료제, 예를 들어 해당 길항제 항-CD40 항체를 사용한 치료에 내성이 있거나 반응하지 않는다는 의미이다. 암은 특정 치료제를 사용하여 치료를 개시하는 때부터 특정 치료제를 사용한 치료에 난치성일 수도 있고(즉, 치료제의 초기 노출에 비반응성), 또는 치료제를 사용한 최초 치료 기간의 경과에 따라 또는 치료제를 사용한 후속 치료 기간 동안 치료제에 대한 내성이 발생한 결과로서 난치성일 수도 있다.
본 발명의 제약 조성물은 CD40-발현 세포 상에서 CD40 신호화의 자극에 의해 매개되는 암 또는 전암성 상태를 위한 치료적 개입이 필요한 피험자를 치료하는데서, 또는 CD40-발현 세포 상에서 CD40 신호화에 의해 매개되는 어떤 염증질환 또는 자가면역질환에서 용도를 찾는다. "CD40-발현 세포"는 CD40 항원을 발현하는 정상, 전암성, 및 악성 세포를 의미한다. 어떤 구체예에서, CD40-발현 세포는 악성 B 세포이다. "악성" B 세포는 어떤 신생물성 B 세포를 의미하며, 제한은 아니지만 저-등급, 증-등급, 및 고-등급 B 세포 림프종, 면역모세포 림프종, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 엡스타인-바 바이러스(EBV) 유발 림프종, 및 AIDS-관련 림프종을 비롯한 림프종뿐만 아니라 B 세포 급성 림프모구 백혈병, 골수종, 만성 림프구성 백혈병 등에서 유래하는 B 세포를 포함한다. 다른 구체예에서, CD40-발현 세포는 암종 또는 육종 세포이다. "CD40-발현 암종 세포" 또는 "CD40-발현 육종 세포"는 CD40 세포-표면 항원을 발현하는 고상 종양의 어떤 악성(즉, 신생물성) 또는 전암성 암종 또는 육종 세포를 의미한다. 본 발명의 취지에 따르면, CD40 항원을 발현하는 암성 및 전암성 또는 전-악성 세포를 "CD40-발현 신생물성 세포"라고 한다. 세포에서 CD40 발현을 검출하는 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있으며, 제한은 아니지만 PCR 기술, 면역조직화학, 유세포분석, 웨스턴 블롯, ELISA 등을 포함한다. 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 사용한 치료가 정당하다면, 길항제 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물이 어떤 적합한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물의 치료 개입이 필요한 피험자는 CD40-발현 신생물성 세포 상에서 CD40 신호화에 의해 매개되는 어떤 암 또는 전암성 상태로 고통받고 있거나, 또는 이러한 상태가 발생할 또는 재발할 위험이 있을 수 있다. 이러한 암 및 전암성 상태의 예는 제한은 아니지만, B 세포 계통 암, 비-B 세포 혈액암, 및 CD40-발현 신생물성 세포 상에서 CD40 신호화에 의해 매개된다고 알려진 고상 종양들 중 어느 것을 포함한다.
CD40-발현 신생물성 세포를 포함하는 B 세포 계통 암의 예는 급성 림프모구 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 전림프구성 백혈병(PLL), 유모세포 백혈병, 호지킨병, 다발성 골수종, 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증, 중쇄 질환, 및 림프종들, 제한은 아니지만, 예를 들어 확산성 소 림프구 림프종, 여포성, DLBCL, 점막 관련 림프양 조직 림프종, 단구양 B 세포 림프종, 비장세포 림프종, 림프종 모양 육아종증, 혈관내 림프종증, 면역모구 림프종, AIDS-관련 림프종 등이다.
따라서, 본 발명의 제약 조성물은 비정상 통제불능 B 세포 증식 또는 축적과 관련된 비호지킨 림프종을 갖는 피험자의 치료에서 용도를 찾는다. 본 발명의 취지에 따르면, 이러한 림프종은 Working Formulation 분류도에 따라 저 등급, 중 등급, 및 고 등급으로 범주화되는 B 세포 림프종이다("The Non-Hodgkin's Lymphoma Pathologic Classification Project," Cancer 49(1982):2112-2135 참조). 따라서, 저 등급 B 세포 림프종은 소 림프구, 여포성 소-분열 세포, 및 여포성 혼성 소-분열 및 거대 세포 림프종을 포함하고; 중 등급 림프종은 여포성 거대 세포, 확산성 소-분열 세포, 확산성 혼성 소 세포 및 거대 세포, 및 확산성 거대 세포 림프종을 포함하고; 고 등급 림프종은 거대 세포 면역모구, 림프모구, 및 버킷 및 비-버킷 타입의 소 비-분열 세포 림프종을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물이 개정 유럽 미국 림프종 분류(REAL) 시스템에 따라서 분류된는 B 세포 림프종의 치료적 치료에 유용하다는 것이 인정된다. 이러한 B 세포 림프종은 제한은 아니지만, 전구체 B 세포 신생물로 분류되는 림프종, 예를 들어 B 림프모구 백혈병/림프종; 말초 B 세포 신생물, 예를 들어 B 세포 만성 림프구성 백혈병/소 림프구성 림프종, 림프형질세포양 림프종/면역종, 맨틀세포 림프종(MCL), 여포 중심 림프종(여포성)(확산성 소세포, 확산성 혼성 소세포 및 거대세포, 및 확산성 거대세포 림프종을 포함한다), 변역부 B 세포 림프종(절외부, 절, 및 비장세포 타입을 포함한다), 형질세포종/골수종, 서브타입 원발성 세로판(가슴샘)의 확산성 거대세포 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 및 버킷-형 고등급 B 세포 림프종; 및 분류 불가능한 저등급 또는 고등급 B 세포 림프종이다.
또한, 본 발명의 제약 조성물은 MGUS(의미불명단클론감마병증)로 알려진 전암성 상태를 가진 피험자를 치료하는데도 사용될 수 있다. MGUS 환자 중 약 25%가 결국 다발성 골수종(MM)이나 관련된 혈장 세포 장애들로 발전한다(Kyle(1993) Mayo Clinic. Proc. 68:26-36). 골수에서 악성 혈장 세포의 증식, 혈청 또는 뇨 모노클로날 단백질(M 단백질)의 검출, 빈혈, 고칼슘혈증, 신기능부족, 및 용해성 뼈 병소가 MM의 임상 소견이며, MGUS는 MM의 다른 임상적 특징들 없이 혈청이나 뇨에서 M 단백질의 존재가 임상적으로 인정된다(예를 들어, Kyle and Lust (1989) Semin. Hematol 26:176-200; Greipp and Lust Stem Cells (1995) 13:10-21). MGUS 환자는 증상이 없으며, 안정한 M 단백질 측정값을 가진다(Kyle (1993) Mayo Clinic. Proc. 68:26-36). 피험자에서 일단 MGUS가 확인되면, 본 발명의 적합한 제약 조성물, 예를 들어 본원에 개시된 길항제 항-CD40 항체를 포함하는 조성물을 사용한 유지 치료에 의해 이들 피험자에서 다발성 골수종의 발생을 차단할 수 있다.
특히, 본 발명의 제약 조성물은 상기 열거된 것들을 비롯하여, 최초 라인의 암치료법에 난치성인(즉, 내성이거나 내성으로 될) B 세포 림프종을 치료하는데 유용하다. 용어 "암치료"는 화학요법, 수술, 방사선요법, 단일 항암 항체 요법, 및 이들의 조합 등의 암을 위한 치료 수단을 의미한다. 하위 환자 집단은 CD40L-매개 CD40 신호화를 조정하거나, ADCC를 조정하거나, 또는 양자 모두를 조정하는 하나 이상의 항-CD40 항체를 사용한 치료 개입이 바람직하다.
또한, 본 발명의 제약 조성물은 비-B 세포 관련 혈액암을 치료하는데도 유용하다. 이러한 악성질환은 제한은 아니지만, 급성 백혈병; 골수모구 백혈병; 급성 골수성 백혈병; 전골수성 백혈병; 골수단핵세포성 백혈병; 단핵구성 백혈병; 적백혈병; 과립구 백혈병(만성 골수성 백혈병); 적혈구 증가증; 등을 포함한다.
CD40-발현 신생물성 세포를 포함하며, 따라서 본 발명의 제약 조성물을 사용한 치료에 유리하게 반응하는 고상 종양은 제한은 아니지만, 난소암, 폐암(예를 들어, 편평세포 암종, 선암종, 및 거대 세포 암종 타입의 비-소세포 폐암, 및 소세포 폐암), 유방암, 결장암, 신장암(예를 들어, 신장세포 암종을 포함), 방광암, 간암(예를 들어, 간세포 암종을 포함), 위암, 경부암, 전립선암, 비인두암, 갑상선압(예를 들어, 갑상선 유두상 암종), 흑색종 같은 피부암, 및 육종, 예를 들어 골육종 및 유잉 육종을 포함한다.
암 또는 전암성 상태를 가진 피험자에게 본 발명의 제약 조성물을 투여함으로써 달성될 수 있는 유리한 결과는 이런 암이나 상태와 관련된 어떤 양성 치료반응을 포함한다. 암 치료에 관하여 "양성 치료반응"은 항-CD40 치료제의 항종양 활성과 관련되는 질환의 개선 및/또는 해당 질환과 관련된 증상의 개선을 의미한다. 즉, 항증식 효과, 종양의 더 이상의 성장 방지, 종양 크기의 축소, 암세포수의 감소, 및/또는 CD40-발현 세포의 자극에 의해 매개된 하나 이상의 증상의 감소가 관찰될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 양성 치료반응은 질환에 있어서 다음의 개선들 중 하나 이상을 말하는 것일 것이다: (1) 종양 크기 축소; (2) 암(즉, 신생물) 세포수의 감소; 신생물성 세포 죽음의 증가; (4) 신생물성 세포 생존의 감소; (4) 종양 성장 억제(즉, 어떤 정도까지 둔화, 바람직하게는 중단); (5) 말초 기관으로 암세포 침윤의 억제(즉, 어떤 정도까지 둔화, 바람직하게는 중단); (6) 종양 전이 억제(즉, 어떤 정도까지 둔화, 바람직하게는 중단); (7) 더 이상의 종양 성장 방지; (8) 환자 생존율 증가; 및 (9) 암과 관련된 하나 이상의 증상의 어떤 정도의 완화. 어떤 주어진 악성질환에서 양성 치료반응은 해당 악성질환에 특정된 표준화된 반응 기준에 의해 측정될 수 있다. 종양 반응은 자기공명영상(MRI) 스캔, X-선 촬영영상, 컴퓨터단층촬영(CT) 스캔, 뼈 스캔 영상, 내시경, 및 골수흡인(BMA)를 포함하는 종양 생검 표본추출 및 순환계 중 종양 세포의 계수 등의 스크리닝 기술을 이용하여 종양 형태(즉, 전체적인 종양 부담, 종양 크기 등)의 변화에 대해 평가될 수 있다. 이들 양성 치료반응에 더하여, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체-함유 제약 조성물로 치료받고 있는 피험자는 질환과 관련된 증상에 있어서 유리한 개선 효과를 경험할 수 있다. 따라서, B 세포 종양에 대해서, 피험자는 소위 B 증상이라고 하는 것들, 즉 도한, 발열, 체중감소, 및/또는 두드러기의 감소를 경험할 수 있다. 전암성 상태에 대해서는, 항-CD40 치료제를 사용한 치료가 관련된 악성 상태의 발생, 예를 들어 의미불명단클론감마병증(MGUS)로 고통받는 피험자에서 다발성 골수종의 발생을 차단하고 및/또는 발생 전까지의 시간을 연장할 수 있다.
"항-염증 활성"은 염증의 감소 또는 예방을 의미한다. 본 발명의 길항제 항-CD40 항체-함유 액체 제약 조성물을 사용한 치료는 자가면역질환 및/또는 염증질환의 치료와 관련하여 유리한 생리학적 반응을 일으키며, 여기서 질환은 CD40 항원을 발현하는 세포를 수반한다. 본 발명의 조성물이 증식, 활성화 등과 같은 세포에 있어서의 표현형적 변화를 방지하는데 유용할 수 있다는 것이 인정된다.
본 발명의 길항제 항-C40 항체-함유 액체 제약 조성물을 사용한 치료 개입을 받는 피험자는 CD40-발현 세포 상에서 CD40 신호화에 의해 매개되는 어떤 염증질환 또는 자가면역질환으로 고생하고 있거나, 또는 이러한 질환이 발생하거나 또는 재발할 위험이 있을 수 있다. 염증질환은 염증 및 조직 파괴, 또는 이들의 조합을 특징으로 한다. "염증질환"은 면역반응의 초기 사건이나 표적이, 예를 들어 동종항원, 이종항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 미지 항원, 또는 알레르겐을 포함하는 비-자기 항원(들)을 수반하는 어떤 염증성 면역-매개 과정을 포함한다.
또한, 본 발명의 취지에 따라서, 용어 "염증질환(들)"은 "자가면역질환(들)"을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "자가면역성"은 일반적으로 "자기 항원"을 수반하는 염증성 면역-매개 과정을 포괄하는 것으로 이해된다. 자가면역잘환에서 자기 항원(들)은 숙주 면역반응을 촉발한다.
또한, 본 발명의 제약 조성물은 조직 이식 거부반응과 관련된 염증의 치료에도 사용될 수 있다. "이식 거부반응" 또는 "이식편 거부"는, 제한은 아니지만 HLA 항원, 혈액 군 항원 등을 포함하는 이식편에 대항하여 어떤 숙주에서 일어나는 면역반응을 말한다.
또한, 본 발명의 제약 조성물은 골수 이식에 관련된 것 등의 이식편 대 숙주 질환의 치료에도 사용될 수 있다. 이러한 이식편 대 숙주 질환에서, 공여자 골수는 림프구와 림프구로 성숙하는 세포를 포함한다. 공여자의 림프구는 수용자의 항원을 자기 것이 아니라고 인식하여 염증성 면역반응을 일으킨다. 이에 따라, 본원에서 사용된 "이식편 대 숙주 질환" 또는 "이식편 대 숙주 반응"은 공여자 림프구가 숙주의 항원에 대해 반응하는 어떤 T 세포 매개 면역반응을 말한다.
자가면역 및/또는 염증 장애의 예들는 제한은 아니지만, 전신 홍반성루프스 (SLE), 원반모양루프스, 루푸스 신염, 사르코이드증, 염증성 관절염, 예를 들어 소아 관절염, 류마티스 관절염, 염증성 관절염, 건선성 관절염, 라이터 증후군, 강직성 척추염, 및 통풍성 관절염, 기관 또는 조직 이식 거부반응, 초급성, 급성, 또는 만성 거부반응 및/또는 이식편 대 숙주 질환, 다발성 경화증, 고 IgE 증후군, 결절다발성 동맥염, 원발성 담즙성 간경변증, 염증성 장질환, 크론병, 셀리악병(글루텐-과민성 장질환), 자가면역 간염, 악성빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈, 건선, 피부경화증, 중증근무력증, 자가면역 혈소판감소성자반증, 자가면역 갑상선염, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 면역복합질환, 만성피로 면역 기능부전 증후군 (CFIDS), 다발성 근염 및 피부근염, 한랭글로불린혈증, 혈전용해, 심근병증, 심상성 천포창, 간질성 폐 섬유증, I형 및 II형 당뇨병, 1, 2, 3, 및 4 타입 지연형 과민반응, 알레르기 또는 알레르기성 장애, 치료 단백질에 대한 원치않는/의도치 않은 면역반응(예를 들어, 미국특허출원 제US2002/0119151호 및 Koren, et al.(2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3:349-60 참조), 천식, 척-스트라우스 증후군(알레르기성 육아종증), 아토피 피부염, 알레르기성 및 자극성 접촉 피부염, 두드러기, IgE-매개 알레르기, 죽상경화증, 혈관염, 비정형성 염증 근육병증, 용혈병, 알츠하이머병, 만성 염증성 탈수초 다발성 신경병증 등을 포함한다. 어떤 다른 구체예에서, 본 발명의 제약 조성물은 폐에 염증이 있는 개체를 치료하기 위해 사용되며, 이들은 제한은 아니지만, 폐 이식편 거부반응, 천식, 사르코이드증, 폐기종, 낭성 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 만성 기관지염, 알레르기성 비염 및 과민성 폐렴 같은 알레르기성 폐 질환, 호산구성 폐렴, 골수 및/또는 폐 이식 또는 다른 원인으로 인한 폐쇄성 세기관지염, 이식편 죽상경화증/이식편 정맥경화증 뿐만 아니라 콜라겐, 혈관, 및 류마티스 관절염 및 홍반성 루프스 같은 자가면역질환으로 인한 폐 섬유증을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 제약 조성물은 CD40L-매개 CD40 신호화의 조정, ADCC의 조정, 또는 양자 모두의 조정을 통한 작동방식 이외의 다른 작동방식을 가진 다른 공지된 치료제에 대해 처음부터 내성이거나, 또는 내성이 발생한 자가면역질환 및 염증질환의 치료에 유용하다. 본 발명의 제약 조성물은 CD40L-매개 CD40 신호화를 조정하거나, ADCC를 조정하거나, 또는 양자 모두를 조정하는 하나 이상의 길항제 항-CD40 항체를 사용한 치료 개입이 바람직한 하위 환자 집단을 치료하는데 사용될 수 있다.
염증질환 또는 자가면역질환을 가진 피험자에게 본 발명의 제약 조성물을 투여함으로써 달성될 수 있는 유리한 결과는 질환과 관련된 어떤 양성 치료반응을 포함한다. 자가면역질환 및/또는 염증질환에 관한 "양성 치료반응"은 이들 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 항-염증 활성과 관련되는 질환의 개선, 및/또는 질환과 관련된 증상의 개선을 의미한다. 즉, 항증식 효과, CD40-발현 세포의 더 이상의 증식 방지, 제한은 아니지만, 염증성 사이토카인, 유착 분자, 프로테아제, 면역글로불린(CD40을 보유한 세포가 B 세포인 경우), 이들의 조합의 분비 감소를 포함하는 염증반응의 감소, 항염증 단백질 생산의 증가, 자가반응 세포수의 감소, 면역관용의 증가, 자가반응 세포 생존 억제, 및/또는 CD40-발현 세포의 자극에 의해 매개되는 하나 이상의 증상의 감소가 관찰될 수 있다. 이러한 양성 치료반응은 투여경로에 제한되지 않으며, 공여자, 공여자 조직(예를 들어, 기관 관류 등), 숙주, 이들의 어떤 조합 등에의 투여를 포함할 수 있다.
자기공명영상(MRI) 스캔, X-선 촬영영상, 컴퓨터단층촬영(CT) 스캔, 유세포분석 또는 형광-활성화 세포 분류장치(FACS) 분석, 조직학, 육안병리학, 및 혈액화학법 같은 스크리닝 기술을 이용하여 임상적 반응이 평가될 수 있으며, 제한은 아니지만, ELISA, RIA, 크로마토그래피 등에 의한 검출가능한 변화도 포함된다. 이들 양성 치료반응에 더하여, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체-함유 액체 제약 조성물을 사용하여 치료받고 있는 피험자는 질환과 관련된 증상에 있어서 어떤 유리한 개선 효과를 경험할 수 있다.
다음의 실시예들은 예시로서 제공되며 본 발명을 제한하지 않는다.
CHIR-12.12는 CHO 세포 배양 과정에 의해 생산되는 완전히 인간화된 항-CD40 IgG1 모노클로날 항체이다. 이 분자는 분자량이 150 kDa이고, 분자 구조는 이황화 결합에 의해 함께 연결된 2개의 중쇄와 2개의 경쇄로 구성된다. CHIR-12.12는 인 간 CD40 세포-표면 수용체 단백질을 표적으로 한다. 이것은 강력한 길항제이며, 정상 B 세포의 시험관내 CD40 리간드-매개 증식을 억제할 뿐만 아니라, NHL 및 CLL 환자의 암세포의 시험관내 CD40 리간드-매개 증식을 억제한다. CHIR-12.12 항체를 발현하는 하이브리도마 셀라인 153.8E2.D10.D6.12.12(CMCC#12056)이 2003년 9월 17일자로 특허기탁번호 PTA-5543로서 American Type Culture Collection[ATCC; 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209 (USA)]에 기탁되었다.
이론에 결부되지는 않지만, CHIR-12.12 항체는 특질들의 독특한 조합을 가진 이중 작용 길항제 항-CD40 모노클로날 항체이다. 이 완전한 인간 모노클로날 항체는 B 세포의 생존 및 증식을 위한 CD40L-매개 CD40 신호화 경로를 차단한다; 이런 길항작용은 궁극적으로 세포사를 야기한다. 또한, CHIR-12.12는 이펙터 세포에 의한 인식과 결합을 매개하고, 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)을 개시한다. 일단 CHIR-12.12가 이펙터 세포에 결합되면, 세포용해 효소가 방출되어 B 세포 아폽토시스 및 용해가 야기된다.
CHIR-12.12의 생물학적 활성과 이들을 측정하는데 사용되는 분석에 관한 더 상세한 설명은 2003년 11월 4일, 2003년 11월 26일 및 2004년 4월 27일자 제출되어 미국특허출원 제60/517,337호(대리인 사건번호 No. PP20107.001(035784/258442)), 제60/525,579호(대리인 사건번호 No. PP20107.002(035784/271525)), 제60/565,710호(대리인 사건번호 No. PP20107.003(035784/277214))를 각각 배정받은 가 출원들 발명의 명칭 "길항제 항-CD40 모노클로날 항체 및 그 사용 방법"; 및 2004년 11월 4일자 제출되어 WO 2005/044854로 공개된 국제특허출원 제PCT/US2004/037152호(대 리인 사건번호 No. PP20107.004(035784/282916)) 발명의 명칭 "길항제 항-CD40 모노클로날 항체 및 그 사용 방법"에 설명된 대로 수행될 수 있으며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 참고자료로 본원에 포함된다. 또한, 국제공보 WO 2005/044304, WO 2005/044305, WO 2005/044306, WO 2005/044855, WO 2005/044307 및 WO 2005/044294를 참조하며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 참고자료로 본원에 포함된다. 또한, 2005년 12월 9일자 제출되어 미국특허출원 제60/749,285호(대리인 사건번호 No. PP028035.0002(035784/304312))를 배정받은 가 출원 발명의 명칭 "CD40 신호화에 의해 매개되는 증식성 장애의 진단 및 치료 방법", 및 2006년 5월 18일자 제출되어 WO 2006/125143로 공개된 대응 국제특허출원 제PCT/US2006/019414호; 및 2005년 12월 9일자 제출되어 미국특허출원 제60/749,336호(대리인 사건번호 No. PP028062. 0002(035784/304311))를 배정받은 가 출원 발명의 명칭 "자가면역 및/또는 염증 성분을 갖는 질환의 진단 및 치료 방법", 및 2006년 5월 18일자 제출되어 WO 2006/ 125117로 공개된 대응 국제특허출원 제PCT/US2006/019325호(대리인 사건번호 No. PP028062.0003(035784/311608))에 설명된 분석평가법들을 또한 참조하며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 참고자료로 본원에 포함된다.
CHIR-12.12의 주된 임상 용도는 B 세포 관련 악성질환들, 예를 들어 만성 림프구성 백혈병(CLL), 다발성 골수종(MM), 및 비호지킨 림프종(NHL), 및 CD40-발현 세포와 관련된 자가면역 및/또는 염증 질환의 치료이다. 임상시험용의 CHIR-12.12 제약 제품은 액체 제제 중에 20 mg/ml CHIR-12.12 항체로 조제된다. 액체 제제 중에서 항체를 안정화하기 위한 최적 버퍼, 등장제, 및 다양한 부형제를 결정하기 위 해 다음의 연구들을 수행하였다.
실시예 1
CHIR-12.12의 안정화에 대한 다양한 버퍼 종들 및 메티오닌의 효과
용액 조건(예를 들어, pH, 버퍼 종, 및 이온강도) 및 부형제(예를 들어, 계면활성제 및 안정제)는 액체 제제 중 단백질의 안정성을 위한 중요한 요인들이다. CHIR-12.12의 물리화학적 안정성은 pH 5.5에서 최적이다. 그러나, CHIR-12.12 단백질은 불리한 용액 조건에서 응집과 단편화를 통해 변성될 수 있다; 또한, 이것은 산화될 수 있으며, Tween 같은 부형재 원료와 함께 도입되는 과산화물 불순물 및/또는 미량의 금속의 존재하에 특히 그러하다. 최적 pH 5.5에서 조제되었을 때 응집, 단편화, 및 산화에 대해 CHIR-12.12 모노클로날 항체를 안정화하는 최상의 버퍼 종들과 적합한 부형제를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
재료
CHIR-12.12 연구 약물 물질(DS) 롯트는 CHO-유래 정제 벌크 롯트 #CD021105A 및 롯트 #PD010705A이었다. 이 DS 롯트는 Xoma, Ltd.(Berkeley, CA)에서 생산되었다. 각 버퍼 용액에서 DS를 투석한 후 바람직한 양의 Tween을 혼합하여 본 연구를 위한 제제 샘플을 제조하였다. CHIR-12.12 단백질의 농도는 모든 샘플에서 약 20 mg/ml였다.
분석 방법
크기-배제 크로마토그래피(SEC)
SEC-HPCL은 분자량이 감소하는 순서대로 분자를 분리한다. 결론적으로 HPLC 칼럼으로부터 CHIR-12.12 응집물이 먼저 용출되고, 그 다음 모노머가 용출되고 마지막으로 단편들이 용출된다. CHIR-12.12의 순도, 응집현상 및 단편화를 Tosohaas TSK-GEL 3000SW XI 칼럼을 장착한 Waters Alliance HPLC에 의해 분석하였고, 이동상은 50 mM 나트륨 포스페이트, 200 mM NaCl, pH 7.0이고, 유속은 0.7 mL/min이었다.
소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
CHIR-12.1의 산화를 Tosoh TSK 겔 부틸-NPR 칼럼을 장착한 Waters Alliance HPLC 시스템에 의해 측정하였고, 이동상 A는 2 M 암모늄 술페이트/20 mM Tris, pH 7.0, 이동상 B는 20 mM Tris, pH 7.0이고, 유속은 1.0 ml/min이었다. CHIR-12.12 항체는 파파인에 의해 소화되어 Fab과 Fc 단편을 산출한다. CHIR-12.12의 산화 산물은 산화된 Fc 단편들(metSO)이며, 이것은 주 Fab 종들과 주 Fc 종들 사이에 HPLC 칼럼으로부터 용출된 전-Fc 종들이다.
실험 및 결과
응집 및 단편화에 대한 시트레이트 버퍼의 안정화 효과
DS 롯트 #PD010705A로부터의 CHIR-12.12를 150 mM NaCl, 0.1% (w/v) Tween 80 및 pH 5.5를 가진 10 mM 시트레이트, 아세테이트, 숙시네이트, 또는 포스페이트 버퍼 용액 중에 20 mg/ml로 조제하였다. 제제 샘플을 3 cc 유리 바이알에 1.2 ml씩 채우고 5℃, 25℃ 및 40℃에 저장하였다. CHIR-12.12 안정성 샘플을 지정된 시점에서 SEC 분석에 의해 분석하였다.
도 1-3은 25℃에 저장된 샘플에서 순도, 응집물, 및 단편에 대한 SEC 분석을 나타낸다. 도 4-6은 40℃에 저장된 샘플에서 순도, 응집물, 및 단편에 대한 SEC 분석을 요약한다. 모든 결과는 시험된 4개의 제제 중에서 시트레이트-계 제제 샘플이 가장 높은 순도와 가장 낮은 응집 및 단편화 수준을 유지했음을 나타낸다. 5개월 동안 5℃에 저장된 샘플에 대해서는 변화가 거의 검출되지 않았지만(데이터 나타내지 않음), 촉진된 SEC 데이터에 의하면 시트레이트 버퍼가 나머지 3개의 일반적으로 사용되는 버퍼 종들보다 응집 및 단편화에 대한 CHIR-12.12의 장기 실시간 안정성을 개선하는데 있어서 더 우수할 수 있음이 예측된다.
CHIR-12.12에 대한 시트레이트 버퍼의 산화 억제 효과
CHIR-12.12 안정성 샘플을 0.1% 및 0.2% (w/v) Tween 80을 가진 시트레이트, 아세테이트, 및 숙시네이트 버퍼 중에 제조하였다. 샘플을 5℃, 25℃, 및 40℃에 저장하고, 정해진 시점에서 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)로 산화에 대해 분석하였다. CHIR-12.12의 산화 산물은 전-Fc 피크 종들의 합계 퍼센트, 즉 Pre-Fc%로 측정하였다. 표 1의 결과는 시트레이트-계 제제가 숙시네이트- 및 아세테이트-버퍼 제제보다 더 적은 산화 산물을 생성했음을 나타내며, 이는 시트레이트 버퍼가 CHIR-12.12의 산화를 최소화했음을 시사한다. 이들 결과는 시트르산이 아마도 킬레이트화제로 작용하여 CHIR-12.12 단백질의 미량 금속-유도 산화를 억제했음을 암시한다.
SEC 및 HIC 분석은 시트레이트 버퍼가 CHIR-12.12를 응집 및 단편화로부터 보호하는데 있어서 숙시네이트, 아세테이트, 및 포스페이트 버퍼 종들보다 더 우수하다는 것을 나타낸다. 또한, 시트레이트 버퍼는 CHIR-12.12 단백질의 산화를 최 소화한다는 점에서 숙시네이트 및 아세테이트 버퍼보다 우수하다.
Figure 112008073008134-PCT00004
CHIR-12.12에 대한 L-메티오닌의 산화 억제 효과
DS 롯트 #CD021105A를 150 mM NaCl, 0.1% Tween 80 또는 Tween 20 및 다양한 양(0-5 mM)의 L-메티오닌을 가진 10 mM 나트륨 시트레이트/시트르산 중에 20 mg/ml로 조제하였다. 제제 샘플을 3cc 바이알에 2.5 ml씩 채우고 40℃에 저장했다. 표 2는 초기 시간에서와 40℃에서 3개월 경과한 시간에서 샘플에 대한 HIC 결과를 나타낸다. 초기 시간에서 CHIR-12.12의 산화는 모든 제제에서 원 벌크 약물 물질(DS) 롯트 # CD021105 A과 비슷했다. L-메티오닌이 없는 제제에서 산화 수준은 3개월 동안 40℃에 저장하자 2배 이상이 되었다. 그러나, L-메티오닌을 함유하는 제제에서 산화 수준은 40℃에서 3개월 저장하는 동안 거의 변화되지 않았다.
이 결과는 5 mM L-메티오닌이 고도로 스트레스를 가한 저장 조건에서 CHIR-12.12의 산화를 방지하는데 효과적이며 충분했다는 것을 나타낸다. CHIR-12.12에 대한 L-메티오닌의 산화 억제 효과는 Lye-펩티드 맵에 의해 확인되었다.
Figure 112008073008134-PCT00005
요약하면, 시트레이트 버퍼는 CHIR-12.12의 응집, 단편화 및 산화를 최소화하므로 CHIR-12.12 액체 제제를 위한 최적의 버퍼이다. L-메티오닌은 CHIR-12.12의 산화를 효과적으로 억제하며, 5 mM L-메티오닌이 바람직하다.
실시예 2
CHIR-12.12에 대한 아르기닌-HCl의 안정화 효과
다음 연구는 정맥내 주입에 의한 투여를 위한 액체 제약 조성물로서 조제된 CHIR-12.12의 장기 안정성을 위한 장성제 및 안정제를 선택하는 것을 목표로 하였다. NaCl이 단백질 비경구 제품에 가장 일반적으로 사용되는 등장제지만, 이것은 항체 치료제에 대해 최적의 안정화 효과를 가질 수 없다. 본 연구는 수성 제제 중에서 CHIR-12.12에 대한 염화나트륨과 산성 형태 아르기닌(아르기닌-HCl)의 안정화 효과를 비교한 것을 기록한다.
CHIR-12.12 벌크 항체 약물 물질을 pH 5.5의 시트레이트 버퍼를 사용하여 제조하였고, 150 mM NaCl 또는 150 mM L-아르기닌-HCl로 CHIR-12.12 액체 제제의 목표 삼투농도 295 mOsm/kg을 달성하였다. 차등 주사 열량계(DSC), 크기-배제 크로마토그래피(SEC-HPLC), SDS-PAGE 및 양이온-교환 HPLC(CIEX-HPLC)를 사용하여 CHIR-12.12 항체의 생물리적 및/또는 생화학적 안정성을 평가하였다. 본 연구는 150 mM L-아르기닌-HCl이 CHIR-12.12 수성 제제를 등장성으로 만들 뿐만 아니라, 응집, 단편화 및 탈아미드화에 대한 CHIR-12.12의 입체형태적 안정성을 증가시킨다는 것을 증명한다. L-아르기닌-HCl은 촉진된 안정성 조건에서 NaCl보다 더 우수한 것으로 증명되었다. 더욱이, 가속된 안정성 데이터에 의하면 CHIR-12.12 L-아르기닌-HCl 제제에 대해 더 장기간의 저장수명이 예측된다.
재료
본 연구에서 사용된 CHIR-12.12 약물 물질(DS)은 CHO-유래 정제 벌크 롯트 # CD021105A이었다. 이 DS 롯트는 Xoma Ltd.(Berkeley, CA)에서 생산되었다.
상기 DS 롯트의 CHIR-12.12를 다음 제제들에 사용하였다:
제제 1: 20 mg/ml CHIR-12.12, 10 mM 나트륨 시트레이트/시트르산, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 80, 및 pH 5.5
제제 2: 20 mg/ml CHIR-12.12, 10 mM 나트륨 시트레이트/시트르산, 150 mM L-아르기닌-HCl, 0.1% Tween 80, 및 pH 5.5
분석 방법
차등 주사 열량계(DSC)
CHIR-12.12 제제 샘플의 입체형태적 안정성을 MicroCal VP-DSC를 사용하여 1℃/min으로 15℃에서 90℃까지 가열하면서 평가하였다.
크기-배제 크로마토그래피(SEC-HPLC)
CHIR-12.12의 순도, 응집, 및 단편화를 Tosohaas TSK-GEL 3000SW XL 칼럼을 장착한 Waters Alliance RPLC에 의해 분석하였고, 이동상은 50 mM 나트륨 포스페이트, 200 mM NaCl, pH 7.0이고, 유속은 0.7 ml/min이었다.
SDS PAGE(비-환원 및 환원)
또한, CHIR-12.12의 순도를 비-환원 및 환원 조건에서 12% Tris-글리신 겔을 사용하여 평가하였다. 코마씨 블루 염색에 의해 단백질이 검출되었다.
양이온 교환 크로마토그래피(CIEX-HPLC)
CHIR-12.12의 전하 변화-관련 탈아미드화를 Dionex Propac WCX-10 칼럼을 장착한 Waters Alliance HPLC 시스템에 의해 측정하였고, 이동상 A는 50 mM HEPES, pH 7.3, 이동상 B는 500 mM NaCl 함유 50 mM HEPES, pH 7.3이고 유속은 0.8 ml/min이었다.
하기 결과 섹션에서 언급된 숫자들에 있는 약어의 해석은 다음과 같다:
숙시네이트, NaCl, 0.1% TW80 = 10 mM 나트륨 숙시네이트/숙신산 버퍼, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 80, pH 5.5
시트레이트, NaCl, 0.1% Tw80 = 10 mM 나트륨 시트레이트/시트르산 버퍼, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 80, pH 5.5
아세테이트, NaCl, 0.1 % Tw80 = 10 mM 나트륨 아세테이트/아세트산 버퍼, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 80, pH 5.5
Phos, NaCl, 0.1% Tw80 = 10 mM 나트륨 포스페이트 다이베이직/나트륨 포스페이트 모노베이직 버퍼, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 80, pH 5.5
시트레이트, Arg, 0.1 % Tw80 = 10 mM 나트륨 시트레이트/시트르산 버퍼, 150 mM L-아르기닌-HCl, 0.1% Tween 80, pH 5.5
결과
차등 주사 열량계(DSC)
도 7은 상기 "재료" 섹션에 설명된 2개 제제 중의 CHIR-12.12에 대한 DSC 써모그램을 나타낸다. 열에 의한 CHIR-12.12의 풀림이 적어도 2번의 열 변환에서 나타났는데, 이는 아마도 각각 Fab 및 Fc의 풀림/용융을 나타내는 것일 수 있다. 더 고온에서 단백질은 아마도 응집되었을 텐데, 그 결과 DSC 신호가 손실되었다. 본 연구에서 최저 열 변화 온도가 용융 온도 Tm으로 정의되었다. L-아르기닌-HCl-함유 제제는 NaCl-함유 제제보다 더 높은 Tm을 나타냈는데, 이는 L-아르기닌-HCl이 CHIR-12.12에 NaCl보다 더 높은 입체형태적 안정성을 제공한다는 것을 암시한다.
SEC-HPLC 분석
5℃에서 6개월 동안 인큐베이션한 후, SEC-HPLC는 L-아르기닌-HCl- 및 NaCl-함유 제제에서 무시할 만한 양의 단백질 응집물 및 단편(< 0.5%)을 검출하였으며, 두 제제 사이에 감지가능한 안정성 차이는 없었다(데이터 나타내지 않음). 촉진된 저장 조건에서, 즉 25℃에서 6개월 동안 L-아르기닌-HCl-함유 제제는 도 8에 나타낸 대로 더 높은 퍼센트의 모노머를 함유했다. 모노머가 줄어들면서 응집물과 단편 모두의 함량이 저장 시간에 따라 서서히 증가하였다. 그러나, 도 9 및 10에 나타낸 대로, L-아르기닌-HCl-함유 제제는 NaCl-함유 제제보다 적은 응집물과 단편을 생성했다. 유사하게, 도 11, 12, 및 13에 나타낸 대로, 40℃에서 저장했을 때, L-아르기닌-HCl-함유 제제는 NaCl-함유 제제보다 더 높은 퍼센트의 모노머와 더 적은 퍼센트의 응집물 및 단편을 나타냈다. 40℃에서 4개월 동안 저장했을 때, L-아르기닌-HCl-함유 제제는 91.8% 모노머, 1.7% 응집물, 및 6.5 % 단편을 가졌던 반면, NaCl-함유 제제는 87.9% 모노머, 2.2% 응집물, 및 9.9% 단편을 가졌다. SEC-HPLC는 L-아르기닌-HCl이 NaCl과 비교하여 CHIR-12.12 단백질의 안정성을 개선한다는 것을 증명한다.
SDS-PAGE(비-환원 및 환원)
표 3은 비-환원(NR) 및 환원(R) 조건에서 분석한 L-아르기닌-HCl- 및 NaCl-함유 제제에 대한 SDS-PAGE 결과를 나타낸다. CHIR-12.12의 순도는 비-환원 조건에서는 주 밴드의 퍼센트로서, 또는 환원 조건에서는 중쇄 밴드와 경쇄 밴드의 합계 퍼센트로서 측정하였다. 0 시간을 제외하고, L-아르기닌-HCl-함유 제제는 비-환원 조건과 환원 조건 모두에서 NaCl-함유 제제보다 더 높은 순도를 나타냈다. SDS-PAGE로부터의 관찰은 L-아르기닌-HCl이 NaCl보다 CHIR- 12.12의 안정성을 증가시켰던 SEC-HPLC의 결과와 일치했다.
Figure 112008073008134-PCT00006
CIEX-HPLC 분석
CIEX-HPLC는 전하에 기초하여 분자를 분리하며, 따라서 주 피크 종들에 앞서서 산성 변이체가 용출되고, 주 피크 종들 뒤에 염기성 변이체가 용출된다. CHIR-12.12의 순도 및 그것의 탈아미드화 산물 함량은 각각 주 피크의 퍼센트와 산성 변이체의 퍼센트로 측정했다.
도 14, 15, 및 16은 각각 두 제제에서의 순도, 탈아미드화 산물 함량, 및 염기성 변이체 함량을 나타낸다. 0 시간에서 두 제제는 68.6% 순도, 15.5% 탈아미드화 산물 및 15.9% 염기성 변이체를 가졌다. 25℃에 저장했을 때, L-아르기닌-HCl-함유 제제는 NaCl-함유 제제보다 높은 순도와 높은 염기성 변이체 함량을 유지했으며, 낮은 퍼센트의 탈아미드화 산물을 나타냈다. 25℃에서 6개월 동안 저장했을 때, L-아르기닌-HCl-함유 제제는 47.3% 순도, 12.5% 염기성 변이체, 및 40.0% 탈아미드화 산물을 가졌던 반면, NaCl-함유 제제는 45.6% 순도, 11.7% 염기성 변이체, 및 42.7% 탈아미드화 산물을 가졌다. L-아르기닌-HCl- 및 NaCl-함유 제제는 5℃에서 6개월 저장하는 동안 거의 변화를 나타내지 않았지만, 촉진된 저장 조건(25℃)에서의 CIEX- HPLC 결과에 의하면 L-아르기닌-HCl이 탈아미드화에 대한 CHIR-12.12의 장기 실시간 안전성을 개선하는데 있어서 NaCl보다 더 우수할 수 있음이 예측된다.
요약하면, 본 연구는 150 mM L-아르기민-HCl이 CHIR-12.12 액체 제제를 등장성으로 만들 뿐만 아니라, 응집, 단편화 및 탈아미드화에 대해 CHIR-12.12의 입체형태적 안정성을 증가시킨다는 것을 증명한다. L-아르기닌-HCl은 촉진된 안정성 조건에서 NaCl보다 더 우수하며, 더 나아가 촉진된 안정성 데이터에 의하면 CHIR-12.12 L-아르기닌-HCl 제제에 대한 장기간의 저장수명이 예측된다.
실시예 3
냉동 저장으로 인한 CHIR-12.12 벌크 약물 물질의 응집을 최소화하는데 있어서 Tween 80 및 Tween 20의 효과
CHIR-12.12 벌크 약물 물질의 냉동 저장은 제품 안정성과 저장수명 증가, 미생물 성장 감소, 및 수송 도중의 거품발생 제거를 비롯한 몇 가지 이유 때문에 액체 저장보다 바람직하다. 그러나, 냉동과 이어진 해동은 얼음-액체 계면 및 용질의 농도 구배를 도입함으로써 단백질 용액에 스트레스를 유도할 수 있다. 스트레스는 단백질을 변성시키고, 응집과 어떤 경우 가시적 미립자 또는 침전물의 형성을 야기할 수 있다. 단백질 응집물은 약물 효능 감소 및 면역원성 증가와 주로 관련되었기 때문에, 단백질 제제 성분 및 냉동-해동 조건을 최적화함으로써 응집을 최소화하는 것이 매우 중요하다.
당, 다가 알코올, 아미노산, 및 계면활성제 같은 제제 부형제가 아마도 단백질 및 항체를 응집으로부터 안정화할 수 있을 것이다. 한 모노클로날 항체 연구에서, 몇 개의 일반적으로 사용되는 당, 다가 알코올, 및 아미노산이 냉동-해동에 의해 촉발되는 응집을 감소시키는데 있어서 계면활성제보다 더욱 효과적임이 밝혀졌다. 그러나, CHIR-12.12를 사용한 초기의 연구는 당(예를 들어, 트레할로스), 다가 알코올(예를 들어, 소르비톨), 또는 아미노산(예를 들어, 글리신)의 단독 사용은 냉동 및 해동 동안 CHIR-12.12의 응집을 유의하게 감소시킬 수 없었음을 나타냈다.
본 연구는 냉동 및 해동 동안 CHIR-12.12 응집을 최소화할 수 있는 조제 접근법에 중점을 두었다. 이 방식에서, CHIR-12.12의 냉동-해동-유도 응집을 최소화하기 위해 다양한 계면활성제를 평가하였다. 실제 냉동된 CHIR-12.12 약물 물질은 본 연구에서 평가된 대로의 여러 번의 냉동-해동 순환을 경험할 가능성이 거의 없지만, 확장된 냉동-해동 스트레스 연구는 장기 저장 및 수송 동안 여러 번의 냉동 및 해동이 우연히 일어날 수 있다는 가정하에 조제된 벌크 약물이 응집할 가능성을 예측하기 위해 사용된 최악의 시나리오이다.
재료
CHIR-12.12 벌크 DS 롯트 # UA7870, # TC23-2, # UB 1291, # PD010705A, 및 # CD083005A를 본 연구에 사용하였다. Tween 80, Tween 20, Brij 35, 및 Pluronic F68는 각각 Sigma, J.T. Baker, Alfa Aesar 및 MediaTech Cellgro에서 구입하였다. CHIR-12.12 약물 물질의 냉동 저장용 폴리카보네이트(PC) 병은 Nalgene에서 구입하였다.
방법
대조군 샘플을 제외한 모든 나머지 샘플을 -20℃ 또는 -60℃에서 완전히 냉동한 다음 주위 온도에서 완전히 해동하는 것을 여러번 반복하였다.
3가지 분석 방법을 사용하여 모노머에서 가시적 응집물 범위까지 CHIR-12.12 단백질을 검출하였다. 가시적 미립자를 검출하기 위한 시각적 관찰은 Tyndal 라이트(M.W. Technologies, Inc.) 아래서 수행했다. 액체 입자계수 시스템(HIAC/Royco)을 사용하여 ≥ 10㎛ 및 ≥ 25㎛의 가시 크기 이하의 응집물을 계수하였다. 동적 광산란 분석기(Malvern Nano 시리즈)를 사용하여 모노머 및 응집물의 수력학적 직경과 입자 크기 분포를 측정하였다.
가시적 입자 평가
냉동-해동 연구용 샘플을 CHIR-12.12 약물 물질 롯트 # UA7870 및 롯트 # TC23-2로부터 제조하였다. 모든 샘플은 10 mM 나트륨 시트레이트/시트르산, 150 mM NaCl, 및 pH 5.5 버퍼 용액 중에서 투석한 다음, 다음의 비이온성 계면활성제 중 하나를 다양한 퍼센트(0-0.5% w/v)로 첨가하여 조제하였다: Tween 80, Tween 20, Brij 35, 및 Pluronic F68. 각 샘플을 유리 바이알에 2.5 ml씩 채우고, -60℃에서 하룻밤 냉동시킨 다음 주위 온도에서 해동시키는 사이클을 8회까지 반복하였다. 초기 시간(0 시간)에서 그리고 각 냉동-해동 사이클 후에 샘플을 투명도와 가시적 침전물/응집물에 대해 시각적으로 시험하였다.
가시 크기 이하의 입자 계수
CHIR-12.12 약물 물질 롯트 # UB 1291 및 #PD010705A를 용액(20 mg/ml CHIR-12.12, 10 mM 나트륨 시트레이트/시트르산, 150 mM NaCl, pH 5.5) 중에 제조한 다음, Tween 80 또는 Tween 20을 0-0.5% (w/v)로 첨가하였다. 제제 샘플을 20 ml씩 125cc 폴리카보네이트 병에 채우고, -60℃에서 냉동시킨 다음 주위 온도로 해동시켰다. 5회의 냉동-해동 사이클 후, HIAC-Royco 액체 입자계수 시스템을 사용하여 ≥ 10㎛ 및 ≥ 25㎛의 가시 크기 이하의 응집물에 대해 샘플을 측정하였다.
동적 광산란 분석
5회의 냉동-해동 사이클 전과 후에, 동정 광산란 분석장치를 사용하여 응집물에 대해 제제(20 mg/ml CHIR-12.12, 10 mM 나트륨 시트레이트/시트르산, 150 mM L-아르기닌-HCl, 5 mM L-메티오닌, 0-0.2% Tween 20, and pH 5.5)를 평가하였다.
동적 광산란(DLS) 분광기는 Stokes-Einstein 방정식을 이용하여 측정된 확장 계수와 입자가 구형이라는 가정으로부터 모노머 및 응집물을 포함하는 입자의 수력학적 직경을 계산한다. 또한, 응집물 종들의 수와 다분산성이 DLS 연구로부터 획득된다.
결과
가시적 입자 평가
표 4는 시각적 관찰 결과를 요약한다. 냉동-해동 사이클을 개시하기 전인 0 시간에서, 모든 샘플은 약간 유백색인 상태로 가시적 응집물/침전물은 없었다. 1회의 냉동-해동 사이클 후, 어떤 계면활성제도 첨가하지 않은 모든 제제와 0-0.05% (w/v)의 Tween 80을 함유하는 제제, 그리고 0-0.1% (w/v)의 Brij 35를 함유하는 제제, 뿐만 아니라 0-0.5% (w/v)의 Pluronic F68를 함유하는 샘플에서 약간의 가시적 응집물/침전물이 형성되었다. 0.05%-0.5% (w/v) Tween 20를 함유하는 샘플은 8회의 냉동-해동 사이클 동안 어떤 응집물 또는 침전물을 나타내지 않았다. 이것은 Tween 20이 여러 번의 냉동-해동 사이클로 인한 커다란 불용성 응집물의 형성을 방지하는데 있어서 Tween 80보다 더 효과적임을 암시한다.
Figure 112008073008134-PCT00007
가시 크기 이하의 입자 계수
표 5는 Tween 80을 다양한 농도로 함유하는 시트레이트/시트르산-완충 제제들의 눈에 보이는 것보다 약간 작은 응집물의 ml 당 수를 나타낸다. Tween 80의 농도가 증가할수록 가시 크기 이하의 입자 수의 하향 경향이 관찰되었다; Tween 80이 0.1% (w/v) 이상이었을 때 가시 크기 이하의 입자 수 감소가 중간 정도였는데, 이는 Tween 80의 사용을 위한 적합한 농도가 0.1-0.2% (w/v)였음을 암시한다.
Figure 112008073008134-PCT00008
표 6은 Tween 20을 첨가한 또는 첨가하지 않은 시트레이트/시트르산-완충 제제의 가시 크기 이하의 응집물의 ml 당 수를 나타낸다. 이 응집물 수는 제제 중에 Tween 20의 첨가되었을 때 크게 감소되었다. Tween 20이 0.05% (w/v) 이상이었을 때, 가시 크기 이하의 응집물 수 감소가 거의 평탄역에 도달하였는데, 이는 Tween 20의 적합한 농도가 약 0.05-0.2% (w/v)이었음을 암시한다.
Figure 112008073008134-PCT00009
추가하여, 표 5와 표 6은 5회의 냉동-해동 사이클 후 Tween 80-함유 제제와 Tween 20-함유 제제가 모두 ≥ 25㎛ 응집물을 매우 적게 생성했고, Tween 20-함유 제제는 Tween 80-함유 제제보다 ≥ 10㎛ 응집물을 더욱 적게 생성했음을 나타낸다. 이 결과는 Tween 20이 CHIR-12.12 시트레이트/시트르산-완충 제제에서 가시 이하 크기의 응집물의 형성을 최소화하는데 있어서 Tween 80보다 더욱 효과적임을 시사한다.
표 4, 5, 및 6의 결과에 기초하면, Tween 20은 CHIR-12.12 제제에서 응집물의 형성을 최소화하는데 있어 Tween 80보다 바람직한 부형제이다. 따라서, CHIR-12.12 제제에서 응집물의 형성을 제거하는데 필요한 Tween 20의 농도를 더욱 최적화하기 위한 추가의 연구들을 수행했다. 제제(20 mg/ml CHIR-12.12, 10 mM 나트륨 시트레이트/시트르산, 150 mM L-아르기닌-HCl, 5 mM L-메티오닌, 0-0.2% Tween 20, pH 5.5)는 CHIR-12.12 약물 물질 롯트 # CD083005A로부터 제조했다. 20 ml 제제 샘플을 125cc 폴리카보네이트 병에 채우고, -20℃에서 냉동시킨 다음 주위 온도에서 해동시켰다. 5회의 냉동-해동 사이클 전과 후에, HIAC-Royco 액체 입자 계수기를 이용하여 가시 크기 이하의 입자 수에 대해 제제 샘플을 측정했다. 결과를 표 7에 요약한다.
Figure 112008073008134-PCT00010
5회의 냉동-해동 사이클 후, L-아르기닌-HCl 및 L-메티오닌을 함유하는 샘플은 L-아르기닌-HCl과 L-메티오닌을 첨가하지 않은 제제보다 훨씬 적은 응집물을 생성하였는데, 즉 Tween 20의 부재하에 169 입자/ml ≥ 10㎛ 대 1439 또는 1671 입자/ml ≥ 10㎛ 였다(표 6 및 7 참조). 그러나, Tween 20이 도입되었을 때, L-아르기닌-HCl과 L-메티오닌은 냉동-해동-유발 응집물을 최소 수준까지 유의하게 감소시키지 않았다. 이것은 L-아르기닌-HCl과 L-메티오닌이 CHIR-12.12의 냉동-해동 유발 응집물을 최소화하는데 있어서 충분히 효과적이지 않음을 암시한다.
표 5-7에 요약한 데이터로부터, 0.025-0.1% (w/v) Tween 20을 함유하는 냉동-해동 샘플의 가시 크기 이하 응집물 수는 냉동-해동 사이클 전에 각 샘플에서 비슷하게 유지되었다. 이것은 L-아르기닌-HCl과 L-메티오닌과 조합하여 Tween 20을 함유하는 제제가 가시 크기 이하의 응집물을 최소한으로 생산했음을 시사한다. 따라서, Tween 20은 냉동 및 해동 동안 가시 크기 이하의 응집물 생성에 있어 CHIR-12.12를 효과적으로 최소화하는 제제 부형제이다. Tween 20의 유효 농도는 0.025-0.1% (w/v)인 것으로 측정되었다.
동적 광산란 분석
표 8은 입자의 평균 수력학적 직경, 다분산성, 및 CHIR-12.12의 모노머 종들의 강도 퍼센트를 나타낸다. 동적 광산란 분석은 모노머 종들에 대해 100% 강도로 표시된바, 5회 냉동-해동 사이클 전과 후에 모든 샘플에서 단지 모노머 종만을 검출하였다. 5회 냉동-해동 사이클 연구 후, 수력학적 직경과 다분산성의 증가에 의해 표시된바, Tween 20 미첨가 샘플과 0.005% (w/v) Tween 20 첨가 샘플에서 소수의 응집물(아마도 다이머나 트라이머)이 모노머와 함께 존재할 수 있었다. 0.025-0.1% (w/v) Tween 20을 함유하는 샘플은 수력학적 직경과 다분산성 값이 거의 변화를 나타내지 않았는데, 이는 이들이 감지가능한 응집물을 형성하지 않고 모노머를 이전 수준으로 유지했음을 시사한다.
Figure 112008073008134-PCT00011
시각적 관찰, 가시 크기 이하 입자 수, 및 동적 광산란 분석에 기초하여, 냉동-해동-유발 응집으로 인한 CHIR-12.12를 최소화하기 위한 Tween 20의 최적 농도는 0.025-0.1% (w/v)인 것으로 측정되었다.
요약하면, Tween 20과 Tween 80은 모두 냉동 및 해동 동안 CHIR-12.12 응집을 최소화하는 것으로 밝혀졌다. Tween 20과 Tween 80의 최적 농도는 각각 0.025-0.1% (w/v) 및 0.1-0.2% (w/v)이다. Tween 20이 더 적은 농도에서 응집물 형성의 수 및 범위를 더 낮은 수준까지 감소시킨다는 점에서 Tween 20이 Tween 80보다 더욱 효과적이다. 본 연구는, 바람직하게는 L-아르기닌-HCl 및 L-메티오닌과 조합하여 Tween을 최적 농도로 첨가하는 것이 -20℃ 이하에서 유의한 응집 없이 시트레이트/시트르산-완충 CHIR-12.12 벌크 약물 물질의 저장을 가능하게 한다는 것을 증명하였다.
실시예 4
항-CD40 항체의 길항제 활성의 분석
다음 분석을 사용하여 항-CD40 항체의 길항제 활성을 평가할 수 있다. 이들 분석을 위한 인간 B 세포는, 예를 들어 편도선절제술을 받은 개체로부터 획득한 편도선에서 분리하여 획득할 수 있으며, 이것은 본질적으로 De Groot et al. (1990) Lymphokine Research (1990) 9:321에 설명된 방법이다. 간단히 말해서, 작은 칼을 사용하여 조직을 분산시키고, 5 mM L-로이신 메틸 에스테르로 처리하여 포식세포와 NK 세포를 고갈시키고, 2-아미노에틸 이소티오우로늄 브로마이드로 처리한 양 적혈구(SRBC)를 사용하여 한 사이클 로세팅하여 T 세포를 제거한다. 결과의 B 림프구 제제의 순도는 항-(CD20) mAb B1(Coulter Clone, Hialeah, FA) 또는 항-(CD3) mAb OKT3(Ortho, Raritan, NJ) 및 토끼 항-(마우스 Ig)의 FITC-콘쥬게이트 F(ab')2 단편(Zymed, San Francisco, CA)으로 표지하는 간접 면역형광법, 및 FACS 분석에 의해 조사될 수 있다.
B-세포 증식 분석
B 세포(4 x 104, 웰 당)를 바닥이 평평한 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 10% 태아 소 혈청을 보충한 200㎕ IMDM 중에 배양한다. 고정된 항-(IgM) 항체 (Immunobeads; 5㎍/ml; BioRad, Richmond, California)를 첨가하여 B 세포를 자극한다. 바람직한 경우, 100 U/ml 재조합 IL-2을 첨가한다. 마이크로배양을 개시할 때 시험 모노클로날 항체(mAb)를 농도를 변화시켜 첨가하고, 3일째에 18시간 펄싱한 후 (3H)-티미딘의 결합을 측정하여 증식을 평가한다.
길항제 항-CD40 항체는 고정된 항-IgM의 존재하에 또는 고정된 항-IgM과 IL-2의 존재하에 인간 B 세포 증식을 유의하게 공-자극하지 않는다.
Banchereau-형 B-세포 증식 분석
Banchereau et al. (1991) Science (1991) 251:70에 설명된 것과 유사한 배양 시스템에서 B 세포 증식을 자극하는 항-CD40 모노클로날 항체의 능력을 시험하기 위해 인간 FcγRII의 HR 대립형질 형태를 발현하는 마우스 3T6 트랜스펙턴트 세포를 사용한다. B 세포(2 x 104, 웰 당)를 바닥이 평평한 마이크로웰에서 1 x 104 트랜스펙턴트 세포(5000 Rad 조사)의 존재하에 10% 태아 소 혈청과 100 U/ml 재조합 IL-4로 부총한 200㎕ IMDM 중에 배양한다. B 세포의 첨가 전에 3T6 세포를 5시간 이상 동안 배양 플라스틱에 부착시킨다. 항-CD40 mAb를 농도를 15 ng/ml 내지 2000 ng/ml로 변화시키면서 첨가하고, 7일째에 [3H]-티미딘으로 18시간 펄싱한 후 티미딘 결합을 측정하여 B 세포 증식을 평가한다.
길항제 항-CD40 mAb를 사용한 S2C6-자극 B 세포 증식의 억제
길항제 항-CD40 모노클로날 항체(mAb)는 또한 상기 설명된 B 세포 증식 분석을 이용하여 S2C6(SGN-14라고도 알려짐, 이것은 문헌에 따르면 정상 B 세포의 증식의 CD40 자극에 대한 작동제이다; Francisco et al. (2000) Cancer Res. 60:3225-3231) 같은 항-CD40 항체에 의한 B 세포 증식의 자극을 억제하는 능력에 대해 특성화될 수 있다. 인간 편도선 B 세포(4 x 104, 웰 당)를 Sepharose 비드(5 ㎍/ml)에 결합된 항-IgM와 항 CD40 mAb S2C6 (1.25 ㎍/ml)의 존재하에 마이크로웰에서 200㎕ 중에 배양한다. 해당 항-CD40 mAb의 농도를 변화시키면서 첨가하고, 3일 후에 [3H] 티미딘 결합을 평가한다. 대조군으로서 항-(글루코세레브로시다제) mAb 8E4를 유사한 농도로 첨가할 수 있다. Barneveld et al.(1983) Eur. J. Biochem. 134:585. 길항제 항-CD40 항체는 mAb S2C6에 의한 항-IgM 유도 인간 B-세포 증식의 공-자극을, 예를 들어 적어도 75% 이상까지 억제할 수 있다(즉, 길항제 항-CD40 항체의 존재하에 S2C6-자극 증식은 길항제 항-CD40 항체의 부재하에 관찰되는 것의 25%를 넘지 않는다). 반대로, β-글루코세레브로시다제에 대한 등량의 비-관련 mAb 8E4에서는 유의한 억제가 보이지 않았다. Barneveld et al.(상동). 이러한 결과는 항-CD40 mAb가 인간 B 세포의 증식에 대한 자극 신호를 송달하지 않으며, 반대로 다른 mAb로 CD40을 촉발시킴으로써 발휘되는 자극 신호를 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.
EL4B5 세포를 사용한 B 세포 활성화 분석
Zubler et al. (1985) J. Immunol. (1985) 134:3662는 EL4B5라고 알려진 마우스 흉선종 EL-4 라인의 돌연변이 서브클론이 증식 및 시험관내 면역글로불린-분비 원형질 세포로의 분화에 대해 뮤린 및 인간 기원의 B 세포를 강하게 자극할 수 있음을 관찰했다. 이런 활성화는 항원-의존성이며 MHC 제한적이지 않은 것으로 밝혀졌다. 인간 B 세포의 최적의 자극을 위해서는 활성화 인간 T 세포로부터의 상청액이 필요했지만, 또한 B 세포 반응은 EL4B5 세포가 포르볼-12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA) 또는 IL-1에 의해 전-활성화되었을 때도 발생했다. Zubler et al. (1987) Immunological Reviews 99:281; 및 Zhang et al. (1990) J. Immunol. 144: 2955. 이 배양 시스템에서 B 세포 활성화는 효과적이었는데, 제한 희석 실험은 대부분의 인간 B 세포가 활성화되어 증식되고 항체-분비 세포로 분화될 수 있음을 나타냈다. Wen et al. (1987) Eur. J. Immunol. 17:887.
B 세포(웰 당 1000)를 바닥이 평평한 마이크로타이터 플레이트에서 10% 열-불활성화 태아 소 혈청, 5 ng/ml 포르볼-12-미리스테이트 13-아세테이트(Sigma) 및 5% 인간 T 세포 상청액을 보충한 200㎕ IMDM 중에 조사된(5000 Rad) EL4B5 세포(5 x 104, 웰 당)와 함께 배양한다. 배양을 개시할 때 mAb를 농도를 변화시키면서 첨가하고, 6일째에 [3H]-티미딘으로 18시간 펄싱한 후 티미딘 결합을 평가한다. T 세포 상청액의 제조를 위해 정제된 T 세포를 1 ㎍/ml PHA과 10 ng/ml PMA의 존재하에 36시간 동안 106/ml 밀도로 배양한다. Wen et al. (1987) Eur. J. Immunol. (1987) 17:887. 세포를 원심분리하여 T 세포 상청액을 획득하고 -20℃에 저장한다. EL4B5 B 세포 배양물에서 인간 B 세포의 증식을 증진시키는데 있어서 T 세포 상청액의 유효성을 시험하고, 가장 효과적인 상청액들을 모아서 실험에 사용한다.
EL4B5-유도 인간 B 세포 증식에 대한 항-CD40 항체의 효과를 평가하는 경우, MOPC-141(IgG2b) 같은 모노클로날 항체가 대조군으로 첨가될 수 있다.
길항제 항-CD40 항체는 EL4B5 셀라인에 의해 자극된 B 세포 증식을, 예를 들어 적어도 75% 이상까지 억제할 수 있다(즉, 길항제 항-CD40 항체의 존재하에 관찰된 EL4B5-유도 B 세포 증식은 길항제 항-CD40 항체의 부재하에 관찰된 것의 25%를 넘지 않는다). 반대로, MOPC-141 같은 대조군 항체는 EL4B5-유도 B 세포 증식에 대해 유의한 효과를 갖지 않았다.
B 세포의 항체 생산에 대한 인간 T 세포 헬퍼 분석
길항제 항-CD40 항체는 B 세포에 의한 면역글로불린 생산의 길항제로서 기능할 수 있다. 항-CD40 항체는 T 세포 헬퍼 분석에서 활성화 T 세포에 의해 접촉-의존성 방식으로 자극된 B 세포에 의한 면역글로불린 생산을 억제하는 항체의 능력을 평가함으로써 이런 타입의 길항제 활성에 대해 시험될 수 있다. 이 방식에서, 96- 웰 조직 배양 플레이트를 항-CD3 mAb CLB-T3/3(CLB, Amsterdam, The Netherlands)의 복수액의 1:500 희석액으로 코팅한다. 나타낸 대로 공-자극 mAb를 첨가한다: 항 CD2 mAbs CLB-T11.1/1 및 CLB-T11.2/1(CLB, Amsterdam, The Netherlands), 복수 1:1000 및 항-CD28 mAb CLB-28/1(CLB, Amsterdam, The Netherlands) 모두. 이어서, 편도선 T 세포(3000 Rad 조사; 웰당 105), 편도선 B 세포(웰 당 104), 및 rIL-2 (20 U/ml)를 첨가한다. 각 세포 배양물의 최종 부피는 200㎕이다. 8일 후 세포를 회전시켜 세포-프리 상청액을 회수한다. (희석된) 샘플 중에서 인간 IgM 및 IgG의 농도는 하기 설명된 대로 ELISA에 의해 추정된다.
한 구체예에서, 인간 편도선 B 세포(104/웰)을 항-CD3 mAb로 코팅한 96-웰 플레이트에서 T 세포를 공-자극하는 상이한 mAb를 첨가하거나 첨가하지 않고 조사된 정제된 T 세포(3000 Rad, 105/웰)와 함께 배양한다. 배양 8일 후, 상청액을 수거하여 B 세포에 의한 면역글로불린 생산을 측정한다. B 세포에 의한 면역글로불린 생산은 하기 설명된 ELISA 분석에 의해 평가된다. 해당 항-CD40 항체를 배양을 시작할 때 농도를 변화시키면서 첨가한다. 대조군으로서 mAb MOPC-141가 첨가될 수 있다.
길항제 항-CD40 항체는 인간 T 세포에 의해 자극된 B 세포의 IgG 및 IgM 항체 생산을 적어도 50% 이상까지 억제할 수 있다(즉, 길항제 항-CD40 항체의 존재하에 B 세포에 의한 T 세포-유도 항체 생산은 길항제 항-CD40 항체의 부재하에 관찰된 것의 50%를 넘지 않는다). 반대로, MOPC-141 같은 대조군 항체는 B 세포에 의한 T 세포 유도 항체 생산에 대해 유의한 효과를 갖지 않았다.
면역글로불린 정량을 위한 ELISA 분석
인간 IgM 및 IgG의 농도는 ELISA에 의해 추정된다. 96-웰 ELISA 플레이트를 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션하여 0.05 M 카르보네이트 버퍼(pH = 9.6) 중의 4 ㎍/ml 마우스 항-인간 IgG mAb MH 16-01(CLB, Amsterdam, The Netherlands) 또는 1.2 ㎍/ml 마우스 항-인간 IgM mAb 4102(T ago, Burlingame, CA)로 코팅한다. 플레이트를 PBS-0.05% Tween-20(PBS-Tween)로 3회 세척하고 1시간 동안 BSA로 포화시킨다. 2회 세척 후, 플레이트를 시험 샘플의 상이한 희석물로 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 3회 세척 후, 1 ㎍/ml 퍼옥시다제-표지 마우스 항-인간 IgG mAb MH 16-01(CLB) 또는 마우스 항-인간 IgM mAb MH 15-01(CLB)와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 결합된 Ig를 검출한다. 플레이트를 4회 세척하고, 기질로서 O-페닐렌디아민을 첨가하면 결합된 퍼옥시다제 활성이 나타난다. 인간 표준 혈청(H00, CLB)을 사용하여 각 분석에 대한 표준 곡선을 확립한다.
본원에서 사용된 관사 "한"은 관사의 문법적 목적에서 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)를 말한다. 예로서, "한 요소"는 하나 이상의 효소를 의미한다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허출원은 이 발명이 속하는 분야의 당업자의 수준을 나타낸다. 모든 간행물 및 특허출원은 각각의 간행물 또는 특허출원이 참고자료로 포함되도록 구체적으로 그리고 개별적으로 나타낸 것처럼 동일한 정도로 본원에 참고자료로 포함된다.
전술한 발명은 이해를 분명히 할 목적으로 예시와 예를 들어 일부 상세히 설명되었지만, 첨부된 청구항의 범위 내에서 어떤 변화 및 변형이 실시될 수 있음이 자명할 것이다.
Figure 112008073008134-PCT00012
Figure 112008073008134-PCT00013
Figure 112008073008134-PCT00014
SEQUENCE LISTING <110> Lu, Xiaofeng Chen, Bao-Lu Araya, Kidisti Okhamafe, Augustus <120> Antagonist Anti-CD40 Antibody Pharmaceutical Compositions <130> PP028228.0002 (325023) <150> 60/794,011 <151> 2006-04-21 <160> 12 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence for light chain of 12.12 human anti-CD40 antibody <221> CDS <222> (1)...(720) <400> 1 atg gcg ctc cct gct cag ctc ctg ggg ctg cta atg ctc tgg gtc tct 48 Met Ala Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 gga tcc agt ggg gat att gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg acc 96 Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr 20 25 30 gtc acc cct gga gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tcc agt cag agc 144 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 ctc ctg tat agt aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac ctg cag aag 192 Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 cca ggg cag tct cca cag gtc ctg atc tct ttg ggt tct aat cgg gcc 240 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala 65 70 75 80 tcc ggg gtc cct gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt 288 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 aca ctg aaa atc agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac 336 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 tgc atg caa gct cga caa act cca ttc act ttc ggc cct ggg acc aaa 384 Cys Met Gln Ala Arg Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 115 120 125 gtg gat atc aga cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg 432 Val Asp Ile Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg 480 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat 528 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac 576 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 agc aag gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa 624 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag 672 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 720 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys * 225 230 235 <210> 2 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of 12.12 human anti-CD40 antibody <400> 2 Met Ala Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr 20 25 30 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Met Gln Ala Arg Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 115 120 125 Val Asp Ile Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 3 <211> 2016 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence for heavy chain of 12.12 human anti-CD40 antibody (with introns) <400> 3 atg gag ttt ggg ctg agc tgg gtt ttc ctt gtt gct att tta aga ggt 48 gtc cag tgt cag gtg cag ttg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag 96 cct ggg agg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc 144 agt agc tat ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg 192 gag tgg gtg gca gtt ata tca tat gag gaa agt aat aga tac cat gca 240 gac tcc gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag atc 288 acg ctg tat ctg caa atg aac agc ctc aga act gag gac acg gct gtg 336 tat tac tgt gcg aga gat ggg ggt ata gca gca cct ggg cct gac tac 384 tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca gca agt acc aag ggc 432 cca tcc gtc ttc ccc ctg gcg ccc gct agc aag agc acc tct ggg ggc 480 aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg 528 acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc 576 ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg 624 acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg 672 aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt ggt gag agg 720 cca gca cag gga ggg agg gtg tct gct gga agc cag gct cag cgc tcc 768 tgc ctg gac gca tcc cgg cta tgc agt ccc agt cca ggg cag caa ggc 816 agg ccc cgt ctg cct ctt cac ccg gag gcc tct gcc cgc ccc act cat 864 gct cag gga gag ggt ctt ctg gct ttt tcc cca ggc tct ggg cag gca 912 cag gct agg tgc ccc taa ccc agg ccc tgc aca caa agg ggc agg tgc 960 tgg gct cag acc tgc caa gag cca tat ccg gga gga ccc tgc ccc tga 1008 cct aag ccc acc cca aag gcc aaa ctc tcc act ccc tca gct cgg aca 1056 cct tct ctc ctc cca gat tcc agt aac tcc caa tct tct ctc tgc aga 1104 gcc caa atc ttg tga caa aac tca cac atg ccc acc gtg ccc agg taa 1152 gcc agc cca ggc ctc gcc ctc cag ctc aag gcg gga cag gtg ccc tag 1200 agt agc ctg cat cca ggg aca ggc ccc agc cgg gtg ctg aca cgt cca 1248 cct cca tct ctt cct cag cac ctg aac tcc tgg ggg gac cgt cag tct 1296 tcc tct tcc ccc caa aac cca agg aca ccc tca tga tct ccc gga ccc 1344 ctg agg tca cat gcg tgg tgg tgg acg tga gcc acg aag acc ctg agg 1392 tca agt tca act ggt acg tgg acg gcg tgg agg tgc ata atg cca aga 1440 caa agc cgc ggg agg agc agt aca aca gca cgt acc gtg tgg tca gcg 1488 tcc tca ccg tcc tgc acc agg act ggc tga atg gca agg agt aca agt 1536 gca agg tct cca aca aag ccc tcc cag ccc cca tcg aga aaa cca tct 1584 cca aag cca aag gtg gga ccc gtg ggg tgc gag ggc cac atg gac aga 1632 ggc cgg ctc ggc cca ccc tct gcc ctg aga gtg acc gct gta cca acc 1680 tct gtc cct aca ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc 1728 cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg 1776 gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat 1824 ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc 1872 gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg 1920 tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg 1968 cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 2016 <210> 4 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of 12.12 human anti-CD40 antibody <400> 4 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 210 215 220 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 245 250 255 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 290 295 300 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 325 330 335 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 340 345 350 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 370 375 380 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 385 390 395 400 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 420 425 430 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 435 440 445 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 450 455 460 Leu Ser Pro Gly Lys 465 <210> 5 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of variant of 12.12 human anti-CD40 antibody <400> 5 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 210 215 220 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 245 250 255 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 290 295 300 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 325 330 335 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 340 345 350 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 370 375 380 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 385 390 395 400 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 420 425 430 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 435 440 445 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 450 455 460 Leu Ser Pro Gly Lys 465 <210> 6 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of 5.9 human anti-CD40 antibody <400> 6 Met Ala Leu Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Ser Gly Ala Ile Val Met Thr Gln Pro Pro Leu Ser Ser Pro 20 25 30 Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg 50 55 60 Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Phe Phe Arg Arg Leu 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Met Gln Val Thr Gln Phe Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 7 <211> 474 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of 5.9 human anti-CD40 antibody <400> 7 Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly 1 5 10 15 Val Cys Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser 65 70 75 80 Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Ala Ala Gly Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr 115 120 125 Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Lys 145 150 155 160 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 165 170 175 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 185 190 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 210 215 220 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 225 230 235 240 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 245 250 255 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 260 265 270 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 275 280 285 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 290 295 300 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 305 310 315 320 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 325 330 335 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 340 345 350 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 355 360 365 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 370 375 380 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 385 390 395 400 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 405 410 415 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 420 425 430 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 435 440 445 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 450 455 460 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 8 <211> 474 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of variant of 5.9 human anti-CD40 antibody <400> 8 Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly 1 5 10 15 Val Cys Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser 65 70 75 80 Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Ala Ala Gly Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr 115 120 125 Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 145 150 155 160 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 165 170 175 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 185 190 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 210 215 220 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 225 230 235 240 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 245 250 255 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 260 265 270 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 275 280 285 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 290 295 300 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 305 310 315 320 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 325 330 335 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 340 345 350 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 355 360 365 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 370 375 380 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 385 390 395 400 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 405 410 415 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 420 425 430 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 435 440 445 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 450 455 460 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 9 <211> 612 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(612) <221> misc_feature <222> (0)...(0) <223> Coding sequence for short isoform of human CD40 <400> 9 atg gtt cgt ctg cct ctg cag tgc gtc ctc tgg ggc tgc ttg ctg acc 48 Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15 gct gtc cat cca gaa cca ccc act gca tgc aga gaa aaa cag tac cta 96 Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu 20 25 30 ata aac agt cag tgc tgt tct ttg tgc cag cca gga cag aaa ctg gtg 144 Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val 35 40 45 agt gac tgc aca gag ttc act gaa acg gaa tgc ctt cct tgc ggt gaa 192 Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 50 55 60 agc gaa ttc cta gac acc tgg aac aga gag aca cac tgc cac cag cac 240 Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His 65 70 75 80 aaa tac tgc gac ccc aac cta ggg ctt cgg gtc cag cag aag ggc acc 288 Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr 85 90 95 tca gaa aca gac acc atc tgc acc tgt gaa gaa ggc tgg cac tgt acg 336 Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr 100 105 110 agt gag gcc tgt gag agc tgt gtc ctg cac cgc tca tgc tcg ccc ggc 384 Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly 115 120 125 ttt ggg gtc aag cag att gct aca ggg gtt tct gat acc atc tgc gag 432 Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu 130 135 140 ccc tgc cca gtc ggc ttc ttc tcc aat gtg tca tct gct ttc gaa aaa 480 Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys 145 150 155 160 tgt cac cct tgg aca agg tcc cca gga tcg gct gag agc cct ggt ggt 528 Cys His Pro Trp Thr Arg Ser Pro Gly Ser Ala Glu Ser Pro Gly Gly 165 170 175 gat ccc cat cat ctt cgg gat cct gtt tgc cat cct ctt ggt gct ggt 576 Asp Pro His His Leu Arg Asp Pro Val Cys His Pro Leu Gly Ala Gly 180 185 190 ctt tat caa aaa ggt ggc caa gaa gcc aac caa taa 612 Leu Tyr Gln Lys Gly Gly Gln Glu Ala Asn Gln * 195 200 <210> 10 <211> 203 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu 20 25 30 Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val 35 40 45 Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 50 55 60 Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His 65 70 75 80 Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr 85 90 95 Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr 100 105 110 Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly 115 120 125 Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu 130 135 140 Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys 145 150 155 160 Cys His Pro Trp Thr Arg Ser Pro Gly Ser Ala Glu Ser Pro Gly Gly 165 170 175 Asp Pro His His Leu Arg Asp Pro Val Cys His Pro Leu Gly Ala Gly 180 185 190 Leu Tyr Gln Lys Gly Gly Gln Glu Ala Asn Gln 195 200 <210> 11 <211> 834 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(834) <221> misc_feature <222> (0)...(0) <223> Coding sequence for long isoform of human CD40 <400> 11 atg gtt cgt ctg cct ctg cag tgc gtc ctc tgg ggc tgc ttg ctg acc 48 Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15 gct gtc cat cca gaa cca ccc act gca tgc aga gaa aaa cag tac cta 96 Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu 20 25 30 ata aac agt cag tgc tgt tct ttg tgc cag cca gga cag aaa ctg gtg 144 Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val 35 40 45 agt gac tgc aca gag ttc act gaa acg gaa tgc ctt cct tgc ggt gaa 192 Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 50 55 60 agc gaa ttc cta gac acc tgg aac aga gag aca cac tgc cac cag cac 240 Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His 65 70 75 80 aaa tac tgc gac ccc aac cta ggg ctt cgg gtc cag cag aag ggc acc 288 Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr 85 90 95 tca gaa aca gac acc atc tgc acc tgt gaa gaa ggc tgg cac tgt acg 336 Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr 100 105 110 agt gag gcc tgt gag agc tgt gtc ctg cac cgc tca tgc tcg ccc ggc 384 Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly 115 120 125 ttt ggg gtc aag cag att gct aca ggg gtt tct gat acc atc tgc gag 432 Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu 130 135 140 ccc tgc cca gtc ggc ttc ttc tcc aat gtg tca tct gct ttc gaa aaa 480 Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys 145 150 155 160 tgt cac cct tgg aca agc tgt gag acc aaa gac ctg gtt gtg caa cag 528 Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln 165 170 175 gca ggc aca aac aag act gat gtt gtc tgt ggt ccc cag gat cgg ctg 576 Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu 180 185 190 aga gcc ctg gtg gtg atc ccc atc atc ttc ggg atc ctg ttt gcc atc 624 Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile 195 200 205 ctc ttg gtg ctg gtc ttt atc aaa aag gtg gcc aag aag cca acc aat 672 Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn 210 215 220 aag gcc ccc cac ccc aag cag gaa ccc cag gag atc aat ttt ccc gac 720 Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp 225 230 235 240 gat ctt cct ggc tcc aac act gct gct cca gtg cag gag act tta cat 768 Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His 245 250 255 gga tgc caa ccg gtc acc cag gag gat ggc aaa gag agt cgc atc tca 816 Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser 260 265 270 gtg cag gag aga cag tga 834 Val Gln Glu Arg Gln * 275 <210> 12 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu 20 25 30 Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val 35 40 45 Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 50 55 60 Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His 65 70 75 80 Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr 85 90 95 Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr 100 105 110 Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly 115 120 125 Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu 130 135 140 Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys 145 150 155 160 Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln 165 170 175 Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu 180 185 190 Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile 195 200 205 Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn 210 215 220 Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp 225 230 235 240 Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His 245 250 255 Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser 260 265 270 Val Gln Glu Arg Gln 275

Claims (62)

  1. a) 인간 B 세포 표면에서 발현되는 인간 CD40 항원에 특이적으로 결합할 수 있으며, 상기 B 세포 표면에서 발현되는 CD40 항원에 결합되었을 때 유의한 작동제 활성을 나타내지 않는, 치료적 또는 예방적 활성 성분인 길항제 항-CD40 모노클로날 항체;
    b) 조성물을 거의 등장성으로 만들기에 충분한 양의 산성 형태 아르기닌(아르기닌-HCl); 및
    c) 조성물의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0의 범위로 유지할 수 있는 시트레이트/시트르산 버퍼인 완충제
    를 포함하는 안정한 액체 제약 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 약 240 mmol/kg 내지 약 360 mmol/kg의 삼투농도를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 완충제의 농도는 약 5 mM 내지 약 100 mM인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 완충제의 농도는 약 5 mM 내지 약 20 mM인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 완충제의 농도는 약 10 mM인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충제는 나트륨시트레이트/시트르산 버퍼인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 조성물은 약 pH 5.5를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 약 50 mM 내지 약 200 mM의 농도로 아르기닌-HCl을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 조성물은 약 100 mM 내지 약 175 mM의 농도로 아르기닌-HCl을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 조성물은 약 150 mM의 농도로 아르기닌-HCl을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 완충제의 농도는 약 5 mM 내지 약 20 mM인 것을 특 징으로 하는 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 완충제는 나트륨시트레이트/시트르산 버퍼이고, 상기 완충제의 농도는 약 10 mM이며, 상기 조성물은 약 pH 5.5를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 조성물은 약 150 mM의 농도로 아르기닌-HCl을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 1 항에 있어서, 계면활성제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트 20인 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 계면활성제는 약 0.001% 내지 약 1.0% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 20인 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.025% 내지 약 0.1% (w/v)의 농도로 폴리소르베이트 20을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제 1 항 또는 제 14 항에 있어서, 상기 조성물의 저장 동안 상기 항-CD40 모노클로날 항체 중의 적어도 하나의 산화성 아미노산 잔기의 산화를 억제하기에 충분한 양으로 메티오닌을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.5 mM 내지 약 20.0 mM의 농도로 메티오닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 조성물은 약 1.0 mM 내지 약 20.0 mM의 농도로 메티오닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 조성물은 약 5.0 mM의 농도로 메티오닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 길항제 항-CD40 모노클로날 항체가
    a) 모노클로날 항체 CHIR-5.9 또는 CHIR- 12.12;
    b) 하이브리도마 셀라인 5.9 또는 12.12에 의해 생산되는 모노클로날 항체;
    c) SEQ ID NO:6에 나타낸 서열, SEQ ID NO:7에 나타낸 서열, SEQ ID NO:8에 나타낸 서열, SEQ ID NO:6과 SEQ ID NO:7에 나타낸 두 서열, 및 SEQ ID NO:6과 SEQ ID NO:8에 나타낸 두 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하 는 모노클로날 항체;
    d) SEQ ID NO:2에 나타낸 서열, SEQ ID NO:4에 나타낸 서열, SEQ ID NO:5에 나타낸 서열, SEQ ID NO:2와 SEQ ID NO:4에 나타낸 두 서열, 및 SEQ ID NO:2와 SEQ ID NO:5에 나타낸 두 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 모노클로날 항체;
    e) SEQ ID NO:1에 나타낸 서열, SEQ ID NO:3에 나타낸 서열, 및 SEQ ID NO:1과 SEQ ID NO:3에 나타낸 두 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 모노클로날 항체;
    f) 하이브리도마 셀라인 5.9 또는 12.12에 의해 생산되는 모노클로날 항체와 결합할 수 있는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체;
    g) SEQ ID NO:10 또는 SEQ ID NO:12에 나타낸 인간 CD40 서열의 잔기 82-87을 포함하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체;
    h) SEQ ID NO:10 또는 SEQ ID NO:12에 나타낸 인간 CD40 서열의 잔기 82-89를 포함하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체;
    i) 경합 결합 분석에서 모노클로날 항체 CHIR-5.9 또는 CHIR-12.12와 경합하는 모노클로날 항체;
    j) 재조합에 의해 생산된, 선행 항목 a)의 모노클로날 항체 또는 선행 항목 c) - i) 중 어느 하나의 모노클로날 항체; 및
    k) 인간 CD40 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는, 선행 항목 a) - j) 중 어느 하나의 모노클로날 항체의 항원-결합 단편인 모노클로날 항체
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 단편이 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 및 단쇄 Fv 단편으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 길항제 항-CD40 모노클로날 항체가 상기 조성물 중에 약 0.1 mg/ml 내지 약 50.0 mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 길항제 항-CD40 모노클로날 항체가 상기 조성물 중에 약 1.0 mg/ml 내지 약 35.0 mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 길항제 항-CD40 모노클로날 항체가 상기 조성물 중에 약 10.0 mg/ml 내지 약 35.0 mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물이 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 적어도 18개월의 기간 동안 안정한 것을 특징으로 하는 조성물.
  28. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물이 약 25℃에서 적어도 3개월의 기간 동안 안정한 것을 특징으로 하는 조성물.
  29. 치료적 또는 예방적 활성 성분인 길항제 항-CD40 모노클로날 항체, 약 50 mM 내지 약 200 mM 농도의 산성 형태 아르기닌(아르기닌-HCl), 및 조성물의 pH를 pH 5.0 내지 약 pH 7.0의 범위로 유지하기 위한 완충제를 포함하는 안정한 액체 제약 조성물로서, 상기 완충제는 약 5 mM 내지 약 20 mM 농도의 나트륨시트레이트/시트르산 버퍼이고, 상기 길항제 항-CD40 모노클로날 항체는
    a) 모노클로날 항체 CHIR-5.9 또는 CHIR- 12.12;
    b) 하이브리도마 셀라인 5.9 또는 12.12에 의해 생산되는 모노클로날 항체;
    c) SEQ ID NO:6에 나타낸 서열, SEQ ID NO:7에 나타낸 서열, SEQ ID NO:8에 나타낸 서열, SEQ ID NO:6과 SEQ ID NO:7에 나타낸 두 서열, 및 SEQ ID NO:6과 SEQ ID NO:8에 나타낸 두 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 모노클로날 항체;
    d) SEQ ID NO:2에 나타낸 서열, SEQ ID NO:4에 나타낸 서열, SEQ ID NO:5에 나타낸 서열, SEQ ID NO:2와 SEQ ID NO:4에 나타낸 두 서열, 및 SEQ ID NO:2와 SEQ ID NO:5에 나타낸 두 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 모노클로날 항체;
    e) SEQ ID NO:1에 나타낸 서열, SEQ ID NO:3에 나타낸 서열, 및 SEQ ID NO:1 과 SEQ ID NO:3에 나타낸 두 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 모노클로날 항체;
    f) 하이브리도마 셀라인 5.9 또는 12.12에 의해 생산되는 모노클로날 항체와 결합할 수 있는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체;
    g) SEQ ID NO:10 또는 SEQ ID NO:12에 나타낸 인간 CD40 서열의 잔기 82-87을 포함하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체;
    h) SEQ ID NO:10 또는 SEQ ID NO:12에 나타낸 인간 CD40 서열의 잔기 82-89를 포함하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체;
    i) 경합 결합 분석에서 모노클로날 항체 CHIR-5.9 또는 CHIR-12.12와 경합하는 모노클로날 항체;
    j) 재조합에 의해 생산된, 선행 항목 a)의 모노클로날 항체 또는 선행 항목 c) - i) 중 어느 하나의 모노클로날 항체; 및
    k) 인간 CD40 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는, 선행 항목 a) - j) 중 어느 하나의 모노클로날 항체의 항원-결합 단편인 모노클로날 항체
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 및 단쇄 Fv 단편으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  31. 제 29 항에 있어서, 상기 조성물은 약 150 mM의 농도로 아르기닌-HCl을 포함하고, 완충제는 약 5 mM 내지 약 20 mM 농도의 나트륨시트레이트/시트르산이며, 상기 조성물은 약 5.0 내지 약 6.0의 pH와 약 250 mmol/kg 내지 약 330 mmol/kg의 삼투농도를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  32. 제 29 항에 있어서, 상기 조성물은 메티오닌, 폴리소르베이트 20, 또는 메티오닌과 폴리소르베이트 20 모두를 더 포함하며, 상기 메티오닌은 존재할 경우 상기 조성물 중에 약 0.5 mM 내지 약 20.0 mM의 농도로 존재하고, 상기 폴리소르베이트 20은 존재할 경우 상기 조성물 중에 약 0.025% 내지 약 0.1% (w/v)의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  33. 제 29 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 길항제 항-CD40 모노클로날 항체가 상기 조성물 중에 약 10.0 mg/ml 내지 약 35.0 mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 길항제 항-CD40 모노클로날 항체는 모노클로날 항체 CHIR-5.9 또는 CHIR-12.12인 것을 특징으로 하는 조성물.
  35. 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물의 제약학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, CD40-발현 세포와 관련된 암 또는 전-암성 상태를 가진 피험자의 치료 방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 암은 신생물성 B 세포 성장을 특징으로 하는 암인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 암은 비호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종, B 세포 림프종, 고등급 B 세포 림프종, 중간등급 B 세포 림프종, 저등급 B 세포 림프종, B 세포 급성 림프모구성 백혈병, 호지킨병, 형질세포종, 여포성 림프종, 여포성 소 분할 림프종, 여포성 거대세포 림프종, 여포성 혼성 소 분할 림프종, 확산성 소 분할세포 림프종, 확산성 소 림프구성 림프종, 전림프구성 백혈병, 림프형질세포양 림프종, 변연부 림프종, 점막 관련 림프양 조직 림프종, 단핵구양 B 세포 림프종, 비장세포 림프종, 유모세포 백혈병, 확산성 거대세포 림프종, 종격동 B 세포 림프종, 림프종 모양 육아종증, 혈관내 림프종증, 확산성 혼성 세포 림프종, 확산성 거대세포 림프종, 면역모구성 림프종, 버킷 림프종, AIDS-관련 림프종, 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증, 맨틀세포 림프종, 및 중쇄 질환으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 35 항에 있어서, 상기 암은 비-B 세포 혈액성 악성질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 상기 악성질환은 급성 백혈병, 골수모구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 골수단핵구성 백혈병, 단핵구성 백혈병, 적백혈병, 만성 골수구성 백혈병, 및 진성적혈구 증가증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 35 항에 있어서, 상기 암은 CD40 항원을 발현하는 신생물성 세포를 포함하는 고상 종양인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 고상 종양은 폐 암종, 유방 암종, 난소 암종, 피부 암종, 결장 암종, 방광 암종, 간 암종, 위 암종, 전립선암, 신장세포 암종, 비인두 암종, 편평세포 암종, 갑상선 유두상 암종, 경부 암종, 및 육종으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 35 항에 있어서, 상기 전-암성 상태는 의미불명 단클론감마병증(MGUS)인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, CD40-발현 세포와 관련된 염증 질환 또는 자가면역 질환을 가진 피험자의 치료 방법.
  44. 제 43 항에 있어서, 상기 염증 질환 또는 자가면역 질환은 전신 홍반성 루프스(SLE), 원반모양 루프스, 루프스 신염, 사르코이드증, 소아 관절염, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 라이터 증후군, 강직성 척추염, 통풍성 관절염, 기관 또는 조직 이식 거부, 이식편 대 숙주 질환, 다발성 경화증, 고 IgE 증후군, 결절성 다발동맥염, 원발성 담즙성 간경변증, 염증성 장 질환, 크론병, 셀리악병(글루텐-과민성 장질환), 자가면역 간염, 악성 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈, 건선, 피부경화증, 중증 근무력증, 자가면역 혈소판감소성 자반증, 자가면역 갑상선염, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 면역복합질환, 만성피로 면역 기능부전 증후군(CFIDS), 다발근염 및 피부근염, 한랭글로불린혈증, 혈전용해, 심근병증, 심상성 천포창, 간질성 폐 섬유증, I형 및 II형 당뇨병, 1, 2, 3, 및 4 타입 지연형 과민반응, 알러지 또는 알러지성 장애, 천식, 척-스트라우스 증후군(알러지성 육아종증), 아토피 피부염, 알러지성 및 자극 접촉성 피부염, 두드러기, IgE-매개 알레르기, 죽상경화증, 혈관염, 비정형성 염증 근육병증, 용혈병, 알츠하이머병, 및 만성 염증성 탈수초 다발성 신경병증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 항-CD40 모노클로날 항체, 조성물을 거의 등장성으로 만들기에 충분한 양의 아르기닌-HCl, 및 조성물의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0으로 유지하기 위한 시트레이트/시트르산 버퍼인 완충제를 조합함으로써 조성물을 제제화하는 단계를 포함하는, 액체 제약 조성물 중에서 항-CD40 모노클로날 항체의 안정성을 증가시키는 방법.
  46. 항-CD40 모노클로날 항체, 조성물을 거의 등장성으로 만들기에 충분한 양의 산성 형태 아르기닌(아르기닌-HCl), 및 조성물의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0로 유지하기 위한 시트레이트/시트르산 버퍼인 완충제를 조합함으로써 조성물을 제제화하는 단계를 포함하는, 항-CD40 모노클로날 항체를 포함하는 액체 제약 조성물의 제조 방법.
  47. 제 45 항 또는 제 46 항에 있어서, 상기 조성물은 약 240 mmol/kg 내지 약 360 mmol/kg의 삼투농도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 45 항 또는 제 46 항에 있어서, 상기 완충제의 농도는 약 5 mM 내지 약 100 mM이고, 약 50 mM 내지 약 200 mM의 아르기닌-HCl을 상기 항-CD40 모노클로날 항체 및 상기 완충제와 조합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 48 항에 있어서, 상기 완충제의 농도는 약 5 mM 내지 약 20 mM이고, 약 100 mM 내지 약 175 mM의 아르기닌-HCl을 상기 항-CD40 모노클로날 항체 및 상기 완충제와 조합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 49 항에 있어서, 상기 완충제의 농도는 약 10 mM이고, 약 150 mM의 아르기닌-HCl을 상기 항-CD40 모노클로날 항체 및 상기 완충제와 조합하는 것을 특징으 로 하는 방법.
  51. 제 45 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충제는 나트륨시트레이트/시트르산 버퍼인 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 51 항에 있어서, 상기 조성물은 약 pH 5.5를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 45 항 또는 제 46 항에 있어서, 상기 조성물은 메티오닌, 폴리소르베이트 20, 또는 메티오닌과 폴리소르베이트 20 모두를 더 포함하도록 제제화되며, 상기 메티오닌은 존재할 경우 상기 조성물 중에 약 0.5 mM 내지 약 20.0 mM의 농도로 존재하고, 상기 폴리소르베이트 20은 존재할 경우 상기 조성물 중에 약 0.025% 내지 약 0.1% (w/v)의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 45 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 길항제 항-CD40 모노클로날 항체는
    a) 모노클로날 항체 CHIR-5.9 또는 CHIR- 12.12;
    b) 하이브리도마 셀라인 5.9 또는 12.12에 의해 생산되는 모노클로날 항체;
    c) SEQ ID NO:6에 나타낸 서열, SEQ ID NO:7에 나타낸 서열, SEQ ID NO:8에 나타낸 서열, SEQ ID NO:6과 SEQ ID NO:7에 나타낸 두 서열, 및 SEQ ID NO:6과 SEQ ID NO:8에 나타낸 두 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 모노클로날 항체;
    d) SEQ ID NO:2에 나타낸 서열, SEQ ID NO:4에 나타낸 서열, SEQ ID NO:5에 나타낸 서열, SEQ ID NO:2와 SEQ ID NO:4에 나타낸 두 서열, 및 SEQ ID NO:2와 SEQ ID NO:5에 나타낸 두 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 모노클로날 항체;
    e) SEQ ID NO:1에 나타낸 서열, SEQ ID NO:3에 나타낸 서열, 및 SEQ ID NO:1과 SEQ ID NO:3에 나타낸 두 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 모노클로날 항체;
    f) 하이브리도마 셀라인 5.9 또는 12.12에 의해 생산되는 모노클로날 항체와 결합할 수 있는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체;
    g) SEQ ID NO:10 또는 SEQ ID NO:12에 나타낸 인간 CD40 서열의 잔기 82-87을 포함하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체;
    h) SEQ ID NO:10 또는 SEQ ID NO:12에 나타낸 인간 CD40 서열의 잔기 82-89를 포함하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체;
    i) 경합 결합 분석에서 모노클로날 항체 CHIR-5.9 또는 CHIR-12.12와 경합하는 모노클로날 항체;
    j) 재조합에 의해 생산된, 선행 항목 a)의 모노클로날 항체 또는 선행 항목 c) - i) 중 어느 하나의 모노클로날 항체; 및
    k) 인간 CD40 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는, 선행 항목 a) - j) 중 어느 하나의 모노클로날 항체의 항원-결합 단편인 모노클로날 항체
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 54 항에 있어서, 상기 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 및 단쇄 Fv 단편으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 45 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 길항제 항-CD40 모노클로날 항체가 상기 조성물 중에 약 0.1 mg/ml 내지 약 50.0 mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 56 항에 있어서, 상기 길항제 항-CD40 모노클로날 항체가 상기 조성물 중에 약 10.0 mg/ml 내지 약 35.0 mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 치료적 또는 예방적 활성 성분인 모노클로날 항체 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9 또는 그것의 항원-결합 단편, 약 50 mM 내지 약 200 mM 농도의 산성 형태 아르기닌(아르기닌-HCl), 및 조성물의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0의 범위로 유지하기 위한 완충제를 포함하는 안정한 액체 제약 조성물로서, 상기 완충제가 약 5 mM 내지 약 20 mM 농도의 나트륨 시트레이트/시트르산 버퍼인 것을 특징으로 하는 조성 물.
  59. 제 58 항에 따른 제약 조성물의 제약학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, CD40-발현 세포와 관련된 암 또는 전-암성 상태를 가진 피험자의 치료 방법.
  60. 제 58 항에 따른 제약 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, CD40-발현 세포와 관련된 염증 질환 또는 자가면역 질환을 가진 피험자의 치료 방법.
  61. 액체 제약 조성물 중에서 모노클로날 항체 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9, 또는 그것의 항원-결합 단편의 안정성을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 상기 모노클로날 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 약 50 mM 내지 약 200 mM 산성 형태 아르기닌(아르기닌-HCl) 및 상기 조성물의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0으로 유지하기 위한 완충제와 조합함으로써 상기 조성물을 제제화하는 단계를 포함하며, 상기 완충제가 약 5 mM 내지 약 20 mM 농도의 나트륨시트레이트/시트르산 버퍼인 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 모노클로날 항체 CHIR-12.12 또는 CHIR-5.9, 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하는 액체 제약 조성물의 제조 방법으로서, 상기 방법은 상기 모노클로날 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 약 50 mM 내지 약 200 mM 산성 형태 아르기닌(아르 기닌-HCl) 및 상기 조성물의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0으로 유지하기 위한 완충제를 조합함으로써 상기 조성물을 제제화하는 단계를 포함하며, 상기 완충제가 약 5 mM 내지 약 20 mM 농도의 나트륨시트레이트/시트르산 버퍼인 것을 특징으로 하는 방법.
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