KR20080090389A - 오8이에 대한 인간 모노클로날 항체 - Google Patents

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Abstract

본 개시사항은 분리된 모노클로날 항체에 관한 것으로, 특히 O8E에 높은 친화도로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 제공한다. 본 개시사항의 항체를 코드하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포 및 본 개시사항의 항체를 발현하는 방법도 또한 제공된다. 본 개시사항의 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트, 비스페시픽 분자 및 약학적 조성물도 또한 제공된다. 또한 본 개시사항은 암을 치료하는 방법을 제공한다.
항체, 인간 모노클로날, 항-O8E 항체, 면역컨쥬게이트

Description

오8이에 대한 인간 모노클로날 항체{HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO O8E}
관련 출원에 대한 크로스 -레퍼런스( Cross - Reference to Related Applications )
본 출원은 여기에서 레퍼런스로 편입되어진, 2005년 12월 8일자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/748,914호 및 2006년 9월 5일자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/824,593호 양자를 우선권으로 주장한다.
본 발명의 개시사항은 일반적으로 면역학 및 분자 생물학의 분야에 관한 것이다. 더욱 자세하게는, 여기에서 제공되어 지는 것은 인간 항-O8E 모노클로날 항체, 인간 항-O8E 모노클로날 항체를 코드하는 핵산, 인간 항-O8E 모노클로날 항체를 제조하는 방법 및 O8E를 발현하는 세포의 성장으로 특징되어 지는 암과 같은 질병을 치료하는 방법이다.
유방암 및 난소암은 각각 미국에서 여성의 암 사망의 두 번째 및 네 번째로 손꼽히는 원인이다(American Cancer Society(2005) Cancer facts and figures). 아메리칸 캔서 소사이어티는 미국에서, 2005년에 대략 40,000 여성이 유방암으로 죽 고, 그리고 약 16,000명이 난소암으로 죽을 것이라고 예측했다. 표층 상피성 종양은 장액성 종양, 점액성 종양, 자궁내막 종양, 및 투명세포암종을 포함하는 모든 난소 악성 종양의 80% 이상으로 고려된다(Seidman et al. "Blaustein' s Pathology of the Female Genital Tract" 791-4 (Kurman, editor, 5th ed. New York, Springer- Verlag, 2002). 난소암은 주로 전이성 질병이 지엽적이고 멀리 떨어진 위치로 전이되는 진행단계에 있다(Pettersson, (1994) Int . Fed . OfGyn . and Obstetrics, Vol. 22; 및 Heintz et al (2001) J. Epidermiol . Biostat. 6: 107-38). 따라서, 진행성 유방암의 생존가능한 여생이 난소암에 대해서 보다는 유의적으로 높은 반면, 유방암 환자의 5년 생존율도 실질적으로 난소암 환자에 비하여 양호하다.
B7-유사 분자는 이뮤노그로불린(Ig) 슈퍼패밀리에 속한다. B7-유사 분자의 세포 외의 부분은 단일 IgV 및 IgC 영역을 포함하고 ~20%-40%의 아미노산 동일성을 공유한다. B7-유사 분자는 항원-특이적 면역 반응의 조절과 미세한 조율에 결정적인 역할을 한다. B7H4, B7x 및 B7S1으로 또한 알려진 O8E는 B7 과(科)의 하나로 T 세포 반응의 자극적 및 저해적 조절 양자에서 역할을 하는 것으로 생각되고 있다 (Carreno et al, (2002) Ann . Rev . Immunol. 20:29-53 및 Khoury et al, (2004) Immunity 20:529-538). 인간 O8E은 크로모좀 1 상에 지도로 그려지고 66 kb에 달하는 여섯 개의 엑손과 다섯 개의 인트론으로 구성되어, 엑손 6은 두 개의 다른 트랜스크립트를 발생하기 위한 대안적인 스플라이싱으로 사용된다 (Choi et al. (2003) J. Immunol. 171:4650-4654).
O8E는 차례로 세포주기 차단을 유도하고 분비를 저해하는, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 시토킨 생성 및 세포독성의 전개인, 시토킨류의 T 세포 상 리셉터에 결합함에 의해 그 생리학적인 기능을 발휘한다 (Prasad et al. (2003) Immunity 18:863-873; Sica et al. (2003) Immunity 18:849-861; Wang et al (2004) Microbes Infect. 6:759-66; 및 Zang et al. (2003) Proc . Natl . Acad . ScI U.S.A. 100:10388-10392). O8E가 면역 반응의 희석자일 것이고 그리고 항원-특이적 면역 반응 및 항-종양 반응의 다운-레귤레이션에서 역할을 할 것이라는 것이 제안되었다 (Zang et al. (2003) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 100:10388-10392; Prasad et al (2003) Immunity 18:863-873; Sica et al. (2003) Immunity 18:849-861; Choi et al (2003) J. Immunol. 121:4650-4654; 및 Carreno et al. (2003) Trends Immunol. 24:524-7).
그러나 단백질 발현을 하지 않는 O8E mRNA는 간, 골격근, 신장, 췌장 및 소장을 포함하는 광범위한 영역의 정상적인 체세포 조직에서 검출되어 진다 (Sica et al. (2003) Immunity 18:849-61 및 Choi et al. (2003) J. Immunol . 121:4650-4). O8E는 T 세포, B 세포 모노사이트 및 수지상 세포의 자극에 의해 유도될 수 있지만, 그러나 면역 조직 화학 분석은 약간의 난소 및 폐암(Id.)에서 양성 염색반응을 제외하고는 몇몇 말단조직에서 거의 발현이 없다는 것을 밝혔다. 부가하여, O8E는 종양의 등급 및 단계에 의존하지 않고 일차 및 전이성 유방암에서 지속적으로 과발현되어, 이 단백질이 유방암 생물학에서 결정적인 역할을 하는 것으로 제시된다 (Tringler et al. (2005) Clinical Cancer Res. 11: 1842-48). 또한, U.S. 특허번 호 6,962,980; 6,699,664; 6,468,546; 6,488,931; 6,670,463; 및 6,528,253 참조, 이들의 각각은 그 전체로 여기에 레퍼런스로 편입된다.
방사선 치료법, 세포독성적 항종양 제제로 종래의 화학적 치료법, 호르몬 치료법(아로마타제 저해제, 황체형성-호르몬 방출-호르몬 유사화합물), 비스포스포네이트 및 단일-형질전환 저해제를 포함하는 아주 다양한 치료적 양식들이 진행성 유방암 및 난소암의 치료로 이용될 수 있다 (Smith (2002) Lancet, 360:790-2). 그러나, 불행하게도 많은 환자가 이들 치료적 양식들에 극히 빈약하게 반응하거나 또는 전혀 반응하지 않는다. 따라서, 유방암 및 난소암에 대한 새로운 분자 마커와 치료적 제제를 찾는 것이 요구되고 있다. 따라서, O8E는 O8E 발현에 의해 특징되는 유방암 및 난소암을 포함하는 암과 다른 다양한 질병의 치료를 위한 가치있는 타겟이다.
본 개시사항은 O8E (a/k/a B7H4, B7S1 및 B7x)에 결합하고 그리고 수많은 바람직한 특성을 나타내는 분리된 모노클로날 항체, 특히 인간 시퀀스 모노클로날 항체를 제공한다. 이들 특성은 인간 O8E에 결합하는 높은 친화성을 포함한다. 또한 본 개시사항의 항체 및 조성물을 사용하여 다양한 O8E 매개 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
일 측면에 있어서, 본 발명의 상세한 설명은 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위에 관한 것으로, 여기서 항체는 (a) 인간 O8E에 1x10-7 M 또는 그 이하의 KD로 결합하고; 그리고 (b) 08E로 형질전환된 인간 CHO 세포에 결합한다.
어떤 실시형태에서, 항체는 세포 라인 SKBR3 (ATCC 기탁번호 HTB-30)과 같은 유방세포 암종 종양 세포라인에 결합한다.
비록 대안적인 실시형태로 항체로 뮤어라인 항체, 키메르 항체 또는 인체적응된 항체일 수도 있지만, 전형적으로 항체는 인간 항체이다.
일 실시형태에서, 항체는 인간 O8E에 5x10-8 M 또는 그 이하의 KD로 결합하고, 인간 O8E에 2x10-8 M 또는 그 이하의 KD로 결합하고, 인간 O8E에 1x10-8 M 또는 그 이하의 KD로 결합하고, 인간 O8E에 5x10-9 M 또는 그 이하의 KD로 결합하고, 인간 O8E에 4x10-9 M 또는 그 이하의 KD로 결합하고, 인간 O8E에 3x10-9 M 또는 그 이하의 KD로 결합하고, 또는 인간 O8E에 2x10-9 M 또는 그 이하의 KD로 결합한다.
다른 실시형태에서, 항체는 SKBR3 유방세포 암종 종양 세포 상에 발현된 O8E에 결합 후 이들 세포에 의해 내면화되어 진다.
다른 실시형태에서, 본 개시 사항은 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공하고, 여기서 항체는 레퍼런스 항체와 O8E에 결합에 대해 교차 경쟁하며, 여기서 레퍼런스 항체는 (a) 인간 O8E에 1x10-7 M 또는 그 이하의 KD로 결합하고; 그리고 (b) 08E로 형질전환된 인간 CHO 세포에 결합한다.
다양한 실시형태에 있어서, 레퍼런스 항체는 (a) SEQ ID NO: 1의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 (b) SEQ ID NO: 6의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함하거나; 또는 (a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 (b) SEQ ID NO: 7의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함하거나; 또는 (a) SEQ ID NO: 3의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 (b) SEQ ID NO: 8의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함하거나; 또는 (a) SEQ ID NO: 4의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 (b) SEQ ID NO: 9의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함하거나; 또는 (a) SEQ ID NO: 5의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 (b) SEQ ID NO: 10의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함한다.
일 측면에 있어서, 본 개시사항은 인간 VH 4-34 유전자(여기서 SEQ ID NO: 51로 표시되는 단백질 산물)의 산물 또는 이로부터 유래된 중사슬 가변영역을 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분에 관한 것이고, 여기서 항체는 O8E에 특이적으로 결합한다. 이 개시사항은 또한 인간 VH 3-53 유전자(여기서 SEQ ID NO: 52로 표시되는 단백질 산물)의 산물 또는 이로부터 유래된 중사슬 가변영역을 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공하고, 여기서 항체는 O8E에 특이적으로 결합한다. 이 개시사항은 또한 인간 VH 3-9/D3-10/JH6b 유전자(여기서 SEQ ID NO: 53으로 표시되는 단백질 산물)의 산물 또는 이로부터 유래된 중사슬 가변영역을 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공하고, 여기서 항체는 O8E에 특이적으로 결합한다. 이 개시사항은 더욱이 인간 VK A27 유전자(여기서 SEQ ID NO: 54로 표시되는 단백질 산물)의 산물 또는 이로부터 유래된 경사슬 가변영역을 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공하고, 여기서 항체는 O8E에 특이적으로 결합한다. 이 개시사항은 또한 인간 VK L6/JK1 유전자(여기서 SEQ ID NO: 55로 표시되는 단백질 산물)의 산물 또는 이로부터 유래된 경사슬 가변영역을 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공하고, 여기서 항체는 O8E에 특이적으로 결합한다.
다른 측면에서는, 본 개시사항은 (a) 인간 VH 4-34, 3-53 또는 3-9 유전자의 중사슬 가변영역 및 (b) 인간 VK A27 또는 VK L6의 경사슬 가변영역을 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공하고, 여기서 항체는 O8E에 특이적으로 결합한다.
관련 실시형태에서는, 항체는 인간 VH 4-34 유전자의 중사슬 가변영역 및 인간 VK A27 유전자의 경사슬 가변영역을 포함한다. 다른 관련 실시형태에서는, 항체는 인간 VH 3-53 유전자의 중사슬 가변영역 및 인간 VK A27 유전자의 경사슬 가변영역을 포함한다. 또 다른 관련 실시형태에서는, 항체는 인간 VH 3-9 유전자의 중사슬 가변영역 및 인간 VK L6 유전자의 경사슬 가변영역을 포함한다. 또 다른 관련 실시형태에서는, 본 개시사항은 CDRl, CDR2 및 CDR3시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역 및 CDRl, CDR2 및 CDR3시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공하고, 여기서, (a) 중사슬 가변영역 CDR3 시퀀스는 SEQ ID NOs: 21, 22, 23, 24 및 25의 아미노산 시퀀스 및 이들의 보존적 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하고; (b) 경사슬 가변영역 CDR3 시퀀스는 SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39 및 40의 아미노산 시퀀스 및 이들의 보존적 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하고; (c) 항체는 인간 O8E에 1x10-7 M 또는 그 이하의 KD로 결합하고; (d) 08E로 형질전환된 인간 CHO 세포에 결합한다.
전형적으로, 중사슬 가변영역 CDR2 시퀀스는 SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 19 및 20의 아미노산 시퀀스 및 이들의 보존적 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하고; 그리고 경사슬 가변영역 CDR2 시퀀스는 SEQ ID NOs: 31, 32, 33, 34 및 35의 아미노산 시퀀스 및 이들의 보존적 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함한다. 전형적으로, 중사슬 가변영역 CDR1 시퀀스는 SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14 및 15의 아미노산 시퀀스 및 이들의 보존적 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하고; 그리고 경사슬 가변영역 CDR1 시퀀스는 SEQ ID NOs: 26, 27, 28, 29 및 30의 아미노산 시퀀스 및 이들의 보존적 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함한다.
특정한 조합은 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:11을 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl;
(b) SEQ ID NO:16을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2;
(c) SEQ ID NO:21을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3;
(d) SEQ ID NO:26을 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl;
(e) SEQ ID NO:31을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:36을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3.
다른 특정한 조합은 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:12를 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl;
(b) SEQ ID NO:17을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2;
(c) SEQ ID NO:22를 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3;
(d) SEQ ID NO:27을 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl;
(e) SEQ ID NO:32를 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:37을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3.
또 다른 특정한 조합은 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:13을 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl;
(b) SEQ ID NO:18을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2;
(c) SEQ ID NO:23을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3;
(d) SEQ ID NO:28을 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl;
(e) SEQ ID NO:33을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:38을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3.
또 다른 특정한 조합은 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:14를 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl;
(b) SEQ ID NO:19를 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2;
(c) SEQ ID NO:24를 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3;
(d) SEQ ID NO:29를 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl;
(e) SEQ ID NO:34를 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:39를 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3.
또 다른 특정한 조합은 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:15를 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl;
(b) SEQ ID NO:20을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2;
(c) SEQ ID NO:25를 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3;
(d) SEQ ID NO:30을 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl;
(e) SEQ ID NO:35를 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:40을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3.
본 개시사항의 다른 특정한 항체 또는 이들의 항원 결합 부분은 (a) SEQ ID NO: 1의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 (b) SEQ ID NO: 6의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함한다.
다른 특정한 조합은 (a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 (b) SEQ ID NO: 7의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함한다.
또 다른 특정한 조합은 (a) SEQ ID NO: 3의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 (b) SEQ ID NO: 8의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함한다.
또 다른 특정한 조합은 (a) SEQ ID NO: 4의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 (b) SEQ ID NO: 9의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함한다.
또 다른 특정한 조합은 (a) SEQ ID NO: 5의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 (b) SEQ ID NO: 10의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함한다.
본 개시사항의 다른 측면에 있어서, 상기에 언급된 항체의 어느 것과 O8E에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항체 또는 이들의 항원 결합 부분이 제공된다.
본 개시사항의 항체는, 예를 들어 전 길이 항체, 예를 들어 IgGl, IgG2 또는 IgG4 아이소타이프일 수 있다. 대안적으로는, 항체는 Fab, Fab' 또는 Fab'2 분획이나 단일 사슬 항체(즉, scFv)와 같은 항체 분획일 수 있다.
본 개시사항은 또한 세포독소나 방사성 동위원소와 같은 치료적 제제에 연결된 본 개시사항의 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 포함하는 이뮤노컨쥬게이트를 제공한다. 본 개시사항은 또한 본 개시사항의 항체 또는 이들의 항원 결합 부분와 다른 결합 특이성을 갖는 제이 작용 부위에 연결된 상기 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 포함하는 비스페시픽 분자를 제공한다. 본 개시사항의 항체 또는 이들의 항원 결합 부분 또는 이뮤노컨쥬게이트나 비스페시픽 분자를 포함하는 조성물 및 약학적으로 허용가능한 담체가 또한 제공된다.
본 개시사항의 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 코드하는 핵산분자가 또한 본 개시사항에 포함되어 질 뿐 아니라 이러한 핵산을 포함하는 발현 벡터, 이러한 발현 벡터를 포함하는 숙주세포 및 이러한 숙주세포를 사용하여 항-O8E 항체를 제조하는 방법도 본 발명에 의해 포함된다. 더욱이, 본 발명의 개시사항은 인간 면역글로불린 중 및 경사슬 트랜스유전자를 포함하는 트랜스유전자의 마우스를 제공하고, 여기서 마우스는 본 개시사항의 항체 뿐 아니라 이러한 마우스로부터 제조된 하이브리도마를 발현하고, 여기서 이 하이브리도마는 본 개시사항의 항체를 생산한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 개시사항은 대상에 질병의 예방 또는 치료를 위해 유효량으로 본 개시사항의 항-O8E 인간 항체를 투여하는 것을 포함하는 O8E를 발현하는 종양 세포의 성장에 의해 특징되는 질병을 치료 또는 예방을 위한 방법을 제공한다. 이 질병은 암, 예를 들어 유방 세포 암종 암일 수 있다.
또 다른 측면에 있어서, 본 개시사항은 자가면역 질환을 치료하기에 유효한 량으로 본 개시사항의 항-O8E 인간 항체를 대상에 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시사항의 다른 특징 및 이점은, 한정하는 것으로 해석되지 않는 다음의 자세한 설명 및 실시예로부터 명백해질 것이다. 본 출원 전체를 통해 인용된 모든 참고문헌, 유전자은행 기재사항, 특허 및 공개된 특허출원의 내용은 레퍼런스로 여기에 명백하게 편입된다.
도 1A는 1G11 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변영역의 뉴클레오티드 시퀀스 (SEQ ID NO:41) 및 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:1)를 나타낸다. CDRl (SEQ ID NO:11), CDR2 (SEQ ID NO:16) 및 CDR3 (SEQ ID NO:21) 영역이 묘사되고, V 및 J 생식계열 유래가 표시되었다.
도 1B는 1G11 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변영역의 뉴클레오티드 시퀀스 (SEQ ID NO:46) 및 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:6)를 나타낸다. CDRl (SEQ ID NO:26), CDR2 (SEQ ID NO:31) 및 CDR3 (SEQ ID NO:36) 영역이 묘사되고, V 및 J 생식계열 유래가 표시되었다.
도 2A는 2A7 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변영역의 뉴클레오티드 시퀀스 (SEQ ID NO:42) 및 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:2)를 나타낸다. CDRl (SEQ ID NO:12), CDR2 (SEQ ID NO:17) 및 CDR3 (SEQ ID NO:22) 영역이 묘사되고, V, D 및 J 생식계열 유래가 표시되었다.
도 2B는 2A7 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변영역의 뉴클레오티드 시퀀스 (SEQ ID NO:47) 및 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:7)를 나타낸다. CDRl (SEQ ID NO:27), CDR2 (SEQ ID NO:32) 및 CDR3 (SEQ ID NO:37) 영역이 묘사되고, V 및 J 생식계열 유래가 표시되었다.
도 3A는 2F9 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변영역의 뉴클레오티드 시퀀스 (SEQ ID NO: 43) 및 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO: 3)를 나타낸다. CDRl (SEQ ID NO:13), CDR2 (SEQ ID NO:18) 및 CDR3 (SEQ ID NO:23) 영역이 묘사되고, V, D 및 J 생식계열 유래가 표시되었다.
도 3B는 2F9 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변영역의 뉴클레오티드 시퀀스 (SEQ ID NO: 48) 및 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO: 8)를 나타낸다. CDRl (SEQ ID NO:28), CDR2 (SEQ ID NO:33) 및 CDR3 (SEQ ID NO:38) 영역이 묘사되고, V 및 J 생식계열 유래가 표시되었다.
도 4A는 12El 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변영역의 뉴클레오티드 시퀀스 (SEQ ID NO:44) 및 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:4)를 나타낸다. CDRl (SEQ ID NO:14), CDR2 (SEQ ID NO:19) 및 CDR3 (SEQ ID NO:24) 영역이 묘사되고, V, D 및 J 생식계열 유래가 표시되었다.
도 4B는 12El 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변영역의 뉴클레오티드 시퀀스 (SEQ ID NO:49) 및 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:9)를 나타낸다. CDRl (SEQ ID NO:29), CDR2 (SEQ ID NO:34) 및 CDR3 (SEQ ID NO:39) 영역이 묘사되고, V 및 J 생식계열 유래가 표시되었다.
도 5A는 13Dl2 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변영역의 뉴클레오티드 시퀀스 (SEQ ID NO:45) 및 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:5)를 나타낸다. CDRl (SEQ ID NO:15), CDR2 (SEQ ID NO:20) 및 CDR3 (SEQ ID NO:25) 영역이 묘사되고, V, D 및 J 생식계열 유래가 표시되었다.
도 5B는 13D12 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변영역의 뉴클레오티드 시퀀스 (SEQ ID NO:50) 및 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:10)를 나타낸다. CDRl (SEQ ID NO:30), CDR2 (SEQ ID NO:35) 및 CDR3 (SEQ ID NO:40) 영역이 묘사되고, V 및 J 생식계열 유래가 표시되었다.
도 6은 인간 생식계열 VH 4-34 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:51)를 갖는 IGl1 및 13D12의 중사슬 가변 영역의 아미노산 시퀀스의 배열을 나타낸다.
도 7은 인간 생식계열 VH 3-35 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:52)를 갖는 2A7 및 2F9 의 중사슬 가변 영역의 아미노산 시퀀스의 배열을 나타낸다.
도 8은 조합된 인간 생식계열 VH 3-9/D3-10/JH6b 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:53)를 갖는 12El의 중사슬 가변 영역의 아미노산 시퀀스의 배열을 나타낸다.
도 9는 인간 생식계열 VK A27 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:54)를 갖는 IGl 1, 2A7, 2F9 및 13D12의 경사슬 가변 영역의 아미노산 시퀀스의 배열을 나타낸다.
도 10은 조합된 인간 생식계열 VK L6/JK1 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:55)를 갖는 12El의 경사슬 가변 영역의 아미노산 시퀀스의 배열을 나타낸다.
도 11A 및 11B는 인간 O8E에 대한 인간 모노클로날 항체가 O8E에 특이적으로 결합하는 것을 입증하는 ELISA 실험의 결과를 나타낸다.
도 11A는 정제된 O8E 단백질의 부가에 이어 인간 항-O8E 항체로 도포된 ELISA 플레이트 및 래빗 항-O8E 항혈청으로 검출로부터의 결과를 나타낸다.
도 11B는 모노클로날 항-C9 (0.6 μg/ml)에 이어 항-마우스 Fc로 도포하고 그런 다음 지시된 바와 같이 펜타-O8E 단백질로 적정하고 그리고 이어 1 μg/ml에서 인간 항-O8E 항체로 적정된 ELISA 플레이트로부터의 결과를 나타낸다.
도 12는 항-O8E 인간 모노클로날 항체 2A7가 O8E 형질전환 CHO 세포에 결합 하는 것을 입증하는 유동세포분석법 실험의 결과를 나타낸다.
도 13은 SKBR3 유방 암종 세포 뿐 아니라 O8E 형질전환 SKO V3 및 HEK 세포에서 O8E의 발현을 입증하는 유동세포분석법 실험의 결과를 나타낸다.
도 14는 인간 O8E에 대한 인간 모노클로날 항체가 08E+ CHO 세포 내로 체화할 수 있는 것을 입증하는 Hum-Zap 체화 실험의 결과를 나타낸다.
도 15는 인간 O8E에 대한 인간 모노클로날 항체가 08E+ SKBR3 세포 내로 체화할 수 있는 것을 입증하는 Hum-Zap 체화 실험의 결과를 나타낸다.
도 16은 IGl1, 2A7, 2F9 및 13Dl2를 포함하는 다양한 인간 항-O8E 모노클로날 항체로 에피토프 맵핑 연구의 결과를 나타낸다.
도 17은 인간 모노클로날 항-08E 항체가 인간 유방암 세포 라인 SKBR3을 ADCC 의존 형식으로 죽이는 것을 입증하는 항체 의존성 세포의 세포독성 (ADCC) 어세이의 결과를 나타낸다.
도 18은 인간 모노클로날 항-08E 항체가 O8E 형질전환된 SKOV3 세포를 ADCC 의존 형식으로 죽이는 것을 입증하는 항체 의존성 세포의 세포독성 (ADCC) 어세이의 결과를 나타낸다.
도 19는 인간 모노클로날 항-08E 항체가 인간 유방암 세포 라인 SKBR3을 농도 및 ADCC 의존 형식으로 죽이는 것을 입증하는 항체 의존성 세포의 세포독성 (ADCC) 어세이의 결과를 나타낸다.
도 20은 항-O8E 항체에 의한 HEK-B7H4 종양의 종양 성장 저해를 보여주는 SCID 마우스 상에서의 생체 내 연구의 결과를 나타낸다.
본 개시 사항은 분리된 모노클로날 항체에 관한 것이며, 특히 높은 친화성으로 O8E (a/k/a B7H4, B7S1 및 B7x)에 특이적으로 결합하는 인간 시퀀스 모노클로날 항체에 관한 것이다. 어떤 실시형태에 있어서, 본 개시 사항의 항체는 특히 중 및 경사슬 생식계열 시퀀스로부터 유래되고 및/또는 특정 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDR 영역과 같은 특정 구조의 형상을 포함한다. 본 개시 사항은 분리된 항체, 이러한 항체를 만드는 방법, 이러한 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트 및 비스페시픽 분자, 그리고 이 개시 사항의 항체, 면역컨쥬게이트 및 비스페시픽 분자를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 이 개시 사항은 또한 암과 같이 O8E의 발현과 연계된 질병을 치료할 뿐 아니라, O8E를 검지하는 것과 같은 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 개시사항은 또한 다양한 암의 치료를 위해, 예를 들어, 유방암 암종, 전이성 유방암, 난소 세포 암종, 전이성 난소암 및 신장 세포 암종의 치료에 본 개시사항의 항-O8E 항체를 사용하는 방법을 제공한다. 본 개시사항이 보다 확실하게 이해되도록 하기 위해, 용어가 먼저 정의된다. 부가적인 정의는 상세한 설명의 전반을 통하여 제시되어 진다.
용어 "O8E," "B7H4," "B7x" 및 "B7S1"은 여기서는 상호교환적으로 사용되고 그리고 인간 O8E의 변형체, 이성체, 유사화합물, 오르토로그 및 파라로그를 포함한다. 예를 들어, O8E에 특이적인 항체는 어떤 경우에는 인간 이외의 다른 종으로부터의 O8E와 교차반응할 것이다. 어떤 실시형태에서, 인간 O8E에 특이적인 항체는 인간 O8E에 대해 완전하게 특징적일 수 있고 그리고 교차-반응성의 종 또는 다른 타입을 나타내지 않을 수 있다.
용어 "인간 O8E"은 진뱅크 수탁번호 NP_078902를 갖는 인간 O8E의 완전 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:56)와 같은 인간 시퀀스 O8E를 언급한다. O8E는 또한 이 분야에서, 예를 들어 BL-CAM, B3, Leu-14 및 Lyb-8로 공지되어 있다. 인간 O8E 시퀀스는 예를 들어 보전적 돌연변이 또는 비-보전 영역에서의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO:56의 인간 O8E와는 다를 것이고 그리고 CD22는 SEQ ID NO:56의 인간 O8E와 실질적으로 같은 생물학적 기능을 갖는다. 예를 들어, 인간 O8E의 생물학적 기능은 본 개시사항의 항체에 의해 특이적으로 결합된 O8E의 세포 외 영역에 에피토프를 갖는 것이거나 또는 인간 O8E의 생물학적 기능은 예를 들어, T-세포 증식 저해, 시토킨 생산의 저해, 세포 주기 생성의 저해, 또는 T 세포 수용체에 결합을 포함한다.
특정한 인간 O8E 시퀀스는 일반적으로 SEQ ID NO:56의 인간 O8E에 아미노산 시퀀스에서 적어도 90% 동일하게 될 것이고, 그리고 다른 종(즉, 뮤어라인)의 O8E 아미노산 시퀀스에 비해 아미노산 시퀀스를 인간인 것으로 동정하는 아미노산 잔기를 포함한다. 어떤 경우에 있어서, 인간 O8E는 아미노산 시퀀스에서 SEQ ID NO:56의 인간 O8E에 적어도 95%, 또는 더욱이는 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 것이다. 어떤 실시형태에서는, 인간 O8E 시퀀스는 SEQ ID NO:56의 O8E와 다른 아미노산이 10개 보다 많지 않은 것을 나타낸다. 어떤 실시형태에서는, 인간 O8E 시퀀스는 SEQ ID NO:56의 O8E와 다른 아미노산이 5 또는 더욱이는 4, 3, 2, 또는 1개 보다 만지 않은 것을 나타낸다. 동일성 백분율은 여기에 기술된 바와 같이 하여 결정될 수 있다.
용어 "면역 반응"은 예를 들어, 림프구, 항원 표시 세포, 식세포, 그래뉼사이트 및 병인, 암성 세포, 또는 어떤 경우에는 자가면역성이나 병리적 염증, 정상 인간 세포나 조직에, 인체에 병인의 침입으로부터 파괴 또는 제거를 위해 선택적 손상을 초래하는 상기 세포 또는 간(항체, 사이토키닌 및 보체를 포함)에 의해 생산된 가용성 거대분자의 작용을 언급한다.
"시그날 형질도입 경로"는 세포의 일 부분으로부터 세포의 다른 부분으로 신호의 전달에 어떤 역할을 하는 다양한 시그날 형질도입 분자 간에 생화학적 상관관계에 대한 것이다. 여기서 사용된 것으로, 구 "세포 표면 수용체"는, 예를 들어 신호를 수용할 수 있고 그리고 이러한 신호를 세포의 플라즈마 멤브레인을 가로질러 전달할 수 있는 분자 및 복합체를 포함한다. 본 개시사항의 "세포 표면 수용체"의 예는 O8E 수용체이다.
여기서 언급된 것으로 용어 "항체"는 전 항체 및 항원 결합 분획(예를 들어, "항원-결합 부위")이나 이들의 단일 사슬을 포함한다. "항체"는 디설파이드 결합에 의해 상호 연결된 적어도 두 개의 중(H) 사슬 및 두 개의 경(L) 사슬을 포함하는 당단백질 또는 이들의 항원 결합 부위를 언급한다. 각 중사슬은 중사슬 가변영역 (여기서는 VH로 약칭함) 및 중사슬 불변영역을 포함한다. 중사슬 불변영역은 CH1, CH2 및 CH3의 세 도메인을 포함한다. 각 경사슬은 경사슬 가변영역 (여기서는 VL로 약칭함) 및 경사슬 불변영역을 포함한다. 경사슬 불변영역은 하나의 도메인, CL을 포함한다. VH 및 VL 영역은 과변이성의 영역인, 일명 상보성 결정 영역(CDR)으로 더 세분화될 수 있고, 일명 골격 영역(FR)인 보다 보전적인 영역으로 산재될 수 있다. 각 VH 및 VL은 세 CDR 및 네 FR를 포함하여, 아미노-말단으로부터 카르복시-말단 까지 다음의 순서로 배열되어 진다:FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중 및 경사슬의 가변영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보완계의 제일 성분(Clq)을 포함하여, 숙주 조직 또는 인자에 이뮤노글로불린의 결합을 조절할 수 있다.
여기서 사용된 것으로 용어, 항체의 "항원-결합 부분" (또는 간단하게 "항체 부분")은 항원(예를 들어, O8E)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 또는 그 이상의 분획에 대한 것이다. 항체의 항원-결합 작용은 전-길이 항체의 분획에 의하여 수행되어 질 수 있다는 것이 밝혀져 있다. 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포함되어 지는 결합 분획의 예는 (i) Fab 분획으로, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가의 분획; (ii) F(ab')2 분획으로, 힌지 영역에 디설파이드 다리에 의해 연결된 두 개의 Fab 분획을 포함하는 2가의 분획; (iii) 필수적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab인 Fab' 분획 (Fundamental Immunology (Paul ed., 3rd ed. 1993) 참고); (iv) VH 및 CHI 영역으로 구성된 Fd 분획; (v) 항체의 싱글 아암 의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 분획; (vi) VH 도메인을 구성하는 dAb 분획 (Ward et al, (1989) Nature 341:544-546); (vii) 분리된 상보성 결정 영역(CDR); 및 (viii) 나노바디로, 단일 가변 도메인 및 두 개의 불변 도메인을 포함하는 중사슬 가변 영역을 포함한다. 더욱이, 비록 Fv 분획의 두 도메인인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의하여 코드되어 지지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여 1가의 분자를 형성하기 위하여 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루는 단일 단백질 사슬로서 이들이 제조되어 질 수 있는 합성 링커에 의하여 연결되어 질 수 있다 (단일 사슬 Fv (scFv)로 알려진 것; 예를 들어, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc . Natl . Acad . ScL USA 85:5879-5883 참고). 이러한 단일 사슬 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포함되어 지도록 의도된다. 이들 항체 분획은 이 분야의 통상인에게 잘 알려진 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 분획은 온전한 항체로서 동일한 방식으로 실용성에 대해 선별되었다.
여기서 사용된 것으로, "분리된 항체"는 다른 항원적 특이성을 갖는 실질적으로 다른 항체가 없는 항체를 언급하기 위한 것이다(예를 들어, O8E에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 O8E 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, O8E에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종으로부터의 O8E 분자와 같이 다른 항원에 교차-반응성을 갖는다. 더욱이, 분리된 항원은 실질적으로 다른 세포성 물질 및/또는 화합물들이 없을 수 있다.
여기서 사용된 것으로 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성 물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제제를 언급한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 항원결정인자에 대한 친화성 및 단일 결합 특이성을 나타낸다.
여기서 사용된 것으로 용어 "인간 항체" 또는 "인간 시퀀스 항체"는 골격 및 CDR 영역 양자가 인간 생식계열 이뮤노글로불린 시퀀스로부터 유래된 다양한 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 더욱이, 만일 항체가 불변 영역을 포함하면, 이 불변 영역은 또한 인간 생식계열 이뮤노글로불린 시퀀스로부터 유래된다. 인간 항체는 천연 또는 합성 수사를 포함하는 후자의 수사를 포함할 수 있다. 본 개시사항의 인간 항체는 인간 생식계열 이뮤노글로불린 시퀀스에 의해 코드되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(즉, 생체 외에서 랜덤 또는 사이트-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체 내에서 체세포돌연변이에 의하여 도입된 돌연변이). 그러나, 여기서 사용된 것으로 용어 "인간 항체"는 마우스와 같은 다른 포유 동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 시퀀스가 인간 골격 시퀀스 상으로 그래프트되어 진 항체를 포함하는 것을 의도하지는 않는다.
"인간" 다음에 "시퀀스"가 포함될 수 있는, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 골격 및 CDR 영역 양자가 인간 생식계열 이뮤노글로불린 시퀀스로부터 유래된 다양한 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 언급한다. 일 실시형태에서, 인간 모노클로날 항체는 불사 세포에 융합된 인간 중사슬 형질전환 및 경사슬 형질전환을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비인간 동물, 예를 들어, 형질전환 마우스로부터 얻어진 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
여기서 사용된 것으로 용어 "재조합 인간 항체"는 (a) 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 형질전환 또는 트랜스크로모좀이거나 또는 이들로부터 제조된 하이브리도마(하기에 더 기술됨)인 동물(예를 들어, 마우스)로부터 분리된 항체, (b) 인간 항체를 발현하기 위해 변환된 숙주세포로부터, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 분리된 항체, (c) 재조합, 즉 결합 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체 및 (d) 다른 DNA 시퀀스로 인간 이뮤노글로불린 유전자 시퀀스의 유전자 삽입을 포함하는 어떤 다른 수단에 의하여 제조, 발현, 생산 또는 분리된 항체와 같은 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생산 또는 분리된 모든 인간 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 골격 및 CDR 영역이 인간 생식계열 이뮤노글로불린 시퀀스로부터 유래된 가변 영역을 갖는다. 그러나, 어떤 실시형태에서, 이런 재조합 인간 항체는 생체 외에서 돌연변이 유발되어 질 수 있고(또는, 인간 Ig 시퀀스에 대한 동물 형질전환이 사용될 때는 생체 내에서 체세포돌연변이), 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 시퀀스는, 인간 생식계열 VH 및 VL 시퀀스로부터 유래되고 관련되어질 때 생체 내에서 인간 항체 생식계열 레파토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 시퀀스이다.
여기서 사용된 것으로, "아이소타이프"는 중사슬 불변 영역 유전자에 의해 코드되는 항체 클라스(예를 들어, IgM 또는 IgGl)에 대해 언급한다. 구 "항체 인지 항원" 및 "항원에 특이적인 항체"는 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 여기서 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "인간 항체 유도체류"는 인간 항체의 변형된 형태로, 예를 들어 항체의 컨쥬게이트 및 다른 제제나 항체에 대해 언급한다.
용어 "인체적응된 항체"는 마우스와 같은 다른 포유 동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 시퀀스가 인간 골격 시퀀스 상으로 그래프트되어 진 항체를 언급하기 위한 것이다. 부가적 골격 영역 변형이 인간 골격 시퀀스 내에서 이루어질 수 있다.
용어 "키메르 항체"는 가변 영역 시퀀스가 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 시퀀스가 인간 항체로부터 유래된 항체와 같이 가변 영역 시퀀스가 하나의 종으로부터 유래되고 불변 영역 시퀀스가 다른 종으로부터 유래된 항체를 언급하기 위한 것이다.
여기서 사용된 것으로, "인간 O8E에 특이적으로 결합하는" 항체는 인간 O8E에 1 x 10-7 M 또는 그 이하, 보다 전형적으로는 5 x 10-8 M 또는 그 이하, 더 전형적으로는 3 x 10-8 M 또는 그 이하, 더욱 보다 전형적으로는 1 x 10-9 M 또는 그 이하의 가장 전형적으로는 5 x 10-9 M 또는 그 이하의 KD로 결합하는 항체를 언급하기 위한 것이다.
여기서 사용된 것으로, 용어 단백질 또는 세포에 "실질적으로 결합하지 않는"은 단백질 또는 세포에 결합하지 않거나 또는 높은 친화도로 결합하지 않는, 즉 1 x 10-6 M 또는 그 이하, 보다 바람직하기로는 1 x 10-5 M 또는 그 이하, 더 바람직하기로는 1 x 10-4 M 또는 그 이하, 더욱 보다 바람직하기로는 1 x 10-2 M 또는 그 이하의 가장 바람직하기로는 1 x 10-2 M 또는 그 이하의 KD로 단백질 또는 세포에 결합하는 것을 의미한다.
여기서 사용된 것으로, 용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는 특정한 항체-항원 상호작용의 결합 비율을 언급하기 위한 것이고, 반면 여기서 사용된 것으로, 용어 "Kdis" 또는 "Kd,"는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 비율을 언급하기 위한 것이다. 여기서 사용된 것으로, 용어 "KD"는 해리 상수를 언급하기 위한 것으로, 이것은 Ka에 대한 Kd의 비(즉, Kd/Ka)로부터 얻어지고, 몰 농도(M)로 표시된다. 항체에 대한 KD 값은 이 기술 분야에 잘 확립된 방법을 사용하여 결정되어 질 수 있다. 항체의 KD를 결정하기 위한 바람직한 방법은 표면 플라스몬 공조, 전형적으로는 Biacore® 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하는 것이다.
여기서 사용된 것으로, IgG 항체에 대한 용어 "높은 친화도"는 타겟 항체에 대해 1 x 10-7 M 또는 그 이하, 보다 바람직하기로는 5 x 10-8 M 또는 그 이하, 그리고 더 보다 바람직하기로는 1 x 10-9 M 또는 그 이하, 그리고 보다 가장 바람직하기로는 5 x 10-9 M의 KD를 갖는 항체에 대한 것이다. 그러나, "높은 친화도" 결합은 다른 항체 아이소타이프에 대해 변할 수 있다. 예를 들어, IgM 아이소타이프에 대한 "높은 친화도" 결합은 10-6 M 또는 그 이하, 보다 바람직하기로는 10-7 M 또는 그 이하, 더 보다 바람직하기로는 10-8 M 또는 그 이하의 KD를 갖는 항체를 말한다.
여기서 사용된 것으로, 용어 "대상"은 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 척추동물, 즉 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 어류, 파충류 등과 같은 포유 및 비포유동물을 포함한다.
여기서 사용된 것으로, 용어 "O8E"은 과학 문헌에 이들 용어들이 다양하게 나타나는 바와 같이 용어 "B7H4," "B7S1," 및 "B7x"와 동의적으로 사용된다. O8E (B7H4)의 아미노산 시퀀스는 참고로 진뱅크 기탁번호 AAZl 7406, AAS13400, AAP37283, CAI12739 and CAI12737에 의해 그리고 Prasad et at (2003) Immunity 18:863-873; Sica et al. (2003) Immunity 18:849-861; 및 U.S. 특허번호 6,891,030에 의해 공식적으로 이용가능하며 이들 각각은 그 전체로 여기에 레퍼런스로 합체된다.
본 개시 사항의 다양한 측면은 이하의 하부항목에서 더 상세하게 기술되어 진다.
항-O8E 항체
본 개시 사항의 항체는 항체의 특정한 기능적 특징 또는 특성으로 특징되어 진다. 예를 들어, 항체는 인간 O8E에 특이적으로 결합한다. 전형적으로는, 본 개시 사항의 항체는 높은 친화도, 예를 들어 1 x 10-7 M 또는 그 이하의 KD로 CD70에 결합한다. 본 개시사항의 항-O8E 항체는 전형적으로 하나 또는 그 이상의 다음의 특 성을 나타낸다:
(a) 인간 O8E에 1x10-7 M 또는 그 이하의 KD로 결합함;
(b) 08E로 형질전환된 인간 CHO 세포에 결합함.
전형적으로, 항체는 인간 O8E에 5x10-8 M 또는 그 이하의 KD로 결합하고, 인간 O8E에 2x10-8 M 또는 그 이하의 KD로 결합하고, 인간 O8E에 5x10-9 M 또는 그 이하의 KD로 결합하고, 인간 O8E에 4x10-9 M 또는 그 이하의 KD로 결합하고, 인간 O8E에 3x10-9 M 또는 그 이하의 KD로 결합하고, 또는 인간 O8E에 2x10-9 M 또는 그 이하의 KD로 결합하고, 인간 O8E에 1x10-9 M 또는 그 이하의 KD로 결합한다.
O8E에 대한 항체의 결합 능을 평가하기 위한 표준 분석은, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블럿, RIA 및 유동세포분석법을 포함하여 이 분야에 잘 알려진 것이다. 적절한 분석법은 실시예에 보다 자세하게 기술되어 진다. 적절한 분석법은 실시예에 자세하게 기술되어 진다. 항체의 결합 운동학(즉, 결합 친화도) 또한 ELISA, Scatchard 및 Biacore® 시스템 아날리시스와 같은 이 기술 분야에 알려진 표준 분석법으로 평가되어 질 수 있다. 다른 실시예로서, 본 개시 사항의 항체는 유방 암종 종양 세포 라인, 예를 들어 SKBR3 세포 라인에 결합할 수 있다.
모노클로날 항체 IGl1, 2A7, 2F9. 12El 및 13D12
본 개시 사항의 예시된 항체는 실시예 1 및 2에서 기술된 바와 같이 분리되 고 그리고 구조적으로 특징되어 지는 인간 모노클로날 항체 IGI l9 2A7, 2F9, 12El 및 13D12를 포함한다. IGl1, 2A7, 2F9, 12El 및 13D12의 VH 아미노산 시퀀스는 각각 SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 및 5로 나타난다. IGl1, 2A7, 2F9, 12El 및 13D12의 VL 아미노산 시퀀스는 각각 SEQ ID NOs:6, 7, 8, 9 및 10으로 나타난다.
이들 항체의 각각이 O8E에 결합할 수 있는 것으로 되면, VH 및 VL 시퀀스는 "혼합되고 매치될 수 있어" 본 개시 사항의 다른 항-O8E 결합 분자를 생산한다. 이러한 "혼합되고 매치된" 항체의 O8E 결합은 상기 및 실시예들에 기술된 결합 어세이(즉, FACS 또는 ELISA)를 사용하여 시험되어 질 수 있다. 전형적으로는, VH 및 VL 사슬이 혼합되고 매치될 때, 특정한 VH/VL 쌍으로부터의 VH 시퀀스가 구조적으로 유사한 VH 시퀀스로 대체된다. 마찬가지로, 전형적으로는 특정한 VH/VL 쌍으로부터의 VL 시퀀스가 구조적으로 유사한 VL 시퀀스로 대체된다.
따라서, 일 측면에 있어서, 본 개시 사항은 다음을 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위를 제공한다:
(a) SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 (b) SEQ ID NOs:6, 7, 8, 9 및 10으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역; 여기서 항체는 O8E에, 전형적으로는 인간 O8E에 특이적으로 결합한다.
바람직한 중 및 경사슬 조합은 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:1의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 (b) SEQ ID NO:6의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역; 또는
(b) SEQ ID NO:2의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 (b) SEQ ID NO:7의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역; 또는
(c) SEQ ID NO:3의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 (b) SEQ ID NO:8의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역; 또는
(d) SEQ ID NO:4의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 (b) SEQ ID NO:9의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역; 또는
(e) SEQ ID NO:5의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 (b) SEQ ID NO:l0의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역.
또 다른 측면에 있어서, 본 개시 사항은 IGl1, 2A7, 2F9, 12El 및 13D12의 중사슬 및 경사슬 CDR1, CDR2 및 CDR3 또는 이들의 조합을 포함하는 항체를 제공한다. IGl1, 2A7, 2F9, 12El 및 13D12의 VH CDR1의 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NOs:11, 12, 13, 14 및 15에 각각 나타나 있다. IGl1, 2A7, 2F9, 12El 및 13D12의 VH CDR2의 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NOs:16, 17, 18, 19 및 20에 각각 나타나 있다. IGl1, 2A7, 2F9, 12El 및 13D12의 VH CDR3의 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NOs:21, 22, 23, 24 및 25에 각각 나타나 있다. IGl1, 2A7, 2F9, 12El 및 13D12의 VK CDR1의 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NOs:26, 27, 28, 29 및 30에 각각 나타나 있다. IGl1, 2A7, 2F9, 12El 및 13D12의 VK CDR2의 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NOs:31, 32, 33, 34 및 35에 각각 나타나 있다. IGl1, 2A7, 2F9, 12El 및 13D12의 VK CDR3의 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NOs:36, 37, 38, 39 및 40에 각각 나타나 있다. CDR 영역은 카바트 시스템(Kabat, E. A., et al . (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)을 사용하여 묘사되어 진다.
여기에서 IGIl, 2A7, 2F9, 12El 및 13D12로 지정된 인간 항체의 상기 참고된 아미노산 및 뉴클레오티드의 시퀀스 각각은 다음 표 1 및 시퀀스 리스트화로 나타내여 진다.
인간 항체 IGIl, 2A7, 2F9, 12El 및 13D12의 중 및 경사슬 가변 및 불변 영역과 상응하는 CDR의 시퀀스
시퀀스 식별자 상설 시퀀스
SEQ ID NO; 1 1G11 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00001
SEQ ID NO; 2 2A7 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00002
SEQ ID NO; 3 2F9 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00003
SEQ ID NO; 4 12E1 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00004
SEQ ID NO; 5 13D12 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00005
SEQ ID NO; 6 1G11 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00006
SEQ ID NO; 7 2A7 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00007
SEQ ID NO; 8 2F9 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00008
SEQ ID NO; 9 12E1 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00009
SEQ ID NO; 10 13D12 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00010
SEQ ID NO; 11 1G11 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역 CDR1의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00011
SEQ ID NO; 12 2A7 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역 CDR1의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00012
SEQ ID NO; 13 2F9 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역 CDR1의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00013
SEQ ID NO; 14 12E1 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역 CDR1의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00014
SEQ ID NO; 15 13D12 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역 CDR1의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00015
SEQ ID NO; 16 1G11 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역 CDR2의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00016
SEQ ID NO; 17 2A7 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역 CDR2의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00017
SEQ ID NO; 18 2F9 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역 CDR2의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00018
SEQ ID NO; 19 12E1 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역 CDR2의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00019
SEQ ID NO; 20 13D12 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역 CDR2의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00020
SEQ ID NO; 21 1G11 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역 CDR3의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00021
SEQ ID NO; 22 2A7 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역 CDR3의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00022
SEQ ID NO; 23 2F9 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역 CDR3의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00023
SEQ ID NO; 24 12E1 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역 CDR3의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00024
SEQ ID NO; 25 13D12 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역 CDR3의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00025
SEQ ID NO; 26 1G11 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역 CDR1의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00026
SEQ ID NO; 27 2A7 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역 CDR1의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00027
SEQ ID NO; 28 2F9 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역 CDR1의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00028
SEQ ID NO; 29 12E1 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역 CDR1의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00029
SEQ ID NO; 30 13D12 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역 CDR1의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00030
SEQ ID NO; 31 1G11 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역 CDR2의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00031
SEQ ID NO; 32 2A7 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역 CDR2의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00032
SEQ ID NO; 33 2F9 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역 CDR2의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00033
SEQ ID NO; 34 12E1 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역 CDR2의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00034
SEQ ID NO; 35 13D12 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역 CDR2의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00035
SEQ ID NO; 36 1G11 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역 CDR3의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00036
SEQ ID NO; 37 2A7 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역 CDR3의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00037
SEQ ID NO; 38 2F9 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역 CDR3의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00038
SEQ ID NO; 39 12E1 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역 CDR3의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00039
SEQ ID NO; 40 13D12 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역 CDR3의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00040
SEQ ID NO; 41 1G11 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역의 핵산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00041
SEQ ID NO; 42 2A7 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역의 핵산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00042
SEQ ID NO; 43 2F9 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역의 핵산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00043
SEQ ID NO; 44 12E1 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역의 핵산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00044
SEQ ID NO; 45 13D12 인간 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역의 핵산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00045
SEQ ID NO; 46 1G11 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역의 핵산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00046
SEQ ID NO; 47 2A7 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역의 핵산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00047
SEQ ID NO; 48 2F9 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역의 핵산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00048
SEQ ID NO; 49 12E1 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역의 핵산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00049
SEQ ID NO; 50 13D12 인간 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역의 핵산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00050
SEQ ID NO; 51 인간 생식라인 VH 4-34의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00051
SEQ ID NO; 52 인간 생식라인 VH 3-53의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00052
SEQ ID NO; 53 인간 생식라인 VH 3-9/D3-10/JH6b의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00053
SEQ ID NO; 54 인간 생식라인 VHK A27의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00054
SEQ ID NO; 55 인간 생식라인 VK L6/JK1의 아미노산 시퀀스
Figure 112008038464085-PCT00055
인간 항체 지정된 IG11, 2A7, 2F9, 12El 및 13D12의 각각이 O8E에 결합할 수 있는 것으로 되고 그리고 항원-결합 특이성이 일차적으로 CDRl, CDR2, 및 CDR3 영역에 의하여 제공되어 진다면, VH CDRl, CDR2, 및 CDR3 시퀀스 그리고 Vk CDRl, CDR2, 및 CDR3 시퀀스는 "혼합되고 매치"될 수 있어 (즉, 비록 각 항체는 반드시 VH CDRl, CDR2, 및 CDR3 그리고 Vk CDRl, CDR2, 및 CDR3를 포함하여야 되지만, 다른 항체로부터의 CDRs가 혼합되고 매치될 수 있음) 본 개시 사항의 다른 항-O8E 결합 분자를 생성한다. 이러한 "혼합되고 매치된" 항체의 O8E 결합은 상기 및 실시예들에 기술된 결합 어세이(즉, FACS, ELISA, Biacore® 시스템 어날리시스)를 사용하여 시험되어 질 수 있다. 전형적으로, VH CDR 시퀀스가 혼합되고 매치될 때, 특정한 VH 시퀀스로부터 CDRl, CDR2 및/또는 CDR3 시퀀스가 구조적으로 유사한 CDR 시퀀스(들)로 대체된다. 마찬가지로, Vk CDR 시퀀스가 혼합되고 매치될 때, 특정한 Vk 시퀀스로부터 CDRl, CDR2 및/또는 CDR3 시퀀스가 바람직하기로는 구조적으로 유사한 CDR 시퀀스(들)로 대체된다. 신규한 VH 및 VL 시퀀스는 하나 또는 그 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 시퀀스를 모노클로날 항체 IGl1, 2A7, 2F9, 12El 및 13D12에 대해 여기서 개시된 CDR 시퀀스로부터 구조적으로 유사한 시퀀스로 치환함에 의해 만들어질 수 있다는 것은 통상적인 기술을 가진 자에게 확실히 명백할 것이다.
따라서, 다른 측면에 있어서, 본 개시 사항은 다음을 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공한다:
(a) SEQ ID NOs :11, 12, 13, 14 및 15로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl;
(b) SEQ ID NOs:16, 17, 18, 19 및 20으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2;
(c) SEQ ID NOs:21, 22, 23, 24 및 25로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3;
(d) SEQ ID NOs:26, 27, 28, 29 및 30으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl;
(e) SEQ ID NOs:31, 32, 33, 34 및 35로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및
(f) SEQ ID NOs:36, 37, 38, 39 및 40으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3; 여기서 항체는 O8E에, 전형적으로는 인간 O8E에 특이적으로 결합함.
바람직한 실시형태로는, 항체는 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:11을 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl;
(b) SEQ ID NO:16을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2;
(c) SEQ ID NO:21을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3;
(d) SEQ ID NO:26을 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl;
(e) SEQ ID NO:31을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:36을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3.
다른 바람직한 실시형태로는, 항체는 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:12을 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl;
(b) SEQ ID NO:17을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2;
(c) SEQ ID NO:22을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3;
(d) SEQ ID NO:27을 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl;
(e) SEQ ID NO:32을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:37을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3.
다른 바람직한 실시형태로는, 항체는 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:13을 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl;
(b) SEQ ID NO:18을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2;
(c) SEQ ID NO:23을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3;
(d) SEQ ID NO:28을 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl;
(e) SEQ ID NO:33을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:38을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3.
다른 바람직한 실시형태로는, 항체는 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:14을 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl;
(b) SEQ ID NO:19을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2;
(c) SEQ ID NO:24을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3;
(d) SEQ ID NO:29을 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl;
(e) SEQ ID NO:34을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:39을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3.
다른 바람직한 실시형태로는, 항체는 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:15을 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl;
(b) SEQ ID NO:20을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2;
(c) SEQ ID NO:25을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3;
(d) SEQ ID NO:30을 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl;
(e) SEQ ID NO:35을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:40을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3.
CDR3 도메인은, CDRl 및/또는 CDR2 도메인(들)과는 독립적으로, 단독으로 동등한 항원에 대한 항체의 결합 특이성을 결정할 수 있고, 그리고 복수 항체들이 예상대로 공통 CDR3 시퀀스에 기초한 동일한 결합 특이성을 가지고 발생되어 질 수 있다는 것은 이 기술분야에 있어 잘 알려진 것이다. 예를 들어, Klimka et al , British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000) (뮤어라인 항-CD30 항체 Ki-4의 중사슬 가변 도메인 CDR3 만을 사용하여 인체적응된 항-CD30 항체의 생산을 기술함); Beiboer et al , J. Mol . Biol. 296:833-849 (2000) (모체의 뮤어라인 MOC-31 항-EGP-2 항체의 중사슬 CDR3 시퀀스 만을 사용하여 재조합 상피조직의 당간백질-2 (EGP-2)항체를 기술함); Rader et al , Proc . Natl . Acad . ScL U.S.A. 95:8910-8915 (1998) (뮤어라인 항-인테그린 αvβ3 항체 LM609의 중 및 경사슬 가변 CDR3 도메인을 사용하여 인체적응된 항-인테그린 αvβ3 항체의 패널을 기술하고, 여기서 각 구성 항체는 CDR3 도메인 외측에 명확한 시퀀스를 포함하여 모체의 뮤어라인 항체와 동일한 항원결정인자를 모체의 뮤어라인 항체와 거의 같이 높거나 또는 보다 더 높은 친화도로 결합할 수 있음); Barbas et al . , J. Am . Chem . Soc . 116:2161 -2162 (1994) (CDR3 도메인이 항원 결합에 대해 가장 유의성 있는 기여를 제공하는 것을 기술함); Barbas et al , Proc . Natl . Acad . ScL U.S.A. 92:2529-2533 (1995) (안티-테타너스 톡소이드 Fab의 중사슬 상에 인간 태반 DNA에 대해 세 개의 Fabs (SI-I, SI-40, 및 SI-32)의 중사슬 CDR3 시퀀스의 그라프팅함과 이에 의한 존재하는 중사슬 CDR3를 대체하고 CDR3 도메인 단독으로 결합 특이성을 제공한다는 것을 기술함); 및 Ditzel et al , J. Immunol . 157:739-749 (1996) (단일특이적 IgG 테타너스 톡소이드-바인딩 Fab p313 항체의 중사슬로 단지 모체의 다특이적 Fab LNA3의 중사슬 CDR3의 전이가 모체 Fab의 결합 특이성을 보유하는데 충분하다는 그라프팅 연구를 기술함) 참고. 이들 참고 문헌 각각은 그 전체로서 참고로서 여기에 합체되어 진다.
따라서, 어떤 측면 내에서, 본 개시 사항은 마우스 또는 랫트 항체와 같이 비-인간 항체로부터 하나 또는 그 이상의 중 및/또는 경사슬 CDR3 도메인을 포함하는 모노클로날 항체를 제공하며, 여기서 상기 모노클로날 항체는 O8E에 특이적으로 결합할 수 있다. 몇몇 실시형태 내에서, 비-인간 항체로부터 하나 또는 그 이상의 중 및/또는 경사슬 CDR3 도메인을 포함하는 이러한 발명의 항체는 (a) 항원결정인자와 경쟁적으로 결합할 수 있고; (b) 항원결정인자에 기능적 특성을 보유하고; (c) 동일한 항원결정인자에 결합하고; 및/또는 (d) 상응하는 모체의 비-인간 항체에 유사한 결합 친화도를 가진다.
다른 측면 내에서, 본 개시 사항은 예를 들어 비-인간 항체로부터 얻어진 인간 항체와 같은 제일 인간 항체로부터 하나 또는 그 이상의 중 및/또는 경사슬 CDR3 도메인을 포함하는 모노클로날 항체를 제공하며, 여기서 제일 인간 항체는 O8E에 특이적으로 결합할 수 있고, 그리고 제일 인간 항체로부터의 CDR3 도메인은 O8E에 대한 결합 특이성을 결한 인간 항체 내에 CDR3 도메인을 대체하여 O8E에 대한 특이적으로 결합할 수 있는 제이의 인간 항체를 발생한다. 몇 가지의 실시형태 내에서, 제일의 인간 항체로부터 하나 또는 그 이상의 중 및/또는 경사슬 CDR3 도메인을 포함하는 이런 진보적 항체는 (a) 항원결정인자와 경쟁적으로 결합할 수 있고; (b) 항원결정인자에 기능적 특성을 보유하고; (c) 동일한 항원결정인자에 결합하고; 및/또는 (d) 상응하는 모체의 제일의 인간 항체에 유사한 결합 친화도를 가진다.
특정 생식계열 시퀀스를 갖는 항체
어떤 실시형태에서, 본 개시 사항의 항체는 특정 생식계열 중사슬 이뮤노글로불린 유전자로부터의 중사슬 가변영역 및/또는 특정 생식계열 경사슬 이뮤노글로불린 유전자로부터 경사슬 가변영역을 포함한다.
예를 들어, 바람직한 실시형태에 있어서, 본 개시사항은 인간 VH 4-34 유전자의 산물 또는 이들로부터 유래된 중사슬 가변영역을 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공하고, 여기서 항체는 O8E에 특이적으로 결합한다. 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 본 개시 사항은 인간 VH 3-53 유전자의 산물 또는 이들로부터 유래된 중사슬 가변영역을 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공하고, 여기서 항체는 O8E에 특이적으로 결합한다. 또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 본 개시 사항은 조합된 인간 VH 3-9/D3-10/JH6b 유전자의 산물 또는 이들로부터 유래된 중사슬 가변영역을 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공하고, 여기서 항체는 O8E에 특이적으로 결합한다.
또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 본 개시 사항은 인간 VK A27 유전자의 산물 또는 이들로부터 유래된 경사슬 가변영역을 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공하고, 여기서 항체는 O8E에 특이적으로 결합한다. 또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 본 개시 사항은 인간 VK L6/JK1 유전자의 산물 또는 이들로부터 유래된 경사슬 가변영역을 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공하고, 여기서 항체는 O8E에 특이적으로 결합한다.
더욱이 또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 본 개시 사항은 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공하는 것으로, 여기서 항체는:
(a) 인간 VH 4-34 유전자, 인간 VH 3-53 또는 재조합 인간 VH 3-9/D3-10/JH6b 유전자 (각 유전자는 SEQ ID NOs:51, 52 및 53으로 설정된 아미노산 시퀀스를 코드함)의 산물 또는 이들로부터 유래된 중사슬 가변영역을 포함하고;
(b) 인간 VK A27 유전자 또는 재조합 인간 VK L6/JK1 유전자 (각 유전자는 SEQ ID NOs:54 및 55로 설정된 아미노산 시퀀스를 코드함)의 산물 또는 이들로부터 유래된 경사슬 가변영역을 포함하고; 그리고
(c) 항체는 O8E에, 전형적으로는 인간 O8E에 특이적으로 결합함.
VH 4-34 및 VK A27의 각 VH 및 VK를 갖는 항체의 예는 1G1l 및 13Dl2이다. VH 3-53 및 VK A27의 각 VH 및 VK를 갖는 항체의 예는 2A7 및 2F9이다. VH 3-9/D 3- 10/JH6b 및 VK L6/JK1의 각 VH 및 VK를 갖는 항체의 예는 12El이다.
여기서 사용된 것으로, 만일 항체의 가변 영역이 인간 생식계열 이뮤노글로불린 유전자를 사용하는 계로부터 얻어진 것이라면, 인간 항체는 특정 생식계열 시퀀스의 "산물" 또는 "이들로부터 유래된" 중 또는 경사슬 가변영역을 포함한다. 이러한 계는 흥미있는 항원으로 인간 이뮤노글로불린 유전자를 담지하는 형질전환 마우스를 면역시키거나 또는 흥미있는 항원으로 파아지 상에 디스플레이된 인간 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 생식계열 이뮤노글로불린 시퀀스의 "산물" 또는 "이들로부터 유래된" 인간 항체는 인간 생식계열 이뮤노글로불린의 아미노산 시퀀스에 인간 항체의 아미노산 시퀀스를 비교하고 그리고 인간 항체의 시퀀스에 시퀀스가 가장 밀접한(즉, 최대 % 동일성) 인간 생식계열 이뮤노글로불린 시퀀스를 셀렉팅함에 의해 동정되어 질 수 있다. 특정한 인간 생식계열 이뮤노글로불린 시퀀스의 "산물" 또는 "이들로부터 유래된" 인간 항체는, 예를 들어 자연적으로 발생하는 체세포돌연변이 또는 사이트-지정 돌연변이의 의도적인 유발에 기인하여 생식계열 시퀀스에 대비하여 다른 아미노산을 포함할 수 있다. 그러나, 선택된 인간 항체는 인간 생식계열 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코드된 아미노산 시퀀스에 대해 아미노산 시퀀스에 있어 전형적으로 적어도 90% 동일하고, 그리고 인간 항체를 다른 종의 생식계열 이뮤노글로불린 아미노산 시퀀스 (즉, 뮤어라인 생식계열 시퀀스)에 비교할 때 인간으로 동정하는 아미노산 잔기를 포함한다. 어떤 경우에, 인간 항체는 생식계열 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코드된 아미노산 시퀀스에 대하여 아미노산 시퀀스에 있어서 적어도 95%, 또는 더욱이 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 전형적으로는, 특정한 인간 생식계열 시퀀스로부터 유래된 인간 항체는 인간 생식계열 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코드된 아미노산 시퀀스로부터 10개 이하의 아미노산 차이를 보일 것이다. 어떤 경우에서는, 인간 항체는 생식계열 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코드된 아미노산 시퀀스로부터 5개 이하, 또는 더욱이 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 보일 것이다.
상동 항체
더욱이 다른 실시형태에서, 본 개시사항의 항체는 여기에 기술된 바람직한 항체의 아미노산 시퀀스에 상동성인 아미노산 시퀀스를 포함하는 중 및 경사슬 가변 영역을 포함하고, 여기서 항체는 본 개시사항의 항-O8E 항체의 바람직한 기능적 특성을 보유한다.
예를 들어, 본 개시사항은 중사슬 가변영역 및 경사슬 가변영역을 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공하고, 여기서:
(a) 중사슬 가변영역은 SEQ ID NOs:l, 2, 3, 4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스에 적어도 80% 유사한 아미노산 시퀀스를 포함하고;
(b) 경사슬 가변영역은 SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 9 및 10으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스에 적어도 80% 유사한 아미노산 시퀀스를 포함하고;
(c) 항체는 인간 O8E에 1 x 10-7 M 또는 그 이하의 KD로 결합하고; 그리고
(d) 항체는 O8E로 형질 전환된 인간 CHO 세포에 결합함.
다양한 실시형태에서, 항체는 예를 들어, 인간항체, 인간에 체화된 항체 또는 키메르 항체 일 수 있다. 다른 실시형태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 시퀀스는 상기에 제시된 시퀀스에 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사할 수 있다. 상기 설정된 시퀀스의 VH 및 VL 영역에 대해 높은(즉, 80% 또는 그 이상) 유사성을 갖는 VH 및 VL 영역을 가지는 항체는 SEQ ID NOs:41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 및 50을 코드하는 핵산 분자의 돌연변이유발(즉, 사이트-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발)에 의해, 그리고 이에 따른 여기에 기술된 작용적 분석법을 사용하여 코드된 변형된 항체에 대한 보유된 작용(즉, 상기 (c) 및 (d)에 제시된 기능)을 시험함에 의해 얻어질 수 있다.
여기서 사용된 것으로, 두 아미노산 시퀀스 간에 유사성 백분율은 두 시퀀스 간의 동일성 백분율에 동등하다. 두 시퀀스 간의 동일성 백분율은 각 갭의 수와 각 갭의 길이를 고려하여 시퀀스에 의하여 공유된 다수의 동일한 위치의 기능(즉, 유사성 % = 동일한 위치의 #/위치의 전체 # x 100)으로, 두 시퀀스의 최적의 배열을 위하여 도입되어 질 필요가 있다. 시퀀스의 비교 및 두 개의 시퀀스 간의 동일성 백분율의 결정은 아래의 비제한적인 실시예에서 기술된 바와 같이, 수학적 알고리즘을 사용하여 수행되어 질 수 있다.
두 아미노산 시퀀스 간의 동일성 백분율은 PAM120 중량 잔기 테이블, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용하여 ALIGN 프로그램 (version 2.0)으로 합체되는 이 메이어와 더블유 밀러(E. Meyers and W. Miller; Comput . Appl . Biosci., 4:11-17 (1988))의 알고리즘을 사용하여 결정되어 질 수 있다. 부가하여, 두 아미노산 시퀀스 간의 동일성 백분율은 브로섬(Blossum) 62 매트릭스나 PAM250 매트릭스와 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용하여 GCG 소프트웨어 팩키지(www.gcg.com에서 이용할 수 있음) 내의 GAP 프로그램으로 합체되는 니들맨과 분쉬(Needleman and Wunsch; J. MoI . Biol . 48:444-453 (1970)) 알고리즘을 사용하여 결정되어 질 수 있다.
부가적으로 또는 대안적으로, 본 개시사항의 단백질 시퀀스는, 예를 들어 관련된 시퀀스를 동정하기 위한 공공 데이타베이스에 대해 검색을 수행하기 위한 "쿼리 시퀀스"로 더욱이 사용될 수 있다. 이러한 검색은 Altschul, et al . (1990) J. MoI. Biol . 215:403-10의 XBLAST 프로그램 (version 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 개시사항의 항체 분자에 유사한 아미노산 시퀀스를 얻기 위하여 XBLAST 프로그램으로, 스코어 = 50, 워드길이 = 3으로 수행될 수 있다. 비교 목적을 위한 갭트 배열을 얻기 위하여, 갭트 BLAST가 Altschul et al , (1997) Nucleic Acids Res . 25(17):3389-3402에 기술된 것과 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 갭트 BLAST 프로그램을 이용할 때, 각 프로그램(즉, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. www.ncbi.nlm.nih.gov 참고.
보전적 변이를 갖는 항체
어떤 실시형태에서, 본 개시사항의 항체는 CDRl, CDR2 및 CDR3 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역과 CDRl, CDR2 및 CDR3 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함하고, 여기서 하나 또는 그 이상의 이들 CDR 시퀀스는 여기에 기술된 바람직한 항체(즉, 1Gl1, 2A7, 2F9, 12El 또는 13D12)나 또는 이들의 보전적 변이에 기초한 특정된 아미노산 시퀀스를 포함하고, 그리고 여기서 항체는 본 개시사항의 항-O8E 항체의 원하는 작용 특성을 보유한다.
따라서, 본 개시사항은 CDRl, CDR2 및 CDR3 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역과 CDRl, CDR2 및 CDR3 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공하고, 여기서;
(a) 중사슬 가변영역 CDR3 시퀀스는 SEQ ID NOs:21, 22, 23, 24 및 25의 아미노산 시퀀스 그리고 이들의 보전적 변이로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하고;
(b) 경사슬 가변영역 CDR3 시퀀스는 SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39 및 40의 아미노산 시퀀스 그리고 이들의 보전적 변이로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하고;
(c) 항체는 인간 O8E에 1 x 10-7 M 또는 그 이하의 KD로 결합하고; 그리고
(d) 항체는 O8E로 형질 전환된 인간 CHO 세포에 결합함.
바람직한 실시형태에서, 중사슬 가변영역 CDR2 시퀀스는 SEQ ID NOs:16, 17, 18, 19 및 20의 아미노산 시퀀스 및 이들의 보전적 변이로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하고; 그리고 경사슬 가변영역 CDR2 시퀀스는 SEQ ID NOs:31, 32, 33, 34 및 35의 아미노산 시퀀스 및 그리고 이들의 보전적 변이로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함한다. 다른 바람직한 실시형태에서, 중사슬 가변영역 CDR1 시퀀스는 SEQ ID NOs:11, 12, 13, 14 및 15의 아미노산 시퀀스 및 이들의 보전적 변이로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하고; 그리고 경사슬 가변영역 CDR1 시퀀스는 SEQ ID NOs:26, 27, 28, 29 및 30의 아미노산 시퀀스 및 이들의 보전적 변이로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 항체는 예를 들어, 인간 항체, 인체 적응된 항체 또는 키메르 항체일 수 있다.
여기서 사용된 것으로, 용어 "보전적 시퀀스 변이"는 아미노산 시퀀스를 포함하는 항체의 결합 특징이 유의적으로 영향을 받거나 또는 변형하지 않는 아미노산 개변을 언급하기 위한 것이다. 이러한 보전적 변이는 아미노산 치환, 부가 및 결손을 포함한다. 변이는 사이트-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발과 같은 이 분야에 공지된 표준 기술에 의해 본 발명의 항체에 도입되어 질 수 있다. 보전적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 사이드 체인을 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 사이드 체인을 갖는 아미노산 잔기의 과(科)는 이 기술분야에 정의되어 져 있다. 이들 과는 염기성 측쇄(즉, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(즉, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(즉, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(즉, 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-사슬 측쇄(즉, 트레오닌, 발린, 이소류이신) 및 방향성 측쇄(즉, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 개시사항의 항체의 CDR 영역 내에 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고 그리고 변형된 항체는 보유된 기능에 대해 시험되어 질 수 있다.
본 개시사항의 항- O8E 항체와 동일한 항원결정인자에 결합하는 항체
다른 실시형태에서, 본 개시사항은 본 개시사항의 O8E 모노클로날 항체(즉, 본 개시사항의 모노클로날 항체의 어떤 하나와 O8E에 결합에 대해 교차-경쟁하는 능력을 갖는 항체)의 어떤 것과 인간 O8E 상에 동일한 항원결정인자에 결합하는 항체를 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 교차-경쟁 연구를 위한 레퍼런스 항체는 모노클로날 항체 1Gl1 (각각, SEQ ID NOs: 1 및 6에 나타난 것과 같은 VH 및 VL 시퀀스를 가짐) 또는 모노클로날 항체 2A7 (각각, SEQ ID NOs: 2 및 7에 나타난 것과 같은 VH 및 VL 시퀀스를 가짐) 또는 모노클로날 항체 2F9 (각각, SEQ ID NOs: 3 및 8에 나타난 것과 같은 VH 및 VL 시퀀스를 가짐) 또는 모노클로날 항체 12El (각각, SEQ ID NOs: 4 및 9에 나타난 것과 같은 VH 및 VL 시퀀스를 가짐) 또는 모노클로날 항체 13D12 (각각, SEQ ID NOs:5 및 10에 나타난 것과 같은 VH 및 VL 시퀀스를 가짐)일 수 있다. 이러한 교차-경쟁 항체는 표준 O8E 결합 분석법으로 1Gl1, 2A7, 2F9, 12El 또는 13Dl2와 교차-경쟁하는 그 능력에 기초하여 동정되어 질 수 있다. 예를 들어, BIAcore® 시스템 분석법, ELISA 분석 또는 유동세포분석법이 본 개시 사항의 항체와의 교차-경쟁을 입증하기 위하여 사용될 수 있을 것이다. 인간 O8E에, 예를 들어 1Gl1, 2A7, 2F9, 12El 또는 13Dl2의 결합을 저해하는 시험 항체의 능력은 시험 항체가 인간 O8E에 대한 결합에 대해 1Gl1, 2A7, 2F9, 12El 또는 13Dl2와 경쟁할 수 있고, 따라서 인간 O8E 상에 1Gl1, 2A7, 2F9, 12El 또는 13Dl2과 같은 항원결정인자에 결합한다는 것을 입증한다. 바람직한 실시형태에서, 인간 O8E 상에 1Gl1, 2A7, 2F9, 12El 또는 13Dl2과 같은 항원결정인자에 결합하는 항체는 인간 모노클로날 항체이다. 이러한 인간 모노클로날 항체는 실시예에서 기술되어 지는 바와 같이 제조되고 분리되어 질 수 있다.
가공되고 변이된 항체
본 개시사항의 항체는 더욱이 변이된 항체를 가공하는 시발 물질로서 여기에 기술된 하나 또는 그 이상의 VH 및/또는 VL 시퀀스를 갖는 항체를 사용하여 제조되어 질 수 있고, 여기서 변이된 항체는 시발 항체로부터 변형된 특성을 가질 수 있다. 항체는 하나 또는 양자의 가변 영역들 (즉, VH 및/또는 VL) 내에서, 예를 들어 하나 또는 그 이상의 CDR 영역 및/또는 하나 또는 그 이상의 골격 영역 내에서 하나 또는 그 이상의 잔기를 변형함에 의하여 가공되어 질 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 항체는 불변영역들 내에서, 예를 들어 항체의 이펙터 기능을 개변하기 위하여 잔기를 변형함에 의하여 가공되어 질 수 있다. 수행되어 질 수 있는 가변 영역을 가공하는 일 형태는 CDR 그래프팅이다. 항체는 여섯의 중 및 경사슬 상보성 결정 영역들 (CDRs) 내에 위치된 아미노산 잔기를 통하여 현저하게 타겟 항원과 상호작용한다. 이러한 이유 때문에, CDR 내에 아미노산 시퀀스가 CDR의 외측의 시퀀스 보다 개개의 항원들 사이에서 보다 다양하다. CDR 시퀀스는 대부분의 항체-항원 상호작용에 의존될 수 있기 때문에, 다른 특성을 갖는 다른 항원으로부터 골격 시퀀스 상에 그래프트된 특정 자연 발생 항원으로부터의 CDR 시퀀스를 포함하는 발현 벡터를 컨스트럭트함에 의해 특정 자연 발생 항원의 특성을 닮은 재조합 항체를 발현하는 것이 가능하다 (즉, Riechmann, L. et al . (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al . (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc . Natl. Acad . See . U.S.A. 86:10029-10033; Winter의 미국 특허번호 No. 5,225,539, 그리고 Queen 등의 미국 특허번호 Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370. 참고).
따라서, 본 개시 사항의 또 다른 실시형태는 각각 SEQ ID NOs:11, 12, 13, 14 및 15, SEQ ID NOs:16, 17, 18, 19 및 20 그리고 SEQ ID NOs:21 , 22, 23, 24 및 25로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRl, CDR2, 및 CDR3 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 각각 SEQ ID NOs:26, 27, 28, 29 및 30, SEQ ID NOs:31, 32, 33, 34 및 35 그리고 SEQ ID NOs:36, 37, 38, 39 및 40으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRl, CDR2, 및 CDR3 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분에 속한다. 따라서, 이러한 항체는 모노클로날 항체 1Gl1, 2A7, 2F9, 12El 또는 13D12의 VH 및 VL CDR 시퀀스를 포함하고, 더욱이 이들 항체로부터의 다른 골격 시퀀스도 포함할 수 있다.
이러한 골격 시퀀스는 생식계열 항체 유전자 시퀀스를 포함하는 공공 DNA 데이타베이스 또는 공개된 레퍼런스로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 인간 중 또는 경사슬 가변 영역 유전자에 대한 생식계열 DNA 시퀀스는 "VBase" 인간 생식계열 시퀀스 데이타베이스(인터넷 상 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 이용할 수 있음) 뿐 아니라 Kabat, E. A., et al . (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. MoI . Biol. 227:776-798; and Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur . J. Immunol. 24:827-836에서 발견되어 질 수 있고; 이들 각각의 내용은 레퍼런스로 여기에 명백하게 합체되어 진다. 또 다른 예로서, 인간 중 및 경사슬 가변 영역 유전자에 대한 생식계열 DNA 시퀀스는 진뱅크 데이터베이스에서 발견될 수 있다. 예를 들어, HCo7 HuMAb 마우스에서 발견된 다음의 중사슬 생식계열 시퀀스는 다음 진뱅크 수탁번호: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 및 BC070333), 3-33 (NG_0010109 및 NT_024637) 그리고 3-7 (NG_0010109 및 NT_024637)로 이용될 수 있다. 또 다른 예로서, HCo12 HuMAb 마우스에서 발견된 다음의 중사슬 생식계열 시퀀스는 다음 진뱅크 수탁번호: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 및 BC070333), 5-51 (NG_0010109 및 NT_024637), 4-34 (NG_0010109 및 NT_024637), 3-30.3 (CAJ556644) 그리고 3-23 (AJ406678)로 이용될 수 있다.
항체 단백질 시퀀스는 이 분야의 통상인에게 잘 알려진 소위 갭트 BLAST (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402)라고 불리는 일 시퀀스 유사성 검색 방법의 하나를 사용하여 축적된 단백질 시퀀스 데이타베이스에 대해 비교되어 진다. BLAST는 항체 시퀀스와 데이타베이스 시퀀스 간에 통계적으로 유의성이 있는 배열이 배열된 워드의 하이-스코어링 단편 쌍(HSP)을 포함하기 쉬운 발견적 알고리즘이다. 그 스코어가 신장이나 트리밍에 의하여 개선되어 질 수 없는 단편 쌍은 히트(hit)로 불린다. 간략하게는, VBASE 유래의 뉴클레오티드 시퀀스(vbase . mrc - cpe . cam . ac . uk / vbasel / list2 . php)는 전사되고 그리고 FRl 내지 FR3 골격 영역 사이의 영역 및 이를 포함하는 영역은 보유되어 진다. 데이타베이스 시퀀스는 98 잔기의 평균 길이를 갖는다. 단백질의 전체 길이에 걸쳐 정확하게 매치하는 이중의 시퀀스가 제거된다. 디폴트, 턴 오프된 저 복잡성 필터를 제외한 스탠다드 파라미터 및 BLOSUM62의 대체 매트릭스로 프로그램 "blastp"를 사용하여 단백질에 대한 BLAST 검색은 탑 5 히트 생성 시퀀스 매치에 대하여 걸렀다. 뉴클레오티드 시퀀스는 전체 여섯 프레임으로 전사되고 그리고 데이타베이스 시퀀스의 매치하는 단편에 정지 코돈을 갖지 않는 프레임은 잠정적인 히트로 간주되었다. 이것은 차례로 BLAST 프로그램 tblastx를 사용하는 것이 확인되었는데, 이것은 항체 시퀀스를 전체 여섯 프레임으로 전사하고 이들 전사를 전체 여섯 프레임으로 극적으로 전사된 VBASE 뉴클레오티드 시퀀스에 비교한다.
동일성은 시퀀스의 전체 길이에 걸쳐 단백질 데이타베이스와 항체 시퀀스 사이의 정확한 아미노산 매치이다. 양성적(동일성 + 치환 매치)은 동일한 것이 아니라 BLOSUM62 치환 매트릭스에 의해 가이드된 아미노산 치환이다. 만일 항체 시퀀스가 두 개의 데이타베이스 시퀀스와 같은 동일성으로 매치된다면, 가장 양성적을 갖는 히트가 매치되는 시퀀스 히트인 것으로 결정된다.
본 개시사항의 항체에 사용되기 위한 바람직한 골격 시퀀스는 본 개시사항의 선택된 항체에 의해 사용된 골격 시퀀스에 구조적으로 유사한, 즉 본 개시사항의 바람직한 모노클로날 항체에 의해 사용된 VH 4-34 골격 시퀀스 (SEQ ID NO: 51) 및/또는 VH 3-53 골격 시퀀스 (SEQ ID NO: 52) 및/또는 VH 3-9/D3-10/JH6b 골격 시퀀스 (SEQ ID NO: 53) 및/또는 VK A27 골격 시퀀스 (SEQ ID NO: 54) 및/또는 조합된 VK L6/JK1 골격 시퀀스 (SEQ ID NO: 55)에 유사한 것들이다. VH CDRl, CDR2, 및 CDR3 시퀀스, 그리고 VK CDRl, CDR2, 및 CDR3 시퀀스는 골격 시퀀스가 유도되는 생식계열 이뮤노글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 시퀀스를 가지는 골격 영역 상에 그래프트되어 질 수 있거나, 또는 CDR 시퀀스는 생식계열 시퀀스에 비하여 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함하는 골격 영역 상에 그래프트되어 질 수 있다. 예를 들어, 어떤 경우에는 항체의 항원 결합 능을 유지하거나 또는 고양하기 위하여 골격 영역 내에서 잔기를 변이시키는 것이 유리하다는 것이 알려져 있다(즉, Queen 등의 U.S. 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 참고).
다른 타입의 가변 영역 변이는 VH 및/또는 VK CDRl, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 변이하고 이에 의해 대상 항체의 하나 또는 그 이상의 결합 특성(즉, 친화도)을 개선하기 위한 것이다. 사이트-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발은 돌연변이를 도입하기 위해 수행되어 질 수 있고 그리고 항체 결합에 대한 효과 또는 흥미 대상의 다른 기능적 특성이 실시예에 제공되고 여기에서 기술된 것과 같은 생체 외 또는 생체 내 분석법으로 평가될 수 있다. 전형적으로는 (위에서 기술된) 보전적 변이가 도입된다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결손일 수 있지만, 그러나 바람직하기로는 치환이다. 더욱이, 전형적으로 CDR 영역 내에서 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯 잔기 이하가 변형된다.
따라서, 다른 실시형태에서, 본 개시사항은 다음을 포함하는 중사슬 가변영역을 포함하는 분리된 항-O8E 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공한다: (a) SEQ ID NOs:11, 12, 13, 14, 및 15로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스, 또는 SEQ ID NOs:11, 12, 13, 14, 및 15에 비하여 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 갖는 아미노산 시퀀스를 포함하는 VH CDRl 영역; (b) SEQ ID NOs:16, 17, 18, 19, 및 20으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스, 또는 SEQ ID NOs:16, 17, 18, 19, 및 20에 비하여 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 갖는 아미노산 시퀀스를 포함하는 VH CDR2 영역; (c) SEQ ID NOs:21, 22, 23, 24 및 25로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스, 또는 SEQ ID NOs:21, 22, 23, 24 및 25에 비하여 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 갖는 아미노산 시퀀스를 포함하는 VH CDR3 영역; (d) SEQ ID NOs:26, 27, 28, 29 및 30으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스, 또는 SEQ ID NOs:26, 27, 28, 29 및 30에 비하여 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 갖는 아미노산 시퀀스를 포함하는 VK CDR1 영역; (e) SEQ ID NOs:31, 32, 33, 34 및 35로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스, 또는 SEQ ID NOs:31, 32, 33, 34 및 35에 비하여 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 갖는 아미노산 시퀀스를 포함하는 VK CDR2 영역; 및 (f) SEQ ID NOs:36, 37, 38, 39 및 40으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스, 또는 SEQ ID NOs:36, 37, 38, 39 및 40에 비하여 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 갖는 아미노산 시퀀스를 포함하는 VK CDR3 영역.
본 개시사항의 가공된 항체는 그 변이가, 예를 들어 항체의 특성을 개선하기 위하여 VH 및/또는 VK 내에 골격 잔기에 대하여 이루어진 것을 포함한다. 전형적으로 이러한 골격 변이는 항체의 면역성을 감소하게 한다. 예를 들어, 하나의 접근법은 상응하는 생식계열 시퀀스에 대해 하나 또는 그 이상의 골격 잔기를 "후위 변이"하는 것이다. 더욱 자세하게는, 체세포돌연변이된 항체는 항체가 유도되어 진 생식계열 시퀀스와 다른 골격 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 잔기는 항체가 유도되어 진 생식계열 시퀀스에 항체 골격 시퀀스를 비교함에 의하여 동정되어 질 수 있다.
예를 들어, 1Gl1에 대해, VH의 아미노산 잔기 #71 (FR3 내)는 알라닌인 반면, 상응하는 VH 4-34 생식계열 시퀀스에서의 이 잔기는 발린이다. 골격 영역 시퀀스를 이들의 생식계열 형상으로 되돌리기 위하여, 체세포 돌연변이가, 예를 들어 사이트-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발에 의하여 생식계열 시퀀스에 "후위 변이"되어 질 수 있다 (즉, 1G11의 VH의 FR3의 잔기 #71은 알라닌으로부터 발린으로 "후위 변이"될 수 있음). 이런 "후위 변이"된 항체는 또한 본 개시사항에 의해 포괄되어 지는 것으로 의도된다.
다른 예로서, 1Gl1에 대해서, VH의 아미노산 잔기 #81 (FR3 내)는 아르기닌인 반면, 상응하는 VH 4-34 생식계열 시퀀스에서의 이 잔기는 라이신이다. 골격 영역 시퀀스를 이들의 생식계열 형상으로 되돌리기 위하여, 예를 들어 1Gl1의 VH의 FR3의 잔기 #81은 아르기닌으로부터 라이신으로 "후위 변이"될 수 있다. 이런 "후위 변이"된 항체 또한 본 개시사항의 범주에 포함되는 것으로 의도된다.
다른 예로서, 13Dl2에 대해서, VH의 아미노산 잔기 #83 (FR3 내)는 아스파라긴인 반면, 상응하는 VH 4-34 생식계열 시퀀스에서의 이 잔기는 세린이다. 골격 영역 시퀀스를 이들의 생식계열 형상으로 되돌리기 위하여, 예를 들어 13Dl2의 VH의 FR3의 잔기 #83은 아스파라긴으로부터 세린으로 "후위 변이"될 수 있다. 이런 "후위 변이"된 항체 또한 본 개시사항의 범주에 포함되는 것으로 의도된다.
다른 예로서, 2A7에 대해서, VH의 아미노산 잔기 #67 (FR3 내)은 발린인 반면, 상응하는 VH 3-53 생식계열 시퀀스에서의 이 잔기는 페닐알라닌이다. 골격 영역 시퀀스를 이들의 생식계열 형상으로 되돌리기 위하여, 예를 들어 2A7의 VH의 FR3의 잔기 #67은 발린으로부터 페닐알라닌으로 "후위 변이"될 수 있다. 이런 "후위 변이"된 항체 또한 본 개시사항의 범주에 포함되는 것으로 의도된다.
다른 예로서, 2F9에 대해서, VH의 아미노산 잔기 #28 (FR1 내)은 이소류이신인 반면, 상응하는 VH 3-53 생식계열 시퀀스에서의 이 잔기는 트레오닌이다. 골격 영역 시퀀스를 이들의 생식계열 형상으로 되돌리기 위하여, 예를 들어 2F9의 VH의 FR1의 잔기 #28은 이소류이신으로부터 트레오닌으로 "후위 변이"될 수 있다. 이런 "후위 변이"된 항체 또한 본 개시사항의 범주에 포함되는 것으로 의도된다.
다른 예로서, 12El에 대해서, VH의 아미노산 잔기 #23 (FR1 내)은 발린인 반면, 상응하는 VH 3-9 생식계열 시퀀스에서의 이 잔기는 알라닌이다. 골격 영역 시퀀스를 이들의 생식계열 형상으로 되돌리기 위하여, 예를 들어 12El의 VH의 FR1의 잔기 #23은 발린으로부터 알라닌으로 "후위 변이"될 수 있다. 이런 "후위 변이"된 항체 또한 본 개시사항의 범주에 포함되는 것으로 의도된다.
다른 예로서, 1G11에 대해서, VK의 아미노산 잔기 #7 (FR1 내)은 페닐알라닌인 반면, 상응하는 VK A27 생식계열 시퀀스에서의 이 잔기는 세린이다. 골격 영역 시퀀스를 이들의 생식계열 형상으로 되돌리기 위하여, 예를 들어 1G11의 VK의 FR1의 잔기 #7은 페닐알라닌으로부터 세린으로 "후위 변이"될 수 있다. 이런 "후위 변이"된 항체 또한 본 개시사항의 범주에 포함되는 것으로 의도된다.
다른 예로서, 1G11에 대해서, VK의 아미노산 잔기 #47 (FR2 내)은 발린인 반면, 상응하는 VK A27 생식계열 시퀀스에서의 이 잔기는 류이신이다. 골격 영역 시퀀스를 이들의 생식계열 형상으로 되돌리기 위하여, 예를 들어 1G11의 VK의 FR2의 잔기 #47은 발린으로부터 류이신으로 "후위 변이"될 수 있다. 이런 "후위 변이"된 항체 또한 본 개시사항의 범주에 포함되는 것으로 의도된다.
골격 변이의 또 다른 타입은 T 세포 항원결정인자를 제거하고 이에 의해 항체의 잠재적인 면역원성을 감소하기 위해 골격 영역 내에, 더욱이는 하나 또는 그 이상의 CDR 영역 내에 하나 또는 그 이상의 잔기를 돌연변이하는 것을 포함한다. 이 접근법은 또한 "탈면역화반응"으로 언급되고 그리고 Carr 등에 의한 미국 특허 공개번호 20030153043에 더 자세하게 기술되어 있다.
본 개시사항의 가공된 항체는 또한 그 내부에 변이가 이루어져 아미노산 잔기가 항체에 T-세포 에피토프의 상호작용을 개사하는 아미노산 변이를 통해 면역성 반응을 증가하거나 또는 감소하도록 한 것을 포함한다(미국 특허번호 6,835,550; 6,897,049 및 6,936249 참고).
골격 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변이에 부가 또는 대안적으로, 본 개시사항의 항체는 Fc 영역 내에 변이를 포함하도록, 전형적으로는, 혈청 반감기, 보체고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원-의존성 세포의 세포독성과 같은 항체의 하나 또는 그 이상의 기능적 특성을 변형하기 위해 가공되어 질 수 있다. 더욱이, 본 개시사항의 항체는 화학적으로 수사되거나(즉, 하나 또는 그 이상의 화학적인 부분이 항체에 부착되어 질 수 있음) 또는 그의 글리코실화반응을 변형하고 다시 항체의 하나 또는 그 이상의 기능적 특성을 변형하기 위해 수사되어 질 수 있다. 각각의 이들 실시형태는 아래에 보다 자세하게 기술될 것이다. Fc 영역에서 잔기의 번호 부여는 Kabat의 EU 인덱스의 것이다.
일 실시형태에 있어서, CHl의 힌지 영역은 힌지 영역에서의 시스테인 잔기의 수가 변형되도록, 즉 증가 또는 감소되도록 변이된다. 이 접근법은 Bodmer 등의 U.S. 특허번호 No. 5,677,425에 더욱 자세하게 기술되어 있다. CHl의 힌지 영역에서의 시스테인 잔기의 수는, 예를 들어 중 및 경사슬의 조합을 용이하게 하거나 또는 항체의 안전성을 증가 또는 감소되도록 변형된다.
다른 실시형태에 있어서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소하도록 변이된다. 보다 자세하게는, 하나 또는 그 이상의 아미노산 돌연변이가, 항체가 본래의 Fc-힌지 도메인 스타필로코실 단백질 A (SpA) 결합에 대해 손상된 SpA 결합을 갖도록 Fc-힌지 분획의 CH2-CH3 도메인 계면 영역 안으로 도입된다. 이 접근법은 Ward 등의 U.S. 특허번호 No. 6,165,745에 보다 자세하게 기술되어 있다.
또 다른 실시형태에 있어서, 항체는 항체의 생물학적 반감기를 증가하도록 변이된다. 다양한 접근법들이 가능하다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 다음의 돌연변이가 도입될 수 있다: Ward에 의한 U.S. 특허번호 No. 6,277,375호에 기술된 바와 같은 T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가하기 위해, Presta 등에 의한 U.S. 특허번호 No. 5,869,046 및 6,121,022에 기술된 바와 같이, 항체는 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 두 개의 루프로부터 취해진 샐비지 리셉터 결합 항원결정인자를 포함하도록 CHl 또는 CL 영역 내에서 변형되어 질 수 있다.
더욱이 다른 실시형태에서, Fc 영역은 적어도 하나의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 대체함에 의해 변형되어 항체의 이펙터 작용을 변형한다. 예를 들어, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가, 항체가 이펙터 리간드에 대해서는 변형된 친화도를 가지지만 모체 항체의 항원-결합 능을 보유하도록 다른 아미노산 잔기로 치환되어 질 수 있다. 친화도가 변형된 이펙터 리간드는, 예를 들어 보체의 Fc 수용체 또는 Cl 성분일 수 있다. 이 접근법은 Winter 등에 의한 U.S. 특허번호 Nos. 5,624,821와 5,648,260 양자에 보다 자세하게 기술되어 있다.
다른 예에서, 아미노산 잔기 329, 331 및 322로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가, 항체가 변형된 CIq 결합 및/또는 감소된 또는 소멸된 보체 의존성 세포독성(CDC)을 가지도록 다른 아미노산 잔기로 대체되어 질 수 있다. 이 접근법은 Idusogie 등에 의한 U.S. 특허번호 No. 6,194,551에 보다 자세하게 기술되어 있다.
또 다른 예에서, 아미노산 위치 231 및 239 내의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 변형되고 이에 의해 보체를 고정하는 항체의 능력을 변형한다. 이 접근법은 Bodmer 등에 의한 PCT 공개공보 WO 94/29351에 자세하게 기술되어 있다.
더욱이 또 다른 예에서, Fc 영역은 다음의 위치에 하나 또는 그 이상의 아미노산을 수사함에 의하여 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가하거나 및/또는 항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC)을 조정하기 위한 항체의 능력을 증가하도록 수사되어 질 수 있다: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439. 이 접근법은 Presta 등에 의한 PCT 공개공보 WO 00/42072에 보다 자세하게 기술되어 있다. 더욱이, FcγRl, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgGl 상의 결합 사이트가 지도로 그려지고 그리고 개선된 결합을 갖는 변형체가 기술되어 져 있다 (Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol . Chem. 276:6591-6604 참고). 위치 256, 290, 298, 333, 334 및 339에 대한 특정 돌연변이가 FcγRIII에 대한 결합을 개선하기 위해 나타나 진다. 부가적으로, 다음의 조합 돌연변이가 FcγRIII 결합을 개선하기 위해 나타나 진다: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A.
더욱 다른 실시형태에서는, 항체의 글리코실화반응이 수사된다. 예를 들어, 글리코실화된 항체가 제조될 수 있다(즉, 항체는 글리코실화반응을 결한다). 글리코실화반응은, 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화도를 증진하기 위해 변형되어 질 수 있다. 이러한 카르보하이드레이트 변이는, 예를 들어 항체 시퀀스 내의 글리코실화반응의 하나 또는 그 이상의 사이트를 변형함에 의해 성취되어 질 수 있다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 가변 영역 골격 글리코실화반응 사이트의 제거를 초래하고 이에 의하여 그 사이트에서의 글리코실화반응을 제거하는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환이 만들어질 수 있다. 이러한 글리코실화반응은 항원에 대한 항체의 친화도를 증가할 수 있다. 이러한 접근법은 Co 등에 의한 U.S. 특허번호 번호 5,714,350 및 6,350,861에 보다 자세하게 기술되어 있다.
부가적으로 또는 대안적으로, 감소된 양의 퓨코실 잔기를 갖는 히포퓨코실화 항체 또는 증가된 이분할 GlcNac 구조를 갖는 항체와 같이 변형된 타입의 글리코실화반응을 가지는 항체가 만들어 질 수 있다. 이러한 변형된 글리코실화반응 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증진하기 위해 입증되어져 있다. 이러한 카보하이드레이트 변이는, 예를 들어 변형된 글리코실화반응 머시너리로 숙주세포에 항체를 발현함에 의해 성취되어 질 수 있다. 변형된 글리코실화반응 머시너리를 갖는 세포들은 이 기술분야에 잘 기술되어져 있고 그리고 여기에 본 개시사항의 재조합 항체를 발현하고 이에 의해 변형된 글리코실화반응으로 항체를 생산하기 위해 숙주세포로 사용되어 질 수 있다. 예를 들어, 셀 라인 Ms704, Ms705, 및 Ms709는 이 Ms 704, Ms705, 및 Ms709 셀 라인에서 발현된 항체가 그들의 카보하이드레이트 상에 퓨코스를 결하도록 퓨코실트랜스퍼라제 유전자인 FUT8 (알파 (1,6) 퓨코실트랜스퍼라제)를 결한다. Ms704, Ms705, 및 Ms709 FUT8"A 셀 라인들은 두 개의 대체 벡터를 사용하여 CHO/DG44 세포 내에 FUT8 유전자의 타겟된 분열에 의해 제조되어 진다(Yamane 등에 의한 U.S. 특허 공개 번호 No.20040110704 및 Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). 또 다른 예로서, Hanai 등에 의한 EP 1,176,195호는 그 셀 라인에서 발현된 항체가 알파 1,6 결합-관련 효소를 감소하거나 또는 제거함에 의해 히포퓨코실화반응을 나타내도록 퓨코실 트랜스퍼라제를 코드하는 기능적으로 파열된 FUT8 유전자를 갖는 셀 라인을 기술하고 있다. Hanai 등은 또한, 예를 들어 랫트 미엘로마 셀 라린 YB2/0 (ATCC CRL 1662)과 같이 항체의 Fc 영역에 결합하거나 또는 효소 활성을 갖지 않는 N-아세틸글루코사민에 퓨코스를 부가함에 대한 낮은 효소 활성을 갖는 셀 라인을 기술하고 있다. Presta에 의한 PCT 공개공보 WO 03/035835는 Asn(297)-링커된 탄수화물에 대해 퓨코스를 부착하는 감소된 능력을 갖을 뿐 아니라 그 숙주 세포에서 발현된 항체의 히포글리코실화 반응에서의 결과인 CHO 셀 라인인, Lee 13 셀을 기술하고 있다(또한, Shields, R.L. et al (2002) J. Biol . Chem . 277:26733-26740 참고). Umana 등에 의한 PCT 공개공보 WO 99/54342호는 가공된 셀 라인에서 발현된 항체가 항체의 증가된 ADCC 활성을 초래하는 증가된 이분 GlcNac 구조를 나타내도록 당단백질-수사 글리코실 크랜스퍼라제(즉, 베타 (l,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 가공된 셀 라인을 기술한다(또한, Umana et al . (1999) Nat . Biotech . 17:176-180 참고). 대안적으로, 항체의 퓨코스 잔기는 퓨코시다제 효소를 사용하여 단리되어 질 수 있다. 예를 들어, 퓨코시다제 알파-L-퓨코시다제는 항체로부터 퓨코실 잔기를 제거한다(Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem . 14:5516-23).
본 개시사항에 의해 상찰된 여기에서 항체의 또 다른 변이는 PEG화반응이다. 항체는, 예를 들어 항체의 생물학적(즉, 혈청) 반감기를 증가하기 위해 PEG화되어 질 수 있다. 항체를 PEG화하기 위하여, 전형적으로는 항체 또는 이들의 분획이 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 반응성 에스테르 또는 알데하이드 유도체류와 같은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과, 하나 또는 그 이상의 PEG 기가 항체 또는 항체 분획에 부착되는 조건 하에서 반응된다. 전형적으로는, PEG화반응은 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 폴리머)와 아실화반응 또는 알킬화반응을 통해 수행되어 진다.
여기서 사용된 것으로, 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 모노 (Cl-ClO) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드와 같은 다른 단백질을 유도하기 위해 사용되어 지는 PEG의 어떤 형태도 포함하는 것으로 의도된다. 어떤 실시형태에 있어서, PEG화되어 지는 항체는 글리코실화 항체이다. 단백질을 PEG화하기 위한 방법은 이 기술 분야에 알려져 있고 그리고 본 개시사항의 항체에 대하여 적용되어 질 수 있다. 예를 들어, Nishimura 등에 의한 EP 0 154 316 및 Ishikawa 등에 의한 EP 0401 384 참고.
항체를 가공하는 방법
위에서 기술된 바와 같이, 여기에 기술된 VH 및 VK 시퀀스를 갖는 항-O8E 항체는 여기에 부착된 VH 및/또는 VK 시퀀스나 불변 영역(들)을 변이함에 의해 신규한 항-O8E 항체를 얻기 위하여 사용되어 질 수 있다. 따라서, 본 개시사항의 또 다른 측면에 있어서는, 본 개시사항의 항-O8E 항체, 즉 1Gl1, 2A7, 2F9, 12El 또는 13Dl2의 구조적 특성은, 인간 O8E에 결합과 같은 본 개시사항의 항체의 적어도 하나의 기능적 특성을 보유하는 구조적으로 관련된 항-O8E 항체를 만들기 위하여 사용된다. 예를 들어, 1Gl1, 2A7, 2F9, 12El 또는 13Dl2나 이들의 변이체의 하나 또는 그 이상의 CDR 영역은, 상술한 바와 같이 본 개시사항의 부가적으로, 재조합적으로-가공된 항-O8E 항체를 만들기 위하여 공지된 골격 영역 및/또는 다른 CDRs과 재조합적으로 조합되어 질 수 있다. 다른 타입의 변이는 이전 부분에서 기술된 것을 포함한다. 가공하는 방법에 대하여 시발 물질로는 여기에 제공된 하나 또는 그 이상의 VH 및/또는 VK 시퀀스 또는 하나 또는 그 이상의 이들의 CDR 영역이다. 가공된 항체를 만들기 위하여서, 여기에 제공된 하나 또는 그 이상의 VH 및/또는 VK 시퀀스 또는 하나 또는 그 이상의 이들의 CDR 영역을 갖는 항체를 실질적으로 제조(즉, 단백질로서 발현)하는 것이 필요하지는 않다. 더욱이, 시퀀스(들)에 포함된 정보는 오리지날 시퀀스(들)로부터 유래된 "제이 세대" 시퀀스(들)을 만들기 위한 시발 물질로서 사용되고 그리고 그런 다음 "제이 세대" 시퀀스(들)이 준비되고 단백질로 발현된다.
따라서, 또 다른 실시형태에 있어서, 본 개시사항은 다음을 포함하는 항-O8E 항체를 제조하는 방법을 제공한다:
(a) 다음을 제공: (i) SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 및 15로 구성된 군으로부터 선택된 CDRl 시퀀스, SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 19 및 20으로 구성된 군으로부터 선택된 CDR2 시퀀스, 및/또는 SEQ ID NOs: 21, 22, 23, 24 및 25로 구성된 군으로부터 선택된 CDR3 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역 항체 시퀀스; 및/또는 (ii) SEQ ID NOs: 26, 27, 28, 29 및 30으로 구성된 군으로부터 선택된 CDRl 시퀀스, SEQ ID NOs: 31, 32, 33, 34 및 35로 구성된 군으로부터 선택된 CDR2 시퀀스, 및/또는 SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39 및 40으로 구성된 군으로부터 선택된 CDR3 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역 항체 시퀀스;
(b) 적어도 하나의 변형된 항체 시퀀스를 창제하기 위하여 중사슬 가변영역 항체 시퀀스 및/또는 경사슬 가변영역 항체 시퀀스 내에 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변형; 및
(c) 변형된 항체 시퀀스를 단백질로 발현하는 것.
표준 분자 생물학 기술이 변형된 항체 시퀀스를 제조하고 발현하기 위하여 사용되어 질 수 있다.
전형적으로는, 변형된 항체 시퀀스(들)에 의해 코드된 항체는 여기에 기술된 항-O8E 항체의 기능적 특성의 하나, 몇몇 또는 전부를 보유하는 것으로, 여기에 한정되는 것은 아니지만 이 기능적 특성은 다음을 포함한다:
(i) 1x10-7 M 또는 그 이하의 KD로 인간 O8E에 결합;
(ii) O8E로 형질전환된 인간 CHO에 결합.
변형된 항체의 기능적 특성은 이 기술분야에서 이용할 수 있고 그리고/또는 실시예에서 제시된 것(즉, 유동세포분석법, 결합 분석법)과 같은 여기에서 기술된 표준 분석법을 사용하여 평가되어 질 수 있다.
본 발명의 항체를 가공하는 방법의 어떤 실시형태에 있어서, 돌연변이가 시퀀스를 코드하는 항-O8E 항체의 전부 또는 일부를 따라 랜덤하게 또는 선택적으로 도입되어 질 수 있고, 얻어진 변이된 항-O8E 항체는 결합 활성 및/또는 여기에 기술된 다른 기능적 특성에 대해 스크린되어 질 수 있다. 변이 방법은 이 기술 분야에 기술되어 져 있다. 예를 들어, Short에 의한 PCT 공개공보 WO 02/092780은 포화 돌연변이유발, 합성적 결찰 어셈블리 또는 이들의 조합을 사용하여 항체 돌연변이를 유발하고 스크리닝하는 방법을 기술하고 있다. 다른 것으로, Lazar 등에 의한 PCT 공개공보 WO 03/074679는 항체의 물리 화학적 특성을 최적화하기 위하여 컴퓨터화된 스크리닝 방법을 사용하는 방법을 기술하고 있다.
본 개시사항의 항체를 코드하는 핵산 분자
본 개시사항의 다른 측면은 본 개시사항의 항체를 코드하는 핵산 분자에 관한 것이다. 핵산은 모든 세포에, 세포 용융물에, 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 정제 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 다른 세포성 구성분이나 다른 오염물질, 즉 다른 세포성 핵산이나 단백질로부터, 알카린/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그라피, 아가로스 겔 일렉트로포르시스 및 이 분야에 잘 알려진 다른 방법을 포함하는 표준 기술에 의해 정제되어 질 때, "분리된" 또는 "실질적으로 부여된"다. 참고; F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. 본 개시사항의 핵산은, 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있고 그리고 고유의 시퀀스를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 핵산은 cDNA 분자이다.
본 개시사항의 핵산은 표준 분자생물학 기술을 사용하여 얻어질 수 있다. 하이브리도마(즉, 아래에 보다 자세히 기술되어 지는 바와 같이 인간 이뮤노글로불린 유전자를 담지하는 형질전환 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현된 항체를 위해, 하이브리도마에 의해 제조된 항체의 중 및 경사슬을 코드하는 cDNA들이 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의하여 수득되어 질 수 있다. 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리로부터 얻어진 항체(즉, 파아지 디스플레이 기술을 사용하여)를 위해서는, 항체를 코드하는 핵산이 라이브러리로부터 회수되어 질 수 있다.
본 개시사항의 바람직한 핵산 분자는 1Gl1, 2A7, 2F9, 12El 또는 13D12 모노클로날 항체의 VH 및 VL 시퀀스를 코드하는 것이다. 1Gl1, 2A7, 2F9, 12El 및 13D12의 VH 시퀀스를 코드하는 DNA 시퀀스는 각각 SEQ ID NOs: 41, 42, 43, 44 및 45에 나타나 있다. 1Gl1, 2A7, 2F9, 12El 및 13D12의 VL 시퀀스를 코드하는 DNA 시퀀스는 각각 SEQ ID NOs: 46, 47, 48, 49 및 50에 나타나 있다.
일단 VH 및 VL 부분을 코드하는 DNA 분획이 얻어지면, 이들 DNA 분획은, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전-길이의 항체 사슬 유전자로, Fab 분획 유전자로 또는 scFv 유전자로 전환하는 표준 재조합 DNA 기술에 의해 더 조작되어 질 수 있다. 이들 조작에 있어서, VL- 또는 VH-코드 DNA 분획은 항체 불변 영역 또는 가변 링커와 같은 다른 단백질을 코드하는 또 다른 DNA 분획에 조작적으로 연결되어 진다. 여기서 사용된 것으로 용어 "조작적으로 연결된"은 두 개의 DNA 분획이 이 두 개의 DNA 분획에 의해 코드된 아미노산 시퀀스가 프레임 안에 남아 있도록 연결되어진 것을 의미하기 위한 것이다.
VH 영역을 코드하는 분리된 DNA는 중사슬 불변 영역 (CHl, CH2 및 CH3)을 코드하는 다른 DNA 분자에 VH-코드하는 DNA를 조작적으로 연결함에 의해 전-길이의 중사슬 유전자로 전환되어 질 수 있다. 인간 중사슬 불변 영역 유전자의 시퀀스는 이 기술 분야에 잘 알려져 있고(즉, Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참고), 그리고 이들 영역을 포괄하는 DNA 분획은 표준 PCR 증폭에 의하여 얻어질 수 있다. 중사슬 불변 영역은 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 가장 전형적으로는 IgGl 또는 IgG4 불변 영역이다. Fab 분획 중사슬 유전자를 위해서는, VH-코드하는 DNA가 단 중사슬 CHl 불변 영역만을 코드하는 다른 DNA 분자에 조작적으로 연결되어 질 수 있다.
VL 영역을 코드하는 분리된 DNA는 경사슬 불변 영역, CL을 코드하는 다른 DNA 분자에 VL-코드하는 DNA를 조작적으로 연결함에 의해 전-길이의 경사슬 유전자 (뿐 아니라 Fab 경사슬 유전자)로 전환되어 질 수 있다. 인간 경사슬 불변 영역 유전자의 시퀀스는 이 기술 분야에 잘 알려져 있고(즉, Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참고), 그리고 이들 영역을 포괄하는 DNA 분획은 표준 PCR 증폭에 의하여 얻어질 수 있다. 경사슬 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있지만, 가장 전형적으로는 카파 불변 영역이다.
scFv 유전자를 제작하기 위하여, VH- 및 VL-코드하는 DNA 분획이 가변 링커를 코드하는, 즉 아미노산 시퀀스 (GIy4 -Ser)3를 코드하는 다른 분획에, VH 및 VL 시퀀스가 가변 링커에 의하여 연결된 VL 및 VH 영역을 갖는 접촉성 단일-사슬 단백질로 발현되어 질 수 있도록 조작적으로 연결되어 진다 (즉, Bird et al . (1988) Science 242:423-426; Huston et al . (1988) Proc . Natl . Acad . Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al . (1990) Nature 348:552-5541 참고)
본 개시사항의 모노클로날 항체의 생산
본 개시사항의 모노클로날 항체 (mAbs)는 통상적인 모노클로날 항체 방법론, 즉 콜러와 밀스타인(Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495)의 표준 체세포 하이브리드화반응 기술을 포함하는 다양한 기술에 의하여 생산되어 질 수 있다. 비록 체세포 하이브리드화반응 절차가 바람직하지만, 원론적으로는 모노클로날 항체를 생산하기 위한 다른 기술, 즉 B 림프구의 바이러스의 또는 발암의 형질전환이 채용되어 질 수 있다.
하이브리도마를 제조하기 위한 바람직한 동물 계는 뮤어라인 계이다. 마우스에서 하이브리도마 생산은 아주 잘 확립된 절차이다. 용융을 위해 면역화된 비장세포의 분리를 위한 면역화반응 프로토콜 및 기술은 이 분야에 잘 알려져 있다. 용융 파트너(즉, 뮤어라인 미엘로마 세포) 및 용융 과정 또한 잘 알려져 있다.
본 개시사항의 키메르 또는 인체 체화된 항체는 상술된 바와 같이 제조된 뮤어라인 모노클로날 항체의 시퀀스에 기하여 제조되어 질 수 있다. 중 및 경사슬 이뮤노글로불린을 코드하는 DNA는 표준 분자생물학 기술을 사용하여 흥미 대상의 비-인간 하이브리도마로부터 수득되어 질 수 있고 인간 이뮤노글로불린 시퀀스를 포함하도록 가공되어 질 수 있다. 예를 들어, 키메르 항체를 만들기 위해, 뮤어라인 가변 영역들은 이 분야의 공지된 방법을 사용하여 인간 불변 영역들에 연결되어 질 수 있다 (즉, Cabilly 등의 U.S. 특허번호 No.4,816,567 참고). 인체에 체화된 항체를 만들기 위해, 뮤어라인 CDR 영역들이 이 분야의 공지된 방법을 사용하여 인간 골격 영역 안으로 삽입되어 질 수 있다 (즉, Winter의 U.S. 특허번호 No. 5,225,539 및 Queen 등의 U.S. 특허번호 Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 참고).
바람직한 실시형태에서, 본 개시사항의 항체는 인간 모노클로날 항체이다. O8E에 대향하는 이러한 인간 모노클로날 항체는 마우스 계 보다는 인간 면역계의 일부를 담지하는 형질전환 또는 염색체전환 마우스를 사용하여 생산되어 질 수 있다. 이들 형질전환 또는 염색체전환 마우스는 각각 HuMAb 마우스® 및 KM 마우스®로 여기서 언급된 마우스를 포함하고, 그리고 "인간 Ig 마우스"로 여기서 집합적으로 언급되어 진다.
HuMAb 마우스® (Medarex, Inc.)는 내재성 μ 및 κ 사슬 유전자좌들을 비활성화하는 타겟된 돌연변이와 함께 재배열되지 않은 인간 중사슬 (μ 및 γ) 및 κ 경사슬 이뮤노글로불린 시퀀스를 코드하는 인간 이뮤노글로불린 유전자의 미니 유전자좌를 포함한다 (즉, Lonberg, et al . (1994) Nature 368(6474): 856- 859 참고). 따라서, 마우스는 면역화반응에 반응하여 마우스 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내고, 도입된 인간 중 및 경사슬 전환유전자는 클래스 스윗칭 및 체세포돌연변이를 당하여 높은 친화성 인간 IgGκ 모노클로날을 발생한다(Lonberg, N. et al. (1994), supra ; reviewed in Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern . Rev . Immunol. 13: 65-93, 및 Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann . NY . Acad . Sci . 764:536-546 참고). HuMab 마우스의 제조 및 용도와 이들 마우스에 의해 수행된 게놈의 변이는 Taylor, L. et al . (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al . (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. et al . (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; 및 Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851의 문헌에 더 자세하게 기술되어 있으며, 이들의 모든 내용은 그 전체로서 레퍼런스에 의해 특징적으로 합체되어 진다. 더욱이, Lonberg 및 Kay의 U.S. 특허번호 Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 및 5,770,429; Surani 등의 U.S. 특허번호 No. 5,545,807; Lonberg 및 Kay의 PCT 공개공보 Nos. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 및 WO 99/45962,; 그리고 Korman 등의 PCT 공개공보 No. WO 01/14424 참고.
또 다른 실시형태에서, 본 개시사항의 인간 항체는 인간 중사슬 전환유전자 및 인간 경사슬 전환염색체를 담지하는 마우스와 같이 전환유전자 및 전환염색체 상에 인간 이뮤노글로불린 시퀀스를 가지고 있는 마우스를 사용하여 변조되어 질 수 있다. 여기서는 "KM 마우스®"로 언급되는 이런 마우스는 Ishida 등의 PCT 공개공보 WO 02/43478에 자세하게 기술되어 있다.
더 더욱이, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 전환유전자의 동물계가 이 분야에서 이용될 수 있고, 그리고 본 개시사항의 항-O8E 항체를 상승하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스 (Abgenix, Inc.)로 언급된 대안적인 전환유전자의 시스템이 사용될 수 있고; 이러한 마우스는, 예를 들어 Kucherlapati 등의 U.S. 특허번호 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 및 6,162,963에 기술되어 있다.
더욱이, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 전환염색체의 동물계가 이 분야에서 이용될 수 있고 그리고 본 개시사항의 항-O8E 항체를 상승하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"로 언급된 인간 중사슬 전환염색체 및 인간 경사슬 전환염색체 양자를 담지한 마우스가 사용될 수 있고; 이러한 마우스는, Tomizuka et al (2000) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 97:722-727에 기술 되어 있다. 더욱이, 인간 중사슬 및 인간 경사슬 전환염색체를 담지한 카우는 이 기술분야에 기술되어 있고(Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) 그리고 본 개시사항의 항-O8E 항체를 상승하기 위하여 사용될 수 있다.
본 개시사항의 인간 모노클로날 항체는 또한 인간 이뮤노글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파아지 디스프레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체를 분리하기 위한 이러한 파아지 디스프레이 방법은 이 기술분야에 확립되어 있다. 예를 들어, Ladner 등의 U.S. 특허번호 5,223,409; 5,403,484; 및 5,571,698; Dower 등의 U.S. 특허번호 5,427,908 및 5,580,717; McCafferty 등의 U.S. 특허번호 5,969,108 및 6,172,197; 그리고 Griffiths 등의 U.S. 특허번호 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 및 6,593,081 참고.
본 개시사항의 인간 모노클로날 항체는 또한 인간 항체 반응이 면역화반응으로 발생될 수 있도록 인간 면역 세포가 그 안에 재구성되어 진 SCID 마우스를 사용하여 제조되어 질 수 있다. 이러한 마우스는 예를 들어 Wilson 등의 U.S. 특허번호 5,476,996 및 5,698,767에 기술되어 있다.
인간 Ig 마우스의 면역화반응
인간 Ig 마우스가 본 개시사항의 인간 항체를 상승하기 위해 사용될 때, 이러한 마우스는, Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al . (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; 그리고 PCT 공개공보 WO 98/24884 및 WO 01/14424에 기술된 바와 같이 O8E 항원 및/또는 재조합 O8E, 또는 O8E 용융 단백질의 정제된 또는 인리치 제제인, O8E-발현 셀 라인으로 면역화될 수 있다. 전형적으로는, 마우스는 제 일차 면역화반응 후 6-16 주령의 것일 것이다. 예를 들어, O8E 항체의 정제되거나 또는 재조합된 제제(5-50 μg)가 복강 내로 인간 Ig 마우스를 면역화하기 위해 사용될 수 있다.
O8E에 대한 완전하게 인간 모노클로날 항체를 발생하기 위한 상세한 과정은 아래 실시예 1에 기술되어 있다. 다양한 항원으로의 누적적 경험은, 불완전 프로인드 어쥬번트에 항원으로 매 격주로 IP 면역화(전체 여섯 번 까지)에 따른 완전 프로인드 어쥬번트에 항원으로 복강 내로 최초로 면역화될 때 형질전환 마우스가 반응하는 것을 보여준다. 그러나, 프로인드 외에 다른 어쥬번트가 또한 유효한 것으로 알려져 있다. 부가하여, 어쥬번트가 없는 전 세포가 고도로 면역성인 것으로 알려져 있다. 면역 반응은, 예를 들어 리트로오비탈의 출혈에 의해 얻어지는 플라즈마 샘플로 면역화 프로토콜의 경로 상에서 모니터될 수 있다. 이 플라즈마는 ELISA에 의해 선별될 수 있고 그리고 충분한 역가의 항-O8E 인간 이뮤노글로불린을 갖는 마우스가 용융을 위해 사용될 수 있다(실시예 1에 기술된 바와 같음). 마우스는 희생되고 지라를 제거하기 3일 전 정맥주사로 항원으로 부양되어 질 수 있다. 각 면역화반응에 대해 2-3 용융이 수행되어 지는 것이 필요할 수 있다고 추측된다. 6 내지 24 마우스가 각 항원에 대해 전형적으로 면역화된다. 통상적으로 HCo7 및 HCol2 스트레인 양자가 사용된다. 부가하여, HCo7 및 HCol2 전환유전자 양자가 두 개의 다른 인간 중사슬 전환유전자(HCo7/HCol2)를 갖는 단일 마우스 내로 함께 증식되어 질 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, KM 마우스® 스트레인이 PCT 공개공보 WO 02/43478에 기술된 바와 같이 사용되어 질 수 있다.
본 개시사항의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 발생
본 개시사항의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 발생하기 위하여, 면역된 마우스로부터의 지라세포 및/또는 림프절 세포가 분리될 수 있고 그리고 마우스 미엘로마 셀 라인과 같은 적절한 불멸화된 셀 라인에 용융될 수 있다. 얻어진 하이브리도마는 항원-특이적 항체의 생산을 위해 선별될 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터 지라 림프구의 단일 세포 현탁액은 50% PEG로 Sp2/0 비분비 마우스 미엘로마 세포(ATCC, CRL 1581)의 삼분의 일의 수로 용융될 수 있다. 대안적으로, 면역화된 마우스로부터 지라 림프구의 단일 세포 현탁액은, 사이토 플러스 라지 챔버 셀 퓨젼 일렉트로포레이터(Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD)를 사용하여, 전자용융 방법에 기초한 전기장을 사용하여 Sp2/0 마우스 미엘로마 세포의 동일 수로 용융될 수 있다. 세포는 10% 송아지 혈청(Hyclone, Logan, UT), 10% P388DI (ATCC, CRL TIB-63) 조건부 배지, DMEM (Mediatech, CRL 10013, 고농도 글루코스, L-글루타민 및 소디움 피부레이트 포함) 내에 3-5% 오리젠 (IGEN) 플러스 5mM HEPES, 0.055 mM 2-머캅토에탄올, 50mg/ml 겐타마이신 및 1X HAT (Sigma, CRL P-7185)를 포함하는 선택 배지에서 2주 동안 배양되어 진 후 평판 바닥 마이크로타이터 플레이트에 대략 1 x 105로 이식되어 진다. 대략 1-2주 후, 세포는 HAT가 HT로 대체된 배지에 배양되어 질 수 있다. 각각의 웰은 그런 다음 인간 모노클로날 IgM 및 IgG 항체에 대하여 ELISA 또는 FACS에 의해 선별되어 질 수 있다. 양성 클론은 그런 다음 FACS에 의해, 예를 들어 CHO-O8E 형질전환 세포 같은 O8E 발현 세포 상에 또는 ELISA에 의해 O8E 재조합 단백질 상에서 O8E 양성 항체에 대해 선별되어 질 수 있다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 일어나면, 배지는 통상적으로 10-14일 후에 관찰되어 질 수 있다. 항체 분비 하이브리도마는 재이식될 수 있고 다시 스크린될 수 있으며, 그리고 만일 여전히 인간 IgG에 대해 양성적이라면, 모노클로날 항체는 희석을 제한함에 의해 적어도 두 번 서브클론될 수 있다. 안정한 서브클론은 그런 다음 소량의 항체를 특징화를 위해 조직 배양 배지에서 발생하기 위해 생체 외에서 배양될 수 있다.
인간 모노클로날 항체를 정제하기 위하여, 선택된 하이브리도마가 2-리터의 스피너-플라스크에서 모노클로날 항체 정제를 위하여 성장되어 질 수 있다. 상등액은 단백질 A-세파로스(Pharmacia, Piscataway, NJ.)로 어피니티 크로마토그라피 수행 전에 여과되고 농축되어 질 수 있다. 용리된 IgG는 순도를 공고하게 하기 위해 겔 일렉트로포르시스 및 고성능액체크로마토그라피에 의해 체크되어 질 수 있다. 완충액 용액은 PBS로 교체될 수 있으며 그리고 농축이 1.43 흡광계수를 이용하여 OD 280에 의해 측정되어 질 수 있다. 모노클로날 항체는 적량으로 분할되어 -80℃에서 저장될 수 있다.
본 개시사항의 모노클로날 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 발생
본 개시사항의 항체는 또한 예를 들어, 이 기술 분야에서 잘 알려진 바와 같은 재조합 DNA 기술 및 유전자 트랜스펙션 방법의 조합을 사용하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산되어 질 수 있다(즉, Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).
예를 들어, 항체 또는 이들의 항체 분획을 발현하기 위하여, 부분적 또는 전-길이 경 및 중사슬을 코드하는 DNAs가 표준 분자생물학 기술(즉, 흥미대상 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용하여 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝)을 사용하여 얻어질 수 있고, 그리고 유전자가 복제의 및 전사의 제어 시퀀스에 조작적으로 연결되어 지도록 DNAs가 발현 벡터 내에 삽입되어 질 수 있다. 본 내용에서 용어 "조작적으로 연결"은 벡터 내의 복제의 및 전사의 제어 시퀀스가 항체 유전자의 복제 및 전사를 조절하는 이들의 의도된 기능으로 작용하도록 항체 유전자가 벡터 내에 결찰되어 지는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 발현 벡터 및 발현 조절 시퀀스는 사용된 발현 숙주 세포에 필적할 수 있는 것으로 선택된다. 항체 경사슬 유전자 및 항체 중사슬 유전자는 별도의 벡터 내로 삽입되어 질 수 있거나 또는 보다 전형적으로는 양 유전자가 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법(즉, 항체 유전자 분획 및 벡터 상에 상보적 제한 사이트의 결찰, 또는 만일 제한사이트가 존재하지 않으면 블룬트 말단 결찰)에 의해 발현 벡터 내로 삽입된다. 여기에 기술된 항체의 경 및 중사슬 가변 영역들이, VH 분절이 벡터 내에서 CH 분절에 조작적으로 연결되고 VK 분절은 벡터 내에서 CL 분절에 조작적으로 연결되도록 바람직한 아이소타입의 중사슬 불변 및 경사슬 불변 영역들을 이미 코드하는 발현 벡터 내에 이들을 삽입함에 의해 어떤 항체 아이소타입의 전-길이 항체 유전자를 제작하기 위하여 사용되어 질 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터가 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 용이하게 하는 시그날 펩티드를 코드할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 시그날 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 골격-내로 연결되도록 벡터 내에 클론될 수 있다. 시그날 펩티드는 이뮤노글로불린 시그날 펩티드이거나 또는 이형성 시그날 펩티드(즉, 비-이뮤노글로불린 단백질로부터의 시그날 펩티드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자에 부가하여, 본 개시사항의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 조절하는 조절 시퀀스를 담지한다. 용어 "조절 시퀀스"는 항체 사슬 유전자의 복제 또는 전사를 조절하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소(즉, 폴리아데닐화 시그날)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 시퀀스는, 예를 들어 Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))에 기술되어 있다. 조절 시퀀스의 분비를 포함하는 발현 벡터의 디자인은 형질전환되어지는 숙주 세포의 선택, 소망하는 단백질의 발현 준위 등과 같은 인자에 의존할 수 있다는 것은 이 분야의 통상인에 의해 인지될 수 있는 것일 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현에 대한 바람직한 조절 시퀀스는 사이토메가바이러스(CMV), 시미안 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스(즉, 아데노바이러스 메이저 레이트 프로모터(AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서와 같은 포유동물의 세포에서 고준위의 단백질 발현을 하는 바이러스의 요소를 포함한다. 대안적으로, 유비퀴틴 프로모터나 β-글로빈 프로모터와 같은 비바이러스의 조절 시퀀스가 사용될 수 있다. 더 더욱이, 조절 요소는 SRa 프로모터 시스템과 같은 다른 근원으로부터의 시퀀스로 구성되고, 이것은 SV40 어얼리 프로모터 및 인간 T 세포 류케미아 바이러스 타입 1의 긴 말단 반복으로부터 시퀀스를 포함한다 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol . Cell . Biol. 8:466-472).
항체 사슬 유전자 및 조절 시퀀스에 부가하여, 본 개시사항의 재조합 발현 벡터는 숙주세포(즉, 복제의 근원)에서 벡터의 복제와 선택할 수 있는 마커 유전자를 조절하는 시퀀스와 같은 부가적인 시퀀스를 담지할 수 있다. 선택할 수 있는 마커 유전자는 벡터가 도입되어 지는 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다(즉, Axel 등에 의한 U.S. 특허번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017). 예를 들어, 전형적으로 선택할 수 있는 마커 유전자는 벡터가 도입되어 지는 숙주세포 상에 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 저항성을 부여한다. 바람직한 선택할 수 있는 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선택/증폭으로 dhfr-숙주 세포에서 사용하기 위한 것) 및 네오 유전자 (G418 선택을 위한 것임)를 포함한다.
경 및 중사슬의 발현을 위하여, 경 및 중사슬을 코드하는 발현 벡터(들)은 표준 기술에 의하여 숙주 세포 내로 트랜스펙트된다. 용어 "트랜스펙션"의 다양한 형태는 원핵생물 또는 진핵생물의 숙주 세포 내로 외래성 DNA의 도입, 즉 전기천공법, 칼슘-포스페이트 침전법, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 등을 위해 공통적으로 사용되는 광범위한 기술을 포괄하는 것으로 의도된다. 비록 원핵생물 뿐 아니라 진핵생물 숙주 세포에 본 개시사항의 항체를 발현하는 것이 이론적으로는 가능하기만, 진핵생물 세포 및 가장 전형적으로는 포유동물 숙주 세포에 항체의 발현이 가장 바람직한데, 이는 이러한 진핵생물 세포 및 특히 포유동물 세포가 적절하게 폴드되고 면역학적으로 활성인 항체를 조합하고 분비하는 것이 원핵 세포보다 보다 쉽기 때문이다. 항체 유전자의 원핵 생물 발현이 활성인 항체의 고 수율의 생산에 비효율적인 것으로 보고되어 있다 (Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).
본 개시사항의 재조합 항체를 발현하는 바람직한 포유동물의 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포)(Urlaub and Chasin, (1980) Proc . Natl . Acad . ScL USA 77:4216-4220에 기술되고, DHFR 선택가능한 마커, 즉 R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol . Biol . 755:601-621에 기술된 것 같은 것으로 사용된 dhfr-CHO 세포를 포함함), NSO 미엘로마 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 미엘로마 세포로 사용하기 위한, 다른 바람직한 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 코드하는 재조합 발현 벡터가 포유동물의 숙주 세포 안으로 도입되어 질 때, 항체는 숙주 세포에 항체의 발현, 보다 전형적으로는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 안으로 항체의 분비를 허용하기에 충분한 시간의 기간 동안 숙주 세포를 배양함에 의해 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하는 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
항원에 결합하는 항체의 특징
본 개시사항의 항체는, 예를 들어 세포유동분석법에 의해 O8E에 결합에 대해 시험되어 질 수 있다. 간략하게는, O8E-발현 세포는 준비된 조직 배양 플라스크 및 단일 세포 현탁액으로부터 프레쉬하게 수확된다. O8E-발현 세포 현탁액은 프라이머리 항체로 직접적으로 염색되거나 또는 PBS 내에 1% 파라포름알데하이드로 고정 후 염색된다. 대략 일백만 개 세포가 0.5% BSA 및 50-200 μg/ml의 프라이머리 항체를 포함하는 PBS에 재현탁되어 지고 그리고 30분 동안 얼음에서 배양되어 진다. 세포는 0.1% BSA, 0.01% NaN3를 포함하는 PBS로 수세되고, 그리고 100 μl의 1:100 희석된 FITC-컨쥬게이트된 고트-항-인간 IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)에 재현탁되어 지고 그리고 부가적으로 30분 동안 얼음에서 배양되어 진다. 세포는 다시 두 번 수세되고, 그리고 0.5 ml의 수세 완충액에 재현탁되어 지고 그리고 FACS캘리버 사이토메터 (Becton-Dickinson, San Jose, CA) 상에서 형광염색되어 분석되어 진다.
대안적으로, 본 개시사항의 항체는 표준 ELISA에 의해 O8E에 결합에 대해 시험되어 질 수 있다. 간략하게는, 마이크로타이터 플레이트가 PBS 내에 0.25 μg/ml로 정제된 O8E로 도포되어지고 그런 다음 PBS 내에 5% 송아지 혈청 알부민으로 차단되어 진다. 항체의 희석(즉, 08E-면역화된 마우스로부터의 프라즈마의 희석)이 각 웰에 부가되고 37℃에서 1-2 시간 동안 배양되어 진다. 플레이트는 PBS/트윈으로 수세되고 그런 다음 알카린 포스파타제에 컨쥬게이트된 제이의 시약(즉, 인간 항체에 대해서는, 염소-항-인간 IgG Fc-특이적 폴리크로날 시약)으로 37℃에서 1 시간 동안 배양되어 진다. 수세 후, 플레이트는 pNPP 기질 (1 mg/ml)로 전개되고, 그리고 405-650의 OD에서 분석된다. 전형적으로는, 가장 높은 역가를 전개하는 마우스가 용융을 위해 사용될 것이다.
여기서 기술된 ELISA 또는 FACS 분석법은 또한 O8E 면역원으로 양성적인 반응성을 보이는 하이브리도마에 대한 선별을 하기 위해 사용되어 질 수 있다. O8E에 대해 높은 항원항체결합력으로 결합하는 하이브리도마가 서브클론되고 더욱이 특징화된다. 모체 세포의 반응성을 보유하는(ELISA 또는 FACS에 의해) 각 하이브리도마로부터의 일 클론이 -140℃에서 저장된 5-10 바이알 세포 은행을 만들기 위해 그리고 항체 정제를 위해 선택되어 질 수 있다.
항-O8E 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마는 모노클로날 항체 정제를 위해 2-리터의 스피너-프라스크에서 성장되어 질 수 있다. 상등액은 단백질 A-세파로스(Pharmacia, Piscataway, NJ.)로 어피니티 크로마토그라피 수행 전에 여과되고 농축되어 질 수 있다. 용리된 IgG는 순도를 확실하게 하기 위해 겔 일렉트로포르시스 및 고성능액체크로마토그라피에 의해 체크되어 질 수 있다. 버퍼 용액은 PBS로 교체될 수 있으며 그리고 농축이 1.43 흡광계수를 이용하여 OD 280에 의해 결정되어 질 수 있다. 모노클로날 항체는 나누어 -80℃에서 저장될 수 있다.
선택된 항-O8E 모노클로날 항체가 유일한 항원결정인자에 결합하는가를 결정하기 위해, 각 항체가 상업적으로 이용할 수 있는 시약(Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 바이티닐화될 수 있다. 비표지된 모노클로날 항체 및 바이오티닐화된 모노클로날 항체를 사용한 경쟁성 연구가 상술한 바와 같은 O8E 도포-ELISA 플레이트를 사용하여 수행될 수 있다. 바이오티닐화된 mAb 결합은 스트렙-아비딘-알카린 포스파타제 프로브로 검지되어 질 수 있다. 부가적으로, 경쟁성 연구가 방사선 표지 항체를 사용하여 수행될 수 있고 그리고 비표지된 경쟁 항체는 아래 실시예에서 보다 자세하게 기술하고 있는 바와 같이, Scatchard 분석법으로 검출될 수 있다.
정제된 항체의 아이소타입을 결정하기 위해, 아이소타입 ELISA가 특정한 아이소타입의 항체에 대해 특이적인 시약을 사용하여 수행되어 질 수 있다. 예를 들어, 인간 모노클로날 항체의 아이소타입을 결정하기 위해, 마이크로타이터 플레이터의 웰이 4℃에서 밤 세워 1 μg/ml의 항-인간 이뮤노글로불린으로 도포되어 질 수 있다. 1% BSA로 블럭킹 후, 플레이트는 1 내지 2시간 동안 대류 온도에서 1 μg /ml 또는 그 이하의 시험 모노클로날 항체 또는 정제된 아이소타입 대조군으로 반응된다. 웰은 그런 다음 인간 IgGl 뿐 아니라 인간 IgM-특정 알카린 포스파타제-컨쥬게이트된 프로브와 반응되어 질 수 있다. 플레이트는 상술한 바와 같이 전개되어 지고 분석된다.
항-O8E 인간 IgGs는 웨스턴 블럿팅에 의하여 O8E 항원과 반응성에 대하여 더 시험되어 질 수 있다. 간단하게는, O8E가 준비되어 질 수 있고 그리고 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 일렉트로포르시스되어 질 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원은 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전이되고, 10% 송아지 태반 혈청으로 차단되고 그리고 시험된 모노클로날 항체로 탐지된다. 인간 IgG 결합은 항-인간 IgG 알카린 포스파타제를 사용하여 검지되어 질 수 있고 BCIP/NBT 기질 타블렛(Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.)으로 전개될 수 있다.
항체 물리적 특성
본 개시사항의 항체는 더욱이 항-O8E 항체의 다양한 물리적 특성에 의해 더욱더 특징지어 질 수 있다. 이들 물리적 특성에 기하여 항체의 다른 클라스를 검출하고 및/또는 분화하기 위해 다양한 어세이가 사용될 수 있다.
어떤 실시형태에서, 본 개시사항의 항체는 경 또는 중사슬 가변 영역 내에 하나 또는 그 이상의 글리코실화반응 사이트를 포함할 수 있다. 가변 영역 내에 하나 또는 그 이상의 글리코실화반응 사이트의 존재는 변형된 항원 결합에 기한 항체의 pK의 변형 또는 항체의 증가된 면역원성을 초래할 수 있을 것이다 (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA and Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099- 109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7: Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706). 글리코실화반응은 N-X-S/T 시퀀스를 포함하는 모티프에서 일어나는 것이 알려져 있다. 가변 영역 글리코실화반응은 Fab를 생산하는 항체를 단리하는 글리코블럿(Glycoblot) 어세이를 사용하여 시험되어 질 수 있고, 그런 다음 과옥소산염 산화 및 시프 염기 형성을 측정하는 어세이를 사용하여 글리코실화반응에 대해 시험한다. 대안적으로, 가변 영역 글리코실화반응은 Fab로부터 당류를 단당류로 단리하고 개개의 당류 함량을 분석하는 디오넥스 라이트 크로마토그라피(Dionex-LC)를 사용하여 시험되어 질 수 있다. 어떤 경우에는, 가변 영역 글리코실화반응을 포함하지 않는 항-O8E 항체를 갖는 것이 바람직하다. 이것은 가변 영역에 글리코실화반응 모티프를 포함하지 않는 항체를 선택함에 의해 또는 이 기술 분야에 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 글리코실화반응 모티프 내의 잔기를 변이함에 의해 달성되어 질 수 있다.
바람직한 실시형태에서는, 본 개시사항의 항체는 아스파라긴 아이소머리즘 사이트를 포함하지 않는다. 탈아미드화 또는 이소아스파르트산 효과가 각각 N-G 또는 D-G 시퀀스 상에서 일어날 수 있을 것이다. 탈아미드화 또는 이소아스파르트산 효과는 주 사슬 보다는 곁 사슬 카르복시 말단을 비꼬는 구조로 함에 의해 항체의 안전성을 감소하는 아스파르트산의 창제를 초래한다. 아스파르트산의 창제는 아스파르트산에 대한 시험을 위해 역상 HPLC를 사용하는 이소-퀀트 어세이를 사용하여 측정되어 질 수 있다.
각 항체는 유일한 등전점(pI)을 가질 것이지만, 일반적으로 항체는 6 내지 9.5 사이의 pH 범위로 될 것이다. IgGl 항체에 대한 pI는 전형적으로 7 내지 9.5 사이의 pH 범위로 될 것이고, IgG4 항체에 대한 pI는 전형적으로 6 내지 8 사이의 pH 범위로 될 것이다. 항체는 이 범위 외로 되는 pI를 가질 것이다. 비록 효과가 일반적으로 알려지지는 않았지만, 정상 범위 외의 pI를 갖는 항체는 약간의 접혀지지 않고 생체 내의 조건에서 불안정성을 가질 수 있다는 고려가 있다. 등전점은 pH 기울기를 만들고 증진된 정확성을 위해 레이저 포커싱을 이용할 수 있는 캐필러리 이소일렉트릭 포커싱 어세이를 사용하여 시험되어 질 수 있다 (Janini et al (2002) Electrophoresis 23:1605-11; Ma et al. (2001) Chromatographia 53:S75-89; Hunt et al (1998) J Chromatogr A 800:355-67). 어떤 경우에는, 정상 범위로 되는 pI 값을 포함하는 항-O8E 항체를 갖는 것이 바람직하다. 이것은 정상 범위로 되는 pI를 갖는 항체를 선택함에 의하거나 또는 이 기술분야에 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 하전된 표면 잔기를 변이함에 의해 달성될 수 있다.
각 항체는 열적 안정성을 나타내는 용융 온도를 가질 것이다 (Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). 보다 높은 열적 안정성이 생체 내에서 보다 큰 전체 항체 안정성을 나타낸다. 항체의 용융점은 분화적 스캐닝 칼로리메트리를 사용하여 측정되어 질 수 있다 (Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52). TM1은 항체의 초기 비접힘의 온도를 나타낸다. TM2는 항체의 완전 비접힘의 온도를 나타낸다. 일반적으로, 본 개시사항의 항체의 TM1은 60℃ 보다 크고, 바람직하기로는 65℃ 보다 크며, 더욱 바람직하기로는 70℃ 보다 큰 것이 바람직하다. 대안적으로, 항체의 열적 안정성은 원편광 이색성 분광분석을 사용하여 측정될 수 있다 (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).
바람직한 실시형태에서, 급속하게 분해되지 않는 항체가 선택되어 진다. 항-O8E 항체의 분획화는 이 기술분야에서 잘 이해되어 진 것과 같은 캐필러리 일렉트로포르시스 (CE) 및 MALDI-MS를 사용하여 측정되어 질 수 있다 (Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).
다른 바람직한 실시형태에서, 최소한의 응집효과를 가지는 항체가 선택된다. 응집은 원하지 않는 면역 반응 및/또는 변형되거나 바람직하지 않은 약리운동학적 특성을 촉발할 수 있다. 일반적으로 25% 또는 그 이하, 바람직하기로는 20% 또는 그 이하, 보다 바람직하기로는 15% 또는 그 이하, 더 보다 바람직하기로는 10% 또는 그 이하 그리고 더 더욱 보다 바람직하기로는 5% 또는 그 이하의 응집을 갖는 항체가 허용가능할 수 있다. 응집은 사이즈-엑스클루젼 컬럼 (SEC) 고수행성 액체 크로마토그라피(HPLC), 및 단량체, 이량체, 삼량체 또는 다량체를 동정하기 위한 광산란을 포함하는 이 기술분야에서 잘 알려진 몇 가지의 기술에 의하여 측정될 수 있다.
면역컨쥬게이트
또 다른 측면에서, 본 개시사항은 세포독소, 약물(즉, 면역억제제) 또는 방사성 독물과 같은 치료적인 부분에 컨쥬게이트된 항-O8E 항체 또는 이들의 분획으로 특징된다. 이러한 컨쥬게이트들은 여기에서는 "면역컨쥬게이트"로 언급되어 진다. 하나 또는 그 이상의 세포독소를 포함하는 면역컨쥬게이트는 "면역독소"로 언급된다. 세포독소 또는 세포독소 제제는 세포에 해로운(즉, 죽이는) 제제를 포함한다. 이 예들은 택솔, 시토찰라신 B, 글라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-디하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로케인, 테트라케인, 리도케인, 프로프라노롤 및 퓨로마이신 그리고 이들의 유사화합물들을 포함한다. 치료적 제제는 또한 예를 들어, 항대사산물들(즉, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 디카바진), 알킬화 제제(즉, 메클로르에탄, 티오에파 클로르앰뷰실, 멜파란, 카르뮤스틴 (BSNU)과 로뮤스틴 (CCNU), 시클로토스파미드, 뷰술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 cis-디클로로디아민 플레티늄 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린류(즉, 다우노루비신 (이전의 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제류 (즉, 댁티노마이신 (이전의 액티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신과 안트라마이신(AMC)), 및 세포분열 저지성 제제(즉, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함한다.
본 개시사항의 항체에 컨쥬게이트될 수 있는 치료적 세포독소의 다른 바람직한 예는 듀오카르마이신, 칼리케아미신, 메이탄신 및 아우리스타틴과 이들의 유도체를 포함한다. 칼리케아미신 항체 컨쥬게이트의 예는 상업적으로 이용할 수 있다 (Mylotarg™; Wyeth-Ayerst).
세포독소는 이 기술 분야에서 이용할 수 있는 링커 기술을 사용하여 본 개시사항의 항체에 컨쥬게이트될 수 있다. 항체에 세포독소를 컨쥬게이트하기 위해 사용되어 지는 링커 타입의 예는 여기에 한정되는 것은 아니지만 하이드라존, 티오에테르, 에스테르, 디설파이드 및 펩티드-함유 링커를 포함한다. 링커로는 예를 들어 리소솜 구획 내에서 낮은 pH에 의한 단리에 민감하거나 또는 카테프신(즉, 카테프신 B, C, D)와 같은 종양 조직에 우세하게 발현된 프로테아제와 같은 프로테아제에 의한 단리에 민감한 것이 선택될 수 있다.
세포독소 타입, 항체에 치료적 제제를 컨쥬게이트하는 링커 및 방법의 부가적인 논의에 대해서는 또한 다음을 참고한다: Saito, G. et al. (2003) Adv . Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol . Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat . Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr . Opin . Imestig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, CJ. (200Y) Adv . DrugDeliv. Rev. 53:247-264.
본 개시사항의 항체는, 또한 방사면역컨쥬게이트로 언급될 수 있는 세포독소적 방사성 의약품을 생산하기 위해 또한 방사성 동위원소에 컨쥬게이트 될 수 있다. 진단학적으로 또는 치료학적으로 사용하기 위하여 항체에 컨쥬게이트될 수 있는 방사성 동위원소의 예는 여기에 한정되는 것은 아니지만, 요오딘131, 인듐111, 이트리움9 0 및 루테티움177을 포함한다. 방사면역컨쥬게이트를 제조하는 방법은 이 기술 분야에 확립되어 있다. 방사면역컨쥬게이트의 예는 제발린™ (IDEC Pharmaceuticals) 및 벡사르™ (Corixa Pharmaceuticals)을 포함하는 상업적으로 이용할 수 있는 것이고, 그리고 유사한 방법이 본 개시사항의 항체를 사용하여 방사면역컨쥬게이트를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시사항의 항체 컨쥬게이트는 주어진 생물학적 반응을 변형하기 위해 사용될 수 있고, 그리고 약물 부분은 고전적인 화학적 치료제에 한정된 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 약물 부분은 원하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 엑소톡신 또는 디프테리아 독소와 같은 효소학적으로 활성인 독소 또는 이들의 활성 분획; 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ와 같은 단백질; 또는 예를 들어, 림포카인, 인터류이킨-1 ("IL-I"), 인터류이킨-2 ("IL-2"), 인터류이킨-6 ("IL-6"), 그래뉼로사이트 매크로파이지 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 그래뉼로사이트 콜로니 자극 인자("G-CSF") 또는 다른 성장 인자와 같은 생물학적 반응 개사자를 포함한다.
항체에 이러한 치료적 부분을 컨쥬게이트하기 위한 기술은 잘 알려져 있다. 다음 참고; 즉, Arnon et al, "Monocronal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," in Monocronal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al, "Antibodies For Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monocronal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," in Monocronal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al . (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe et al, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates," Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).
비스페시픽 분자
또 다른 측면에서, 본 개시사항은 본 개시사항의 항-O8E 항체 또는 이들의 분획을 포함하는 비스페시픽 분자에 특징이 있다. 본 개시사항의 항체 또는 이들의 항체 결합 부분은 다른 기능적 분자, 즉 적어도 두 개의 다른 결합 사이트 또는 타겟 분자에 결합하는 비스페시픽 분자를 발생하기 위한 또 다른 펩티드 또는 단백질(즉, 다른 항체 또는 리셉터용 리간드)로 유도되어 지거나 또는 링커되어 질 수 있다. 본 개시사항의 항체는 사실 두 개 이상의 다른 결합 사이트 및/또는 타겟 분자에 결합하는 멀티스페시픽 분자를 발생하기 위한 하나 이상의 다른 기능적 분자로 유도되어 지거나 또는 링커되어 질 수 있고; 이러한 멀티스페시픽 분자는 또한 여기서 사용된 것으로 용어 "비스페시픽 분자"에 의해 포괄되어 지는 것으로 의도된다. 본 개시사항의 비스페시픽 분자를 만들기 위해, 본 개시사항의 항체가, 비스페시픽 분자를 초래하도록, 다른 항체, 항체 분획, 펩티드 또는 결합 의태물과 같은 하나 또는 그 이상의 다른 결합 분자에 기능적으로 연결(즉, 화학적 커플링, 유전적 용융, 비공유결합적 연계 등등)되어 질 수 있다.
따라서, 본 개시사항은 적어도 하나의 O8E에 대한 제일 결합 특이성 및 제이 타겟 항원결정인자에 대한 제이 결합 특이성을 포함하는 비스페시픽 분자를 포함한다. 본 개시사항의 특정한 실시형태에서, 제이 타겟 항원결정인자는 Fc 리셉터, 즉, 인간 FcγRI(CD64) 또는 인간 Fcα 리셉터(CD89)이다. 따라서, 본 개시사항은 FcγR 또는 FcαR 발현 이펙터 세포 (즉, 모노사이트, 매크로파아지 또는 다형핵백혈구 세포(PMNs)) 및 타겟 세포 발현 O8E 양자에 결합할 수 있는 비스페시픽 분자를 포함한다. 이들 비스페시픽 분자는 이펙터 세포에 O8E 발현 세포를 타겟으로 하고 그리고 O8E 발현 세포의 식세포작용, 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 사이토톡신 방출 또는 초산화물 음이온의 발생과 같은 Fc 리셉터-매개 이펙터 세포 활성을 촉발한다.
비스페시픽 분자가 멀티스페시픽인 본 개시사항의 일 실시형태에서, 분자는 더욱이 항-Fc 결합 특이성 및 항-O8E 결합 특이성에 부가하여 제삼 결합 특이성을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 이 제삼 결합 특이성은 항-증진 인자(EF) 부분, 즉 세포 독성 활성에 포함된 표면 단백질에 결합하고 그리고 이에 의해 타겟 세포에 대하여 면역 반응을 증진하는 분자이다. "항-증진 인자 부분"은 주어진 분자, 즉 항원 또는 리셉터에 결합하고, 이에 의해 Fc 리셉터 또는 타겟 세포 항원에 대한 결합 결정소의 효과의 증진을 초래하는 항체, 기능적 항체 분획 또는 리간드일 수 있다. "항-증진 인자 부분"은 Fc 리셉터 또는 타겟 세포 항원을 결합할 수 있다. 대안적으로, 항-증진 인자 부분은 제일 및 제이 결합 특이성들이 결합하는 실체와 다른 실체에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항-증진 인자 부분은 세포독성 T-세포에 결합할 수 있다(즉, 타겟 세포에 대해 증가된 면역 반응을 초래하는 CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 또는 다른 면역 세포를 통해).
일 실시형태에 있어서, 본 개시사항의 비스페시픽 분자는 결합 특이성으로 즉, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단일 사슬 Fv를 포함하는 적어도 하나의 항체, 또는 이들의 항체 분획을 포함한다. 항체는 또한 Ladner et al.의 U.S. 특허번호 4,946,778에 기술된 바와 같이 Fv 또는 단일 사슬 컨스트럭트와 같은 경사슬 또는 중사슬 이량체 또는 이들의 최소한의 분획일 수 있으며, 여기에 기술된 내용은 명백하게 레퍼런스로 합체된다.
일 실시형태에 있어서, Fcγ 리셉터에 대한 결합 특이성은 모노클로날 항체에 의하여 제공되어 지고, 이 결합은 인간 이뮤노글로불린 G (IgG)에 의해 차단되지 않는다. 여기에 사용된 것으로, 용어 "IgG 리셉터"는 크로모솜 1 상에 위치된 여덟의 γ-사슬 유전자의 하나를 언급한다. 이들 유전자는 세 개의 Fcγ 리셉터 클래스: FcγRI (CD64), FcγRII(CD32), 및 FcγRIII (CD16)로 분류된 전체 12의 트랜스멤브레인 또는 가용성 리셉터 이성형을 코드한다. 일 바람직한 실시형태에 있어서, Fcγ 리셉터는 인간 고 친화성 FcγRI이다. 인간 FcγRI은 72 kDa 분자로, 모노머의 IgG에 대해 높은 친화도를 보인다(108 - 109M-1).
어떤 바람직한 항-Fcγ 모노클로날 항체의 생산 및 특징화는 Fanger 등에 의한 PCT 공개공보 WO 88/00052 및 U.S. 특허번호 4,954,617에 기술되어 있으며, 이 가르침은 여기에 레퍼런스로 완전히 합체된다. 이들 항체는 리셉터의 Fcγ 결합 사이트로부터 뚜렷이 다른 사이트에 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII의 항원결정인자에 결합하고 따라서 이들의 결합이 IgG의 물리학적 준위에 의해 실질적으로 차단되지 않는다. 본 개시사항에서 유용한 특이적 항-FcγRI 항체는 mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 및 mAb 197이다. mAb 32를 생산하는 하이브리도마는 American Type Culture Collection, ATCC Accession No. HB9469으로부터 이용할 수 있다. 일 다른 실시형태에 있어서, 항-Fcγ 리셉터 항체는 모노클로날 항체 22 (H22)의 인체적응된 형태이다. H22 항체의 생산 및 특성은 Graziano, R.F. et al. (1995,) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 및 PCT 공개공보 WO 94/10332에 기술되어 있다. H22 항체 생산 셀 라인은 American Type Culture Collection에 기탁번호 HA022CL1로 기탁되어 있으며, 수납번호 CRL 11177를 가진다.
다른 바람직한 실시형태에 있어서, Fc 리셉터에 대한 결합 특이성은 인간 IgA 리셉터에 결합하는 항체, 즉 Fc-알파 리셉터 (FcαRI (CD89))에 의하여 제공되고, 이의 결합은 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린 A (IgA)에 의하여 차단되지 않는다. 용어 "IgA 리셉터"는 크로모솜 19 상에 위치된 하나의 α-유전자 (FcαRI)의 유전자 생산을 포함하는 것을 의도한다. 이 유전자는 55 내지 110 kDa의 몇몇 대안적으로 스플라이스된 트랜스멤브레인 이형체를 코드하는 것이 알려져 있다. FcαRI (CD89)은 구조적으로 모노사이트/매크로파아지, 호산성의 및 호중구의 그래뉼로사이트 상에서 발현되어 지지만, 그러나 비-이펙터 세포 집단 상에서 발현되어 지지 않는다. FcαRI는 IgAl 및 IgA2 양자에 대해 중간의 친화도(≒ 5 x 107 M-1)를 가지고, G-CSF 또는 GM-CSF와 같은 시토킨에 노출에 의해 증가된다 (Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440). A3, A59, A62 및 A77로 동정되고, IgA 리간드 결합 도메인 외측으로 FcαRI를 결합하는 네 개의 FcαRI-특이적 모노클로날 항체가 기술되어 있다 (Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764).
FcαRI 및 FcγRI는 본 개시사항의 비스페시픽 분자에서 사용되기 위한 촉발 리셉터로 바람직한데, 이는 이들이 (1) 면역 이펙터 세포, 즉 모노사이트, PMNs, 매크로파아지 및 수지상 세포 상에서 일차적으로 발현되고; (2) 고준위(즉, 세포 당 5,000-100,000)로 발현되고; (3) 세포독성 활성의 매개자이고(즉, ADCC, 식세포작용); (4) 셀프-항원을 포함하여, 이들에 타겟된 항원의 증진된 항원 개시를 매개하기 때문이다.
비록 인간 모노클로날 항체가 바람직하지만, 본 개시사항의 비스페시픽 분자에서 채용될 수 있는 다른 항체, 즉 뮤어라인, 키메르 및 인체적응된 모노클로날 항체를 포함한다.
본 개시사항의 비스페시픽 분자는 이 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 구성분 결합 특이성, 즉 항-FcR 및 항-O8E 결합 특이성을 컨쥬게이트함에 의해 제조되어 질 수 있다. 예를 들어, 비스페시픽 분자의 각 결합 특이성은 별도로 발생되어 질 수 있고 그런 다음 각 다른 하나에 대해 컨쥬게이트되어 질 수 있다. 결합 특이성이 단백질이거나 펩티드일 때, 다양한 커플링 제제 또는 가교제가 공유결합 컨쥬게이트화를 위해 사용되어 질 수 있다. 가교제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-석신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 및 술포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-l-카르복실레이트 (sulfo-SMCC)를 포함한다 (즉, Karpovsky et al. (1984) J. Exp . Med.160:1686; Liu, MA et al (1985) Proc . Natl . Acad . ScL USA 82:8648). 다른 방법은 Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83) 및 Glennie et al. (1987) J Immumol. 139: 2367-2375에 기술된 것들을 포함한다. 바람직한 컨쥬게이트화 제제는 SATA 및 sulfo-SMCC로, 양자는 Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)로부터 이용할 수 있다.
결합 특이성이 항체일 때, 이들은 두 중사슬의 C-말단 힌지 영역의 설프하이드릴 결합을 통해 컨쥬게이트될 수 있다. 특히 바람직한 실시형태에서, 힌지 영역은 기수의 설프하이드릴 잔기, 전형적으로는 컨쥬게이션 전에 이것을 포함하도록 변이되어 진다.
대안적으로, 양 결합특이성은 동일한 벡터에 코드되어 질 수 있고 그리고 동일한 숙주세포에 발현되고 조립되어 질 수 있다. 이 방법은 특히 비스페시픽 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 용융 단백질인 경우 유용하다. 본 개시사항의 비스페시픽 분자는 하나의 단일 사슬 항체 및 결합 결정소를 포함하는 단일 사슬 분자 또는 두 결합 결정소를 포함하는 단일 사슬 비스페시픽 분자일 수 있다. 비스페시픽 분자는 적어도 두 개의 단일 사슬 분자를 포함할 수 있다. 비스페시픽 분자를 제조하는 방법은 예를 들어 U.S. 특허번호 5,260,203; U.S. 특허번호 5,455,030; U.S. 특허번호 4,881,175; U.S. 특허번호 5,132,405; U.S. 특허번호 5,091,513; U.S. 특허번호 5,476,786; U.S. 특허번호 5,013,653; U.S. 특허번호 5,258,498; 및 U.S. 특허번호 5,482,858에 기술되어 있다.
이들의 특이적 타겟에 대한 비스페시픽 분자의 결합은, 예를 들어 효소-결합 면역흡착 검사 (ELISA), 방사면역측정법 (RIA), FACS 아날리시스, 바이오어세이 (즉, 성장저해), 또는 웨스턴 블럿 어세이에 의하여 확인되어 질 수 있다. 이들 어세이의 각각은 일반적으로 흥미대상의 복합체에 특이적인 표지된 시약(즉, 항체)를 채용함에 의해 특정한 흥미대상의 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다. 예를 들어, FcR-항체 복합체는, 즉 항체-FcR 복합체를 인지하고 특이적으로 결합하는 효소-결합 항체 또는 항체 분획을 사용하여 검출될 수 있다. 대안적으로, 복합체는 다양한 다른 면역분석을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 항체는 방사능활성적으로 표지되어 질 수 있고 그리고 방사면역측정법 (RIA)으로 사용되어 질 수 있다 (예를 들어, 여기에 참고로 합체된 Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986 참고). 방사활성 아이소토프는 γ 카운트 또는 신틸레이션 카운트와 같은 수단에 의해 또는 오토라디오그라피에 의해 검출될 수 있다.
약학적 조성물
또 다른 측면에서, 본 개시사항은 약학적으로 허용될 수 있는 담체와 함께 제형화된, 본 개시사항의 모노클로날 항체 또는 이들의 항원-결합 부분의 하나 또는 조합을 포함하는 조성물, 즉 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 본 개시사항의 항체, 또는 면역컨쥬게이트나 비스페시픽 분자의 하나 또는 조합(즉, 두 개 또는 그 이상의 다른 것)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시사항의 약학적 조성물은 타겟 항원 상에 다른 항원결정성인자를 결합하거나 또는 상보적인 활성을 갖는 항체 (또는 면역컨쥬게이트나 비스페시픽)의 조합을 포함할 수 있다.
본 개시사항의 약학적 조성물은 또한 조합 치료로, 즉 다른 제제와 조합하여 투여되어 질 수 있다. 예를 들어, 조합 치료는 적어도 하나의 다른 항-염증성 또는 면역억제성 제제와 조합된 본 개시사항의 항-O8E 항체를 포함할 수 있다. 조합 치료에 사용될 수 있는 치료적인 제제의 예는 아래에 본 개시사항의 항체의 용도에 대한 부분에서 보다 자세하게 기술되어 진다.
여기서 사용된 것으로, "약학적으로 허용가능한 담체"는 생리학적으로 수용할 수 있는 일부 및 모든 용매류, 분산 배지, 도포제류, 항균 및 항곰팡이제, 등전제 및 흡수 지연제제 등을 포함한다. 전형적으로는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하로, 비경구적으로, 척수로 또는 상피내로 투여(즉, 주사 또는 주입에 의해)에 적절하다. 투여의 경로에 의존하여, 활성 화합물, 즉 항체, 면역컨쥬게이트 또는 비스페시픽 분자는 화합물을 비활성화할 수 있는 산 및 다른 중성 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하기 위한 물질에 도포되어 질 수 있다.
본 개시사항의 약학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 적절한 염을 포함할 수 있다. "약학적으로 적절한 염"은 모체 화합물의 원하는 생물학적 활성을 보유하면서 어떤 바람직하지 않은 독소학적 영향을 부여하지 않는 염에 관한 것이다 (즉, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm . Sci. 66:1-19 참고). 이러한 염의 예는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등과 같은 비독성의 무기산으로부터 유래된 것 뿐 아니라 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환 알카노이산, 하이드록시 알카노이산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등과 같은 비독성의 유기산으로부터 유래된 것을 포함한다. 염기 부가염은 소디움, 포타슘, 마그네슘, 칼슘 등과 같은 알카린 토금속류로부터 유래된 것 뿐 아니라 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등과 같은 비독성의 유기 아민으로부터 유래된 것을 포함한다.
본 개시사항의 약학적 조성물은 또한 약학적으로 허용가능한 항-산화제를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 항산화제의 예는: (1) 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 소디움 비설페이트, 소디움 메타비설파이트, 소디움 비설파이트 등과 같은 수용성 항산화제; (2) 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시애니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등과 같은 오일-가용성 항산화제; 그리고 (3) 시트르 산, 에틸렌디아민 테트라초산(EDTA), 솔비톨, 타르타르산, 인산 등과 같은 금속 킬레이팅 제제를 포함한다.
본 개시사항의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 적절한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 것) 및 이들의 적절한 혼합물, 올리브 기름과 같은 식물성 오일, 및 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용함에 의해, 분산의 경우에는 요구되는 입자 사이즈로 유지함에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지되어 질 수 있다.
이들 조성물은 또한 보전제, 습윤제, 에멀시화제 및 분산제와 같은 어쥬번트를 포함할 수 있다. 미생물 존재의 방지는 멸균 절차에 의해, 그리고 그 위에 다양한 항균 및 항곰팡이제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 솔르브산 등의 유입에 의한 양자의 방법에 의해 공고하게 될 수 있다. 당, 염화나트륨 등과 같은 등전제를 조성물 내에 포함하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 부가하여, 주사가능한 약학적 제형의 지연된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연하는 제제의 유입에 의해 일어날 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체는 멸균 수성 용액 또는 분산액 및 멸균 주사용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약학적으로 활성인 기질에 대한 이러한 배지 및 제제의 사용은 이 기술 분야에 알려져 있다. 통상적인 배지 및 제제가 본 활성 화합물과 조화할 수 없는 것이 아닌 한, 본 개시사항의 약학적 조성물에서의 이들의 사용은 고려되어 진다. 보충적인 활성 화합물이 또한 본 조성물에 합체되어 질 수 있다.
치료적 조성물은 제조 및 저장의 조건에서 전형적으로 멸균이어야 하고 안정하여야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜 또는 높은 약물 농도에 적절한 다른 구조로 제형화되어 질 수 있다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 리퀴드 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 적절한 이들의 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅을 사용함에 의해, 분산의 경우에는 요구되는 입자 사이즈로 유지함에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지되어 질 수 있다. 많은 경우에, 예를 들어 당, 만니톨, 솔비톨 같은 폴리알코올류 또는 염화나트륨과 같은 등전제를 조성물 내에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 지연된 흡수는 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴으로 흡수를 지연하는 제제를 조성물 내에 포함함에 의해 일어날 수 있다.
멸균의 주사가능한 용액은 상기 열거된 성분들의 하나 또는 조합으로, 필요하면 멸균 미세여과가 따르는, 활성 화합물을 필요한 양으로 적절한 용매에 합체함으로 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산은 기본적인 분산 배지와 상기에 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 포함하는 멸균 운반체에 활성 화합물을 합체함에 의해 제조된다. 주사가능한 멸균 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조의 방법은 미리 멸균-여과된 이들의 용액으로부터 어떤 부가적인 소망하는 성분이 더해진 활성 성분의 분말을 얻는 진공 건조 및 동결-건조(냉동진공건조)이다.
단일 복용 형태를 생산하기 위해 담체 물질과 조합되어 질 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 대상, 특히 투여의 형식에 의존하여 다양하게 변할 것이다. 단일 복용 형태를 생산하기 위해 담체 물질과 조합되어 질 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 얻는 조성물의 양이 될 것이다. 일반적으로, 일백 퍼센트 중에서, 이 양은 약 0.01 퍼센트에서 99 퍼센트의 활성성분, 전형적으로는 약 0.1 퍼센트에서 70 퍼센트, 가장 전형적으로는 약 1 퍼센트에서 30 퍼센트의 활성성분이 약학적으로 허용될 수 있는 담체와 조합하는 범위일 것이다.
복용 요법은 최적의 바람직한 반응(즉, 치료적 반응)을 제공하기 위해 조정된다. 예를 들어, 단일 환제가 투여되어 질 수 있고, 몇 개로 분할된 복용량이 시간에 걸쳐 투여되어 지거나 또는 복용량이 치료적 상황의 급박성에 의해 나타난 것에 따라 비례하여 감소하거나 증가될 수 있다. 복용량의 일정성과 투여의 편이성을 위한 복용단위 형태로는 비경구적 조성물로 제형화하는 것이 특별히 유익하다. 여기서 사용된 것으로 복용 단위 형태는 치료되는 대상에 단위로 사용하는 복용량으로 적합한 단위를 물리적으로 분리하는 것을 의미한다; 각 단위는 요구된 약학적 담체와 연계하여 원하는 치료적 효과를 생산하기 위해 계산된 소정 양의 활성 화합물을 포함한다. 본 개시사항의 복용 단위 형태에 대한 명세는 (a) 활성 화합물의 유일한 특징과 달성된 특정한 치료적 효과 및 (b) 개별적으로 민감성의 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 포함하는 기술에서 내재하는 제한에 의해 기술되고 그리고 이에 직접적으로 의존한다.
항체의 투여를 위하여, 복용량은 호스트 체중의 약 0.0001 내지 100 mg/kg 그리고 보다 통상적으로는 0.01 내지 5 mg/kg의 범위로 된다. 예를 들어, 복용량은 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중 또는 1-10 mg/kg의 범위 내로 된다. 필요되어 지는 때에는, 보다 높은 복용량, 즉 15 mg/kg 체중, 20 mg/kg 체중 또는 25 mg/kg 체중이 사용되어 질 수 있다. 모범적인 치료 요법은 주당 일 회 투여, 매 이 주당 일 회, 매 삼 주당 일 회, 매 사 주당 일 회, 한 달에 일 회, 매 3 달에 일 회 또는 매 3 내지 6 달에 일 회 투여를 수반한다. 본 개시사항의 항-O8E 항체에 대한 특정한 복용량 요법은 다음의 복용량 스케쥴의 하나를 사용하여 주어진 항체로, 정맥 내 투여를 통해 1 mg/kg 체중 또는 3 mg/kg 체중을 포함한다: (i) 6회 복용에 대해서는 매 사 주, 그런 다음 매 세 달 간격; (ii) 매 삼 주; (iii) 일단 한번은 3 mg/kg 체중으로 하고 다음으로 매 삼 주 1 mg/kg 체중.
몇몇 방법에 있어서, 다른 결합 특이성을 갖는 본 개시사항의 둘 또는 그 이상의 항-O8E 모노클로날 항체가 동시적으로 투여되어 지고, 이 경우에 투여되어 지는 각 항체의 복용량은 지시된 범위 내로 되도록 된다. 항체는 통상적으로 복수의 경우로 투여되어 진다. 단일 복용 간의 간격은, 예를 들어 주 단위로, 월 단위로, 매 삼 개월 단위로 또는 매년 단위로 될 수 있다. 간격은 또한 환자에 있어 타겟 항원에 대한 항체의 혈중 준위를 측정함에 의해 나타난 바에 따라 비규칙적으로 될 수 있다. 어떤 방법에서는, 복용은 약 1-1000 μg /ml의 플라즈마 항체 농도, 그리고 어떤 방법에서는 약 25-300 μg /ml의 플라즈마 항체 농도를 달성하도록 조정된다.
다른 방법에 있어서, 본 개시사항의 하나 또는 그 이상의 항-O8E 모노클로날 항체가, 예를 들어 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1과 같은 명확한 결합 특이성을 갖는 항체와 동시적으로 투여되어 지고, 이 경우에 투여되어 지는 각 항체의 복용량은 지시된 범위 내로 되도록 된다.
대안적으로, 항체는 지연된 방출 제형으로 투여되어 질 수 있고, 이 경우에 보다 적은 빈도 투여가 요구된다. 복용량 및 빈도는 환자에 있어서 항체의 반감기에 의존하여 다양하게 변한다. 일반적으로, 인간 항체는 가장 긴 반감기를 보이고 여기에 인간 체화된 항체, 키메르 항체, 및 비인간 항체가 따른다. 투여의 복용량 및 빈도는 치료가 예방적인 것인지 또는 치료를 위한 것인지에 의존하여 다양하게 변할 수 있다. 예방적인 적용에 있어서, 상대적으로 낮은 복용량은 장기간의 시간으로 상대적으로 잦지 않은 간격으로 투여된다. 어떤 환자는 이들의 남은 일생 동안 치료를 받는 것을 계속한다. 치료적 적용에 있어서는, 질병의 진행이 감소되거나 또는 중단되어 질 때까지 그리고 바람직하기로는 환자가 부분적으로 또는 완전한 질병의 증상의 개선을 보일 때까지 상대적으로 짧은 간격에서 상대적으로 높은 복용량이 때로는 필요하다. 그 후로, 환자는 예방적인 요법으로 투여되어 질 수 있다.
본 개시사항의 약학적 조성물에서 활성 성분의 실질적인 복용량 준위는 환자에 독이 됨이 없이 특정 환자, 조성물 및 투여의 양식에 대한 소망하는 치료적 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위하여 다양하게 변할 수 있다. 선택된 복용량 준위는 사용된 본 개시사항의 특정 조성물, 이들의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여의 경로, 투여의 시간, 사용된 특정 화합물의 배출율, 치료의 기간, 사용된 특정의 조성물과 조합하여 사용된 다른 약물, 화합물 및/또는 물질들, 치료되어 지는 환자의 나이, 성, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전의 병력 및 의료분야에 잘 알려진 다른 인자를 포함하는 다양한 약리운동학적 인자에 의존하여 변할 것이다.
본 개시사항의 항-O8E 항체의 "치료학적으로 유효한 복용량"은 전형적으로는 질병 증상의 심각성을 감소하고, 질병 증상이 없는 기간 및 빈도를 증가하고, 또는 질병 고통에 기인한 손상 및 불구를 예방을 초래한다. 예를 들어, O8E+ 종양의 치료에 대해서, "치료학적으로 유효한 복용량"은 전형적으로는 치료되지 않은 대상에 비하여 적어도 약 20%, 보다 전형적으로는 적어도 약 40%, 더 보다 전형적으로는 적어도 약 60%, 더더욱 보다 전형적으로는 적어도 약 80%의 세포 성장 또는 종양 성장을 저해한다. 종양성장을 저해하는 화합물의 능력은 인간 종양에서 효능성에 진단적인 동물 모델 시스템으로 평가되어 질 수 있다. 대안적으로, 이 조성물의 특성은 숙달된 개업의에게 알려진 어세이에 의하여 생체 외에서의 저해와 같이, 저해하는 화합물의 능력을 검사함에 의해 평가될 수 있다. 치료적 화합물의 치료학적으로 유효한 량은 종양의 사이즈를 감소하거나 그렇지 않으면 대상에서 증상을 개선한다. 이 기술 분야에서의 통상인은 대상의 사이즈, 대상의 증상의 심각성, 및 선택된 투여의 경로 또는 특정한 조성물과 같은 인자에 기초하여 이러한 양을 결정할 수 있을 것이다.
본 개시사항의 조성물은 이 기술 분야에 알려진 하나 또는 그 이상의 다양한 방법을 사용하여 하나 또는 그 이상의 투여의 경로를 통해 투여되어 질 수 있다. 숙련된 전문가에 의해 인식되어 질 것과 같이, 투여의 경로 및/또는 양식은 희망하는 결과에 의존하여 다양하게 변할 것이다. 본 개시사항의 항체의 바람직한 투여의 경로는 정맥내, 근육내, 상피내로, 복막내로, 피하로, 척수로 또는, 예를 들어 주사 또는 주입에 의하는 투여의 다른 비경구적 경로를 포함한다. 여기에서 사용되는 것으로 구 "비경구적 투여"는 통상적으로 주사에 의한 내부로 및 국부적 투여 이외의 투여의 양식을 의미하고, 제한됨이 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 낭내로, 캡슐내, 궤도내, 심장내, 상피내, 복강내, 도관을 통해, 피하내, 큐티클아래, 관절내, 캡슐하, 거미막밑, 척수내, 경막외와 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
대안적으로, 본 개시사항의 항체는 국부적으로, 상피로 또는 점막의 투여 경로와 같은 비-장관외 경로를 통해, 예를 들어 비강으로, 구강으로, 질 동맥으로, 직장으로, 설하로 또는 국소적으로 투여되어 질 수 있다.
활성성분은 임플란트, 피부를 통한 패치, 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템과 같은 화합물을 빠른 방출에 대해 보호하는 담체로 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물류, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락산과 같은 생분해가능하고 생체적합한 폴리머들이 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조에 대한 많은 방법들이 특허되어 지거나 이 분야의 통상인에게 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978 참고.
치료적 조성물들은 이 기술 분야에 알려진 의료적 장치로 투여되어 질 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시형태에서, 본 개시사항의 치료적 조성물은 U.S. 특허번호 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 또는 4,596,556에 기술된 장치와 같은 무바늘 피하 주사 장치로 투여되어 질 수 있다. 본 개시사항에 유용한 잘-알려진 임플란트 및 모듈의 예는; 조절된 비율로 의약을 분배하는 이식가능한 마이크로-주입 펌프를 개시하는 U.S. 특허번호 4,487,603; 피부를 통해 치료제를 투여하기 위한 치료장치를 개시하는 U.S. 특허번호 4,486, 194; 정확한 주입율로 치료약을 전달하는 의약 주입 펌프를 개시하는 U.S. 특허번호 4,447,233; 지속적 약물 전달을 위한 가변 흐름의 이식가능한 유입 장치를 개시하는 U.S. 특허번호 4,447,224; 멀티-챔버 구획부를 갖는 삼투적 약물 전달 시스템을 개시하는 U.S. 특허번호 4,439,196; 및 삼투적 약물 전달 시스템을 개시하는 U.S. 특허번호 4,475,196을 포함한다. 이들 특허는 여기에 레퍼런스로 합체된다. 많은 다른 이런 임프란트, 전달 시스템 및 모듈이 이 기술분야의 통상인에게 잘 알려져 있다.
어떤 실시형태에서, 본 개시사항의 인간 모노클로날 항체는 생체 내에서 적절한 분산을 공고하게 하기 위해 제형되어 질 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 배리어(BBB)는 아주 높은 친수성 화합물을 배제한다. 본 개시사항의 치료적 화합물이 BBB를 통과(만일 원한다면)하는 것을 확실하게 하기 위해, 이들은, 예를 들어 리포솜에 제형되어 질 수 있다. 리포솜을 제조하는 방법에 대해서는, 예를 들어 U.S. 특허번호 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331를 참고. 리포솜은 특정한 세포 또는 조직으로 선택적으로 이전되고, 따라서 타겟된 약물 전달을 증진하는 하나 또는 그 이상의 부분을 포함할 수 있다(예를 들어, V. V. Ranade (1989) J. Clin . Pharmacol. 29:685 참고). 예시적으로 타겟하는 부분은 폴레이트 또는 바이오틴 (예를 들어, Low 등의 U.S. 특허번호 5,416,016 참고); 만노사이드류 (Umezawa et al., (1988) Biochem . Biophys . Res . Commun . 153:1038): 항체 (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob . Agents Chemother. 39:180); 계면활성제 단백질 A 리셉터 (Briscoe et al. (1995) Am . J. Physiol. 1233: 134); pl20 (Schreier et al. (1994) J. Biol . Chem. 269:9090)를 포함하고; 또한 K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; JJ. Killion; LJ. Fidler ( 1994) Immunomethods 4:273 참고.
본 개시사항의 용도 및 방법
본 개시사항의 항체, 특히 인간 항체, 항체 조성물 및 방법은, 예를 들어 O8E의 검출, O8E의 차단에 의한 암의 치료나 면역 반응의 증진을 포함하는 다수의 생체 외 및 생체 내의 진단적 및 치료적 유용성을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시사항의 항체는 인간 항체이다. 예를 들어, 이들 분자는 실험실 또는 생체 외에서 배양에 있는 세포에 투여될 수 있고, 또는 다양한 질환을 치료하고, 예방하고 그리고 진단하기 위해 또는 다양한 상황에서 면역성을 증진하기 위해 인간 대상에, 즉 생체 내에 투여되어 질 수 있다.
여기서 사용된 것으로, 용어 "대상"은 인간 또는 비-인간 동물을 포함하는 것을 의도한다. 용어 "비-인간 동물"은 척추동물, 즉 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류 및 파충류 등과 같은 포유 및 비포유동물을 포함한다. 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소 및 말과 같은 포유류가 바람직하다. 바람직한 대상은 면역 반응의 증진이 필요하거나 O8E 발현과 연관된 질환을 가진 인간 환자를 포함한다. 방법은 특히 비정상적인 O8E 발현과 연관된 질환을 가진 인간 환자를 치료하는데 적절하다. 방법은 또한 특히 T-세포 매개 면역 반응을 증진함에 의해 치료될 수 있는 질병을 갖는 인간 환자를 치료하는데 적절하다. 면역원성의 항원-특이성 증진을 이루기 위해, 항-O8E 항체가 흥미대상의 항원과 같이 투여되어 질 수 있다. O8E에 대한 항체가 다른 제제와 함께 투여될 때, 이 두 개는 순차로 또는 동시적으로 투여되어 질 수 있다.
O8E에 대해 본 개시사항의 항체의 특이적인 결합이 주어지면, 본 개시사항의 항체는 세포의 표면에 O8E 발현을 특징적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고, 그리고 더욱이 면역친화성 정제를 통해 O8E을 정제하기 위해 사용될 수 있다.
암
O8E는 유방세포 암종, 전이성 유방암, 난소세포 암종, 전이성 난소암 및 신장 세포 암종을 포함하는 다양한 인간의 암에서 발현되어 진다 (Tringler et al (2005) Clinical Cancer Res. 11: 1842-48; Salceda et al. (2005) Exp Cell Res. 306:128-41; Tringler et al. (2006) Gynecol Oncol. 100:44-52; Krambeck et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103:10391-6; Chen et al. (2006) Kidney Int . Epub; Sun et al. (2006) Lung Cancer 53:143-51; Bignotti et al. (2006) Gynecol Oncol. 103:405-16; Kryczek et al. (2006) J Exp Med 203:871-81; Simon et al. (2006) Cancer Res . 66:1570-5). 항-O8E 항체는 암성 종양의 성장을 저해하기 하기 위해 단독으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 항-O8E 항체는 아래에 기술하는 바와 같이 다른 면역적 제제, 표준 암 치료 또는 다른 항체와 조합하여 사용될 수도 있다.
B 및 T 림프구 희석제 (BTLA)가 O8E에 대한 수용체로 되어 지는 것이 밝혀졌고 그리고 세포독성 T 람프구 항원-4 (CTLA-4) 및 예정사-1 (PD-I)에 유사한 면역 반응 상에 저해적인 효과를 가진다 (Carreno and Collins (2003) Trends Immunol 24:524-7). O8E는 T-세포 증식의 저해, 사이토키닌 생산 및 세포 주기 생산에 의한 T 세포 면역원성을 음성적으로 조절하는 기능을 가진다 (Choi et al. (2003) J Immunol. 171 :4650-4). 08E-Ig 용융 단백질은 T-활성화를 저해하는 반면, 항체에 의한 O8E의 차단이 환자에 있어서 면역 반응을 고양할 수 있다 (Sica et al.(2003) Immunity 18:849- 61).
일 측면에서, 본 개시사항은 암성 종양의 성장이 저해되도록 항-O8E 항체를 사용하여 생체 내에서 대상의 치료에 관한 것이다. 항-O8E 항체는 암성 종양의 성장을 저해하기 하기 위해 단독으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 항-O8E 항체는 아래에 기술하는 바와 같이 다른 면역적 제제, 표준 암 치료 또는 다른 항체와 조합하여 사용될 수도 있다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 개시사항은 대상에 치료적으로 유효한 양의 항-O8E 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 투여하는 것을 포함하는 대상에 있어서의 종양의 성장을 저해하는 방법을 제공한다. 바람직하기로는, 항체는 인간 항-O8E 항체이다 (여기에 기술된 어떤 인간 항-인간 O8E 항체 같은 것). 부가적으로 또는 대안적으로, 항체는 키메르 또는 인체 체화된 항-O8E 항체일 수 있다.
그 성장이 본 개시사항의 항체를 사용함에 의해 저해되어 질 수 있는 바람직한 암은 면역 치료에 전형적으로 반응하는 암을 포함한다. 치료에 대한 바람직한 암의 비-제한적인 예는 유방암 (즉, 유방세포 암종), 난소암 (즉, 난소세포 암종) 및 신장 세포 암종(RCC)을 포함한다. 본 개시사항의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 다른 암의 예로는 멜라노마(즉, 전이성 악성 멜라노마), 전립선암, 결장암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 뇌종양, 급성 미엘로마 백혈병, 만성 미엘로마 백혈병을 포함하는 만성 또는 급성 백혈병, 급성 림프 백혈병, 만성 림프 백혈병, 림프종(즉, 호킨스 및 비-홉킨스 림프종, 림프구 림프종, 주요 CNS 림프종, T-세포 림프종), 비강암종, 머리 또는 목의 암, 자궁암, 직장암, 항문 지역의 암, 위암, 고환 암, 자궁암, 나팔관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 외음문암, 식도암, 작은 창자 암, 내분비계 암, 갑상선암, 부 동맥 암, 부신암, 연질 조직의 육종, 요도암, 성기암, 유년의 고체 종양, 방광암, 신장 또는 요관 암, 신장 골반 암, 중추 신경계(CNS) 종양, 종양 신생, 척추 축 종양, 뇌 줄기 신경아교종, 뇌하수체선종, 카포지의 종양, 상피 암, 평판상피세포암, 석면에 의해 유발된 것을 포함하는 환경적으로 유발된 암, 즉 중피종 및 상기 암들의 조합을 포함한다.
임의적으로, O8E에 대한 항체는 암 세포, 정제된 종양 항원(재조합 단백질, 펩티드 및 탄화수소 분자를 포함), 세포 및 면역 자극 시토킨을 코드하는 유전자로 형질전화된 세포와 같은 면역성 제제와 조합되어질 수 있다(He et al J. Immunol. 173:4919-28 (2004)). 사용될 수 있는 종양 백신의 비-제한적인 예는 gplOO, MAGE 항원, Trp-2, MARTl 및/또는 티로시나제의 펩티드와 같은 미엘로마 항원의 펩티드, 또는 시토킨 GM-CSF을 발현하도록 트랜스펙트된 종양 세포를 포함한다.
인간에 있어서, 몇몇 종양은 멜라노마와 같은 면역성인 것으로 보여진다. O8E 차단에 의한 T 세포 활성화의 임계점을 상승함에 의해 종양이 숙주에서 반응으로 활성화되어 질 수 있는 것으로 기대된다.
O8E 차단은 백신화 프로토콜과 조합될 때 가장 유효한 것으로 되기 쉽다. 종양에 대한 백신화를 위한 많은 실험적인 전략이 고안되어 있다 (Rosenberg, S., "Development of Cancer Vaccines", ASCO Educational Book Spring: 60-62 (2000); Logothetis, ASCO Educational Book Spring: 300-302 (2000); Khayat, ASCO Educational Book Spring: 414-428 (2000); Foon, ASCO Educational Book Spring: 730-738 (2000) 참고; 또한, Restifo and Sznol, Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043 in DeVita, V. et al. (ed), Cancer: Principles and Practice of Oncology. Fifth Edition 91997) 참고). 이들 전략 중의 하나로는, 백신은 자가조직의 또는 동종이계의 종양 세포를 사용하여 제조된다. 전형적으로는, 이들 세포성 백신은 종양 세포가 GM-CSF를 발현하기 위해 형질도입될 때 가장 유효하다. GM-CSF는 종양 백신화반응에 대한 항원 표시의 강력한 활성자인 것으로 보여진다 (Dranoff et al. Proc . Natl . Acad . Sd U.S.A. 90: 3539-43 (1993)).
다양한 종양으로의 유전자 발현 및 큰 스케일 유전자 발현 패턴의 연구는 소위 종양 특이적 항원의 정의로 이끈다 (Rosenberg, Immunity 10: 281-7 (1999)). 많은 경우에, 이들 종양 특이적 항원은, 예를 들어 멜라노사이트 항원 gplOO, MAGE 항원 및 Trp-2와 같은, 종양이 발생하는 세포에 그리고 종양에 발현된 분화 항원이다. 보다 중요하기로는, 이들 항원의 대부분은 숙주에서 발견된 종양 특이적 T 세포의 타겟인 것으로 보여질 수 있다. O8E 차단은 종양에서 발현된 재조합 단백질 및/또는 펩티드의 집합과 조합하여 이들 단백질에 반응하는 면역을 발생하기 위해 사용되어 질 수 있다. 이들 단백질은 자가 항원으로 면역계에 의하여 정상적으로 검토되고 따라서 이들에 내성이다. 종양 항원은 또한 크로모솜의 말단 소립의 합성에 필요되고 그리고 인간 암의 85% 이상으로 그리고 단지 제한된 수의 체세포 조직에서만 발현되는 단백질 말단 소립을 포함한다 (Kim et al. Science 266: 2011-2013 (1994)). (이들 체세포 조직은 다양한 수단에 의한 면역 공격으로부터 보호되어 질 수 있다). 종양 항원은 또한 단백질 시퀀스를 변형하거나 또는 두 개의 비관련 시퀀스 사이의 용융 단백질 (예를 들어, 필라델피아 크로모솜에서의 bcr-abl) 또는 B 세포 종양으로부터의 유전자형을 창출하는 체세포돌연변이 때문에 암 세포에서 발현된 "네오-항원"일 수 있다.
다른 종양 백신은 인간 파필로마 바이러스 (HPV), 간염 바이러스 (HBV 및 HCV) 그리고 카포지의 헤르페스 암종 바이러스 (KHSV)와 같은 인간 암에 유입된 바이러스로부터의 단백질을 포함할 수 있다. O8E 차단과 융합하여 사용될 수 있는 종양 특이적 항원의 다른 형태는 그 자체 종양 조직으로부터 분리된 정제된 열 충격 단백질(HSP)이다. 이들 열 충격 단백질은 종양 세포로부터의 단백질의 분획을 포함하고 그리고 이들 HSP들은 종양 면역성을 이끌어 내기 위한 항원 내재 세포로 전달에 아주 효과적이다 (Suot and Srivastava Science 269:1585-1588 (1995)); Tamura et al . Science 278:117- 120 (1997)).
수지상 세포 (DC)는 수위의 항원-특이적 반응에 사용될 수 있는 강력한 항원 내재 세포이다. DC들은 생체 외로 생산되어 질 수 있고 그리고 다양한 단백질 및 펩티드 항원 뿐 아니라 종양 세포 추출물들로 적하되어 질 수 있다 (Nestle, F. et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332). DC들은 또한 이들 종양 항원을 보다 잘 발현하기 위해 유전적인 수단에 의해 형질도입되어 질 수 있다. DC들은 또한 면역화의 목적을 위해 종양 세포에 직접적으로 용융되어 진다 (Kugler, A. et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336). 백신화의 방법으로서 DC 면역화반응이 보다 강력한 항-종양 반응을 활성화하기 위하여 PD-Ll 차단과 효과적으로 조합되어 질 수 있다.
O8E 차단은 또한 표준 암 치료와 조합되어 질 수 있다. O8E 차단은 화학치료요법제와 효과적으로 조합되어 질 수 있다. 이들 경우에, 투여된 화학치료제의 복용량을 감소하는 것이 가능할 수 있다 (Mokyr, M. et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304). 이러한 조합의 예는 다양한 암의 치료를 위한 디카르바진과 조합한 항-O8E 항체이다. 이러한 조합의 다른 예는 다양한 암의 치료를 위한 인터류이킨-2 (IL-2)와 조합한 항-O8E 항체이다. O8E 차단과 화학치료의 조합된 사용 뒤의 과학적인 이론적 근거는, 대부분 화학치료적 화합물의 세포 독성 작용의 귀결인 세포 사가 항원 내재 경로에서 종양 항원의 증가된 준위를 초래한다는 것이다. 세포 사를 통한 O8E 차단으로 시너지를 초래할 수 있는 다른 조합 치료법은 방사선, 수술 및 호르몬 상실이다. 이들 프로토콜의 각각은 숙주에 있어서 종양 항원의 근원을 만든다. 혈관종생성 저해제가 또한 O8E 차단과 조합되어 질 수 있다. 혈관종생성의 저해는 숙주 항원 내재 경로로 종양 항원을 공급할 수 있는 종양 세포 사를 이끈다.
O8E 블럭킹 항체는 또한 종양 세포에 Fc 알파 또는 Fc 감마 리셉터-발현 이펙터 세포를 타겟으로 하는 비스페시픽 항체와 조합하여 사용될 수 있다 (즉, U.S. 특허번호 5,922,845 및 5,837,243 참고). 비스페시픽 항체는 두 개의 별도의 항원을 타겟으로 하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-Fc 리셉터/항 종양 항원(예를 들어, Her-2/neu) 비스페시픽 항체는 매크로파아지가 종양 사이트를 타겟으로 하기 위해 사용된다. 이 타겟화는 종양 특이적 반응을 보다 효과적으로 활성화할 수 있다. 이들 반응의 T 세포 암은 O8E 차단의 사용에 의하여 증강되어 질 것이다. 대안적으로 항원은 종양 항원 및 수지상 세포 특이적 세포 표면 마커에 결합하는 비스페시픽 항체의 사용에 의해 DC들에 직접적으로 전달되어 질 수 있다.
종양은 아주 다양한 메카니즘에 의해 숙주 면역 감시를 회피한다. 많은 이들 메카니즘은 종양에 의해 발현되고 그리고 면역억제적인 단백질의 비활성화에 의해 극복될 수 있다. 이들은 다른 것들 중에 TGF-베타 (Kehrl, J. et al. (1986) J. Exp. Med . 163: 1037-1050), IL-10 (Howard, M. & O'Garra, A. (1992) Immunology Today 13: 198-200), 및 Fas 리간드 (Hahne, M. et al. (1996) Science 274: 1363-1365)를 포함한다. 이들 실체 각각의 항체는 면역억제제의 효과에 반대작용을 하고 숙주에 의한 종양 면역 반응에 유리한 항-PD-Ll과 조합하여 사용될 수 있다.
숙주 면역 반응성을 활성화하기 위해 사용될 수 있는 다른 항체가 항-O8E과 조합하여 사용될 수 있다. 이들은 DC 기능과 항원 내재를 활성화하는 수지상 세포의 표면상의 분자를 포함한다. 항-CD40 항체는 T 세포 헬퍼 활성에 대해 효과적으로 치환될 수 있고 (Ridge, J. et al (1998) Nature 393: 474-478) 그리고 O8E 항체와 조합하여 사용될 수 있다. CTLA-4 (즉, US 특허번호 5,811,097), OX-40 (Weinberg, A. et al. (2000) Immunol 164: 2160- 2169), 4-1BB (Melero, I. et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997)), PD-I (del Rio et al. (2005) Eur J Immunol 35:3545-60) 및 ICOS (Hutloff, A. et al (1999) Nature 397: 262-266)와 같은 T 세포 공동자극의 분자에 대한 활성화하는 항체가 또한 T 세포 활성화의 증진된 준위를 제공할 수 있다.
골수이식은 조혈제 유래의 각종 종양을 치료하기 위해 현재 사용되어 지고 있다. 숙주 질병에 대한 이식이 이들 치료의 결론이지만, 치료적 이점은 종양 반응에 대해 이식으로부터 얻어질 수 있다. O8E 차단은 공여자 융합 종양 특이적 T 세포의 유효성을 증가하기 위하여 사용되어 질 수 있다.
또한, 항원 특이적 T 세포의 생체 외 활성화와 팽창을 포함하고 그리고 종양에 대해 항원 특이적 T 세포로 하기 위해 수용체로 이들 세포의 적응적 전이를 하는 몇 가지의 실험적 치료 프로토콜이 있다 (Greenberg, R. & Riddell, S. (1999) Science 285: 546-51). 이들 방법은 또한 CMV와 같은 전염성 제제에 대해 T 세포 반응을 활성화하기 위해 사용될 수 있다. 항-O8E 항체의 존재에서 생체 외 활성화는 채용적으로 전이된 T 세포의 빈도와 활성을 증가하는 것으로 기대될 수 있다.
다양한 종양 세포에 대해 O8E의 발현이 주어지면, 본 개시사항의 인간 항체, 항체 조성물 및 방법은 대상에 있어 종양유전 질환, 즉 예를 들어 유방암 (즉, 유방세포 암종), 난소암 (즉, 난소세포 암종) 및 신장암을 포함하는 O8E 발현 종양 세포의 존재에 의해 특징되어 지는 질환을 치료하기 위해 사용되어 질 수 있다. 본 개시사항의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 다른 암의 예로는 멜라노마(즉, 전이성 악성 멜라노마), 전립선암, 결장암 및 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 머리 또는 목의 암, 피부 또는 안구 악성 멜라노마, 자궁암, 직장암, 항문 지역의 암, 위암, 고환 암, 자궁암, 나팔관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 외음문암, 호킨스질병, 비-홉킨스 림프종, 급성 림프구 백혈병(ALL), 만성 림프구 백혈병(CLL), 버킷 림프종, 악성 대세포 림프종 (ALCL), 다발성 골수종, 피부 T-세포 림프종, 결절성 소분할세포 림프절, 림프성 림프절, 말단 T-세포 림프절, 레너트 림프종, 이뮤노블라스트 림프절, T-세포 백혈병/림프절 (ATLL), 성인 T-세포 백혈병 (T-ALL), 엔트로블라스트/센트로사이트 (cb/cc) 엽포 림프절 암, B 계대의 미만성 대형세포 림프절, 혈관면역아세포 림프선병증 (AILD)-형 T 세포 림프종, HIV 연계 체강 기재 림프종, 태생암종, 비인두염의 미분화된 암종 (즉, 쉬민케 종양), 캐스틀만 질환, 카포지 사코마, 다발성 골수종, 웰덴스트롬 거대글로불린혈증 및 기타 B-세포 림프절, 식도의 암, 작은 창자의 암, 내분비계의 암, 갑상선의 암, 부갑상선의 암, 연질 조직의 육종, 요도암, 성기암, 급성 미엘로마 백혈병, 만성 미엘로마 백혈병을 포함하는 만성 또는 급성 백혈병, 급성 림프 백혈병, 만성 림프 백혈병, 유년의 고체 종양, 림프 임파종, 방광암, 신장 또는 요관 암, 신장 골반 암, 중추 신경계(CNS) 종양, 기본 CNS 림프종, 신경교아, 뇌 종양, 비강암종, 종양 신생, 척추 축 종양, 뇌 줄기 신경아교종, 뇌하수체선종, 카포지의 종양, 상피 암, 비늘모양 세포 암, T-세포 림프종, 석면에 의해 유발된 것을 포함하는 환경적으로 유발된 암 및 상기 암들의 조합을 포함한다. 본 개시사항은 또한 전이성 암의 치료에 유용하다.
따라서, 일 실시형태에 있어서, 본 개시사항은 대상에 치료적으로 유효한 양의 항-O8E 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 투여하는 것을 포함하는 대상에 있어서의 종양의 성장을 저해하는 방법을 제공한다. 전형적으로는, 항체는 인간 항-O8E 항체이다 (여기에 기술된 어떤 인간 항-인간 O8E 항체 같은 것). 부가적으로 또는 대안적으로, 항체는 키메르 또는 인체 체화된 항-O8E 항체일 수 있다.
감염성 질병
본 개시사항의 다른 방법은 특정한 독성 또는 병원균에 노출된 환자를 치료하기 위해 사용된다. 따라서, 본 개시사항의 다른 측면은 대상이 감염성 질환에 대해 치료되도록 대상에 항-O8E 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 투여하는 것을 포함하는 대상에 있어서 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하기로는, 항체는 인간 항-인간 O8E 항체(여기에 기술된 어떤 인간 항-O8E 항체와 같은 것)이다. 부가적으로 또는 대안적으로, 항체는 키메르 또는 인체 체화된 항체일 수 있다.
상술한 바와 같이 종양에의 그 적용에 유사하게, 항체 매개 O8E 차단은 병원균, 독소 및 자가-항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위하여 단독으로, 또는 어쥬번트로 백신과 조합하여 사용될 수 있다. 이 치료적 어프로치가 특히 유용할 수 있는 병원균의 예는 현재로는 효과적인 백신이 아닌 병원균, 또는 통상적인 백신이 완전하게 효과적이지 않는 병원균을 포함한다. 이들은 여기에 한정되는 것은 아니지만, HIV, 간염 (A, B, & C), 인플루엔자, 헤르페스, 편모충, 말라리아, 리슈마니어, 스타필로코커스 아우레우스, 슈도모나스 에어루기노사를 포함한다. O8E 차단은 감염의 과정을 걸쳐 변형된 항원이 존재하는 HIV와 같은 항원에 의한 확립된 전염에 대해 특히 유용하다. 이들 신규한 항원결정인자는 항-인간 O8E 투여의 시에 외래성인 것으로 인지되고, 따라서 O8E를 통한 네거티브 시그날에 의해 감쇠되지 않는 강력한 T 세포 반응을 일으킨다.
본 개시사항의 방법에 의하여 치료될 수 있는 감염을 유발하는 병원성 바이러스의 예는 HIV, 간염 (A, B, 또는 C), 헤르페스 바이러스(예를 들어, VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-II, 및 CMV, 엡스타인바바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코르노바이러스, 호흡기세포융합바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 루벨라 바이러스, 파르보바이러스, 백시너 바이러스, HTLV 바이러스, 댕기열 바이러스, 파필로마바이러스, 몰루스쿰 바이러스, 폴리오바이러스, 공수병 바이러스, JC 바이러스 및 아르보바이러스의 뇌염 바이러스를 포함한다.
본 개시사항의 방법에 의하여 치료될 수 있는 감염을 유발하는 병원성 세균의 예는 클라미디아, 리켓치아 박테리아, 미코박테리아, 포도상 구균, 연쇄상 구균, 뉴모노 구균, 메닝고 구균 및 코노 구균, 클렙시엘라, 프로테우스, 세라티아, 슈도모나스, 레지오넬라, 디프테리아, 살모넬라, 바실리, 콜레라, 파상풍, 보톨리누스 중독증, 탄저병, 역병, 렙토스피로시스 및 라임 병 박테리아를 포함한다.
본 개시사항의 방법에 의하여 치료될 수 있는 감염을 유발하는 병원성 곰팡이의 예는 칸디다(알비칸, 크루세이, 그라브라타, 트로피칼리스 등), 클립토코커스 네오포만스, 아스퍼길러스(퓨미가터스, 니거 등), 지너스 뮤코랄레스(뮤코르, 앱시디아, 리조푸스), 스포로트릭스 쉔키, 블라스토미세스 더마티티디스, 파라코찌디오이데스 브라실리엔시스, 코찌디오이데스 이미티스 및 히스토플라즈마 캡슐레텀을 포함한다.
본 개시사항의 방법에 의하여 치료될 수 있는 감염을 유발하는 병원성 기생충의 예는 엔타모에바 히스토리티카, 발란티디움 콜리, 내그레리아포우레리, 아켄타모에바 에스피., 기알디아 람비아, 크립토스포리디움 에스피., 뉴모시스티스 카리니, 플라스모디움 비백스, 바베시아 미크로티, 트립파노소마 부루세이, 트립파노소마 크루찌, 레이쉬마니아 도노바니, 톡소플라즈마 곤디, 니포스트롱길러스 브라실리엔시스를 포함한다.
상기 방법의 모두에 있어서, O8E 차단은 시토킨 치료(즉, 인터페론, GM-CSF, G-CSF, IL-2) 또는 비스페시픽 항원 치료와 같은 다른 형태의 면역치료법과 조합될 수 있어, 종양 항원의 증진된 내재를 제공한다 (예를 들어, Holliger (1993) Proc . Natl . Acad . ScL USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123 참고).
자가면역 반응
항-O8E 항체는 자가면역 반응을 유발하고 증폭할 수 있다. 실제로, 종양 세포 및 펩티드 백신을 사용하는 항-종양 반응의 유도는 많은 항-종양 반응이 항-자가 반응성(depigmentation observed in anti- CTLA-4 + GM-CSF-modified B 16 melanoma in van Elsas et al supra; depigmentation in Trp-2 vaccinated mice (Overwijk, W. et al (1999) Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 96: 2982- 2987); TRAMP 종양 세포 백신에 의해 유발된 자가면역 전립선염 (Hurwitz, A. (2000) supra), 인간의 임상적 실험에서 관찰된 멜라노마 펩티드 항원 백신화반응 및 백피(Rosenberg, SA and White, DE (1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19 (1): 81-4)를 포함한다는 것을 밝힌다.
따라서, 질병 치료를 위해 이들 자가 단백질에 대한 면역 반응을 효과적으로 발생시키기 위한 백신화반응 프로토콜을 안출하기 위해서 다양한 자가 단백질과 조합하여 항-O8E 차단을 사용하는 것을 고려하는 것이 가능하다. 예를 들어, 알쯔하이머 병은 뇌에 아밀로이드 증착에 있어서 Aβ 펩티드의 부적절한 축적을 포함하고: 아밀로이드에 대한 항체 반응은 이들 아밀로이드 증착을 깨끗하게 할 수 있다 (Schenk et al, (1999) Nature 400: 173-177).
다른 자가 단백질이 또한 알러지 및 천식의 치료를 위한 IgE 및 류마티스성 관절염 치료를 위한 TNFα와 같은 타겟으로 사용되어 질 수 있을 것이다. 마지막으로, 다양한 호르몬에 대한 항체 반응은 항-O8E 항체의 사용에 의하여 유도되어 질 것이다. 재생성 호르몬에 대한 중화 항체 반응은 피임을 위해 사용되어 질 것이다. 특정 종양의 성장을 위해 필요로 되는 호르몬 및 기타 가용성 인자에 대한 중화 항체 반응은 또한 가능한 백신화반응 타겟으로 고려될 것이다.
항-O8E 항체의 사용에 대해 상술한 것과 유사한 방법이 알쯔하이머 병에서 Aβ를 포함하는 아밀로이드 증착과 같은 다른 자가-항원, TNFα 및 IgE와 같은 시토킨의 부적절한 축적을 갖는 환자를 치료하기 위한 치료적 자가면역 반응의 유발을 위해 사용될 수 있다.
백신
항-O8E 항체는 흥미대상의 항원(예를 들어, 백신)과 항-O8E 항체의 공동 투여에 의해 항원-특이적 면역 반응을 자극하기 위해 사용될 것이다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 개시사항은 대상에 있어서 항원에 대한 면역 반응이 고양되도록, 대상에 (i) 항원; 및 (ii) 항-O8E 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 투여하는 것을 포함하는 대상에 있어서의 항원에 대한 면역 반응을 증진하는 방법을 제공한다. 바람직하기로는, 항체는 인간 항-인간 O8E 항체(여기에 기술된 어떤 인간 항-O8E 항체와 같은 것)이다. 부가적으로 또는 대안적으로, 항체는 키메르 또는 인체 체화된 항체일 수 있다. 항원은, 예를 들어 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 병원체로부터의 항원일 수 있다. 이러한 항원의 비-제한적 예는 상기한 종양 항원(또는 종양 백신), 또는 바이러스, 박테리아 또는 다른 상기한 병원균으로부터의 항원과 같은 상기 부분에 기술된 것들을 포함한다.
본 개시사항의 항체 조성물 (즉, 인간 모노클로날 항체, 멀티스페시픽 및 비스페시픽 분자 및 이뮤노컨쥬게이트)를 생체 내로 또는 생체 외로 투여하는 적절한 경로는 이 기술 분야에 잘 알려져 있으며 이 분야의 통상인에게 의해 선택되어 질 수 있다. 예를 들어, 항체 조성물은 주사(예를 들어, 정맥 내로 또는 피하로)에 의해 투여되어 질 수 있다. 사용된 분자의 적절한 복용량은 대상의 연령 및 체중과 항체 조성물의 농도 및/또는 제형에 의존할 것이다.
이미 기술한 바와 같이, 본 개시사항의 인간 항-O8E 항체는 하나 또는 그 이상의 다른 치료적 제제, 예를 들어 세포독소 제제, 방사독소 제제 또는 면역억제 제제와 같이 투여되어 질 수 있다. 항체는 제제에 연결되어 질 수 있고(면역 복합체로서) 또는 제제와 별도로 투여되어 질 수 있다. 후자의 경우(별도 투여)에, 항체는 전에, 후에 또는 제제와 동시적으로 투여되어 질 수 있고 또는 다른 공지된 치료법, 예를 들어 방사선과 같은 항암 치료와 같이 투여될 수 있다. 이러한 치료적 제제는, 다른 것 중에서 이들 자체로 환자에 독성이거나 독성 이하인 수준으로만 유효한 독소루비신(아드리아마이신), 시스플라틴 블레오마이신 설페이트, 카르뮤스틴, 크로르암부실, 디카르바진 및 시클로포스파미드 하이드록시우레아와 같은 항-신생 제제를 포함한다. 시스플라틴은 매 4주에 한번 씩 100 mg/복용량으로 정맥 내로 투여되고, 그리고 아드리아마이신은 매 21일에 한번 씩 60-75 mg/ml 복용량으로 정맥 내로 투여된다. 화학치료제와 본 개시사항의 인간 항-O8E 항체 또는 이들의 항원 결합 부분의 공동 투여는 인간 종양 세포에 대해 세포독성 효과를 생성하는 다른 메카니즘을 통해 작동하는 두 개의 항암 제제를 제공한다. 이러한 공동 투여는 약물에 대한 저항성의 전개 또는 항체로 이들 종양 세포에 비반응성을 부여하는 종양 세포의 항원성에 있어서의 변화에 기인한 문제점을 해결할 수 있다.
또한 본 개시사항의 항체 조성물(예를 들어, 인간 항체, 비스페시픽 또는 멀티스페시픽 분자 또는 면역컨쥬게이트) 및 사용 지시를 포함하는 키트도 본 발명의 범주 내이다. 이 키트는 더욱이 적어도 하나의 부가적인 시약 또는 본 개시사항의 하나 또는 그 이상의 부가적인 인간 항체(예를 들어, 제일 인간 항체와 구별되는 O8E 항원 내에서 항원결정인자에 결합하는 상보적인 활성을 갖는 인간 항체)를 포함할 수 있다. 키트는 전형적으로 키트 내용물의 의도된 사용을 지시하는 라벨을 포함한다. 이 용어 라벨은 키트와 같이 또는 그렇지 않으면 키트를 수반하여 공급된 활자 또는 기록물을 포함한다.
조합 치료법
일 실시형태에서, 본 개시사항은 대상에 O8E 항체 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 항체를 투여하는 것을 포함하는 과증식 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 더욱이 실시형태에 있어서, 항-O8E 항체는 필요량 이하로 처방된 복용량으로 투여되고, 항-CTLA-4 및/또는 PD-I 항체는 필요량 이하로 처방된 복용량으로 투여되거나 또는 양자가 필요량 이하로 처방된 복용량으로 투여된다. 다른 실시형태에 있어서, 본 개시사항은 대상에 O8E 항체를 투여하고 그리고 필요량 이하로 처방된 복용량의 항-CTLA-4 및/또는 PD-1 항체를 투여하는 것을 포함하는 면역자극제제로 과증식 질환의 치료와 연관된 부작용을 개선하는 방법을 제공한다. 어떤 실시형태에 있어서, 대상은 인간이다. 어떤 실시형태에서는, 항-CTLA-4 항체는 인간 시퀀스 모노클로날 항체 10Dl이고 그리고 항-PD-1 항체는 17D8, 2D3, 4Hl, 5C4 및 4Al1과 같은 인간 시퀀스 모노클로날 항체이다. 인간 시퀀스 모노클로날 항체 10Dl은 U.S. 특허번호 6,984,720호에 기술된 것과 같이 분리되고 그리고 구조적으로 특징되어 진다. 인간 시퀀스 모노클로날 항체 17D8, 2D3, 4Hl, 5C4 and 4Al1은 U.S. 가 특허번호 60/679,466호에 기술된 것과 같이 분리되고 그리고 구조적으로 특징되어 진다.
항-O8E, 항-CTLA-4 항체 및 항-PD-1 모노클로날 항체 (mAbs) 및 본 개시사항의 인간 시퀀스 항체는 통상적인 모노클로날 항체 방법론, 즉 콜러와 밀스타인 (1975)에 의한 Nature 256:495의 표준 체세포 하이브리드화 방법을 포함하는 다양한 기술에 의해 생산되어 질 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하기 위한 방법, 즉 B 림프구의 바이러스의 또는 발암성 형질전환이 채용되어 질 수 있다. 하이브리도마르 제조하기 위한 일 동물계는 뮤어라인 계이다. 마우스에서 하이브리도마 생산은 아주 잘 확립된 절차이다. 용융을 위한 면역화된 지라의 분리를 위한 면역화 프로토콜 및 기술은 이 기술 분야에 잘 알려져 있다. 용융 파트너(즉, 뮤어라인 미엘로마 세포) 및 용융 절차도 또한 질 알려져 있다(즉, Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York 참고).
항체의 조합은 O8E 및 PD-1 및/또는 CTLA-4의 차단에 의한 과증식 질환에 대한 면역 반응의 고양에 유용하다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시사항의 항체는 인간 항체이다. 예를 들어, 이들 분자들은 다양한 상황에서 면역원성을 고양하기 위해 배양 중의, 실험관에 또는 생체 외에, 또는 인간 대상, 즉 생체 내의 세포에 투여되어 질 수 있다. 따라서, 일 측면에서, 본 개시사항은 대상에 있어서 면역 반응이 변형되도록, 대상에 본 개시사항의 항원 조합 또는 이들의 항원 결합 부분의 조합을 투여하는 것을 포함하는 대상에 있어서의 면역 반응을 변형하는 방법을 제공한다. 바람직하기로는, 반응은 고양되거나, 자극되거나 또는 상향-조절되어 진다. 다른 실시형태에 있어서, 본 개시사항은 대상에 항-CTLA-4 또는 항-PD-1 항체의 치료량 이하의 복용량 및 항-O8E 항체를 투여하는 것을 포함하는 면역자극제의 치료제로 과증식 질병의 치료와 연관된 부작용을 개선하는 방법을 제공한다.
항체에 의한 O8E, PD-I 및 CTLA-4의 차단은 환자에 있어서 암 세포에 대한 면역 반응을 고양할 수 있다. 그 성장이 본 개시사항의 항체를 사용하여 저해되어 질 수 있는 암은 전형적으로 면역치료법에 반응성인 암을 포함한다. 본 개시사항의 조합치료법으로 치료하기 위한 암의 대표적인 예는 멜라노마 (예를 들면, 전이성 악성 멜라노마), 신장 암, 전립선 암, 유방암, 결장암 및 폐암을 포함한다. 본 개시사항의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 다른 암의 예로는 골암, 췌장암, 피부암, 머리 또는 목의 암, 피부 또는 안구 악성 멜라노마, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 지역의 암, 위암, 고환 암, 자궁암, 나팔관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 외음문암, 호킨스질병, 비-홉킨스 림프종, 식도암, 작은 창자 암, 내분비계 암, 갑상선암, 부 동맥 암, 부신암, 연질 조직의 육종, 요도암, 성기암, 급성 미엘로마 백혈병, 만성 미엘로마 백혈병을 포함하는 만성 또는 급성 백혈병, 급성 림프 백혈병, 만성 림프 백혈병, 유년의 고체 종양, 림프 임파종, 방광암, 신장 또는 요관 암, 신장 골반 암, 중추 신경계(CNS) 종양, 기본 CNS 림프종, 신생혈관형성 종양, 척추 축 종양, 뇌 줄기 신경아교종, 뇌하수체선종, 카포지의 종양, 상피 암, 비늘모양 세포 암, T-세포 림프종, 석면에 의해 유발된 것을 포함하는 환경적으로 유발된 암 및 상기 암들의 조합을 포함한다. 본 개시사항은 또한 전이성 암의 치료에 유용하다.
어떤 실시형태에 있어서, 여기에 기술된 치료적인 항체의 조합이 약학적으로 허용될 수 있는 담체에 단일 조성물로 동시적으로 또는 약학적으로 허용될 수 있는 담체에 각각의 항체를 갖는 별도의 조성물로 동시적으로 투여되어 질 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 치료적인 항체의 조합은 연속적으로 투여되어 질 수 있다. 예를 들어, 항-O8E 항체 및 항-PD-1 항체는 항-O8E 항체가 먼저 투여되어 지고 그리고 항-PD-1가 두 번째로 또는 항-PD-1 항체가 먼저 투여되어 지고 그리고 항-O8E 가 두 번째로 투여되는 것과 같이 연속적으로 투여되어 질 수 있다. 더욱이, 만일 일 복용량 이상의 조합 치료가 연속적으로 투여되어 진다면, 연속적인 투여의 순서는 각 투여의 시점에서 뒤집어 지거나 또는 동일한 순서로 유지될 수 있고, 연속적인 투여는 동시적인 투여 또는 이들의 조합과 조합되어 질 수 있다. 예를 들어, 항-O8E 항체 및 항-PD-1 항체 조합의 제 일차 투여는 동시에 되어 질 수 있고, 제 이차 투여는 항-O8E이 먼저 투여되어 지고 그리고 항-PD-1가 두 번째로 연속적으로 되고 그리고 제 삼차 투여는 항-PD-1가 먼저 투여되어 지고 그리고 항-O8E가 두 번째로 연속적으로 투여될 수 있다. 또 다른 대표적인 복용 계획은 항-PD-1가 먼저 투여되어 지고 그리고 항-O8E가 두 번째로 연속적으로 되는 제 일차 투여와 이어지는 투여는 동시에 되어지는 것을 포함한다.
선택적으로, 항-O8E 및 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 항체의 조합은 더욱이, 암 세포, 정제된 종양 항원(재조합 단백질, 펩티드 및 탄화수소 분자), 면역 자극 시토킨을 코드하는 유전자를 갖는 세포 및 이로 형질전환된 세포와 같은 면역성 제제와 조합되어 질 수 있다 (He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28). 사용될 수 있는 종양 백신의 비-제한적인 예는 gplOO의 펩티드와 같은 멜라노마 항원, MAGE 항원, Trp-2, MARTl 및/또는 트립시나제의 펩티드 또는 시토킨 GM-CSF를 발현하기 위해 형질전환된 종양 세포를 포함한다(아래에 더 자세하게 기술함).
조합된 O8E 및 PD-1 및/또는 CTLA-4 차단은 더욱이 백신화 프로토콜과 조합되어 질 수 있다. 종양에 대한 백신화에 대해 많은 실험적 책략이 고안되어 왔다(Rosenberg, S. (2000) Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C, 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. (2000) ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. (2000) ASCO Educational Book Spring: 730-738 참고; 또한, Restifo and Sznol, Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043 in De Vita et al (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology. Fifth Edition 참고). 이들 책략 중 하나에 있어서는, 백신은 자가조직의 또는 동종이계의 종양 세포를 사용하여 제조된다. 이들 세포성 백신은 종양 세포가 GM-CSF를 발현하기 위해 형질도입될 때 가장 유효한 것으로 보여진다. GM-CSF는 종양 백신화반응에 대한 항원 표시의 강력한 활성자인 것으로 나타났다 (Dranoff et al. (1993) Proc . Natl . Acad . Sd U.S.A. 90: 3539-43).
다양한 종양으로의 유전자 발현 및 큰 스케일 유전자 발현 패턴의 연구는 소위 종양 특이적 항원의 정의로 이끈다 (Rosenberg (1999) Immunity 10: 281-7). 많은 경우에, 이들 종양 특이적 항원은, 예를 들어 멜라노사이트 항원 gplOO, MAGE 항원 및 Trp-2와 같은, 종양이 발생하는 세포에 그리고 종양에 발현된 분화 항원이다. 보다 중요하기로는, 이들 항원의 대부분은 숙주에서 발견된 종양 특이적 T 세포의 타겟인 것으로 보여 질 수 있다. 어떤 실시형태에서, 여기에 기술된 항체 조성물을 사용한 조합된 O8E 및 PD-l 및/또는 CTLA-4 차단은 종양에서 발현된 재조합 단백질 및/또는 펩티드의 집합과 조합하여 이들 단백질에 반응하는 면역을 발생하기 위해 사용되어 질 수 있다. 이들 단백질은 자가 항원으로 면역계에 의하여 정상적으로 검토되고 따라서 이들에 내성인 것이다. 종양 항원은 또한 크로모솜의 말단 소립의 합성에 필요되고 그리고 인간 암의 85% 이상으로 그리고 단지 제한된 수의 체세포 조직에서만 발현되는 단백질 말단 소립을 포함한다 (Kim, N et al. (1994) Science 266: 2011-2013). (이들 체세포 조직은 다양한 수단에 의한 면역 공격으로부터 보호되어 질 수 있다). 종양 항원은 또한 단백질 시퀀스를 변형하거나 또는 두 개의 비관련 시퀀스 사이의 용융 단백질 (예를 들어, 필라델피아 크로모솜에서의 bcr-abl) 또는 B 세포 조양으로부터의 유전자형을 창출하는 체세포돌연변이 때문에 암 세포에서 발현된 "네오-항원"일 수 있다.
다른 종양 백신은 인간 파필로마 바이러스 (HPV), 간염 바이러스 (HBV 및 HCV) 그리고 카포지의 헤르페스 암종 바이러스 (KHSV)와 같은 인간 암에 유입된 바이러스로부터의 단백질을 포함할 수 있다. O8E 차단과 융합하여 사용될 수 있는 종양 특이적 항원의 다른 형태는 그 자체 종양 조직으로부터 분리된 정제된 열 충격 단백질(HSP)이다. 이들 열 충격 단백질은 종양 세포로부터의 단백질의 분획을 포함하고 그리고 이들 HSP들은 종양 면역성을 이끌어 내기 위한 항원 내재 세포로 전달에 아주 효과적이다 (Suot, R & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamura et al. (1997) Science 278:117-120).
수지상 세포 (DC)는 수위의 항원-특이적 반응에 사용될 수 있는 강력한 항원 내재 세포이다. DC들은 생체 외로 생산되어 질 수 있고 그리고 다양한 단백질 및 펩티드 항원 뿐 아니라 종양 세포 추출물들로 적하되어 질 수 있다 (Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332). DC들은 또한 이들 종양 항원을 보다 잘 발현하기 위해 유전적인 수단에 의해 형질도입되어 질 수 있다. DC들은 또한 면역화의 목적을 위해 종양 세포에 직접적으로 용융되어 진다 (Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336). 백신화의 방법으로서 DC 면역화반응이 보다 강력한 항-종양 반응을 활성화하기 위하여 조합된 O8E 및 PD-1 및/또는 CTLA-4 차단과 효과적으로 더 조합되어 질 수 있다.
조합된 O8E 및 PD-1 및/또는 CTLA-4 차단은 또한 표준 암 치료와 더 조합되어 질 수 있다. 예를 들어, 조합된 O8E 및 PD-1 및/또는 CTLA-4 차단은 화학치료 요법제와 효과적으로 조합되어 질 수 있다. 이들 경우에, 항-O8E 및 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 항체의 조합으로 관찰되어 진 바와 같이, 본 개시사항의 조합의 투여로 다른 투여된 화학치료제의 복용량을 감소하는 것이 가능할 수 있다(Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304). 화학적 치료와 O8E 및 PD-1 및/또는 CTLA-4 차단의 조합된 사용을 뒤로한 과학적 이론적 해석은 가장 화학적 치료적 화합물의 세포독성 작용의 결과인 세포 사가 항원 내재 경로에 있어서 종양 항원의 증가된 준위를 초래한다는 것이다. 세포 사를 통한 조합된 O8E 및 PD-1 및/또는 CTLA-4 차단으로 시너지를 초래할 수 있는 다른 조합 치료법은 방사선, 수술 및 호르몬 상실이다. 이들 프로토콜의 각각은 숙주에 있어서 종양 항원의 근원을 만든다. 혈관종생성 저해제는 또한 조합된 O8E 및 PD-1 및/또는 CTLA-4 차단과 조합되어 질 수 있다. 혈관종생성의 저해는 숙주 항원 내재 경로로 종양 항원 원이 공급될 수 있는 종양 세포 사를 이끈다.
O8E 및 PD-1 및/또는 CTLA-4 블럭킹 항체의 조합은 또한 종양 세포에 Fc α 또는 Fc γ 리셉터-발현 이펙터 세포를 타겟으로 하는 비스페시픽 항체와 조합하여 사용될 수 있다 (예를 들어, U.S. 특허번호 5,922,845 및 5,837,243 참고). 비스페시픽 항체는 두 개의 별도의 항원을 타겟으로 하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-Fc 리셉터/항 종양 항원(예를 들어, Her-2/neu) 비스페시픽 항체는 종양 사이트에 매크로파아지를 타겟으로 하기 위해 사용된다. 이 타겟화는 종양 특이적 반응을 보다 효과적으로 활성화할 수 있다. 이들 반응의 T 세포 암은 조합된 O8E 및 PD-1 및/또는 CTLA-4 차단의 사용에 의하여 증강되어 질 것이다. 대안적으로, 항원은 종양 항원 및 수지상 세포 특이적 세포 표면 마커에 결합하는 비스페시픽 항체의 사용에 의해 DC들에 직접적으로 전달되어 질 수 있다.
다른 예에서, 항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체의 조합은 리룩산® (rituximab), 허셉틴® (trastuzumab), 벡싸르® (tositumomab), 제발린® (ibritumomab), 캠파스® (alemtuzumab), 림포사이드® (eprtuzumab), 아바스틴® (bevacizumab) 및 타르세바® (erlotinib) 등과 같은 항-신생 항체들과 조합하여 사용되어 질 수 있다. 이론으로 한정되어 지는 것을 원하는 것이 아닌 일 예로, 항-암 항체 또는 독에 컨쥬게이트된 항-암 항체로의 치료는 O8E, CTLA-4 또는 PD-1에 의해 매개된 면역 반응을 가능하게 하는 암 세포 사(즉, 종양 세포)로 이끌 수 있다. 예시적인 실시형태에서는, 과증식 질환(즉, 암 종양)의 치료는 숙주에 의한 항-종양 면역 반응을 가능하게 할 수 있는, 항-O8E 및 항-PD-1 및/또는 항-CTLA-4 항체, 동시적으로 또는 연차적으로 이들의 조합과 조합한 항-암 항체를 포함할 수 있다.
종양은 아주 다양한 메카니즘에 의해 숙주 면역 감시를 회피한다. 많은 이들 메카니즘은 종양에 의해 발현되고 그리고 면역억제적인 단백질의 비활성화에 의해 극복될 수 있다. 이들은, 다른 것들 중에서, TGF-β (Kehrl, J. et al. (1986) J Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard, M. & O'Garra, A. (1992) Immunology Today 13: 198-200) 및 Fas 리간드 (Hahne, M. et al. (1996) Science 274: 1363-1365)를 포함한다. 다른 실시예에서, 각 이들 시체에 대한 항체는 면역 억제 제제의 효과에 반대작용하고 그리고 숙주에 의한 항-종양 면역 반응에 유리한 항-O8E 및 항-PD-1 및/또는 항-CTLA-4 조합으로 더 조합되어 질 수 있다.
숙주 면역 반응성을 활성화하기 위해 사용될 수 있는 다른 항체는 더욱이 항-O8E 및 항-PD-1 및/또는 항-CTLA-4 조합과 조합하여 사용될 수 있다. 이들은 DC 기능과 항원 내재를 활성화하는 수지상 세포의 표면상의 분자를 포함한다. 항-CD40 항체는 T 세포 헬퍼 활성에 대해 효과적으로 치환될 수 있고 (Ridge, J. et al (1998) Nature 393: 474-478) 그리고 항-CTLA-4와 조합하여 효과적이라는 것을 보여준다 (Ito, N. et al (2000) Immunobiology 201 (5) 527-40). OX-40 (Weinberg, A. et al. (2000) Immunol 164: 2160- 2169), 4-1BB (Melero, I. et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997)), PD-I (del Rio et al. (2005) Eur J Immunol. 35:3545-60) 및 ICOS (Hutloff, A. et al (1999) Nature 397: 262-266)와 같은 T 세포 공동자극의 분자에 대한 활성화하는 항체가 또한 T 세포 활성화의 증진된 준위를 제공할 수 있다.
골수이식은 조혈제 유래의 각종 종양을 치료하기 위해 현재 사용되어 지고 있다. 숙주 질병에 대한 이식이 이들 치료의 결과이지만, 치료적 이점은 종양 반응에 대해 이식으로부터 얻어질 수 있다. 조합된 O8E 및 PD-1 및/또는 CTLA-4 차단은 공여자 융합 종양 특이적 T 세포의 유효성을 증가하기 위하여 사용되어 질 수 있다.
또한, 항원 특이적 T 세포의 생체 외 활성화와 팽창을 포함하고 그리고 종양에 대해 항원 특이적 T 세포로 하기 위해 수용체로 이들 세포의 적응적 전이를 하는 몇 가지의 실험적 치료 프로토콜이 있다 (Greenberg, R. & Riddell, S. (1999) Science 285: 546-51). 이들 방법은 또한 CMV와 같은 전염성 제제에 대해 T 세포 반응을 활성화하기 위해 사용될 수 있다. 항-O8E 및 항-PD-1 및/또는 항-CTLA-4 항체의 존재에서 생체 외 활성화는 채용적으로 전이된 T 세포의 빈도와 활성을 증가하는 것으로 기대될 수 있다.
여기에 제시된 바와 같이 조직은 항-CTLA-4 항체로 치료 후 GI 트랙 (설사 및 대장염) 및 피부 (홍조 및 소양증)와 같은 면역자극적 치료적 항체에 따른 면역-관련 부작용을 보일 수 있다. 예를 들어, 비-결장 위장 내의 면역-관련 부작용이 또한 항-CTLA-4 항체 치료 후 식도(식도경련), 십이지장(십이지장염) 및 회장(회장염)에서 관찰될 수 있다.
어떤 실시형태에 있어서, 본 개시사항은 대상에 항-O8E 항체 및 치료량 이하의 복용량의 항-CTLA-4 항체를 투여하는 것을 포함하는, 면역 자극 제제로 과증식 질환의 치료와 관련된 부작용을 개선하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 개시사항의 방법은 환자에게 흡수될 수 없는 스테로이드를 투여함에 의해, 면역자극 치료적 항체-유도 대장염이나 또는 설사의 발생빈도를 감소하는 방법에 대해 제공한다. 면역자극 치료적 항체를 받아들이는 환자들은 이러한 항체에 의해 유도된 대장염이나 설사를 진행하는 위험에 있기 때문에,이 전체 환자들은 본 개시사항의 방법에 따른 치료법에 대해 적절하다. 비록 스테로이드가 염증성 장 질환(IBD)을 치료하고 IBD의 악화를 예방하기 위해 투여되어져 왔지만, 이들이 IBD로 진단되지 않은 환자에게 IBD(의 발생빈도 감소)를 방지하기 위해 사용되어 지지는 않았다. 비록 흡수될 수 없는 스테로이드이지만, 이 스테로이드와 유의성 있는 관련된 부작용은 예방적 사용을 억제하여 왔다.
또 다른 실시형태에 있어서, 조합 O8E 및 PD-1 및/또는 CTLA-4 차단(즉, 면역자극적 치료적 항체 항-O8E 및 항-PD-1 및/또는 항-CTLA-4)은 어떤 흡수될 수 없는 스테로이드의 사용과 더 조합되어 질 수 있다. 여기에서 사용된 것으로서, "흡수되어 질 수 없는 스테로이드"는 간에서의 대사작용에 따라, 스테로이드의 생체 내 이용가능성이 낮게 되도록, 즉 약 20% 이하로 되도록 광범위한 일차 통과 대사작용을 나타내는 글루코코르티코이드이다. 본 개시사항의 일 실시형태에 있어서, 흡수되어 질 수 없는 스테로이드는 부데소니드이다. 부데소니드는 국소적으로 작용하는 글루코코르티코스테로이드로, 경구 투여 후 일차적으로 간에 의하여 광범위하게 대사되어 진다. ENTOCORT EC® (Astra-Zeneca)는 회장에 그리고 결장을 통하여 약물 전달을 최적화하기 위해 개발된 부데소니드의 pH- 및 시간-의존성 경구 제형이다. ENTOCORT EC®는 회장 및/또는 상승하는 결장을 포함하는 크론병을 조절하기 위한 온화한 치료를 위해 미국에서 승인되었다. 크론병의 치료를 위한 ENTOCORT EC®의 통상적인 경구 복용량은 6 내지 9 mg/일 이다. ENTOCORT EC®는 소화관 점막 내에 흡수되어 보유되어 지기 전에 소화관으로 방출되어 진다. 일단 이것은 소화관 점막 표적 조직을 통과하기만 하면, ENTOCORT EC®는 간에서 사이토크롬 P450 시스템에 의해 광범위하게 대사되어져 대수롭지 않은 글루코코르티코이드 활성을 대사한다. 따라서, 생체이용가능성은 낮다(약 10%). 부데소니드의 낮은 생체이용가능성은 보다 덜 광범위한 제일-통과 대사작용을 갖는 다른 글루코코르티코이드에 비교하여 개선된 치료율을 가져온다. 부데소니드는 계통적으로-작용하는 코르티코스테로이드류보다 보다 적은 시상하부-뇌하수체이상분비로 인한 억제를 포함하는 보다 적은 부작용을 초래한다. 그러나, ENTOCORT EC®의 만성적 투여는 하이퍼코르티시즘 및 부신의 억제와 같은 계통적인 글루코코르티코이드 효과를 초래할 수 있다. PDR 58th ed. 2004; 608-610 참고.
더욱이 다른 실시형태에 있어서, 흡수되어 질 수 없는 스테로이드와 조합하여 조합 O8E 및 PD-1 및/또는 CTLA-4 차단(즉, 면역자극적 치료적 항체 항-O8E 및 항-PD-1 및/또는 항-CTLA-4)은 더욱이 살리실레이트와 조합되어 질 수 있다. 살리실레이트는, 예를 들어: 설파살라진(AZULFIDINE®, Pharmacia & UpJohn); 올살라진 (DIPENTUM®, Pharmacia & UpJohn); 발살라지드(COLAZAL®, Salix Pharmaceuticals, Inc.); 및 메살라민(ASACOL®, Procter & Gamble Pharmaceuticals; PENTASA®, Shire US; CANASA®, Axcan Scandipharm, Inc.; ROWASA®, Solvay)과 같은 5-ASA 제제를 포함한다.
본 개시사항의 방법에 따르면, 항-O8E 및 항-PD-1 및/또는 항-CTLA-4 항체 및 흡수되어 질 수 없는 스테로이드와 조합하여 투여된 살리실레이트는 면역자극적 항체에 의해 유도된 대장염의 발생빈도를 감소할 목적으로 살리실레이트 및 흡수되어 질 수 없는 스테로이드의 오버랩핑이나 또는 연속적인 투여를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 개시사항에 따라 면역자극적 항체에 의해 유도된 대장염의 발생빈도를 감소하는 방법은 살리실레이트 및 흡수되어 질 수 없는 스테로이드를 동시적으로 또는 연속적으로(즉, 살리실레이트가 흡수되어 질 수 없는 스테로이드 투여 6 시간 후 투여됨) 또는 이들의 조합으로 투여되는 것을 포함한다. 더욱이, 본 개시사항에 따르면, 살리실레이트 및 흡수되어 질 수 없는 스테로이드는 동일한 경로(즉, 양자가 경구적으로 투여됨)에 의하거나 또는 다른 경로(즉, 살리실레이트는 경구적으로 투여되고 그리고 흡수되어 질 수 없는 스테로이드는 직장으로 투여됨)에 의해 투여되어 질 수 있고, 이것은 항-O8E, 항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체를 투여하기 위해 사용된 경로와 다를 수 있다.
보체가 결합하는 IgGl, -2 또는 -3 또는 IgM로부터의 부분과 같이 보체 결합 사이트를 갖는 본 개시사항의 조성물(즉, 인간 항체, 멀티스페시픽 및 비티스페시픽 분자 또는 면역컨쥬게이트)는 또한 보체의 존재하에서 사용되어 질 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 본 개시사항의 결합 제제 및 적절한 이펙터 세포를 갖는 표적 세포를 포함하는 세포 군집의 생체 외 처리는 보체 또는 보체를 함유하는 혈청의 부가에 의해 보충되어 질 수 있다. 본 개시사항의 결합 제제로 도포된 표적 세포들의 식세포작용은 보체 단백질을 결합하에 의해 개선되어 질 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 본 개시사항의 조성물(즉, 인간 항체, 멀티스페시픽 및 비티스페시픽 분자)로 도포된 표적 세포들은 또한 보체에 의해 용해되어 질 수 있다.
더욱 다른 실시형태에 있어서, 본 개시사항의 조성물은 보체를 활성화하지 않는다.
본 개시사항의 조성물(즉, 인간 항체, 멀티스페시픽 및 비티스페시픽 분자 또는 면역컨쥬게이트)는 또한 보체와 함께 투여되어 질 수 있다. 따라서, 본 개시사항의 범위 내에서는 인간 항체, 멀티스페시픽 또는 비티스페시픽 분자 및 혈청이나 보체를 포함하는 조성물을 포함한다. 이들 조성물은 보체가 인간 항체, 멀티스페시픽 또는 비티스페시픽 분자에 근접하여 위치되어 진다는 이점이 있다. 대안적으로, 본 개시사항의 인간 항체, 멀티스페시픽 또는 비티스페시픽 분자 및 보체 또는 혈청은 별도로 투여되어 질 수 있다. 따라서, 본 개시사항의 항체 조성물로 치료된 환자는 세포독성 또는 방사성 독성제제와 같은 인간 항체의 치료적 효과를 증진하거나 고양하는 다른 치료제제와 같이 (본 개시사항의 인간 항체 투여 전에, 동시에, 또는 그 후에) 부가적으로 투여되어 질 수 있다.
다른 실시형태에서, 대상은 예를 들어 시토킨으로 대상을 치료함에 의해 Fcγ 또는 Fcγ 수용체의 발현 또는 활성을 조절, 즉 증진하거나 저해하는 제제로 부가적으로 처리되어 질 수 있다. 멀티스페시픽 분자로 치료하는 동안 투여하기 위한 바람직한 시토킨은 그래뉼로사이트 콜로니-자극 인자(G-CSF), 그래뉼로사이트-매크로파이지 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 인터페론-γ(IFN-γ) 및 종양 괴사 인자 (TNF)를 포함한다.
본 개시사항의 조성물(즉, 인간 항체, 멀티스페시픽 분자 및 비스페시픽 분자)은 예를 들어 FcγR 또는 O8E 세포를 표지하기 위해 이들 세포를 발현하는 표적 세포로 또한 사용되어 질 수 있다. 이러한 용도를 위해, 결합 제제는 검출되어 질 수 있는 분자에 연결되어 질 수 있다. 따라서, 본 개시사항은 FcγR 또는 O8E와 같은 Fc 수용체 발현 세포를 생체 외 또는 실험실 내에서 어떤 장소에 배치하는 방법을 제공한다. 검출가능한 라벨은 즉, 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 코-팩터일 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시사항은 샘플 또는 대조 샘플을 인간 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위와 접촉하는 것을 포함하여, 항체 또는 이들의 부분과 O8E와의 복합체를 형성할 수 있게 하는 조건하에서 O8E에 특이적으로 결합하는, 샘플에서 O8E 항원의 존재를 검출하거나 또는 O8E 항원의 양을 측정하는 방법을 제공한다. 이 복합체의 형성이 그런 다음 검출되고, 여기서 대조 샘플에 비교된 샘플과의 사이에서 복합체 형성의 차이가 샘플에 있어서의 O8E 항원의 존재를 암시한다.
다른 실시형태에 있어서, 본 개시사항은 대상에 O8E 매개 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
더욱이 다른 실시형태에서, 본 개시사항의 면역컨쥬게이트는 이런 화합물을 항체에 연결함에 의해 O8E 세포 표면 수용체를 갖는 세포에 대해 표적 화합물(즉, 치료적 제제, 라벨, 세포독성, 방사성 독성 면역억제제 등)로 하기 위해 사용되어 질 수 있다. 예를 들어, 항-O8E 항체는, 여기서 그 전체로서 레퍼런스로 합체되어 지는 미국 특허출원 번호 10/160,972, 10/161,233, 10/161,234, 11/134,826, 11/134,685 및 U.S. 가 특허출원 번호 60/720,499에 기술된 바와 같이 UPT5에 컨쥬게이트되어 질 수 있거나, 및/또는 미국 특허번호 6,281,354 및 6,548,530, 미국 특허공개번호 20030050331, 20030064984, 20030073852 및 20040087497에 기술된 또는 WO 03/022806에 공개된 독성 화합물에 컨쥬게이트되어 질 수 있다. 따라서, 본 개시사항은 또한 O8E 발현 세포를 (즉, 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 코-팩터와 같은 검출가능한 라벨로)생체 외 또는 생체 내에 배치하는 방법을 제공한다. 대안적으로, 면역컨쥬게이트는 O8E에 세포독성 또는 방사성 독성을 표적함에 의해 O8E 세포 표면 수용체를 가지는 세포를 사멸하기 위해 사용되어 질 수 있다.
본 개시사항은 부가적인 제한으로서 해석되지 않는 다음의 실시예에 의하여 더욱 자세히 기술된다. 모든 도면 및 이 출원 명세서 전체를 통해 인용된 모든 레퍼런스, 특허 및 공개된 특허출원은 분명하게 여기에 레퍼런스로 합체되어 진다.
실시예
실시예 1
O8E 에 대한 인간 모노클로날 항체의 생성
이 실시예는 인간 O8E (a/k/a B7H4, B7S1 및 B7x)에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체의 생성을 개시한다.
항원
CHO 및 HEK-293 세포가 표준 재조합 트랜스펙션 방법을 사용하여 O8E로 트랜스펙트되고 그리고 면역화 반응을 위한 항원으로 사용되었다. 부가하여, 재조합 O8E가 단독으로 또한 면역화 반응을 위한 항원으로 사용되었다.
형질전환 HuMAb 마우스® 및 KM 마우스®
O8E에 대해 완전한 인간 모노클로날 항체가, 인간 항체 유전자를 각각 발현하는 형질전환성 트랜스크로모솜 마우스의 KM 스트레인 및 형질전환 HuMAb 마우스®의 HCo7 및 HCo12 스트레인을 사용하여 제조되었다. 이들 마우스 주들의 각각에 있어서, 내인성 마우스 카파 경사슬 유전자는 Chen et al. (1993) EMBO J. .12:811-820에 기술된 바와 같이 열성동형으로 파열되었고 그리고 내인성 마우스 중사슬 유전자는 PCT 공개공보 WO 01/09187의 실시예 1에 기술된 바와 같이 열성동형으로 파열되었다. 이들 마우스 주들의 각각은 Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851에 기술된 바와 같이 인간 카파 경사슬 이식 유전자 KCo5를 담지한다. HCo7 스트레인은 U.S. 특허번호 5,545,806; 5,625,825; 및 ,5,545,807호에 기술된 바와 같이 HCo7 인간 중사슬 이식 유전자를 담지한다. HCo 12 스트레인은 PCT 공개공보 WO 01/09187의 실시예 2에 기술된 바와 같이 HCo 12 인간 중사슬 이식 유전자를 담지한다. KM 마우스® 스트레인은 PCT 공개공보 WO 02/43478에 기술된 바와 같은 SC20 트랜스크로모솜을 포함한다.
HuMAb 및 KM 면역화반응:
O8E에 대해 완전한 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위해, HuMAb 마우스® 및 KM 마우스®의 마우스들이 CHO-O8E 트랜스펙트된 세포, HEK293-O8E 트랜스펙트된 세포 및/또는 정제된 재조합 O8E 단백질로 면역된다. HuMab 마우스®에 대한 일반적인 면역화 계획은 Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 11: 845-851, 및 PCT 공개공보 WO 98/24884에 기술되어 있다. 마우스는 항원의 제 일차 주입 후 6-16 주령이 되었다. O8E 단백질의 정제된 재조합 제제 (5-50 μg)이 HuMAb 마우스™ 및 KM 마우스™를 면역화하기 위해 사용되었다.
형질전환된 마우스는 컴플릿트 프로이드 어쥬번트 내에서 항원으로 복막 내로 (IP) 또는 피하로 (Sc) 이회 면역되고, 컴플릿트 프로이드 어쥬번트 내 항원으로 3-21일 IP 또는 SC 면역화(전체 11회 면역화까지)가 따른다. 면역 반응은 레트로오비탈 블리드에 의해 모니터되어 진다. 플라즈마는 ELISA에 의해 선별되고(아래에 기술됨과 같음) 그리고 충분한 역가의 항-O8E 인간 이뮤노글로불린을 갖는 마우스가 용융을 위해 사용되었다. 마우스는 희생되어 비장이 제거되기 3 및 2일 전에 정맥 내로 항원으로 면역되었다. 전형적으로는, 각 항원에 대해 10-35 용융이 수행되었다. 다수 무리의 마우스가 각 항원에 대해 면역화되었다.
항- O8E 항체를 생산하는 HuMb 마우스™ 또는 KM -마우스™의 셀렉션 :
O8E를 결합한 항체를 생산하는 HuMb 마우스™ 또는 KM-마우스™를 선택하기 위해, 면역화된 마우스로부터의 혈청이 Fishwild, D. et al. (1996)(supra)에 기술된 바와 같이 ELISA에 의하여 시험되었다. 간략하게는, 마이크로타이터 플레이트가 PBS 내 1-2 μg/ml로 정제된 재조합 O8E로 도포되어 지고, 50 μl/웰이 4℃에서 밤 세워 배양되고, 그런 다음 PBS/트윈 (0.05%) 내에 200 μl/웰의 5% 치킨 혈청으로 차단되었다. O8E-면역 마우스로부터의 혈청 희석이 각 월에 부가되고 그리고 대류 온도에서 1-2 시간 동안 배양된다. 플레이트는 PBS/트윈으로 수세되고 그런 다음 홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)와 컨쥬게이트된 고트-항-인간 IgG Fc 폴리크로날 항체로 1시간 동안 실온에서 배양된다. 수세 후, 플레이트는 ABTS 기판 (Sigma, A-1888, 0.22 mg/ml)으로 전개되고 그리고 OD 415-495에서 스펙트로포토미터에 의해 측정되었다. 가장 높은 역가의 항-O8E 항체를 전개한 마우스가 용융을 위해 사용되었다. 용융은 아래에 기술된 바와 같이 수행되었고, 하이브리도마 상등액이 ELISA 및 FACS에 의해 항-O8E 활성에 대해 시험되었다.
O8E 에 대해 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성:
HuMab 마우스™ 및 KM 마우스™로부터 분리된 마우스 비장세포가 표준 프로토콜에 기초한 PEG를 사용하여 마우스 미엘로마 셀 라인에 PEG로 용융되었다. 얻어진 하이브리도마는 그런 다음 항원-특이적 항체의 생성을 위해 선별되었다. 면역된 마우스로부터 비장 림프구의 단일 세포 현탁액이 50% PEG (Sigma)를 갖는 SP2/0 비분비 마우스 미엘로마 세포(ATCC, CRL 1581)의 사분의 일의 수에 용융된다. 세포는 평편 바닥 마이크로타이터 플레이트에 대략적으로 1x105/웰로 이식되어 지고, 10% 송아지 태반 혈청(Hyclone, Logan, UT)을 포함하는 선택배지, 10% P388D1 (ATCC, CRL TIB-63) 조건부 배지, 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-머캅토에탄올, 50 mg/ml 겐타마이신 및 IxHAT (Sigma, CRL P-7185)가 더해진 DMEM (Mediatech, CRL 10013, 고 글루코스, L-글루타민 및 소디움 피부레이트를 가짐) 내에 3-5% 오리진 (IGEN)에서 약 2주간 배양되어 진다. 1-2 주 후, 세포는 HAT가 HT로 대체된 배지에서 배양된다. 개개의 세포는 그런 다음 인간 항-O8E 모노클로날 IgG 항체에 대해 ELISA 및 FACS(상술한 것)에 의해 선별된다. 양성적인 클론은 그런 다음 O8E 양성 항체에 대해 O8E 재조합 단백질 상에서 ELISA에 의해 또는, 예를 들어 CHO-O8E 트렌스펙트된 세포인 O8E 발현 세포 상에서 FACS에 의해 선별된다. 간략하게는, O8E-발현 세포는 조직 배양 플라스크로부터 싱싱하게 수확되어지고 단일 세포 현탁액이 제조된다. O8E-발현 세포 현탁액은 프라이머리 항체로 직접적으로, 또는 PBS 내 1% 파라포름알데히드로 고정 후 염색되어 진다. 대략적으로, 일백만 세포가 0.5% BSA 및 50-200 μg/ml의 프라이머리 항체를 포함하는 PBS 내에 현탁되고, 그리고 30분 동안 얼음 상에서 배양되어 진다. 세포는 0.1% BSA, 0.01% NaN3를 포함하는 PBS로 이회 수세되고, 100 μl의 1:100으로 희석된 FITC-컨쥬게이트 고트-항-인간 IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)에 재현탁되고 그리고 추가적으로 30분 동안 얼음 상에서 배양되어 진다. 세포는 다시 이회 수세되고, 0.5 ml의 수세 완충액으로 1:100으로 희석된 FITC-컨쥬게이트 고트-항-인간 IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)에 재현탁되고 그리고 FACS캘리버 사이토메터 (Becton-Dickinson, San Jose, CA) 상에서 형광 염색으로 분석되어 진다.
일단 광범위한 하이브리도마 성장이 발생되면, 배지는 통상적으로 10-14일 후에 모니터된다. 항체-분비 하이브리도마가 재이식되고, 다시 선별되고, 그리고 여전히 인간 IgG에 대해 양성이면, 항-O8E 모노클로날 항체가 희석을 제한함에 의해 적어도 이회 서브클론되어 진다. 안정한 서브클론은 그런 다른 추가적인 특징화를 위해 조직 배양 배지에서 소량의 항체를 생성하기 위해 실험실 내에서 배양된다.
하이브리도마 클론 1G11, 2A7, 2F9, 12El 및 13D12가 부가적인 분석을 위해 선택되어 졌다.
실시예 2:
인간 모노클로날 항체 1 G11 , 2A7, 2F9, 12 El 및 13 D12 의 구조적 특징
이 실시예는 O8E에 특이적으로 결합하는 시퀀스 분석 다섯(5) 인간 모노클로날 항체를 개시한다.
1G11, 2A7, 2F9, 12El 및 13D12 모노클로날 항체의 중 및 경사슬 가변영역들을 코드하는 cDNA 시퀀스가 표준 PCR 기술을 사용하여 각각 1G11, 2A7, 2F9, 12El 및 13D12 하이브리도마로부터 수득되어 지고, 그리고 표준 DNA 시퀀싱 기술을 사용하여 시퀀스되었다.
1G11의 중사슬 가변영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 시퀀스는 도 1A와 SEQ ID NO:41 및 1에 각각 도시되어 있다.
1G11의 경사슬 가변영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 시퀀스는 도 1B와 SEQ ID NO:46 및 6에 각각 도시되어 있다.
공지된 인간 생식계열 이뮤노글로불린 중사슬 시퀀스에 1G11 중사슬 이뮤노글로불린 시퀀스의 비교는 1G11 중사슬이 인간 생식계열 VH 4-34로부터 VH 분절을 이용하는 것을 증명한다. 생식계열 VH 4-34 시퀀스에 대한 1G11 VH 시퀀스의 얼라인먼트는 도 6에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧트 시스템을 사용한 1G11 VH 시퀀스의 부가적인 분석은 도 1A 및 6과 SEQ ID NOs:11, 16 및 21에 각각 나타난 바와 같이 중사슬 CDRl, CDR2 및 CD3 영역의 윤곽을 이끌어낸다.
공지된 인간 생식계열 이뮤노글로불린 경사슬 시퀀스에 1G11 경사슬 이뮤노글로불린 시퀀스의 비교는 1G11 경사슬이 인간 생식계열 VK A27로부터 VL 분절을 이용하는 것을 증명한다. 생식계열 VK A27 시퀀스에 대한 1G11 VL 시퀀스의 얼라인먼트는 도 9에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧트 시스템을 사용한 1G11 VL 시퀀스의 부가적인 분석은 도 1B 및 9와 SEQ ID NOs:26, 31 및 36에 각각 나타난 바와 같이 중사슬 CDRl, CDR2 및 CD3 영역의 윤곽을 이끌어낸다.
2A7의 중사슬 가변영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 시퀀스는 도 2A와 SEQ ID NO:42 및 2에 각각 도시되어 있다.
2A7의 경사슬 가변영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 시퀀스는 도 2B와 SEQ ID NO:47 및 7에 각각 도시되어 있다.
공지된 인간 생식계열 이뮤노글로불린 중사슬 시퀀스에 2A7 중사슬 이뮤노글로불린 시퀀스의 비교는 2A7 중사슬이 인간 생식계열 VH 3-53으로부터 VH 분절 및 인간 생식계열 JH 6b로부터 JH 분절을 이용하는 것을 증명했다. 생식계열 VH 3-53 시퀀스에 대한 2A7 VH 시퀀스의 얼라인먼트는 도 7에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧트 시스템을 사용한 2A7 VH 시퀀스의 부가적인 분석은 도 2A 및 7과 SEQ ID NOs:12, 17 및 22에 각각 나타난 바와 같이 중사슬 CDRl, CDR2 및 CD3 영역의 윤곽을 이끌어낸다.
공지된 인간 생식계열 이뮤노글로불린 경사슬 시퀀스에 2A7 경사슬 이뮤노글로불린 시퀀스의 비교는 2A7 경사슬이 인간 생식계열 VK A27로부터 VL 분절을 이용하는 것을 증명했다. 생식계열 VK A27 시퀀스에 대한 2A7 VL 시퀀스의 얼라인먼트는 도 9에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧트 시스템을 사용한 2A7 VL 시퀀스의 부가적인 분석은 도 2B 및 9와 SEQ ID NOs:27, 32 및 37에 각각 나타난 바와 같이 경사슬 CDRl, CDR2 및 CD3 영역의 윤곽을 끌어낸다.
2F9의 중사슬 가변영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 시퀀스는 도 3A와 SEQ ID NO:43 및 3에 각각 도시되어 있다.
2F9의 경사슬 가변영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 시퀀스는 도 3B와 SEQ ID NO:48 및 8에 각각 도시되어 있다.
공지된 인간 생식계열 이뮤노글로불린 중사슬 시퀀스에 2F9 중사슬 이뮤노글로불린 시퀀스의 비교는 2F9 중사슬이 인간 생식계열 VH 3-53으로부터 VH 분절 및 인간 생식계열 JH 6b로부터 JH 분절을 이용하는 것을 증명했다. 생식계열 VH 3-53 시퀀스에 대한 2F9 VH 시퀀스의 얼라인먼트는 도 7에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧트 시스템을 사용한 2F9 VH 시퀀스의 부가적인 분석은 도 3A 및 7과 SEQ ID NOs:13, 18 및 23에 각각 나타난 바와 같이 중사슬 CDRl, CDR2 및 CD3 영역의 윤곽을 이끌어낸다.
공지된 인간 생식계열 이뮤노글로불린 경사슬 시퀀스에 2F9 경사슬 이뮤노글로불린 시퀀스의 비교는 2F9 경사슬이 인간 생식계열 VK A27로부터 VL 분절을 이용하는 것을 증명했다. 생식계열 VK A27 시퀀스에 대한 2F9 VL 시퀀스의 얼라인먼트는 도 9에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧트 시스템을 사용한 2F9 VL 시퀀스의 부가적인 분석은 도 3B 및 9와 SEQ ID NOs:28, 33 및 38에 각각 나타난 바와 같이 경사슬 CDRl, CDR2 및 CD3 영역의 윤곽을 이끌어낸다.
12E1의 중사슬 가변영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 시퀀스는 도 4A와 SEQ ID NO:44 및 4에 각각 도시되어 있다.
12E1의 경사슬 가변영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 시퀀스는 도 4B와 SEQ ID NO:49 및 9에 각각 도시되어 있다.
공지된 인간 생식계열 이뮤노글로불린 중사슬 시퀀스에 12E1 중사슬 이뮤노글로불린 시퀀스의 비교는 12E1 중사슬이 인간 생식계열 VH 3-9로부터 VH 분절, 인간 생식계열 3-10으로부터 D 분절 및 인간 생식계열 JH 6b로부터 JH 분절을 이용하는 것을 증명했다. 생식계열 VH 3-9 시퀀스에 대한 12E1 VH 시퀀스의 얼라인먼트는 도 8에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧트 시스템을 사용한 12E1 VH 시퀀스의 부가적인 분석은 도 3A 및 8과 SEQ ID NOs:14, 19 및 24에 각각 나타난 바와 같이 중사슬 CDRl, CDR2 및 CD3 영역의 윤곽을 끌어낸다.
공지된 인간 생식계열 이뮤노글로불린 중사슬 시퀀스에 12E1 경사슬 이뮤노글로불린 시퀀스의 비교는 12E1 경사슬이 인간 생식계열 VK L6으로부터 VL 분절 및 인간 생식계열 JK 1로부터 JK 분절을 이용하는 것을 증명했다. 생식계열 VK L6 시퀀스에 대한 12E1 VL 시퀀스의 얼라인먼트는 도 10에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧트 시스템을 사용한 12E1 VL 시퀀스의 부가적인 분석은 도 3B 및 10과 SEQ ID NOs:29, 34 및 39에 각각 나타난 바와 같이 경사슬 CDRl, CDR2 및 CD3 영역의 윤곽을 이끌어낸다.
13D12의 중사슬 가변영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 시퀀스는 도 5A와 SEQ ID NO:45 및 5에 각각 도시되어 있다.
13D12의 경사슬 가변영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 시퀀스는 도 5B와 SEQ ID NO:50 및 10에 각각 도시되어 있다.
공지된 인간 생식계열 이뮤노글로불린 중사슬 시퀀스에 13D12 중사슬 이뮤노글로불린 시퀀스의 비교는 13D12 중사슬이 인간 생식계열 VH 4-34로부터 VH 분절을 이용하는 것을 증명했다. 생식계열 VH 4-34 시퀀스에 대한 13D12 VH 시퀀스의 얼라인먼트는 도 6에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧트 시스템을 사용한 13D12 VH 시퀀스의 부가적인 분석은 도 5A 및 6과 SEQ ID NOs:15, 20 및 25에 각각 나타난 바와 같이 중사슬 CDRl, CDR2 및 CD3 영역의 윤곽을 끌어낸다.
공지된 인간 생식계열 이뮤노글로불린 경사슬 시퀀스에 13D12 경사슬 이뮤노글로불린 시퀀스의 비교는 13D12 경사슬이 인간 생식계열 VK A27로부터 VL 분절을 이용하는 것을 증명했다. 생식계열 VK A27 시퀀스에 대한 13D12 VL 시퀀스의 얼라인먼트는 도 9에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧트 시스템을 사용한 13D12 VL 시퀀스의 부가적인 분석은 도 5B 및 9와 SEQ ID NOs:30, 35 및 40에 각각 나타난 바와 같이 경사슬 CDRl, CDR2 및 CD3 영역의 윤곽을 이끌어낸다.
실시예 3 :
항-08E 인간 모노클로날 항체의 결합 특이성의 특징
이 실시예는 O8E에 대한 결합 특이성을 시험하기 위해 표준 ELISA에 의하여 수행된 면역정제된 O8E에 대한 결합에 대해 항-O8E 항체의 비교를 개시한다.
재조합 His-태그 및 myc-태그된 O8E가 플레이트 상에서 밤세워 도막되어 지고, 그런 다음 항-O8E 인간 모노클로날 항체 2A7, 12El 및 13Dl2에 대한 결합에 대하여 시험되어 진다. 표준 ELISA 절차가 수행되었다. 항-O8E 인간 모노클로날 항체가 1 μg/ml의 농도로 부가되고 그리고 1:2 일련의 희석으로 적정되어졌다. 홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)와 컨쥬게이트된 고트-항-인간 IgG (Fc 또는 카파 사슬-특이적) 폴리크로날 항체가 제 이차 항체로 사용되었다.
재조합 B7H4-Ig가 단백질 A를 사용하여 크로마토그라피에 의해 B7H4-Ig 컨스트럭트로 트랜스펙트된 293T 세포의 상등액으로부터 정제되었다. ELISA 플레이트는 인간 항체로 도포되고, 정제된 단백질이 부가되고 그런 다음 래빗 항-B7H4 항혈청으로 검출되었다. 도 11A 참고. C-9 태그를 갖는 재조합 펜타-B7H4 단백질이 2A7 어피니티 컬럼을 사용하여 크로마토그라피에 의해 펜타-B7H4-C9 컨스트럭트로 트랜스펙트된 293T 세포의 상등액으로부터 정제되었다. ELISA 플레이트는 항-마우스 Fc로 도포되고, 모노클로날 항-C9 (0.6 ug/ml)이 부가되고, 그런 다음 지시된 바와 같이 펜타-B7H4로 적정되고, 그런 다음 인간 항체가 1 ug/ml로 부가된다. 도포된 항-마우스 Fc에 M-항-C9 (0.6 ug/ml)이 따르고, 그런 다음 지시된 바와 같이 펜타-O8E로 적정되고, 그런 다음 HuMAbs @ 1 ug/ml로 부가된다. 도 11B 참고.
항-O8E 인간 모노클로날 항체 2A7, 12El 및 13D12는 O8E에 높은 특이성으로 결합했다.
실시예 4
유방 암종 세포 라인의 표면 상에 발현된 08E에 결합하는 항-08E 항체의 특징
이 실시예는 유동세포분석법에 의해 CHO-O8E (a/k/a B7H4, B7S1 and B7x) 형질전환체 및 그 세포 표면 상에 O8E를 발현하는 유방 세포 암종 세포에 결합하는 항-O8E 항체의 시험을 개시한다.
유방 세포 암종 세포 라인 SKBR3 (ATCC Accession No. HTB-30)뿐 아니라 O8E로 트랜스펙트된 CHO 세포라인이 항체 결합에 대해 시험되어 졌다. HuMAb 2A7 항-O8E 인간 모노클로날 항체의 결합은 2A7로 1 μg/ml의 농도에서 1x1O5 세포를 배양함에 의해 평가되었다. 세포가 수세되고 그리고 결합이 FITC-표지 항-인간 IgG Ab로 검출되었다. 유동세포분석법이 FACScan 유동세포분석법 (Becton Dickinson, San Jose, CA)을 사용하여 수행되었다. 결과는 도 12 및 13에 나타냈다.
이들 결과는 항-O8E HuMAbs가 O8E 발현 CHO 세포에 그리고 예시적인 유방 세포 암종 세포 라인에 결합하는 것을 입증한다.
실시예 5
항-08E 모노클로날 항체의 결합 친화도의 스카트챠드 분석법
이 실시예는 스카트챠드 분석법을 사용한 O8E 트랜스펙트된 HEK 세포 라인에 대한 결합 친화도에 대해 인간 모노클로날 항체 1G11, 2F9, 2A7, 12El 및 13D12 모노클로날 항체의 시험을 개시한다.
HEK 세포가 전 길이 O8E로 스카트챠드 기술을 사용하여 형질전환되고 10% 송아지 태반 혈청 (FBS)을 포함하는 RPMI 배지에서 성장된다. (도 12는 2A7 인간 항-O8E 모노클로날 항체로 이들의 HEK-O8E 세포의 FACs 분석을 나타낸다.) 세포는 트립신 처리되고 그리고 트리스 기재 결합 완충액(24mM Tris pH 7.2, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 2mM 글루코스, 1mM CaCl2, 1mM MgCl2, 0.1% BSA)으로 한번 수세되고 그리고 세포는 결합 완충액에서 2x106 세포/ml로 조정되었다. 밀리포어 플레이트(MAFB NOB)가 물에 1% 무지방 건조 분유로 도포되고 그리고 4℃에서 밤 세워 저장되었다. 플레이트는 0.2ml의 결합 완충액으로 삼 회 수세되었다. 50마이크로리터의 완충액이 단독으로 최대 결합 웰(전체 결합)에 부가되었다. 25마이크로리터의 완충액이 단독으로 대조 웰(비-특이적 결합)에 부가되었다. 다양한 농도의 125I-항-O8E 항체가 모든 웰에 25μl의 부피로 부가되었다. (비표지 물질은 이용될 수 없고, 결합은 이들 경우에 포함되어 질 수 있기 때문에, 몇몇 경우에는 FITC 표지 항체가 적정을 위해 사용되었다.) 100배 초과에서 다양한 농도의 비표지 항체가 대조 웰에 25 μl의 부피로 부가되고 그리고 결합 완충액 내에 25 μl의 O8E 형질전환된 CHO 세포 (2x106 세포/ml)가 모든 웰에 부가되었다. 플레이트는 4℃에서 쉐이커 상에서 200 RPM으로 두 시간 동안 배양되었다. 배양 완료시 밀리포어 플레이트가 0.2 ml의 냉 수세 완충액 (24mM 트리스 pH 7.2, 50OmM NaCl, 2.7mM KCl, 2mM 글루코스, 1mM CaCl2, 1mM MgCl2, 0.1% BSA)으로 삼 회 수세되었다. 여액이 제거되고 감마 카운터로 계수되었다. 평균 결합의 평가가 프리즘 소프트웨어(San Diego, CA)로 단일 사이트 결합 변수를 사용하여 실행되었다.
데이타는 시그모이달 복용량 반응(PRIZM™)을 사용하여 비-직선 회귀에 의해 분석되고 그리고 표 2에 기술된 바와 같이 항체를 서열화하기 위해 사용되는 EC50의 계산을 초래한다. 이들 실험에서 계산된 EC50 값은 항체 친화도의 정성적인 측정이고 O8E에 대한 절대적 친화도를 나타내지는 않는다.
항체 EC50 95%CI
2F9.E6-FITC 407pM 250 내지 663pM
13D12.G10 746pM 569 내지 979pM
2A7.C11 750pM 519pM 내지 1nM
1G11.H11-FITC 1.69pM 1.4 내지 2.0nM
12E1.G9* 19.8pM 14 내지 27.6nM
* 하단 및 상단 값이 불완전 곡선에 대해 보상하기 위해 상수로 조정됨.
실시예 6
항-08E 모노클로날 항체의 내재화
이 실시예는 Hum-Zap 내재화 분석법을 사용하여 O8E-발현 CHO 및 유방 암종 세포 내로 내재화하는 능력에 대해 항-O8E HuMAbs의 시험을 기술한다. Hum-Zap 분석이 독성 사포린에 컨쥬게이트된 인간 IgG에 대해 친화성을 갖는 이차 항체의 결합을 통한 프라이머리 인간 항체의 내재화에 대해 시험하였다.
O8E-발현 유방 암종 암 세포 라인 SKBR3이 밤세워 100 μl 웰에 1.25x104 세포/웰로 접종되었다. 항-O8E HuMAb 항체 1Gl1, 2F9, 2A7, 12El 또는 13D12가 10 nM의 농도로 웰에 부가되었다. O8E에 비특이적인 아이소타이프 대조 항체가 음성 대조로 사용되었다. Hum-Zap (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA, IT-22-25)가 11 nM의 농도에서 부가되고 그리고 플레이트는 72 시간 동안 배양되게 하였다. 플레이트는 그런 다음 1.0 μCi의 3H-티미딘으로 24 시간 동안 펄스되고, 수확되어 탑 카운트 신틸레이션 카운터(Packard Instruments, Meriden, CT)에서 판독되었다. 결과는 표 3 및 도 14-15에 나타냈다. 항-O8E 항체 1G11, 2F9, 2A7, 12E1 및 13D12는 O8E-발현 SKBR3 유방 암종 암 세포에 3H-티미딘 합일화에서 항체 농도 의존적 감소를 나타냈다.
이들 데이타는 항-O8E 항체 1G11, 2F9, 2A7, 12E1 및 13D12는 유방 암종 암 세포 라인 내로 내재화한다는 것으로 입증한다.
분석 No. 1 분석 No. 2 분석 No. 3
내재화 % 내재화 % 내재화 %
항-08E 평균 표준편차 평균 표준편차 평균 표준편차
2A7/C11 29 12 17.5 3.5 40.7 2.7
2F9.E6 37 17 NT NT NT NT
1G11.H1 18 8 NT NT NT NT
13D12.G10 NT NT 12.1 2.5 12.2 2.8
12E1.G9 NT NT 10.4 18.5 4.3 2.7
내재화 효율성에 대한 서열은 SKBR3에서 세 번 실험과 CHO-O8E에서 두 번 실험에 걸친 평균이다. 내재화 서열은, CHO-O8E에 결합에 대한 EC50s 단독으로 표 4 및 5에 나타냈다. 결과는, 내재화는 에피토프 의존적이다는 것을 제안하는 내재화 효율성은 결합 친화도와 직접적으로 상관되지 않는 것을 보여준다.
SBKR3 유방 암종 세포 라인에서 내재화에 의해 분류된 내재화 효율성
내재화
항-08E SKBR3 CHO-08E EC50 CHO-08E 결합
2F9.E6 1 3 407pM
2A7.C11 2 1 750pM
1G11.H1 3 4 1.69pM
13D12.G10 4 2 746pM
12E1.G9 5 5 19.8pM
CHO - O8E 세포 라인에서 내재화에 의해 분류된 내재화 효율성
내재화
항-08E SKBR3 CHO-08E EC50 CHO-08E 결합
2A7.C11 2 1 750pM
13D12.G10 4 2 746pM
2F9.E6 1 3 407pM
1G11.H11 3 4 1.69pM
12E1.G9 5 5 19.8pM
CHO-O8E에 사포린 컨쥬게이트의 내재화 활성은 인간 모노클로날 항체 2A7, 2F9 및 1Gl1를 사용하여 ~500 pM 내지 1 pM 범위를 통한 복용량 반응으로 측정되었다. 도 14에 도시된 바와 같이, 내재화는 낮은 pM 범위에서 EC50으로 아주 효율적이었다. CHO 모체 세포 라인 및 Hu IgG-SAP가 음성 대조군으로 사용되고 그리고 비 유의성의 배경 독성 또는 비-특이적 내재화를 나타냈다. SAP에 직접 항-O8E 컨쥬게이트는 SKBR3 세포로 사용되었다. Ig-SAP 복용의 작용으로 내재화에 대한 백분율(대조군에 대해)은 도 15에 나타내어 졌다.
실시예 7
유방 세포 암종 세포 라인 상에 독성- 컨쥬게이트 항-08E 항체의 세포사의 평가
이 실시예는 세포 증식 분석에서 08E+ 유방 세포 암종 세포 라인을 죽이는 능력에 대하여 독성에 컨쥬게이트된 항-O8E 모노클로날 항체의 시험을 기술한다.
항-O8E HuMAb 항체 1Gl1, 2F9, 2A7, 12E1 또는 13D12가 펩티딜, 히드라존 또는 디 설파이드 링커와 같은 링커를 통해 독성에 컨쥬게이트되어 질 수 있다. SKB R3와 같은 O8E-발현 유방 암종 암 세포 라인이 100 μl 웰에 3시간 동안 약 1 내지 3x104 세포/웰로 접종되었다. 항-O8E 항체-독성 컨쥬게이트가 30 nM의 출발 농도에서 부가되고 그리고 1:3 일련의 희석으로 하향 적정되어졌다. O8E에 비특이적인 아이소타이프 대조 항체가 음성 대조로 사용되었다. 플레이트는 69 시간 동안 배양되었다. 플레이트는 그런 다음 1.0 μCi의 3H-티미딘으로 24 시간 동안 펄스되고, 수확되어 탑 카운트 신틸레이션 카운터(Packard Instruments, Meriden, CT)에서 판독되었다. 항-O8E 항체는 O8E-발현 유방 암종 암 세포에 3H-티미딘 합일화에서 항체-독성 농도 의존적 감소를 나타내는 것이 기대되었다. 이 데이터는 항-O8E 항체 1Gl1, 2F9, 2A7, 12E1 및 13D12가 독성에 컨쥬게이트될 때 유방 암종 암 세포에 강력하게 세포독성이다는 것으로 입증한다.
실시예 8
항-08E 항체의 ADCC 활성의 평가
이 실시예는 형광 세포 독성 분석에 있어서 항체 의존적 세포의 세포독성(ADCC)을 통해 이펙터 세포의 존재하에 08E+ 세포 라인을 죽이는 능력에 대한 항-08E 모노클로날 항체의 시험을 개시한다.
인간 이펙터 세포는 다음과 같이 전 혈액으로부터 제조되었다. 인간 말초 혈액 단핵 세포가 표준 피콜-파쿼 분리에 의해 헤파린화된 전세포로부터 정제되었다. 세포는 10% FBS 및 200 U/ml의 인간 IL-2을 포함하는 RPMI 1640 배지에 재현탁되어지고 그리고 37℃에서 밤세워 교반되었다. 다음날 세포가 수집되어 배양 배지에서 4 시간 동안 수세되었고 그리고 2x107 세포/ml로 재현탁되었다. 표적 08E+ 세포는 37℃에서 20분 동안 1x106 표적 세포/mL 당 2.5 μl BATDA에서의 BATDA 시약 (Perkin Elmer, Wellesley, MA)으로 배양되었다. 표적 세포는 사회 수세되고, 자아 최종 부피 1x105 세포/ml로 하였다.
08E+ 세포 라인 SKBR3 뿐 아니라 O8E 트랜스펙트 SK0V3 세포 라인이 다음과 같이 델피아 형광 발광 분석법을 사용하여 인간 항-08E 모노클로날 항체에 대해 항체 특이적 ADCC에 대해 시험되었다. 각 타겟 세포 라인 (100 μl의 표지된 타겟 세포)이 50 μl의 이펙터 세포 및 50 μl의 항체로 배양되었다. 1 : 50의 이펙터에 대한 타겟의 비율이 실험 전체를 통해 사용되었다. 모든 연구에서, 인간 IgGl 아이소타이프 대조가 음성 대조로 사용되었다. 2000 rpm 펄스 스핀과 37℃에서 한 시간 배양하여, 상등액이 수집되고, 다시 재빠르게 자아지고 그리고 20 μl의 상등액이 180 μl의 Eu 용액 (Perkin Elmer, Wellesley, MA)이 부가된 평판 바닥 플라스크에 옮겨지고 그리고 RubyStar 판독기 (BMG Labtech)에서 판독되었다. 용융 %는 다음과 계산되었다: (샘플 방출 - 자발적 방출 * 100) / (최대 방출 - 자발적 방출), 여기서, 자발적 방출은 단지 타겟 세포 만을 포함하는 웰로부터의 형광이고 그리고 최대 방출은 타겟 세포를 포함하고 2% 트리톤-X로 처리된 웰로부터의 형광이다. 항-O8E 항체 1G11, 2F9 및 2A7을 갖는 SKBR3 세포에 대한 세포 세포독성 용융 %는 도 17에 나타냈고; 항-O8E 항체 1G11, 2F9 및 2A7을 갖는 SK0V3-O8E 트랜스펙트 세포 라인에 대한 세포 세포독성 용융 %는 도 18에 나타냈고; 그리고 항-O8E 항체 2F9 및 2A7을 갖는 SKBR3 세포에 대한 농도-의존적 세포 세포독성 용융 %는 도 19에 나타냈다. 08E+-발현 세포 라인 SKBR3 및 SK0V3-O8E는 HuMAb 항-O8E 항체 1G11, 2F9 및 2A7로 항체 조정 세포독성을 보였다. 이들 데이타는 HuMAb 항-08E 항체가 08E+ 발현 세포에 특이적인 세포독성을 나타낸다는 것을 입증한다.
실시예 9
천연 및 세포독성- 컨쥬게이트 항-08E 항체를 사용하여 생체 내 이종이식 종양 모델의 처리
이 실시예는 종양성장에 대한 항체의 생체 내 효과를 검사하기 위해 독성-컨쥬게이트 항-08E 항체를 유방 세포 암종 종양이 이식된 마우스의 생체 내 처리를 개시한다.
SKBR3 또는 다른 적절한 유방 세포 암종 세포가 표준 실험 절차를 사용하여 실험실에서 팽창되었다. 6-8 주령 사이의 웅성 Ncr 흉선 누드 마우스 (Taconic, Hudson, NY)가 오른쪽 옆구리로 마우스 당 0.2 ml의 PBS/마트리젤 (1 :1) 내에 7.5xlO6 ACHN 또는 A-498 세포가 피하로 이식되었다. 마우스는 계량되고 이식 후 주당 이회 전자 캐리퍼를 사용하여 삼차원적으로 종양이 측정되었다. 종양 부피는 높이 x 폭 x 길이로 계산되었다. 평균 270 mm3 ACHN 종양 또는 평균 110 mm3 A498 종양을 갖는 마우스가 처리 군으로 랜덤화 되었다. 마우스는 0일에 PBS 담체, 독성-컨쥬게이트 아이소타이프 대조 항체 또는 독성-컨쥬게이트 항-08E HuMAb로 복강 내로 복용되었다. 본 개시사항의 항체에 컨쥬게이트되어 질 수 있는 독성 화합물의 예는 계류 중인 미국 특허출원 지정 번호 MEDX-0034US4에 기술되어 있다. 항-O8E HuMAb를 섭취한 마우스는 세 가지 다른 독성 화합물로 테스트되었다. 마우스는 복용 후 60일 동안 종양 성장에 대해 모니터되어 진다. 마우스는 종양이 종단 말단점 (2000 mm3)에 도달할 때 희생되었다. 독성에 컨쥬게이트된 적절한 항-08E 항체는 종양 말단 부피 (2000 mm3)에 도달하는 평균 시간이 확장되고 그리고 종양 성장 진행을 늦추었다. 따라서, 이러한 항-08E 항체-독성 컨쥬게이트로 처리는 생체 내에서 종양 성장에 직접적인 저해 효과를 가진다.
실시예 10
항- O8E HuMAb 2A7로 면역조직화학
이 실시예는 항-O8E HuMAb 2A7이 노르말 마우스 조직 배열(IMGENEX Histo-Array; Imgenex Corp., San Diego, CA)을 사용한 면역조직화학에 의한 08E를 인지하는 것을 개시한다.
면역조직화학을 위하여, 2,000 μm 조직 코어가 사용되었다. 30분 동안 건조 후, 분절은 아세톤으로 고정되었고(실온에서 10분 동안) 5분 동안 에어-건조되었다. 슬라이드는 PBS에 수세되고 그리고 나서 20분 동안 PBS 내 10% 노르말 고트 혈청으로 예비-배양되고 이어서 실온에서 30분 동안 10% 노르말 고트 혈청을 갖는 PBS 내 10 μg/ml FITC화 2A7로 배양되었다. 다음으로, 슬라이드는 PBS로 삼 회 수세되고 그리고 실온에서 30분 동안 마우스 항-FITC (10 μg/ml DAKO)로 배양되었다. 슬라이드는 다시 PBS로 수세되고 그리고 실온에서 30분 동안 고트 항-마우스 HRP 컨쥬게이트 (DAKO)로 배양되었다. 슬라이드는 PBS로 세번(3x) 다시 수세되었다. 디아미노벤지딘 (Sigma)이 기질로 사용되어, 갈색 염색을 얻었다. 증류수로 수세한 후, 슬라이드는 헤마톡실린으로 1분 동안 반대-염색되었다. 이어서, 슬라이드는 흐르는 증류수로 10초 동안 수세되고 그리고 글리세르젤 (DAKO) 내에 부착되었다. 이들 연구의 결과는 표 6에 나타냈다.
노르말 마우스 조직 배열에서 O8E의 면역반응성
조직 종류
Figure 112008038464085-PCT00056
Figure 112008038464085-PCT00057
2㎍/㎖ 5㎍/㎖ 5㎍/㎖
피부, 귓 볼 상피 피부기름샘 다른 성분 - - - ± ± - - - -
결장 표면 상피 다른 성분 ±,1 - 1+ - ± -
소장 내층 상피 다른 성분 ±,1 - 1+,2+ - ± -
위 표면&분비선 상피 세포 신경망 다른 성분 1+,2+, ocas - - 1+,2+,freq ±,1+ - 1+,2+, ocas - -
췌장 아시너스 상피 아일릿 다른 성분 1+ - - 2+ ± - ±,1 - -
타액선 아시너스 상피 다른 성분 ± - 1+ - - -
간장 간세포 다른 성분 - - ±.- - - -
대뇌 뉴론 신경망/섬유 ± -,± 2+,1+,freq 2+,1+,ocas ±.- -
뇌교 뉴론 신경망/섬유 ± ± ± 2+,1+,freq ±. -
소뇌 푸르키네 세포 백질 다른 성분 ±,1+ - - 1+ 1+,2+ - ±.- - -
지라 적색 속질 내의 대 임파구 세포 다른 성분 - - 1+,2+.rare -,± - -
갑상선 - - -
골격근 - - -
설 - - -
심장 - -,± -
폐 - - -
신장 피질 - -,± -
신장 수질 - - -
방광 과도 상피 기타 성분 - - ±,1 - - -
정낭 상피 루멘 내의 유동액 기타 성분 ±,- 1+ - ± 3+ - - ± -
정소 일차 정모세포 다른 성분 - - ±,1+ - - -
부정소 - - -
자궁 자궁내막/분비선 상피 다른 성분 -,± - ± - - -
난소 - ± -
면역 반응성의 강도:+-(동등); +(약함; 2+(보통); 3+(강함); 4+ (강력); -(음성); Fre; 빈번; Ocas; 가끔
이들 데이터 및 항-O8E 항체 1G11 및 2F9에 대해 수집된 상응하는 데이터는 결장 및 소장에서 뿐 아니라 세머너리 소낭의 루멘 유동체에서 엔테로엔도크린-형 세포에서 강력한 O8E 면역반응성(3+, 4+)을 강하게 하고; 대외의 뉴런에서, 대뇌 및 뇌교의 신경망 및 섬유에서, 대뇌의 백질에서, 소장의 상피세포에서, 그리고 소수의 지라의 대림프세포에서 적당한 O8E 면역반응성(1+, 2+)을 약하게 하는 것으로 밝혀지고; 약한 O8E 면역반응성(1+)이 결장 표면 상피, 대뇌에서의 퍼키니 세포 및 타액선과 췌장의 아시너스의 상피에서 입증되었고; 약한 O8E 면역반응성이 방광의 전이 상피에서, 정환의 제 일차 정모세포 및 위의 신경망에서 동등하게 나타났고; 그리고 피부, 간, 심장, 폐, 흉선, 신장, 자궁, 난소, 부고환, 혀 및 골격근을 포함하는 모든 다른 기관들이 다의성 염색에 음성적인 것을 보인다는 것을 입증한다.
실시예 11
디퓨코실화 HuMAbs 의 생성
이 실시예는 퓨코실 잔기가 부족한 항-O8E HuMAbs의 생산을 입증한다. 감소된 양의 퓨코실화 잔기를 갖는 항체는 항체의 ADCC 능력을 증가하는 것을 입증했다. 퓨코실트랜스퍼라제 유전자 FUT 8 (Biowa, Inc., Princeton, NJ)를 결핍한 CHO 세포 라인 Ms704-PF가 항-O8E HuMAb의 중 및 경사슬을 발현하는 벡터로 전기적으로 관통되었다. 약물-저항성 클론은 6 mM L-글루타민 및 500 μg/ml G418 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 갖는 Ex-Cell 325-PF CHO 배지 (JRH Biosciences, Lenexa, KS)에서의 성장에 의해 선정되었다. 클론은 표준 ELISA 분석법을 사용하여 IgG 발현에 대해 스크린되었다. 두 개의 별도 클론인 B8A6 및 B8C11이 생산되었으며, 생산 비율은 일당 세포당 1.0 내지 3.8 피코그램의 범위로 되었다.
실시예 12
디퓨코실화 항-08E 항체의 ADCC 능의 평가
이 실시예는 형광 세포독성 분석에서 항체 의존적 세포의 세포독성 (ADCC)을 통한 이펙터 세포의 존재하에 08E+ 세포를 죽이는 능력에 대하여 디퓨코실화 및 비-디퓨코실화 항-08E 모노클로날 항체의 시험을 개시한다.
인간 항-08E 모노클로날 항체는 상술한 바와 같이 디퓨코실화되었다. 인간 이펙터 세포는 다음과 같이 전 혈액으로부터 제조된다. 인간 말초 혈액 단핵 세포는 표준 피콜-파쿼 분리에 의해 헤파린화된 전 혈액으로부터 정제되었다. 세포는 10% FBS (배양 배지) 및 200 U/ml의 인간 IL-2을 포함하는 RPMI 1640 배지에 재현탁되어지고 그리고 37℃에서 밤세워 교반되었다. 다음날 세포가 수집되어 배양 배지에서 한번 수세되었고 그리고 2x107 세포/ml로 재현탁되었다. 표적 08E+ 세포는 37℃에서 20분 동안 2.5mM 프로벤시드 (분석 배지)로 보충된 배양 배지 내에 1x106 표적 세포/mL 당 2.5 μl BATDA로 되는 BATDA 시약 (Perkin Elmer, Wellesley, MA)으로 배양되었다. 표적 세포는 2OmM HEPES 및 2.5mM 프로벤시드를 갖는 PBS 내에서 사회 수세되고, 자아 지고 그리고 분석 배지에서 1x105 세포/ml의 최종 부피로 하였다.
08E+ 세포 라인 ARH-77 (인간 B 림프모세포 백혈병; ATCC Accession No. CRL-1621)이 다음과 같이 델피아 형광 발광 분석법을 사용하여 디퓨코실화 및 비-디퓨코실화된 인간 항-08E 모노클로날 항체에 대해 항체 특이적 ADCC에 대해 시험되었다. 표적 세포 라인 ARH77 (100 μl의 표지된 표적 세포)이 50 μl의 이펙터 세포 및 50 μl의 1G11 또는 디퓨코실화 1G11 항체로 배양되었다. 비율 1 : 100의 이펙터에 대한 표적 세포가 전 실험을 통해 사용되었다. 인간 IgGl 아이소타이프 대조가 음성 대조로 사용되었다. 2100 rpm 펄스 스핀과 37℃에서 한 시간 배양하여, 상등액이 취해지고, 다시 재빠르게 자아지고 그리고 20 μl의 상등액이 180 μl의 Eu 용액 (Perkin Elmer, Wellesley, MA)이 부가된 평판 바닥 플라스크에 옮겨지고 그리고 퓨젼 알파 TRP 플레이트 판독기 (Perkin Elmer)에서 판독되었다. 용융 %는 다음과 계산되었다: (샘플 방출 - 자발적 방출 * 100) / (최대 방출 - 자발적 방출), 여기서, 자발적 방출은 단지 표적 세포 만을 포함하는 웰로부터의 형광이고 최대 방출은 표적 세포를 포함하고 3% 리졸로 처리된 웰로부터의 형광이다. O8E+ 발현 세포 라인 ARH-77은 HuMAb 항-08E 항체 1G11로 항체 조정 세포독성과 항-08E 항체 1G11의 디퓨코실화 형태와 연계된 특이적 용융의 증가된 백분율을 보일 것이다. 따라서, 디퓨코실화 HuMAb 항-08E 항체는 08E+ 발현 세포에 특이적인 세포독성을 증진한다.
실시예 13
면역-형광 염색 분석법에 의한 HuMab 항-08E 항체의 내재화
표적 세포인 08E+ SKBR3 (인간 유방암, ATCC# HTB-30) 및 ZR-75 (인간 유방암, ATCC# CRL-1500)이 면역-형광 염색을 사용하여 세포에 결합에 의한 HuMab 항- 08E 항체 2A7C11, 1G11Hl 및 2F9E6의 내재화에 대한 시험을 위해 사용되었다.
0.25% 트립신/EDTA로 처리에 의하여 조직 배양 플라스크로부터 수확된 SKBR3 및 ZR-75 세포 (96-웰 플레이트 내에서 웰 당 lOOμl 당 104)가 각각 FACS 완충액 (PBS + 5% FBS5 배지) 내에서 5μg/ml로의 HuMab 항-08E 항체로 30분 동안 얼음 상에서 배양되었다. 인간 IgGl 아이소타이프 대조가 음성 대조군으로 사용되었다. 배지로 두 번 수세 후, 세포는 배지에 재 현택되고(웰 당 lOOμl) 그런 다음 1:00 희석으로 PE (Jackson ImmunoResearch Lab)와 컨쥬게이트된 고트 항-인간 제이 항체로 30분 동안 얼음 상에서 배양되었다. 배지로 수세 후, 세포는 0분에 즉시 형광 마이크로스코프 (Nikon) 하에서 이미지되어 지거나 또는 여러 시간 동안 30℃에서 배양되어 진다. 염색된 세포의 세포 형태학 및 면역-형광 강도의 이미지는 도면 아래에 나타난 바와 같이 다른 시점에 취해진다. 형광은 IgGl 대조 항체에서는 관찰되지 않았다. 유사한 결과가 또한 분석에 있어서 FITC-직접 컨쥬게이트 HuMab 항-08E 항체로 얻어진다.
이미지 데이터는 0분에 세 HuMab 항-08E 항체 모두로 세포 표면 멤브레인 상에 형광의 발생이 관찰되었다. 배양 30분 후에, 멤브레인 형광 강도가 유의적으로 감소하였으며 반면 세포의 내면에서의 염색은 증가하였다. 120분 시점에 멤브레인 상에 형광은 사라지고, 대신 세포 내의 구획에서는 존재하는 것으로 나타났다. 이 데이타는 HuMab 항-08E 항체가 08E-발현 내인성 종양 세포에 결합하여 특이적으로 체화되어 질 수 있다는 것으로 입증한다.
실시예 14
SCID 마우스에서 HEK -B7H4 종양 상에서 항- O8E 항체의 효율성
이 실시예에서, 종양 성장에 대한 항체의 생체 내의 효과를 시험하기 위해 HEK-B7H4 종양이 이식된 SCID 마우스가 천연 항-O8E 항체로 생체 내로 처리되었다.
관능적 B 및 T 림프구를 결한 엄격히 조합된 면역 결핍(SCID) 마우스가 종양 성장을 연구하기 위해 사용되었다. B7H4로 트랜스펙트된 HEK 종양 세포 라인으로부터의 세포가 매트리젤(50% v/v) 내에 5백만 세포/마우스로 피하로 이식되었다. 각 마우스는 0일에 0.2 ml의 세포 접종액을 받아들였다. 마우스는 종양 성장이 시작되는지 10일 되는 날에 체크되고 그리고 대략 6주 동안 종양 성장에 대해 이 주 간격으로 모니터되었다. 종양이 약 130 mm3에 달하였을 때, 마우스는 종양 부피에 의해 세 그룹으로 랜덤화되었다. 마우스는 10 mg/kg 천연 항--O8E 항체 2A7, 아이소타이프 대조, 또는 음성 대조로 완충액 제형으로 처리되었다. 동물은 복막 내 주입에 의해 매 5일 간격으로 5 주입으로 복용되었다. 전자 캘리퍼를 사용하여, 종양이 삼차원(높이 x 폭 x 길이)적으로 측정되어 종양 부피가 계산되었다.
마우스는 종양이 약 1500 mm3의 부피에 달하였을 때 또는 15% 이상의 체중 손실을 보일 때 희생되었다. 결과는 도 20에 나타냈다. 종양 성장은 항-O8E 항체 2A7로 처리에 의해 저해되었다. 2A7로 처리된 군에 대해 평균 종양 성장 저해는 34일에 63%이었다. 종양은 복용이 중단된 후 성장이 다시 시작되었다. 이들 결과는 항-O8E 항체가 생체 내에서 O8E를 발현하는 종양을 치료하는데 유효하다는 것을 보여준다.
실시예 15
항- O8E 항체를 사용하는 면역조직화학
면역조직화학에 의한 B7H4를 인지하는 항-B7H4 HuMAb 2A7의 능력이 난소암, 폐암, 유방암, 및 머리 & 목 암으로부터 임상적 생체검사법을 사용하여 시험되었다.
면역조직화학을 위하여, 5 μm 동결 분절이 사용되었다 (Ardais Inc, USA). 30분 동안 건조 후, 분절은 아세톤으로 고정되었고(실온에서 10분 동안) 5분 동안 에어 건조되었다. 슬라이드는 PBS에 수세되고 그리고 나서 20분 동안 PBS 내 10% 노르말 고트 혈청으로 예비-배양되고 이어서 실온에서 30분 동안 10% 노르말 고트 혈청을 갖는 PBS 내 10 μg/ml FITC화 항체로 배양되었다. 다음으로, 슬라이드는 PBS로 삼 회 수세되고 그리고 실온에서 30분 동안 마우스 항-FITC (10 μg/ml DAKO)로 배양되었다. 슬라이드는 다시 PBS로 수세되고 그리고 실온에서 30분 동안 고트 항-마우스 HRP 컨쥬게이트 (DAKO)로 배양되었다. 슬라이드는 PBS로 세 번 수세되었다. 디아미노벤지딘 (Sigma)이 기질로 사용되어, 갈색 염색을 얻었다. 증류수로 수세한 후, 슬라이드는 헤마톡실린으로 1분 동안 반대-염색되었다. 이어서, 슬라이드는 흐르는 증류수로 10초 동안 수세되고 그리고 글리세르젤 (DAKO) 내에 부착되었다. 임상적 생검법 면역조직화학적 염색은 폐암, 유방암, 난소암, 및 머리 & 목 암 샘플에서 양성 염색을 나타냈다.
실시예 16
정상 및 암 조직 상에 정량적 RT - PCR
다양한 정상 및 암성 조직 샘플이 정량적 역전사효소 PCR (RT-PCR)을 사용하여 O8E mRNA 발현에 대해 스크린 되었다. mRNA의 발현은 O8E 단백질 발현의 징후이다.
정량적 RT-PCR를 위해, 다음의 O8E 프라이머가 사용되었다: Operon (Huntsville, AL)에 의하여 제공된 것으로 B7-H4.3: AGGATGGAATCCTGAGCTGCACTT; B7-H4.4: TCCGACAGCTCATCTTTGCCTTCT. 표준 반응 조건이 사용되었다 (1 ng/μl에서 5 μl cDNA 주쇄, 40 μM에서 0.1 μl 업스트림 프라이머, 40μM에서 0.1 μl 다운스트림 프라이머, 6μl 2X SYBR 그린 PCR 믹스 (Applied Biosystems # 4367659), 및 0.8μl 물). cDNA는 ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA)에서 표준 PCR 조건을 사용하여 40 사이클 동안 증폭되었다. 정량적 RT-PCR 결과는 아래 표 7에 나타냈다. 미정 계수를 갖는 샘플은 형광 임계 아래인 값을 나타낸다. 유방, 난소 및 머리와 목 종양은 몇몇 난소 및 머리와 목 암 샘플에서 보여진 가장 높은 준위의 발현으로 O8E를 발현하는 것을 나타낸다. 이것은 정상 조직에 비하여 유방, 난소 및 머리와 목 종양 샘플에서 O8E의 증가된 발현이 있다는 것을 입증한다.
Figure 112008038464085-PCT00058
Figure 112008038464085-PCT00059
않는다. 실제로, 여기에서 기술된 것에 부가하여 본 개시사항의 다양한 변형이 상술한 상세한 설명과 첨부되어 진 도면으로부터 이 기술분야의 전문가에게 명백하게 될 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내로 되는 것으로 의도된다.
특허, 특허출원, 공개공보, 제품 상세한 설명 및 프로토콜은 본 출원 전체를 통해 인용되고, 이들의 개시사항은 모든 목적을 위해 그 전체로서 레퍼런스로 여기에 편입된다.
SEQUENCE LISTING <110> Medarex, Inc. <120> HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO O8E <130> 04280/1203606-US1 <160> 55 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Phe Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Arg 65 70 75 80 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Leu Ser Ser Trp Ser Asn Trp Ala Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Tyr Gly Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Thr Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Val Ser Arg Asn 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Tyr Gly Ser Gly Arg Thr Asp Cys Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Asp Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Lys Ala Leu Tyr Gly Ser Gly Ser Ser Asp Phe Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Ala Val Ser Ser 115 120 125 <210> 5 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Lys Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Glu Leu Arg Tyr Phe Glu Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Glu Ile Val Leu Thr Gln Phe Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 7 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 8 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Arg Thr Phe Gly Gln 85 90 95 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 <210> 10 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Asp Tyr Phe Trp Thr 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ser Asn Tyr Met Asn Trp 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Arg Asn Tyr Met Asn 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Glu Ile Asn His Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Val Ile Tyr Gly Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Val Ile Tyr Gly Ser Gly Arg Thr Asp Cys Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Lys Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Leu Ser Ser Trp Ser Asn Trp Ala Phe Glu Tyr 1 5 10 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Asp Thr Tyr Ala Met Asp Val 1 5 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Asp Gly Asp Tyr Gly Met Asp Val 1 5 <210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Leu Tyr Gly Ser Gly Ser Ser Asp Phe Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Glu Leu Arg Tyr Phe Glu Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Met Tyr Thr 1 5 10 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Tyr Thr 1 5 10 <210> 39 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Gln Gln Arg Arg Thr 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Arg Thr 1 5 <210> 41 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt gattacttct ggacctggat ccgccagccc 120 ccagggaagg gcctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaaccac caactacaac 180 ccgtccctca agagtcgagt caccatttca gcagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aggctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag actcagcagc 300 tggtcgaact gggcctttga gtactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 42 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 gaggtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctgggtt caccgtcagt agcaactaca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt atttatggca gtggtagaac atattacgca 180 gactccgtga agggccgagt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agatacctac 300 gctatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctct 345 <210> 43 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 gaggtgcagt tggtggagtc tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctgggtt catcgtcagt agaaactaca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt atttatggca gtggtaggac agactgcgca 180 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agatggggac 300 tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctca 348 <210> 44 <211> 378 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 tcctgtgtag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggtag cataggctat 180 gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtac aaaagccctc 300 tatggttcgg ggagttctga cttctactac tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc 360 acggtcgccg tctcctca 378 <210> 45 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120 ccagggaagg ggctggagtg gattgggaaa atcaatcata gcggaagtac caactacaac 180 ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aaactaaact ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agaattacga 300 tattttgaaa actactacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 46 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 gaaattgtgt tgacgcagtt tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcacctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccagggt cctcatctat ggtgcatcca gaagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgct cactttcggc 300 ggagggacca aggtggagat caaa 324 <210> 47 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacccat gtacactttt 300 ggccagggga ccaagctgga gatcaaa 327 <210> 48 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctct gtacactttt 300 ggccagggga ccaagctgga gatcaaa 327 <210> 49 <211> 309 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtaggacgt tcggccaagg gaccaaggtg 300 gaaatcaaa 309 <210> 50 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcg gacgttcggc 300 caagggacca aggtggaaat caaa 324 <210> 51 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg <210> 52 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg <210> 53 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 54 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 <210> 55 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Thr Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (44)

  1. 분리된 인간 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위에 있어서,
    여기서 상기 항체는: (a) 인간 O8E에 1x10-7 M 또는 그 이하의 KD로 결합하고; 그리고 (b) 유방 세포 암종 종양 세포 라인에 결합함을 특징으로 하는 분리된 인간 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 IgGl 또는 IgG4 아이소타이프의 전-길이 항체임을 특징으로 하는 분리된 인간 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 항체 분획이거나 또는 단일 사슬 항체임을 특징으로 하는 분리된 인간 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 인간 O8E에 5.5x10-9 M 또는 그 이하의 KD로 결합함을 특징으로 하는 분리된 인간 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 인간 O8E에 3x10-9 M 또는 그 이하의 KD로 결합함을 특징으로 하는 분리된 인간 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 인간 O8E에 2x10-9 M 또는 그 이하의 KD로 결합함을 특징으로 하는 분리된 인간 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 내재화된 것임을 특징으로 하는 분리된 인간 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 유방 세포 암종 종양 세포 라인은 SKBR3 세포 라인으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 분리된 인간 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 퓨코스 잔기를 결한 것임을 특징으로 하는 분리된 인간 모노클 로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  10. 분리된 인간 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위에 있어서,
    여기서 상기 항체는 O8E에 대한 결합에 대해 레퍼런스 항체와 교차-경쟁을 하고, 상기 레퍼런스 항체는: (a) 인간 O8E에 1x10-7 M 또는 그 이하의 KD로 결합하고; 그리고 (b) 유방 세포 암종 종양 세포 라인에 결합함을 특징으로 하는 분리된 인간 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 상기 레퍼런스 항체는: (a) SEQ ID NO: 1의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변 영역; 및 (b) SEQ ID NO: 6의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함함을 특징으로 하는 분리된 인간 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 상기 레퍼런스 항체는: (a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변 영역; 및 (b) SEQ ID NO: 7의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함함을 특징으로 하는 분리된 인간 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  13. 제 10항에 있어서,
    상기 상기 레퍼런스 항체는: (a) SEQ ID NO: 3의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변 영역; 및 (b) SEQ ID NO: 8의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함함을 특징으로 하는 분리된 인간 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  14. 제 10항에 있어서,
    상기 상기 레퍼런스 항체는: (a) SEQ ID NO: 4의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변 영역; 및 (b) SEQ ID NO: 9의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함함을 특징으로 하는 분리된 인간 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  15. 제 10항에 있어서,
    상기 상기 레퍼런스 항체는: (a) SEQ ID NO: 5의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변 영역; 및 (b) SEQ ID NO: 10의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함함을 특징으로 하는 분리된 인간 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  16. 인간 VH 4-34 유전자,
    인간 VH 3-53 유전자 또는 인간 VH 3-9 유전자의 산물 또는 이로부터 유래된 경사슬 가변영역을 포함하고, 여기서 항체는 O8E에 특이적으로 결합하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분.
  17. 인간 VK Al7 유전자 또는 인간 VK L6 유전자의 산물 또는 이로부터 유래된 경사슬 가변영역을 포함하고, 여기서 항체는 O8E에 특이적으로 결합하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분.
  18. 제 1항에 있어서,
    항체는 a) SEQ ID NO: 11을 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl; b) SEQ ID NO: 16을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2; c) SEQ ID NO: 21을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3; d) SEQ ID NO: 26을 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl; e) SEQ ID NO: 31을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및 f) SEQ ID NO: 36을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3을 포함함을 특징으로 하는 분리된 인간 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  19. 제 1항에 있어서,
    항체는 a) SEQ ID NO: 12를 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl; b) SEQ ID NO: 17을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2; c) SEQ ID NO: 22를 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3; d) SEQ ID NO: 27을 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl; e) SEQ ID NO: 32를 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및 f) SEQ ID NO: 37을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3을 포함함을 특징으로 하는 분리된 인간 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  20. 제 1항에 있어서,
    항체는 a) SEQ ID NO: 13을 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl; b) SEQ ID NO: 18을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2; c) SEQ ID NO: 23을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3; d) SEQ ID NO: 28을 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl; e) SEQ ID NO: 33을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및 f) SEQ ID NO: 38을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3을 포함함을 특징으로 하는 분리된 인간 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  21. 제 1항에 있어서,
    항체는 a) SEQ ID NO: 14를 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl; b) SEQ ID NO: 19를 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2; c) SEQ ID NO: 24를 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3; d) SEQ ID NO: 29를 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl; e) SEQ ID NO: 34를 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및 f) SEQ ID NO: 39를 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3을 포함함을 특징으로 하는 분리된 인간 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  22. 제 1항에 있어서,
    항체는 a) SEQ ID NO: 15를 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl; b) SEQ ID NO: 20을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2; c) SEQ ID NO: 25를 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3; d) SEQ ID NO: 30을 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl; e) SEQ ID NO: 35를 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및 f) SEQ ID NO: 40을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3을 포함함을 특징으로 하는 분리된 인간 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  23. a) SEQ ID NO: 1의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 b) SEQ ID NO: 6의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함하고, 여기서 항체는 O8E에 특이적으로 결합하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  24. a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 b) SEQ ID NO: 7의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함하고, 여기서 항체는 O8E에 특이적으로 결합하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  25. a) SEQ ID NO: 3의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 b) SEQ ID NO: 8의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함하고, 여기서 항체 는 O8E에 특이적으로 결합하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  26. a) SEQ ID NO: 4의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 b) SEQ ID NO: 9의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함하고, 여기서 항체는 O8E에 특이적으로 결합하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  27. a) SEQ ID NO: 5의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 b) SEQ ID NO: 10의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함하고, 여기서 항체는 O8E에 특이적으로 결합하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  28. 청구항 1의 항체 또는 이들의 항원 결합 부위 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는 조성물.
  29. 치료적 제제에 연결된 청구항 1의 항체 또는 이들의 항원 결합 부위를 포함하는 면역컨쥬게이트.
  30. 청구항 29의 면역컨쥬게이트 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는 조성물.
  31. 제 30항에 있어서,
    상기 치료적 제제는 세포독성임을 특징으로 하는 면역컨쥬게이트.
  32. 청구항 31의 면역컨쥬게이트 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는 조성물.
  33. 제 29항에 있어서,
    상기 치료적 제제는 방사성 동위원소임을 특징으로 하는 면역컨쥬게이트.
  34. 청구항 33의 면역컨쥬게이트 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는 조성물.
  35. 청구항 1의 항체 또는 이들의 항원 결합 부위를 코드하는 분리된 핵산 분자.
  36. 청구항 35의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  37. 청구항 36의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  38. 청구항 39의 숙주 세포에서 항체를 발현하고 그리고 숙주 세포로부터 항체를 분리하는 것을 포함하는 항-O8E 항체를 제조하는 방법.
  39. 대상에 질병의 예방 또는 치료를 위해 청구항 1의 항체 또는 이들의 항원 결합 부위를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 O8E를 발현하는 종양 세포의 성장에 의해 특징되는 질병을 치료 또는 예방하는 방법.
  40. 제 39항에 있어서,
    상기 질병은 암임을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 40항에 있어서,
    상기 암은 유방 세포 암종임을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 40항에 있어서,
    상기 암은 난소암임을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 40항에 있어서,
    상기 암은 신장암임을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 40항에 있어서,
    상기 암은 머리및 목암임을 특징으로 하는 방법.
KR1020087012915A 2005-12-08 2008-05-29 오8이에 대한 인간 모노클로날 항체 KR101469287B1 (ko)

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