KR20080064040A - 알파-아밀라제를 생산하는 이노노투스 린테우스 및 그를 이용하여 다당체 함량이 증가된 이노노투스 린테우스 균사체를 제조하는 방법 - Google Patents
알파-아밀라제를 생산하는 이노노투스 린테우스 및 그를 이용하여 다당체 함량이 증가된 이노노투스 린테우스 균사체를 제조하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 알파아밀라제에 대해 높은 활성을 가지는 신규 목질진흙버섯 균주의 분리 및 다량의 다당체 생산조건에 관한 것이다. 본 발명의 방법으로 얻어진 I. linteus 균주는 알파아밀라제와 polysaccharide 함량이 현저하게 높으므로 이를 이용한 기능성 식품 원료 및 기능성 식품 첨가제로 사용한다.
이노노터스린테우스,auto-yeast,알파아밀라제,기능성식품원료,기능성식품첨가제
Description
본 발명은 알파아밀라제에 대해 높은 활성을 가지는 신규 목질진흙버섯(Inonotus linteus EDEN-1)균주의 분리 및 이를 이용한 다량의 다당체 생산조건에 관한 것이다.
뽕나무에 자생하는 상황버섯은 일반적으로 진흙버섯속(Phellinus)의 균류를 지징하는 버섯으로 뽕나무 줄기에 자생하며 삿갓표면을 제외하고는 모두 황색을 띄고 있어 상황이라고 불리워지고 있으며, 상신, 상이, 호손안 등의 이명을 가지고 있다. 상황버섯에 속하는 버섯으로는 목질진흙버섯(Phellinus linteus), 말똥진흙버섯(P.pini), 참진흙버섯(P. contiguus), 녹슨진흙버섯(P. ferrugino), P.baumi, P.ribis, P.rino 등의 다수가 존재하나 중국에서는 상황의 의미를 P.ignarius, 우리나라와 일본에서는 Phellinus linteus를 상황으로 인정하고 있는 실정이며, 국내에서는 P. linteus 와 P. baumi를 식품 부원료로 사용가능하도록 식약청에 규정하고 있다.
P. linteus(목질진흙버섯)는 매우 강력한 항종양 효과를 가지며 항암면역활성 산성다당류인 α-(1,6)-헤테로글루칸(heteroglycan)과 갈락토만노글루칸(galactomannoglucan)의 유효성분을 갖고 있으며, 특유의 베타글루칸(β-glucna(polysaccharide))이라고 하는 면역증강을 유발하는 물질을 가지고 있는 것으로 알려지며, 최근 항암활성이 96.7%로 지금까지 밝혀진 것들 중 가장 높은 것으로 학회에서 보고되어 식품 및 제약을 비롯하여 인간을 포함한 동식물의 면역증강물질로 각광을 받고 있으나, 그 배양방법이 어렵고 배양기간이 1~2년으로 길며, 자연계에서 매우 희귀종으로 자실체(fruiting body)를 입수하기가 대단히 어려울 뿐만 아니라 균사체의 인공배양도 어려워 종양치료제로서 그 효과가 있음에도 불구하고 적극적으로 활용되지 못하고 있는 것이 현실이다.
이에 배양기간이 짧고 상황버섯 고유의 다당체 성분인 베타글루칸의 함량이 높은 상황버섯 균사체 배양법과 관련해 많은 연구가 이루어지고 있으나 아직 저가의 polysaccharide 생산과 관련된 체계적인 연구는 매우 부족한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 개발된 것으로, 알파아밀라제에 대해 높은 활성을 가지는 신규 목질진흙버섯(Inonotus linteus EDEN-1)균주의 분리·동정 및 이를 이용한 다량의 polysaccharide 생산조건에 관한 것으로, 구체적으로는 알파아밀라제의 활성이 우수한 신규 목질진흙버섯(Inonotus linteus EDEN-1)균주의 자실체 조직 또는 포자를 한천배지에서 조직배양 후 계대배양하여, 이를 여러 가지 조건에서 실험함으로써 균사체 배양시의 다량의 polysaccharide 생산조건에 관한 정보를 제공하는데 목적이 있다. 본 발명의 다른 목적은 상황버섯 균사체 속성배양법과 다량의 polysaccharide 생산조건과 같은 기술력을 확립하여 제품화함으로써 국내외적으로 수요가 급증할 것으로 여겨지는 목질진흙버섯 균사체 배양방법에 대한 기본 자료를 제시하여 국가 산업발전에 기여하고 나아가 국가경쟁력을 키우도록 하는 것이다.
본 발명에 관한 자세한 내용은 실시예와 실험예를 중심으로 상세하게 설명하고자 하나, 다음의 실시예에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 균주의 분리
본 발명자들은 2003년 8월 경북 포항 죽장에 위치한 산지에서 그 형태와 색상이 뛰어난 자연산 목질진흙버섯을 채취하여 당일 자실체 조직으로부터 균을 조직 배양하여 균사체를 분리하였다. 조직배양의 방법은 채취한 목질진흙버섯 자실체를 99% ethyl alcohol에 5분간 침지하여 표면 살균을 수행한 후 조직과 포자를 YMG 평판배지(포도당, 맥아추출물, 효모추출물)에 받아내는 방법으로 균사체를 확보하였으며, 24℃ 항온배양기에서 10일동안 배양하여 종균을 확보하여 사용하였다.
실시예 2. 균주의 동정
균주의 동정은 상기의 종균을 배양하여 자실체를 얻은 후 자실체의 형태적 특성을 이용한 방법과 한국미생물연구원에서 ISP-5.8s rDNA sequence의 유전자 검사를 통해 species까지 동정하였다.
<형태학적 특성>
· 관공 : 각형내지 원형으로 mm당 6~8개 분포, 주로 암갈색을 띠며, 관공의 길이는 1mm 정도이다.
· 균사 : 이균사형태
· 포자 : 크기 3.8~4.8 × 2.9~4 um
· 세포벽 : 두껍고, 담황색에서 담황갈색의 나형 내지 광타원형
채취시의
I. linteus
EDEN-1 형태
<염기서열 분석>
I. linteus
EDEN-1의 16s rDNA 염기서열분석 결과
이상의 결과를 종합하여 볼 때, 야생으로부터 얻은 균주는 이노노터스 린테우스(Inonotus linteus)로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명자들은 이 균주를 Inonotus linteus EDEN-1으로 명명하고, 한국농용미생물보존센터에서 기탁하였으며 수탁번호는 KACC93046P이다.
분리한
I. linteus
EDEN-1의 계통도
그리고, 최근 2005년 국제 유전자 Genbank의 계통도 재분류 작업에서 Phellinu linteus는 Inonotus linteus로 그 학명이 바뀌게 되어 본 발명에 사용된 균주명을 KCCM의 유전자 분석 결과에 따라 Inonotus linteus EDEN-1으로 하게 되었다.
실시예 3. 배지별에 따른 I. linteus EDEN-1의 생육 및 polysacchride 생산량 비교본 실시예3에 사용한 배지의 종류 및 조성은 표1과 같다.
| Componet | Composition (g/ℓ) | |||||||
| CDM | GPM | MEM | MCM | MMM | ACM | PDM | YMG | |
| 포도당 | 30 | 20 | 20 | 4 | ||||
| 전분 | 20 | |||||||
| 펩톤 | 5 | 2 | ||||||
| 소이톤 | 4 | |||||||
| 맥아추출물 | 20 | 4 | ||||||
| 효모추출물 | 2 | 6 | 10 | |||||
| 감자추출물 | 3 | 24 | ||||||
| NaNO3 | 3 | |||||||
| K2HPO4 | 1 | 1 | 1 | 1 | ||||
| KH2PO4 | 0.46 | 0.46 | 0.46 | |||||
| FeSO4.7H2O | 0.01mg | |||||||
| MgSO4.7H2O | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | ||||
| NaCl | 0.5 | |||||||
| 아스파라긴 | 2 | |||||||
| KCl | 0.5 | |||||||
| 한천 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 |
The ingredients were dissolved in 1,000 ㎖ of distilled waterAbbreviation : CDM; Czapek-Dox medium, GPM; Glucose peptone yeast extract medium, MEM; Malt extract medium, MCM; Mushroom complex medium, MMM; Mushroom minimal medium, ACM; Agrocybe cylindracea medium, PDM; Potato dextrose medium, YMG; Yeast extract malt extract glucose medium
균사체 생육을 측정하기 위해서 제조된 평판배지는 pH 6.0으로 조정하였고 평판배지의 중앙에 8mm의 균사체 조각을 놓아두고 24도 항온기에서 10일동안 배양 후 colony의 직경을 mm까지 측정하였다. 실험은 3회 반복 수행하여 평균 및 표준편차를 구하였으며, polysaccharide의 양은 10일 동안 진탕배양 후 여과된 액을 이용하여 ethanol 침전법을 적용하여 측정하였다.
여러 복합배지에서 의 I. linteus EDEN-1의 생육정도
이중 YMG, ACM, MCM 배지 순으로 생장이 우수한 것으로 나타났다.
그리고, polysaccharide의 양이 가장 우수한 배지로는 YMG 배지로 0.82 g이 회수되었으며 MMM 배지에서 0.31 g이 회수되었다.
실시예 4. 여러 P. linteus 균주와의 다당체 비교
본 실시예4에 사용한 배지는 실시예3에서 polysachride의 양이 가장 우수한 것으로 나타난 YMG 배지를 사용하였으며, polysacchride 측정방법은 동일한 방법을 사용하였다. 비교대상으로 사용된 목질진흙버섯 ATCC 26710 은 한국생명공학연구원 생물자원센터, IMSNU 31014는 서울대학교 미생물연구소로부터 분양 받아 사용하였다.
목질진흙버섯으로부터 polysaccharide의 추출을 위하여 각 균주를 500 ㎖의 YMG 액체배지를 이용 접종량이 5%(V/V)가 되도록 접종후 24± 1℃에서 진탕배양기(120 rpm)에서 10일간 배양하였으며, 균사의 생육도 측정을 위하여 배양된 균사를 여과지(Toyo filter No.2)를 사용하여 여과 후, 증류수로 3회 세척, 건조(70℃, 24 hr)하여 건조체 중량을 측정하였고, 동일한 방법으로 배양된 배양체를 121℃, 1.5기압에서 autoclave하여 filter paper로 여과 후 여액의 2배에 해당하는 Ethanol(95%)를 첨가하여 4℃에서 24시간 동안 정치시키고, 5,000× g에서 15분간 원심분리하여 침전된 exo-polysaccharide을 회수하여 70℃에서 건조시켜 polysaccharide의 양을 측정하였으며, 동일한 방법으로 접종하지 않은 배지의 대조군들을 직접조제하여 얻은 polysaccharide의 양을 제외시켜 결과를 산출하였다.
| polysaccharide양 | mycelial growth |
여러 목질진흙버섯의 균사 생육 및 polusaccharide 함량 측정
실험 결과 특허에 사용된 분리 균주의 경우 생육과 polysaccharide의 양이 가장 우수한 것으로 나타났다.
실시예 5. 분리균주 I. linteus EDEN-1 의 polysaccharide 생산량 변화
본 실시예5에 사용한 배지는 YMG 배지를 기본으로 하여 맥아추출물을 제외한 YG 배지와 효모추출물을 제외한 MG 배지, 포도당을 제외시킨 YM 배지를 병행하여 실험을 진행하였으며, 해당결과에서 얻어진 효모추출물의 첨가에 따른 결과를 변화시키기 위해 맥주발효후 발생하는 건조효모(Dried Yeast)와 건조효모를 분해시킨 후 정제 효모추출물의 전단계인 파괴된 세포벽을 포함한 파쇄효모추출물(Auto Yeast)를 첨가하여 실험을 수행하였다.
여러 조성 변화에 따른
I. linteus
EDEN-1의 polysaccharide 함량 측정
그 결과 아래와 같이 AUTO-YEAST를 사용한 YG 배지와 YMG 배지에서 매우 높은 polysacchride 생산을 확인할 수 있었다.
AUTO-YEAST 양의 변화에 따른 다당체 생성 정도의 변화 측정
그래서 AUTOYEAST의 양을 점진적으로 변화시켜 실험을 수행해본결과 아래와 같이 0.6%에서 가장 우수한 다당체 생성을 확인할 수 있었다. 본 다당체 생성량을 확인하기 위해서 Ethanol 침지전 과정으로 열수 추출된 균사체 및 yeast는 filter paper로 걸러내는 작업을 수행하였다.
실시예 6. 분리균주의 알파아밀라제 활성 실험
알파알밀라제의 효소 활성은 Danielssion(1947)의 방법을 사용하여 측정하였다. 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0)에 녹인 1% starch 용액 500 ㎕, sterilized water 480 ㎕, 조효소액 20 ㎕를 넣고 34℃에서 5분간 반응시킨 후, DNS법으로 환원당의 양을 측정하였다. α-D-glucose를 표준용액으로 사용하였으며, 1 unit는 1분 동안 1umol의 환원당을 생성하는 효소량으로 정의하였다.
단백질 정량은 Coomassie brilliant blue가 단백질과 결합하여 청색으로 발색되는 흡광도를 595 nm에서 측정하는 Bradford 방법(Bradford, 1976)을 사용하였다. 정량하고자 하는 시료 100 ㎕에 시판하는 Broadford 용액 2.5 ml을 첨가하고 10분 후 흡광도를 측정(UV-160A spectrophotometer, Shimadzu)하였으며, 표준곡선은 bovine serum albumin V을 기초로 하여 작성하였다.
여러 목질 진흙버섯의 alfa amylase 활성도 측정
실시예 7. 분리균주와 다른 linteus 균주의 곡물 배양특성
본 실시예7을 위하여 선별된 맵쌀 보리쌀 200g에 AUTOYEAST를 0.6%혼합하여 12시간동안 침지한 후 121℃에서 3시간동안 멸균하여 4℃에서 3시간동안 하온시켜 linteus 균을 1%(v/v)이 되도록 접종하였다. 그리고 24℃에서 45일동 배양시켜 본 결과물을 획득하였다.
. 
A : IMSNU 31031 B : EDEN-1
위의 그림과 같이 IMSNU 31031의 보다 EDEN-1의 경우 훨씬 노란색을 가지는 것으로 나타났다. 그리고 본 도 8에는 나타나지 않았지만, ATCC 26710의 경우 곡물에서의 배양이 잘 되지 않아 사진을 찍기 위해 탈병하는 과정에서 부서져 버려 그 결과물을 찍지 못했다. 이러한 결과는 해당 린테우스 균주간의 알파아밀라제 분비량에 차이가 나기 때문인 것으로 여겨진다.
이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명은 분리균 I. linteus EDEN-1은 알파아밀라제 활성이 다른 목질진흙버섯에 비해 우수하다. 분리균은 기존 다른 목질진흙버섯에 비해 polysaccharide의 생산량이 높고, 노란색상이 우수하며, autoyeast를 0.6%정도 첨가하여 배양할 경우 높은 polysaccharide의 생성을 유도하는 것으로 나타났다. 이는 본 발명의 결과를 통해 제조되는 목질진흙버섯 균사체는 높은 polysaccharide 생산이 가능하여 제약 및 식품 원료, 기능성 식품 첨가제로 높은 적용 효과가 나타나게 되는 것이다.
Claims (2)
- 알파아밀라제 활성이 및 노란 색상이 뛰어난 신규 I. linteus EDEN-1, KACC93046P 균주
- auto-yeast 첨가를 통해 polysaccharide함량이 증가된 I. linteus EDEN-1, KACC93046P 균사체의 제조방법
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