KR20080012483A

KR20080012483A - 레스베라트롤을 함유하는 쌀

Info

Publication number: KR20080012483A
Application number: KR1020060073352A
Authority: KR
Inventors: 백소현; 신운철; 강현중; 박광근; 김현순; 김정곤
Original assignee: 대한민국(관리부서:농촌진흥청)
Priority date: 2006-08-03
Filing date: 2006-08-03
Publication date: 2008-02-12

Abstract

본 발명은 항암, 항고지혈증, 항혈전작용 등의 다양한 약리 효과를 가지는 레스베라트롤을 함유하는 쌀에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 레스베라트롤을 암호화하는 유전자가 세포내에 도입된 형질전환 벼 종자 및 벼 식물체로부터 생산할 수 있는 레스베라트롤을 함유하는 쌀에 관한 것이다.

본 발명에 의하면 레스베라트롤 합성 유전자를 이용하여 레스베라트롤 고함유 작물을 개발할 수 있으며, 특히 레스베라트롤 생합성 벼는 식용 및 화장품, 음료, 사료 등 다양한 가공품의 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

레스베라트롤 생합성 유전자(RS), 항암, 항혈전, 벼과식물, 형질전환

Description

레스베라트롤을 함유하는 쌀 {Rice containing resveratrol}

도 1은 본 발명의 팔광땅콩으로부터 분리한 레스베라트롤 생합성 유전자 AhRS의 염기 서열과 아미노산 서열을 나타낸다.

도 2는 본 발명 AhRS 유전자가 포함된 형질전환용 벡터를 나타낸다.

도 3은 본 발명 AhRS 유전자가 도입된 형질전환 벼 식물체를 나타낸다.

도 4는 본 발명 AhRS 유전자 형질전환 벼의 PCR 분석 결과를 나타낸다.

도 5는 본 발명 AhRS 유전자 형질전환 벼의 Southern 분석 결과를 나타낸다.

도 6은 본 발명 AhRS 유전자 형질전환 벼의 northern 분석 결과를 나타낸다.

도 7은 레스베라트롤과 피세이드 표준물질(A), 동진벼(B), 본 발명 AhRS 유전자 형질전환 벼 T₂ 세대(DRS-195-4)의 레스베라트롤 생합성(C)을 나타낸 HPLC 분석 결과를 나타낸다.

레스베라트롤 생합성 유전자 (resveratrol synthase, RS)의 산물인 레스베라트롤은 식물이 강한 자외선 (UV)이나, 곰팡이균에 감염되었을 때 방어물질로 생합성 되는 피토알렉신 (phytoalexin) 물질로 1976년 Langcake와 Pryce에 의해 보고되었다.

레스베라트롤은 강한 항산화성으로 결장암, 구강포진, 궤양치료에 이용되고 있으며, 또한 항암, 항혈전, 항고지혈증, 항염증, 발작질환, 심혈관 질병의 예방 등 인간의 건강 증진을 위한 약리 효과가 (Aggarwal 등, 2004; Fremont, 2000; Jang 등, 1997; Wu 등, 2001) 있음이 밝혀졌다.

또한, 레스베라트롤은 상기의 약리활성 효과 외에도 수명연장 관련 단백질인 sir2를 활성화 시키는 물질로 알려졌다. Sir2 단백질은 저칼로리 조건에서 NAD⁺에 의하여 활성화되어 세포의 수명을 연장시키는 수명연장 관련 단백질 중 하나인데, Konrad 등 (2003)의 보고에 의하면 sir2 단백질은 칼로리를 제한하였을 때에만 NAD⁺에 의하여 유일하게 활성화되는데, 레스베라트롤을 첨가한 조건에서도 저칼로리 조건과 유사하게 sir2 단백질이 활성화되어, 효모를 이용한 실험에서 레스베라트롤을 첨가하였을 때 효모의 수명이 평균 70%가 증가하였다는 실험 결과를 발표하였다.

이러한 생리활성을 갖는 레스베라트롤은 72종 이상의 식물체에서 합성되며, 소나무 등 목본류에서는 항상 생산되지만, 초본류에서는 피토알렉신 활성에 의해 상처, 오존에 의한 손상, UV, 병해충 감염 등 외부 스트레스에 의한 자기방어 물질로 생합성 되며, 레스베라트롤의 생합성이 가장 우수한 식물은 포도와 땅콩이다 (Schroder 등, 1990).

적포도주에는 레스베라트롤이 함유되어 있어 '프렌치 패러독스' (French Paradox)라 하여 적포도주의 섭취와 심혈관질환의 발병률은 부의 상관관계가 있다 (Wu 등, 2001)는 보고는 적포도주가 전 세계적으로 관심을 끌게 된 계기가 되었다.

하지만, 레스베라트롤의 함량을 인위적으로 증진시키기 위하여 재배시 포도에 인위적으로 균주를 접종하거나, 수확 후 포도와 땅콩 종자에 초음파 세척 처리나, UV 조사 등을 통하여 레스베라트롤의 함량을 증진시키는 연구들이 시도되고 있다.

또한, 포도와 땅콩으로부터 분리한 레스베라트롤 합성 유전자를 생명공학기법을 이용하여 레스베라트롤 생합성 작물을 개발하려는 연구가 시도되고 있다. 포도의 레스베라트롤 합성 유전자를 이용한 형질전환 키위 식물체 잎에서 182㎍/g의 레스베라트롤이 생산되었으며 (Kobayashi 등, 2000), 땅콩의 레스베라트롤 합성 유전자를 이용한 형질전환 담배의 현탁배양 세포에서 50ng/g의 레스베라트롤이 생산되었음을 보고하였다 (Hain 등, 1990).

레스베라트롤 합성 유전자는 1분자의 coumaroyl-CoA와 3분자의 malonyl-CoA 를 전구물질로 이용하여 레스베라트롤을 생합성 한다. 또한, 찰콘 합성 (chalcone synthase) 유전자도 레스베라트롤 합성 유전자와 마찬가지로 1분자의 coumaroyl-CoA와 3분자의 malonyl-CoA를 전구물질로 이용하여 플라보노이드(flavonoid)를 생합성 한다. 벼에는 레스베라트롤 합성 유전자는 존재하지 않으나, 찰콘 합성 유전자가 11번 염색체에 존재하며, 또한 정상적인 단백질을 생산한다고 보고하였다 (Reddy 등, 1996).

P. Stark-Lorenzen 등은 포도에서 유래한 스틸빈(레스베라트롤) 합성 유전자를 벼에 도입하여 도열병에 저항성이 있음을 보고하였다(Plant Cell Reports(1997) 16;668-673).

그러나 본 발명에서와 같이 레스베라트롤 합성 유전자를 벼에 도입하여 레스베라트롤을 함유하는 쌀을 생산한 사례는 아직까지 없다.

본 발명의 목적은 항암, 항고지혈증, 항혈전작용 등 다양한 약리 효과를 가지는 레스베라트롤을 함유하는 쌀을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적은 레스베라트롤을 암호화하는 유전자가 세포내에 도입된 형질전환 벼 종자 및 벼 식물체를 제공하는데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 레스베라트롤을 함유하는 쌀을 제 공한다.

본 발명은 레스베라트롤을 암호화하는 유전자가 세포내에 도입된 형질전환 벼 종자를 제공한다.

본 발명은 레스베라트롤을 암호화하는 유전자가 세포내에 도입된 형질전환 벼 식물체를 제공한다.

본 발명은 레스베라트롤을 암호화하는 유전자를 세포내에 도입하여 레스베라트롤을 생산하는 재조합 벼 종자의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 상기의 형질전환 벼 종자를 배양하여 벼 식물체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 레스베라트롤을 암호화하는 유전자가 도입된 벼 형질전환용 재조합벡터를 제공한다.

상기에서 레스베라트롤을 암호화하는 유전자는 땅콩 또는 포도로부터 유래된 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명의 내용을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 레스베라트롤을 함유하는 쌀을 생산하기 위한 레스베라트롤 생합성 벼를 개발하기 위하여, 농촌진흥청 육성 팔광땅콩에서 레스베라트롤 합성 유전자를 분리하였고, 이를 이용하여 레스베라트롤과 피세이드 (resveratrol-3-O-D-glucoside, 레스베라트롤과 배당체 결합물)를 생합성 하는 벼를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 레스베라트롤을 암호화하는 유전자는 땅콩 또는 포도로부터 유래한 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 실시예에서 레스베라트롤 합성 유전자는 땅콩으로부터 유래한 레스베라트롤 합성 유전자를 분리한 것으로, 식물체내에서 레스베라트롤(389 amino acid)을 발현한다(도 1 참조). 상기 레스베라트롤 합성 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가진다. 또한, 본 발명에서는 경우에 따라 상기 서열번호 1기재의 염기서열 중 일부결실, 과잉의 염기 또는 염기서열의 부가, 또는 염기 서열 중의 염기 또는 부분서열의 다른 염기서열로의 치환, 또는 이들의 복합인 변형서열이 사용될 수 있다. 하지만, 상기 변형서열은 궁극적으로 얻어지는 최종 레스베라트롤 단백질의 3차원적 구조에 실질적으로 영향을 주지 않는 범위 또는 활성에 실질적으로 영향을 주지 않는 범위내일 것이 요구된다.

또한, 본 발명의 레스베라트롤은 상기 서열번호 1 기재의 유전자와 이들의 변형서열 이외에도 이와 상보적인 유전자를 포함한다. 상보적인 유전자는 DNA 복제과정을 통해 서열번호 1 기재의 유전자와 이들의 변형서열을 가지는 유전자로 쉽게 합성할 수 있는 주형으로 사용될 수 있다. 상보적인 유전자를 얻는 과정은 당업자에게 극히 용이한 기술에 불과하며, 이러한 서열은 서열번호 1 기재의 유전자 또는 이들의 변형서열을 주형으로 직접 작성될 수 있다.

또한, 본 발명의 레스베라트롤은 서열번호 2 기재의 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 서열번호 2 기재의 폴리펩타이드는 389개의 아미노산 서열을 가지며, 레스베라트롤 생합성 활성을 가진다.

또한, 본 발명은 서열번호 2 기재의 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 포함한다. 이들 유전자는 형질전환에 사용될 숙주의 종류에 따라 제공되는 코돈용법(codon usage)에 따라 상기 폴리펩타이드를 발현할 수 있도록 암호화하는 다양한 조합의 유전자일 수 있다.

본 발명에서 레스베라트롤을 암호화하는 유전자가 도입된 식물체를 제조하기 위하여 벡터는 pSB22, pBI121, pCAMBIA2301, pCAMBIA3301 등의 식물체 형질전환용 벡터를 사용할 수 있다.

상기에서, 식물체 형질전환용 벡터는 식물체 전신 발현을 유도하기 위하여 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터와 제초제 저항성 유전자를 선발 마커로 가질 수 있도록 구축할 수 있다.

형질전환과정은 식물체의 형질전환체 제조공정에서 통상적으로 사용되는 어떠한 시스템도 이용될 수 있다. 이러한 기술로서는 특히 이들에 한정되지 않지만 칼슘/폴리에틸렌 글리콜법을 이용한 원형질체의 형질전환법, 전기 천공법 및 미량주사법 또는 (코팅된)입자 충격투입법 등이 있다.

이와 같은 소위 직접 유전자 형질전환법 이외에 바이러스 벡터(예를 들면, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV)로부터 얻음) 및 박테리아 벡터(예를 들면, 아그로박테리움속으로부터 얻음) 등의 벡터를 포함하는 형질전환 시스템이 널리 이용될 수 있다. 선택 및/또는 스크리닝 후, 형질전환된 원형질체, 세포 또는 식물부분을 공지의 방법에 따라 완전한 식물로 재생시킬 수 있다(Horsch, R. b. et al., 1985). 형질전환법 및/또는 재생기술의 선택은 본 발명에서 중요한 것은 아니다.

벼를 포함한 단자엽 작물의 형질전환 및 재생은 표준공정은 아니나, 최근의 과학적 진보에 따라 원리적으로 단자엽 식물도 형질전환이 가능하며 형질전환 세포로부터 생식 능력이 있는 트랜스제닉 식물이 재생될 수 있음이 밝혀졌다. 이들 식물에 유전물질을 도입시키는 효과적인 방법과 더불어 이들 식물의 재생 조직배양 시스템의 개발로 형질전환은 더욱 용이하게 되었다. 최근에 단자엽 식물의 형질전환을 위하여 채택되는 방법은 체외 배양체 또는 현탁세포의 미량투사 충격투입법 및 직접적 유전자 흡수법 또는 원형질체의 전기 천공법 등이다. 또한, 이들 방법은 쌍자엽 식물의 형질전환 및 재생에도 적용될 수 있다.

종자에서 특정한 목적으로 사용하기 위하여 재조합 유전자를 높게 또는 적절한 수준으로 발현시키는 것으로 이미 공지된 조절서열이 본 발명에서도 사용될 수 있다. 이와 같은 조절서열은 식물 또는 식물 바이러스로부터 얻어지거나 또는 화학적 방법으로 합성될 수 있다. 이러한 조절서열은 종자에서 전사를 지휘하는 프로모터를 들 수 있다. 발현율을 높이기 위한 프로모터로서는 특히 이들에 한정되지 않지만 종자-특이 유전자의 프로모터, 특히 브라시카 나퍼스의 CruA 프로모터와 같은 저장 단백질 유전자의 프로모터(Ryan et al., 1989) 또는 구조적 발현 유전자의 프로모터 예컨대 CaMV(Cauliflower Mosaic Virus)의 35S 프로모터(Guilley et al., 1982) 등이 있다. 다른 조절서열은 종결서열 및 폴리아데닐화 시그날 그리고 식물에서 이와 같은 기능을 하는 모든 서열 등이 여기에 포함될 수 있다. 구체적인 예로서는 아그로박테리움 투마파시엔의 노팔린 신타아제 유전자의 3'측위 영역 또는 브라시카 나퍼스의 CurA유전자의 3'측위 영역 등이 있다. 또한, 조절서열에서는 CaMV의 35S프로모터에서 발견되는 것과 같은 인핸서서열, AIMV(Alfalfa Mosaic Virus) RNA4의 리더 서열과 같은 mRNA 안정화 서열(Brederode et al., 1980) 또는 이와 같은 기능을 하는 기타 서열 등이 포함될 수 있다.

상기 본 발명의 적합한 유전자 구성체의 모든 부분(프로모터, 조절서열, 안정화서열, 시그날 서열 또는 종결서열)은 필요하다면 공지 기술을 사용하여 이들의 조절 특성이 변하도록 변이될 수 있다.

본 발명에 의하면 레스베라트롤 생합성 기능이 도입된 형질전환 벼 종자 및 벼 식물체를 제조하여 레스베라트롤을 함유하는 쌀를 제공할 수 있다. 따라서 항암, 항혈전, 항고지혈증, 항산화 및 심혈관계 질환 등의 발병을 낮추는 기능을 갖는 레스베라트롤을 유전자 조작 기술에 의해 세계 인구의 1/3 이상이 주식으로 이용하는 벼에 도입함으로써, 레스베라트롤을 쌀을 통해 섭취할 수 있게 하여, 노화, 암, 심혈관질환 등 인간의 질병 예방과 국민건강 증진에 크게 기여할 수 있다.

이하 본 발명의 내용을 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다.

실시예

본 발명은 레스베라트롤 합성 유전자를 이용하여 레스베라트롤을 생합성하는 벼 개발을 위하여, 레스베라트롤 합성 유전자를 RT-PCR을 이용하여 땅콩에서 분리하고, AhRS 유전자의 염기서열을 분석하는 단계와, 상기 AhRS 목적 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현벡터를 제조하는 단계와, 상기 형질전환용 벡터를 이용하여 AhRS 형질전환 벼를 개발하는 단계와, 상기 AhRS 형질전환 벼의 PCR, Southern과 northern 분석 단계와, 상기 AhRS 형질전환 벼의 레스베라트롤 생합성을 HPLC 법을 이용하여 분석하는 단계로 이루어진다.

실시예 1. RT-PCR 이용 땅콩 레스베라트롤 합성 유전자 분리 및 염기서열 분석

유전자 염기서열 데이터베이스인 GenBank (NCBI, USA)에 등록된 땅콩의 레스베라트롤 합성 유전자의 염기서열을 분석하여 정방향 프라이머 (ATGGTGTCT GTGAGTGGAATTC)와 역방향 프라이머 (CGTTATATGGCCACACTGC)를 제작하였다.

농촌진흥청에서 육성한 팔광땅콩으로부터 어린 꼬투리를 수확하여 액체 질소를 이용하여 곱게 마쇄한 후, TRI 시약(MRC, USA)을 사용하여 total RNA를 분리하였다. Total RNA을 NucleoTrap mRNA Midi Purification kit (Clontech, USA)를 이용하여 mRNA를 추출하였다.

TaKaRa One Step RNA PCR kit (Takara, Japan)을 이용하여 땅콩의 꼬투리로부터 분리한 mRNA와 상기의 프라이머를 이용 RT-PCR을 수행하여 레스베라트롤 합성 유전자를 증폭하였다.

상기의 땅콩 mRNA로부터 증폭된 레스베라트롤 합성 cDNA를 유전자 운반체인 pGEM-T Easy vector (Promega, USA)에 클로닝한 후, 대장균 JM109에 형질전환하여 염기서열 분석에 이용하였다. 염기서열 결정은 벡터에 존재하는 T7과 SP6 프라이머를 사용하여 LI-COR (USA)사의 DNA sequencer 4200을 이용하였다. 결정된 염기서열과 아미노산 서열을 도 1에 표시하였다 (도 1).

땅콩에서 분리한 레스베라트롤 합성 유전자 AhRS의 염기서열은 1,172개의 뉴클레오티드(서열 1)와 389개의 아미노산으로 구성된 레스베라트롤 합성 단백질을 암호화하는 서열로 구성되어 있었다(도 1).

실시예 2. AhRS 유전자를 포함하는 형질전환 벡터 제작

AhRS 유전자를 벼에 도입하기 위하여 운반체의 backbone으로 binary 벡터인 pCAMBIA 3300이 사용되었으며, 식물체 전신발현을 유도하기 위하여 ubiquitin 프로모터와 제초제 저항성 유전자 (Bar)를 선발 마커로 갖는 형질전환 벡터를 제작하였다. pUBA 벡터로부터 HindIII와 BamHI 제한효소를 처리하여 ubiquitin 프로모터를 분리하고, pBT121 벡터로부터 BamHI과 EcoRI 제한효소를 처리하여 nos 터미네이터를 분리하였다. pCAMBIA 3300 벡터를 HindIII와 BamHI 제한효소를 처리하여 절단하고, 그 자리에 ubiquitin 프로모터를 첨가하고, pCAMBIA 3300을 BamHI과 EcoRI 제한효소를 처리하여 절단하고, 그 자리에 nos 터미네이터를 첨가하여 pSB22 벼 형질전환용 벡터를 제작하였다.

상기의 AhRS 유전자를 pSB22 벼 형질전환 벡터에 삽입하기 위하여, BamHI 제 한효소 자리를 갖도록 정방향 프라이머 (CGGATCCATGGTGTCTGTGAGTG)와 SacI 제한효소 자리를 갖도록 역방향 프라이머 (CGAGCTCCGTTATATGG CCACA)를 제작하였다. AhRS 유전자를 상기의 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행한 후, 유전자 증폭 산물을 BamHI와 SacI 제한효소로 처리하고 pSB 22 형질전환 벡터에 삽입하여 제작한 pSB2220 벡터를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 각 부호의 약어는 다음과 같다.

BL (left border), RL (right border), pUbi (polyubiquitin gene promoter), RS (resveratrol synthase cDNA of peanut), tNos (polyadenylation signal of nopaline synthase gene), p35S (CaMV 35S promoter), Bar (phosphinothricin acetyltransferase), t35S (polyadenylation signal of CaMV 35S gene), Km(R) (kanamycin-resistant gene).

실시예 3. AhRS 유전자의 벼 형질전환

땅콩의 레스베라트롤 합성 유전자를 갖는 pSB2220 형질전환 벡터를 벼에 도입시키기 위하여, 재조합된 pSB2220은 freezing-thawing 법 (An, 1987; An et al., 1988)을 이용하여 A. tumefaciens (LBA 4404)에 도입하였다.

상기의 pSB2220 (도 2)이 도입된 아그로박테리움을 AB (K₂HPO₄ 6g, NaH₂PO₄ 2g, NH₄Cl 2g, KCl 0.3g, MgSO₄·7H₂O 0.6g, CaCl₂·2H₂O 0.025g, FeSO₄·7H₂O 0.05g, Glucose 10g, DW 10㎖) 액체 배지에 28℃에서 3일간 배양하여 증식시킨 후, 10배 농축하여 벼 캘러스 감염에 이용하였다.

성숙한 벼 종자의 현미를 70% 에탄올로 1분간, 2% NaClO로 1시간 살균하였다. 살균 후 종자를 멸균수로 5회 이상 세척하고, 2N6 (N₆ salt 3.95g/L, sucrose 30g/L, casamino acid 1g/L, 2,4-D 2㎎/L, phytagel 2g/L, pH 5.6∼5.7) 배지에 넣어, 25℃의 암조건에서 약 3주간 배양하여 캘러스를 유도하였다.

상기에서 유도한 벼 캘러스 중 직경이 3∼4mm 정도의 것을 다시 2N6 배지에 옮겨 25℃의 암조건에서 4일간 배양하였다. 이에 따라 캘러스 세포의 분열 활성을 높일 수 있었다. 유전자 도입은 배양된 캘러스와 AB 배지에서 증식한 작제물이 도입된 아그로박테리움을 혼합하여 20분간 감염시킴으로써 행하였다. 감염시킨 후, 250㎎/L cefotaxime이 첨가된 멸균수로 5회 이상 세척하여 아그로박테리움을 제거하였다.

아그로박테리움에 감염된 캘러스를 2N6-PT5 (N₆ salt 3.95g/L, sucrose 30g/L, casamino acid 1g/L, 2,4-D 2㎎/L, phosphinothricin 5㎎/L, cefotaxime 250㎎/L, phytagel 2g/L, pH 5.6∼5.7) 배지에 옮겨, 25℃의 암조건에서 4주간 배양하여 phosphinothricin (PPT) 선발마커에 저항성을 나타내어 활발하게 생장하는 캘러스를 선발하였다 (도 3의 A).

2N6-PT5 배지에서 선발된 캘러스를 N6-BA (N₆ salt 3.95g/L, sucrose 20g/L, sorbitol 30g/L, casamino acid 2g/L, 2,4-D 1㎎/L, BAP 0.5㎎/L PPT 6㎎/L, cefotaxime 250㎎/L, phytagel 2g/L, pH 5.6∼5.7) 배지에 옮겨, 25℃의 암조건에 서 2주간 배양하여 활발하게 생장하는 캘러스를 선발하였다.

N6-BA 배지에서 선발된 캘러스를 MSR (N₆ salt 3.95g/L, sucrose 40g/L, sorbitol 20g/L, myo-inositol 100㎎/L, NAA 0.1㎎/L, kinetin 2㎎/L PPT 6㎎/L, cefotaxime 250㎎/L, phytagel 5g/L, pH 5.6∼5.7) 배지에 옮겨, 25℃의 16시간 명조건에서 1개월 이상 배양하여 식물체를 분화시켰다 (도 3의 B).

재분화된 벼는 페트리디쉬 안에서 약 4∼5cm 정도의 크기가 되면 병 배지에 옮겨 조도 약 2만 룩스, 25℃의 16시간 명조건에서 2∼3 엽기까지 생육시켰다 (도 3의 C).

그 후, 유묘를 GMO 온실의 토양에 이식하여 종자를 수확하였다. 재분화된 당대의 식물체를 T₀ 세대, 이 식물체로부터 수확한 종자를 T₁ 세대로 가정하고, T₂ 세대까지 진전 시켰다 (도 3의 D).

실시예 4. AhRS 유전자 형질전환 벼의 PCR 분석

본 발명에서 사용한 AhRS 유전자가 형질전환 벼에 성공적으로 삽입되었는지를 직접 확인하였다.

이를 위해 재분화 벼 식물체에서 genomic DNA을 분리하고 PCR을 수행하였다.

땅콩의 AhRS 유전자 도입을 확인하기 위해 PCR 수행에 이용된 프라이머는 상기의 pSB2220 형질전환 벡터 제작에 이용된 정방향 프라이머 (CGGATCCATGG TGTCTGTGAGTG)와 역방향 프라이머 (CGAGCTCCGTTATATGGCCACA)를 사용하였다.

PCR 반응액 25㎕의 조성은 10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl₂, 200nM primer, 200μM dNTP, 주형 DNA 10ng 그리고 1unit Taq polymerase (Takara, Japan)이었다. PCR 반응은 94℃에서 2분간 변성반응을 거친 후, 증폭반응 (94℃에서 20초, 64℃에서 20초, 72℃에서 50초)을 35회 진행하였고, 최종 신장반응은 72℃에서 7분간 수행하였다. PCR 반응은 MJ research 사의 PTC-100 (USA)에서 수행하였다.

상기의 AhRS 프라이머를 이용하여 PCR 수행한 결과를 도 4에 나타내었다. 도에서 M은 1kb ladder, P는 positive control, N은 비형질전환체 (동진벼), 1∼12은 pSB2220에 의한 형질전환 재분화 식물체를 나타낸다.

실험결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, 재분화 벼 식물체 모두에서 약 1.1kb 크기의 밴드가 확인되었다. 이는 모든 재분화 벼 식물체에 땅콩의 AhRS 유전자가 벼의 게놈에 안정적으로 도입되었음을 증명하는 것이다.

실시예 5. AhRS 유전자 형질전환 벼의 Southern 분석

본 발명에서 사용한 AhRS 유전자가 형질전환 벼의 게놈에 성공적으로 삽입되었는지 여부를 Southern 분석으로 확인하였다.

이를 위해 재분화 벼 식물체에서 genomic DNA를 추출하였다. 분리한 genomic DNA 10㎍를 BamHI 제한효소로 처리하고, 0.8% agarose gel에서 전기영동한 후, Southern (1975)의 방법을 이용 Hybond N⁺nylon membrane (Amersham, UK)에 DNA를 전이시켰다. AhRS cDNA를 AlkPhos Direct Labelling kit (Amersham, UK)를 이용하여 탐침자를 제작하고, 잡종화 반응을 위해 membrane을 AlkPhos Direct Detection kit (Amersham, UK)를 이용하여 잡종화 과정을 수행한 후, X-ray film에 3시간 노출한 후 현상하였다. 실험결과 사진을 도 5에 도시하였다. 도 5에서 각 기호의 의미는 도 4의 것과 동일하다.

도 5에서 보는 바와 같이, 비형질전환체 (N)인 동진벼에서는 밴드가 전혀 나타나지 않았으나, positive control (P)과 pSB2220에 의한 T₀모든 형질전환체 (1∼12)에서는 1개에서 6개의 밴드를 확인할 수 있었다. 이는 땅콩의 AhRS cDNA가 벼의 게놈 상에 성공적으로 도입되었음을 증명하는 결과이다.

실시예 6. AhRS 유전자 형질전환 벼의 northern 분석

상기의 형질전환 벼에서 외래 유전자 AhRS가 실제적으로 발현되는지 여부를 northern 분석으로 확인하였다.

AhRS 유전자의 발현을 확인하기 위하여 형질전환 벼 T₀ 식물체에서 total RNA를 추출하였다. Northern 분석을 위해 20㎍의 total RNA를 1.0% formaldehyde 젤에서 전기영동한 후, Southern (1975)의 방법을 이용 Hybond N⁺nylon membrane (Amersham, UK)에 RNA를 전이시켰다. 잡종화 반응은 상기의 Southern 분석과 동일한 방법으로 수행한 후, X-ray film에 3시간 노출하여 현상하였다. 실험결과 사진을 도 6에 도시하였다. 도에서 각 기호의 의미는 도 4의 것과 동일하다.

도 6에서 보는 바와 같이, 비형질전환체 (N)인 동진벼에서는 밴드가 전혀 나타나지 않았으나, 상기의 Southern 분석에서 DNA의 도입이 확인된 12개의 모든 형질전환체에서 (비록 발현량은 차이가 있지만) AhRS 유전자가 발현됨을 확인하였다. 이는 땅콩의 AhRS cDNA 유전자가 벼에서 정상적으로 발현되고 있음을 증명하는 결과이다.

실시예 7. AhRS 형질전환 벼의 레스베라트롤 생합성 분석

상기의 형질전환 벼에서 땅콩 AhRS 유전자의 최종산물인 레스베라트롤이 실제로 생성되는지를 HPLC 분석을 통해 확인하였다.

레스베라트롤은 T₂ 세대의 형질전환 벼 종자로부터 추출하였다. 형질전환 현미 종자를 마쇄한 후, 600㎎의 분말을 2㎖ 튜브에 넣고, 80% 메탄올 600㎕을 첨가하였다. 이를 45℃에서 50분간 150rpm으로 교반하여 레스베라트롤이 추출되도록 하였다. 추출 튜브를 4℃ 10,000g에서 5분간 원심분리한 후, 상징액을 0.2㎛ membrane filter로 여과하여 HPLC 분석에 이용하였다. HPLC 분석은 Waters사의 Alliance (Waters 2695, Ireland)와 XTerra RP18 5㎛ 4.6ㅧ250㎜ column (Waters, Ireland)을 이용하였고, 용매는 물과 아세토나이트릴을 구배조건으로 하였다. 구배조건은 처음 0에서 5분간은 물과 아세토나이트릴을 90:10 (v/v)으로, 5에서 65분간은 물과 아세토나이트릴을 70:30 (v/v)으로 기울기를 주어 분석을 수행하였다. 분석은 추출액 10㎕를 주입하여 1.0㎖/min 유속으로 UV 308nm 파장에서 측정하였다. 레스베라트롤, 레스베라트롤과 배당체 결합물인 피세이드 (resveratrol-3-O-D-glucoside)의 피크는 표준물질의 UV spectrum, retention time을 기준으로 추정하였다. 실험결과를 도 7에 나타내었다. 도에서 각 부호의 약어는 다음과 같다. P (resveratrol-3-O-D-glucoside), R (resveratrol), RT ( retention time).

도 7에서 A는 piceid (P)와 reveratrol (R) 표준물질의 m/z값을 나타낸 것이고, B는 레스베라트롤 합성 유전자가 도입되지 않은 비형질전환체 (동진벼)를 나타내었고, C는 레스베라트롤 합성 유전자가 도입된 T₂세대 DRS-195-4 계통의 HPLC 결과를 나타낸 사진이다.

도 7-C 형질전환 벼의 피세이드와 레스베라트롤의 피크는 도 7-A의 표준물질인 피세이드의 머무름 시간 33.4분, 레스베라트롤의 머무름 시간 54.5분과 일치하였다. 이것은 땅콩의 AhRS 유전자가 벼의 게놈에서 안정적으로 발현되어 레스베라트롤과 레스베라트롤의 배당체인 피세이드가 정상적으로 생합성 됨을 증명하는 결과이다.

본 발명에 의해서 레스베라트롤 생합성 벼 종자 및 벼 식물체의 제조가 가능해졌으며, 본 발명의 방법에 의한 형질전환 벼 식물체는 항암, 항혈전, 항고지혈증, 항산화 및 심혈관계 질환에 효과적인 레스베라트롤을 함유하고 있기 때문에 건강 기능성 성분이 강화된 벼 식물체를 만들 수 있게 되었다.

본 발명에 의해 제조된 벼 식물체는 유전자변형작물에 대한 안전성 평가 등 상세한 분석을 거쳐 품종으로 보급될 경우 항암, 항혈전, 항고지혈증, 항산화 및 심혈관계 질환 예방 약리작용이 있는 레스베라트롤을 주식인 쌀을 통해 섭취하게 됨으로써 국민건강 증진에 크게 기여할 수 있다.

본 발명은 레스베라트롤을 암호화하는 유전자를 이용하여 자연계에 존재하지 않는 레스베라트롤 생합성 벼를 개발하여 건강식품, 기능성 화장품, 사료 개발에 활용할 수 있다.

<110> Rural Development Administration <120> Rice containing resveratrol <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1172 <212> DNA <213> Arachis hypogaea <400> 1 atggtgtctg tgagtggaat tcgcaaagtt caaagggcag aaggccctgc aactgtattg 60 gcgataggca cagcaaatcc accaaattgt attgatcaga gcacatatgc tgattattat 120 tttagagtaa ctaacagtga acacatgact gatctcaaga agaagtttca gcgcatttgt 180 gagagaacac aaatcaagaa cagacatatg tacttaacag aagagatact gaaagagaat 240 cctaatatgt gtgcatacga ggcaccgtcg ttggatgcaa gggaagatat gatgattagg 300 gaggtaccaa gggttggaaa agaggccgca accaaggcca tcaaagaatg gggacagcca 360 atgtctaaaa tcacacattt gatcttctgc accgccagcg gtgttgcgtt gcctggcgtt 420 gattatgaac tcatcgtact cttaggactc gacccatgcg tcaagaggta catgatgtac 480 caccaaggct gcttcgctgg cggtactgtt cttcgtttgg ctaaggactt ggctgaaaac 540 aacaaggatg ctcgtgttct tatcgtttgt tctgagaata ccgcaatcac tttccgtggt 600 cctagtgaga cagacatgga tagtcttgta ggacaagcat tgtttgcgga tggagctgct 660 gcgattatca ttggttctga tcctgtgcca gaggttgaga agcctatctt tgagattgtt 720 tcgaccgatc aaaaactcgt ccctggcagc catggagcta ttggtggtct ccttcgtgaa 780 gttgggctta cattctatct taacaagagt gttcctgata ttatttcgca aaatatcaac 840 gacgctctta gtaaagcttt tgatccattg ggtatatttg attataactc aatattttgg 900 attgcacacc ctggtggacg tgcaattttg gaccaggttg aacaaaaggt aaacttaaaa 960 ccagaaaaga tgaaagctac tagagatgtg cttagcaatt atggtaacat gtcaagtgca 1020 tgtgtgtttt tcattatgga tttgatgaga aagaaatccc ttaaagaagg actcaaaacc 1080 accggagaag gacttgattg gggtgtactt tttggctttg gtcctggtct caccattgaa 1140 actgttgtgc tccgcagtgt ggccatataa cg 1172 <210> 2 <211> 389 <212> PRT <213> Arachis hypogaea <400> 2 Met Val Ser Val Ser Gly Ile Arg Lys Val Gln Arg Ala Glu Gly Pro 1 5 10 15 Ala Thr Val Leu Ala Ile Gly Thr Ala Asn Pro Pro Asn Cys Ile Asp 20 25 30 Gln Ser Thr Tyr Ala Asp Tyr Tyr Phe Arg Val Thr Asn Ser Glu His 35 40 45 Met Thr Asp Leu Lys Lys Lys Phe Gln Arg Ile Cys Glu Arg Thr Gln 50 55 60 Ile Lys Asn Arg His Met Tyr Leu Thr Glu Glu Ile Leu Lys Glu Asn 65 70 75 80 Pro Asn Met Cys Ala Tyr Glu Ala Pro Ser Leu Asp Ala Arg Glu Asp 85 90 95 Met Met Ile Arg Glu Val Pro Arg Val Gly Lys Glu Ala Ala Thr Lys 100 105 110 Ala Ile Lys Glu Trp Gly Gln Pro Met Ser Lys Ile Thr His Leu Ile 115 120 125 Phe Cys Thr Ala Ser Gly Val Ala Leu Pro Gly Val Asp Tyr Glu Leu 130 135 140 Ile Val Leu Leu Gly Leu Asp Pro Cys Val Lys Arg Tyr Met Met Tyr 145 150 155 160 His Gln Gly Cys Phe Ala Gly Gly Thr Val Leu Arg Leu Ala Lys Asp 165 170 175 Leu Ala Glu Asn Asn Lys Asp Ala Arg Val Leu Ile Val Cys Ser Glu 180 185 190 Asn Thr Ala Ile Thr Phe Arg Gly Pro Ser Glu Thr Asp Met Asp Ser 195 200 205 Leu Val Gly Gln Ala Leu Phe Ala Asp Gly Ala Ala Ala Ile Ile Ile 210 215 220 Gly Ser Asp Pro Val Pro Glu Val Glu Lys Pro Ile Phe Glu Ile Val 225 230 235 240 Ser Thr Asp Gln Lys Leu Val Pro Gly Ser His Gly Ala Ile Gly Gly 245 250 255 Leu Leu Arg Glu Val Gly Leu Thr Phe Tyr Leu Asn Lys Ser Val Pro 260 265 270 Asp Ile Ile Ser Gln Asn Ile Asn Asp Ala Leu Ser Lys Ala Phe Asp 275 280 285 Pro Leu Gly Ile Phe Asp Tyr Asn Ser Ile Phe Trp Ile Ala His Pro 290 295 300 Gly Gly Arg Ala Ile Leu Asp Gln Val Glu Gln Lys Val Asn Leu Lys 305 310 315 320 Pro Glu Lys Met Lys Ala Thr Arg Asp Val Leu Ser Asn Tyr Gly Asn 325 330 335 Met Ser Ser Ala Cys Val Phe Phe Ile Met Asp Leu Met Arg Lys Lys 340 345 350 Ser Leu Lys Glu Gly Leu Lys Thr Thr Gly Glu Gly Leu Asp Trp Gly 355 360 365 Val Leu Phe Gly Phe Gly Pro Gly Leu Thr Ile Glu Thr Val Val Leu 370 375 380 Arg Ser Val Ala Ile 385

Claims

레스베라트롤을 함유하는 쌀.
레스베라트롤을 암호화하는 유전자가 세포내에 도입된 형질전환 벼 종자.
레스베라트롤을 암호화하는 유전자가 세포내에 도입된 형질전환 벼 식물체.
레스베라트롤을 암호화하는 유전자를 세포내에 도입하여 레스베라트롤을 생산하는 재조합 벼 종자의 제조방법.
제2항에 따른 벼 종자를 배양하여 벼 식물체를 제조하는 방법.
레스베라트롤을 암호화하는 유전자가 도입된 벼 형질전환용 재조합벡터.
제6항에 있어서, 레스베라트롤을 암호화하는 유전자는 땅콩 또는 포도로부터 유래된 것인 벼 형질전환용 재조합벡터.