KR20070117294A - 펙틴 메칠에스터라아제 억제단백질을 코딩하는 고추유전자 ＣａＰＭＥＩ１ 및 이를 이용한 식물병저항성 및환경스트레스저항성의 탐색방법 - Google Patents

펙틴 메칠에스터라아제 억제단백질을 코딩하는 고추유전자 ＣａＰＭＥＩ１ 및 이를 이용한 식물병저항성 및환경스트레스저항성의 탐색방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고추식물의 세균병인 고추 세균성 점무늬병균 (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성균과 비병원성균에 감염되었을 경우 특이적으로 유도되는 신규 저항성 유전자인 펙틴 메칠에스터라아제 억제단백질을 코딩하는 CaPMEI1 유전자, 상기 유전자를 이용한 병저항성 및 환경스트레스 저항성 탐색방법 및 저항성 형질전환 식물체 제작에 관한 것이다. 상기한 본 발명에 의하면, 식물체 병원균의 방어반응의 표지 및 환경스트레스 내성 식물의 분자육종을 위한 유전재료를 제공할 수 있고, 식물병 저항성 등의 탐색을 촉진시킬 수 있다.
고추, 식물병, 저항성, 세균성 점무늬병, 펙틴 메칠에스터라아제

Description

펙틴 메칠에스터라아제 억제단백질을 코딩하는 고추 유전자 ＣａＰＭＥＩ１ 및 이를 이용한 식물병저항성 및 환경스트레스저항성의 탐색방법{Pepper CaPMEI1 Gene coding a pectin methylesterase inhibitor protein and screening method of plant disease and environmental stress resistance}
도 1은 고추 한별품종 ( Capsicum annuum L. cv. Hanbyul)으로부터 클로닝한 본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 도면이고,
도 2는 고추 한별품종의 각 기관에서 본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자의 발현 결과를 나타낸 도면이고,
도 3은 고추 한별품종에 병원성 균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 고추 세균성 점무늬병균 (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하였을 때 건전한 잎과 접종되지 않은 잎에서의 본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자 발현 유도 결과를 나타낸 도면이고,
도 4는 고추 한별품종에 살리실산을 처리한 후 시간별로 본 발명에 의한 CaPMEI1유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이고,
도 5는 고추 한별품종에 에틸렌을 처리한 후 시간별로 본 발명에 의한 CaPMEI1유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이고,
도 6은 고추 한별품종에 메칠 자스모네이트를 처리한 후 시간별로 본 발명에 의한 CaPMEI1유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이고,
도 7은 고추 한별품종에 앱시스산을 처리한 후 시간별로 본 발명에 의한 CaPMEI1유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이고,
도 8은 고추 한별품종에 상처 스트레스를 처리한 후 시간별로 본 발명에 의한 CaPMEI1유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이고,
도 9는 고추 한별품종에 저온 스트레스를 처리한 후 시간별로 본 발명에 의한 CaPMEI1유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이고,
도 10은 고추 한별품종에 건조 스트레스를 처리한 후 시간별로 본 발명에 의한 CaPMEI1유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이고,
도 11은 고추 한별품종에 활성산소를 처리한 후 시간별로 본 발명에 의한 CaPMEI1유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이고,
도 12는 본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pET32a::CaPMEI1의 지도 (Vector map)이고,
도 13은 본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자를 발현시킨 E. coli 단백질에서 CaPMEI1 단백질을 순화시킨 결과를 나타낸 그림이고,
도 14는 본 발명에 의한 CaPMEI1 단백질의 펙틴 메칠에스터라아제 억제활성을 나타낸 그래프이고,
도 15는 시들음병균, 검은무늬병균, 잿빛곰팡이병균에 대한 본 발명에 의한 CaPMEI1 단백질의 항균활성을 나타낸 사진이고,
도 16은 본 발명에 의한 CaPMEI1 단백질을 처리한 시들음병균의 포자발아가 억제되는 것을 나타낸 사진이고,
도 17은 본 발명에 의한 CaPMEI1 단백질을 처리한 시들음병균의 포자 발아율과 균사생장률이 억제되는 것을 나타낸 그래프이고,
도 18은 본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pBIN35S::CaPMEI1::GFP의 지도 (vector map)이고,
도 19는 본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자가 도입된 형질전환 애기장대 식물에서 CaPMEI1 유전자가 과다발현되는 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,
도 20은 본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물에서 세균성 흑반병원균인 수도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000 (Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000) 균주에 대한 병저항성이 나타난 식물체의 사진이고,
도 21은 본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물에서 세균성 흑반병원균인 수도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000 균주에 대한 병저항성 검정 결과를 나타낸 그래프이고,
도 22는 본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물 종자의 200mM(밀리 몰)과 600mM 마니톨에 대한 내성 검정 결과를 나타낸 그래프이고,
도 23은 본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물의 유묘 뿌리생장의 마니톨에 대한 내성 검정 결과를 나타낸 그래프이고,
도 24는 본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물과 비형질전환 대조 식물들을 14일간 물을 주지 않고 키운 뒤, 건조에 대한 생존율을 검증한 결과를 나타낸 사진이고,
도 25는 본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물과 과다발현 시키지 않은 대조 식물들 간에 증산율의 차이를 나타낸 그래프이고,
도 26은 5μＭ(마이크로몰)농도와 10μＭ농도의 메틸비올로젠(methyl violgen)을 함유한 엠에스(MS) 배지에서 본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자로 형질전환된 식물체의 발아율이 증가하는 것을 나타낸 그래프이고,
도 27은 본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물과 과다발현 시키지 않은 대조 식물들의 잎에 메틸비올로젠(methyl violgen)을 처리하고 클로로필의 함량을 측정함으로써, 내성을 정량한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 28은 본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물의 유묘 생장의 메틸비올로젠(methyl violgen)에 대한 내성 검정 결과를 나타낸 사진이고,
도 29는 28도에서 나타난 결과를 생체중량을 측정함으로서 내성을 정량화한 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 펙틴 메칠에스터라아제 억제단백질을 코딩하는 고추 유전자 CaPMEI1, 이를 이용한 식물병저항성 및 환경스트레스저항성의 탐색방법 및 병원균 및 환경스트레스 저항성 형질전환 식물체 제작에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 고추 세균성 점무늬병에 대해 저항성을 가진 것으로 알려진 고추 한별 품종(Capsicum annuum L. cv. Hanbyul)으로부터 신규 저항성 관련 유전자인 CaPMEI1 유전자를 분리하여 해독(Sequencing)하고, 여기에서 얻어진 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 제공함으로써, 생물적/화학적/물리적 저항성 유도 처리 시 저항성 관련 유전자 CaPMEI1 발현 여부를 탐색하는 저항성 탐색방법을 제공하며, 이를 이용한 재조합 단백질의 생산 및 병원균 및 환경스트레스에 대해 저항성을 갖는 형질전환 식물체 제작에 관한 것이다.
담배, 토마토와 함께 대표적인 가지과 식물인 고추는 우리나라에서 오래전부터 향신료 또는 양념으로 사용되어 온 대표적인 작물로서, 그에 대한 병으로는 바이러스병, 세균병, 진균병 등이 고루 다양하게 보고되어 있는데, 그중 치명적인 것으로는 난균류에 의한 역병과 진균에 의한 탄저병 및 세균에 의한 세균성 점무늬병 등을 들 수 있다.
이중 고추 세균성 점무늬병은 고추의 잎, 줄기, 과실에 반점을 형성하여 낙엽을 유발하고 수확량을 감소시키는 병으로서, 통상 더뎅이병, 반점세균병 등으로 불리우며, 고추가 우리나라의 재배작물에서 차지하는 비중을 볼 때 그 피해는 심각한 수준이라고 할 수 있다.
이러한 고추 세균성 점무늬병을 방제하기 위해 지금까지는 농약을 이용한 화학적 방제법이 주로 사용되어 왔는데, 그 독성으로 인하여 병원균뿐만 아니라 주변 생태계의 생물까지도 대량 살상하여 생태계를 파괴시키고 토양과 수질을 오염시키는 폐해가 있어 왔다.
따라서 앞으로는, 식물이 처해 있는 환경 및 조건을 고려하여 물리적/생물학적 방제수단을 적절히 혼용함으로써 농약의 사용을 가능한 줄이는 방법을 사용하는 것이 바람직하다고 할 수 있으며, 더욱이 병에 대해 저항성을 가지고 있는 저항성 품종의 개량 및 육종 등을 통해 병 발생 자체를 억제하는 방법을 찾는 것이 좋다고 할 수 있다.
사실, 그동안 농약을 사용하지 않고 병해충에 의한 피해를 감소시키기 위한 노력의 일환으로 고추를 비롯한 다양한 작물 및 병원균을 대상으로 병 저항성 작물의 육성 프로그램들이 꾸준히 진행되어 왔으며, 병 저항성에 대한 이해 및 이의 실제적 응용을 위해 병 저항성 식물에서의 저항성 기작에 대한 연구가 고추를 비롯한 여러 가지 작물 및 모델식물을 대상으로 실시되어 왔다.
일단 식물 병에 감염되면, 기주식물은 여러 가지 세포내 대사 시스템을 작동시켜 방어기작을 시작하는데, 이러한 방어기작에 의해 병원균 감염 초기에 기주식물과 식물병원균간의 반응이 친화적 반응과 불친화적 반응으로 나뉘어 결정되고, 이에 따라 병의 진전을 제한시킬 수 있는지의 여부가 결정되는 것이다.
불친화적 반응에서, 감염된 식물은 자체의 인식작용에 의해 병원균의 침입을 인지하고, 이에 대하여 감염부위의 세포에 국부적 세포 죽음과 같은 과민성 반 응(hypersensitive reaction), 캘러스(callose)의 축적, 리그닌 (lignin)화에 의한 세포벽의 비후화 등의 반응을 나타내며, 피토알렉신(phytoalexin) 등 여러 종류의 항균성 물질을 생성하고, 소위 병생성 관련 단백질[pathogenesis related (PR) protein]이라 불리는 방어단백질을 생성하는 것으로 알려져 있다.
이러한 방어 기작들은 병원균이 침입하는 경우뿐만 아니라, 에틸렌이나 메틸자스모네이트 등 인위적인 화학적 자극에 의해서도 나타나며, 물리적 상처나 염도, 온도 등의 환경적 스트레스에 의해서도 나타난다고 보고되고 있다.
이렇게 인위적인 생물학적/물리적/환경적 스트레스를 줌으로써 유도되는 저항성을 일반적으로 유도저항성이라고 하는데, 이러한 저항성 유도 반응은 식물이 병원체에 대해 방어할 수 있는 능력에서 중요한 역할을 하는 신호전달경로로써 평가된다.
이것은, 이와 같은 유도저항성이 신호전달에 대한 모형으로서 흥미가 있으며 실용적인 가치가 있을 뿐만 아니라, 저항성을 일으키는 생화학적 변화를 이해함으로써, 병 저항성이 증진되는 유전공학적 식물을 개발하거나 식물의 저항성 유전기작을 촉진하도록 작동하는 식물보호 화학물질을 개발하는 데에 이용될 수 있기 때문이다.
근래, 이러한 유도저항성 연구는 유전공학적 기술의 개입에 의해 훨씬 더 그 발전 속도가 빨라졌는데, 종래에는 저항성 유도 처리를 한 후 저항성 발현 여부를 확인하기 위해 식물을 재배하고 병을 접종한 후 저항성이 나타나는지의 여부를 확인해야 했던 반면, 지금은 유도하고자 하는 저항성 관련 단백질을 코딩하는 유전자 를 밝혀내고 이를 이용하여 실험실 수준에서 저항성 발현 여부를 확인할 수 있게 됨으로써, 포장(Field)에서의 작물재배, 병 접종, 병반 출현 여부 확인 등의 절차를 생략할 수 있게 되었기 때문이다.
이것은 전체적인 저항성 유도 시험의 주기를 단축함으로써 종래에 비해 더 짧은 시간 내에 더 많은 시험을 할 수 있게 되었음을 의미하며, 결국 더 우수한 저항성 품종을 개발할 수 있게 되었음을 의미한다.
그러나 이것은 유도하고자 하는 유전자 서열이 밝혀지고 이에 따라 해당 유전자의 클론이 확보되어 있다는 전제 하에 가능한 것으로서, 이러한 의미에서, 식물 병에 저항성을 나타내는 다양한 병생성 관련 단백질(PR protein)의 유전자 정보를 축적함으로써, 이를 이용한 식물병 저항성 탐색을 촉진하고 나아가 식물병 저항성 품종의 개발을 촉진시키는 것은 시급한 당면 과제라고 할 수 있다.
본 발명은 이와 같은 종래기술 상의 과제를 해결하기 위한 것으로서, 그 목적은 고추 세균성 점무늬병(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)에 대한 방어반응에 관여하는 것으로서 식물병저항성 관련 유전자의 하나인 CaPMEI1 단백질을 코딩하는 CaPMEI1 유전자를 분리하여 해독함으로써 그 서열 정보 및 그에 따른 아미노산 서열 정보를 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 상기 CaPMEI1 유전자를 이용하여 고추 세균성 점무늬병 등 식물병 저항성 및 환경스트레스 저항성 존재 여부를 탐색하는 저항성 탐색방법을 제공하고자 하는 것이다. 더 나아가, 상기 유전자를 이용하여 식물병 또는 환경스 트레스 저항성 형질전환 식물체를 제작하는 데 그 목적이 있다.
본 발명의 상기 목적은, 고추 세균성 점무늬병에 대해 저항성을 가진 것으로 알려진 고추 한별 품종(Capsicum annuum cv. Hanbyul)으로부터 mRNA를 분리한 다음 cDNA 라이브러리를 제조한 후 이를 스크린하여 신규 저항성 관련 유전자 CaPMEI1의 유전자를 선발한 후 그 염기서열을 결정하고, 고추에 병원균 또는 화학물질을 접종 또는 처리하여 상기 CaPMEI1 유전자의 발현 여부를 조사함으로써 달성하였다.
따라서 본 발명은, 고추 한별 품종(Capsicum annuum cv. Hanbyul)으로부터 분리한 서열번호 1의 염기서열을 갖는 신규 식물병 저항성 관련 단백질 유전자 CaPMEI1 및 상기 유전자에 의해 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 제공한다.
상기 단백질은 식물 병원균이 식물을 감염시키는 데 이용하는 주요한 효소인 펙틴 메칠에스터라아제를 억제하는 억제단백질로서, 식물병원균에 대해 항균활성을 갖는다.
또한 본 발명은 상기 유전자를 이용하여 제조한 재조합 벡터 및 형질전환 식물체를 제공한다.
나아가 본 발명은 병원균, 화학물질 및 환경스트레스 중 어느 하나를 접종 또는 처리한 고추 식물체로부터 RNA를 분리하여 전기영동시키고 나이론막(Hybond N+)으로 전이시킨 후, 32P를 처리한 제1항 기재의 CaPMEI1 유전자 프로브와 반응시 켜 CaPMEI1 유전자의 차별적 발현을 확인함을 포함하여 구성되는, 식물체의 병저항성 및 환경스트레스 저항성 탐색방법을 제공한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구성을 상세하게 설명하면 다음과 같다.
먼저, 본 발명은 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 비병원성균주 접종에 대해 저항성 반응인 과민성 반응을 나타내는 한별고추 품종으로부터 mRNA를 분리하여 cDNA 라이브러리를 제작하고, 비병원성 균주를 접종한 고추식물의 잎과 접종하지 않은 건전한 고추식물에서 얻은 총 mRNA를 디옥시제닌(digoxygenin)으로 표지하여 프로브(Probe)를 만들고, 이 cDNA와 프로브를 이용 디퍼런셜 하이브리다이제이션(differential hybridization)을 수행하여 병저항성에 관련될 것으로 추정되는 유전자를 선발하여 클론을 수득하고, 이 클론 중 CaPMEI1 유전자로 확인된 유전자의 염기서열을 해독(Sequencing)함으로써, CaPMEI1으로 명명하고 서열번호 1을 부여하였다(도 1 참조). 또한 본 발명은 본 발명에 의한 상기 CaPMEI1 유전자의 염기서열에 의해 코딩되는 아미노산서열(서열번호 2)을 제공한다(도 1 참조).
고추 한별 품종(Capsicum annuum cv. Hanbyul)으로부터 분리된 CaPMEI1 유전자는 고추 세균성 점무늬병에 대한 방어기작을 가지는 병생성 관련 단백질(PR protein)의 일종인 CaPMEI1 단백질을 코딩하는 유전자로써, 고추 식물에서 세균성 점무늬병에 대한 저항성 반응 동안 특이적으로 그 발현량이 급격히 증가되어 유지되는 것을 관찰할 수 있었다(도 3 참조).
본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자가 다양한 식물병원균, 화학물질 또는 환경스트레스에 의해 차별적으로 유도 발현되는 것을 실험을 통해 확인하였다(도 3 내지 도 11 참조). 따라서 본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자는 식물체의 병저항성 및 환경스트레스 저항성 탐색방법에 이용할 수 있다.
보다 구체적으로는 본 발명에 의한 식물체 병저항성 및 환경스트레스 탐색방법은 병원균, 화학물질 또는 환경스트레스 등을 접종 또는 처리한 식물체로부터 RNA를 분리하고 전기영동시키고 나일론막으로 전이시킨 후, 32P를 처리한 상기 CaPMEI1 유전자 프로브와 반응시켜 CaPMEI1 유전자의 차별적 발현을 확인함을 포함하여 구성된다.
한편, 본 발명에 의한 CaPMEI1 단백질은 펙틴 메칠에스터라아제 억제단백질인 것이 확인되었다(도 14 참조). 펙틴 메칠에스터라아제는 식물 병원균이 식물을 감염시키는 데 이용하는 주요한 효소로써 이에 상응하는 항균활성을 가지는 펙틴 메칠에스터라아제 억제 단백질은 거의 보고 되어있지 않다. 본 발명에 의한 CaPMEI1 단백질의 항균활성을 실험을 통해 확인하였다(도 15 내지 도 17 참조).
또한, 본 발명은 상기와 같이 염기서열이 제공된 CaPMEI1 유전자를 이용하여 재조합 벡터를 제조하여 식물체를 형질전환시켜, 병방어반응 및 환경스트레스 내성 증가를 통해 저항성 분자 육종의 재료를 제공할 수 있다.
보다 구체적으로는 본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자를 아그로박테리움을 이용하여 애기장대 식물에 전이시켜 CaPMEI1 과다발현 형질전환식물을 제조하여 식물병 저항성 및 활성산소, 건조 등의 환경스트레스 저항성 생성여부를 확인하였다(도 19 내지 도 29 참조).
이하, 실시예들을 통해 본 발명을 더 구체적으로 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자의 염기/아미노산 서열 결정
고추 세균성 점무늬병에 대한 저항성에 관여하는 단백질 중 하나인 CaPMEI1 단백질 코딩 유전자 염기서열 및 그로부터 추론되는 아미노산 서열을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.
고추 한별품종(Capsicum annuum cv. Hanbyul)에 고추 세균성 점무늬병의 비병원성균인 BV5-4a(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria strain BV5-4a)를 접종하고 18시간 동안 습실 처리한 후 저항성 병반인 과민성반응이 나타난 식물체를 습실에서 꺼내어 잎을 수거하였다.
다음에, 수거된 잎 표본으로부터 mRNA를 추출하여 역전사한 후 이를 PCR (Polymerase Chain Reaction) 증폭함으로써 cDNA 라이브러리를 제작하였다.
다음에, 이렇게 제작된 cDNA 라이브러리로부터 개개의 cDNA 클론을 제조하여 나이론막에 일정하게 흡착시킨 후, 각각 고추 세균성 점무늬병균의 비병원성 균주를 접종한 고추식물의 잎과 접종하지 않은 건전한 고추식물의 잎에서 추출한 총 mRNA를 디옥시제닌(digoxygenin)으로 표지하여 프로브를 만든 다음, 디퍼런셜 하이 브리다이제이션(differential hybridization)을 수행하였다.
하이브리다이제이션 결과 비병원성 균주로 접종된 식물체의 mRNA 프로브에 대해서만 집중적으로 증폭되어 나타난 유전자를 병저항성에 관련된 유전자로 추정하고 클론을 수득하였다.
수득된 클론들을 해독(Sequencing)한 후, 블라스트 프로그램을 이용하여 그 5'-말단 서열을 GenBank에 등록된 유전자 데이터베이스와 비교함으로써 펙틴 메칠에스터라아제 억제 단백질 도메인의 존재를 확인하고 CaPMEI1 유전자로 명명하였다.
이 유전자에서 유추한 아미노산 서열을 담배, 애기장대, 라디아타 소나무에서 발견된 DC1.2 단백질, 후숙 관련 단백질, 전화효소(인베르타아제)의 아미노산 서열과 비교한 결과, 각각 80%, 50%, 36%의 상동성을 나타냄으로써 신규한 것임을 알 수 있었다.
확인된 CaPMEI1 유전자의 염기서열과 그로부터 추론된 아미노산 서열을 도 1에 나타내고, 각각 염기서열1 및 염기서열 2로 표시하여 서열목록으로 제출하였다.
[실시예 2] 세균성 병원균에 의한 고추식물에서의 CaPMEI1 유전자의 유도 발현
[실험예 1]
먼저 건전한 식물체에서 CaPMEI1 유전자의 발현을 살펴보기 위해 4엽기 고추식물체의 건전한 기관 (잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 푸른열매, 붉은열매)으로부터 RNA를 분리하고, 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔 상에서 전기영동한 후 나이론막 (Hybond N+)으로 전이시켰다.
다음에, 실시예 1에서 수득된 CaPMEI1 유전자를 제한효소 EcoRI 및 XhoI으로 각각 절단하고 삽입 DNA만을 회수하여 32P로 표지한 후, 이를 반응액[0.25 M 인산완충액, 7% SDS, 1 mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염(Dextran Sulfate)]에서 65℃로 16-24시간 동안 배양하여 하이브리다이제이션 (hybridization)을 실시하였다.
이렇게 32P로 표지된 상기 DNA 프로브는 나이론막에 붙어있는 mRNA에 붙게 되며 이 나이론막 위에 X-ray 필름을 얹게 되면 32P로 표지된 DNA가 X-ray 필름을 감광시키므로, 이것으로 발현 여부를 알아볼 수 있게 하였다.
상기 노던블러팅 수행시 리보솜 RNA의 양을 모니터링 함으로써 동일량의 RNA 시료가 로딩되었음을 확인하였다.
이상의 실험결과를 도 2에 나타내었으며 CaPMEI1 유전자는 줄기에서 강한 발현과 뿌리 꽃에서 약한 발현을 보일 뿐, 건전한 기관에서 발현을 살펴볼 수 없었다.
[실험예 2]
고추 세균성 점무늬병균 중 식물체와 친화적 반응을 나타내는 병원성 균주 Ds1과 불친화적 반응을 나타내는 비병원성 균주 Bv5-4a를 배양한 후, 5 X 108 cfu/㎖의 농도로 4엽기 고추식물체 1, 2엽의 뒷면에 주사기를 이용하여 인필트레이 션(Infiltration)하여 접종하고, 28℃, 100% 상대습도 조건에서 18시간 동안 습실처리하였다.
접종 0.5, 1, 2, 6, 12, 18, 24 시간 후에 각각 1, 2엽을 샘플링하여 RNA를 분리하고, 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔 상에서 전기영동한 후 나이론막 (Hybond N+)으로 전이시켰다.
다음에, 실시예 1에서 수득된 CaPMEI1 유전자를 제한효소 EcoRI 및 XhoI으로 각각 절단하고 삽입 DNA만을 회수하여 32P로 표지한 후, 이를 반응액[0.25M 인산완충액, 7% SDS, 1mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염(Dextran Sulfate)]에서 65℃로 16-24시간 동안 배양하여 하이브리다이제이션 (hybridization)을 실시하였다.
이렇게 32P로 표지된 상기 DNA 프로브는 나이론막에 붙어있는 mRNA에 붙게 되며 이 나이론막 위에 X-ray 필름을 얹게 되면 32P로 표지된 DNA가 X-ray 필름을 감광시키므로, 이것으로 발현 여부를 알아볼 수 있게 하였다.
상기 노던블러팅 수행시 리보솜 RNA의 양을 모니터링 함으로써 동일량의 RNA 시료가 로딩되었음을 확인하였다.
이와 같이 고추 세균성 점무늬병균의 병원성균주 접종 후 나타나는 친화적 반응과 비병원성균주 접종 후 나타나는 불친화적 반응에서 CaPMEI1 유전자의 발현 양상을 도 3에 나타내었다. 도 3의 숫자는 접종한 후 고춧잎 채취 시까지의 경과시간을 나타낸다.
이상과 같은 시험 결과, 고추 세균성 점무늬병에 대한 고추식물의 저항성 반 응은 병원성 균주와 비병원성 균주 모두 1시간째부터 18시간까지 발현이 서서히 증가했다가 24시간째에는 감소하였다.
[실시예 3] 화학적 유도체에 의한 본 발명의 CaPMEI1 유전자 유도 발현
본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자가 통상 저항성 유도에 사용되는 화학적 유도체에 의해 유도될 수 있는지를 알아보고 그 구체적 유도방법을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.
[실험예 1]
먼저, CaPMEI1 유전자의 발현 유도에 유용한 유도체를 탐색하기 위하여, 식물병 저항성 발현의 유도에 관여한다고 알려진 화학물질들 중 살리실산, 에틸렌, 메틸 자스모네이트, 앱시스산(엽산)을 사용하여 저항성 유도 시험을 실시하였다.
6엽기 고추식물 잎에 농도 5mM의 살리실산, 100μM의 메틸 자스모네이트, 100 μM의 엽산을 분무기로 고추잎의 앞뒷면에 뿌려 처리하였고, 이중 메틸 자스모네이트를 처리한 식물체는 비닐백으로 밀봉하였다. 에틸렌은 농도 5μl/L로 하여 기체상태로 식물체가 있는 밀폐된 유리 용기에 주입하는 방법으로 처리하였다.
처리 1, 2, 6, 12, 18, 24 시간 후 각각의 식물체에서 잎을 수거하였고, 대조구로 무처리한 식물체 잎을 2, 18 시간째에 함께 수거한 후, 각각의 샘플에서 RNA를 추출하였고 추출된 RNA를 이용하여 다음과 같이 노던블러팅을 수행하였다.
먼저, 추출된 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔 상에서 전기영동한 후 나이론막 (Hybond N+)으로 전이시켰다.
다음에, 실시예 1에서 수득된 CaPMEI1 유전자를 제한효소 EcoRI 및 XhoI으로 각각 절단하고 삽입 DNA만을 회수하여 32P로 표지한 후, 이를 반응액 [0.25M 인산완충액, 7% SDS, 1mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염 (Dextran Sulfate)]에 첨가하고 65℃에서 16-24시간 동안 배양하여 하이브리다이제이션 (hybridization)을 실시하였다.
이때 32P로 표지된 상기 DNA 프로브는 나이론막에 붙어있는 상보적 mRNA에 붙게 되며 이 나이론막 위에 X-ray 필름을 얹게 되면 32P로 표지된 DNA가 X-ray 필름을 감광시키므로 이것으로 발현 여부를 알아볼 수 있다.
시험 결과, 도 3 내지 도 7에 나타난 바와 같이 상기 처리된 모든 물질의 경우에서 CaPMEI1 유전자가 강하게 유도 발현되었으나, 앱시스산 처리에 대해서는 1시간에만 발현이 강하게 유도되고 그 이후에는 사라졌다.
[실시예 4] 환경적 스트레스에 의한 본 발명의 CaPMEI1 유전자 유도 발현
본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자가 환경적 스트레스에 의해 유도될 수 있는지를 알아보고 그 구체적 유도방법을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.
각각의 시험에서 노던블러팅 수행시 리보솜 RNA의 양을 모니터링 함으로써 동일량의 RNA 시료가 로딩되었음을 확인하였으며, 대조구로서 어떤 스트레스도 처리하지 않은 건전잎을 사용하였다.
[실험예 1]
본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자가 상처 스트레스에 의해 유도될 수 있는지를 알아보고 그 구체적 유도방법을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.
고추식물에 상처 스트레스를 처리하기 위해 식물체의 잎을 바늘로 찔러 잎 전체에 걸쳐 상처를 낸 후 각각 1, 2, 6, 12, 18, 24시간이 지나 잎을 수거하였다.
각각의 샘플에서 RNA를 추출한 후, 상기 실시예 3의 실험예 1에서와 동일한 방법으로 노던블러팅을 수행함으로써, 상처 스트레스 처리 후 시간경과에 따른 CaPMEI1 의 발현양상을 알아보았으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
시험 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, CaPMEI1 유전자는 처리 후 빠른 시간 내에 발현되기 시작하여 6시간까지 유지되었다.
[실험예 2]
본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자가 저온 스트레스에 의해 유도될 수 있는지를 알아보고 그 구체적 유도방법을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.
저온처리를 위해 고추 식물체를 4 ℃로 유지되는 냉장실에 보관하면서 각각 1, 2, 6, 12, 18, 24시간째에 잎을 수거하였다.
각각의 샘플에서 RNA를 추출한 후, 상기 실시예 3의 실험예 1에서와 동일한 방법으로 노던블러팅을 수행함으로써, 저온 스트레스 처리 후 시간경과에 따른 CaPMEI1 의 발현양상을 알아보았으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
시험 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, CaMEI1 유전자는 잎에서 1시간대에 처음으로 발현하여 20시간까지 유지되는 경향을 나타내었다.
[실험예 3]
본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자가 건조 스트레스에 의해 유도될 수 있는지를 알아보고 그 구체적 유도방법을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.
건조 처리 후 시간별 CaPMEI1 저항성 유도효과를 알아보기 위하여, 고추식물체의 뿌리에서 흙을 제거하고, 각각 1, 2, 6, 12, 18, 24시간째에 잎을 수거하였다.
각각의 샘플에서 RNA를 추출한 후, 상기 실시예 3의 실험예 1에서와 동일한 방법으로 노던블러팅을 수행함으로써, 건조 스트레스 처리 후 CaPMEI1의 시간별 발현양상을 알아보았으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
시험 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, CaPMEI1 유전자는 잎에서 1시간대에강하게 발현되었다.
[실험예 4]
본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자가 과산화수소에 의해 유도될 수 있는지를 알아보고 그 구체적 유도방법을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.
과산화수소의 시간별 CaPMEI1 저항성 유도효과를 알아보기 위하여, 고추식물체의 잎에 10mM의 과산화수소를 스프레이 방법으로 처리하고, 각각 1, 2, 6, 12, 18, 24시간째에 잎을 수거하였다.
각각의 샘플에서 RNA를 추출한 후, 상기 실시예 3의 실험예 1에서와 동일한 방법으로 노던블러팅을 수행함으로써, 과산화수소를 처리한 후 CaPMEI1 의 시간별, 농도별 발현양상을 알아보았으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
시험 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, CaPMEI1 유전자는 처리 후 1시간 후 부터 축적되기 6시간째에 가장 강하게 발현되어 18시간까지 유지되었다.
[실시예 5] 본 발명에 의한 CaPMEI1 단백질 생산과 항균활성 검정
대장균에서의 CaPMEI1 유전자 과다발현 후 발현산물인 CaPMEI1 단백질의 기능을 알아보기 위하여, 실시예 1에서 수득한 CaPMEI1 유전자를 Novagen에서 제공하는 pET32a 벡터에 도입시켜 재조합벡터 pET32a::CaPMEI1 을 제조하고 그 지도를 도 12에 나타내었다.
이렇게 제조한 재조합벡터 pET32a::CaPMEI1를 대장균 (Escherichia coli strain BL21)에 형질전환시키고 이 재조합벡터가 들어가 있는 대장균을 배양하여 얻어진 단백질 중 Ni-NTA 레진을 이용하여 CaPMEI1 단백질만 정제한 후 다음과 같은 실험을 수행하였다.
[실험예 1]
pET32a 벡터(vector)에 태깅(tagging) 되어 있는 티오레독신 단백질이 함께 발현되므로 이를 제거하기 위하여 1 unit 의 엔테로키나제(enterokinase)로 상온에서 16시간 반응시킨다. 순화하기 전 단계, 순화한 후 그리고 티오레독신을 처리한 후의 CaPMEI1 단백질을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 법을 이용하여 확인하였다. 이 재조합 단백질을 1xSDS 샘플버퍼(sample buffer)에 녹이고 12% SDS-폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)에 전기 영동하였다. 단백질의 정확한 크기를 알기 위하여 단백질 마커를 이용하여 검정하였고 그 그림을 도 13에 나타내었다.
[실험예 2]
CaPMEI1 단백질이 펙틴 메칠에스터라아제 (pectin methylesterase) 억제 활성을 가지고 있는지를 확인하기 위하여 실제 펙틴 메칠에스터라아제와 반응시켰다. 산도 7.8, 25도에서 반응 후 생성물인 NADH의 양을 나타내는 표준곡선에 의하여 정량화 되었고 이 결과를 도 14에 나타내었다.
순화된 재조합 단백질을 첨가한 반응에서 펙틴 메칠에스터라아제만을 처리한 대조구보다 생성된 NADH 함량이 가장 낮은 것을 볼 수 있었고 이 반응은 12분 내에 측정이 가능하였다. 이 실험을 통해 도 14에 나타난 바와 같이 본 발명에 의한 CaPMEI1 단백질이 펙틴 메칠에스터라아제 억제 효과를 가지는 것으로 확인할 수 있었다.
[실험예 3]
CaPMEI1 단백질의 항균활성 여부를 알아보기 위하여 식물 주요 병원균인 시들음병균(Fusarium oxysporum f. sp . matthiolae ), 검은 무늬병균(Alternaria brassicicola), 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea)에 CaPMEI1 단백질을 농도별로 처리해 보았다. 50 ㎍의 농도에서 처리한 시험된 병원균에 대하여 항균활성을 보였고 이 사진은 도 15에 나타내었다. 특히 시들음병균의 경우 CaPMEI1 단백질을 처리했을 때 포자발아율과 균사생장율이 감소되는 것을 관찰하였으며 이 결과를 보여주는 사진과 그래프는 각각 도 16 및 도 17에 나타내었다.
[실시예 6] 본 발명의 CaPMEI1 유전자를 이용한 형질전환 식물체의 제조 및 CaPMEI1 유전자 과다발현에 의한 식물체의 병 저항성 유도
식물체에서의 CaPMEI1 유전자 과다발현시 다른 병발생 관련 유전자들의 유도 여부, 세균성 병에 대한 저항성의 증가 여부 및 환경스트레스에 대한 내성의 증가 여부 등을 알아보기 위하여, 실시예 1에서 수득한 CaPMEI1 유전자를 pBIN35S::GFP 벡터에 도입시켜 재조합벡터 pBIN35S::CaPMEI1::GFP을 제조하고 그 지도를 도 18에 나타내었다.
이렇게 제조한 재조합벡터 pBIN35S::CaPMEI1::GFP를 아그로박테리움 튜메파이엔스(Agrobacterium tumefaciense strain EHA105)에 전기천공법(electroporation)을 통하여 도입하고 다시 재조합벡터가 들어가 있는 EHA105균주를 꽃침지(floral dipping) 방법을 이용하여 애기장대에 도입함으로써 CaPMEI1 유전자를 과다발현시키고 하기와 같은 시험을 수행하였다.
[실험예 1]
상기와 같이 제작된 형질전환 식물체에서 CaPMEI1 유전자의 발현 정도를 검정하기 위하여 실시예 3의 실험예 1에서와 같은 방법으로 노던블러팅을 수행하였고 그 결과 CaPMEI1 유전자를 많이 발현시키는 세 개의 형질전환식물체를 선발하였다(도 19 참조).
[실험예 2]
CaPMEI1 유전자가 과다발현된 식물체에서 세균성 병에 대한 저항성이 증가하였는지의 여부를 알아보기 위하여 상기 CaPMEI1 유전자가 과다발현된 애기장대와 대조구로서의 야생형 애기장대 식물체에 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000 균주를 접종하고 접종일과 2일, 4일 후에 잎을 수거하여 잎 면적당 세균수를 측정 하여 그 결과를 도 21에 나타내었다. 이때에 식물 병반 사진은 도 20에 나타내었다. 여기서 #6, #8, #9는 시험에 사용된 형질전환 식물의 계통 번호를 나타낸다.
시험 결과, 도 21에 나타난 바와 같이 0, 2, 4일 후 모든 형질전환계통 식물이 야생형에 비해 세균 생장을 억제하여 세균성 병에 대한 병저항성을 가지고 있는 것으로 나타났다.
[실시예 7] 본 발명의 CaPMEI1 유전자 과다발현에 의한 식물체의 환경스트레스 내성 유도
본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자가 과다발현된 식물체에서 환경스트레스에 대한 내성이 증가하였는지 여부를 알아보기 위하여, CaPMEI1 유전자가 과다발현된 식물체를 마니톨 처리 등의 건조 스트레스를 처리하여 얻어진 결과를 도 22 내지 도 25에서 나타내었고 메틸비올로젠(산화 스트레스)을 처리하여 내성을 보임을 나타내는 결과를 도 26 내지 도 29에 보여주고 있다.
시험 결과, 본 발명의 CaPMEI1 유전자가 과다발현된 식물체는 건조스트레스와 메틸비올로젠(산화 스트레스) 처리에 대하여 내성을 가지는 것으로 나타났다.
상술한 바와 같이, 본 발명이 완성됨으로써, 고추 세균성 점무늬병(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)에 대한 방어반응에 관여하는 것으로서 식물병저항성 관련 유전자의 하나인 CaPMEI1 단백질을 코딩하는 CaPMEI1 유전자를 분리하여 해독함으로써 그 염기서열 정보 및 그에 따른 아미노산 서열 정보를 제공함과 동시에, CaPMEI1 유전자의 차별적 발현을 확인하는 것으로 구성되는 고추 세균성 점무늬병 등 식물병 저항성 및 환경스트레스 저항성 탐색방법을 제공할 할 수 있게 되었다. 나아가, 본 발명에 의한 CaPMEI1 유전자를 이용하여 식물병 저항성 및 환경스트레스 저항성 식물 육종 및 형질전환 식물체 제작에 기여할 수 있게 된 것이다.
나아가, 본 발명에 의한 CaPMEI1 단백질을 분리하여 기능 분석함으로써 그 분석방법 및 항균활성 탐색방법을 포함하여 식물체의 병저항성 메카니즘을 탐색하는 방법이 제공될 수 있게 되었다.
따라서 본 발명은 저항성 품종 개발을 촉진시킬 수 있는 효과가 있으므로 식물육종 산업상 매우 유용한 발명이라 할 수 있다.
<110> Korea University Industry and Academy Cooperation Foundation <120> Pepper CaPMEI1 Gene coding a pectin methylesterase inhibitor protein and screening method of plant disease and environmental stress resistance <130> P11-060525-01 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 834 <212> DNA <213> Capsicum annuum L. cv. Hanbyul <400> 1 gcacgaggaa agaattcatt ttttttaaaa gaaaggctca gcgaaattaa gaagatggaa 60 ggtggcaatt ttctcacagt ttgtcttatt ttagttgcct tgactacttc taattatttg 120 aaatcagttt cagcggcaag gccagctgtg ggggaaacaa atacggagtt tataagaaca 180 tcttgtaagt caacaactta tcctaactta tgtttcagct cattatcaag ccgtgcaagt 240 gctattggag cttccccaca acttctagca catgaatccc tcaccgttag cctcgaaaca 300 gctcaatcaa catcctctat gatgttgaag ttggcacacg gtcaaggcat gacgccgaga 360 gagatcggcg ccatgcatga ctgtgtggag gaactaagtg acacagtcgt tggactgagg 420 aagtctttgg gggaaatgaa gcaactaagg ggcaaagatt ttgatttgaa aatgaatgat 480 attcaaacat gggtaagtgc tgccttgacg gacgaggata catgcactga ggggtttgat 540 ggaaaagtga tgaacgggaa agtcaagaca gttgttaggg gaaagattct tgaagttgca 600 catttgacga gcaatgcttt ggctttgatc aaccgtctgg ctgcccttca cggctaaagt 660 actcaaaagg acaattagtt gtatactgtt tggtgtgtta atcttctttt agaaaaagtg 720 tacttaattc atgcttagtt gattgctgta atagatataa taccttttgt gatgaatttc 780 ttgaatgaaa atgttccata tgcatttgtt aacaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 834 <210> 2 <211> 200 <212> PRT <213> Capsicum annuum L. cv. Hanbyul <400> 2 Met Glu Gly Gly Asn Phe Leu Thr Val Cys Leu Ile Leu Val Ala Leu 1 5 10 15 Thr Thr Ser Asn Tyr Leu Lys Ser Val Ser Ala Ala Arg Pro Ala Val 20 25 30 Gly Glu Thr Asn Thr Glu Phe Ile Arg Thr Ser Cys Lys Ser Thr Thr 35 40 45 Tyr Pro Asn Leu Cys Phe Ser Ser Leu Ser Ser Arg Ala Ser Ala Ile 50 55 60 Gly Ala Ser Pro Gln Leu Leu Ala His Glu Ser Leu Thr Val Ser Leu 65 70 75 80 Glu Thr Ala Gln Ser Thr Ser Ser Met Met Leu Lys Leu Ala His Gly 85 90 95 Gln Gly Met Thr Pro Arg Glu Ile Gly Ala Met His Asp Cys Val Glu 100 105 110 Glu Leu Ser Asp Thr Val Val Gly Leu Arg Lys Ser Leu Gly Glu Met 115 120 125 Lys Gln Leu Arg Gly Lys Asp Phe Asp Leu Lys Met Asn Asp Ile Gln 130 135 140 Thr Trp Val Ser Ala Ala Leu Thr Asp Glu Asp Thr Cys Thr Glu Gly 145 150 155 160 Phe Asp Gly Lys Val Met Asn Gly Lys Val Lys Thr Val Val Arg Gly 165 170 175 Lys Ile Leu Glu Val Ala His Leu Thr Ser Asn Ala Leu Ala Leu Ile 180 185 190 Asn Arg Leu Ala Ala Leu His Gly 195 200

Claims (15)

  1. 고추 한별 품종(Capsicum annuum L. cv. Hanbyul)으로부터 분리된 서열번호 1의 염기서열을 갖는 식물병 저항성 단백질 유전자 CaPMEI1.
  2. 제1항 기재의 유전자에 의해 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 식물병 저항성 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 상기 단백질은 펙틴 메틸에스터라아제 억제단백질인 것을 특징으로 단백질.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 단백질은 식물병원균에 대해 항균활성을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질.
  5. 제1항 기재의 CaPMEI1 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 CaPMEI1 유전자를 pET32a에 삽입시켜 제조한 재조합벡터 pET32a::CaPMEI1.
  7. 제5항에 있어서, 상기 CaPMEI1 유전자를 pBIN35S::GFP에 삽입시켜 제조한 재 조합벡터 pBIN35S::CaPMEI1::GFP.
  8. 제1항 기재의 유전자 또는 제5항 기재의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 식물체.
  9. 식물체의 병저항성 및 환경스트레스 저항성 탐색방법에 있어서,
    병원균, 화학물질 및 환경스트레스 중 어느 하나를 접종 또는 처리한 고추 식물체로부터 RNA를 분리하여 전기영동시키고 나이론막(Hybond N+)으로 전이시킨 후, 32P를 처리한 제1항 기재의 CaPMEI1 유전자 프로브와 반응시켜 CaPMEI1 유전자의 차별적 발현을 확인함을 포함하여 구성되는, 식물체의 병저항성 및 환경스트레스 저항성 탐색방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 병원균은 고추 세균성 점무늬병의 병원성 및 비병원성균 중 어느 하나임을 특징으로 하는 식물체의 병저항성 및 환경스트레스 저항성 탐색방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 화학물질은 살리실산, 에틸렌, 메틸 자스모네이트 및 엽산 중 어느 하나임을 특징으로 하는 식물체의 병저항성 및 환경스트레스 저항성 탐색방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 환경스트레스는 상처스트레스, 건조스트레스, 저온스트레스 및 활성산소스트레스 중 어느 하나임을 특징으로 하는 식물체의 병저항성 및 환경스트레스 저항성 탐색방법.
  13. 제5항 기재의 재조합 벡터를 E. coli 에 도입한 후 펙틴 메칠에스터라제와 반응시켜 상기 CaPMEI1 단백질의 펙틴 메칠에스터라아제 억제활성을 분석하는 방법.
  14. 제5항 기재의 재조합 벡터를 E. coli 에 도입한 후 식물병원균에 처리하여 상기 CaPMEI1 단백질의 항균활성을 분석하는 방법.
  15. 제5항 기재의 재조합 벡터를 E. coli 에 도입하여 식물병원균에 항균활성을 갖는 CaPMEI1 단백질을 생산하는 방법.
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