KR20070100329A

KR20070100329A - 콜라겐 합성 및/또는 kgf 발현의 촉진 방법

Info

Publication number: KR20070100329A
Application number: KR1020077017096A
Authority: KR
Inventors: 김성훈
Original assignee: 주식회사 이매진
Priority date: 2005-02-01
Filing date: 2006-01-24
Publication date: 2007-10-10
Also published as: CA2596597A1; US20100167997A1; EP1848395A4; AU2006211730A1; WO2006083087A1; JP2008528577A; CN101111222A; EP1848395A1; CA2596597C; KR100903984B1; MX2007009368A

Abstract

본 발명은 콜라겐 합성 및/또는 KGF 발현의 촉진 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 AIMP1 단백질 또는 이의 단편을 이용하여 콜라겐 합성 및/또는 KGF 발현을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 AIMP1 단백질 또는 이의 단편은 이들이 필요한 개체에서 콜라겐 합성 및/또는 KGF 발현의 촉진; 피부 노화의 치료; 축 늘어지거나 및/또는 주름진 피부의 치료; 피부의 유연성 및/또는 탄력의 증진; 폐경기의 역 피부 효과의 치료; 및 콜라겐에 대한 폐경기의 역효과의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

콜라겐 합성 및/또는 KGF 발현의 촉진 방법{METHOD FOR STIMULATING COLLAGEN SYNTHESIS AND/OR KGF EXPRESSION}

본 출원은 2005년 2월 1일자로 출원된 국제특허출원번호 제PCT/KR2005/000300호를 우선권으로 한다.

본 발명은 콜라겐 합성 및/또는 KGF 발현의 촉진 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 AIMP1 단백질 또는 이의 단편을 이용하여 콜라겐 합성 및/또는 KGF 발현을 촉진하는 방법에 관한 것이다.

인간의 몸은 모두 피부로 덮여 있다. 따라서 피부는 신체를 형성하고 있는 것 중에서 최대의 기관이라 할 수 있으며, 일반적으로 표피(epidermis)와 진피(dermis)의 2층으로 구성되어 있다. 표피는 피부의 맨 바깥쪽에 위치한 가장 얇은 층으로 피부의 보습 및 보호를 담당하는 중요한 기능을 한다. 보다 상세하게 표피는 우리 몸 안에 있는 물질이 몸 밖으로 빠져나갈 수 없도록 막아주고 또한 외부로부터 침입해 들어오는 자외선, 바이러스, 세균 등 유해물질의 침입을 막아준다. 또한 피지샘의 기름과 땀샘의 물을 자연적으로 유화시켜 약산성의 피지막을 만들어 유해물질 침입으로부터 보호해 주고, 세균을 살균시킨다. 이러한 표피는 주로 각질형성세포(keratinocytes)로 구성되어 있으며, 각질형성세포의 증식 및 분화가 서로 조화를 이루어 일정하게 유지된다. 각질형성세포는 분화하여 기저층, 유극층, 과립층 및 각질층의 4층을 이룬다. 특히, 각질형성세포는 주로 물리적 장벽에 의해 외부로부터 개체를 보호하는 역할을 담당하며, 면역학적 반응을 조절하는 사이토카인들을 비롯하여 다양한 생물학적 반응 조절물질을 생성 및/또는 분비함으로써 피부의 면역반응과 염증반응을 조절한다. 각질형성세포가 정상적인 생리기능을 수행할 때 건강하고 아름다운 피부를 유지할 수 있다.

진피는 표피에 영양분을 공급하며 표피를 지지하고 외부의 손상으로부터 몸을 보호하고, 수분을 저장하는 능력과 체온조절의 기능을 한다. 진피는 섬유아세포(fibroblasts)와 그의 세포외 기질(extracellular matrix)로 이루어져 있으며, 그 속에 신경, 혈관, 림프관, 근육과 피지선, 아포크린, 에크린선 등 피부 부속 기관을 내포하고 있다. 진피의 구조적인 조립을 위한 주요한 구성 요소인 섬유아세포는 콜라겐, 프로테오글리칸 및 다른 구조적 당단백질 등 세포외 기질을 합성한다. 그 중에서도 콜라겐은 진피의 70％를 차지하는 섬유 단백질로서 피부의 기계적 견고성(탄력성), 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포접착의 지탱, 세포분할과 분화 유도 등의 기능을 한다(Van der M. Rest et al., Biometerials., 11:28-31, 1990; Shimokomaki M. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 580:1-7, 1990; Van der Rest M. et al., Biochimie., 72(6-7):473-484, 1990). 이러한 콜라겐은 고령화 및 자외선 조사에 의한 광노화에 의해 감소하고, 나이가 들어감에 따라 콜라겐 함량이 감소하여 피부의 두께가 얇아지고, 이러한 현상은 피부의 주름 형성을 초래한다(Artheu K. Balin et al., "Aging and the skin", 1998). 반대로, 피부내 콜라겐 합성 촉진 에 의해 콜라겐 대사가 활발해지면, 진피 기질의 성분이 증가되어 주름 개선, 탄력 증진, 피부 강화 등의 효과가 나타난다.

인간의 피부는 나이가 들면서 여러 가지 내, 외적인 요인에 의하여 그 기능이 저하된다. 피부세포의 대사과정이나 자외선에 의해 생성되는 활성산소 등에 의해 세포 구성성분들(예: 세포막에 있는 지질 등)이 산화되고, 이들의 활성 및 생합성이 저해된다. 그 결과, 피부 노화가 일어나게 된다. 피부 노화가 진행되면서 피부는 표피의 두께가 전체적으로 얇아지고 세포와 조직에 탈수현상이 일어나 건조해지며 잔주름이 늘어나고 점차적으로 주름이 깊어진다. 또한 진피의 대부분을 차지하는 콜라겐의 양이 감소하고 콜라겐을 합성하는 섬유아세포의 활성 또한 감소하여 새로운 콜라겐의 합성도 줄어든다. 진피 내 콜라겐의 양이 감소함에 따라 진피의 두께도 감소하고, 결국 피부에 주름이 생기고 유연성과 탄력성이 떨어진다. 따라서, 이러한 피부 노화를 효과적으로 억제하기 위해서는 표피세포 및 진피세포를 둘 다 활성화 및/또는 재생시켜야 한다.

한편, AIMP1(ARS-interacting multi-functional protein 1) 단백질은 종래에 p43 단백질로 알려진 것으로서 본 발명자들에 의해 재명명 된 것이다(Kim S.H. et al., Trends in Biochemical Sciences., 30:569-574, 2005). AIMP1은 312개의 아미노산으로 이루어진 단백질로서, 다중-tRNA 합성효소 복합체(multi-tRNA synthetase complex)에 결합하여 상기 다중-tRNA 합성효소의 촉매적 활성(catalytic activity)을 증진시키는 단백질이다. 상기 AIMP1은 뇌척수염, 신경염 및 포도막염과 같은 실험상의 자가면역질환부위에 있는 미세신경세포에서 높은 수준으로 발현하는데, 이 와 같이 특정 발생 단계 및 조직에서 AIMP1의 발현 수준이 높게 나타나는 현상은AIMP1이 염증반응과 세포 고사에 관여한다는 것을 암시한다(Berger, A. C. et al., J. Immunother. 23:519-527, 2000). 본 발명자들은 AIMP1 및 이의 N-말단 단편이 효과적인 사이토카인, 항암제 및 혈관신생억제제로서 이용될 수 있음을 규명한 바 있다(Park H. et al., J. Leukoc. Biol., 71:223-230, 2002; Park S.G. et al., J. Biol. Chem., 277:45243-45248, 2002; Park H. et al., Cytokine, 21:148-53, 2002) 그러나, AIMP1이 콜라겐 합성 및 KGF 발현과 연관되어 있음은 지금까지 규명된 바 없다.

기술적 과제

따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 동일한 생리활성을 갖는 그의 단편의 유효량을 이들이 필요한 개체(subject in need thereof)에 투여하는 것을 포함하는, 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 콜라겐 합성 및/또는 KGF(keratinocyte growth factor)의 발현을 촉진하는 방법; 피부 노화를 치료하는 방법; 축 늘어지거나(flaccid) 및/또는 주름진 피부를 치료하는 방법; 피부의 유연(smoothing) 및/또는 탄력(firming)을 증진시키는 방법; 폐경기(menopause)의 역 피부 효과(adverse cutaneous effects)를 치료하는 방법; 및 콜라겐에 있어서 폐경기의 역효과를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 동일한 생리활성을 갖는 그의 단편을 유효성분으로 포함하는, 콜라겐 합성 및/또는 KGF 발현 촉진용 조성물; 및 피부노화 방지용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

아울러 본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 동일한 생리활성을 갖는 그의 단편을 유효성분으로 포함하는, 콜라겐 합성 및/또는 KGF 발현 촉진용 조성물; 및 피부노화 방지용 화장료 조성물을 제조하기 위한 용도를 제공하는 것이다.

기술적 해결방법

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드;

(b) 상기 (a) 폴리펩티드와 적어도 70％ 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 분리된 폴리펩티드; 및

(c) 상기 (a) 또는 (b) 폴리펩티드의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유효량을 이들이 필요한 개체(subject in need thereof)에 투여하는 것을 포함하는, 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 콜라겐 합성 및/또는 KGF(keratinocyte growth factor)의 발현을 촉진하는 방법; 피부 노화를 치료하는 방법; 축 늘어지거나(flaccid) 및/또는 주름진 피부를 치료하는 방법; 피부의 유연(smoothing) 및/또는 탄력(firming)을 증진시키는 방법; 폐경기(menopause)의 역 피부 효과(adverse cutaneous effects)를 치료하는 방법; 및 콜라겐에 있어서 폐경기의 역효과를 치료하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 동일한 생리활성을 갖는 그의 단편을 유효성분으로 포함하는, 콜라겐 합성 및/또는 KGF 발현 촉진용 조성물; 및 피부노화 방지용 화장료 조성물을 제공한다.

또한 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 동일한 생리활성을 갖는 그의 단편을 유효성분으로 포함하는, 콜라겐 합성 및/또는 KGF 발현 촉진용 조성물; 및 피부노화 방지용 화장료 조성물을 제조하기 위한 용도를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 콜라겐 합성 및 KGF(keratinocyte growth factor) 발현과 관계된 AIMP1의 신규 용도를 제공함에 특징이 있다.

AIMP1 단백질은 312개의 아미노산으로 이루어진 단백질로서, 전립선 암, 면역 및 형질전환 세포를 포함하는 다양한 형태의 세포로부터 분비되며 분비된 AIMP1은 단핵구/마크로파지, 내피세포 및 섬유아세포와 같은 다양한 표적세포에 작용하는 것으로 알려져 있다. 상기 AIMP1 단백질은 세 군데의 SNP가 알려져 있다(NCBI의 SNP 데이터베이스 참조). 즉, 전장 AIMP1 단백질의 아미노산 서열(서열번호 1) 중 79번째 아미노산인 알라닌(Ala)이 프롤린(Pro)으로 치환된 경우(서열번호 24, SNP accession no. rs3133166), 104번째 아미노산인 트레오닌(Thr)이 알라닌(Ala)으로 치환된 경우(서열번호 25, SNP accession no. rs17036670), 117번째 아미노산인 트레오닌이 알라닌(서열번호 26, SNP accssion no. rs2230255)으로 치환된 경우가 알려져 있다.

본 발명자들은 상기 AIMP1 단백질이 각기 다른 다양한 표적세포에 대해 다양하고 복잡한 활성을 가지고 있기 때문에 AIMP1은 각 활성을 나타내기 위하여 각기 다른 구조적 모티브 또는 도메인들을 사용할 것이라 가정하였다. 이와 같은 가능성을 확인하기 위하여 본 발명자들은 콜라겐 합성 및 KGF(keratinocyte growth factor) 발현 촉진에 관한 AIMP1 단백질의 기능 도메인을 결정하기 위하여 AIMP1의 N 말단 단편 및 C 말단 단편을 제조한 다음에 각 단편들의 콜라겐 합성 및 KGF(keratinocyte growth factor) 발현 촉진에 대한 활성을 조사하였다(실시예 5 참조). 그 결과, 콜라겐 합성 및 KGF 발현을 촉진하는 활성이 AIMP1 단백질의 C 말단 단편에는 없으나, N 말단 단편에는 효과가 있는 것으로 나타났다(도 5참조).

나아가, 본 발명자들은 AIMP1 단백질의 N 말단의 단편에서 어떤 도메인이 상기와 같은 활성이 있는지를 확인하기 위하여 결손 단편을 제작하여 실험한 결과 AIMP1의 6-46번 아미노산 영역이 콜라겐 합성 및 KGF 발현을 촉진하는 활성이 있음을 확인하였다(도 6 및 도 7참조). 상기와 같은 실험 결과에 의해, AIMP1 단백질의 6-46번 아미노산 영역을 포함하며 적어도 192개의 아미노산으로 이루어진 단편들, 즉, 서열번호 2, 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14로 이루어진 펩타이들에 의해 콜라겐 합성 및 KGF 발현을 촉진하는 활성을 가진다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, AIMP1 단백질의 1-192번의 아미노산으로 이루어진 단편(서열번호 27) 및 AIMP1 단백질의 6-192번의 아미노산으로 이루어진 단편(서열번호 28)에 의해서도 콜라겐 합성 및 KGF 발현을 촉진하는 활성을 가진다는 것을 확인할 수 있었다(결과 미도시).

콜라겐은 진피의 섬유아세포에서 생산되고, 진피의 70％를 차지하는 섬유상 단백질로서, 피부의 유연과 탄력을 담당한다. 따라서, 콜라겐의 합성이 감소되면 피부가 노화되어 피부의 탄력성과 유연성이 급격히 감소하고, 결국 피부가 축 늘어지거나 주름이 생긴다. 반대로, 피부 내 콜라겐 합성 촉진에 의해 콜라겐 대사가 활발해지면, 진피 기질의 성분이 증가되어 주름 개선, 탄력 증진, 피부 강화 등의 효과가 나타난다. 상기한 바와 같이 본 발명의 AIMP1 단백질 및 이의 단편은 콜라겐의 합성을 촉진시키는 활성을 가진다(도 1 내지 도 3 및 도 5 내지 도7 참조).

KGF(keratinocyte growth factor)는 피부의 표피를 구성하는 주 성분인 각질형성세포의 성장 인자로서 진피의 섬유아세포로부터 생산되는 외분비 인자(paracrine factor)이다. KGF는 상피세포의 재생과 상환에 관여하는데, 상피세포를 성장시켜 피부 표피층을 재생시킨다(Moore T. et al, Lab. Invest. 60:237-244, 1989; Han DS et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 279:G1011-1022, 2000). 또한, KGF는 섬유아세포 성장 인자 패밀리의 하나인 섬유아세포 성장 인자 7(fibroblast growth factor 7)이라고도 알려져 있으며, KGF를 암호화하는 유전자가 도입된 형질전환 쥐는 두꺼워진 표피(thickened epidermis)를 갖는 것으로 나타났다(Guo L. et al., EMBO J., 12(3):973-986, 1993). 현재 KGF는 국제화장품등록협회(Cosmetic Toiletry and Fragrance Association)에 화장품 원료 물질로 등록되어 있다. 또한 KGF와 콜라겐이 서로 결합하여 각질형성세포의 세포분열을 촉진시키는 것으로 알려져 있다(Ruehl M. et al., J. Biol Chem., 277:26872-8, 2002). 상기한 바와 같이, 본 발명의 AIMP1 단백질 및 이의 단편은 KGF의 발현을 촉진시키는 활성을 갖는다(도 4, 도 5 및 도 6참조).

상기와 같은 활성들을 갖는 AIMP1 단백질 및 이의 단편은 피부에서 콜라겐 합성 및/또는 KGF 발현의 촉진을 위한 용도로 사용될 수 있다. 또한 콜라겐 합성 및/또는 KGF의 발현을 촉진시킴으로써 피부 노화 또는 이에 의한 피부 증상(cutaneous signs)을 억제, 치료, 개선 및/또는 예방하기 위한 용도로도 사용될 수 있다.

따라서 본 발명은 AIMP1 단백질 또는 이의 단편의 유효량을 이들이 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는, 시험관내 또는 생체내에서 콜라겐 합성 및/또는 KGF 발현을 촉진하는 방법; 피부 노화를 치료하는 방법; 축 늘어지거나 및/또는 주름진 피부를 치료하는 방법; 및 피부의 유연 및/또는 탄력을 증진시키는 방법을 제공한다.

한편, 폐경기(menopause)에서 콜라겐 수준(level)이 감소하거나 진피의 두께가 감소되는 등 진피에서 주요 변화가 일어난다. 폐경기 이후 콜라겐 대사의 변화와 관련된 연구들에 의하면, 골밀도의 감소와 피부 두께의 감소, 그리고 매해 콜라겐 수준의 평행적 감소가 관찰된다고 보고하고 있다(C. Castelo-Braance et al., Maturitas., 18(3):199-206, 1994). 즉, 폐경 후 피부 콜라겐의 감소는 처음의 폐경 연도에 가장 급격히 오며, 폐경 후 20년까지 매년 피부 콜라겐이 2.1％씩 감소되며, 폐경 후 5년 동안 피부 콜라겐이 30％ 정도 감소된다. 이로 인해서 피부 두께가 급격히 감소하고, 또한 피지(sebum)가 감소함에 따라 피부가 거칠어지며 주름이 증가되고 피부 탄력이 급격히 감소하는 등 다양한 피부 노화의 현상이 촉진되는 것으로 보고되고 있다. 또한 폐경 후 여성의 요실금 빈도 증가와 관련하여 방광벽의 콜라겐 감소로 인한 탄력성 감소가 주요한 원인으로 제안되고 있다(Bergman A et al., Gynecol Obstet Invest., 37(1):48-51, 1994). 그러므로 콜라겐 합성 및 KGF 발현의 촉진 활성을 갖는 본 발명의 AIMP1 단백질 및 이의 단편은 폐경기에서의 피부 노화, 폐경기에서의 콜라겐 대사 이상으로 인한 이상증상(abnormal condition or abnormal symptom) 등을 억제, 치료, 개선 및/또는 예방하기 위한 용도로도 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 AIMP1 단백질 및 이의 단편의 유효량을 이들이 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는 폐경기의 역 피부 효과 및 콜라겐에 있어서 폐경기의 역효과를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 사용되는 AIMP1 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한 본 발명의 AIMP1 단백질에는 그의 기능적 동등물도 포함된다. 본 발명에서 '기능적 동등물'이란 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 AIMP1과 실질적으로 동등한 생리 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다.

상기에서 '동등한 생리활성'이란 콜라겐의 합성 및/또는 KGF의 발현을 촉진시키는 활성을 말한다. 상기 기능적 동등물은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는90％ 이상의 서열 상동성(homology)을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 바람직하게는 AIMP1의 SNP로 알려진 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26인 폴리펩티드일 수 있다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과 서열번호 1의 펩타이드와 적어도 70％ 이상의, 바람직하게는 80％, 더욱 바람직하게는 90％이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 것으로 예를 들면, 70％, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 것을 포함하며, 서열번호 1의 펩타이드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩타이드를 말한다. 본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은 서열번호 1의 아미노산 서열과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후 서열번호 1의 아미노산 서열에 대한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한 상기 서열 동질성은 두개의 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램은 두개의 폴리펩타이드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭(matching) 되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 패널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연개되어 사용될 수 있는 PAM25(표준 스코링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp. 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다: 일치하는 서열(indentical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(machted span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다. 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.

또한 본 발명에서는 AIMP1의 단편도 사용될 수 있다. 상기 AIMP1의 단편은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이와 적어도 70％의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드의 일부 단편일 수 있다. 또한 상기 단편은 AIMP1의 아미노산 서열의 일부와 100％의 동일성(identity)을 가지고, 본 발명의 AIMP1과 동등한 생리활성을 나타낸다. 상기 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열 중에서 선택된 적어도 10개 이상, 바람직하게는 41개, 보다 바람직하게는 100개 이상의 계속되는(contiguous) 아미노산으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 단편은 바람직하게 AIMP1의 아미노산 서열(서열번호 1) 중에서 선택된 41개의 계속되는 아미노산 서열(서열번호 12)를 포함하며, 적어도 192개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드일 수 있다. 가장 바람직하게는 서열번호 2, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 27 내지 서열번호 34로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있다. 상기 서열번호 29 내지 31의 아미노산 서열은 상기 서열번호 27의 아미노산 서열의 공지된 SNP이고, 상기 서열번호 32 내지 34의 아미노산 서열은 상기 서열번호 28의 아미노산 서열의 공지된 SNP이다.

본 발명의 폴리펩티드는 유전공학적 방법에 의해 작제될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 AIMP1 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 폴리펩티드'라 함은 본 발명에 따른 폴리펩티드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., supra; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie ＆ Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.

또한, 본 발명의 펩타이드는 당분야에 공지된 기술로 화학적으로 합성할 수 있다 (Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., NY (1983)). 즉, 본 발명의 펩타이드는 통상의 단계적인 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법을 이용하여 제조할 수 있다 (Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, (1997); A Practical Approach, Atherton ＆ Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, (1989)). 특히, 바람직한 제조방법은 고체상 합성방법(solid phase synthesis)을 이용하는 것이다. 본 발명에 따른 펩타이드는 보호된 아미노산간의 응축반응 (condensation reaction)에 의하여 통상의 고체상 방법으로, C-말단으로부터 시작하여 규명된 아미노산 서열에 따라 순차적으로 진행하면서 합성할 수 있다. 응축 반응 후 보호기 및 C-말단 아미노산이 연결된 담체를 산분해 (acid decomposition) 또는 아미놀리시스 (aminolysis)와 같은 공지의 방법에 의해 제거할 수 있다. 상기 언급된 펩타이드 합성법은 관련 서적에 상세히 기술되어 있다(Gross and Meienhofer's, The Peptides, vol 2., Academic Press, 1980).

본 발명에 따른 펩타이드의 합성을 위해 사용할 수 있는 고체상의 담체는 이 분야에서 통상 사용되는 담체로서 예를 들어, 치환된 벤질 형태의 폴리스티렌 레진 (polystyrene resins of substituted benzyl type), 히드록시메틸페닐아세틱 아미드 형태의 폴리스티렌 레진, 치환된 벤즈히드릴폴리스티렌 레진, 펩타이드에 결합할 수 있는 기능기를 가진 폴리아크릴아미드 레진 등을 사용할 수 있다. 아미노산 응축 또한 통상의 방법일 수 있으며, 예를 들어 디시클로헥실카보디이미드(DDC), 산 무수물(acid anhydride) 및 활성화 에스테르(activated ester) 방법이 사용될 수 있다.

본 발명의 펩타이드 합성에 사용된 보호기들은 통상의 펩타이드 합성에 사용되는 보호기들로서 산 분해, 환원 또는 아미놀리시스와 같은 통상의 방법에 의해 쉽게 제거되는 것들이다. 아미노 보호기들의 구체적인 예로는 포밀; 트리플루오로아세틸; 벤질옥시카보닐; (오르쏘-또는 파라-) 클로로벤질옥시카르보닐 및 (오르쏘-또는 파라-) 브로모벤질옥시카르보닐과 같은 치환된 벤질옥시카르보닐; t-부톡시카보닐 및 t-아밀록시카보닐과 같은 지방족 옥시카보닐 등이 있다. 아미노산의 카복실기들은 에스테르기로 전환시킴으로써 보호할 수 있다. 에스테르기로는 벤질 에스테르, 메톡시벤질 에스테르와 같은 치환된 벤질 에스테르; 시클로헥실 에스테르, 시클로헵틸 에스테르 또는 t-부틸 에스테르와 같은 알킬 에스테르 등이 있다. 구아니디노기는 보호기가 필요하지 않지만, 니트로; 또는 토실, 메톡시벤젠술포닐 또는 메시틸렌술포닐과 같은 아릴술포닐에 의해 보호될 수 있다. 이미다졸의 보호기로는 토실, 벤질 및 디니트로페릴 등이 있다. 트립토판의 인돌기는 보호기가 없어도 되며 포밀 등으로 보호기를 붙일수도 있다.

탈보호 및 담체로부터 펩타이드를 분리하는 것은 여러 스캐빈저(scavenger)하에 무수 하이드로 플루오라이드에 의해 수행될 수 있다. 스캐빈저의 예로는 아니솔, (오르쏘-, 메타-, 파라-) 크레솔, 디메틸술파이드, 씨오크레솔, 에탄엔디올 및 머캅토피리딘 등을 들 수 있는데 이들은 펩타이드 합성에서 통상 사용되는 것들이다.

유전공학적 방법에 의해 제조된 재조합 펩타이드 또는 화학적으로 합성된 펩타이드는 예를 들면 추출법, 재결정법, 다양한 크로마토크래피(겔 여과법, 이온 교환, 침전, 흡착, 역전상), 전기영동, 역류 분배법 등 당업계에 공지된 방법으로 분리 및 정제할 수 있다.

본 발명에서 '유효량'이라 함은, 시험관내 또는 생체내에서 콜라겐 합성 및/또는 KGF 발현을 촉진하거나 이를 통하여 피부 노화의 치료; 축 늘어지거나 및/또는 주름진 피부의 치료; 피부의 유연성 및/또는 탄력의 증진; 폐경기의 역 피부 효과의 치료; 및 콜라겐에 대한 폐경기의 역효과의 치료로 이루어진 군에서 선택되는 효과를 나타내는 양을 말한다.

본 발명에 있어서, '개체(subject)'란 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물 또는 상기 동물의 피부 세포, 피부 조직을 의미한다. 상기 개체는 치료가 필요한 환자(patient)일 수 있다. 또한 상기 피부 세포는 바람직하게는 섬유아세포일 수 있다.

본 발명의 AIMP1 단백질 및 이의 단편은 상기 기재한 효과 중에서 원하는 효과가 도출될 때까지 투여될 수 있다. 본 발명의 AIMP1 단백질 및 이의 단편은 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 경로로 투여될 수 있다. 즉, 경구 또는 비경구, 예컨대 구강, 근육내, 정맥내, 피내, 동맥내, 골수내, 경막내, 복강내, 비강내, 질내, 직장내, 설하 또는 피하 투여되거나, 위장관, 점막 또는 호흡기로 투여될 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 피부에 직접적으로 도포하는 방법 또는 상기 폴리펩티드를 주사용 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부 아래층에 일정량을 주입하거나 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 피부에 직접 도포될 수 있다. 또한 본 발명에 따른 AIMP1 단백질 및 이의 단편은 표적 세포나 조직(예:피부 세포나 피부 조직)에 고친화성 결합을 유발하는 분자와 결합되거나 상기 분자 내에 캡슐화된 형태로 투여될 수도 있다. 본 발명의 AIMP1 단백질 및 이의 단편은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 스테롤(예: 콜레스테롤), 지질(예: 양이온 지질, 비로좀 또는 리포좀) 또는 표적 세포 특이적 결합제(예: 표적세포 특이적 수용체에 의해 인지되는 리간드)와 결합될 수 있다. 적합한 커플링제 또는 가교제로는 예컨대 단백질 A, 카보디이미드, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오테이트 (SPDP) 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 AIMP1 단백질 또는 이의 단편은 상기 기재된 용도들을 위한 약학적(pharmaceutical), 피부학적(dermatological) 또는 화장료(cosmetic) 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.

상기 조성물은 당업계에서 제조되는 어떠한 제형으로 제조될 수 있다. 바람직하게는 피부 도포용 제형으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제조될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화 아연 등이 사용될 수 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 클로로플루오르히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서, 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테라일 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이드, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한 본 발명에 따른 조성물은 메조테라피(mesotherapy)를 위한 주사용 제형으로 제조될 수 있다. 상기 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드를 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다.

또한 본 발명의 조성물은 경구 투여용 제형으로도 제조될 수 있다. 경구 투여용의 경우, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신)와 활탁제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제 및/또는 감미제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.

또한 본 발명의 조성물은 본 발명의 효과를 더욱 강화시키기 위해 콜라겐 합성 촉진, 섬유아세포 증식 촉진, 피부 노화 억제/개선, 피부 보습, 피부의 탄력/유연 증진, 주름 개선, 피부 기능 강화 등의 효과를 갖는 공지의 물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 물질로는, 이에 제한되지는 않으나, 레티노인산(retinoic acid), TGF(trans-forming growth factor), 베툴린산(betulinic acid), 신남산(cinnamic acids), 하이드로스틸벤 (hydrostilbene), 비타민 A, 비타민 E, 비타민 C, 적포도 추출 분말 등을 사용할 수 있다. 이외 피부로의 단백질의 흡수를 촉진하는 물질, 방부제, 수화제, 유화 촉진제, 완충제 등 기타 약학적, 피부학적 및/또는 화장품학적으로 허용가능한 매질 또는 기재를 더욱 함유할 수 있다.

본 발명에 따라 투여되는 AIMP1 단백질 또는 이의 단편의 양은 조성물 총 중량에 대하여 0.001％ 내지 20％, 바람직하게는 0.005％ 내지 10％의 범위일 수 있다.

본 발명의 조성물에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 개체에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 투여 목적에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 1회 투여시 0.1 ㎍ 내지 10 mg의 유효용량으로 하루에 수 차례 반복 투여될 수 있다. 그러나, 상기 폴리펩티드의 농도는 투여 경로 및 치료 횟수뿐 만 아니라 치료가 필요한 개체의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 각 개체에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 폴리펩티드의 상기 기재된 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

도 1은 포피 섬유아세포에서 AIMP1에 의해 유도되는 콜라겐 합성을 농도별로 조사한 RT-PCR(윗부분) 및 웨스턴 블럿(아랫부분)의 분석 결과이다.

GADPH: RT-PCR 분석을 위한 대조군

튜불린: 웨스턴 블럿 분석을 위한 대조군

도 2는 포피 섬유아세포에서 AIMP1에 의해 유도되는 콜라겐 합성을 농도별로 조사한 RT-PCR(윗부분) 및 웨스턴 블럿(아랫부분)의 분석 결과이다.

도 3은 야생형 마우스(WT) 및 AIMP1이 결여된 동형접합성 마우스(Ho)의 재상피화 부위(re-epithelialization regions)에서 AIMP1의 처리에 따른 콜라겐의 양을 항-콜라겐 항체를 이용한 면역 형광 염색법으로 비교한 결과이다.

도 4는 포피 섬유아세포 및 U2OS 세포에서 AIMP1에 의해 유도되는 KGF의 발현을 조사한 RT-PCR 분석 결과이다.

싸이클린 D 및 GADPH: 대조군

도 5는 AIMP1의 단편(N-말단 및 C-말단)에 의해 콜라겐 및 KGF가 유도되는지를 시간별로 조사한 RT-PCR 분석 결과이다.

GADPH: 대조군

도 6은 포피 섬유아세포에서 AIMP1 및 이의 N-말단 단편들인 서열번호 2(1-147), 서열번호 12(6-46), 서열번호 13(1-46), 서열번호 14(1-53)로 표시되는 펩타이드와 AIMP1의 C-말단 단편(193-312; 서열번호 15)에 의해 유도된 콜라겐 및 KGF의 발현을 조사한 RT-PCR 분석 결과이다.

GADPH: 대조군

도 7은 포피 섬유아세포에서 AIMP1 및 AIMP1의 N 말단 단편들(1-147; 서열번호 2 및 6-46; 서열번호 12)에 의해 유도되는 콜라겐 합성을 조사한 웨스턴 블럿의 분석 결과이다.

발명의 실시를 위한 최선의 형태

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

＜참고예 1＞

AIMP1 및 이의 단편의 제조

312개의 아미노산으로 이루어진 AIMP1 단백질(서열번호 1), 이의 N-말단 단편(1-147; 서열번호 2) 및 C-말단 단편(148-312; 서열번호 3)은 당업계에 공지된 박 등의 방법(Park S.G. et al., J. Biol. Chem., 277:45243-45248, 2002)에 따라 제조하였다.

＜참고예 2＞

AIMP1의 N 말단 결손 단편들 및 C 말단 결손 단편의 제조

AIMP1의 N 말단 결손 단편들 및 C 말단 결손 단편, 즉, AIMP1-(6-46; 서열번호 12), AIMP1-(1-46; 서열번호 13), AIMP1-(1-53; 서열번호 14), AIMP1-(193-312; 서열번호 15), AIMP1-(1-192; 서열번호 27) 및 AIMP1-(6-192; 서열번호 28)단편을 각각 제조하였다. 상기 각 단편은 AIMP1의 cDNA를 주형으로 하고 각 단편에 대한 특이적인 프라이머 세트(표1)를 이용하여 PCR 증폭으로 합성하였다. PCR 반응 조건 은 다음과 같다; 95℃에서 2분간 가열하여 주형 DNA를 전변성시킨 후, 95℃에서 30초; 56℃에서 30초; 및 72℃에서 1분을 1 사이클로 하여 총 25사이클을 수행하고, 72℃에서 5분간 최종 반응시켰다. 상기 PCR 산물들을 EcoRI 및 XhoI로 자르고 동일한 효소로 절단한 pGEX4T3 벡터(아머샴 바이오사이언스사)에 라이게이트 하였다. 상기 벡터로 E.coli BL21(DE3)를 형질전환하고 이를 배양하여 펩타이들의 발현을 유도하였다. GST-tag 융합 단백질로 발현되는 각 펩타이드를 GSH 아가로스로 정제하였다. 리포폴리사카라이드를 제거하기 위해, 단백질 용액을 파이로젠 무첨가 완충액(10mM 인산칼륨 완충액, pH 6.0, 100 mM 염화나트륨)에서 투석하였다. 투석 후 단백질을 동일한 완충액으로 평형시킨 폴리마이신 수지(Bio-Rad)에 로딩하고 20분간 배양한 다음 용출시켜 각 AIMP1의 결손 단편들을 제조하였다.

표 1

AIMP1의 N말단 결손 단편 및 C말단 결손 단편의 제조에 사용한 프라이머 세트

＜실시예 1＞

AIMP1의 처리 농도에 따른 콜라겐의 합성 촉진

＜1-1＞ 포피 섬유아세포의 배양 및 AIMP1 처리

AIMP1에 의한 콜라겐의 전사 RNA를 측정하기 위하여, 포피 섬유아세포(5×10⁴ cells/well, 회사명: MTT, 기탁번호:MC1232)를 6 웰 플레이트에 있는 10％ 혈청 함유 DMEM배지에서 12시간 동안 배양한 후, 다시 무혈청 배지에서 3시간 정도 배양하였다. 이후, AIMP1 단백질(서열번호 1)을 농도별(0, 20, 50, 100 및 200 nM)로 각각 6시간(RT-PCR) 또는 12시간(웨스턴 블럿) 동안 처리하였다.

＜1-2＞ RT-PCR 분석

상기 실시예 ＜1-1＞에서 AIMP1이 농도별로 처리된 세포를 회수한 후, TRIzol(invitrogen)로 용해시켰다. 세포 용해액에 10％ 양의 클로로포름(chloroform)을 첨가하여 잘 혼합하였다. 혼합액을 12,000g에서 15분간 원심분리를 하여 상등액을 수득하였다. 수득된 상등액에 에탄올을 최종 농도가 70％가 되도록 첨가하였다. 이후, 다시 26,000 g에서 5분간 원심분리를 하여 침전물을 수득하였다. 상기 침전물을 건조하고, 멸균된 증류수로 녹여서 총 RNA를 추출하였다. 3 ㎍의 총 RNA를 이용하여 cDNA를 제조하였다. 이후, 콜라겐 특이적 프라이머(서열번호 4 및 서열번호 5)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이 때 대조군은 GADPH 특이적 프라이머(서열번호 6 및 서열번호 7)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같다: 95℃에서 5분간 가열하여 주형 DNA를 전변성시킨 후, 95℃에서 1분; 52℃에서 1분; 및 72℃에서 1분을 1 사이클로 하여 총 25사이클을 수행하고, 72℃에서 5분간 최종 반응시켰다.

그 결과, 도 1의 윗부분(upper)에서 보는 바와 같이, AIMP1이 섬유아세포에서 콜라겐의 합성을 농도 의존적으로 촉진함을 확인할 수 있었다.

＜1-3＞ 웨스턴 블럿 분석

상기 실시예 ＜1-1＞에서 AIMP1이 농도별로 처리된 세포를 회수하고, 세포 용해 완충액(lysis buffer)(50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 10％ glycerol, 5 mM EGTA, 1 mM sodium orthovanadate, 10 mM NaF, 12 mM b-glycerophosphate, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 5 mg/ml aprotinin, and 1％ NP40)으로 세포를 용해시켰다. 용해 된 세포를 26,000 g에서 15분간 원심분리하여 세포 추출물을 분리하였다. 세포 추출물 30㎍을 8％ SDS-PAGE로 분리하고, 항-콜라겐 I 항체(Abcam)를 이용하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 면역분석법(immunoblotting)을 실시하였다. 이 때 대조군에는 항-튜불린 항체(Sigma)를 이용하였다.

그 결과, 도 1의 아랫부분(bottom)에서 보는 바와 같이, AIMP1이 섬유아세포에서 콜라겐의 합성을 농도 의존적으로 촉진함을 단백질 수준에서도 확인할 수 있었다.

＜실시예 2＞

AIMP1의 처리 시간에 따른 콜라겐의 합성 촉진

＜2-1＞ 포피 섬유아세포의 배양 및 AIMP1 처리

포피 섬유아세포(5×10⁴ cells/well)를 6 웰 플레이트에 있는 10％ 혈청 함유 DMEM배지에서 12시간 동안 배양한 후, 다시 무혈청 배지에서 3시간 정도 배양하였다. 이후, 100 nM 의 AIMP1을 시간별(0, 2, 4, 6, 12 및 24 h)로 처리하였다.

＜2-2＞ RT-PCR 분석

상기 실시예 ＜2-1＞에서 AIMP1이 처리된 세포를 지정된 시간에 회수하고, 상기 실시예 ＜1-2＞와 동일한 방법에 따라 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 도2의 윗부분(upper)에서 보는 바와 같이, AIMP1이 섬유아세포에서 콜라겐의 합성을 시간 의존적으로 촉진함을 확인할 수 있었다.

＜2-3＞ 웨스턴 블럿 분석

상기 실시예 ＜2-1＞에서 AIMP1이 처리된 세포를 지정된 시간에 회수하고, 상기 실시예 ＜1-3＞과 동일한 방법에 따라 웨스턴 블럿을 수행하였다. 그 결과, 도 2의 아랫부분(bottom)에서 보는 바와 같이, AIMP1이 섬유아세포에서 콜라겐의 합성을 촉진함을 단백질 수준에서도 확인할 수 있었다.

＜실시예 3＞

생체 내에서 AIMP1의 콜라겐 합성 촉진

당업계에 공지된 진 트랩 방법(Zambrowicz, B. P., et al., Nature 392:608-611, 1998; Kim JY et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:7912-7916, 2002)으로 수컷 C57BL6 마우스에 AIMP1 구조유전자 내 돌연변이를 유발시켜 AIMP1이 결여된 동형접합성 마우스(AIMP1-/- 마우스, Ho)를 제조하였다(Park S.G. et al., Am. J. Pathol., in press:, 2005). 이후, 8주령의 동형접합성 마우스와 야생형 마우스(AIMP1+/+ 마우스, WT)의 등에 가위를 이용하여 지름 0.5 cm 크기의 원형 절제창을 내었다. 상처 부위는 드레싱(dressing)하지 않은 채 방치하였다. 상기 참고예 1에서 제조된 AIMP1 단백질 4 ㎍을 20％ 글리세롤 함유 PBS 5㎕에 용해시켜서 상처 부위에 도포하였다. 상기 도포는 상처를 낸 후 3일까지 이틀에 한 번씩 12시간 간격으로 수행하였다. 대조군(AIMP1 단백질 무처리군)에는 20％ 글리세롤 함유 PBS 을 처리하였다. 이후, 상처 부위의 조직을 가위를 이용하여 떼어낸 후, 4% 파라포름알데하이드에서 밤새 고정시켰다. 고정된 조직을 PBS로 세척하고 30% 자당액에 4시간 동안 배양한 후, 마지막으로 OCT(optimal cutting temperature) 합성물에 혼합하여 -70℃에 냉동시켰다.

6 ㎛의 동결 절편(frozen section)을 실란(silane)이 코팅된 슬라이드에 부착시킨 후, PBS로 세척하였다. 이후, 0.1％ tween 20과 1％ 탈지분유를 함유하는 PBS로 블록킹(blocking)한 다음 항-콜라겐 I 항체(Abcam)와 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 슬라이드를 0.1％ Tween 20을 함유하는 PBS로 3회 세척한 후, FITC가 연결된 2차 항체를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 절편을 형광 현미경(confocal immunofluorescence microscopy, μ-Radiance, BioRad) 하에서 관찰하였다.

그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, AIMP1이 결여된 동형접합성 마우스(Ho)에서보다 야생형 마우스(WT)에서 더 많은 양의 콜라겐이 관찰되었으며, 이는 AIMP1의 외부 처리(exogenous treatment)에 의해 더욱 증가하였다. 이로부터 AIMP1이 콜라겐의 합성을 촉진시킴을 생체 내 조건에서도 확인할 수 있었다.

＜실시예 4＞

AIMP1에 의한 KGF 발현 촉진

100 nM의 AIMP1을 2시간 동안 처리하여 배양한 포피 섬유아세포에서 상기 실시예 ＜1-2＞에 기재된 동일한 방법에 따라 총 RNA를 추출하였다. 이후, KGF 특이적 프라이머(서열번호 8 및 9)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 이 때 대조군은 싸이클린(cyclin)-D 특이적 프라이머(서열번호 10 및 11) 및 GADPH 특이적 프라이머(서열번호 6 및 서열번호 7)를 이용하여 RT-PCR을 각각 수행하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같다: 95℃에서 5분간 가열하여 주형 DNA를 전변성시킨 후, 95℃에서 1분; 52℃에서 1분; 및 72℃에서 1분을 1사이클로 하여 총 25사이클을 수행하고, 72℃에서 5분간 최종 반응시켰다.

그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이, 포피 섬유아세포에서 AIMP1의 처리에 의하여 KGF의 발현이 증가된 것으로 나타났다. 이는 AIMP1이 KGF의 발현을 증가시킴을 통해 피부의 표피층의 재생에 관여함을 나타내는 것이다.

＜실시예 5＞

p43 단편에 의한 콜라겐 합성 및 KGF 발현 촉진

포피 섬유아세포(5×10⁴ cells/well)를 6 웰 플레이트에 있는 10％ 혈청 함유 DMEM배지에서 12시간 동안 배양한 후, 다시 무혈청 배지에서 3시간 정도 배양하였다. 이후, 상기 참고예 1에서 제조된 p43의 N-말단 및 C-말단 단편을 100 nM의 농도로 시간별(0, 1, 2, 4, 및 6h)로 처리하였다. 이후, 콜라겐 특이적 프라이머(서열번호 4 및 5), KGF 특이적 프라이머(서열번호 8 및 9) 및 GADPH 특이적 프라이머(서열번호 6 및 7)을 이용하여 상기 실시예 ＜1-2＞와 동일한 방법에 따라 RT-PCR을 수행하였다.

그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이, 콜라겐 및 KGF 의 합성이 p43의 N-말단 단편에 의해 촉진되는 것으로 나타났다. 그러나, C-말단 단편의 경우, 유의적인 효과가 없는 것으로 나타났다.

＜실시예 6＞

AIMP1 N 말단 결손 단편 및 C 말단 결손 단편에 의한 콜라겐 합성 및 KGF 발현 촉진

포피 섬유아세포(5×10⁴cells/well)를 6 웰 플레이트에 있는 10％ 혈청 함유 DMEM배지에서 12시간 동안 배양한 후, 다시 무혈청 배지에서 3시간 정도 배양하였다. 이후, 상기 참고예 2에서 제조된 AIMP1의 N-말단 단편들(서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14) 및 AIMP1의 C-말단 단편(서열번호 15)을 100nM의 농도로 각각 2시간 및 6시간 처리한 후, 콜라겐 특이적 프라이머(서열번호 4 및 5), KGF 특이적 프라이머(서열번호 8 및 9) 및 GADPH 특이적 프라이머(서열번호 6 및 7)을 이용하여 상기 실시예 ＜1-2＞와 동일한 방법에 따라 RT-PCR을 수행하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, AIMP1의 N말단 결손 단편인 6-46(서열번호 12) 및 이를 포함하는 펩타이들(서열번호 13, 서열번호 14)을 처리하였을 때 콜라겐 및 KGF의 합성이 AIMP1의 C 말단 단편인 193-312(서열번호 15)을 처리한 경우보다 더 많이 촉진됨을 확인하였다.

＜실시예 7＞

AIMP1 및 이의 N-말단 단편들에 의한 콜라겐 합성 촉진

포피 섬유아세포(5×10⁵ cells/well)를 6웰 플레이트에 있는 10％ 혈청 함유 DMEM 배지에서 48 시간 동안 배양한 후, 다시 무혈청 배지에서 3시간 정도 배양하였다. 이후, AIMP1 단백질(서열번호 1)과 AIMP1 N-말단 단편들(서열번호 2 및 서열번호 12)을 200 nM의 농도로 12시간 동안 처리하였다. 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포를 사용하였다.

상기 AIMP1 및 이의 N-말단 절편들이 처리된 세포와 대조군 세포를 지정된 시간에 회수하고, 상기 실시예 ＜1-3＞과 동일한 방법에 따라 웨스턴 블럿을 수행하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, AIMP1이 처리되지 않은 포피 섬유아세포보다 AIMP1 (서열번호 1) 및 AIMP1 N-말단 절편들(서열번호 2 및 서열번호 12)이 처리된 포피 섬유아세포에서 콜라겐의 합성이 더 많이 촉진됨을 단백질 수준에서 확인할 수 있었다.

＜제형예 1＞

유연 화장수

본 발명의 AIMP1 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 유연 화장수는 하기 표 2와 같은 성분 및 함량을 이용하여 제조하였다.

표 2

＜제형예 2＞

영양 화장수

본 발명의 AIMP1 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 영양 화장수는 하기 표 3과 같은 성분 및 함량을 이용하여 제조하였다.

표 3

＜제형예 3＞

영양 크림

본 발명의 AIMP1 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 영양 크림은 하기 표 4와 같은 성분 및 함량을 이용하여 제조하였다.

표 4

＜제형예 4＞

에센스

본 발명의 AIMP1 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 에센스는 하기 표 5와 같은 성분 및 함량을 이용하여 제조하였다.

표 5

＜제형예 5＞

팩

본 발명의 AIMP1 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 팩은 하기 표 6과 같은 성분 및 함량을 이용하여 제조하였다.

표 6

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 AIMP1 단백질 및 이의 단편은 피부에서 콜라겐 합성 및 KGF 발현을 촉진시킨다. 따라서, 본 발명의 AIMP1 단백질 또는 이의 단편은 이들이 필요한 개체에서 콜라겐 합성 및/또는 KGF 발현의 촉진; 피부 노화의 치료; 축 늘어지거나 및/또는 주름진 피부의 치료; 피부의 유연성 및/또는 탄력의 증진; 폐경기의 역 피부 효과의 치료; 및 콜라겐에 대한 폐경기의 역효과의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Claims

(a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드;

(b) 상기 (a) 폴리펩티드와 적어도 70％ 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 분리된 폴리펩티드; 및

(c) 상기 (a) 또는 (b) 폴리펩티드의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유효량을 이들이 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는, 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 콜라겐 합성 및/또는 KGF(keratinocyte growth factor)의 발현을 촉진하는 방법.
(a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드;

(b) 상기 (a) 폴리펩티드와 적어도 70％ 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 분리된 폴리펩티드; 및

(c) 상기 (a) 또는 (b) 폴리펩티드의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유효량을 이들이 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는, 피부 노화를 치료하는 방법.
(a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드;

(b) 상기 (a) 폴리펩티드와 적어도 70％ 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 분리된 폴리펩티드; 및

(c) 상기 (a) 또는 (b) 폴리펩티드의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유효량을 이들이 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는, 축 늘어지거나(flaccid) 및/또는 주름진 피부를 치료하는 방법.
(a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드;

(b) 상기 (a) 폴리펩티드와 적어도 70％ 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 분리된 폴리펩티드; 및

(c) 상기 (a) 또는 (b) 폴리펩티드의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유효량을 이들이 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는, 피부의 유연(smoothing) 및/또는 탄력(firming)을 증진시키는 방법.
(a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드;

(b) 상기 (a) 폴리펩티드와 적어도 70％ 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 분리된 폴리펩티드; 및

(c) 상기 (a) 또는 (b) 폴리펩티드의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유효량을 이들이 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는, 폐경기(menopause)의 역 피부 효과(adverse cutaneous effects)를 치료하는 방법.
(a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드;

(b) 상기 (a) 폴리펩티드와 적어도 70％ 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖 는 분리된 폴리펩티드; 및

(c) 상기 (a) 또는 (b) 폴리펩티드의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유효량을 이들이 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는, 콜라겐에 있어서 폐경기의 역효과를 치료하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (b) 단계의 폴리펩티드는 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 이루어진 군 에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (c) 단편은 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 적어도 192개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 (c) 단편은 서열번호 2, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 27 내지 서열번호 34 중에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드;

(b) 상기 (a) 폴리펩티드와 적어도 70％ 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 분리된 폴리펩티드; 및

(c) 상기 (a) 또는 (b) 폴리펩티드의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 유효성분으로 포함하는, 콜라겐 합성 및/또는 KGF 발현 촉진용 조성물.
(a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드;

(b) 상기 (a) 폴리펩티드와 적어도 70％ 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 분리된 폴리펩티드; 및

(c) 상기 (a) 또는 (b) 폴리펩티드의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 유효성분으로 포함하는, 피부노화 방지용 화장료 조성물.
제10항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (b) 단계의 폴리펩티드는 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 이루어진 군 에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제10항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (c) 단편은 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 적어도 192개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
제13항에 있어서, 상기 (c) 단편은 서열번호 2, 서열번호 12, 서열번호 13,서열번호 14 및 서열번호 27 내지 서열번호 34 중에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
(a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드;

(b) 상기 (a) 폴리펩티드와 적어도 70％ 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 분리된 폴리펩티드; 및

(c) 상기 (a) 또는(b) 폴리펩티드의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 유효성분으로 포함하는, 콜라겐 합성 및/또는 KGF 발현 촉진용 조성물을 제조하기 위한 용도.
(a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드;

(b) 상기 (a) 폴리펩티드와 적어도 70％ 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 분리된 폴리펩티드; 및

(c) 상기 (a) 또는 (b) 폴리펩티드의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 유효성분으로 포함하는, 피부노화 방지용 화장료 조성물을 제조하기 위한 용도.
제15항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (b) 단계의 폴리펩티드는 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 이루어진 군 에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
제15항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (c) 단편은 서열번호 12 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 적어도 192개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드인 것을 특징으로 하는 용도.
제18항에 있어서, 상기 (c) 단편은 서열번호 2, 서열번호 12, 서열번호 13,서열번호 14 및 서열번호 27 내지 서열번호 34 중에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인 것을 특징으로 하는 용도.