ITRM20120404A1 - Uso del kgf nel trattamento di disturbi della menopausa - Google Patents

Description

“USO DEL KGF NEL TRATTAMENTO DI DISTURBI DELLA MENOPAUSAâ€

SETTORE DELL’INVENZIONE

La presente invenzione rientra nel campo medico, in particolare si riferisce all’uso del fattore di crescita dei cheratinociti (KGF/FGF7) e di sue relative composizioni farmaceutiche nel trattamento di condizioni di atrofia vaginale, disuria, dolore vaginale e/o secchezza vaginale indotte da uno stato di post-menopausa, da intervento chirurgico, da una patologia e/o da trattamenti chemioterapici o radioterapici.

SFONDO DELL’INVENZIONE

La mancanza di estrogeni in post-menopausa provoca alterazioni dell'epitelio vaginale in più del 50% di donne di 50-60 anni [Pandit et al,1997]. Questi disturbi sono caratterizzati dalla loro cronicità e ricorrenza, anche con conseguente disfunzione sessuale, e facilmente il loro significato supera la loro reale gravità in quanto rafforzano il timore di un declino generalizzato [Rossin-Amar, 2000]. La mancanza di estrogeni induce una progressiva atrofia della vulva che risulta in assottigliamento della mucosa, con 30-50% di riduzione dei livelli di vascolarizzazione. La riduzione simultanea di glicogeno, in particolare in cellule dello strato intermedio, provoca una modifica dell'ecosistema vaginale, con un conseguente rischio aumentato della presenza di agenti patogeni responsabili di vaginiti ricorrenti. Inoltre, l'atrofia vaginale può verificarsi anche in donne in premenopausa che hanno subito un intervento chirurgico per cancro dell'endometrio, incluso quello pelvico, o una linfoadenectomia para-aortica e sono trattate con brachiterapia vaginale adiuvante (VBT), per diminuire il rischio di recidive locali e per migliorare il tasso di sopravvivenza delle pazienti [Scholten 2005; Keys 2004; Lee 2009]. Tutti questi trattamenti possono dar luogo a eventi avversi in una percentuale variabile di pazienti, inclusi disuria, dolore vaginale, atrofia della mucosa vaginale e secchezza vaginale [Dickler 2010]. Questi sintomi possono essere considerati un problema sanitario significativo per una parte sostanziale della popolazione mondiale femminile, dal momento che sono spesso legati a infiammazione, dispareunia e perdita di godimento sessuale.

La perdita di estrogeni à ̈ riconosciuta come la causa più comune dei sintomi della menopausa, causando spesso il trattamento di disturbi post-menopausa vulvo-vaginali con la terapia sistemica ormonale sostitutiva (HRT). Tuttavia, il coinvolgimento degli estrogeni nella genesi-progressione dei tumori dell'endometrio, dell'ovaio e della mammella, anche se il rischio aumentato di cancro dipende dal tipo di terapia ormonale sostitutiva, la durata d'uso, massa corporea e l'intervallo tra menopausa e l’inizio della terapia ormonale sostitutiva, crea una sfiducia delle donne e anche di alcuni medici a consigliare la terapia adiuvante [Hendrix et al,2005; Grodstein et al, 2004], che à ̈ stata seriamente messa in dubbio. Fino ad ora, nessun consenso à ̈ stato raggiunto per quanto riguarda la terapia appropriata: HRT deve essere somministrato a donne con disturbi di menopausa per soddisfare le loro esigenze individuali, tenendo conto del loro profilo di rischio individuale e degli obiettivi generali terapeutici.

Per questi motivi, formulazioni di estrogeni intravaginali sono state introdotte per evitare l'esposizione sistemica agli estrogeni e sono stati preferiti in donne che non hanno altri sintomi della menopausa che richiedono un trattamento sistemico [Johnston et al, 2004; Willhite e O'Connell, 2001]. Tuttavia, à ̈ stato dimostrato che l’estradiolo topico à ̈ significativamente assorbito e appare nella circolazione generale [Martin et al, 1979; Furuhjelm et al, 1980; Deutsch et al, 1981; Mandel et al, 1983; Ballagh, 2005; Kendall et al, 2006; Kvorning e Jensen, in: Pubblicazione Presentata a: workshop Internazionale, Copenhagen, 1986], confermando così l'esposizione all’aumentato rischio di cancro al seno e dell'endometrio dopo il trattamento ormonale locale [Notelovitz et al, 2002; Rioux et al, 2000; Schiff et al, 1977]. Alla luce di questa considerazione, preparati non-ormonali sono stati sviluppati per il trattamento di vaginite atrofica [Kendall et al., 2006; Berger et al., 2008], come isoflavoni derivati da soia. Tuttavia, l'uso di formulazioni topiche basate su isoflavoni di soia allo scopo di prevenire i sintomi del postmenopausa ha dato scarsi risultati in termini di efficacia [Levis et al., 2011].

Il recettore α degli estrogeni (ERα) esercita la sua funzione prevalentemente attraverso il legame al suo ligando, 17β-estradiolo (E2), che induce cambiamenti conformazionali che permettono il reclutamento di molecole coattivatrici o corepressori e il legame a elementi di risposta ad estrogeni (ERE) sul DNA per regolare la trascrizione di geni bersaglio (percorso “classico†di segnalazione dell’ER). Nell'ultimo decennio, prove emergenti hanno sostenuto l'importanza di un percorso di segnalazione di ERα alternativo (indicato come “non classico†) nel mediare le azioni degli estrogeni [Hall et al., 2001].

Questo percorso può portare effetti sia genotropici che non genotropici in cellule bersaglio ed à ̈ indipendente dal legame di ER ad ERE. Il segnale genotropico mediato da ERα coinvolge altri fattori di trascrizione, come la proteina attivatrice-1 (AP1), la proteina di specificità-1 (SP1), e NF-κB [Paech et al, 1997; Coleman e Smith, 2001; Porter et al, 1996; Cerillo et al, 1998], che a loro volta mediano la regolazione della trascrizione dei loro geni bersaglio. Il segnale genotropico mediato da ERα include l'attivazione del recettore membrana-associato e la stimolazione di vie citoplasmatiche, come PI3K/AKT, ERK e la cascata di segnalazione di p38 [Singh, 2001; Watters et al, 1997; Zhou et al, 1996]. È interessante notare che i fattori che determinano se il segnale mediato da ER passi attraverso il percorso classico o attraverso il non-classico rimangono quasi del tutto sconosciuti.

Negli ultimi anni, à ̈ stato dimostrato che vari fattori di crescita giocano un ruolo nella proliferazione delle cellule cancerose del seno interagendo con il percorso degli estrogeni, sebbene i meccanismi e gli effettori di tale interazione non siano ancora chiari. Un certo numero di studi ha fornito indicazioni di un cross-talk tra la segnalazione di ER e la segnalazione di EGF/EGFR. In particolare, à ̈ stato ipotizzato che lo sviluppo di resistenza al tamoxifene in cellule di cancro al seno può essere correlato all’attivazione ER-mediata di EGFR, HER2/neu e IGFR.

Il fattore di crescita dei cheratinociti (KGF/FGF7) (NCBI Reference Sequence: NM_002009.3, sequenza amminoacidica GenBank: CAG46799.1), un membro della famiglia dei fattori di crescita dei fibroblasti (FGF), gioca un ruolo fondamentale nella regolazione di proliferazione cellulare, migrazione e differenziamento durante lo sviluppo e in risposta al danno e alla riparazione dei tessuti [Finch e Rubin, 2004]. Esso agisce legandosi al recettore tirosina chinasi FGFR2-IIIb/KGFR, generato attraverso uno splicing alternativo del gene FGFR2 e prevalentemente espresso sulle cellule epiteliali di diversi organi, giocando un ruolo chiave nel controllo della crescita e del differenziamento epiteliale [Zhang et al., 2006]. La via KGF/KGFR à ̈ essenziale per il mantenimento dell'integrità e funzionalità di tessuti epiteliali adulti, a causa dell’attività citoprotettiva e rigenerativa del KGF. In effetti, l'espressione di KGF à ̈ fortemente sovra regolata dopo lesioni in vari tessuti epiteliali come pelle, reni, vescica, pancreas, stomaco ed intestino [Werner et al, 1992;. Marchese et al, 1995;. Brauchle et al, 1996;. Werner, 1998]. Inoltre, il KGF protegge da lesioni dell'epitelio polmonare e migliora la riparazione distale delle vie aeree stimolando la proliferazione cellulare, inibendo l’apoptosi e i radicali liberi dell'ossigeno e mobilizzando le cellule progenitrici epiteliali [Gomperts et al., 2007]. È stato dimostrato che il trattamento con KGF ricombinante (Palifermin) à ̈ in grado di proteggere le cellule epiteliali contro una varietà di lesioni, incluso il danno indotto da radiazione, quindi KGF à ̈ stato approvato dalla FDA per il trattamento di gravi mucositi orale che risultano dalla radio e/o chemioterapia del cancro nei pazienti con tumori ematologici o della testa e del collo [Spielberger et al, 2004;. Beaven e Shea, 2007; Brizel et al, 2008;. Barash et al, 2009.]. D’altra parte, la somministrazione di KGF sui topi con vagine in via di sviluppo durante il periodo neonatale risulta in una proliferazione estrogeno-indipendente dell'epitelio vaginale, suggerendo così un potenziale legame tra il trattamento con estrogeni e l'attivazione del segnale di KGF/KGFR [Masui et al., 2004]. Inoltre, gli autori hanno già eseguito il primo trapianto autologo di tessuto vaginale in una donna con sindrome di Mayer von Rokitansky Kuster Hauser (MRKHS) mediante l'uso di tessuto vaginale autologo coltivato in vitro [Panici et al., 2007], fornendo in tal modo l'ideale modello in vitro per analizzare l'effetto di estrogeni e KGF sul trofismo della mucosa vaginale.

La domanda Internazionale WO 2006/083087 descrive che il peptide N-terminale AIMP1 à ̈ in grado di stimolare la sintesi del collagene e/o l’espressione di KGF. Tuttavia, non à ̈ dimostrata la capacità del peptide di oltrepassare la barriera epidermica e la membrana plasmatica e quindi essere realmente efficace nei trattamenti cutanei. Come invece à ̈ noto in letteratura, le sostanze proteiche non oltrepassano la barriera epidermica in presenza di cute integra.

Esiste quindi la necessità di fornire un agente terapeutico in grado di trattare localmente i disturbi della menopausa, quali la secchezza e l’atrofia vaginale, sostituendo le terapie già in uso (formulazioni a base di estrogeni).

DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE

Gli autori hanno indagato il cross-talk tra i percorsi di estrogeni e KGFR, per chiarire i meccanismi alla base dell’effetto degli estrogeni che promuove la crescita e il ruolo potenziale dei fattori di crescita nello sviluppo di nuove strategie terapeutiche per l’atrofia della mucosa. Inoltre, gli autori hanno confrontato l'efficacia in vivo del trattamento locale con estrogeni con la somministrazione topica di KGF, dimostrando che KGF può essere utilizzato come terapia alternativa per l’atrofia vaginale post-menopausa o altre disfunzioni quali quelle che si verificano in pazienti sottoposti a radioterapia dopo chirurgia del cancro endometriale.

Forma pertanto oggetto dell’invenzione il fattore di crescita dei cheratinociti (KGF/FGF7) per uso nel trattamento di condizioni di atrofia vaginale, disuria, dolore vaginale e/o secchezza vaginale indotte da uno stato di post-menopausa, da un intervento chirurgico, da una patologia e/o da trattamenti chemioterapici o radioterapici.

Per “fattore di crescita dei cheratinociti†o “KGF/FGF7†o “KGF†si intende l’intera proteina selvatica KGF (NCBI Reference Sequence: NM_002009.3 (SEQ ID No.1):

, sequenza amminoacidica GenBank: CAG46799.1 (SEQ ID No.2):

) o il KGF ricombinante umano (sequenza amminoacidica SwissProt: P21781 # (SEQ ID No. 2):

), il KGF ricombinante umano Palifermin (DrugBank: DB00039 (frammento da aa. 56 a aa. 194 di SEQ ID No.2):

) o loro varianti alleliche o ortologhe, frammenti, mutanti, derivati o analoghi funzionali. Preferibilmente, il fattore di crescita dei cheratinociti stimola la proliferazione dell’epitelio vaginale.

In una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, l’intervento chirurgico comprende l’asportazione di cancro dell'endometrio, incluso quello pelvico, o una linfoadenectomia para-aortica.

In una forma di realizzazione preferita, il trattamento comprende brachiterapia vaginale adiuvante.

In una forma di realizzazione preferita, il chemioterapico à ̈ il tamoxifene o un farmaco antitumorale appartenente alla famiglia dei modulatori selettivi del recettore degli estrogeni.

Un ulteriore oggetto dell’invenzione à ̈ una composizione farmacologica comprendente il fattore di crescita dei cheratinociti e eccipienti farmaceuticamente accettabili per uso nel trattamento di condizioni di atrofia vaginale, disuria, dolore vaginale e/o secchezza vaginale indotte da uno stato di post-menopausa, da un intervento chirurgico, da una patologia e/o da trattamenti chemioterapici o radioterapici.

Detta composizione farmacologica à ̈ preferibilmente per somministrazione topica.

La composizione farmacologica secondo l’invenzione, comprende preferibilmente una quantità farmaceuticamente efficace del fattore di crescita dei cheratinociti.

In una forma di realizzazione preferita, il fattore di crescita dei cheratinociti à ̈ ad una concentrazione da 1 a 100 Î1⁄4g/ml, più preferibilmente ad una concentrazione di 50 Î1⁄4g/ml. Preferibilmente, la composizione farmacologica dell’invenzione comprende inoltre un agente gelificante. Detto agente gelificante à ̈ preferibilmente Pluronic F127.

Le composizioni farmacologiche dell’invenzione possono essere preparate miscelando il fattore di crescita dei cheratinociti avente il grado desiderato di purezza con opzionali vettori, eccipienti o stabilizzanti fisiologicamente accettabili (Remington Pharmaceutical Sciences 16a edizione, Osol, A. Ed.., 1980), in forma di formulazioni liofilizzate o soluzioni acquose. Vettori, eccipienti o stabilizzanti accettabili sono atossici ai destinatari ai dosaggi e concentrazioni impiegate, e possono includere tamponi, antiossidanti, conservanti, peptidi, proteine, polimeri idrofili, agenti chelanti come EDTA, zuccheri, contro-ioni formanti sali come sodio, complessi metallici (ad esempio, complessi Znproteine) e / o tensioattivi non ionici testati come TWEEN , Pluronics  o polietilene glicole (PEG).

Il trattamento topico con KGF à ̈ fortemente indirizzato e specifico verso il trattamento locale dei disturbi della menopausa ed à ̈ quindi indicato per contrastare i sintomi come la secchezza e l’atrofia vaginale. Il KGF può quindi sostituire le terapie già in uso, i.e. formulazioni a base di estrogeni.

I vantaggi dati dall’uso del KGF, dovuti alla sua origine proteica, sono conseguenza dell’impenetrabilità della barriera epiteliale e della presenza fisiologica del suo recettore specifico in membrana che gli consente di svolgere la sua funzione senza oltrepassarla. Il KGF, infatti, contrariamente agli estrogeni, non viene sottoposto ad un passaggio in circolo (transcutaneo).

In una forma di realizzazione preferita della composizione farmacologica dell’invenzione, KGF à ̈ somministrato in un dosaggio di 10-30 ng/die, garantendo quindi che solo la quota introdotta e rilasciata potrà agire a livello locale senza cross-reagire con altre vie di segnalazione.

La presente invenzione verrà descritta in esempi non limitativi, facendo riferimento alle seguenti figure:

Figura 1. Effetto del trattamento con KGF ed E2 sulla proliferazione di KC. (A) analisi di immunofluorescenza con un anticorpo policlonale diretto contro Ki67 in KC non trattate o trattate con differenti concentrazioni di KGF o E2 (0,5-20 ng/ml) per 24 h. (B) Valutazione della proliferazione delle cellule dopo trattamento con KGF e E2 (20 ng/ml) in due differenti popolazioni di KC, derivate da biopsie di donne in premenopausa o post-menopausa, rispettivamente. (C) Valutazione del possibile effetto sinergico o additivo di KGF ed E2. Cellule KC sono state trattate con KGF, E2 o una combinazione di essi, e sottoposte ad immunofluorescenza con anticorpi anti-Ki67. (D) Valutazione dell'effetto proliferativo di KGF e E2 in presenza di Tamoxifene. KC sono state trattate con KGF, E2, tamoxifene (Tam, 100 nM), KGF più Tam o E2 più Tam per 24 h. Dopo 24 h, le cellule sono state fissate e colorate con cristal violetto 1% o sottoposte ad immunofluorescenza con anticorpi anti-Ki67. La percentuale di cellule positive per Ki67 à ̈ stata determinata contando il numero di nuclei Ki67-positivi rispetto al numero totale dei nuclei in dieci diverse aree scelte a caso da tre diversi esperimenti. Le barre di errore rappresentano le deviazioni standard.

Figura 2. Effetto di KGF ed E2 sull'attivazione delle vie non genomiche di ER-alfa (A) cellule MCF-7 sono state trattate con KGF e E2 (20 ng/ml) per 5 o 30 minuti, e l'analisi in Western blot dello stato di fosforilazione di ERK à ̈ stata effettuata utilizzando un anticorpo monoclonale ERK fosfospecifico (pERK). I livelli di ERK totale sono stati valutati tramite “blotting†con un anticorpo ERK2-specifico. (B) Analisi in Western blot dello stato di fosforilazione di MAPK p38 à ̈ stata effettuata utilizzando un anticorpo monoclonale p38 fosfospecifico (pp38). I livelli di p38 totale sono stati valutati con “blotting†con un anticorpo p38-specifico. (C) Analisi in Western blot dello stato di fosforilazione di Akt à ̈ stata effettuata utilizzando un anticorpo monoclonale Akt fosfospecifico (pAkt). I livelli di Akt totale sono stati valutati con “blotting†con un anticorpo Akt-specifico. (D) Analisi in Western blot dello stato di fosforilazione di ERalfa à ̈ stata effettuata utilizzando un anticorpo monoclonale ERalfa fosfospecifico (pERa). I livelli di ERalfa totale sono stati valutati mediante “blotting†con un anticorpo ERaspecifico.

Figura 3. Valutazione della sovra regolazione di KGFR E2-mediata. (A) cellule MCF-7 sono state trattate o non con E2 (20 ng/ml) per 24 h, e la quantità di proteina KGFR à ̈ stata valutata mediante analisi in Western blot con un anticorpo anti-bek policlonale. La tubulina à ̈ servita come controllo di caricamento. (B) I livelli di espressione di mRNA di KGFR sono stati determinate mediante PCR Real Time, e normalizzati per i livelli di mRNA 18s. La quantità di mRNA di KGFR in cellule trattate con E2 à ̈ stata espressa come incremento del livello di mRNA di KGFR rispetto alle cellule non trattate.

Figura 4. Localizzazione cellulare di ERalfa dopo il trattamento con KGF o E2. (A) frazionamento subcellulare di cellule MCF-7. Le frazioni citoplasmatiche e nucleari sono state analizzate con anti-ERalfa, anti-β-tubulina come controllo per la frazione citoplasmatica e anti-lamina B come marcatore nucleare. (B) immunofluorescenza di MCF-7 non trattate o trattate con KGF, E2 o una combinazione di essi per 5 o 30 min. Le cellule sono state trattate con anticorpi primari anti-ERalfa seguiti da anticorpi secondari coniugati con FITC (verde). Microfilamenti di actina sono stati evidenziati con Texas red coniugato alla falloidina (rosso). Sono mostrate immagini sovrapposte.

Figura 5. Ruolo di KGF nella stimolazione degli effetti genomici di ERalfa. Il costrutto ERE-LUC à ̈ stato transfettato in cellule MCF-7 non trattate o trattate con KGF o E2 per 24 h, e l’attività di luciferasi à ̈ stata determinata. Dati del saggio reporter di luciferasi sono espressi come incremento rispetto al controllo (cellule non trattate) e rappresentano la media di tre esperimenti separati dopo la correzione per le differenze nell'efficienza di trasfezione tramite attività di pRL-TK. Le barre di errore rappresentano le deviazioni standard.

Figura 6. Studi in vivo su un modello murino. (A) Il ceppo di topi CD1 utilizzati in questo studio à ̈ stato sottoposto a ovariectomia, per indurre atrofia vaginale, e quindi localmente trattato con 25 Î1⁄4l di idrogel caricato con KGF (10 o 30 ng/die) o con E2 (30 ng/die o 1 Î1⁄4g/die). (B) studio reologico su idrogel di Pluronic F127. Una soluzione di F127 (cP = 20% w/v in H2O) à ̈ stata riscaldata ad una velocità di 2 °C/min da 10 a 40 °C, ed i valori di G' (modulo elastico) e G'' (modulo di perdita) sono stati misurati durante questa rampa di temperatura e riportati come grafico. (C) diagramma schematico delle molecole modello utilizzate per il test di rilascio in vitro con Pluronic F127. (D) Test di rilascio con Pluronic F127. Idrogel caricati con le molecole modello sono stati introdotti in un sacchetto di membrana da dialisi e incubati in 60 ml di acqua distillata a 37 °C in agitazione ad una velocità di 50 rpm. I profili di rilascio degli idrogel carichi sono stati espressi in termini di percentuale cumulativa in uscita e in funzione del tempo.

Figura 7. Valutazione dell’effetto in vivo di KGF e E2 sull’epitelio vaginale. (A) Concentrazioni sieriche di E2 e KGF nei topi trattati, misurata utilizzando i kit standard di ELISA per E2 e KGF. I valori sono espressi in pg/ml, come media ± deviazione standard. ND, non rilevabile (inferiore a 10 pg/mL). (B) Le sezioni di tessuto della vagina di topi di controllo, topi ovariectomizzati trattati con il solo veicolo e topi trattati con dosi basse e alte di E2 o KGF sono state colorate con ematossilina ed eosina. La mucosa vaginale di gruppi di controllo mostra un epitelio squamoso stratificato con strato corneo e la presenza di un ben formato strato lucido. Una significativa induzione di stratificazione dell'epitelio vaginale e ipercheratosi si osserva nella vagina esposta sia a E2 che a KGF (leggermente più evidente nei gruppi trattati con dosi elevate), ma non nel gruppo trattato con il solo veicolo, in cui la mucosa vaginale mostra una significativa diminuzione nello spessore epiteliale in confronto con il gruppo di controllo (ingrandimento originale 20X).

Figura 8. Quantificazione dell’effetto in vivo di KGF e E2 su epitelio vaginale. (A) Le sezioni di tessuto della vagina di topi di controllo, topi ovariectomizzati trattati con il solo veicolo e topi trattati con dosi basse e alte di E2 o KGF sono state colorate con ematossilina ed eosina. L’epitelio vaginale corneificato à ̈ stato osservato nella vagina esposti sia a E2 che a KGF, ma non nel gruppo trattato con il veicolo (ingrandimento originale 40x). (B) Il numero di strati epiteliali, lo spessore dell’epitelio e il rapporto tra la superficie epiteliale e la lunghezza della membrana basale sono stati calcolati per ogni trattamento. In breve, tre animali per ogni gruppo sono stati trattati e tre immagini sono state scattate per ciascun animale. Valori medi sono stati ottenuti da cinque misure di ciascuna immagine. Le barre verticali rappresentano gli errori standard.

Figura 9. Valutazione della proliferazione basale dell’epitelio vaginale dopo trattamento con KGF e E2. Sezioni di epitelio vaginale sono state sottoposte a immunoistochimica con un anticorpo anti-PCNA per identificare la proliferazione dello strato basale. Le sezioni sono state controcolorate con ematossilina. Sono mostrate sezioni rappresentative per ciascun gruppo di trattamento (ingrandimento originale 20x).

ESEMPI

Materiali e Metodi

Le colture cellulari e i trattamenti

La linea cellulare umana di adenocarcinoma del seno MCF-7 positiva al recettore degli estrogeni α, acquistata dalla American Type Culture Collection (n. HTB-22, ATCC-LGC Promochem, Teddington, UK), à ̈ stata coltivata in Mezzo di coltura Dulbecco modificato (DMEM; Invitrogen , Karlsruhe, Germania), integrato con 10% siero fetale bovino (FBS; Invitrogen) e antibiotici. Colture primarie di cheratinociti (KC) umani estrogeno-sensibili sono state stabilizzate a partire da biopsia a tutto spessore di 1 cm<2>della mucosa del vestibolo vaginale. A seguito di dissociazione enzimatica, i cheratinociti sono stati seminati su piastre di coltura rivestite con collagene IV (10 mg / ml), come precedentemente riportato [Panici et al., 2007], e mantenute in terreno basale dei cheratinociti (KBM, Lonza) integrato con aliquote di KGM (Lonza), con cambi di terreno due volte a settimana. Per tutti gli esperimenti con 17ï ¢-estradiolo (E2) e tamoxifene, le cellule MCF-7 sono state coltivate in DMEM senza rosso fenolo integrato con 10% di FBS trattato con destrano/carbone (Invitrogen), e i KC sono stati trasferiti ad un terreno a ridotta concentrazione di steroidi (KGM senza EGF e BPE). Sia MCF-7 che KC sono state deprivate di siero per 4 ore e quindi trattate per 48 h con KGF umano ricombinante (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), E2 (Sigma-Aldrich, Milano, Italia), tamoxifene (Sigma-Aldrich, 100 nM) o combinazioni di essi.

RT-PCR quantitativa

Le cellule sono state raccolte e l’RNA totale à ̈ stato estratto con l'uso del reagente TRIzol (Invitrogen). Il cDNA à ̈ stato generato con oligo (dT) da 1ï g di RNA utilizzando il kit trascrittasi inversa SuperScript III (Invitrogen). Dopo la trascrizione inversa, l'abbondanza di KGFR in cellule MCF-7 trattate o non trattate con E2 à ̈ stata quantificata mediante Q-RT-PCR. Per KGFR, sono stati sviluppati saggi TaqMan ® personalizzati specifici (Applied Biosystems di Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) (KGFR “forward†, 5'-GGCTCTGTTCAATGTGACCGA-3'; KGFR “reverse†, 5’-GTTGGCCTGCCCTATATAATTGGA-3’. Sonda TaqMan, 5’-TTCCCCAGCATCCGCC-3’), utilizzati ad una concentrazione di 1x per pozzetto. Un totale di 2 Î1⁄4l/pozzetto di stampo à ̈ stato aggiunto ai pozzetti del campione con master mix per PCR Taqman Universal ad una concentrazione di 1x e acqua ad un volume di 25 Î1⁄4l/pozzetto. I saggi sono stati condotti in triplicato su uno strumento ABI 7500 Real Time (Applied Biosystems) utilizzando le seguenti condizioni: 50 °C per 2 min, 95 °C per 10 minuti, e poi 95 °C per 15 s e 60 °C per 1 min , ripetuto 40 volte. La quantificazione relativa à ̈ stata eseguita usando mRNA 18s come controllo endogeno. I dati sono stati espressi come incremento di mRNA di KGFR rispetto al controllo.

Microscopia a immunofluorescenza

Le cellule, coltivate su vetrini copri oggetto, sono state trattate come descritto sopra, poi fissate in paraformaldeide al 4% in tampone fosfato isotonico (PBS) per 30 min a 25 °C, seguito da trattamento con glicina 0,1 M in PBS per 20 min a 25 °C e con 0,1% Triton X-100 in PBS per ulteriori 5 minuti a 25 °C per consentire la permeabilizzazione. Per valutare la proliferazione cellulare, le cellule sono state incubate con un anticorpo anti-Ki67 policlonale di coniglio (1:50 in PBS; Zymed Laboratories, San Francisco, CA), che identifica le cellule ciclanti. L'anticorpo primario à ̈ stato osservato con anticorpi di capra anti-IgG di coniglio coniugati con Texas Red (1:100 in PBS; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). I nuclei sono stati visualizzati utilizzando 4', 6-diamido-2-fenilindolo dicloridrato (DAPI) (1:10000 in PBS; Sigma-Aldrich). Segnali di fluorescenza sono stati analizzati mediante la registrazione di immagini colorate utilizzando un fotocamera digitale SPOT-2 a colori CCD raffreddata (Diagnostic Instruments Incorporated, Sterling Heights, MI) e software AxioVision (Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germania).

La percentuale di cellule positive per Ki67 à ̈ stata valutata contando, per ogni trattamento, un totale di 500 cellule, prese a caso da dieci campi microscopici in tre diversi esperimenti, espressa come valore medio  95% CI e riportata come grafici. Per gli esperimenti di localizzazione di ERα, il citoscheletro di actina à ̈ stato visualizzato utilizzando TRITC-falloidina (1:100 in PBS) e ERα à ̈ stato visualizzato usando un anticorpo monoclonale anti-ERα (Santa Cruz) (1:100 in PBS). Le immagini colorate singolarmente e fuse sono state acquisite con Zeiss Apotome ® e software AxioVision (Carl Zeiss, Jena, Germania) con lenti dell'obiettivo 40 ×.

Saggio di sopravvivenza cellulare

Per valutare la citotossicità di cellule trattate con Tamoxifene, le MCF-7 sono state trattate come descritto sopra, fissate per 10 min in una soluzione di acetico acido al 10% -metanolo al 10%, colorate con cristal violetto (1% p/v) e fotografate utilizzando una macchina fotografica digitale Power Shot G5 (Canon, Inc., Tokyo, Giappone).

Analisi Western blot

Cellule MCF-7 non trattate o trattate con KGF o E2 sono state lisate in tampone RIPA. Le proteine totali (50-150 Î1⁄4g) sono state risolte in condizioni riducenti tramite 7-10% SDS-PAGE e trasferite su membrane Immobilon-FL (Millipore, Billerica, MA, USA). Le membrane sono state bloccate in TBS contenente 0,5% Tween 20 (TBS-T) e il 5% di latte per 1 ora a 25 °C e quindi lavate due volte per 20 minuti ciascuna in TBS-T. Le membrane sono state poi incubate con l'anticorpo primario per una notte a 4 °C. Gli anticorpi primari utilizzati sono stati i seguenti: anti-fosfo-p44/42 MAPK, anti-fosfo-Akt, anti-Akt, antifosfo-p38, anti-p38, anti-fosfo-ERα (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers , MA, USA), anti ERK2, anti-Bek (C-17), anti ERα, anti-Lamina B (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-tubulina (Sigma-Aldrich). Le membrane sono state poi incubate con anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (HRP) (Sigma-Aldrich) per 1 ora a 25 °C. L’anticorpo legato à ̈ stato rilevato dai reagenti avanzati di rilevamento di chemiluminescenza (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, USA), secondo le istruzioni del produttore. La tubulina à ̈ stata monitorata per normalizzare. L'analisi densitometrica à ̈ stata effettuata utilizzando Quantity One Program (Bio-Rad Laboratories srl, Segrate, MI, Italia).

Frazionamento subcellulare

Le cellule sono state raccolte in PBS, e centrifugate a 2000 rpm per 5 minuti per ottenere un pellet, risospeso poi in tampone di lisi cellulare contenente Hepes 10 mM pH 8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8, 0,2% TritonX100, saccarosio 500 mM e inibitori della proteasi, agitato e mantenuto in ghiaccio per 15 min. Dopo centrifugazione a 13000 rpm per 10 min a 4 °C, il supernatante rappresentava la frazione citoplasmatica. Il pellet à ̈ stato poi lavato due volte con un tampone di lavaggio dei nuclei contenente Hepes 10 mM pH 8, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA pH 8 e 25% glicerolo. La frazione proteica nucleare à ̈ stata ottenuta dopo centrifugazione a 13000 rpm per 10 min a 4 ° C e incubazione del pellet per 15 min a 4 ° C con un tampone contenente Hepes 10 mM pH 8, 350mM NaCl, 0,1 mM EDTA pH 8 e 25% glicerolo. L'efficienza di frazionamento à ̈ stata analizzata mediante immunoblotting usando un anticorpo anti-β-tubulina come marcatore citoplasmatico e un anticorpo anti-lamina B come marcatore nucleare.

Trasfezione cellulare e doppio saggio con luciferasi reporter

Cellule MCF-7 sono state seminate su piastre da 24 pozzetti ad una densità di 2x10<5>cellule/pozzetto e co-trasfettate con 1 Î1⁄4g del costrutto ERE-LUC (elemento responsivo agli estrogeni contenente il gene reporter per la luciferasi di lucciola) (Addgene) e 300 ng del plasmide pRL-TK (luciferasi di renilla) di controllo per la normalizzazione della efficienza della trasfezione. Le trasfezioni sono state eseguite usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore. Dopo 6 h, le cellule sono state trattate con KGF o E2. Le attività di luciferasi sono state determinate con doppio sistema di saggio con luciferasi reporter (Promega) 24 h dopo il trattamento, secondo il protocollo del produttore. Tutte le trasfezioni sono state condotte in triplicato.

Studi reologici di Pluronic F127

Pluronic F127 (PEO100-PPO65-PEO100) (PM ≈ 12600), un polimero sintetico anfifilico formato da ossido di polietilene e ossido di polipropilene, quando disciolto in acqua ad alte concentrazioni (> 15%), ha la caratteristica di essere liquido a temperature inferiori a 25 °C e acquisisce la consistenza di un idrogel a temperature più alte. Per dimostrare la transizione soluzione-gel che avviene con l'aumento di temperatura, à ̈ stato eseguito uno studio reologico di una soluzione di F127 (cP = 20% p / v in H2O) riscaldandola ad una velocità di 2 °C/min, da 10 a 40 °C, e misurando in questo rampa di temperatura il valore di G' (modulo elastico) e G'' (modulo di perdita): questi parametri descrivono rispettivamente la capacità di immagazzinare e dissipare l'energia, e sono descrittivi della natura elastica o viscosa di un materiale. Specificamente, una sostanza allo stato liquido à ̈ caratterizzata da valori di G'' superiori a quelli di G', e viceversa, una sostanza in gel possiede valori di G'' inferiori a quelli di G'.

Test di rilascio in vitro di Pluronic F127

Per il test di rilascio in vitro sono state utilizzate due molecole modello: mioglobina, una proteina idrofila di PM paragonabile al KGF, e prednisolone, un ormone lipofilo caratterizzato da una struttura chimica simile a quella di E2. 2 mL di idrogel caricati contenenti 4 mg di mioglobina o prednisolone in una soluzione di Pluronic F127 al 20% p/v sono stati introdotti in un sacchetto con membrana di dialisi (MWCO 3500 Da) e il sacchetto da dialisi sigillato all'estremità à ̈ stato incubato in 60 mL di mezzo di rilascio (acqua distillata) a 37 ° C e agitato ad una velocità di 50 rpm. Condizioni di saturazione sono state evitate tramite sostituzione frequente di acqua dolce. Ad intervalli di tempo predeterminati, aliquote di 0,5 mL di mezzo di rilascio sono state prelevate e sostituite con un volume uguale di soluzione fresca. Il comportamento di rilascio in vitro di idrogel caricati con mioglobina à ̈ stato confrontato con quello di idrogel caricati con prednisolone. Tutti i saggi sono stati eseguiti in triplicato. Profili di rilascio sono stati espressi in termini di percentuale di rilascio cumulativo in funzione del tempo.

Animali

Il ceppo di topi CD1 à ̈ stato utilizzato in questo studio (Charles Rivers). I topi sono stati tenuti in una struttura standard per animali da laboratorio con illuminazione (12 h/giorno) e temperatura (25 ± 1 °C) controllate ed à ̈ stato dato loro cibo e acqua ad libitum. Tutti i protocolli sperimentali che coinvolgono animali erano conformi alle Linee Guida dell’Università Sapienza per la cura e l’uso degli animali da laboratorio e sono state approvate dal Comitato Etico della presente istituzione. 40 topi di sesso femminile sono stati sottoposti ad ovariectomia, al fine di indurre atrofia vaginale, ed à ̈ stata somministrata loro una dieta Altromin C1000 senza fitoestrogeni (Altromin, Lage, Germania) per tutta la durata degli esperimenti. Dopo 30 giorni i topi sono stati trattati localmente introducendo giornalmente nel canale vaginale 25 Î1⁄4l di idrogel caricato con KGF (10 o 30 ng/die) o con E2 (30 ng/die o 1 Î1⁄4g/die). Un gruppo di controllo era rappresentato da topi non ovariectomizzati, e un gruppo di topi ovariectomizzati à ̈ stato trattato solo con idrogel. Dopo 60 giorni di trattamento, i topi sono stati sacrificati e le vagine sono state subito espiantate, fissate in formalina e processate per l'analisi istologica.

Istologia

Sezioni seriali della mucosa vaginale ottenute dai quattro gruppi di topi sono state colorate con ematossilina/eosina, montate in modo permanente sotto un vetrino e analizzate istologicamente. Lo spessore e gli strati di cellule epiteliali della vagina sono stati determinati in tre animali per ogni gruppo, in tre immagini per ciascun animale (ingrandimento 10x). Valori medi sono stati ottenuti da cinque misure di ciascuna immagine. Al fine di quantificare lo spessore dell'epitelio vaginale, la distanza verticale tra la superficie inferiore delle cellule nello strato basale e la superficie apicale delle cellule nello strato superficiale à ̈ stata misurata con l'aiuto di NIH Image J v1.56 (National Institutes of Health, Bethesda, MD), e designata come spessore. Per stimare il numero di strati dell'epitelio vaginale, lo strato di cellule che copriva cinque cellule basali contigue à ̈ stato contato nel campione stesso.

Immunoistochimica

Sezioni seriali della mucosa vaginale ottenute dai quattro gruppi di topi sono state analizzate per l'espressione di PCNA (un marcatore di proliferazione cellulare) mediante immunoistochimica. Le sezioni sono state elaborate utilizzando la tecnica del complesso avidina-biotina perossidasi (DAKO, Glostrup, Danimarca) e incubate con anticorpo monoclonale anti-A-rat-PCNA di topo (clone P10, 1:4000) (Abcam, Cambridge, UK), che riconosce cellule proliferanti.

Saggio Immuno-Assorbente legato ad un Enzima (ELISA)

Le concentrazioni di E2 e KGF nel siero di topi trattati sono state misurate utilizzando kit ELISA standard (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA). La sensibilità del saggio ELISA era ≥ 10 pg / mL. Preparazioni standard di E2 o KGF sono state usate come controlli interni. I valori sono presentati come media ± deviazione standard.

Analisi statistica

Ciascuna serie di esperimenti à ̈ stata ripetuta almeno in triplicato, e i valori di deviazione standard sono stati calcolati. Il t-test di Student a due code à ̈ stato utilizzato per l'analisi statistica, e i valori p (p-values) inferiori a 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.

Risultati

Comparazione dell’efficacia del KGF e dell’E2 nell’induzione della proliferazione dell’epitelio vaginale in vitro

Allo scopo di verificare la possibilità di utilizzare il KGF come mezzo terapeutico alternativo alla somministrazione di estrogeni, abbiamo dapprima confrontato l’effetto di KGF ed E2 sull’epitelio vaginale ricostruito in vitro a partire da biopsie del vestibolo vaginale. La possibilità di ricostruire in vitro lembi di mucosa vaginale à ̈ derivata dall’esperienza, ormai consolidata dagli autori, nella ricostruzione di neovagina autologa in pazienti con sindrome di Mayer von-Rokitansky Kuster Hauser (Panici et al., 2007). Per lo studio sono state arruolate 20 pazienti in pre-menopausa e 16 in post-menopausa, operate per patologie non correlate, da cui abbiamo potuto prelevare, dopo consenso informato, biopsie di mucosa vaginale dalle quali abbiamo ottenuto colture cellulari primarie. Per ciascuna paziente, abbiamo sottoposto la coltura di mucosa vaginale ottenuta in vitro a trattamento con diverse dosi di E2, KGF o una combinazione dei due, allo scopo di confrontare i loro effetti in termini di proliferazione cellulare (valutata mediante tecniche di immunofluorescenza), determinando la percentuale di cellule positive per l’antigene Ki67, un marker delle cellule ciclanti. La capacità proliferativa del KGF e quella dell’E2 sono state confrontate attraverso la realizzazione di una curva doserisposta (Figura 1A). I risultati ottenuti hanno indicato un’efficacia in termini di proliferazione cellulare dell’E2 di poco maggiore (1.2 fold increase) rispetto al KGF, ma solo a basse dosi (0,5 ng/ml). Alle dosi comunemente utilizzate in letteratura (20 ng/ml per il KGF e 2.7 ng/ml per l’E2), l’effetto proliferativo del KGF à ̈ risultato assolutamente paragonabile a quello dell’ormone. I dati ottenuti dai due gruppi di pazienti, pre- e postmenopausa, sono stati analizzati separatamente per determinare eventuali differenze nell’efficacia del trattamento con E2 o KGF. Nonostante una differenza nei livelli basali di proliferazione (più alti nelle cellule di pazienti giovani e più bassi in quelle di pazienti in post-menopausa) i risultati indicano che, in entrambe le popolazioni, il KGF à ̈ stato in grado di stimolare la proliferazione dell’epitelio vaginale in misura paragonabile a quella dell’estradiolo (Figura 1B).

In un altro set di esperimenti à ̈ stato analizzato l’effetto combinato di entrambi i fattori, KGF ed E2, ma non à ̈ stato evidenziato effetto sinergico né additivo (Figura 1C).

Parallelamente, cellule di mucosa vaginale di entrambi i gruppi sono state sottoposte a un pretrattamento con tamoxifene, per verificare l’effetto di questo farmaco chemioterapico sulla proliferazione indotta da KGF o estrogeni. I dati ottenuti, sia mediante immunofluorescenza con anti-Ki67 che mediante colorazione delle cellule vitali con Crystal Violet, hanno dimostrato che, mentre l’effetto proliferativo dell’E2 à ̈ inibito dalla presenza di tamoxifene, il KGF à ̈ in grado di stimolare la proliferazione cellulare anche in presenza di tamoxifene (Figura 1D). Tale evidenza suggerisce che il KGF potrebbe risultare efficace nel trattamento di disturbi post-menopausa anche in pazienti oncologiche sottoposte a chemioterapia con tamoxifene per la cura di tumori estrogeni-sensibili, che implica in queste pazienti l’inefficacia del trattamento locale con estrogeni.

Analisi del cross-talk fra la via di trasduzione del segnale attivata da E2 e KGF Indicazioni dell’esistenza di un cross-talk fra la via di signaling del recettore per gli estrogeni e quella dei recettori tirosina-chinasi erano state ottenute in precedenza per l’EGF/EGFR e per l’IGF-IR. Abbiamo pertanto analizzato, in un modello cellulare rappresentato dalla linea cellulare di carcinoma mammario MCF-7, esprimente sia KGFR che il recettore per gli estrogeni ER alfa, il potenziale cross-talk tra la via del segnale attivata dagli estrogeni e la via del segnale mediata dal legame KGF/KGFR. È noto che gli estrogeni sono regolatori della crescita e del differenziamento in un’ampia gamma di tessuti bersaglio, compresi gli organi riproduttivi, la ghiandola mammaria, il sistema nervoso, il sistema cardiovascolare e scheletrico. Essi sono anche coinvolti in molti processi patologici, in particolare il tumore al seno e tumori endometriali. Gli effetti biologici degli estrogeni sono principalmente mediati dal legame e dall'attivazione di ERα, ER beta e del recettore GPER. ERa e ERb regolano la trascrizione interagendo con gli elementi responsivi agli estrogeni (ERE) localizzati all’interno del promotore dei geni bersaglio. Oltre a questa, definita via “genomica†o via classica, negli ultimi anni si à ̈ avuta una crescente evidenza che le risposte biologiche agli estrogeni possano essere mediate da segnali iniziati a livello della membrana, che innescano una rapida trasduzione intracellulare, attivando la via del segnale come quella delle MAPK o di PI3K/Akt. Tali segnali vengono indicati come via “non genomica†dell’ER. In particolare, questa via risulta responsabile di rapidi effetti indotti dagli estrogeni, tra cui la transattivazione del recettore per il fattore di crescita epidermico (EGFR) e la stimolazione della trascrizione del gene per l’IGF-IR.

Per verificare il livello di attivazione delle vie del segnale coinvolte nella via non genomica da parte di E2 e KGF, abbiamo investigato l’attivazione delle MAPK ERK1 e 2 in cellule MCF-7, in cui abbiamo dimostrato la consistente e costante attivazione delle MAPK indotta da KGF dopo 5 e 30 minuti di trattamento, mentre dopo trattamento con E2 à ̈ stato rilevato un incremento nei livelli di fosforilazione di ERK1 e 2 meno consistente e limitato ai 5 min di trattamento, mentre a tempi più prolungati (30 min), l’attivazione di ERK1 e 2 risulta essere ridotta notevolmente (Figura 2A). Quindi siamo andati ad analizzare l’attivazione di un’altra via non genomica degli estrogeni, quella di p38. Anche in questo caso, à ̈ risultato come entrambi i trattamenti fossero in grado di fosforilare la proteina p38 (Figura 2B). Sono stati poi condotti esperimenti volti ad approfondire l’attivazione della via PI3K/Akt, dopo trattamento con KGF o E2, al fine di verificare se anche questa via fosse attivata da entrambi i fattori e fosse quindi candidata a rappresentare un ulteriore punto di contatto fra la via degli estrogeni e quella del KGFR. A tale scopo à ̈ stata analizzata la fosforilazione di Akt. I risultati ottenuti hanno evidenziato un effetto analogo di KGF ed E2 nell’attivazione di Akt (Figura 2C). Ciò conferma che il cross-talk fra le due vie à ̈ a monte dell’attivazione di queste tre vie del segnale, e sembra suggerire una collaborazione fra i due segnali a livello della membrana plasmatica.

L’analisi dell’attivazione ligando-indipendente del recettore per gli estrogeni a seguito di trattamento con KGF, mediante Western blot con anticorpi specifici in grado di riconoscere la forma attiva del recettore (fosforilata in Ser118), ha dimostrato inoltre che il KGF à ̈ in grado di determinare, al pari dell’E2, la fosforilazione dell’ER alpha, confermando un ruolo diretto del KGF nella via non genomica degli estrogeni (Figura 2D).

Parallelamente allo studio della via di trasduzione del segnale, à ̈ stata effettuata anche un’analisi dei livelli di espressione del recettore KGFR in cellule MCF-7 trattate con E2. I risultati ottenuti mediante Western blot indicano chiaramente un incremento della proteina KGFR determinato dal trattamento con E2 (Figura 3A). L’analisi dell’mRNA cellulare effettuata mediante Real Time PCR mostra inoltre una sovra regolazione dell’espressione di KGFR dopo trattamento con E2 (2,2 fold increase) (Figura 3B) che, visto il ruolo del KGF/KGFR nell’attivazione della via non genomica dell’ER, potrebbe rappresentare un meccanismo importante per incrementare l’effetto degli estrogeni sul tessuto epiteliale. La via genomica, invece, prevede che l’ERalpha, una volta attivato dal suo ligando E2 traslochi nel nucleo, dove agisce stimolando la trascrizione dei suoi geni bersaglio mediante il legame a sequenze ERE. Per verificare se il KGF stimolasse anche la via genomica degli estrogeni, abbiamo effettuato esperimenti di frazionamento nucleocitoplasma su lisati di cellule MCF-7 trattate con E2 o KGF a vari tempi, seguiti da Western blot con anticorpi anti-ER su entrambe le frazioni. La purezza delle due frazioni à ̈ stata controllata utilizzando come controllo una proteina espressa esclusivamente nel citoplasma (la tubulina) ed una espressa invece nel nucleo (la lamina B). I risultati hanno dimostrato che in assenza di trattamento l’ER à ̈ distribuito in maniera uniforme nelle due frazioni, mentre dopo trattamento con E2 già dopo 5 minuti si ha una drammatica ridistribuzione dell’ER nel nucleo, con una notevole riduzione della sua quantità nella frazione citoplasmatica. Il trattamento con KGF, alle stesse dosi e agli stessi tempi, non sembra invece in grado di determinare alcuna significativa ridistribuzione del recettore nel nucleo (Figura 4A). Per approfondire tali risultati e verificare l’effettiva localizzazione dell’ER dopo trattamento con KGF, sono stati effettuati esperimenti di immunofluorescenza con un anticorpo specifico. L’analisi à ̈ stata effettuata mediante microscopia a fluorescenza con modulo Apotome, per ottenere sezioni ottiche e poter identificare la localizzazione di più segnali. In particolare l’analisi, effettuata marcando il citoscheletro cellulare con Falloidina-TRITC, il nucleo con DAPI e l’ER con un anticorpo specifico seguito da un anticorpo secondario FITC, ha consentito di evidenziare lo spostamento dell’ER nel nucleo dopo trattamento con E2 (confermando i dati del frazionamento nucleo-citoplasma), ma anche di identificare una inattesa localizzazione dell’ER sulla membrana plasmatica dopo trattamento con KGF (Figura 4B).

A questo punto l’ipotesi formulata à ̈ stata quella di un contatto diretto fra KGFR ed ER a livello della membrana plasmatica, mediato da KGF, che quindi agirebbe spingendo l’ER verso la via non genomica.

Per confermare che il KGF agisce esclusivamente mediante la via non genomica, abbiamo effettuato un saggio di transattivazione in vitro con un plasmide contenente una sequenza di tre elementi responsivi agli estrogeni (ERE), sequenze di DNA alle quali si lega l’ER, presenti sui geni attivati dal trattamento con estrogeni, legate al gene per la luciferasi. Questo set di esperimenti mostra che solo l’E2, e non il KGF, à ̈ in grado di determinare l’attivazione di tale costrutto, confermando l’assenza di stimolazione della via genomica degli estrogeni da parte di KGF (Figura 5).

Pertanto, tutte le indicazioni ottenute su modelli in vitro hanno supportato l’ipotesi iniziale di un utilizzo del KGF alternativo alla terapia ormonale. Infatti, il KGF à ̈ attivo quanto l’E2 nello stimolare la proliferazione dell’epitelio vaginale, inoltre non perde di efficacia in caso di cotrattamento con tamoxifene e infine non stimola la via genomica degli estrogeni, che à ̈ la principale responsabile degli effetti sistemici del trattamento con E2, in primo luogo l’aumento di incidenza di tumori della mammella e dell’endometrio.

Analisi dell’effetto di E2 e KGF in un modello animale di topi ovariectomizzati I risultati ottenuti in vitro sono stati poi trasferiti in vivo attraverso uno studio condotto su un modello animale, in cui à ̈ stato valutato l’effetto della somministrazione locale di KGF sull’atrofia vaginale. Il protocollo, che ha avuto l’approvazione dal Ministero del Lavoro, della Salute e delle Politiche Sociali, Dip. della Sanità Pubblica e Veterinaria, Nutrizione e Sicurezza degli Alimenti, Direzione Generale della Sanità Animale e del Farmaco Veterinario, a seguito di presentazione del progetto di ricerca per l’impiego degli animali in sperimentazione ai sensi del decreto legislativo 116/92, à ̈ stato condotto su un ceppo base CD1 di topi femmine. A tale scopo sono stati confrontati 10 topi femmine di due mesi in età fertile non trattati con 40 topi femmine dello stesso ceppo ed età ovariectomizzati (Figura 6A).

Dopo 30 gg dall’ovariectomia si à ̈ proceduto a controllare che i valori di E2 in circolo fossero crollati nelle 40 topine operate. Tutti gli animali arruolati nel progetto di studio sono stati nutriti con una dieta speciale priva di estrogeni (Dieta Speciale Altromin C1000 Fitoestrogen Free diet). I topi ovariectomizzati sono stati divisi in gruppi di 8 ciascuno: un gruppo non ha ricevuto alcun trattamento; un gruppo ha ricevuto solo il veicolo, un gruppo il veicolo+E2 30 ng/die; un gruppo il veicolo+E2 1 ug/die; un gruppo il veicolo+KGF 10 ng/die; un gruppo il veicolo+KGF 30 ng/die.

Valutazione dell’efficacia del veicolo utilizzato

Allo scopo di ottenere un unico veicolo che consentisse il rilascio del KGF e dell’E2, la matrice selezionata per lo studio à ̈ stata il Pluronic F127, un polimero sintetico anfifilico a blocchi, costituito da 2 blocchi di polietilenossido (PEO) intervallati da un blocco di polipropilenossido (PPO). Tale polimero ci à ̈ sembrato rispondere perfettamente allo scopo in quanto à ̈ in grado di rilasciare due diverse sostanze: una proteina idrofila (KGF) ed un ormone lipofilo (E2). Il polimero, già ampiamente usato nel campo biomedicale (guarigione delle ferite, ingegneria dei tessuti, antiaderenziale in ambito chirurgico) grazie alla sua biocompatibilità, solubilizzato in acqua ad alte concentrazioni (c 15% w/v) ha la densità di un liquido a basse temperature, permettendo così di diluirvi in maniera omogenea le sostanze da utilizzare per i trattamenti, ma assume la densità di un idrogel a temperature superiori (T>25°C), consentendo l’applicazione locale. Prima di utilizzare tale sostanza, abbiamo effettuato uno studio comparativo al fine di verificare che la veicolazione dell’E2 e del KGF, nonché la loro cinetica di rilascio nel trattamento in vivo sulle vagine dei topi, fosse paragonabile.

Per dimostrare la transizione soluzione-gel che avviene con l’aumento della temperatura, abbiamo effettuato uno studio reologico di una soluzione di Pluronic F127 (cP = 20% w/v in H2O) riscaldandola alla velocità di 2 °C/min, da 10 a 40 °C, e misurando durante questa rampa di temperatura il valore di G’ (modulo elastico) e di G’’ (modulo viscoso): tali parametri descrivono rispettivamente la capacità di immagazzinare e di dissipare l’energia, e sono quindi descrittivi della natura elastica o viscosa di un materiale. Nello specifico, una sostanza allo stato liquido risulta caratterizzata da valori di G’’ superiori a quelli di G’; al contrario, una sostanza allo stato gel possiede valori di G’’ inferiori a quelli di G’ (Figura 6B). Il campione F12720% risulta essere una soluzione a T inferiori ai 25°C; tra i 25 e i 28°C si osserva una transizione del materiale, che diventa via via più elastico, fino a divenire idrogel a temperature superiori ai 28°C. E’ quindi possibile conservare la soluzione polimerica in frigorifero, prelevarla comodamente con una pipetta e applicarla poi in situ, ove diventa istantaneamente gel a temperatura corporea.

Per confrontare la cinetica di rilascio di entrambe le molecole (KGF ed E2) sono state impiegate due molecole modello, la Mioglobina (MGB), una proteina idrofila di PM paragonabile al KGF (PMMGB=16700, PMKGF=19000) ed il Prednisolone, un ormone lipofilo caratterizzato da una struttura chimica simile all’estradiolo (Figura 6C). Gli idrogel caricati sono stati preparati solubilizzando a freddo, in una fiala da 5 ml, una quantità esatta di molecola modello (ca.4-5 mg) in 2 ml di soluzione di F12720% w/v; la soluzione à ̈ stata poi portata allo stato di idrogel ponendo la fiala chiusa ermeticamente a 37°C. Successivamente, la fiala, chiusa in testa con una retina forata, à ̈ stata inserita nel mezzo di rilascio (60 ml H2O bidistillata, T = 37°C), e mantenuta sotto costante e blanda agitazione: il rilascio à ̈ avvenuto quindi mediante diffusione dalla superficie superiore del gel al mezzo di dissoluzione. Periodicamente, aliquote del mezzo (V=2ml) sono state prelevate e sostituite con un ugual volume di H2O: i dati di rilascio hanno tenuto conto di questi effetti di diluizione. Il rilascio à ̈ risultato pressoché identico per le due diverse molecole: questo à ̈ indice del fatto che il Pluronic consente la stessa tipologia di rilascio sia per le molecole lipofile che per quelle idrofile (Figura 6D). Il rilascio delle molecole modello à ̈ inoltre risultato praticamente totale nell’arco delle 24 ore.

Alla fine del trattamento giornaliero, che ha avuto la durata di 60 giorni, gli animali sono stati sacrificati per valutare il trofismo dell’epitelio vaginale dopo trattamento. Al termine del trattamento sono stati eseguiti prelievi di sangue da tutti gli animali, per valutare i livelli sierici di E2 e KGF. La valutazione mediante saggio ELISA ha permesso di verificare che il KGF, non passando la barriera delle membrane cellulari, non era rilasciato nel circolo sanguigno, a differenza dell’E2 che raggiungeva la circolazione sistemica già con il trattamento a basse dosi (Figura 7A).

Gli animali sono stati sacrificati e le vagine sono state prelevate e immediatamente fissate in formalina e processate per l’istologia. L’epitelio vaginale dei topi trattati à ̈ stato analizzato istologicamente mediante ematossilina/eosina, e confrontato con l’epitelio del gruppo di topi non sottoposti a ovariectomia (Figura 7B, 8A). I criteri adottati per determinare il trofismo della mucosa vaginale sono stati lo spessore (evidenziato sia contando numero di strati epiteliali presenti, sia mediante misurazione dello spessore dell’epitelio in Î1⁄4m, sia mediante il rapporto fra area dello strato epiteliale e lunghezza della membrana basale) (Figura 8B) e la capacità proliferativa dei cheratinociti (determinata mediante analisi dell’espressione di PCNA, marcatore della proliferazione cellulare) (Figura 9).

In conclusione, il KGF si à ̈ dimostrato molto efficace sia in vitro che in vivo nella stimolazione della proliferazione dell’epitelio vaginale. Pertanto riteniamo che il KGF possa rappresentare una nuova possibile strategia terapeutica nel trattamento dell’atrofia vaginale post-menopausa, che da una parte manterrebbe tutta l’efficacia dei trattamenti ormonali attualmente in uso, riducendone però i rischi.

Claims (11)

1. RIVENDICAZIONI 1. Il fattore di crescita dei cheratinociti (KGF/FGF7) per uso nel trattamento di condizioni di atrofia vaginale, disuria, dolore vaginale e/o secchezza vaginale indotte da uno stato di post-menopausa, da un intervento chirurgico, da una patologia e/o da trattamenti chemioterapici o radioterapici.
2. 2. Il fattore di crescita dei cheratinociti per uso secondo la rivendicazione 1, in cui il fattore di crescita dei cheratinociti stimola la proliferazione dell’epitelio vaginale.
3. 3. Il fattore di crescita dei cheratinociti per uso secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui l’intervento chirurgico comprende l’asportazione di cancro dell'endometrio, incluso quello pelvico, o una linfoadenectomia para-aortica.
4. 4. Il fattore di crescita dei cheratinociti per uso secondo una delle rivendicazione da 1 a 3, in cui il trattamento comprende brachiterapia vaginale adiuvante.
5. 5. Il fattore di crescita dei cheratinociti per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il chemioterapico à ̈ il tamoxifene o un farmaco antitumorale appartenente alla famiglia dei modulatori selettivi del recettore degli estrogeni.
6. 6. Composizione farmacologica comprendente il fattore di crescita dei cheratinociti e eccipienti farmaceuticamente accettabili per uso nel trattamento di condizioni di atrofia vaginale, disuria, dolore vaginale e/o secchezza vaginale indotte da uno stato di post-menopausa, da un intervento chirurgico, da una patologia e/o da trattamenti chemioterapici o radioterapici.
7. 7. La composizione farmacologica secondo la rivendicazione 6 per somministrazione topica.
8. 8. La composizione farmacologica secondo la rivendicazione 6 o 7 in cui il fattore di crescita dei cheratinociti à ̈ ad una concentrazione da 1 a 100 Î1⁄4g/ml.
9. 9. La composizione farmacologica secondo la rivendicazione 8 in cui il fattore di crescita dei cheratinociti à ̈ ad una concentrazione di 50 Î1⁄4g/ml.
10. 10. La composizione farmacologica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 6-9 comprendente inoltre un agente gelificante.
11. 11. La composizione farmacologica secondo la rivendicazione 10, dove l’agente gelificante à ̈ Pluronic F127.