KR20070031871A - Ｅｇｆ 수용체 에피토프 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Ｅｇｆ 수용체 에피토프 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반적으로 성장 인자 수용체 에피토프 펩타이드, 구체적으로 EGF 계열 수용체 에피토프 펩타이드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항종양 또는 항암 활성이 있는 항체 생산이나 면역학적 반응의 자극에 사용되는 상기 수용체 펩타이드의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 수용체 펩타이드에 대해 특이적으로 지시된 항체에 관한 것이다. 또한, 면역 반응의 발생 방법 및 종양 및 암 치료 방법도 제공한다.
성장 인자 수용체, 에피토프 펩타이드. EGF 계열 수용체, 항체 생산, 면역 치료

Description

ＥＧＦ 수용체 에피토프 펩타이드 및 이의 용도{EGF Receptor epitope peptides and uses thereof}
본 발명은 일반적으로 성장 인자 수용체 에피토프 펩타이드, 구체적으로 EGF 계열 수용체 에피토프 펩타이드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 수용체 펩타이드를 항종양 또는 항암 활성이 있는 항체의 생산에 또는 면역 반응을 자극하는 데 사용하는 상기 수용체 펩타이드의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 수용체 펩타이드에 대해 특이적으로 지시된 항체에 관한 것이다.
치료 표적인 표피 성장 인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor: EGFR) 및 탈2-7 EGFR
암의 면역요법적 치료는 수술, 방사선요법 및 화학요법과 같은 전통적인 치료법에 비해 이점이 있는데, 이는 질병의 표적에 대한 특이성이 높을 수 있다는 점이다. 종양 특이적 mAb는 암 세포를 표적화하는 사용될 수 있지만, 종양 관련 항원을 잠재 표적으로서 동정하고 위치를 찾아야 할 필요를 창출한다. EGFR, IL-2 수용체 및 p185 HER2와 같은 성장 인자 수용체의 과잉발현은 폐, 유방, 두경부 및 난소 종양과 같은 종양과 종종 관련이 있다.
EGFR은 티로신 키나제 성장 인자 수용체 단백질 계열에 속한 것이다. EGFR은 오랫동안 연구 과제가 되었고, 최근 세포외 도메인(Ogiso H et al. Cell 2002, 110:775-787; Garrett TP et al. Cell 2002, 110:763-773; Ferguson KM et al. Cell 2003; 11:507) 및 세포내 키나제 도메인(Stamos J et al. J.Biol.Chem.2002, 277:46265-46272)의 구조 결정 연구가 성공적으로 수행되었다. 이 연구는 수용체와 이의 리간드의 행태에 중대한 정보를 제공했다. EGFR은 세포 표면 관련 분자로서, 고도 특이적 리간드, 예컨대 EGF 및 형질전환성 성장 인자 알파(TGF α)의 결합을 통해 활성화된다. 리간드 결합 후, 수용체는 이량체화되어 세포내 티로신 키나제 영역이 인산화된다. 이것은 하류 시그널링을 유도하고 캐스케이드 반응을 활성화시켜 세포를 성장 및 증식시킨다. 정상 세포와 달리 종양 세포가 기능이 EGFR에 의존적이라면, 세포의 증식과 분화에 관한 EGFR의 조절성 제어를 억제할 가능성의 범위로 인해 수용체는 치료의 공통 표적이다. EGFR은 간과 피부에서 보통 발현되며, 종종 두경부암, 결장직장암, 췌장암, 신경아교종, 방광암 및 폐암과 같은 고형암에서 활성 증가가 발견되는 바, 예후성 마커로서 유용하다. EGFR의 과잉발현은 종양에 자가분비 루프 성장을 유리하게 하는 TGF α 생산의 증가를 종종 동반한다. 또한, 일부 종양에서 관찰되는 EGFR 유전자 증폭 및 재배열은 EGFR의 돌연변이 형태의 발생과 종종 관련이 있다는 것이 발견되었다(Libermann TA, et al Nature 1985, 313:144-147; Wong AJ, Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 2965-2969; Frederick L, et al. Cancer Res 2000, 60: 1383-1387). 가장 일반적인 돌연변이체 중 하나는 EGFR 변형체(EGFRvIII 또는 탈2-7EGFR)이다. 탈2-7EGFR은 엑손 2-7이 결실된 전사체의 과잉발현에 대응하는 801개 염기쌍의 프레임내(in-frame) 결실, 및 세포외 도메인 중 아미노산 잔기 6-273의 상당한 결실이 있고, 접목 부위에 신규 글리신이 삽입된 것이다(Wong AJ et al. Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 2965-2969; Sugawa N. et al Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 8602-8606l Yamazaki H. et al Jpn J Cancer Res 1990, 81: 773-779; Ekstrand AJ et al. Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 4309-4313). 이러한 EGFR의 절두 형태는 리간드 결합에 의존적이지 않으며, 항상성으로 활성이다. 탈2-7EGFR은 대부분(>50%)의 악성 신경아교종에서 발현되며, 유방 암종(27%), 난소 암종, 전립선 암종 및 폐 암종(17%)과 탈2-7EGFR의 연관성이 있음도 보고되어 있다(Wong AJ, et al Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 2965-2969; Garcia dP et al Cancer Res 1993, 53: 3217-3220; Wikstrand CJ et al Cancer Res 1995, 55: 3140-3148; Moscatello DK et al Cancer Res 1995, 55:5536-5539).
항EGFR 항체
EGFR의 세포외 영역에 대한 항체의 생산에 초점을 둔 연구에는 다수가 있다. 생산된 mAb는 주로 리간드 결합을 차단하고 시그널링을 파괴하여 항종양 활성을 매개한다. 이러한 mAb에는 EGFR을 특이적으로 인식하는 펭 외 다수(Peng D et al., Cancer Res 1996, 56:3666-3669) 및 멘델슨 외 다수(Mendelson J Clin Cancer Res 1997, 3:2703-2707)에 의해 처음으로 개발된 몇 가지 mAb가 있다. Mab 425, 528 IgG2a 및 225 IgG1은 두경부 편평세포 암종 환자의 치료에 사용되었다(Sturgies EM, et al Otolaryngo. Head Neck Surg 1994, 111:633-643).
방사선표지를 수반하는 실험 연구에 따르면, mAb425는 신경아교종를 비롯한 종양 성장의 효과적인 억제제로 밝혀졌다(Rodeck U et al J Cell Biochem 1987, 35: 315-320; Brady LW et al Int J Radiat Oncol Biol Phys 1991, 22: 225-230; Faillot T et al Neurosurgery 1996, 39: 478-483). IMC-C225 mAb는 EGFR을 특이적으로 인식하며 두경부암, 결장직장암, 췌장암 및 폐암과 같은 암의 치료에 가능성이 상당하다. mAb255는 p27 K1P1을 상승조절하고 전립선암 세포주의 G1 정지를 유도한다. 그 후에, 치료 능력을 증대시키기 위하여 마우스 225 항체의 키메라 형태(ERBITUX™(Imclone Systems, NY) IMC-C225)가 개발되었다. IMC-C225는 EGFR의 결합 친화성을 증가시켰고 마우스에서 이종이식편 성장을 감소시키는데 더욱 효과적이었다. 마우스 항체와 키메라 항체는 방사선요법(Robert F et al J Clin Oncol 2001, 19:3234-3243) 또는 화학요법(Shin DM et al Clin. Cancer Res 2001, 7: 1204-1213)과 함께 복합 요법으로 처치 시 둘 다 더욱 더 효과적이었다. IMC-C225 작용의 치료 기작은 효과적인 수용체 차단 기능과 ADCC 특성을 포함하는 것으로 보인다. IMC-225는 환자의 종양 크기를 감소시킬 수 있다. 간 및 피부 결합 부위를 포화시키기 위해서는 다량의 IMC-C225가 요구되며, 주요 부작용은 여드름모양 발진 및 소양증이다. 임상 시험을 통해, 시스플라틴과 함께 처치 시 11 내지 22% 사이의 환자에서 종양 성장의 부분적 반응 속도가 관찰되었다. 이 항체의 임상전 및 임상적 진행은 베이즐가 외 다수(49) 및 멘델슨 외 다수(Baselga J et al. J Clin Oncol 2000, 18: 904-914; Mendelson J. J.Clin.Oncol. 2002, 20 Suppl 1: 1S-13S) 에 의한 검토에서 다루어진 바 있다.
mAb R3은 EGFR에 대하여 유발되었고 방사선면역요법용으로 처음 개발되었다(Waterfield MD, et al. J.Cell Biochem. 1982, 20: 149-161; Ramos-Suzarte M, et al. J.Nucl.Med. 1999, 40:768-775). R3의 키메라 형태 및 사람화된 형태가 모두 생산되었고 아프리카 녹색 원숭이에서 시험되었다. R3의 사람화된 형태는 마우스 항체와 동일한 결합 친화성을 보유했고, 키메라 항체보다 면역원성이 2배 낮은 것으로 발견되었다. 테크네튬 표지된 마우스 및 사람화된 mAb를 이용한 마우스 이종이식편의 임상전 시험은 쥐 형태보다 사람화된 형태가 진단 도구로서 유용성이 크다는 것을 보여주었다. 래트 항-EGFR mAb인 ICR62는 리간드 결합에 경쟁하면서 마우스에 있는 사람 종양 이종이식편(편평세포 암종)을 근절시키는데 효과적이다. I기 임상 시험의 보고에 따르면, 상기 항체가 편평세포 암종 환자에게 안전하게 투여되었고, 그 이후 두경부 편평세포 암종 세포주에서 성장 인자 수용체 및 이의 리간드의 시그널링 경로를 연구하는데 사용되었다(O-charoenrat P et al Clin.Exp.Metastasis 2000, 18:155-161; O-charoenrat P et al. Int.J.Cancer 2000, 86: 307-317; O-charoenrat P et al Oral Oncol. 2002, 38:627-640).
항EGFR mAb 108.4는 시스플라틴과 함께 투여했을 때 향상된 항종양 효과를 나타냈다(Aboud-Pirak E et al. J Natl Cancer Inst 1988, 80: 1605-1611). Fab 단편만으로도 동일한 결과가 나타났고, 이는 그 기작이 숙주 보체 시스템과 Fc의 상호작용에만 의존적인 것이 아님을 암시한다. 다른 예에 따르면, 항체와 수용체 사 이의 기본적인 기작을 규명하기 위하여 복합 치료의 가능성이 mAb RG 83852로도 조사되었다(Perez-Soler R et al J Clin Oncol 1994, 12: 730-739). 이것은 mAb RG 83852에 의한 EGFR의 상승조절이 종양에 존재하는 수용체의 티로신 키나제 활성을 증가시키며, 이로 인해 화학요법에 대한 감수성을 증가시키는 것으로 생각되었다. 모노클로날 항체에 의한 표적화된 방사선조사는 암 치료의 또 다른 시도이다. 신경아교종의 치료 시 몇몇 항EGFR 항체를 방사선표지하는 효과에 대한 다수의 연구가 칼로포노스(Kalofonos HP et al. J Nucl.Med. 1989, 30: 1636-1645)에 의해 수행되었다. 이 연구는 양호한 표적화 및 최소 독성을 보고했다. EGFR의 리간드 결합을 차단하는 사람화된 mAb EMD 72000은 현재 임상 시험 중에 있다(Bier H et al. Cancer Chemother. Pharmacol.2001, 47:519-524). 마지막으로, 유전자전이 마우스 유래의 완전 사람 항체 ABX-EGF도 역시 EGFR을 효과적으로 표적화한다(Yang XD et al. Crit.Rev.Oncol.Hematol. 2001, 38:17-23).
항 탈2-7 EGFR 항체
야생형 EGFR은 대부분의 상피 세포에서 발현되며, 이에 따라 치료적으로 수용체를 표적화하는 방법의 결점은 암세포뿐만 아니라 정상 조직에도 독성을 미치는 부작용이 있다는 점이다. 또한, 방사선 동형 또는 세포독성제와 접합시켰을 때, 상기 항체는 정상 조직에 잠재적인 해를 입힐 수 있다. 이상적인 것은 암 세포 상의 EGFR을 우선적으로 표적으로 한다면 바람직할 것이다. 탈2-7EGFR은 성체에 존재하는 암세포에 고도로 특이적이기 때문에 매력적인 치료 표적이다. 탈2-7EGFR에 대한 항체를 이용한 연구가 실시되었고, 여기서 암세포주의 세포 성장 억제가 관찰되었 다. mAb 528(Strugis EM et al, Otolaryngol.Head Neck Surg 1994, 111: 633-643; Masui H et al Cancer Res 1984, 44: 1002-1007) 및 425(전술한 것)는 모두 탈2-7EGFR 및 EGFR에 결합한다. 접목 부위에 글리신을 삽입시켜 만든 탈2-7EGFR의 고유 서열은 세포외 영역의 N-말단 부근에 위치한 신규 에피토프를 생산했다(Humphrey PA et al. Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 4207-4211; Lorimer IA et al Clin Cancer Res 1995, 1: 859-864). 융합 이음부에 특이적인 몇몇 항체로서 mAb Y10(Wikstrand CJ et al Cancer Res. 1995, 55: 3140-3148; Okamoto S et al. Br.J Cancer 1996, 73: 1366-1372; Sampson JH et al. Proc Natl Acad Sci USA 2000, 97: 7503-7508) 등이 생산되었다. 이 항체는 마우스의 뇌종양 이종이식편을 치료하는데 효과적으로 사용되었으며, 세포 성장 저하를 통해 기계작용적으로 기능하고 ADCC 및 CDC에 대한 역량도 나타냈다. 융합 이음부에 특이적인 서열의 펩타이드에 대하여 발생된 항체로는 파지 디스플레이법에 의해 발생된 Fv 단편인 MR1이 있다(Lorimer IA et al Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93: 14815-14820). Fv는 고형암 침윤능이 있어서, 면역독소 전달에 사용되고 있다. 탈2-7EGFR의 융합 이음부를 표적으로 하는 몇몇 항체는 방사선표지되었으며, 이 항체에는 L8A4, DH8.3 및 Ua30:2(Reist CJ et al Cancer Res 1997 57: 1510-1515; Hills D et al. Int J Cancer 1995, 63: 537-543; Ohman L et al. Tumour Biol 2002, 23: 61-69)가 있다. 방사선표지된 DH8.3 항체는 정상 EGFR이 아닌 탈2-7EGFR을 인식하며 누드 마우스의 종양 크기를 감소시킨다.
쥐 항EGFR 항체 mAb-806
쥐 모노클로날 항체 mAb-806(클래스 IgG2b)은 정상 발현되는 야생형 EGFR이 아닌 탈2-7EGFR에 결합하는 것으로 밝혀졌다(미국 특허 출원 USSN; Johns TG et al. Int J Cancer 2002, 98: 398-408). mAb-806은 정상 야생형 수용체와 반응하지 않지만, 증폭된 EGFR 유전자를 함유하는 종양 세포에 존재하는 일정 비율(약 10%)의 야생형 EGFR을 인식한다(Johns TG et al. Int J Cancer 2002, 98: 398-408; Luwor RB et al Cancer Res. 2001, 61: 5355-5361). 탈2-7EGFR 및 증폭된 야생형 EGFR 모두를 표적으로 하는 mAb-806의 능력은 둘 모두 종양에서 두드러진 빈도로 발생함으로 인해, 치료제로서 mAb-806을 사용하기 위해서는 추가 효과가 부여되어야 한다.
mAb-806은 탈2-7EGFR의 고유 융합 이음부를 인식하지 못한다는 점에서 탈2-7EGFR을 표적으로 하는 다른 항체와 상이하다(Wong AJ, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 2965-2969; Sugawa N. et al. Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 8602-8606; Yamazaki H, et al. Jpm.J Cancer Res 1990, 81: 773-779; Ekstrand AJ, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 4309-4313). mAb-806의 결합 에피토프는 야생형과 절두형 탈2-7EGFR 모두에 존재한다. mAb-806이 탈2-7EGFR 및 증폭된 EGFR에는 결합하고 정상 발현된 야생형 수용체에는 결합하지 않는 성질이 있다면 이 에피토프가 입체형태(conformation) 의존적인 것으로 추정되었다. 임상 개발에서 야생형 EGFR에 대한 많은 항체들은 리간드 결합을 차단시켜 기능한다. 이러한 기작은 mAb-806의 작용 기작으로 보이지 않는데, 그 이유는 mAb-806이 탈2-7EGFR 및 증폭된 EGFR의 비리간드 결합을 통해 결합하고 정상 수용체와 결합하지 않는 특 성 때문이다. 이것은 mAb-806이 리간드 결합 또는 이량체화를 방해하지 않는다는 것을 시사한다.
mAb-806 항체는 U87MG.탈2-7EGFR 세포주에서 발현되는 탈2-7EGFR에는 결합하지만, 미증폭 야생형 EGFR을 함유하는 모세포주(U87MG)에는 결합하지 않는다. mAb-806과 DH8.3 mAb의 효능을 비교해보면, mAb-806이 종양 표적화에 더욱 유효하며, DH8.3보다 더 강력한 결합을 형성하는 것으로 확인되었다(.EGFR Johns TG et al Int J Cancer 2002, 98:398-408). mAb-806은 증폭된 EGFR(Johns TG et al Int J Cancer 2002, 98:398-408) 뿐만 아니라 U87MG.탈2-7EGFR을 함유하는 A431 세포주를 사용한 경우 마우스 이종이식편의 성장을 용량 의존 방식으로 억제하는 것으로 관찰되었다. 역시 모 U87MG 이종이식편에서는 성장 억제가 관찰되지 않았다. 특히, U87MG.탈2-7EGFR, LN-Z308.탈2-7EGFR 및 A1207.탈2-7EGFR 이종이식편(모두 탈2-7EGFR을 발현한다)에 mAb-806을 투여한 경우, 두개골내 이종이식된 아교모세포종에 대해서도 종양 성장의 감소가 확인되었다(Mishima K et al Cancer Res. 2001, 61:5349-5354). 모 U87MG 종양, U87MG.DK 종양(키나제 결손성 탈2-7EGFR을 발현한다)의 이종이식편에서는 억제가 거의 관찰되지 않았고, U87MG 신경아교종에서는 약간의 반응만이 나타났다. 종양 성장의 감소와 동시에 혈관형성 감소 및 아폽토시스 증가도 나타났다.
고유 성질로 인해 mAb-806 항체는 두경부암 및 신경아교종과 같은 암의 치료에 촉망받는 치료제이다. 따라서 mAb-806의 사람화된 형태의 개발은 그 효능에 상당한 영향을 미칠 것이다. 이러한 항체는 HAMA 반응을 일으키지 않고, 작동인 자(effector) 기능을 점증시키는 능력을 향상시켜, 항체의 임상적 전망을 크게 증가시킨다.
초기에 이러한 mAb의 사용은 치료법상의 마술의 탄환으로서 기대가 컸지만, 몇가지 주된 장애가 사람을 제외한 동물 항체의 임상 용도를 제한한다는 것을 곧 깨닫게 되었다. 사람을 제외한 동물의 mAb는 다회 용량으로 투여하는 경우, 일반적으로 바람직하지 않은 면역 반응을 자극하며, 이는 치료제로서의 용도를 상당히 제한하는 것이었다. 마우스 항체는 사람 면역계에서 이종 단백질로서 인식되어 사람 항마우스 항체 반응, 즉 HAMA(human anti-mouse antibody) 반응으로 알려진 면역 효과를 일으킨다. 이러한 HAMA 반응은 항체 기능의 중화 및 심각한 알레르기 유사 반응을 일으킬 수 있다.
많은 HAMA 반응은 항원 결합부(Fab)에 대해 일어나며, 드물게는 항체의 불변 영역(Fc)에 대해 일어난다. 설치류 mAb의 임상 투여 시 초래되는 부가 문제점들은 Fc 영역과 관련이 있다. 사람 Fc는 특정 Fc 수용체에 결합하여, 혈중의 항체 유지를 돕는다. 결과적으로, 설치류 mAb의 반감기는 보통 1 내지 3일로, 1주 이상인 사람 Ig의 반감기에 비해 단축된다. 또 다른 단점은 사람 Fc 수용체에 Fc 결합 시 개시되는 다양한 작동인자 기능의 점증이 감소된다는 점이다. 특정 작동세포, 예컨대 대식세포, 단핵구 및 호중구 등의 Fc 수용체에 대한 결합은 항체 의존적 세포 매개 세포용해(ADCC)로 알려진 반응을 유도하는 면역계를 유발한다. Fc 수용체는 또한 보체 캐스케이드(일군의 상호작용 단백질)를 유발하여 보체 의존적 세포용해 반응(CDC)을 유도하는 데에도 책임이 있다. 이는 세포 용해를 초래하고 세균 감염에 싸우는 항체의 유효성을 증가시킨다. 불변 도메인의 종류는 주로 세포 용해 시 항체의 효능을 조절한다.
마우스 mAb의 면역원성을 극복하기 위하여 취할 수 있는 시도에는 여러 가지가 있는데, 그 예로는 항체 용량의 신속한 주입 및 항체 단편(예, 일본쇄 Fv(scFv))의 사용법이 있다(예컨대, Carter P Nat.Rev.Cancer 2001, 1:118-129; Hudson P et al Nature Med 2003, 9: 129-134 및 이 문헌들에 인용된 문헌). 또는 치료법에 완전 IgG를 사용할 때에는 HAMA 반응을 저하시키기 위하여 항체 공학법을 이용하고 있다. 이러한 시도는 반감기를 증가시키며 작동인자 기능을 더욱 효과적으로 점증시키는 추가적인 잠재적 이점을 제공했다. 이러한 인체화 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 미국 특허 5,225,539, 5,530,101, 5,585,089, 5,859,205 및 6,797,492에 설명되어 있다. 이 문헌들은 모두 본원에 참고인용되었다.
사람 항체
mAb의 면역원성 문제를 극복하기 위한 또 다른 시도는 완전(전체) 사람 항체를 생산하는 방법이다. 친화성 강화 방법을 사용하여 항원에 특이적으로 결합하는 일정 범위의 사람 항체를 선택하기 위하여 파지 디스플레이법을 사용할 수 있다(McCafferty J et al Nature 1990, 348: 552-554; Azzazy HM et al Clin. Biochem. 2002, 35: 425-445). 박테리오파지는 세균만을 감염시키는 바이러스로서, 대장균(Escherichia coli)에서 증식한다. 파지 디스플레이법은 파지 게놈에 사람 유전자 물질을 삽입하는 단계를 수반한다. 필라멘트형 파지 시스템은 파지 표면에 디스플레이(display)된 리간드의 구조 및 기능 정보(표현형)가 파지 게놈에 존재하는 리간드의 유전자 정보(유전자형)와 연관되는 독특한 성질을 갖고 있다. 따라서, Ig 분자의 라이브러리를 만들어, 필라멘트형 파지의 표면에 디스플레이되게 할 수 있으며, 이로써 결합 친화성을 나타내는 분자를 선발할 수 있다. 이 방법은 항원 친화성이 높은 다수의 항체를 매우 신속하게 동시에 선별할 수 있는 이점이 있다. 또한, 결합 화합력을 완전하게 보존하는데 필요한 잠재적으로 중요한 잔기의 세트를 포함하는 조합 라이브러리를 수득하여 항체 인체화에도 성공적으로 사용되었다. 이후 중요한 잔기의 랜덤 돌연변이유발에 의해서 최적의 프레임워크(framework)를 수득할 수 있다.
유전자전이 마우스
최근, 사람 mAb를 생산하는 파지 디스플레이법의 대안적 시도로서, 마우스 DNA에 사람 유전자를 삽입하여, 완전한 사람 단백질 서열을 생성할 수 있는 유전자전이 마우스를 창조하는 방법이 개발되었다(관련 방법의 검토를 위해 문헌, Little M et al Immunol.Today 2000, 21: 364-370; Humphreys DP et al Curr.Opin.Drug Discov.Devel. 2001, 4:172-185; Ishida T et al Nippon Rinsho 2002, 60: 439-444을 참조한다). 따라서, 이러한 마우스는 표적 항원으로의 면역화 반응에서 사람 항체를 생산할 수 있다. 생산된 항체는 사실상 사람 항체로서, 숙주 면역계에 의해 거부되지 않을 것으로 예상된다. 아브게닉스(Abgenix)에서 생산된 XenoMouse®는 사람 중쇄 유전자의 약 80%와 다수의 경쇄 유전자를 함유한다. 이 마우스에는 일정 범위의 질병을 표적 삼을 수 있는 여러 종류의 항체를 함유하는 여러 종의 마우스 가 있다(Yang XD et al Cancer Res 1999, 59:1236-1243; Davis CG et al Cancer Metastasis Rev 1999, 18: 421-425). 예컨대, ABX-MA1은 MCAM/MUC18(마우스에 존재하는 사람 흑색종 세포에서 종양 두께 및 전이와 관련 있는 당단백질)을 표적으로 하는 완전 사람 항체로서, 흑색종의 치료에 촉망받고 있다(Mills L et al. Cancer Res 2002, 62:5106-5114). ABX-EGF는 EGFR을 표적으로 하며, 현재 두경부암, 비소세포 폐암종 및 결장암의 치료를 위한 I/II기 임상 시험 중이다.
따라서, 선행 기술의 방법에 수반된 전술한 단점과 질병의 진단, 치료 및 예방에 사용되는 항체의 유용성 및 용도의 인식에서 보면, 당해 기술분야에서 사람화된/완전 사람 항체, 특히 EGF 수용체에 대해 지시된 상기 항체의 제조 및 사용에 대한 기술 개발이 여전히 필요하다는 것은 너무나 자명한 문제점이다. 특히, 사람 중에서 항체 면역 반응을 감소시키거나 전혀 일으키지 않는 것으로 입증되고 EGFR의 발암성 형태 또는 활성화된 형태뿐만 아니라 EGFR의 증폭된 형태 또는 과잉발현된 형태를 인식하는 사람화된/완전 사람 항체가 필요로 된다.
본 명세서에 기재된 참고 문헌들의 인용은 그 문헌들을 본 발명의 선행 기술로 인정하는 것이라고 해석해서는 안 된다.
발명의 요약
본 발명에 따라서, EGFR 항체 mAb806의 항종양 활성의 독특한 특이성과 방식을 이끄는 기작을 밝히기 위하여, mAb806의 EGFR 결합 에피토프를 측정했다. 에피토프 수용체 펩타이드 CGADSYEMEEDGVRKC(서열번호 1)는 mAb806 에피토프를 함유한 다. 이러한 수용체 펩타이드는 종양발생성, 과증식성 또는 비정상 세포에서 발견되고 정상세포 또는 야생형 세포(본 명세서에 사용된 "야생형 세포"란 용어는 내인성 EGFR은 발현하지만 탈2-7EGFR은 발현하지 않는 세포를 생각하는 것으로서, 구체적으로 EGFR 유전자를 과잉발현하는 세포를 제외한 세포이며; "야생형"이란 용어는 비정상세포 또는 종양발생성 세포가 아닌 정상 세포에 존재하는 유전자형 또는 표현형 또는 여타 특징을 의미한다)에서는 검출할 수 있거나 또는 전이할 수 있는 것이 아닌 EGFR 항체의 생산에 적합하다.
따라서, 본 발명은 수용체 항종양능 및 항종양활성이 있는 항체의 생산에 또는 항종양 반응인 면역 반응을 자극하는데 사용될 수 있는 수용체 에피토프, 구체적으로 성장 인자 수용체 에피토프를 제공한다. 성장 인자 수용체 에피토프는 성장 인자 수용체의 전이 형태로 노출되는 루프 에피토프를 포함하며, 상기 수용체의 전이 형태를 인식하는 항체를 생산할 수 있으며, 이를 이용하여 불활성 형태에서 활성 리간드 결합된 형태로의 변화를 비롯한 활성화를 방해하거나 억제하는 등을 통해 조절한다. 본 발명은 항종양능 및 항종양 활성이 있는 항체의 생산에 또는 항종양 반응인 면역 반응을 자극하는데 사용될 수 있는 수용체 에피토프, 구체적으로 EGF 계열 수용체 에피토프, 가장 구체적으로 EGFR 에피토프를 제공한다. 일반적인 관점에서, 본 발명은 종양발생성, 과증식성 또는 비정상 세포에서는 발견되지만 정상 세포 또는 야생형 세포에서는 검출할 수 있거나 전이할 수 있는 것이 아닌 수용체 에피토프, 구체적으로 EGF 수용체 에피토프 또는 EGF 수용체계 에피토프를 제공한다.
본 발명에 따르면, 항종양 활성이 있는 항체, 구체적으로 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 성장 인자 수용체 펩타이드, 구체적으로 EGFR 펩타이드가 제공된다.
본 발명에 따르면, 종양발생성, 과증식성 또는 비정상 세포에서 발견되나 정상 세포 또는 야생형 세포에서는 검출할 수 있거나 전이할 수 있는 것이 아닌 EGFR을 인식할 수 있는 항체를 생산할 수 있는 성장 인자 수용체 펩타이드, 구체적으로 EGFR 펩타이드가 제공된다.
이러한 본 발명의 성장 인자 수용체 펩타이드, 구체적으로 EGF 계열 수용체 펩타이드는 종래 공지된 성장 인자 수용체, 예컨대 EGFR의 항체들에서 관찰할 수 있는 정상 조직 흡수와 관련된 문제점 없이, 두경부암, 유방암, 폐암, 방광암, 결장암 또는 전립선암 및 신경아교종과 같은 다양한 종류의 종양을 동정하고, 특성 규명하며 표적화하는 진단 및 치료 용도를 제공한다.
가장 광범위한 관점에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 성장 인자 수용체 펩타이드의 아미노산 서열을 함유하는 분리된 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 분리된 펩타이드는 하나 또는 그 이상의 혼합물을 포함하는 것으로서, 성장 인자 수용체를 인식하고 항종양 활성이 있는 항체의 생산뿐만 아니라 암 또는 종양 질병이 있는 동물, 구체적으로 포유동물, 가장 구체적으로 사람의 면역화에 사용하기에 적합하다.
본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열에 기술된 아미노산 서열을 함유하는 분리된 수용체 폴리펩타이드 및 이의 면역원성 단편에 관한 것이다.
본 발명은 아미노산 서열 CGADSYEMEEDGVRKC (서열번호 1)를 갖는 분리된 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 아미노산 서열 CGADSYEMEEDGVRK (서열번호 2)를 갖는 분리된 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 아미노산 서열 CGPDYYEVEEDGIRKC (서열번호 3)를 갖는 분리된 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 아미노산 서열 CNTDTYEVEENGVRKC (서열번호 4)를 갖는 분리된 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 아미노산 서열 CGPDSYEVEEDGVRKC (서열번호 5)를 갖는 분리된 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 아미노산 서열 CSSDSYEVEEDGVRKC (서열번호 6)를 갖는 분리된 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 아미노산 서열 CGADSYEMEEDAVRKC (서열번호 7)를 갖는 분리된 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 아미노산 서열 CPLHNQEVTAEDGTQRC (서열번호 8)를 갖는 분리된 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 아미노산 서열 CPPDKMEVDKNGLKMC (서열번호 9)를 갖는 분리된 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 아미노산 서열 CPSSKMEVEENGIKMC (서열번호 10)를 갖는 분리된 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 아미노산 서열 CX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15(서열번호 11)를 갖는 분리된 펩타이드를 제공하며, 여기서 각 Xn 잔기는 다음과 같이 독립적으로 선택될 수 있다:
X1은 G, P, N 또는 S; X2는 A, P, T, S 또는 L; X3은 D, H 또는 S; X4는 S, Y, T, N 또는 K; X5는 Y, Q 또는 M; X6은 M 또는 V; X7은 E, T 또는 D; X8은 A 또는 결실; X9는 E 또는 K; X10은 D 또는 N; X11은 G 또는 A; X12는 V, I, L 또는 T; X13은 R, Q 또는 K; X14는 R, K 또는 M; X15는 C 또는 결실이다.
본 발명은 아미노산 서열 CX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15(서열번호 12)를 갖는 분리된 펩타이드를 제공하며, 여기서 각 Xn 잔기는 다음과 같이 독립적으로 선택될 수 있다:
X1은 G, P, N, Q, S 또는 T; X2는 A, P, T, S, L, M, V, I 또는 P; X3은 D, E, H, R, K, S 또는 T; X4는 S, Y, F, W, T, N, Q, K 또는 R; X5는 Y, F, W, Q, N, M, V, A, L, I 또는 P; X6은 M, V, A, L, I 또는 P; X7은 E, D, T 또는 S; X8은 A, V, L, I, P, M 또는 결실이며; X9는 D, E, K 또는 R; X10은 D, E, N 또는 Q; X11은 G, A, M, V, L, I 또는 P; X12는 V, I, L, M, A, P, S 또는 T; X13은 R, K, H, Q 또는 N; X14는 R, K, H, M, A, V, L, I 또는 P; X15는 C 또는 결실이다.
본 발명은 아미노산 서열 CX1X2X3X4X5EX6X7X8X9GX10X11X12C(서열번호 13)를 갖는 분리된 펩타이드를 제공하며, 여기서 각 Xn 잔기는 다음과 같이 독립적으로 선택될 수 있다:
X1은 G 또는 A; X2는 A 또는 K; X3은 D 또는 A; X4는 S 또는 A; X5는 Y 또는 A; X6은 M 또는 A; X7은 E 또는 A; X8은 E 또는 A; X9는 D 또는 A; X10은 V, A 또는 K; X11은 R 또는 A; X12는 K 또는 A이다.
본 발명은 아미노산 서열 CX1X2X3X4X5EX6X7X8DGVRKC(서열번호 14)를 갖는 분리된 펩타이드를 제공하며, 여기서 각 Xn 잔기는 다음과 같이 독립적으로 선택될 수 있다:
X1은 G 또는 A; X2는 A 또는 K; X3은 D 또는 A; X4는 S 또는 A; X5는 Y 또는 A; X6은 M 또는 A; X7은 E 또는 A; X8은 E 또는 A이다.
본 발명은 또한 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열에 기술된 바와 같은 펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다.
본 발명은 면역원성 수용체 펩타이드, 구체적으로 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택된 펩타이드, 또는 이의 면역원성 단편을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 적어도 하나의 면역원성 수용체 펩타이드 또는 이의 면역원성 펩타이드 단편의 혼합물을 제공한다.
본 발명은 성장 인자 수용체 에피토프 펩타이드 또는 이의 면역원성 단편을 투여하여, 비정상 또는 과잉발현된 성장 인자 수용체를 발현하는 세포에서는 노출되어 있으나 야생형 세포에서는 노출되어 있지 않은 에피토프 펩타이드와 면역반응성인 항체를 생산하는 것을 포함하는, 포유동물의 면역화 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 EGF 수용체 펩타이드 또는 이의 면역원성 단편을 투여하여, 비정상 또는 과잉발현된 EGFR을 발현하는 세포에서는 노출되어 있으나 야생형 세포에서는 노출되어 있지 않은 에피토프 펩타이드와 면역반응성인 항체를 생산하는 것을 포함하는, 포유동물의 면역화 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 EGF 수용체 펩타이드를 투여하여, EGF 수용체 에피토프 펩타이드와 면역반응성인 항체를 생산하는 것을 포함하는, 포유동물의 면역화 방법을 제공한다.
또 다른 관점에 따르면, 본 발명은 본 명세서에 기술된 수용체 펩타이드를 주성분으로 하는 백신 및 면역원성 조성물을 포함한다. 본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 하나 이상의 EGFR 펩타이드와 약제학적으로 허용되는 보강제(adjuvant)를 함유하는 백신을 제공한다. 본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 하나 이상의 펩타이드와 약제학적으로 허용되는 보강제를 함유하는 백신을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 하나 이상의 EGFR 펩타이드와 약제학적으로 허용되는 보강제를 함유하는 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 하나 이상의 펩타이드와 약제학적으로 허용되는 보강제를 함유하는 면역원성 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 하나 이상의 EGF 계열 수용체 펩타이드와 추가로 하나 이상의 다른 종양 항원을 함유하는 항종양 또는 항암 백신을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 EGF 계열 수용체 펩타이드와 추가로 하나 이상의 다른 EGF 또는 EGFR 항원을 함유하는 항종양 또는 항암 백신을 제공한다.
다른 관점에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 EGF 계열 수용체 펩타이드 또는 이의 면역원성 단편의 면역원성 함량을 함유하는, 두경부암, 유방암, 폐암, 방광암, 결장암 또는 전립선암 및 신경아교종, 또는 EGFR(또는 EGFR계 수용체 중 임의의 수용체)의 이상 발현을 나타내는 다른 모든 종양을 앓고 있는 포유동물 검체, 특히 사람 검체의 치료에 유용한 백신을 제공한다. 이러한 백신은 상기 펩타이드와 약제학적으로 허용되는 보강제를 함유할 수 있다. 백신은 또한 담체에 접합된 펩타이드를 함유할 수도 있다.
본 발명은 EGF 계열 수용체 루프 펩타이드와 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 하나 이상의 펩타이드 중에서 선택되는 EGF 계열 수용체 펩타이드와 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 EGF 계열 수용체 루프 펩타이드 항체와 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 하나 이상의 펩타이드와 면역반응성인 EGF 계열 수용체 펩타이드 항체와 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 관점에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 EGF 계열 수용체 펩타이드에 대한 정제된 항체를 제공한다.
본 발명의 분리된 폴리펩타이드에 대한 항체는 천연 발생의 항체 및 재조합 제조된 항체를 포함한다. 이러한 항체는 공지된 유전자 기술로 제조된 폴리클로날 및 모노클로날 항체는 물론 이중특이 항체 및 진단 또는 치료 용도에 적합하도록 다른 작용기를 함유하는 항체도 포함할 수 있다. 이러한 항체는 두경부암, 유방암, 폐암, 난소암, 방광암, 후두암, 편평세포 암종 또는 전립선 종양 및 신경아교종을 비롯한 이에 국한되지 않는 암을 진단하거나 또는 종양을 특성 규명하는 면역분석법에 사용될 수 있다. 또한, 항체는 두경부암, 유방암, 폐암, 난소암, 방광암, 후두암, 편평세포 암종 또는 전립선 종양 및 신경아교종을 비롯한 이에 국한되지 않는 암을 치료하거나 종양을 감소시키는 수동 면역화에 사용될 수 있다.
또한, 검출성 표지(label)로 표지되고 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 EGF 계열 수용체 펩타이드에 대한 항체도 제공한다. 구체적 양태에 따르면, 표지는 효소, 형광을 발하는 화학 물질 및 방사선 원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다. 방사선 표지, 예컨대 동위원소 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe,26Y, 90Y, 124I, 125I, 131I, 111I, 99Tc 및 186Re 등이 사용되는 경우에는 공지되어 통용되고 있는 계수 절차를 이용할 수 있다. 표지가 효소인 경우 에는, 현재 이용되는 당업계에 공지된 비색법, 분광분석법, 형광분광분석법, 전류측정법 또는 가스정량법 중 임의의 방법으로 검출을 수행할 수 있다.
본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 EGF 계열 수용체 펩타이드에 대한 하나 이상의 항체와 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 EGF 계열 수용체 펩타이드에 대한 적어도 2개의 항체 혼합물과 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 EGF 계열 수용체 펩타이드에 대한 항체 또는 이의 활성 단편에 대한 활성을 기초로 하거나 또는 이와 동일한 활성을 보유하는 것으로 측정된 제제 또는 다른 약물을 기초로 할 수 있는 특정 치료 방법에 관한 것이다. 제1 치료 방법은 두경부암, 폐암, 결장암, 방광암, 유방암, 전립선암 및 신경아교종을 비롯한 이에 국한되지 않는 암의 예방 또는 치료와 관련된 것이다.
구체적으로, 본 발명의 항체 또는 이의 활성 단편, 및 이로부터 유도된 키메라 항체 또는 합성 항체는 치료에 적당한 경우, 예컨대 암 치료를 위해 투여하기 위하여 적당한 매개제, 담체 또는 희석제를 함유하는 약제학적 조성물로 제조될 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 페길화와 같은 당업계에 공지된 방법을 통해 결합 성분, 항체 또는 단편의 반감기를 조절하는 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 또한 다른 항체 또는 치료제를 함유할 수도 있다. 즉, 본 발명의 조성물은 단독 투여하거나 다른 치료법과 함께, 다른 치료제 또는 제제와 함께 치료 증상에 따라 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 EGF 계열 수용체 펩타이드에 대한 항체, 구체적으로 본 명세서에 기술된 항체 또는 이의 단편, 및 다른 제제 또는 치료제, 예컨대 항암제 또는 항암 치료제, 항EGFR 제제 또는 항체 또는 면역 조절제를 함유하는 조성물을 포함한다. 이러한 항암제는 더욱 일반적으로 티로신 키나제 억제제, 예컨대 AG1478, ZD1839(제피티니브) 또는 ST1571(이마티니브 메실레이트), 인산화 캐스케이드 억제제, 해독후 조절제, 세포 성장 또는 분열 억제제(예, 항유사분열제), PDGFR 억제제 또는 시그널 형질도입 억제제일 수 있다. 다른 치료법 또는 치료제로는 비스테로이드성 항염증 약물(예, 아스피린, 파라세타몰, 이부프로펜 또는 케토프로펜) 또는 아편제(예, 몰핀), 또는 항구토제와 같은 통증 경감 약물의 적당한 용량의 투여를 포함할 수 있다. 즉, 이러한 제제는 항EGFR 특이 제제, 예컨대 AG1478 또는 ZD1839이거나, 또는 더욱 일반적인 항암제 및 항신생물제, 예컨대 독소루비신, 카르보플라틴 및 시스플라틴(이에 국한되지 않는다)일 수 있다. 또한, 조성물은 면역 반응을 자극하고 암 세포 또는 종양의 감소 또는 제거를 자극하는, 면역 조절제, 예컨대 인터루킨, 종양 괴사 인자(TNF) 또는 다른 성장 인자, 시토킨 또는 호르몬(예컨대 덱사메타손)과 함께 투여될 수 있다. 조성물은 또한 다른 항EGFR 항체와 함께 투여되거나, 다른 항EGFR 항체를 함유하는 혼합물을 포함할 수 있으며, 이러한 다른 항체의 예로는 항EGFR 항체 528; 225; SC-03; 108(ATCC HB9764) 미국 특허 6,217,866; 14E1(미국 특허 5,942,602); DH8.3; L8A4; Y10; HuMAX-EGFr(Genmab/Medarex); ICR62; 및 ABX-EGF(Abgenix)가 포함되지만, 이에 국 한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 EGF 계열 수용체 펩타이드 및 이의 임의의 단편에 대한 항체로서, 치료 또는 진단 목적에 사용하기 위해 다른 분자 또는 제제에 공유 결합되거나 다른 방식으로 관련된 항체를 포함한다. 이러한 다른 분자 또는 제제에는 독특한 특징이 있는 분자(예컨대, 다른 항체 또는 항체 단편), 독소, 리간드, 방사선 동위원소 및 화학치료제가 포함되며, 이에 국한되는 것은 아니다. 당해 기술분야에는 이와 같이 치료 목적으로 사용하기 위해 항체와 공유결합되거나 다른 방식으로 관련되는 분자 또는 제제가 다수가 공지되어 있다. 이러한 분자 또는 제제의 예에는 칼리케아미니신(calicheamicin), 메이탄시노이드(maytansinoid), 듀오카마이신(duocarmycin), 리신(ricin), 디프테리아 독소 및 슈도모나스 외독소와 같은 독소; 종양 괴사 인자(TNF)와 같은 리간드; 90Y, 125I, 131I, 211At, 225Ac, 213Bi 및 다른 α, β 또는 γ 방출 동위원소와 같은 방사선 동위원소; 및 파클리탁셀(Taxol®) 및 독소루비신(Adriamycin®)과 같은 화학치료 약물이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명은 두경부암, 유방암, 폐암, 난소암, 방광암, 후두암, 편평세포 암종 또는 전립선 종양 및 신경아교종을 비롯한 암 및 종양을 측정 및/또는 모니터하느 진단 검사 및 방법에 사용되는, 본 발명의 수용체 펩타이드 및 이에 대한 항체의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 분리된 성장 인자 수용체 펩타이드를 암호화하거 나 또는 폴리펩타이드의 활성을 경쟁적으로 억제하는, 재조합 DNA 분자 또는 클로닝된 유전자, 또는 이의 축퇴성 변형체, 돌연변이체, 유사체 또는 단편과 같은 분리된 핵산에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 EGF 계열 수용체 펩타이드를 암호화하는 재조합 DNA 분자 또는 클로닝된 유전자, 또는 이의 축퇴성 변형체, 돌연변이체, 유사체 또는 단편과 같은 분리된 핵산에 관한 것이다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 재조합 DNA 분자 또는 클로닝된 유전자의 DNA 서열은 적당한 숙주에 도입될 수 있는 발현 조절 서열에 작동적으로 결합될 수 있다. 따라서, 본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 EGF 계열 수용체 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 함유한 재조합 DNA 분자로 형질전환된 단세포 숙주도 포함한다.
또한, 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 EGF 계열 수용체 펩타이드를 암호화할 수 있는 핵산, 즉 재조합 DNA 분자도 제공한다. DNA 분자가 발현 조절 서열에 작동적으로 결합된 상기 재조합 DNA 분자도 제공한다.
또한, 본 발명은 면역원성 EGF 계열 수용체 펩타이드, 구체적으로 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 펩타이드를 암호화하는 핵산을 함유한 핵산 백신 또는 DNA 백신에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 하나 이상의 면역원성 EGF 계열 수용체 펩타이드를 암호화하는 핵산과 적어도 하나의 다른 폴리펩타이드, 구체적으로 종양 항원 또는 면역조절 분자 펩타이드를 함유하는 핵산 백신 또는 DNA 백신에 관한 것이다.
본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 EGF 계열 수 용체 펩타이드를 암호화할 수 있는 핵산과 프로모터를 함유하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 상기 프로모터가 세균, 효모, 곤충 또는 포유동물의 프로모터를 함유하는 것인 벡터를 제공한다. 본 발명은 벡터가 플라스미드, 코스미드, 효모 합성 염색체(YAC), 박테리오파지 또는 진핵생물 바이러스 DNA인 벡터를 고려한다.
또한, 본 발명은 적당한 숙주 세포에서 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 EGF 계열 수용체 펩타이드를 암호화할 수 있는 벡터를 함유하는, 폴리펩타이드 생산용 숙주 벡터 시스템을 제공한다. 적당한 숙주 세포가 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 함유하는 숙주 벡터 시스템이 제공된다. 이로써, 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 EGF 계열 수용체 펩타이드를 암호화할 수 있는 재조합 DNA 분자 또는 벡터로 형질전환된 단세포 숙주도 제공된다.
본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 그룹 중에서 선택되는 EGF 수용체 에피토프 펩타이드의 존재 또는 노출을 검출하여 두경부암, 유방암 또는 전립선 종양 및 신경아교종을 포함하는 종양 및 암을 측정 및 모니터하는 방법을 포함한다. 이러한 구체적 방법에 따르면, EGF 수용체 에피토프 펩타이드는
a. 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 그룹 중에서 선택되는 EGF 수용체 에피토프 펩타이드의 존재 또는 노출이 의심되는 시료를 상기 EGF 수용체 펩타이드에 대한 항체와, 이러한 항체에 대한 상기 펩타이드의 결합이 일어나게 하는 조건 하에서 접촉시키는 단계; 및
b. 상기 시료 유래의 EGF 수용체 에피토프 펩타이드와 항체 사이에 결합의 발생 여부를 검출하는 단계를 통해 측정하며, 이러한 결합의 검출이 시료에 EGF 수 용체 에피토프 펩타이드의 존재 또는 노출을 시사한다.
본 발명은 본 발명의 EGF 수용체 에피토프 펩타이드의 노출 또는 EGFR 전이 상태의 안정성을 조절하는데 효과적인 잠재 화합물을 선별하는 분석 시스템을 포함한다. 일 양태에서, 시험 화합물 또는 이러한 화합물을 함유하는 추출물은 특정 EGFR을 발현하는 세포 시료에 투여하여, 본 발명의 EGF 수용체 에피토프 펩타이드 노출 시 상기 화합물의 효과 또는 대조군과 비교를 통해 EGFR 전이 상태의 안정성을 측정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 두경부암, 유방암, 폐암, 난소암, 방광암, 후두암, 편평세포 암종 또는 전립선 종양 및 신경아교종을 비롯한 종양 또는 암을 앓고 있는 포유동물의 치료 방법을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1 내지 14중 임의의 서열 그룹 중에서 선택되는 EGF 수용체 에피토프 펩타이드를 함유하는 백신의 면역원적 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 두경부암, 유방암, 폐암, 난소암, 방광암, 후두암, 편평세포 암종 또는 전립선 종양 및 신경아교종을 비롯한 종양 또는 암을 앓고 있는 포유동물의 치료 방법을 제공한다.
다른 관점에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 그룹 중에서 선택되는 EGF 수용체 에피토프 펩타이드와 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물의 일정 양을 검체에게 투여하여 면역 반응을 유도하는 것을 포함하여, 두경부암, 유방암, 폐암, 난소암, 방광암, 후두암, 편평세포 암종 또는 전립선 종양 및 신경아교종을 비롯한 종양 또는 암이 있는 검체에서 면역 반응을 유도 하는 방법을 제공한다.
여타 다른 목적과 장점은 이하 예시된 도면을 참고로 하여 함께 설명되는 이하의 상세한 설명의 검토를 통해서 당업자라면 쉽게 파악할 수 있을 것이다.
도 1. EGFR의 단편과 mAb806의 반응성. EGFR의 용해성 단편(1-513 및 310-501) 또는 성장 호르몬/EGFR 단편 융합 단백질(GH-274-501, GH-282-501, GH-290-501 및 GH-298-501)을 함유하는 세포 용해물은 SDS-PAGE로 분리하여 막으로 이동시키고 mAb806(좌측 패널) 또는 항myc 항체 9B11(우측 패널)을 이용하여 면역블롯팅했다.
도 2A 및 2B. 효모에서 디스플레이되는 EGFR의 단편과 mAb806의 반응성.
A, 효모에서 디스플레이된 EGFR 단편의 mAb806 표지화에 대한 평균 형광 시그널을 나타내는 대표적인 유동세포측정 히스토그램. 효모 디스플레이에서, 일정 비율의 세포는 표면에 단백질을 발현하지 않아서 2개의 히스토그램 피크를 생성한다. mAb806은 유도되지 않은 음성 대조군에는 결합하지 않았다.
B, 1-501 EGFR 단편은 효모 펠릿을 80℃까지 30분 동안 가열함으로써 변성되었다. 1-501 단편 상의 선형 c-myc C-말단 태그는 9E10 항체에 의해 여전히 인식되었고, 이는 열처리가 효모 표면에 디스플레이된 단편을 포함하지 않는다는 것을 증명한다. 변성 확인에는 입체형태 민감성인 mAb225를 사용했다.
도 3A 및 3B. EGFR 유래 펩타이드에 의한 mAb806 결합 억제.
A, 1-501 및 GH-274-501 EGFR 단편은 287-302 EGFR 펩타이드의 존재 또는 부재하에서 도 1에 기술된 바와 같이 mAb806(상단 패널)으로 면역블롯팅했다. EGFR 단편의 존재는 mAb806 면역블롯팅 후 막을 제거하고 다시 항myc로 탐침하여 확인했다(하단 패널).
B, ELISA 평판은 1-501 EGFR 단편으로 코팅하고, 287-302 또는 287-298 EGFR 펩타이드의 농도를 증가시키면서 mAb806과 함께 항온처리했다. 결과는 평균 A405±SD로 나타냈다.
도 4A 및 4B. 화학적으로 변형된 287-302 EGFR 펩타이드를 이용한 mAb806 결합 억제 실험.
A, ELISA 평판을 501-Fc로 코팅한 다음, 농도가 증가되는 산화, 환원 및 에이징된(실험 절차에 기술된 바와 같이 제조한 것) 287-302 EGFR 펩타이드의 존재 하에서 mAb806과 항온배양했다. 결과는 평균 억제율(%)±SD(오차 바는 육안으로 나타내기에는 너무 작았다)로 나타냈다.
B, ELISA 평판을 501-Fc로 코팅한 다음, 농도가 증가되는 카르복시메틸화된 287-302 EGFR 펩타이드 또는 287-302 EGFR 펩타이드를 CNBr 절단하여 제조한 N-말단(CGADSYEM)(서열 번호: ) 및 C-말단(EEGVRKC)(서열 번호: ) 펩타이드의 존재 하에서 mAb806과 항온배양했다. 결과는 평균 억제율(%)±SD(오차 바는 육안으로 나타내기에는 너무 작았다)
도 5A 및 5B. 펩타이드에 대한 mAb806 결합의 BIAcore에 의한 분석.
A, 287-302 EGFR 펩타이드는 티올 커플링으로 표면에 고정시키고, 농도가 증 가되는(31.25, 62.5, 125, 250, 500 및 1000nM) 펩타이드 위로 mAb806 항체를 통과시켰다. 그 다음, 스캐챠드 분석을 통해 결합 친화성을 측정했다(삽입도).
B, 287-302 EGFR 펩타이드를 아민 커플링으로 표면에 고정시키고, 287-302(상단 패널), 287-298(중간 패널) 또는 287-301(하단 패널) EGFR 펩타이드(5 및 10μM) 존재하에 표면 위로 500nM 농도의 mAb806 항체를 통과시켰다.
도 6A 내지 6D. EGFR 구조 내의 mAb806 에피토프의 위치.
A, mAb806 에피토프를 함유하는 시스테인 루프의 구조를 보여주는 탄소 배치도.
B, EGFR의 리간드 결합된 이량체 형태를 나타내는 공간 충진 모델(space-filled model). 이량체는 주로 각 EGFR 분자의 CR1 루프에 위치하는 2개의 이량체화 아암에 의해 안정화된다.
C, 이량체화를 방해하는 도메인 CR1과 CR2 사이의 자가억제성(auto-inhibitory) 상호작용을 보여주는 EGFR의 테터드 형태(tethered form).
D, CR1-루프의 이량체화 아암(왼쪽 패널)이 인접 분자의 제2 루프와 상호작용하기 위한 위치에서 준비된 상태를 분명하게 보여주는 EGFR의 신장된(전이) 형태. 색: EGF 리간드는 오렌지로 나타내고; 아미노산 579의 글리코실화 부위는 적색, mAb806 에피토프는 자주색으로 나타냈다. EGFR 구조(31, 35, 36) 및 가능한 수용체 활성화 기작은 앞에서 상세히 설명한 바와 같다.
도 7. EGFR의 CR1 루프 결실체를 발현하는 293T 세포의 유동세포측정법. 내인성 야생형 EGFR을 소량 발현하는 293 모세포를 탈2-7EGFR 또는 탈CR1-루프 EGFR(2개의 독립된 클론)로 형질감염시키고, 관련없는 IgG2b 항체(백색 히스토그램), mAb528(검정 히스토그램) 또는 mAb806(회색 히스토그램)으로 염색했다.
도 8A 내지 8C.
A, mAb806의 가능한 항종양 기작. mAb806은 불활성 EGFR에 결합할 수 없으나, 이 수용체가 미테터링되면 mAb806 에피토프가 노출되어 항체 결합이 가능하게 된다. 수용체에 대한 mAb806의 결합은 거의 확실하게 이량체화를 방해하고, 이에 따라 EGFR 시그널링을 방해하며, EGFR 내재화를 유도할 수 있다.
B, ErbB3과 ErbB4에 시스테인 루프를 함유하는 mAb806의 상동성. ErbB1에서 보존적인 아미노산은 적색으로 표시하고, 하전의 보존을 나타내는 잔기는 녹색으로 표시했다.
C, CR1-CR2 이량체 계면. N579에 부착된 첫 탄수화물 부는 결정 구조에서 분명하게 관찰할 수 있으며 CR1-CR2 이량체 계면에 위치해 있다. EGFR을 과잉발현하는 세포에서, 이 부위는 이 때 80%만이 글리코실화되어 있다. 글리코실화의 차이는 테터링의 역학과 이로 인한 mAb806 반응성에 영향을 미칠 수 있다.
도 9A 및 9B.
A) 본 연구에서 구축된 hEGFR 도메인 구조 및 돌연변이의 모식도. 약어: L, 리간드 결합 도메인; CR, 시스테인 풍부 도메인; JM, 막근접 도메인; C-T, 카르복시 말단 도메인.
B) 상단 패널: TGFα와 결합된 EGFR ECD의 미테터링된 이량체 형태(1-501)의 리본 다이아그램(Garrett et al., 2002). EGFR 분자는 청색과 녹색이고; 결합된 TGFα 분자는 자주색이다. mAb806 에피토프는 핑크색이다. 하단 패널: EGFR ECD 테터링 형태(1-621)의 리본 다이아그램(Ferguson et al., 2003). CR2 도메인(aa501-621)은 황색으로 표시했다. 양 패널에서, 삽입도는 미테터링된 입체형태의 CR1-루프들 사이의 상호작용 또는 미테터링된 입체형태에서 CR1-루프와 CR2 도메인 사이의 상호작용을 확대한 것이다. 작제물에서 돌연변이된 아미노산은 삽입도에서 볼 수 있다. 가까이 반데르발스 접촉된 원자는 점선으로 연결하고 H 결합은 점선으로 표시했다.
도 10. wt 또는 돌연변이 EGFR을 안정적으로 발현하는 BaF/3 세포주의 FACS 분석. 세포를 mAb528과 항온배양한 후, 실험 절차에 상세히 설명된 바와 같은 알렉사488-표지된 항마우스 Ig과 항온배양했다. 도면의 가로좌표에는 형광 강도를, 세로좌표에는 형광도 채널당 세포수를 나타냈다. 각 패널의 음성 대조군(무관련 항체)의 형광도는 밝은 회색 오버레이로 도시했다.
도 11. wt 및 돌연변이 수용체에 대한 EGF 결합의 스캐챠드 분석. 리간드 결합 친화성은 125I-EGF 고정 농도에서 미표지 EGF와 경쟁반응을 통해 측정했다(실험 절차 참조). 도면은 RadLig 프로그램(BioSoft)의 "Kell for Windows" 버전을 사용하여 초기 결과를 가지고 작도했다.
도 12A 내지 12C. WT 및 돌연변이 EGFR의 이량체화 및 수용체 복합체의 특정 포스포티로신 함량. 휴지기 세포를 EGF(100ng/ml, 16nM) 또는 대조군 완충액으로 처리했다. 세포 불침투성, 동종이작용기성 가교결합제 BS3을 즉시 첨가하고, 실온에 서 30분 동안 항온배양했다. 반응을 정지시킨 후, 세포를 용해시키고, 세포 단백질을 SDS/PAGE로 분리한 다음, 면역블롯팅을 위해 PVDF 막으로 이동시켰다. A) EGFR 단백질(상단) 및 포스포티로신(하단)의 면역검출. PVDF 막은 항포스포티로신 항체에 노출시킨 후 박리시키고, 항EGFR 항체로 재탐침했다. B) 실험 절차에 기술된 바와 같은 정량적 스캐닝 농도계측법으로 측정한, EGF 자극의 존재 및 부재 하의 이량체 대 총 EGFR(이량체+단량체)의 비율. C) 전술한 바와 같은 정량적 스캐닝 농도계측법으로 측정한, 포스포티로신 함량 대 EGFR 단량체와 이량체 단백질의 비율.
도 13A 내지 13C. 리간드 의존적 티로신 인산화 및 MAPK 활성화. A) 휴지기 세포를 EGF(100ng/ml)에 실온에서 10분 동안 노출시킨 다음 SDS-PAGE 시료 완충액에서 직접 용해시켰다. 단백질을 4 내지 12% 겔에서 분리한 다음 PVDF 막으로 이동시키고, 포스포티로신(상단) 또는 포스포-MAPK(하단)에 대한 항체를 이용하여 탐침했다. 블롯을 박리하여 항EGFR 항체 또는 항MAPK 항체로 각각 재탐침하여(도시하지 않음) 실험 절차에 기술한 바와 같은 특정 단백질 인산화에 대해 측정했다. B) wt 및 돌연변이 수용체에 대한 포스포티로신 대 EGFR 단백질의 비율. C) 총 MAPK 단백질에 대한 포스포-MAPK의 비율.
도 14A 내지 14C. CR2 돌연변이체에서 나타나는 EGFR 활성화의 용량 반응. wt 또는 CR2 돌연변이체 수용체를 발현하는 세포를 성장 인자와 혈청의 제거로 정지 상태가 되게 한 다음, 대조군 완충액이나 농도가 증가하는 EGF(0.03 내지 100nM)에 노출시켰다(0.03 내지 100nM). A) 총 세포 용해물을 SDS/PAGE의 4 내지 12% 구배 겔에서 분석한 뒤, 항포스포티로신, 항EGFR 또는 항포스포MAPK 항체로 면 역블롯팅했다. B) 및 C): 반응성 밴드의 농도계측법적 정량을 위해 필름을 스캐닝하고, 포스포Shc 및 포스포MAPK 결과를 EGF 농도에 대한 최대 밴드 강도%로서 도시했다. 기호는 검정 원, wtEGFR; 검정 삼각형, D563H-EGFR; 백색 삼각형, V583D-EGFR; 백색 사각형, E578C-EGFR.
도 15. wt 또는 돌연변이체 EGFR을 발현하는 BaF/3 세포의 EGF에 대한 유사분열 반응. 대조군 완충액(백색 원) 또는 농도가 증가하는 EGF(검정 원)로 처리된 세포의 [3H] 티미딘 혼입을 실험 절차에 기술된 바와 같이 측정했다.
도 16. CR1 루프가 결실된 EGFR을 발현하는 BaF/3 세포에 대한 mAb528 및 mAb806 항체 결합성 비교. wt, △2-7 또는 △CR1-루프 EGFR을 발현하는 세포를 도 2에 기술된 바와 같이 mAb528(검은 선) 또는 mAb806(회색칠 부분)으로 염색하고 FACScan으로 분석했다. 각 피크에 대한 중앙 형광도 채널은 CellQuest의 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 측정하고, 두 항체 사이의 비율을 계산하는데 사용했다. 클래스가 일치하는 무관련 항체의 대조군 형광도는 점선 오버레이로서 나타냈다.
도 17A 내지 17C. EGFR 입체형태 및 활성화. EGR은 저친화성 상태에서 고친화성 상태로 전이하는 동안 주된 입체형태 변화를 일으킨다. 저친화성 입체형태(A)는 2개의 시스테인 풍부 도메인 CR1과 CR2 사이에서 분자간내 상호작용에 의해 테터링된다. 테터링된 단량체(A)는 테터링된 이량체(B) 또는 고친화성 테터링된 단량체(F)와 평형 상태이다. 경막(TM) 및/또는 키나제 도메인은 테터링된 이량체(B)와 미테터링된 이량체의 형성을 유도하는 것으로 생각된다. 테터링된 이량체(B)는 ECD 와 키나제 도메인 사이에 분자간 접촉이 있음을 만화로 도시했다. 수용체의 테터링된 형태는 친화성이 낮다. 미테터링된 단량체와 이량체는 친화성이 더 높다. 미테터링된 이량체의 세포내 키나제 도메인은 리간드(예, EGF 또는 TGF-α) 결합이 이량체-리간드 복합체(D) 내의 추가 재배향을 유도하고서야 비로소 활성화된다. 수용체-리간드 복합체는 더 높은 정도의 올리고머(예, 사량체, E)를 형성할 수 있다. 리간드 결합 친화성은 인사이드-아웃 시그널링(inside-out signalling)(예, ATP)을 통해 추가 조절된다. 리간드 결합 및 이량체화/올리고머화가 키나제 활성화 및 기재 인산화를 유도할지라도, 수용체 유래의 시그널링은 내재화, 분해 및 탈인산화에 의해서도 조절된다.
도 18A 내지 18D는 효모 표면에 디스플레이된 EGFR 단편 273-621에 대한 mAb 806 결합성을 분석한 유동세포측정 결과를 도시한 것이다. c-myc 태그에 의해 검출된 EGFR 디스플레이 형광성은 가로좌표에, mAb806 결합성은 세로좌표에 표시했다. (A) 분류(sort) 1(10nM mAb806) 및 분류 2(75nM), 분류 문은 점선으로 표시했다. (B-D) 대표적인 돌연변이체의 (B), (C)+ 및 (D)++결합성, 및 양성 및 음성 대조군 75nM. WT=야생형 EGFR273-621.
도 19는 효모 표면에 디스플레이된 EGFR 273-621 및 돌연변이체에 대한 mAb806의 역가를 도시한 것이다. 검정, 야생형(++); 암회색, C287R(+); 경회색, E293K(-). 단일 부위 결합 모델에 대한 전방위적 맞춤 실험을 3가지 독립된 세트의 결과(사각형, 삼각형 및 다이아몬드형은 독립된 세트를 나타낸다)를 가지고 수행했다.
도 20A 내지 20D는 mAb806 에피토프. (A-B) EGFR-EGF 이량체 구조(PDB ID 1IVO)의 사슬에 존재하는 에피토프의 전면도 및 후면도. 단량체 구조에(PDB ID 1NQL)에서는 Glu293이 보이지 않기 때문에 이량체 구조를 사용했다. 색으로 표시한 잔기들은 결합 상실에 대한 라이브러리로부터 분리한 돌연변이체이다. 적색, 알라닌 치환 시 결합을 상실하게 되는 잔기; 오렌지색, 하지 않는 잔기; 회색; 라이브러리에서 분리되지 않고 알라닌 치환 시 결합 상실을 전혀 나타내지 않는 잔기. (C) 에피토프는 이황화 결합과 2개의 염 가교(Glu293-Arg300 및 Asp297-Lys301)에 의해 감금되어 있다. 음하전 잔기, 적색; 양성, 청색; 시스테인, 황색, 이미지는 이량체 구조(PDB ID 1IVO)의 두 EGFR 분자에 존재하는 잔기 287-302를 포함한다. (D) (A)에서와 같은 색으로 나타내고 EGFR의 나머지는 청색인 자가억제된 EGFR 단량체 내의 mAb806 에피토프.
본 발명에는 당업계에 통용되는 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술이 이용될 수 있다. 이러한 기술은 문헌에 상세히 설명되어 있다. 예컨대, Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III[Ausubel, R.M., ed.(1994)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumes I-III[J.E. Celis, ed.(1994)]; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III[Coligan, J. E., ed.(1994)]; "Oligonucleotide Synthesis"(M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription And Translation" [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I.Freshney, ed.(1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes"[IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning"(1984).
따라서, 본 명세서에 사용된 다음 용어들은 이하에 기술된 바와 같은 의미를 갖는 것이다.
"성장 인자 수용체 펩타이드", "수용체 에피토프 펩타이드", "EGF 계열 수용체 펩타이드", "EGF 수용체 펩타이드", "EGFR 에피토프", "EGFR 펩타이드"라는 용어 및 구체적으로 나열되지 않은 모든 변형어들은 호환 사용할 수 있는 것으로서, 본 명세서와 청구의 범위에 사용된 바와 같이 단일 또는 복수 펩타이드를 함유하는 펩타이드 물질을 의미하고, 본 명세서에 설명되고 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열과 표 1 및 2에 제시된 아미노산 서열 데이터 및 이의 변형체를 갖고, 본 명세서와 청구의 범위에 설명된 활성 프로필을 갖는 펩타이드까지 포함한다. 따라서, 활성이 거의 동등하거나 변경된 활성을 나타내는 단백질도 이와 같은 의미로 해석되어야 한다. 이러한 변형은 고의적인 것, 예컨대 부위 지시된 돌연변이유발을 통해 수득한 변형이거나, 또는 우연한 것, 예컨대 복합체 또는 이의 지정된 서브유닛의 생산자인 숙주에서 돌연변이를 통해 수득된 것일 수 있다. 변형체를 비롯한 수용체 에피토프 펩타이드의 변형을 형성시키고 검사하는 방법으로서, 예컨대 부위 지시된 돌연변이유발 또는 랜덤 돌연변이유발 등은 당업자에게 공지되어 있으며, 본 명세서에 기술되고 예시된 것뿐만 아니라 실시예 3에 제시된 것을 포함한다. 또한, "성장 인자 수용체 펩타이드", "수용체 에피토프 펩타이드", "EGF 계열 수용체 펩타이드", "EGF 수용체 펩타이드", "EGFR 에피토프", "EGFR 펩타이드"와 같은 용어들은 그 범위에 본 명세서에서 구체적으로 언급된 단백질 및 펩타이드는 물론 실질적으로 상동성인 모든 유사체 및 대립유전자 변형을 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
본 명세서에 기술된 아미노산 잔기는 "L" 이성질체 형태인 것이 바람직하다. 하지만, 면역글로불린 결합의 바람직한 기능적 성질이 폴리펩타이드에서 보유되는 한, 어떠한 L-아미노산 잔기라도 "D" 이성질체 형태의 잔기로 치환될 수 있다. NH2는 폴리펩타이드의 아미노 말단에 존재하는 유리 아미노 기를 의미한다. COOH는 폴리펩타이드의 카르복시 말단에 존재하는 유리 카르복시 기를 의미한다. 표준 폴리펩타이드 명명법(J.Biol.Chem., 243:3552-59(1969))에 따라서 아미노산 잔기의 약어는 다음 대응 표에 제시한 바와 같다:
대응 표
Figure 112006068032313-PCT00001
특히 주의할 점은 본 명세서에 제시된 모든 아미노산 잔기 서열이 좌측과 우측 배향이 통상적인 아미노 말단과 카르복시 말단 방향이라는 점이다. 또한, 아미노산 잔기 서열의 처음 또는 마지막의 점선은 하나 이상의 아미노산 잔기로 이루어진 다른 서열에 대한 펩타이드 결합을 나타낸다는 점이다. 상기 표에는 본 명세서에서 대체 사용할 수 있는 관련된 3문자 표기법과 1문자 표기법을 나타냈다.
"레플리콘(replicon)"은 생체내에서 DNA 복제의 자율 단위로서 작용하는, 즉 자신의 제어 하에서 복제할 수 있는 임의의 유전자 요소(예, 플라스미드, 염색체, 바이러스)이다.
"벡터"는 다른 DNA 분절이 부착되어, 부착된 분절의 복제를 유발할 수 있는 플라스미드, 파지 또는 코스미드와 같은 레플리콘이다.
"DNA 분자"는 일본쇄 형태 또는 이본쇄 나선 형태인 데옥시리보뉴클레오타이드(아데닌, 구아닌, 티민 또는 시토신)의 중합체 형태를 의미한다. 이 용어는 분자의 1차 및 2차 구조만을 나타내며, 임의의 특정 3차 형태를 한정하지 않는다. 즉, 이 용어는 특히 선형 DNA 분자(예, 제한효소 단편), 바이러스, 플라스미드 및 염색체에서 발견되는 2본쇄 DNA를 포함한다. 특정 이본쇄 DNA 분자 구조를 논할 때, 일반적인 관례에 따라서 본 명세서에 기술된 서열은 비전사성 DNA 가닥(즉, mRNA와 상동성인 서열을 갖는 가닥)을 따라 5'에서 3' 방향의 서열만을 제시했다.
"복제 오리진"은 DNA 합성에 참여하는 DNA 서열을 의미한다.
DNA "암호화 서열"은 적당한 조절 서열의 제어 하에 배치되었을 때 전사되고 생체내에서 폴리펩타이드로 해독되는 이본쇄 DNA 서열이다. 암호화 서열의 경계는 5'(아미노) 말단에 있는 개시 코돈과 3'(카르복시) 말단에 있는 해독 종지 코돈에 의해 결정된다. 암호화 서열은 원핵생물 서열, 진핵생물 mRNA 유래의 cDNA, 진핵생물(예, 포유동물) DNA 유래의 게놈 DNA 서열 및 심지어 합성 DNA 서열 등을 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 시그널 및 전사 종결 서열은 보통 암호화 서열의 3'쪽에 위치한다.
전사 및 해독 제어 서열은 DNA 조절 서열, 예컨대 프로모터, 인헨서, 폴리아데닐화 시그널, 터미네이터 등으로서, 숙주 세포에서 암호화 서열을 발현시키기 위한 것이다.
"프로모터 서열"은 세포에서 RNA 폴리머라제에 결합할 수 있고 하류(3' 방향) 암호화 서열의 전사를 개시시킬 수 있는 DNA 조절 영역이다. 본 발명을 한정하기 위해, 프로모터 서열은 3' 말단이 전사 개시 부위 옆에 결합되고, 전사를 배경 이상의 검출가능한 수준으로 개시시키는데 필요한 염기 또는 요소의 최소 수를 포함하도록 상류(5' 방향)를 연장시킨다. 프로모터 서열 내에는 전사 개시 부위(편리하게는 뉴클레아제 S1을 이용한 맵핑에 의해 한정된다) 뿐만 아니라 RNA 폴리머라제의 결합에 필요한 단백질 결합 도메인(콘센서스 서열)이 존재한다. 진핵생물 프로모터는 종종 "TATA" 박스 및 "CAT" 박스를 함유하지만, 반드시 그렇지는 않다. 원핵생물 프로모터는 -10 및 -35 콘센서스 서열 외에도 샤인-달가노 서열을 함유한다.
"발현 제어 서열"은 다른 DNA 서열의 전사 및 해독을 제어 및 조절하는 DNA 서열이다. 암호화 서열은 RNA 폴리머라제가 암호화 서열을 mRNA로 전사한 뒤, 이 암호화 서열에 의해 암호화되는 단백질로 해독될 때 세포 내에 존재하는 전사 및 해독 제어 서열들의 "제어하에" 있다.
"시그널 서열"은 암호화 서열 앞에 포함될 수 있다. 이 서열은 폴리펩타이드의 N-말단에 위치한 시그널 펩타이드를 암호화하여, 숙주 세포와의 교신으로 폴리펩타이드가 세포 표면으로 유도되게 하거나 배양액으로 분비되게 하며, 이 시그널 펩타이드는 단백질이 세포에서 방출되기 전에 숙주 세포에 의해서 절단된다. 시그널 서열은 원핵생물 및 진핵생물에 존재하는 다양한 단백질과 결합되어 있음을 확인할 수 있다.
본 발명의 프로브(probe)을 언급 시 본 명세서에 사용된 "올리고뉴클레오타이드"란 용어는 2 이상, 바람직하게는 3개보다 많은 리보뉴클레오타이드로 구성된 분자를 의미한다. 이의 정확한 크기는 많은 요인에 따라 달라질 것이며, 즉 올리고뉴클레오타이드의 궁극적인 기능과 용도에 따라 달라진다.
본 명세서에 사용된 "프라이머"란 용어는 정제된 제한효소 분해물로서 천연 발생물이든지, 합성 생산된 것인지의 여부에 관계없이, 핵산 가닥에 상보성인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉 DNA 폴리머라제와 같은 유도제와 뉴클레오타이드의 존재 하에 적당한 온도와 pH에 위치했을 때 합성 개시점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 이러한 프라이머는 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있고, 유도제의 존재 하에 원하는 연장 산물의 합성을 도모하기에 충분히 긴 길이이어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머 급원 및 방법의 사용을 비롯한 많은 요인에 따라 달라질 것이다. 예컨대, 진단 용도인 경우, 표적 서열의 복잡성에 따라서 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 일반적으로 15 내지 25개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드를 함유하지만, 더 적은 수의 뉴클레오타이드도 함유할 수도 있다.
본 명세서에 사용된 프라이머는 특정 표적 DNA 서열의 다른 가닥에 "실질적으로" 상보성인 것을 선택한다. 이것은 그 프라이머가 충분히 상보성이어서 각각의 가닥과 하이브리드화할 수 있어야 한다는 것을 의미한다. 따라서, 프라이머 서열은 반드시 주형의 서열을 정확하게 반영할 필요는 없다. 예를 들어, 비상보성 뉴클레오타이드 단편이 프라이머의 5' 말단에 부착하고 이 프라이머의 나머지 서열은 가닥에 상보성일 수 있다. 또는, 비상보성 염기 또는 이보다 긴 서열이 프라이머에 산재될 수도 있는데, 단 프라이머 서열은 하이브리드화할 가닥의 서열과 충분한 상보성을 보유하여 연장 산물의 합성에 주형 역할을 해야 한다.
본 명세서에 사용된, "제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한효소"는 세균 효소를 의미하는 것으로서, 각각 특정 뉴클레오타이드 서열이나 그 부근의 이본쇄 DNA를 절단한다.
세포는 외인성 또는 이종 DNA가 세포 내로 도입되었을 때 상기 DNA에 의해 "형질전환된" 것이다. 형질전환 DNA는 세포의 게놈을 구성하는 염색체 DNA로 통합(공유 결합)되거나 통합되지 않을 수 있다. 예컨대, 원핵생물, 효모 및 포유동물 세포에서 형질전환 DNA는 플라스미드와 같은 에피솜 성분에서 유지될 수 있다. 진핵생물 세포의 경우에 안정하게 형질전환된 세포는 형질전환 DNA가 염색체에 통합되어 염색체 복제를 통해 딸세포에게 유전되는 것이다. 이러한 안정성은 형질전환 DNA를 함유하는 딸 세포 집단으로 이루어진 세포주 또는 클론을 설립하는 능력을 통해 확인할 수 있다. "클론"은 단세포 또는 공통 조상으로부터 유사분열에 의해 유래되는 세포 집단이다. "세포주"는 여러 세대동안 시험관내에서 안정된 성장을 할 수 있는 원시 세포의 클론이다.
소정 길이의 DNA 서열에 대해 약 75% 이상(바람직하게는 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 약 90% 또는 95% 이상)의 뉴클레오타이드가 짝을 이룰 때("정합성"이라고도 한다), 두 DNA 서열은 "실질적으로 상동성"이다. 실질적으로 상동성인 서열은 서열 데이터 뱅크에서 이용할 수 있는 표준 소프트웨어를 사용하여 서열을 비교하거나, 또는 특정 시스템에 따라 규정된 바와 같은 예컨대 엄중 조건 하에서 서던 하이브리드화 실험을 통해 확인할 수 있다. 적당한 하이브리드화 조건의 규정은 당업계에 공지되어 있다. 예컨대 Maniatis et al. 상기 문헌 설명 참조; DNA Cloning, Vol.I & II, 상기 문헌 설명 참조; Nucleic Acid Hybridization, 상기 문헌 설명 참조.
서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열과 같은 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드를 암호화하고 서로 축퇴될 수 있는 본 발명의 수용체 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열은 본 발명의 범위에 속하는 것으로 이해되어야 한다. "축퇴되는"이란 특정 아미노산을 나타내는데 다른 3문자 코돈이 사용되는 것을 의미한다. 당업계에 공지된 바와 같이 다음과 같은 코돈이 특정 아미노산 각각을 암호화하기 위하여 상호교환적으로 사용될 수 있다:
Figure 112006068032313-PCT00002
이상 특정된 코돈이 RNA 서열에 대한 것임은 자명한 것이다. DNA에 대한 대응 코돈은 U 대신에 T를 보유한다.
서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열을 암호화하는 DNA 서열에는 특정 코돈이 다른 아미노산을 암호화하는 코돈으로 변화되도록 돌연변이가 이루어질 수 있다. 이러한 돌연변이는 일반적으로 가능한 최소의 뉴클레오타이드 변화를 통해 제조한다. 이러한 분류의 치환 돌연변이는 최종 단백질의 아미노산 변화가 비보존적 방식(즉, 특정 크기 또는 특징의 아미노산 그룹에 속하는 아미노산의 코돈을 다른 그룹에 속하는 아미노산의 코돈으로 변화시키는 방식) 또는 보존적 방식(즉, 특징 크기 또는 특징의 아미노산 그룹에 속하는 아미노산의 코돈을 동일 그룹에 속하는 아미노산의 코돈으로 변화시키는 방식)으로 이루어지게 할 수 있다. 이러한 보존적 변화는 일반적으로 최종 단백질의 구조 및 기능에 더 적은 변화가 이루어지게 한다. 비보존적 변화는 최종 단백질의 구조, 활성 또는 기능을 변경시킬 가능성이 더 크다. 본 발명은 최종 단백질의 활성 또는 결합 특징을 유의적으로 변경시키지 않는 보존적 변화를 함유하는 서열을 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
다음은 아미노산의 다양한 그룹의 일 예이다:
비극성 R 기를 갖는 아미노산
알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌
하전을 띠지 않은 극성 R 기를 갖는 아미노산
글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민
하전을 띤 극성 R 기를 갖는 아미노산(pH 6.0에서 음하전성)
아스파르트산, 글루탐산
염기성 아미노산(pH 6.0에서 양하전성)
리산, 아르기닌, 히스티딘(pH 6.0에서)
페닐 기를 가진 아미노산 그룹도 또 하나의 그룹이다:
페닐알라닌, 트립토판, 티로신
분자량에 따라서도 또 하나의 그룹이 구성될 수 있다(즉, R 기의 크기):
글리신 75
알라닌 89
세린 105
프롤린 115
발린 117
트레오닌 119
시스테인 121
류신 131
이소류신 131
아스파라긴 132
아스파르트산 133
글루타민 146
리신 146
글루탐산 147
메티오닌 149
하스티딘(pH 6.0) 155
페닐알라닌 165
아르기닌 174
티로신 181
트립토판 204
특히 다음과 같은 치환이 바람직하다:
- 양하전이 유지될 수 있도록 Arg을 Lys으로 치환하거나 그 반대로 치환할 수 있다;
- 음하전이 유지될 수 있도록 Asp을 Glu로 치환하거나 그 반대로 치환할 수 있다;
- 유리 -OH가 유지될 수 있도록 Thr을 Ser으로 치환할 수 있다;
- 유리 NH2가 유지될 수 있도록 Asn을 Gln으로 치환할 수 있다.
또한, 아미노산 치환은 특히 바람직한 성질을 가진 아미노산의 치환을 위해 도입할 수 있다. 예를 들어, Cys은 다른 Cys과 이황화 가교를 형성할 수 있는 잠재적 부위를 도입시킬 수 있다. His은 특정 "촉매" 부위로서 도입할 수 있다(즉, His은 산 또는 염기로서 작용할 수 있고 생화학적 촉매작용의 가장 일반적인 아미노산이다). Pro은 단백질 구조에 - 턴을 유도하는 특정 평면 구조로 인해 도입할 수 있다.
2개의 아미노산 서열은 아미노산 잔기의 약 70% 이상(바람직하게는 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 약 90% 또는 95% 이상)이 동일하거나 보존적 치환을 나타낼 때 "실질적으로 상동성"이다.
DNA 작제물의 "이종성" 영역은 천연의 더 큰 분자와 결합된 것으로 발견되지 않는, 큰 DNA 분자 내의 동정가능한 DNA 분절이다.
즉, 이종성 영역이 포유동물 유전자를 암호화하는 경우에, 이 유전자는 보통 공급원 유기체의 게놈에서 인접하는 포유동물 게놈 DNA 양측에 존재하지 않는 DNA사이에 존재한다. 이종성 암호화 서열의 다른 예는 암호화 서열 자체가 천연에서 발견되지 않는 작제물인 것이다(예컨대, 게놈 암호화 서열이 인트론, 또는 천연 유전자와 다른 코돈을 가진 합성 서열을 함유하는 cDNA). 대립유전자 변형 또는 천연발생의 돌연변이 현상은 본 명세서에 정의된 바와 같은 DNA의 이종성 영역을 형성시키지 않는다.
DNA 서열은 발현 조절 서열이 이 DNA 서열의 전사 및 해독을 제어 및 조절하다면 발현 조절 서열에 "작동적으로 결합"된 것이다. "작동적으로 결합된"이란 용어는 발현될 DNA 서열 앞에 적당한 개시 시그널(예, ATG)을 보유하고, 정확한 리딩 프레임을 유지하여 DNA 서열이 발현 제어 서열의 제어 하에서 발현되어 이 DNA 서열에 의해 암호화된 목적 산물이 생산될 수 있는 것을 포함한다. 재조합 DNA 분자에 삽입시키고자 하는 유전자가 적당한 개시 시그널을 함유하지 않는 경우에, 이러한 유전자 앞에 개시 시그널을 삽입할 수도 있다.
"표준 하이브리드화 조건"이란 용어는 하이브리드화 및 세척 시 5 x SSC 및 65℃와 실질적으로 동일한 염 및 온도 조건을 의미한다. 하지만, 당업자는 이러한 "표준 하이브리드화 조건"이 완충액 중의 나트륨 및 마그네슘 농도, 뉴클레오타이드 서열 길이 및 농도, 부정합 비율, 포름아미드 비율 등을 비롯한 특정 조건에 따라 달라진다는 것을 잘 알고 있을 것이다. 또한, "표준 하이브리드화 조건"의 측정에는 하이브리드화하는 두 서열이 RNA-RNA, DNA-DNA 또는 RNA-DNA인지가 중요하다. 이러한 표준 하이브리드화 조건은 공지된 공식에 따라 당업자라면 쉽게 결정할 수 있는데, 하이브리드화는 보통 예상되거나 측정된 Tm보다 10 내지 20℃ 낮은 온도에서 필요한 경우 더 엄중한 세척 조건으로 실시한다.
"항체"는 특정 에피토프에 결합하는 항체 및 이의 단편을 포함하는 임의의 면역글로불린이다. 이 용어는 폴리클로날, 모노클로날 및 키메라 항체를 모두 포함하는 것으로서, 키메라 항체는 미국 특허 4,816,397 및 4,816,567에 상세하게 설명되어 있다.
항체는 다양한 방식으로 변형될 수 있는 바, "항체"란 용어는 필요한 특이성의 결합 도메인을 보유한 임의의 특정 분자 또는 물질을 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 즉, 항체란 용어는 항체 단편, 항체의 유도체, 기능성 등가물 및 상동물, 예컨대 천연 유래인지 또는 전체 또는 부분 합성 유래인지의 여부에 관계없이 면역글로불린 결합 도메인을 함유하는 임의의 폴리펩타이드를 포함한다. 따라서, 다른 폴리펩타이드에 융합된 면역글로불린 결합 도메인 또는 이의 등가물을 함유하는 키메라 분자도 포함된다. 키메라 항체의 클로닝 및 발현에 대해서는 EP-A-0120694 및 EP-A-0125023, 미국 특허 4,816,397 및 4,816,567에 설명되어 있다.
전 항체의 단편이 항원에 결합하는 기능을 수행할 수 있다는 것은 밝혀져 있다. 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546(1989)); (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 2개의 결합된 Fab 단편을 함유하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인과 VL 도메인을 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 상기 도메인들이 결합하여 항원 결합 부위를 형성하는 단일쇄 Fv 분자(scFv)(Bird et al., Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al., PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); (viii) 다가 항체 단편(scFv 이량체, 삼량체 및/또는 사량체(Power and Hudson, J Immunol.Methods 242: 193-204 9(2000)); (ix) 이중특이성 단일쇄 Fv 이량체(PCT/US92/09965); 및 (x) 유전자 융합에 의해 작제된 다가 또는 다중특이성 단편인 "다이아바디"(WO94/13804; P.Holliger et al Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90 6444-6448(1993)).
"항체 결합 부위"는 항원에 특이적으로 결합하는 중쇄 및 경쇄 가변 및 초가변 영역으로 구성된 항체 분자의 구조적 부분이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 다양한 표현 중의 "항체 분자"란 용어는 순수 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분을 의미한다.
항체 분자의 예에는 순수 면역글로불린 분자, 실질적으로 순수한 면역글로불린 분자 및 본 명세서에 기술된 치료 방법에 사용하기에 바람직한 Fab, Fab', F(ab')2 및 F(v)와 같은 당업계에 공지된 부분을 비롯한 파라토프(paratope)를 함유하는 면역글로불린 분자의 부분이 있다. 항체 분자의 Fab 및 F(ab')2 부분은 공지된 방법에 따라서 실질적으로 순수한 항체 분자에 각각 파파인 및 펩신의 단백분해 반응을 통해 제조할 수 있다(예컨대, 미국 특허 4,342,566, Theofilopolous et al.). 항체 분자의 Fab' 부분도 공지된 것이며, 두 중쇄 부분을 결합하는 이황화 결합을 머캅토에탄올로 환원시킨 후, 수득되는 단백질 머캅탄을 요오도아세트아미드와 같은 시약으로 알킬화시켜 F(ab')2 부분으로부터 생산할 수 있다. 순수 항체 분자를 함유하는 항체가 본 발명에 바람직하다.
다양한 표현 형태 중의 "모노클로날 항체"란 용어는 특정 항원과 면역반응할 수 있는 1종의 항체 결합 부위만을 갖는 항체를 의미한다. 따라서, 일반적으로 모노클로날 항체는 면역반응하는 임의의 항원에 대해 단일 결합 친화성을 나타낸다. 모노클로날 항체는 다수의 항체 결합 부위를 갖지만 각 부위가 다른 항원에 대해 면역특이성인 항체 분자, 예컨대 이중특이(키메라) 모노클로날 항체를 포함할 수도 있다.
"약제학적으로 허용되는"이란 표현은 생리적 내성이고 보통 사람에게 투여했을 때 위 상해, 현기증 등과 같은 알레르기성 또는 유사한 부적당한 반응을 일으키지 않는 분자 실재물 및 조성물을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "치료학적 유효량"이란 표현은 임상적으로 유의적인 변화 크기 또는 표적 세포 덩어리의 S기 활성, 또는 병리상태의 다른 특징, 예컨대 EGFR 발현에서 항체 반응, T 세포 또는 B 세포 반응의 감소를 차단하고, 바람직하게는 적어도 약 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 적어도 90% 감소시키기에 충분한 양을 의미하는 것이다.
"보강제(adjuvant)"란 용어는 특히 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 화합물 또는 혼합물을 의미한다. 보강제는 항원을 서서히 방출하는 조직 저장소로서, 그리고 면역반응을 비특이적으로 증강시키는 림프양계 활성인자로서 작용할 수 있다(Hood et al., Immunology, Secend Ed., 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, California, p. 384). 종종, 보강제 없이 항원 단독물의 1차 예방접종은 체액 또는 세포 면역반응을 유발시키지 못할 수도 있다. 종래 공지되고 사용되는 보강제에는 완전 프로인트 보강제, 불완전 프로인트 보강제, 사포닌, 수산화알루미늄과 같은 무기 겔, 리소레시틴과 같은 표면 활성 물질, 플루로닉 폴리올, 다가음이온, 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 유제, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 및 잠재적으로 유용한 사람 보강제, 예컨대 BCG(bacille-Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르범(Corynebacterium parvum)이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 무기 염 보강제에는 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 인산칼슘, 수산화아연 및 수산화칼슘이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 보강제 조성물은 추가로 약 10%(중량 기준) 식물성 오일과 약 1 내지 2%(중량 기준) 인지질을 함유하는 지방 에멀젼의 지질을 함유하는 것이 바람직하다. 보강제 조성물은 경우에 따라 오일성 입자가 연속 수성상에 분산되어 있는 에멀젼 형태로서, 에멀젼 형성 폴리올이 약 0.2%(중량 기준) 내지 약 49%(중량 기준)의 함량으로, 경우에 따라 대사가능한 오일이 15%(중량 기준) 이하의 에멀젼 형성 양으로, 경우에 따라 글리콜 에테르계 계면활성제가 약 5%(중량 기준) 이하의 에멀젼 안정화 양으로 보유하는 에멀젼 형태를 함유하는 것이 바람직하다. 보강제의 다른 예에는 모노포스포릴 지질 A(MPL, SmithKline Beecham), 살로넬라 미네소타 Re 595 리포폴리사카라이드의 정제 및 산 가수분해 후 수득되는 동류물; 사포닌, 예컨대 Quillja 사포나리아 추출물로부터 정제한 순수 QA-21 사포닌인 QS21(SmithKline Beecham); PCT 출원 WO 96/33739에 기술된 DQS21(SmithKlein Beecham); 퀼라리아 사포나리아 몰리나 나무의 껍질 유래의 ISCOM(CSL Ltd., Parkville, Victoria, Australia); QS-7, QS-17, QS-18 및 QS-L1(So et al., Mol. Cells 7: 178-186, 1997); 몬타나이드; 명반; CpG 올리고뉴클레오타이드(예컨대, Kreig et al., Nature 374: 546-9, 1995); 스쿠알렌 및/또는 토코페롤과 rxk이 생분해성 오일로 제조한 각종 유중수 에멀젼; 및 피부의 외측부에서 발견되는 특정 면역 세포 상의 소위 "톨 유사 수용체(toll-like receptor) 7"에 의해 흡수되는 인자가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 특히, 항원은 DQS21/MPL의 혼합물과 한께 혼합되어 투여될 수 있다. DQS21 대 MPL의 비율은 일반적으로 약 1:10 내지 10:1 범위, 바람직하게는 약 1:5 내지 5:1 범위, 더욱 바람직하게는 약 1:1이다. 사람 투여용인 경우에 DQS21 및 MPL은 통상 약 1㎍ 내지 약 100㎍ 범위의 양으로 백신 조성물에 존재할 수 있다. 기타 다른 보강제도 당업계에 알려져 있으며, 본 발명에 사용할 수 있다(예컨대, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2nd Ed., 1986). 폴리펩타이드와 보강제의 혼합물 또는 에멀젼의 제조방법은 면역반응의 유도 및/또는 증강 기술분야 및 백신접종 기술분야의 당업자에게 공지되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "면역조절제"란 용어는 면역반응 또는 면역학적 반응을 조절할 수 있는 제제를 의미한다. 이러한 조절에는 항체 생산, 체액 반응, 세포 면역 반응의 증강이 포함된다. 면역조절제의 예에는 보강제, 시토킨, 인터루킨, 케모킨 및 성장 인자가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
면역조절제의 "유효량"이란 용어는 백신에 의해 유도된 면역반응을, 세포 매개, 체액 매개 또는 항체 매개성 여부에 관계없이 증강시키기에 충분한 면역조절제의 양을 의미한다. 면역조절제의 유효량은 주사제인 경우, 사람 검체에 대해서 약 0.1 내지 1,000㎍ 범위, 바람직하게는 1 내지 900㎍ 범위, 더욱 바람직하게는 5 내지 500㎍ 범위일 수 있고, 동물 검체인 경우에는 약 0.01 내지 10.0㎍/kg(체중) 범위일 수 있다. 이러한 양은 투여 방식에 따라 다소 달라질 수 있으나, 일반적 범위는 동일하다. 1종 이상의 면역조절제가 사용된다면, 각 면역조절제가 상기 함량으로 존재하거나 총 함량이 상기 범위일 수 있다. 항원의 유효량은 면역조절제의 부재 하에서 확인가능한 면역 반응을 유도할 수 있는 양일 수 있다. 사용되는 항원의 적당한 양은 특정 항원에 따라 다르며, 당업계에 공지되어 있다.
필수적인 정확한 유효량은 종, 연령 및 검체의 일반적 상태, 치료되는 질환의 병도, 투여 방식 등에 따라서 검체마다 다를 수 있다. 즉, 정확한 유효량을 특정하는 것은 불가능하다. 하지만, 적당한 유효량은 종래 백신 기술의 정보 또는 통상의 실험만을 사용하여 당업자라면 측정할 수 있을 것이다.
항원을 함유하는 조성물이나 백신에 대한 "면역학적 반응"은 당해 백신이나 조성물에 대한 세포 및/또는 항체 매개의 면역 반응을 숙주 중에서 발생시키는 것이다. 보통, 이러한 반응은 당해 조성물이나 백신에 함유된 항원이나 항원들에 특이적으로 지시된 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 억제인자 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포를 생산하는 검체로 이루어진다.
본 명세서에 사용된 "pg"는 피코그램, "ng"은 나노그램, "ug" 또는 "㎍"은 마이크로그램, "mg"은 밀리그램, "ul" 또는 "㎕"는 마이크로리터, "ml"은 밀리리터, "l"는 리터를 의미한다.
다양한 문법 형태의 "이상 발현"이란 용어는, 과잉발현되지 않는 상태에 비하여 임의의 일정 시점에서 많은 양의 단백질이 존재하거나 검출될 수 있도록 발현 또는 해독의 증강, 단백질의 프로모터 또는 조절인자의 변형, 단백질에 대한 유전자의 증폭 또는 반감기 또는 안정성의 증강을 비롯한 임의의 방법에 의해 수득되는, 조직에 존재하는 단백질의 임의의 증가된 또는 변경된 발현 또는 과잉발현, 예컨대 단백질 양의 증가를 의미하며 이를 포함할 수 있다. 이상 발현은 세포에 존재하는 단백질 발현 또는 해독후 변형 기구가 단백질의 발현 증강 또는 단백질 농도 또는 함량의 증가로 인해 혹사되거나 달리 붕괴되는 임의의 시나리오 또는 변경, 예컨대 서열 변경, 결실 또는 삽입, 또는 변경된 폴딩으로 인해 변이된 단백질 또는 변형체와 같은 변경된 단백질이 발현되는 것을 포함하며, 이를 고찰해야 한다.
"이상 발현"이란 용어는 단백질의 이상(보통 증가된) 함량/농도가 존재하는 상태를, 이상 함량 또는 농도의 유효 원인에 관계없이 포함하기 위해 본 명세서에서 특별히 선택되어진 것임을 이해하는 것이 중요하다. 즉, 단백질의 이상 함량은 암에 걸린 검체의 두경부에서 취한 많은 세포/조직 시료에서 나타나는 현상인 유전자 증폭 없이 단백질의 과잉발현에 의해 일어나는 것일 수 있는 한편, 여타 시료는 유전자 증폭에 기인하는 이상 단백질 농도를 나타낸다.
후자와 관련하여, 본 발명을 예시하고자 본 명세서에 제시한 본 발명자들의 연구 중 일부는 일부 시료가 성장 인자 수용체, 예컨대 EGF 계열 수용체, 구체적으로 EGFR의 증폭으로부터 산출되는 이상 단백질 농도를 나타내는 시료 분석을 포함한다. 이는 성장 인자 수용체, EGF 계열 수용체, EGFR의 이상 농도를 설명하는데 있어서 "증폭/증폭된" 등과 같은 용어의 사용과, 증폭이 참고적으로 이루어진 실험 발견이 본 명세서에 제공되었기 때문이다. 하지만, 단백질의 이상 함량 또는 농도의 관찰은, 본 발명의 결합 부재에 의하여 임상적 간섭이 고찰되는 환경 또는 경우가 확정지어지며, 이로 인해 본 명세서는 "이상 발현"이란 용어가 더욱 광범위하게 성장 인자 수용체, EGF 계열 수용체, EGFR 농도의 대응하는 이상을 산출하는 원인 환경을 포착하는 것으로 간주되어야 한다.
따라서, 다양한 표현 형태로 사용된 "과잉발현" 및 "증폭"이란 용어는 상이한 기술적 의미가 있는 것이지만, 본 발명의 정황 중에서 이상 성장 인자 수용체, EGF 계열 수용체, EGFR 단백질 농도가 존재하는 상태를 나타낸다면 서로 동등한 것으로 간주되어야 한다. 결론적으로, "이상 발현"이란 용어는 본 발명에서 의도한 범위에 "과잉발현" 및 "증폭"이란 용어가 포함되는 것으로 생각될 때 선택되었고, 따라서 이 용어들은 모두 본 명세서에서 서로 동등한 것으로 간주될 수 있다.
본 발명은 항종양 역량 및 활성이 있는 항체를 생산하거나 또는 항종양 반응인 면역학적 반응을 자극하는데 활용될 수 있는 수용체 에피토프, 구체적으로 성장 인자 수용체 에피토프에 관한 것이다. 성장 인자 수용체 에피토프는 전이 형태의 성장 인자 수용체에 노출되는 루프 에피토프들을 포함하며, 전이 형태의 수용체를 인식하여, 불활성에서 활성으로의 리간드 결합된 입체형태 변화를 비롯한 활성화를 조절, 예컨대 차단 또는 억제하는 항체를 생산할 수 있다. 본 발명은 항종양 역량 및 활성이 있는 항체를 생산하거나 항종양 반응인 면역학적 반응을 자극하는데 이용될 수 있는 수용체 에피토프, 구체적으로 EGF 계열 수용체 에피토프, 가장 구체적으로 EGFR 에피토프를 제공한다. 일반적인 관점에서, 본 발명은 종양발생성, 과증식성 또는 비정상 세포에서 발견되고, 정상 또는 야생형 세포에서는 검출성 또는 전이성이 아닌 수용체 에피토프, 구체적으로 EGF 수용체 에피토프 또는 EGF 수용체계 에피토프를 제공한다.
본 발명은 성장 인자 수용체, 특히 EGFR에서 이황화물 루프 펩타이드를 형성하는 시스테인에 의해 각 N-말단과 C-말단에 결합되는 루프 펩타이드와 같은 에피토프 펩타이드의 존재 및 노출에 관한 것이다. 이러한 루프 펩타이드는 미테터링된 전이 입체형태일 때 노출되고, 그 존재 또는 함량은 자가분비 리간드 생산(리간드가 EGFR을 활성 이량체로 유도한다), 리간드 독립적 수용체 활성화(수용체를 과잉발현하는 세포에 주로 한정된 상황), 미테터링 농도를 변경시키는 글리코실화의 변경 또는 이러한 경우들의 임의의 조합을 비롯한 경우들에 변경 또는 증가된다.
EGF 계열 성분인 ErbB3 및 ErbB4에서 EGFR mAb806 루프 287-302 에피토프(CGADSYEMEEDGVRKC(서열번호 1))의 서열 상동성은 비교적 적지만, 시스테인 루프의 크기와 위치는 보존적이다. 또한, 2개의 아미노산 잔기는 완전히 보존적이며(E293 및 G298), 또 다른 2개는 하전이 보존적이다(E295 및 R300). 마지막으로, ErbB3( 및 아마도 ErbB4)의 전체 구조는 활성화 동안 아마도 미테터링되는 테터링된 입체형태를 채택한다는 점에서 EGFR의 구조와 매우 유사하다(Cho, H.S. and Leahy, D.J.(2002) Science 297:1330-1333). 즉, ErbB3/B4 중의 동등한 시스테인 루프를 표적으로 한 항체는 mAb806과 성질이 유사하다는 점(즉, 수용체 활성화를 차단하는 성질 및 종양에 한정적인 특이성)에서 유용한 것으로서 본 발명에서 제공된다. 더욱 광범위하게는, 성장 인자 수용체의 전이 형태에 대한 항체 생산은 정상 조직 표적화를 감소시키면서 항시그널링 활성을 유지시키는 신규 방법을 나타낸다.
이하 표 1은 EGF 계열 구성원인 EGFR, ErbB2, ErbB3 및 ErbB4의 루프 서열을 비교한 것이다.
Figure 112006068032313-PCT00003
박스친 부분은 모두 아미노산의 생리화학적 성질이 보존적인 위치이다.
또한, EGFR mAb806 루프 287-302 에피토프(CGADSYEMEEDGVRKC(서열번호 1))를 이용한 진뱅크 BLAST 조사에 따르면, 각종 포유동물 EGFR에 존재하는 상기 루프 에피토프 펩타이드 서열의 천연 대립유전자 및 변형체가 확인된다(표 2).
Figure 112006068032313-PCT00004
본 발명에 따르면, 항종양 활성이 있는 항체, 특히 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 성장 인자 수용체 펩타이드, 구체적으로 EGFR 펩타이드가 제공된다.
본 발명에 따르면, 종양발생성, 과증식성 또는 비정상 세포에서 발견되고 정상 또는 야생형 세포에서 검출성 또는 전이성이 아닌 EGFR을 인식할 수 있는 항체를 생산할 수 있는 성장 인자 수용체 펩타이드, 구체적으로 EGFR 펩타이드가 제공된다.
본 발명의 성장 인자 수용체 펩타이드, 구체적으로 EGF 계열 수용체 펩타이드는 종래 공지된 성장 인자 수용체, 예컨대 EGFR 항체들에서 관찰될 수 있는 정상 조직 흡수와 관련된 문제점 없이, 다양한 종류의 종양, 예컨대 두경부암, 유방암, 폐암, 방광암, 결장암 또는 전립선암 및 신경아교종 등을 동정하고, 특성규명하며 표적화하는 진단 및 치료 용도를 제공한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 성장 인자 수용체 펩타이드의 아미노산 서열을 함유하는 분리된 폴리펩타이드를 포함한다. 또한, 본 발명은 하나 이상의 아미노산이 치환, 예컨대 보존적 또는 비보존적 아미노산으로 치환된 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열의 변형체 또는 변이체를 포함한다. mAb806 항체, 또는 이 항체 유래의 재조합 또는 합성 항체에 의해 인식되거나 결합될 수 있거나, 또는 mAb806의 특징을 가진 항체를 생산할 수 있는 그러한 임의의 변형체 또는 변이체 펩타이드는 본 발명에 포함되는 것이다. 특히, 그러한 임의의 펩타이드들은 항종양 활성이 있고 성장 인자 수용체를 인식하는 항체를 생산할 수 있다. 분리된 펩타이드는 물론 이의 하나 이상의 혼합물도 성장 인자 수용체를 인식하고 항종양 활성이 있는 항체를 생산하고 암 또는 종양 질환이 있는 동물, 특히 포유동물, 가장 특히 사람의 면역화에 사용하기에 적합하다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열에 기술한 아미노산 서열을 가진 성장 인자 수용체 에피토프 또는 이의 면역원성 단편을 암호화하는 재조합 DNA 분자 또는 클로닝된 유전자, 또는 이의 축퇴성 변형체; 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택되는 EGF 계열 수용체 에피토프를 암호화하는 핵산 분자, 구체적으로 재조합 DNA 분자 또는 클로닝된 유전자에 관한 것이다.
앞에서 논의한 바와 같이, 특히 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열의 EGF 수용체 에피토프 중에서 선택되는, EGF 계열 수용체 에피토프 또는 이의 면역원성 단편은 적합한 담체와 함께, 종양이나 암이 있는 환자에게 치료하기 위한 다양한 방법으로 투여하기에 효과적인 강도의 약제학적 조성물로 제조될 수 있다. 다양한 투여 기술이 이용될 수 있지만, 특히 피하, 정맥내 및 복강내 주사, 카테터삽입술 등과 같은 비경구 기술이 이용될 수 있다. 상기 펩타이드 또는 이의 면역원성 단편의 평균 함량은 다양할 수 있으며, 특히 전문의 또는 수의사의 처방 및 권장에 따라야 한다.
항체
또 다른 관점에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열 중에서 선택된 EGF 계열 수용체 펩타이드에 대한 정제된 항체를 제공한다.
본 발명의 분리된 폴리펩타이드에 대한 항체는 천연 발생 항체 및 재조합 제조된 항체를 포함한다. 이러한 항체에는 공지의 유전자 기술에 의해 제조된 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체, 뿐만 아니라 이중특이 항체, 및 진단용으로 사용하기에 적합한 다른 작용기를 함유하는 항체가 포함될 수 있다. 이러한 항체는 EGFR 또는 이 계의 임의의 성분의 이상 발현을 일으키는 종양, 예컨대 두경부암, 유방암, 폐암, 난소암, 방광암, 후두암, 편평세포암종 또는 전립선암 및 신경아교종을 비롯한 이에 국한되지 않는 종양 환자를 치료하는데 치료요법적으로 사용될 수 있다. 이러한 항체는 두경부암, 유방암, 폐암, 난소암, 방광암, 후두암, 편평세포암종 또는 전립선암 및 신경아교종을 비롯한 암을 진단하거나 종양의 특성을 규명하는 면역분석에도 사용될 수 있다. 또한, 이러한 항체는 두경부암, 유방암, 폐암, 난소암, 방광암, 후두암, 편평세포암종 또는 전립선암 및 신경아교종을 비롯한 암을 치료하거나 종양을 감소시키기 위한 수동 면역화에도 사용될 수 있다.
또한, 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 비롯한 항체, 및 수용체 에피토프 펩타이드 및/또는 이의 서브유닛의 활성 또는 노출을 조절하는 약물은 특정 진단 용도에 사용될 수 있는데, 예컨대 바이러스 감염 등과 같은 질환의 검출 및/또는 측정에 사용될 수 있다. 예컨대, 수용체 펩타이드 또는 이의 면역원성 단편은 다양한 세포 배양액에서 공지의 기술, 예컨대 융합된 마우스 비장 림프구 및 골수종 세포 등을 이용한 하이브리도마 기술을 통해 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체를 모두 생산하는데 사용될 수 있다. 이와 유사하게, 본 발명의 수용체 펩타이드 또는 에피토프 루프의 활성을 모방하거나 길항작용하는 소분자를 찾아내거나 합성하여, 진단 및/또는 치료 프로토콜에 사용할 수 있다.
수용체 펩타이드에 대하여 생산된 모노클로날 항체의 패널은 다양한 성질, 즉 동형(isotype), 에피토프, 친화성 등을 통해 선별할 수 있다. 특히 관심의 대상인 것은 수용체의 활성을 중화 또는 조절하는 모노클로날 항체이다. 이러한 모노클로날은 수용체 활성 또는 시그널링 분석 또는 종양발생성 분석에서 쉽게 동정될 수 있다. 또한, 돌연변이 성장 인자 수용체, 예컨대 EGFR 또는 항상성으로 활성인 수용체의 면역친화성 정제가 필요한 경우에는 친화성이 높은 항체가 유용하다.
구체적으로, 본 발명의 진단 방법에 사용되는 항수용체 펩타이드 항체는 친화성 정제된 폴리클로날 항체일 수 있다. 더욱 구체적으로, 항체는 모노클로날 항체(mAb)이다. 또한, 본 명세서에 사용된 항수용체 펩타이드 항체 분자는 전항체 분자의 Fab, Fab', F(ab')2 또는 F(v) 부분의 형태일 수 있다. 합성 항체, 사람화된 항체, 재조합 항체 또는 완전 사람 항체가 특히 바람직하며 본 발명을 통해 제공된다.
항체의 치료 용도는 당업계에 잘 알려져 있다. 치료용으로 항체를 사용하는 방법에는 몇 가지가 있으며, 예컨대 공지의 화학치료 약물과 혼합된 나출형 항체로서, 방사선면역요법용 방사선표지된 항체로서, 또는 세포독성 약물, 독소 또는 독성제와 접합/결합된 항체로서 사용될 수 있다.
방사선표지된 항체 및 이의 단편, 구체적으로 방사선면역접합체는 방사선면역요법에, 구체적으로 암 치료용 방사선표지된 항체로서 유용하게 사용된다. 또 다른 관점에서, 방사선표지된 항체 및 이의 단편은 방사선면역 유도 수술에 유용한데, 이는 암세포, 전암세포, 종양 세포 및 과증식 세포의 존재 및/또는 위치를 이러한 세포를 제거하기 위한 수술 전, 수술 동안 또는 수술 후에 동정하고 나타낼 수 있기 때문이다.
본 발명의 항체 및 이의 단편이 다른 분자 또는 제제에 접합되거나 부착되어 있는 본 발명의 면역접합체 또는 항체 융합 단백질은 추가로 화학 절제용 제제, 독소, 면역조절제, 시토킨, 세포독성제, 화학치료제 또는 약물에 접합된 결합 부재를 포함하며, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 단독으로 투여되거나 다른 치료법, 치료제 또는 제제와 함께, 치료하고자 하는 질환에 따라서 동시적으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 또한, 본 발명은 본 명세서에 기술된 항체 또는 이의 단편과 다른 제제 또는 치료제, 예컨대 항암제, 항암 치료제, 호르몬제, 항EGFR 제제 또는 항체 또는 면역 조절제를 함유하는 조성물을 고찰하며 포함한다. 흔히 일반적으로, 상기 항암제는 티로신 키나제 억제제 또는 인산화 캐스케이드 억제제, 해독후 조절제, 세포 성장 또는 분열 억제제(예, 항유사분열제) 또는 시그널 형질도입 억제제일 수 있다. 다른 치료법 또는 치료제는 적당한 용량의 통증 완화 약물, 예컨대 비스테로이드성 항염증 약물(예, 아스피린, 파라세타몰, 이부프로펜 또는 케토프로펜) 또는 몰핀과 같은 아편제, 또는 항구토제의 투여를 포함할 수 있다. 조성물은 티로신 키나제 억제제(예컨대, AG1478 및 ZD1839, STI571, OSI-774, SU-6668), 독소루비신, 테모졸로마이드, 시스플라틴, 카보플라틴, 니트로소우레아, 빈크리스틴, 하이드록시우레아, 5-플루오로우라실, 시토신, 아라비노사이드, 시클로포스파미드, 에피포도필로톡신, 카무스틴, 로무스틴 및/또는 다른 화학치료제와 함께(순차적으로(즉, 전이나 후에) 또는 동시적으로) 투여될 수 있다. 이러한 제제는 즉 항EGFR 특이적 제제 또는 티로신 키나제 억제제, 예컨대 AG1478, ZD1839, STI571, OSI-774 또는 SU-6668이거나 또는 더 일반적인 항암제 및 항신생물제, 예컨대 독소루비신, 시스플라틴, 테모졸로마이드, 니트로소우레아, 프로카바진, 빈크리스틴, 하이드록시우레아, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노사이드, 시클로포스파미드, 에피포도필로톡신, 카무스틴 또는 로무스틴일 수 있다. 또한, 조성물은 덱사메타손과 같은 호르몬, 면역조절제, 예컨대 인터루킨, 종양 괴사 인자(TNF), 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF) 또는 면역반응 및 암세포 또는 종양의 감소 또는 제거를 자극하는 또 다른 성장 인자 또는 시토킨과 함께 투여될 수 있다. TNF와 같은 면역 조절제는 806 EGFR 에피토프를 인식할 뿐만 아니라 TNF 수용체에도 결합하는 이중특이성 항체 형태의 본 발명의 성분과 함께 혼합될 수 있다. 이러한 조성물은 또한 다른 항EGFR 항체, 예컨대 항EGFR 항체 528, 225, SC-03, DR8.3, L8A4, Y10, ICR62 및 ABX-EGF와 함께 투여될 수 있고, 그런 항체와의 혼합물을 포함할 수도 있다.
항EGFR 항체와 함께 독소루비신 및 시스플라틴과 같은 제제의 사용이 항종양 활성을 증강시킨다는 것은 이미 알려져 있다(Fan et al, 1993; Baselga et al., 1993). 독소루비신과 mAb528의 혼합물은 확립된 A431 이종이식편을 완전히 근절시킨 반면, 어느 한 제제만을 이용한 치료는 일시적인 생체내 성장 억제를 유발했다(Baselga et al., 1993). 이와 마찬가지로, 시스플라틴과 mAb528 또는 225의 혼합물 역시 확립된 A431 이종이식편을 근절시킨 반면, 어느 한 제제를 이용한 치료 시에는 이러한 근절이 관찰되지 않았다(Fan et al., 1993).
앞에서 암시된 바와 같이, 본 발명의 진단 방법은 세포 시료 또는 배양액을 수용체 에피토프 펩타이드에 대한 길항물질, 예컨대 항수용체 펩타이드 항체, 바람직하게는 친화성 정제된 폴리클로날 항체, 더욱 바람직하게는 mAb의 유효량을 함유하는 분석법을 이용하여 조사하는 단계를 포함한다. 전술한 바와 같이, 이러한 방법으로 이익을 얻을 수 있는 환자는 종양, 암, 전암성 병변 또는 다른 성장 인자 수용체 질환을 앓고 있는 환자를 포함한다. 표적 세포, 특히 종양 또는 종양발생성 세포 또는 암 세포의 조사, 분리, 인식 또는 사멸을 돕기 위하여 항수용체 펩타이드 항체를 유도하고 항수용체 펩타이드 항체의 능력을 측정하여 최적화하는 방법은 모두 당업계에 공지되어 있다.
폴리클로날의 항수용체 펩타이드 항체를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(미국 특허 4,493,795, Nestor et al.). 일반적으로 유용한 항체 분자의 Fab 및/또는 F(ab')2 부분을 함유하는 모노클로날 항체는 본 발명에 참고인용된 문헌[Antibodies - A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1988)]에 설명된 하이브리도마 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 간략히 설명하면, 모노클로날 항체 조성물이 생산되는 하이브리도마를 제조하기 위하여, 수용체 펩타이드 또는 이의 면역원성 단편으로 과다면역화된 포유동물의 비장으로부터 수득한 림프구를 골수종 또는 다른 자가영구증식성 세포주와 융합시킨다.
비장세포와 골수종 세포의 융합은 일반적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 6000을 이용하여 실시한다. 융합된 하이브리드화는 HAT에 대한 민감성을 통해 선발한다. 본 발명을 수행하는데 유용한 모노클로날 항체 생산용 하이브리도마는 본 발명의 수용체 펩타이드와 면역반응하는 능력 및 표적 세포 중의 특정 수용체 펩타이드 또는 수용체 활성을 억제하는 능력을 통해 동정한다.
본 발명을 수행하는데 유용한 모노클로날 항체는 적당한 항원 특이성의 항체 분자를 분비하는 하이브리도마를 함유하는 영양 배지를 포함한 모노클로날 하이브리도마 배양물을 개시시켜 생산할 수 있다. 배양물은 하이브리도마가 항체 분자를 배지로 분비하기에 충분한 조건과 시간 동안 유지시킨다. 그 다음 항체 함유 배지를 수거한다. 그 후, 항체 분자는 공지의 기술을 통해 분리할 수 있다.
이러한 조성물의 제조에 유용한 배지는 당업계에 공지되어 있을 뿐만 아니라 시판되고 있으며, 그 예에는 합성 배양 배지, 순계 마우스 등이 있다. 합성 배지의 예로는 글루코스 4.5gm/l, 글루타민 20mm 및 20% 태내송아지 혈청이 보충된 둘베코 최소 필수 배지(DMEM; Dulbecco et al, Virol. 8:396(1959))가 있다. 순계 마우스 종의 일 예는 Balb/c이다.
하이브리도마를 이용하여 모노클로날 항체를 제조하는 일반적인 방법은 공지되어 있다. 무한증식성 항체 생산 세포주는 또한 융합 이외의 다른 기술로 제조할 수 있는데, 그 예에는 B 림프구의 종양발생성 DNA를 이용한 직접 형질전환, 또는 엡스타인 바 바이러스에 의한 형질감염이 있다. 문헌[M. Schreier et al.,"Hybridoma Techniques" (1980); Hammerling et al. ,"Monoclonal Antibodies And T-cell Hybridomas" (1981); Kennett et al., "Monoclonal Antibodies" (1980); 미국 특허 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,451,570; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632; 4,493,890]을 참조할 수 있다.
모노클로날 항수용체 펩타이드 항체를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다[Niman et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80: 4949-4953(1983)]. 일반적으로, 본 발명의 수용체 펩타이드 또는 펩타이드 유사체는 전술한 항수용체 펩타이드 모노클로날 항체 생산 방법에서 면역원으로서 단독으로 사용되거나 면역원성 담체에 접합되어 사용된다. 하이브리도마는 수용체 펩타이드와 면역반응하는 항체를 생산하는 능력을 통해 선별한다.
통상적인 하이브리도마 기술과 다른 모노클로날 항체 제조용 기술이 다수가 공지되어 있다. 특히 유용한 기술은 완전 사람 항체를 제조하는 방법이다. 1가지 방법은 친화성 농축 방법을 이용하여 항원에 특이적으로 결합하는 사람 항체의 범위를 선발하는데 사용될 수 있는 파지 디스플레이 기술이다. 파지 디스플레이는 문헌에 충분히 설명되어 있고, 파지 디스플레이 라이브러리의 작제 및 선별에 대해서는 당업계에 공지되어 있다[예컨대, Hoogenboom et al. Trends Biotechnol., 15: 62-70(1997); Hoogenboom, et al. Immunotechnology 4:1-20(1998); McGregor et al. Mol. Biotechnol, 6:155-62(1996); 및 Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988)]. 또한, 완전한 사람 항체는 사람 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 대부분을 담고 있는 유전자전이 마우스를 면역원으로 면역화하여 제조할 수 있다. 이러한 마우스의 예는 당업계에 공지되어 있으며, 그 예에는 Xenomouse®(Abgenix, Inc.) 및 HuMAb-Mouse(Medarex, Inc.)가 있다. 또한, 미국 특허 6,207,418, 6,150,584, 6,111,166, 6,075,181, 5,922,545, 5,545,806 및 5,569,825를 참조한다. 그 다음, 항체는 표준 기술, 예컨대 표준 하이브리도마 기술 또는 파지 디스플레이를 통해 제조할 수 있다.
사람 이외의 다른 종, 예컨대 마우스로부터 하이브리도마 기술을 통해 유도된 모노클로날 항체는 인체화될 수 있으며, 이는 비사람 항체가 사람에게 주입되었을 때 HAMA가 일어나지 않도록 유전자적으로 더욱 사람화되게 조작된 것을 의미한다. 항체의 인체화 방법은 당업계에 공지되어 있고, 그 중에서 일반적인 방법은 상보성 결정 영역(CDR) 이식 및 피복(재표면화라고도 알려져 있다) 기술이다. 이러한 방법은 문헌과 특허문헌에 상세하게 설명되어 있고, 그 예에는 King "Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies" Taylor & Francis, 1998; 미국 특허 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089, 5,859,205 및 6,797,492(각각 본원에 참고인용됨)가 있다.
본 명세서에 기술된 에피토프 및 대응하는 수용체와 결합/차단/표적화하는 반응을 하거나 또는 다른 몇몇 방식으로 상호작용하는 분자를 개발할 수 있는 다른 방법은 펩타이드 제조에 의한 방법이다. 이러한 펩타이드는 에피토프에 대해 친화성이 있는 임의의 랜덤 펩타이드일 수 있으며, 반드시 면역글로불린 계열에 속하는 것일 필요는 없다. 이러한 펩타이드는 종종 파지 디스플레이 항체에서와 유사한 기술에 의해 분리되기도 한다(Szardenings, J Recept Signal Tranduct Res. 2003; 23(4): 307-49). 이러한 랜덤 펩타이드 라이브러리 유래의 펩타이드의 용도는 항체 및 항체 단편의 용도와 유사하다.
또한, 본 발명은 앞에서 언급된 폴리펩타이드 리간드와 같은 자극의 존재를, 본 발명의 수용체 펩타이드에 의해 매개되는 활성을 유도해내는 능력을 참고로 하여 검출하는 방법을 포함하는 다양한 진단 용도들에 관한 것이다. 앞에서 언급한 바와 같이, 수용체 펩타이드는 다양한 공지의 기술을 통해 자신에 대한 항체를 생산하는데 사용될 수 있고, 이러한 항체는 그 다음 분리되어, 의심되는 표적 세포에서 특정 활성의 존재 여부를 조사하는 검사에 활용될 수 있다.
앞에서 상세히 설명한 바와 같이, 수용체 펩타이드에 대한 항체는 공지의 하이브리도마 기술을 비롯한 표준 방법을 통해서 생산하여 분리할 수 있다. 편의상, 수용체 펩타이드에 대한 항체는 Ab1로 표시하며, 다른 종에서 유발된 항체는 Ab2로 표시했다. 이하에서 확인할 수 있듯이, Ab2의 특징적인 성질은 Ab1과 반응한다는 것이다. 상세한 설명과 청구의 범위를 위해 Ab1은 1차 또는 항수용체 펩타이드 항체로. Ab2는 2차 또는 항Ab1 항체로 나타낼 것이다.
세포에 존재하는 노출된 수용체 에피토프 펩타이드의 존재는 이러한 측정에 이용할 수 있는 통상의 면역학적 방법에 따라 확인할 수 있다. 다수의 유용한 방법이 공지되어 있다. 이러한 방법 중 특히 유용한 방법 3가지는 검출성 표지로 표지된 수용체 펩타이드, 검출성 표지로 표시된 항체 Ab1 또는 검출성 표지로 표지된 항체 Ab2를 이용한다. 이러한 방법들은 다음과 같은 방정식으로 요약될 수 있다. 여기서 별표는 그 입자가 표지된 것을 나타내고, "~"는 수용체 펩타이드를 나타낸다.
A. ~* + Ab1 = ~*Ab1
B. ~ + Ab* = ~Ab1 *
C. ~ + Ab1 + Ab2 * = ~Ab1Ab2 *
이러한 방법들과 이들의 응용은 당업자에게는 모두 익숙한 바, 본 발명의 범위 안에서 활용될 수 있다. "경쟁적" 방법인 방법 A는 미국 특허 3,654,090 및 3,850,752에 기술되어 있다. "샌드위치" 방법인 방법 C는 미국 특허 RE31,006 및 4,016,043에 기술되어 있다. 또 다른 방법으로서 "이중 항체" 또는 "DASP" 방법 등이 공지되어 있다.
각 경우마다 수용체 펩타이드는 하나 이상의 항체 또는 결합 파트너와 복합체를 형성하고, 이러한 복합체 중 한 성분은 검출성 표지가 부착된다. 복합체의 형성 여부 및 필요한 경우 그 함량은 표지 검출에 이용할 수 있는 공지된 방법으로 측정할 수 있다.
이러한 연구에 가장 일반적으로 이용되는 표지는 방사선활성 원소, 효소, 자외선에 노출될 때 형광을 방출하는 화학물질 등이다.
다수의 형광 물질이 공지되어 있으며, 표지로서 이용될 수 있다. 그 예에는 플루오레세인, 로다민, 아우라민, 텍사스 레드, AMCA 블루 및 루시퍼 옐로우가 있다. 특정 검출 물질은 염소에서 제조되어 이소티오시아네이트를 통해 플루오레세인과 접합된 항래빗 항체이다.
수용체 펩타이드 또는 이의 결합 파트너는 또한 방사선활성 원소 또는 효소로 표지될 수 있다. 방사선활성 표지는 현재 통용되는 계수 방법 중 임의의 방법을 통해 검출할 수 있다. 바람직한 동위원소는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I 및 186Re 중에서 선택될 수 있다.
이와 마찬가지로 효소 표지도 유용하며, 통용되는 비색법, 분광분석법, 형광분광분석법, 전류측정법 또는 가스정량법 중 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 효소는 카르보디이미드, 디이소시아네이트, 글루타르알데하이드 등과 같은 가교 분자와의 반응을 통해 선택된 입자에 접합된다. 이러한 방법에 사용될 수 있는 효소는 다수가 공지되어 있고 이용될 수 있다. 바람직한 것은 퍼옥시다제, β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 글루코스 옥시다제 + 퍼옥시다제 및 알칼리성 포스파타제이다. 미국 특허 3,654,090; 3,850,752; 및 4,016,043에는 대체 표지성 물질 및 방법이 명세서에 설명되어 있다.
본 발명에 따라 개발되고 이용되는 특정 분석 시스템은 수용체 분석법으로 알려진 것이다. 수용체 분석법에 따르면, 분석될 물질은 적당히 표지된 후, 일정량의 표지된 물질 및 미표지된 물질을 특정 세포 검사 콜로니에 접종하고, 그 다음 결합 검사를 수행하여 표지된 물질이 세포 수용체에 결합하는 정도를 측정한다. 이러한 방법에 따르면 두 물질간의 친화성 차이가 확인될 수 있다.
따라서, 수용체 펩타이드의 정제된 함량이 방사선표지된 다음, 이에 대한 항체 또는 다른 억제제 등과 혼합된 후에 결합 검사가 수행되어질 것이다. 따라서, 다양한 함량의 표지 및 미표지의 혼합전 수용체 펩타이드를 함유하는 용액이 제조될 것이며, 그 후 세포 시료가 접종되고 그 다음 배양될 것이다. 수득되는 세포 단층은 그 다음 세척되고, 가용화된 다음, 표준 오차가 <5%이 되기에 충분한 시간 동안 감마 계수기에서 계수된다. 수득되는 결과를 스캐챠드 분석으로 처리하면 물질의 활성에 관한 관찰 및 결론이 수득될 수 있다. 이러한 설명은 예시적이지만, 분석된 물질의 세포 결합 능력이 특이한 특징으로서 작용할 수 있는 경우에 수용체 분석법이 수행되고 이용될 수 있는 방식을 설명한 것이다.
본 발명에 따라서 예상되는 유용한 분석법은 "시스/트란스" 분석법으로 알려진 것이다. 간략히 설명하면, 이 분석법은 2개의 유전자 작제물을 이용하며, 이 중 하나는 일반적으로 적당한 세포주로 형질감염되었을 때 당해의 특정 수용체를 지속적으로 발현하는 플라스미드이고, 다른 하나는 수용체/리간드 복합체의 제어 하에서 루시퍼라제와 같은 리포터(reporter)를 발현하는 플라스미드이다. 따라서, 예컨대 특정 수용체의 리간드로서 화합물을 평가하는 것이 바람직하다면 첫 번째 플라스미드는 선택된 세포주에서 수용체를 발현시키는 작제물이며, 두 번째 플라스미드는 특정 수용체에 대한 반응 성분이 삽입되어 있는 루시퍼라제 유전자에 결합된 프로모터를 보유할 것이다. 검사 중인 화합물이 수용체의 작용물질인 경우에 리간드는 수용체와 복합체를 형성할 것이며, 수득되는 복합체는 반응 성분에 결합하여 루시퍼라제 유전자의 전사를 개시시킬 것이다. 그 다음 산출되는 화학발광도는 분광광도계로 측정하고, 용량 반응 곡선을 작도하여 공지의 리간드와 비교한다. 이러한 방법은 인용이 목적인 미국 특허 4,981,784 및 PCT 국제 공개 번호 WO 88/03168에 상세히 설명되어 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 의학적 전문가가 사용하기에 적합한 시판용 검사 키트가 의심되는 표적 세포 중의 비정상인 성장 인자 수용체 또는 노출된 수용체 에피토프 펩타이드의 존재 여부를 측정하기 위한 용도로 제조될 수 있다. 앞에서 논의한 검사 기술에 따르면, 이러한 키트의 한 분류는 적어도 표지된 수용체 펩타이드 또는 이의 결합 파트너, 예컨대 특이적인 항체, 및 사용법, 물론 "경쟁적", "샌드위치", "DASP"등과 같은 선택 방법에 따라 다른 사용법을 함유할 것이다. 또한, 키트는 완충제, 안정화제 등과 같은 기타 시약을 함유할 수도 있다.
따라서, 검사 키트는 EGFR, 활성을 비롯한 소정의 비정상 성장 인자 수용체의 세포 내 존재 또는 그 수용체에 대한 세포의 능력을 증명하기 위한 목적으로 제조할 수 있는 것으로서,
(a) 존재하는 수용체 펩타이드 또는 이에 대한 특이적인 결합 파트너를 검출성 표지에 직접 또는 간접 부착시켜 수득한 소정량의 적어도 하나의 표지된 면역화학적 반응성 성분;
(b) 다른 시약; 및
(c) 본 키트의 사용 안내서를 함유한다.
더욱 구체적으로, 진단 검사 키트는
(a) 일반적으로 고체 상에 결합되어 면역흡착체를 형성하거나, 또는 대안적으로 적당한 태그, 또는 이러한 복수의 말단 산물 등(또는 이들의 결합 파트너)에 결합되는, 공지 양의 전술한 바와 같은 수용체 펩타이드(또는 결합 파트너);
(b) 필요한 경우, 다른 시약; 및
(c) 이 검사 키트의 사용 안내서를 함유할 수 있다.
또 다른 변형으로서, 검사 키트는 소정의 방법(예, "경쟁적", "샌드위치", "이중 항체" 등)에 따라 작용하는 검사 키트를 제조하고 전술한 목적에 사용할 수 있으며,
(a) 수용체 펩타이드를 검출성 표지에 커플링시켜 수득한 표지된 성분;
(b) 적어도 하나의 시약이
(i) 표지된 성분과 결합할 수 있는 리간드;
(ii) 표지된 성분 (a)의 결합 파트너와 결합할 수 있는 리간드;
(iii) 측정될 성분 중 적어도 하나와 결합할 수 있는 리간드; 및
(iv) 측정될 성분 중 적어도 하나의 성분의 적어도 하나의 결합 파트너와 결합할 수 있는 리간드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 리간드 또는 고정된 리간드인 하나 이상의 면역화학적 시약;
(c) 상기 수용체 펩타이드와 이에 대한 특이적인 결합 파트너 사이에 면역화학적 반응을 일으키는 하나 이상의 성분을 검출 및/또는 측정하기 위한 방법의 성능에 대한 안내서를 함유한다.
전술한 바와 같이, 수용체 펩타이드 또는 이에 대한 항체의 활성을 조절하는데 효과적인 잠재 약물을 선별하는 분석 시스템을 제조할 수 있다. 여기서, 수용체 펩타이드 또는 항체는 검사 시스템에 첨가될 수 있고, 잠재성이 있는 약물 역시 최종 세포 배양물에 첨가될 수 있으며, 그 후 잠재성이 있는 약물 단독의 첨가에 의하거나 또는 공지의 수용체 펩타이드 또는 이에 대한 항체의 첨가 함량의 효과로 인해 세포의 성장 인자 수용체 활성에 일어나는 임의의 변화를 관찰하기 위하여 배양물을 조사한다.
조성물
본 발명은 또한 본 발명의 치료 방법을 수행하는데 유용한 치료 조성물에 관한 것이다. 이러한 치료 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제(담체) 및 활성 성분으로서 본 명세서에 기술된 하나 이상의 수용체 펩타이드, 특히 서열번호 1 내지 14 중 임의의 서열을 갖는 펩타이드 중에서 선택되는 펩타이드 또는 이의 면역원성 단편을 혼합물로 함유한다.
폴리펩타이드, 이의 유사체 또는 활성 단편을 활성 성분으로서 함유하는 치료 조성물의 제법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 이러한 조성물은 주사제로서, 액체 용액이나 현탁액으로서 제조되지만, 주사 전에 액체 중의 용액이나 현탁액으로 제조하기에 적합한 고체 형태로도 제조될 수 있다. 또한, 제법은 에멀젼화일 수도 있다. 활성 치료 성분은 종종 약제학적으로 허용되는이며 활성 성분과 상용성인 부형제와 혼합되기도 한다. 적당한 부형제에는 예컨대 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 이의 혼합물이 있다. 또한, 필요하다면 조성물은 소량의 보조 물질, 예컨대 습윤화제 또는 에멀젼화제, 활성 성분의 효과를 증강시키는 pH 완충제를 함유할 수도 있다.
폴리펩타이드, 유사체 또는 활성 단편은 중화된 약제학적으로 허용되는 염 형태로서 치료 조성물에 배합될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염에는 염산이나 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산에 의해 형성된 산 부가 염(폴리펩타이드 또는 항체 분자의 유리 아미노 기에 의해 형성된 염)이 포함된다. 유리 카르복시 기에 의해 형성된 염도 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 철계 수산화물과 같은 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기에 의해 유도될 수 있다.
치료용 수용체 펩타이드 또는 면역원성 단편 함유 조성물은 예컨대 단위 용량의 투여 또는 주사를 통해 정맥내로, 복강내로, 근육내로 또는 경구적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 치료 조성물과 관련하여 사용된 "단위 용량"이란 용어는 사람에 대한 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하는 것으로서, 각 단위는 담체 또는 매개제와 같은 필요한 희석제와 혼합되어 원하는 치료 효과를 제공하도록 계산된 활성 물질의 소정량을 함유한다. 치료 수용체 펩타이드 EH는 면역원성 단편 함유 조성물은 면역화 스케줄에 따라 연속으로 분할 투여될 수 있다.
조성물은 투약 제형에 적합한 방식으로 치료학적 유효량으로 투여한다. 투여할 양은 치료받는 검체, 활성 성분을 이용하는 검체 면역계의 역량 및 원하는 성장 인자 수용체 결합 및 시그널링 역량의 억제 또는 중화 정도에 따라 달라진다. 투여해야 하는 활성 성분의 정확한 양은 전문의의 판단에 따라 달라지며 각 개체마다 다르다. 하지만, 적당한 투여량은 하루에 개체의 체중 kg당 활성 성분 약 0.1 내지 20mg, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 10mg, 더욱 바람직하게는 1 내지 수 mg 범위일 수 있으며, 투여 경로에 따라서 달라진다. 1차 투여 및 추가 접종의 적당한 섭생 역시 다양하지만, 전형적인 방식은 1차 투여 후 1시간 또는 그 이상의 시간 간격을 투고 후속 주사 또는 다른 투여 방식으로 반복 용량을 투여하는 것이다. 또는, 혈액 중의 농도를 10nM 내지 10μM 범위로 유지시키기에 충분한 지속 정맥 주입도 사용가능하다.
치료 조성물은 유효량의 수용체 펩타이드 또는 이에 대한 항체와 추가로 하나 이상의 활성 성분, 즉 항유사분열제, 화학치료제 또는 면역조절제를 함유할 수 있다.
핵산
본 발명의 다른 특징은 본 명세서에 개시된 수용체 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열의 발현이다. 당업계에 공지된 바와 같이, DNA 서열은 적당한 발현 벡터 중의 발현 제어 서열에 작동적으로 결합시킨 후 이러한 발현 벡터를 적당한 단세포 숙주의 형질전환에 이용하여 발현시킬 수 있다. 이와 같은 발현 제어 서열에 대한 본 발명의 DNA 서열의 작동적인 결합은, 이미 DNA 서열에 속해 있는 부분이 아니라면, 개시 코돈 ATG를 DNA 서열의 정확한 리딩 프레임 상류에 제공하는 단계를 포함한다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키는 데에는 다양한 숙주/발현 벡터 조합이 이용될 수 있다. 유용한 발현 벡터는 예컨대 염색체성, 비염색체성 및 합성 DNA 서열의 분절들로 이루어질 수 있다. 적당한 벡터에는 SV40 및 공지된 박테리아 플라스미드의 유도체, 예컨대 E.coli 플라스미드 col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체들과 RP4와 같은 플라스미드; 파지 DNAS, 예컨대 파지 λ의 다양한 유도체, 예컨대 NM989, 및 다른 파지 DNA, 예컨대 M13 및 필라멘트형 일본쇄 파지 DNA; 효모 플라스미드, 예컨대 2μ 플라스미드 또는 이의 유도체; 진핵생물 세포에 유용한 벡터, 예컨대 곤충 또는 포유동물 세포에 유용한 벡터; 플라스미드와 파지 DNA의 조합에서 유래되는 벡터, 예컨대 파지 DNA 또는 다른 발현 제어 서열을 이용하도록 변형시킨 플라스미드 등이 포함된다.
다양한 발현 제어 서열 중 임의의 서열, 즉 여기에 작동적으로 결합된 DNA 서열을 발현을 제어하는 서열은 본 발명의 DNA 서열을 발현하기 위해 상기 벡터들에 이용될 수 있다. 이러한 유용한 발현 제어 서열에는 예컨대 SV40, CMV, 백시니아, 폴리오마 또는 아데노바이러스의 초기 프로모터 또는 후기 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 시스템, TRC 시스템, LTR 시스템, 파지 λ의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 피막 단백질의 제어 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 해당작용 효소의 프로모터, 산 포스파타제(예, Pho5)의 프로모터, 효모 α교배 인자의 프로모터 및 원핵생물 또는 진핵생물 세포 또는 이들의 바이러스들의 유전자 발현을 제어하는 것으로 알려진 다른 서열들, 및 이들의 다양한 조합물이 포함된다.
또한, 단세포 숙주 세포는 다양한 종류가 본 발명에 따른 DNA 서열의 발현에 유용하다. 이러한 숙주로는 공지된 진핵생물 및 원핵생물 숙주가 포함될 수 있으며, 예컨대 대장균, 슈도모나스(Pseudomonas), 바실러스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 효모와 같은 진균, 및 동물 세포, 예컨대 CHO, R1.1, B-W 및 L-M 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(예, COS1, COS7, BSC1, BSC40 및 BMT10), 곤충 세포(예, Sf9) 및 조직 배양된 사람 세포 및 식물 세포가 있다.
일부 벡터, 발현 제어 서열 및 숙주는 본 발명의 DNA 서열을 발현하는 능력이 비슷하게 양호할 수 있다는 것은 당연하다. 하지만, 동일한 발현 시스템에 의해 모든 숙주가 동일한 유효 기능을 발휘하지는 않는다. 그렇지만, 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 원하는 발현을 달성하기 위해 과도한 실험없이도 적당한 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주를 선택할 수 있다. 예컨대, 벡터 선택 시, 숙주는 그 벡터가 작동할 수 있는 것인지 고려되어야 한다. 벡터의 카피수, 카피수를 제어하는 능력 및 벡터에 의해 암호화되는 다른 임의의 단백질, 예컨대 항생제 마커의 발현도 고려되어야 한다.
발현 제어 서열의 선택 시에는 보통 다양한 요인이 고려된다. 예컨대, 시스템의 상대적 강도, 제어성 및 발현될 특정 DNA 서열 또는 유전자와의 상용성, 및 특히 잠재적인 2차 구조에 관해서 고려된다. 적합한 단세포 숙주는 예컨대 선택된 벡터와의 상용성, 분비 특징, 단백질을 정확하게 폴딩하는 능력, 발효 조건 뿐만 아니라 발현되는 DNA 서열에 의해 암호화된 산물이 숙주에게 미치는 독성 및 발현 산물의 정제 용이성 등을 고려하여 선택한다.
이러한 요인은 물론 다른 요인을 고려하여 당업자는 발효조 또는 대량 동물 배양물에서 본 발명의 DNA 서열을 발현하는 다양한 벡터/발현 제어 서열/숙주 조합을 작제할 수 있다.
또한, 본 발명의 범위 안에서 유도된 단백질 복합체/서브유닛의 뉴클레오타이드 서열을 이용하여 펩타이드 유사체를 제조할 수 있을 것으로 생각된다. 단편과 같은 유사체는 상기 펩타이드의 단백분해성 분해, 예컨대 펩신 분해를 통해 제조할 수 있다. 뮤테인과 같은 다른 유사체는 수용체 펩타이드 암호화 서열의 표준 부위 지시성 돌연변이유발법을 통해 제조할 수 있다. 프로모터로서 또는 억제제로서의 작용 여부에 관계없이 소분자와 같은 "수용체 에피토프 펩타이드 활성"을 나타내는 유사체는 공지된 생체내 및/또는 시험관내 분석을 통해 동정할 수 있다.
앞에서 언급한 바와 같이, 수용체 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열은 클로닝보다는 합성법으로 제조할 수 있다. DNA 서열은 수용체 펩타이드 아미노산 서열에 대한 적당한 코돈을 이용하여 설계할 수 있다. 일반적으로, 서열이 발현에 사용될 경우, 계획한 숙주에 바람직한 코돈을 선택할 수 있다. 전체 서열은 표준 방법에 따라 제조한 올리고뉴클레오타이드를 중첩(overlap)시킨 후 완전한 암호화 서열로 어셈블리하여 제조한다[예컨대, Edge, Nature, 292: 756(1981); Nambair et al., Science, 223: 1299(1984); Jay et al., J.Biol.Chem., 259: 6311(1984)].
합성 DNA 서열은 수용체 펩타이드 유사체 또는 "뮤테인"을 발현하는 유전자의 작제를 용이하게 한다. 또는, 뮤테인을 암호화하는 DNA는 천연 성장 인자 수용체 유전자 또는 cDNA의 부위 지시성 돌연변이유발을 통해 제조할 수 있지만, 통상적인 폴리펩타이드 합성을 사용하여 직접 뮤테인을 제조할 수도 있다.
단백질에 비천연 아미노산을 부위 특이적으로 병입시키는 일반 방법에 대해서는 문헌[Christopher J. Noren, Spencer J. Anthony-Cahill, Michael C. Griffith, Peter G. Schultz, Science, 244: 182-188(April 1989)]에 설명되어 있다. 이 방법은 비천연 아미노산을 이용하여 유사체를 제조하는데 사용할 수 있다.
항원 및 백신
T 세포에 의해 인식되는 종양 항원의 특성 규명은 분명한 항원을 이용하여 암에 대항하여 환자를 면역화시키는 기회를 최초로 제공하여 암-백신 연구의 대변혁을 일으켰다. 흑색종은 면역원성 종양의 원형 중 하나이기 때문에 수많은 초기 임상 시험이 흑색종을 가지고 실시되었다. 일부 종양 퇴행은 주로 전이 질환 환자에 대해서 상세히 보고되고 있다. 최근 연구들은 항암 면역 반응을 모니터하는 신규 수단과 강력한 항흑색종 면역 반응의 유도를 목표로 한 보강제의 개발을 포함한다.
전립선 암은 미국내 남성들의 암 사망 원인 중 2위인 질환이다. 백신 전략은 새로운 치료 방법을 제시했다. 전립선 암 백신의 잠재적인 표적 중 하나는 전립선 암과 정상 전립선 상피 세포에서 제한적 발현성을 나타내는 전립선 특이적 항원(PSA)이다. 세포독성 T 림프구(CTL)을 활성화할 수 있고 결과적으로 펩타이드 특이적 CTL로 종양 표적들을 사멸시킬 수 있는 수많은 PSA 특이적 에피토프가 동정되었다. 현재 임상 시험 중에 있는 전략에는 RNA 펄스된 수지상 세포 백신, 재조합 단백질 백신 및 백신의 재조합 바이러스 벡터 전달이 있다. 또한, 더욱 새로운 T 세포 활성화를 증강시키는 보조자극성(costimulatory) 분자도 연구되고 있다.
수지상 세포(DC)는 동물과 사람에서 원발성 T 세포 항종양 면역 반응을 자극할 수 있는 능력이 있는 강력한 항원 제시 세포(antigen presenting cell)이다. 1995년에 수지상 세포 백신접종의 임상 연구가 처음 공개된 이래로 1000명이 넘는 백신접종자에 관한 98개 연구가 피어 리뷰 의학 저널에 공개되거나 미국 임상 종양 학회, 미국 암 연구 학회 또는 미국 혈액학회의 정기 모임에 제출되었다. 연구는 15개국에서 실시되었다. 본 연구에는 24 종류보다 많은 종양 환자들이 참여했고, 대부분의 연구는 합성 항원 또는 이디오타입 항체로 펄싱된 자가 DC를 사용하여 악성 흑색종, 전립선암, 결장직장 암종 또는 다발성 흑색종 환자들을 조사했다. 또한, DC 백신은 종양 용해물 또는 RNA로 DC를 펄싱하거나, 종양 DNA를 이용한 형질감염에 의해, 또는 종양 세포/DC 융합물 제조를 통해 만들었다. 또한, 백신 세포수, 백신 프로그램 기간, 백신접종 부위, 백신의 동결 보존 및 DC의 성숙화 단계의 사용에 대한 다양한 시도들이 이루어졌다. DC 백신접종과 관련된 부작용이 가끔 나타났지만, 대부분은 마일드하고 개인에 따른 것이었으며, 심각한 것은 전혀 없었다. 임상 반응은 약 50% 검사에서 관찰되었다. 따라서 DC 백신접종은 펩타이드 백신의 제한적인 범위와 면역원성을 극복할 수 있는 암 면역요법의 안전한 방법으로 사용될 수 있다.
마우스와 원숭이에서 성공적인 연구 이후, 곤잘레스 등(Gonzales, G et al(2003) Annals Oncol 14: 461-466)은 진행성 단계의 비소세포 폐암(NSCLC) 환자에게 담체 단백질, P64K 수막염균(Neisseria meningitides) 외막 재조합 단백질에 결합된 EGFR 리간드, EGF를 백신접종한 사람 대상 연구를 보고했다. 항EGF 항체 반응이 양호한 환자의 생존 시간이 더 긴 것으로 관찰되었다.
백신을 비롯한 합성 항원은 경우에 따라 다른 종양 항원도 본 발명의 수용체 펩타이드를 화학적으로 합성하여 제조할 수 있다. 이러한 펩타이드, 펩타이드 담체 혼합물, 이러한 펩타이드의 지질 유도체 뿐만 아니라 종양 항원은 개별적으로 사용되거나 혼합물로 혼합된 후, 보강제와 배합되어 면역원성 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명에서 고려된 바와 같이, 항원은 당지질 유사체에 공유 결합되어, 이러한 공유 결합 없이 달성될 수 있는 보강 효과보다 큰 보강 효과를 항원에 제공하는 별도의 분자를 구비할 수 있다. 이러한 조성물은 포유동물의 면역화를 위해, 예컨대 근육내 경로, 비경구 경로를 통해, 또는 마이크로캡슐, 캡슐, 리포좀 및 표적 분자(예컨대 독소 및 항체)를 이용한 점막 표면으로의 전달을 통해 사용될 수 있다.
펩타이드를 함유한 백신은 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 그 예로서 본원에 참고 인용된 미국 특허 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 및 4,596,792가 있다. 펩타이드의 생체내 사용은 먼저 펩타이드 자체가 충분히 긴 혈청 및/또는 조직 반감기 및/또는 충분한 면역원성을 보유하고 있지 않기 때문에 화학적 변형을 필요로 할 수 있다. 또한, 입체형태적 제약을 부과하기 위하여 펩타이드를 변형시키는 것이 유리할 수 있다. 이것은, 예컨대 유도되는 작동세포 면역 반응을 최적화하기 위하여 천연 단백질의 환경에 있는 펩타이드의 천연 발생의 입체형태를 모방하도록 하는데 유용할 수 있다.
본 발명은 수용체 펩타이드 또는 이의 면역원성 단편 및 이의 혼합물의 일정량을 함유하는 면역원성 조성물을 제공한다. 일 양태에 따르면, 수용체 펩타이드는 서열번호 1 내지 14 중에서 선택된다.
본 발명은 검체에게 일정량의 수용체 펩타이드 또는 이의 면역원성 단편과 적합한 보강제를 투여하는 것을 포함하여, 항원 특이적 세포 매개 면역 반응을 자극하거나 강화시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 면역조절제로서 본 발명에 따른 수용체 펩타이드와 보강제 조성물의 일정량과 적당한 담체 또는 희석제를 검체에게 투여하는 것을 포함하여, 종양 또는 암이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 암이 있는 검체는 수용체 펩타이드-보강제 조성물로 치료될 수 있다. 이러한 암에는 두경부암, 유방암, 폐암, 난소암, 방광암, 후두암, 편평세포 암종 또는 전립선암 및 신경아교종이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
또한, 검체의 치료는 화학요법, 화학예방법 또는 방사선요법과 함께 상기 수용체 펩타이드 또는 면역원성 조성물로 수행할 수 있다. 즉 수용체 펩타이드 조성물이 화학요법 또는 방사선요법 개입과 함께 사용될 수 있다는 점도 본 발명에서 고려되는 양태이다. 다른 양태에 따르면, 수용체 펩타이드 조성물의 치료는 수분에서 수주의 간격을 두고 DNA 손상제 처리보다 선행되거나 후속될 수 있다. 그 방법과 프로토콜은 당업자에게 공지되어 있다. DNA 손상제 또는 손상 요인은 당업자에게 공지되어 있으며, 세포에 가했을 때 DNA 손상을 유도하는 임의의 화학적 화합물이나 치료 방법을 의미한다. 이러한 제제 및 요인에는 방사선 및 DNA 손상을 유도하는 파동이 있으며, 그 예에는 감마 조사, X선, UV 조사, 마이크로파, 전자 방출 등이 있다. 또한, "화학치료제"로 설명된 다양한 화학적 화합물은 DNA 손상을 유도하는 기능이 있고, 이들 모두 본 명세서에 개시된 복합 치료법에 사용할 수 있을 것으로 생각된다. 사용할 수 있는 생각되는 화학치료제에는 예컨대 아드리아마이신, 5-플루오로우라실(5FU), 에토포사이드(VP-16), 캄프토테신, 액티노마이신-D, 미토마이신 C, 시스플라틴(CDDP) 및 심지어 과산화수소가 있다. 하나 이상의 DNA 손상제 혼합물은 방사선계 또는 실제 화합물 여부에 관계없이 EHA와 함께 사용될 수 있으며, 예컨대 시스플라틴과 X선이 함께 또는 에토포사이드와 시스플라틴이 함께 사용될 수 있다. 다른 신생물제 또는 독성제에는 각각 세팔로스포린(WO-A94 01 137 및 EP-A-0 382 411 참조) 또는 세팔로스포린 머스타드(EP-A-0 484 870 참조) 등에 결합될 수 있는 5-플루오로우라실, 메토트렉세이트 및 아드리아마이신이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
수용체 펩타이드 또는 면역원성 조성물은 주사제로서, 액체 용액이나 에멀젼으로서 제조할 수 있다. 항원 및 면역원성 조성물은 이와 상용성인 생리적 허용성 담체와 혼합될 수 있다. 그 예에는 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 및 이의 혼합물이 있다. 백신은 또한 그 효과를 더욱 향상시키기 위하여 보조 물질, 예컨대 습윤화제, 에멀젼화제 또는 pH 완충제를 추가로 함유할 수 있다. 백신은 피하 또는 근육내 주사로 투여될 수 있다.
또는, 본 발명에 따라 제조된 면역원성 조성물은 점막 표면에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 방식으로 조제되고 전달될 수 있다. 즉, 면역원성 조성물은 비측 또는 경구(위내) 경로 등을 통해 점막 표면으로 투여될 수 있다. 또는, 다른 투여 방식으로서 좌약 등이 바람직할 수 있다. 좌약의 경우 결합제 및 담체로서, 폴리알킬렌 글리콜 및 트리글리세라이드가 포함될 수 있다. 경구용 제제는 보통 이용되는 부형제, 예컨대 의약 등급의 사카린, 셀룰로스 및 탄산마그네슘을 포함할 수 있다.
투여 방식은 보강제 및 결합된 항원이 면역자극적으로 유효한 숙주 동물의 신체 자리에 보강제 또는 보강제 함유 백신을 전달하는 임의의 적합한 수단 및/또는 방법의 사용을 포함할 수 있다. 전달 방식으로는, 비경구 투여법, 예컨대 암주위, 경점막, 경피, 근육내, 정맥내, 피부내, 피하, 복강내, 심실내, 두개골내 및 종양내 투여 등이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명은 이하 실시예를 참조로 하면 더욱 쉽게 이해될 수 있으며, 이러한 실시예는 본 발명의 예시로서 본 발명을 제한하지 않는다. 이하 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 더욱 완전하게 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 총괄적인 범위를 제한하는 것으로서 간주되어서는 안 된다.
실시예 1
표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 건강을 해치는 임상 결과와 종종 관련되어 나타나는 현상인 다수의 표피 암에서 과잉발현된다. EGFR의 과잉발현은 보통 EGFR 유전자의 증폭에 의해 유발되며, 때로는 세포외 도메인에 내부 결실을 보유한 EGFR 변형체(탈2-7 EGFR 또는 EGFRvIII)의 발현과도 관련이 있다. mAb806은 과잉발현될 때 야생형(wt) EGFR의 서브세트와 탈2-7 EGFR를 모두 인식하지만 정상 조직에서 발현되는 wtEGFR에는 결합하지 않는 유의적 항종양 활성을 나타내는 신규 EGFR 항체이다. A431 종양 세포에서 발현되는 낮은 비율의 wtEGFR에 대한 유일한 결합에도 불구하고 mAb806은 누드 마우스에서 성장한 A431 이종이식편에 대하여 강력한 항종양 활성을 나타낸다. 항종양 활성의 방식과 독특한 특이성을 유도하는 기작을 해명하기 위하여, mAb806의 EGFR 결합 에피토프를 측정하고자 했다. 효모 표면에서 발현되거나 또는 면역블롯 판에서 발현된 EGFR 단편에 대한 mAb806 결합을 분석한 결 과, mAb806 에피토프를 함유하는 것으로 보이는 이황화 결합된 루프(아미노산 287 내지 302)를 확인했다. 실제, mAb806은 상기 아미노산에 상응하는 합성 EGFR 펩타이드에 대해 뚜렷한 높은 친화성(약 30nM)으로 결합했다. EGFR 구조 분석은, EGFR이 불활성 테터링된 입체형태에서 리간드 결합된 활성 입체형태로 변화할 때 나타나는 전이 형태의 수용체일 때 mAb806 결합에 유일하게 유용한 것이 상기 이황화 결합된 루프라는 것을 시사한다. mAb806은 이러한 작은 비율의 일시적인 수용체에 결합하여 그 활성화를 방해하고 결과적으로 강력한 항종양 효과를 나타내는 것으로 보인다. 마지막으로, 이러한 본 발명의 관찰은 전이 형태의 성장 인자 수용체에 대한 항체 생산이 정상 조직의 표적화는 감소시키면서 항종양 활성을 유지시키는 새로운 방법으로 사용될 수 있음을 암시한다.
개요
표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 많은 다른 세포 종류의 증식 및 분화를 유도할 책임이 있는 170kDa 막 결합된 티로신 키나제이다(1,2). 이러한 EGFR의 과잉발현은 많은 표피 종양에서 관찰되었고, EGFR 발현 농도의 증가가 일반적으로 건강을 해친 임상 결과와 상관성을 나타냈다(3-5). 이 수용체의 과잉발현은 EGFR 돌연변이와도 연관이 있는 사건인 EGFR 유전자의 증폭에 의해 종종 일어난다(6). 가장 일반적인 EGFR 돌연변이는 신경아교종에서 흔히 발현되는 탈2-7 EGFR(또는 EGFRvIII)로 알려진 EGFR의 세포외 절두이다(6-8). 이러한 절두는 EGFR의 세포외 도메인으로부터 267개의 아미노산을 제거하고 신규 글리신을 삽입시키며, 이것은 탈2-7 EGFR의 N-말단 부근에 독특한 이음성 펩타이드를 생산한다(6-8). 탈2-7 EGFR은 공지된 임 의의 리간드에 결합할 수 없지만, 낮은 수준의 항상성 활성화를 나타내며, 누드 마우스에서 이종이식편으로서 성장할 때 유방 세포 및 신경아교종의 종양발생성을 증가시킨다(9-11).
EGFR의 억제는 새로운 암 치료제 개발의 합리적인 전략이다(12). 가능한 치료제는 항EGFR 항체(13) 및 EGFR의 소분자량 티로신 키나제 억제제(14)를 포함한다. 현재, 임상에서 검사되고 있는 EGFR의 세포외 도메인에 대해 지시된 많은 항체 중에는 EMD55900(15), ABX-EGF(16) 및 C225(Cetuximab)(17)가 있으며, 이들 모두 환자 중에서 약간의 항종양 활성을 나타냈다. 이 중에서 임상 검사가 가장 많이 진행된 것은 C225로서, 현재 두경부암, 결장직장암 및 비소세포 폐 암종의 치료에 대한 임상 시험 II/III 단계에서 검사받고 있으며, 유럽에서는 최근 사용 승인을 받았다(18). 이러한 항체들의 항종양 활성은 주로 리간드 결합의 차단력과 관계가 있고 다른 항종양 기작, 예컨대 면역 작동인자 기능, 수용체 억제조절, 부적당한 시그널링 유도 및 수용체 이량체화 및/또는 올리고머화 방해도 역할을 할 수 있는 것으로 생각되고 있다. 야생형(wt) EGFR을 표적으로 하는 항체의 1가지 단점은 이 항체가 간과 피부와 같은 정상 조직에서 상당히 흡수된다는 점이다(19, 20). 현재 정상 EGFR의 표적화는 피부 발진과 같은 치료가능한 부작용을 유발하는 것으로 나타나지만, 이러한 항EGFR 항체가 세포독성제 또는 방사선동위원소와 커플링된다면 간 손상을 유의적으로 일으킬 수도 있을 것이다.
mAb806은 탈2-7 EGFR을 발현하는 마우스 섬유아세포에 대해 유발되었고, wtEGFR을 발현하는 정상 조직에는 결합하지 않아서 암 치료의 유력한 후보이 다(21). 독특한 탈2-7EGFR 이음부 펩타이드에 모두 특이적인 다른 탈2-7 EGFR 특이 항체들과 달리(24-26), mAb806은 다른 미지의 에피토프를 인식한다(27). 실제 mAb806은 면역블롯팅 또는 심지어 ELISA 평판의 표면에 코팅을 통해서 EGFR 변성 후 wtEGFR에는 강력하게 결합할 수 있다. mAb806은 다수의 탈2-7EGFR 분획을 인식하지만, EGFR을 과잉발현하는 세포에 존재하는 일부 wtEGFR에도 결합한다(27). 스캐챠드 분석으로 보면, 탈2-7 EGFR 이음부 펩타이드에 특이적인 항체인 mAb DH8.3에 의해 인식되는 탈2-7 EGFR의 약 50%에 mAb806이 결합하는 것으로 나타났다(27). 이에 반해, mAb806은 wtEGFR에 특이적인 mAb528과 비교했을 때 A431 세포에서 과잉발현된 wtEGFR의 <10%에 결합했다. 중요한 것은, mAb806이 wtEGFR을 발현하는 정상 세포에는 결합하지 않는다는 점이다. 흥미로운 것은, mAb806이 또한 보통 소포체 안에 위치한 EGFR의 고 만노스(high mannose) 형태를 우선적으로 인식한다는 점이다. mAb806은 단일 제제로서 사용되는 경우에 탈2-7 또는 증폭된 EGFR을 발현하는 사람 이종이식편에 대하여 유의적인 항종양 활성을 나타냈다. mAb806 결합 에피토프의 측정은 작용 기작의 이해 뿐만 아니라 종양 특이적 항체 개발에 필요한 일반 전략을 제공하는데 중요할 것이다. 현재, 본 발명자들은 2가지 다른 방법을 사용하여 mAb806에 의해 인식되는 에피토프를 동정했다. 또한, 최근 밝혀진 EGFR의 결정 구조를 이용하여 mAb806의 독특한 특이성과 항종양 활성을 매개하는 방식을 설명할 수 있었다.
실험 방법
항체
EGFR에 특이적인 IgG2b 모노클로날 항체 806 및 IgG2a mAb528은 종래 기술된 바와 같이 생물학용 생산실(루드빅 암염구소, 멜버른)에서 제조하여 정제했다(27,28).
발현 벡터
발현 벡터 pEE14/sEGFR501 및 pEE14/sEGFR513은 종래 개시된 벡터로서(29), 시그널 펩타이드와 각각 EGFR 외측도메인의 처음 501 아미노산 및 513 아미노산, 그 다음 c-myc 에피토프 태그를 암호화하며, 모두 사람 사이토메갈로바이러스의 이메디에이트 어얼리 프로모터의 제어하에 전사된다. 발현 벡터 pEE14/sEGFR310-501은 외측도메인의 아미노산 잔기 310-501에 대해 인프레임(in-frame) 융합된 EGFR의 시그널 펩타이드를 암호화하는 cDNA를 함유하며 에피토프 태그로 종결되어 있다.
일련의 중첩성 EGFR c-myc 태그화된 외측도메인 단편은 처음 잔기 274, 282, 290 및 298에서 시작하여 모두 아미노산 501에서 종결되는 것으로서 PCR로 제조했다. 서열 분석 후, 단편들을 포유동물 발현 벡터 pSGHVO에서 발현된 사람 성장 호르몬(GH)의 3' 말단에 인프레임 클로닝시켰다(30). 또한, 잔기 278-286 및 285-293에 해당하는 이본쇄 올리고뉴클레오타이드를 GH와 c-myc 태그 사이의 동일 벡터에 인프레임 클로닝시켰다.
형질감염
사람 293T 배아 신장 섬유아세포를 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)와 10% 태내 송장이 혈청(FCS)에서 유지시켰다. 형질감염 전날에 세포를 배지 2ml를 함유하는 6웰 조직배양판에 1웰당 8x105씩 접종했다. 이러한 세포를 리포펙타민 2000(Invitrogen)과 복합체를 형성한 플라스미드 DNA 3 내지 4㎍으로 제조자의 지시에 따라 형질감염시켰다. 형질감염 24 내지 48 시간 후, 세포 배양물을 빨아내고, 세포 단층을 용해 완충액(1% Triton X-100, 10% 글리세롤, 150mM NaCl, 50mM HEPES pH 7.4), 1mM EGTA 및 완전 프로테아제 억제제 혼합물(Roche)) 250㎕에서 용해시켰다.
CR1-루프(이량체화 아암) 결실은 앞서 설명한 바와 같이 아미노산 244-259를 제거하고 알라닌 잔기 하나를 치환시켜 제조했다. 이 작제물로 293T 세포를 형질감시키고, 안정한 형질감염체를 제네티신의 존재 하에서 선발했다.
웨스턴 블롯팅
세포 용해물 일정량(10 내지 15㎕)을 1.5% β-머캅토에탄올을 함유하는 SDS 시료 완충액과 혼합하고 100℃에서 5분 동안 가열하여 변성시킨 뒤, 10% NuPAGE Bis-Tris 폴리아크릴아미드 겔(Invitrogen)에서 전기영동했다. 그 다음, TBST 완충액(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 100mM NaCl 및 0.1% Tween-20)으로 세정하고 2.5% 탈지분유를 함유한 TBST로 실온에서 30분 동안 차단시킨 니트로셀룰로스 막으로 시료를 전기이동시켰다. 이 막을 차단 완충액 중의 mAb806 0.5㎍/ml와 4℃에서 하룻밤 동안 항온처리했다. 비슷한 막을 c-myc 에피토프를 검출하기 위해 mAb9B11(1:5000, Cell Signalling Technology)로 하룻밤 동안 탐침했다. 필터를 TBST에서 세척하고, 양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 래빗 항마우스 면역글로불린(Biorad)을 1:5000 희석율로 함유하는 차단 완충액에 넣고 실온에서 2시간 동안 항온처리했다. 그 다음, 블롯을 TBST로 세척하고, 웨스턴 피코 화학발광 기질(Pierce)과 항온처리 후 자동 방사선사진 필름을 사용하여 현상했다. 펩타이드 경쟁 실험을 위해, 경쟁 펩타이드 100배 몰 과량의 존재하에 블롯을 mAb806으로 실온에서 1시간 동안 탐침했다. 화학발광 검출 후, 블롯을 9B11로 재탐침했다.
EGFR 단편의 효모 표면 디스플레이
EGFR 단편을 암호화하는 적당한 유전자를 함유하도록 변형된 pCT 효모 디스플레이 플라스미드는 Bio-Rad(Richmond, CA) 유전자 펄서 형질감염 장치를 사용하여 전기침투(33)를 통한 효모 균주 EBY100(32)의 형질전환에 사용했다. 이 플라스미드는 이 DNA가 게놈에 병입되어 있는 효모를 선발하는데 사용될 수 있는 trp+ 마커를 함유한다. 효모 세포 표면에 EGFR 단백질의 발현은 종래 기술된 바와 같이 수행했다(Boder and Wittrup, 2000). 간략히 설명하면, 형질전환된 콜로니는 효모 질소원, 카제아미노산, 덱스트로스 및 인산염 완충액 pH 7.4를 함유하는 최소 배지에 접종하여 진탕 평판에서 OD600이 5 내지 6이 될 때까지 약 1일 동안 30℃에서 증식시켰다. 그 다음, 효모 세포를 갈락토스를 함유하는 최소 배지로 옮겨 단백질을 디스플레이하도록 유도하고, 진탕하에 30℃에서 24시간 동안 항온배양했다. 배양물을 그 다음 분석할 때까지 4℃에 보관했다.
효모 세포 표면에 대한 항체 표지화 실험
c-myc 모노클로날 항체 9E10을 함유하는 복수액 원료는 코반스(Covance; Richmond, CA)에서 입수했다. 효모 세포 1x106을 FACS 완충액(1mg/ml BSA를 함유하는 PBS)으로 세척하고 항-c-myc 복수액(1:50 희석율) 또는 사람 EGFR 모노클로날 항체(10㎍/ml)와 최종 부피를 50㎕로 하여 4℃에서 1시간 동안 항온배양했다. 그 다음, 세포를 빙냉한 FACS 완충액으로 세척하고, 다시 피코에리트린 표지된 항마우스 IgG(1:25 희석율)과 최종 부피를 50㎕로 하여 4℃에서 1시간 동안 광 차단 하에 항온배양했다. 효모 세포를 빙냉한 FACS 완충액으로 세척한 후, 형광도 결과를 쿨터 에픽스 XL 유동세포측정기(Beckman-Coulter)로 수득하고 WinMDI 세포분석 소프트웨어(J.Trotter, Scripps University)로 분석했다. 에피토프의 선형 형태 및 입체형태를 측정하기 위하여 효모 세포를 80℃에서 30분 동안 가열한 뒤, 항체를 표지하기 20분 전에 얼음 상에서 냉각시켰다.
EGFR 유래의 펩타이드
추정상의 mAb806 에피토프를 함유하는 펩타이드(287CGADSYEMEEDGVRKC302(서열번호 1), 287CGADSYEMEEDGVRK301(서열번호 2) 및 287CGADSYEMEEDG298(서열번호 15))는 표준 Fmoc 화학을 사용하여 합성하고, 질량 스펙트럼 분석으로 확인했다. 알칼리성 조건에서 희석된 펩타이드 용액을 하룻밤동안 호기적 산화시켜 고리화된 펩타이드를 제조했다. 선형(환원된) 펩타이드는 합성된 펩타이드를 10mM HCl 수용액에 용해시켜 제조했다. 287-302 펩타이드 시료를 혐기성 조건 하에서 70% 포름산 중의 시아노겐 브로마이드와 반응시켜 N-말단 및 C-말단 펩타이드에 상응하는 단편을 수득했다. 이 펩타이드들을 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)의 존재 하에 아세토니트릴 구배를 사용하여 C18 Vydac 컬럼을 통해 HPLC로 분리했다. 펩타이드의 진위성은 그 다음 질량 분광분석 및 N-말단 서열분석을 통해 특성 규명했다. S-카르복시메틸화 된 펩타이드(SCM-펩타이드) 시료는 펩타이드를 0.5M 중탄산나트륨 pH 8.6 중의 디티오트레이톨과 반응시킨 후, 요오도아세트아미드를 첨가하여 제조했다. SCM-펩타이드는 그 다음 전술한 바와 같이 RP-HPLC로 정제했다.
ELISA 분석
백색 폴리스티렌 96웰 평판(Greiner Lumitrac 600)의 웰을 10mM 구연산나트륨 pH 5.9 중의 사람 Fc 불변 영역에 융합된 sEGFR501의 변형체 형태(T. Adams, 미공개 결과)인 501-Fc 2㎍/ml으로 코팅한 다음, TBS 중의 0.5% 병아리 난알부민으로 차단했다. TBST로 세척한 후, mAb 806 0.5㎍/ml와 다양한 농도의 펩타이드를 함유하는 용액(100㎕/웰)을 웰에 첨가했다. 평판에 결합된 mAb806은 염소 항마우스 면역글로불린-HRP(BioRad)와 웨스턴 피코 화학발광 기질(Pierce)을 사용하여 검출하고 Wallac Victor 1420 계수기(Perkin Elmer)로 정량 분석했다. 일부 분석에서는 96웰 평판을 1-501 EGFR로 코팅하고 종래 기술된 바와 같이 mAb806 결합을 분석하는데 사용했다(Johns et al. Intl. J. Cancer 98: 398-408, 2002).
표면 플라스몬 공명(BIAcore)
BIAcore 3000은 모든 실험에 사용했다. 추정상의 mAb806 에피토프를 함유하는 펩타이드는 5㎕/min의 유속에서 아민 또는 티올-이황화물 교환 커플링을 통해 CM5 센서 칩 위에 고정시켰다(34). 이 센서 표면 위로 806 항체를 25℃에서 5㎕/min의 유속으로 통과시켰다. 실험 진행 사이마다 10mM HCl을 10㎕/min의 유속으로 주입하여 표면을 재생시켰다.
유동세포측정 분석
다른 EGFR 작제물을 발현하는 293 세포 배양물은 mAb528 및 806을 사용하여 EGFR 발현에 대해 분석했다. 1x106 세포는 1% HSA를 함유한 PBS 중에서 4℃하에 30분 동안 1차 항체 5㎍/ml와 항온배양했다. PBS/1% HSA로 세척한 후, 세포를 FITC 커플링된 염소 항마우스 항체와 4℃(1:100 희석율; Calbiochem, San Diego, CA)에서 추가 30분 동안 항온배양했다. 세포를 최소 5000개가 되게 Epics Elite ESP(Beckman Coulter, Hialeah, FL) 상에서 분석하고 윈도우용 EXPO(버전 2)로 분석했다.
결과
EGFR 단편의 면역블롯팅에 의한 mAb806 에피토프의 동정
mAb806 에피토프의 광범위한 위치를 측정하기 위하여 1-513 및 310-501 c-myc 태그화된 EGFR 단편을 SDS-PAGE로 분리하고 mAb806으로 면역블롯팅했다. mAb806은 1-513 단편과 강한 반응성을 나타냈지만 EGFR의 310-501 분절에는 전혀 결합하지 않았다(도 1, 왼쪽 패널). 310-501 단편은 c-myc 태그에 특이적인 mAb 9B11에 의해 검출될 수 있는 바와 같이 막에 존재했다(도 1, 오른쪽 패널). 다른 실험으로서, mAb806은 또한 웨스턴 블롯에서 sEGFR501 단편에도 결합하는 것을 확인했다(결과는 제시하지 않았다). mAb806이 아미노산 6-273이 결실된 탈2-7 EGFR에 결합한다면(27), mAb806 에피토프는 잔기 274-310 또는 501-513 사이에 포함되어 있어야 한다는 결론을 얻었다. mAb806의 에피토프를 나타내기 위하여 모두 아미노산 501로 종결되는 일련의 c-myc 태그화된 EGFR 단편을 발현시켰다. mAb806은 274-501 및 282-501 EGFR 단편 모두와 반응했지만, 아미노산 290 또는 298에서 개시되 는 분절에는 결합하지 못했다(도 1, 왼쪽 패널). 모든 EGFR 작제물의 존재는 c-myc 항체를 사용하여 확인했다(도 1, 오른쪽 패널). 따라서, mAb806 에피토프는 아미노산 282-310 안에 함유되어 있어야 한다. 더욱이, 이러한 에피토프가 아미노산 290 이상까지 확장될 수는 있지만, 282-290 영역은 이러한 특정 면역블롯팅 분석에서 mAb806 반응성에 중요한 일부 아미노산을 함유해야만 한다.
효모 표면에서의 EGFR 단편의 디스플레이에 의한 mAb806 에피토프의 동정
mAb806 에피토프를 측정하기 위하여 제2의 다른 방법을 사용했다. EGFR의 여러 도메인을 포함하는 단편을 효모 표면에서 발현시키고 FACS를 이용하여 mAb806 결합에 대해 검사했다. mAb806은 효모 표면에서 발현된 1-621 및 1-501 단편을 모두 인식했다(도 2A). mAb806은 또한 탈2-7EGFR의 세포외 도메인에 상응하는 273-621 EGFR 단편에 결합했다(도 2A). 이에 반해, mAb806은 294-543 또는 475-621 EGFR 단편을 인식할 수 없는 바(도 2A), mAb806 에피토프의 적어도 일부가 아미노산 274-294(즉, 앞에서 동정된 아미노산 282-290) 사이의 영역 안에 함유되어 있어야 한다는 것을 분명하게 입증한다. 이러한 2개의 다른 방법들이 mAb806 결합에 중대한 동일 영역을 동정한다면 이러한 EGFR 구역이 mAb806 에피토프의 효과적으로 중요한 부분을 함유해야 한다고 확신했다. 흥미롭게도, 1-501 에피토프의 80℃에서의 열 변성은 mAb806 결합에 어떠한 영향도 미치지 않았는데, 이는 상기 에피토프가 입체형태라기 보다는 선형임을 암시하는 것이다(도 2B). 이러한 결과는 mAb806이 SDS-PAGE에 의해 수용체가 변성되기만 하면 "범" EGFR 항체가 되는 것을 보여준 본 발명자들의 연구 결과와 완전히 일치하는 것이었다(27).
추정상의 에피토프를 함유하는 EGFR 펩타이드에 대한 mAb806의 결합
추정상의 mAb806 에피토프를 함유할 가능성이 있는 시스테인 루프에 상응하는 펩타이드(287CGADSYEMEEDGVRKC302)를 합성했다. 이 펩타이드는 면역블롯에서 1-501 및 274-501 EGFR 단편에 대하여 mAb806의 결합을 억제할 수 있었다(도 3A, 상단 패널). 면역블롯의 양 부분에 대한 EGFR 단편의 존재는 긁어내어 항-myc로 재탐침하여 확인했다(도 3A, 하단 패널). 287-302 EGFR 펩타이드 용액은 또한 ELISA 판에서 고정된 1-501 단편에 대한 mAb806의 결합을 억제할 수 있었다(도 3B). 흥미롭게도, 상기 펩타이드보다 더 짧은 펩타이드(아미노산 287-298)는 검사된 농도에서 mAb806의 결합을 억제하지 못했다(도 3B). 즉, mAb806 에피토프는 EGFR에서 이황화 결합된 루프를 형성하는 잔기 287-302 안에 포함된 것으로 보인다.
또한, 사람 IgG1의 Fc 영역에 융합된 1-501 EGFR 단편의 이량체 형태인 고정화된 501-Fc에 대한 mAb806의 결합을 억제하는 287-302 EGFR 펩타이드의 능력을 검사했다. 산화된, 환원된 및 에이징된(즉, 적당히 응집된) 펩타이드는 모두 용량 의존적 방식으로 501-Fc에 대한 mAb806의 결합을 억제했다(도 4A). 환원되고 S-카르복시메틸화된 시스테인 잔기를 함유한 펩타이드는 mAb806의 결합을 억제할 수 없었는데, 이는 하나의 시스테인 잔기 또는 두 시스테인 잔기 모두가 mAb806 에피토프에 이바지하는 하는 것임을 시사한다(도 4B). 시아노겐 브로마이드 절단에 의해 생성된 N-말단(CGADSYEM)(서열번호 16) 또는 C-말단(EEGVRKC)(서열번호 17) 펩타이드 단편은 mAb806 결합을 억제할 수 없었는데(도 4B), 이는 내부 메티오닌 잔기가 에피토프 사이에 존재한다는 것을 암시한다. 이러한 결과는 mAb806 에피토프가 EGFR 유래 펩타이드 287-302 안에 함유되어 있음을 추가적으로 확인시켜준다.
287-302 EGFR 펩타이드는 말단 시스테인 잔기에 커플링하는 티올-이황화물 교환에 의해 CM5 센서 칩에 커플링했고, mAb806 결합은 표면 플라스몬 공명(BIAcore)으로 분석했다. mAb806은 생 세포에서 스캐챠드 분석을 통해 수득한 친화성(27)과 일치하는 겉보기 친화성 30nM(도 5A) 하에 고정화된 펩타이드에 용량 의존적 방식으로 결합시켰다(도 5A). 블랭크 채널, 시스테인 차단된 채널 또는 무관련 펩타이드에 대한 mAb806 결합은 모두 287-302 EGFR 펩타이드에 대한 결합율의 1% 미만이었다(결과는 제시하지 않았다). 이러한 펩타이드에 대한 mAb806의 친화성은 탈2-7EGFR에 대해 디스플레이된 친화성과 유사한 바, 이 펩타이드는 에피토프에 이바지하는 주요 결정인자를 모두 함유하는 것으로 보인다. 이러한 관찰은 상기 펩타이드가 티올 커플링에 의해 고정되고, 이에 따라 분자내 이황화 결합을 형성할 수 없을 때, 루프가 mAb806 결합을 위해 고리화되지 않아야 한다는 것을 추가적으로 입증한다. 또한, 아민 커플링을 통해 287-302 EGFR 펩타이드를 고정시킨 경우에도 mAb806이 여전히 결합되는 것을 확인했다(도 5B).
다음으로, 여러 EGFR 펩타이드 용액이 고정된 287-302 EGFR 펩타이드에 대한 mAb806의 결합을 차단하는 능력이 있는지 검사했다. 예상한 바와 같이 용해성 287-302 EGFR 펩타이드는 용량 의존적 방식으로 mAb806 결합을 억제했다(도 5B, 상단 패널). ELISA 결과(도 3B)에서와 같이 287-298 EGFR 펩타이드는 심지어 상당한 과량으로 사용했을 때에도 mAb806의 결합을 방해할 수 없었다(도 5B, 중간 패널). 단순히 C302(즉, 아미노산 287-301)를 결실시킨 또 다른 펩타이드는 용량 의존적 방 식으로 mAb806의 결합을 약하게 억제할 수 있었다(도 5B, 하단 패널). 이러한 관찰은 아미노산 잔기 C302가 고친화성 mAb806 결합에 필요하다는 것을 확인시켜준다.
mAb806 에피토프의 구조 분석 및 이것의 EGFR 활성화와의 관계
근래 몇몇 결정학적 연구는 EGFR 세포외 도메인의 구조를 설명하고 있다. 따라서, 본 발명자들은 구조적 위치에 비추어 mAb806 에피토프가 독특한 특이성을 설명하는데 도움이 될 수 있는지를 보기 위해 mAb806 에피토프를 분석했다. mAb806 에피토프를 함유하는 시스테인 루프(도 6A)는 시스테인 풍부 CR1 도메인의 C-말단 부분에 위치한다(도 6B, 자홍색). 흥미롭게도, EGFR의 이 영역은 그 구조 중에서 가장 특성 규명이 안된 부분 중 하나로, 이는 유연성의 상대적 정도를 암시한다. 287-302 EGFR 루프의 상당 부분은 EGFR 안에 묻혀있지만, 두 영역은 노출되어 항체가 접근할 수 있는 가능성이 높다. 이러한 영역 중 하나는 D290을 중심으로 한 영역이고(도 6C, 좌측면도에서 자홍색으로 강조된 부분), 다른 하나는 D297을 중심으로 한 영역으로서, 이 분자를 180° 회전시켰을 때 관찰할 수 있다(도 6C, 우측면도에서 자홍색으로 강조된 부분).
도 6C에 도시된 EGFR의 테터링된 형태는 수용체의 불활성 입체형태이다. 이 상태에서 EGFR CR2 도메인은 CR1 도메인 안에 함유된 작은 루프인 이량체화 아암이 다른 EGFR 분자의 이량체화 아암과 상호작용할 수 없게 하는 방식으로 CR1 도메인과 상호작용한다. EGFR의 미테터링은 이량체화 아암이 노출되어(도 6D, 왼쪽 패널) 수용체 이량체화가 일어나게 하는 수용체의 확장된 형태를 만든다(도 6B). 이러한 본 발명자들의 발견은 평형일 때 EGFR의 세포 표면 95%에는 테터링된 입체형태가 존재한다는 것을 암시한다(37). 나머지 EGFR은 불활성 이량체 또는 확장된 미테터링된 형태일 것이다. 리간드 첨가는 더 많은 수용체가 이량체 형태가 되게 할 것이다(도 6B).
가능한 mAb806 결합 부위를 살펴보면, 수용체의 테터링된 형태일 때에만 접근가능한 잔기는 D297을 중심으로 부분이다. 하지만, mAb806이 수용체를 과잉발현하는 세포주에서 단지 5 내지 10%의 EGFR에만 결합한다면, 세포 표면에 있는 EGFR 중 95%를 형성하는 EGFR의 테터링된 형태에 mAb806이 결합할 가능성은 거의 없다. 도 6에 제시된 구조 정보를 기초로 할 때, EGFR의 이량체화는 mAb806 에피토프 안의 임의의 다른 아미노산 잔기를 노출시키지 않아서 mAb806 결합에 대한 표적이 되지 않을 것이다. 항체의 크기면에서 볼 때, D290을 중심으로 하여 노출된 어떠한 아미노산도 테터링된 입체형태 또는 이량체 입체형태의 mAb806에는 접근할 수 없다. EGFR이 테터링된 입체형태에서 활성 이량체 상태로 이동할 때에는 전이성 확장된 상태를 거쳐야 한다. 이러한 전이성 형태의 EGFR(도 6D)는 단량체이거나 또는 불활성 이량체일 수 있고 mAb806 결합 수준에 일치하는 세포 표면에는 비교적 드물다. 중요한 것은, 이러한 전이성 형태의 수용체에서는 D290 주위의 잔기와 보통 묻혀 있는 다수의 아미노산(예, Y292 및 M294)이 항체 결합을 위해 접근할 수 있다는 점이다. 공간적 고찰은 D290 부근의 영역에 대한 mAb860의 결합이 시스테인 루프 외측에 있는 아미노산과의 상호작용을 필요로 할 수 있음을 강력하게 시사하며, 이러한 가능성은 시스테인 루프 안에 mAb806 에피토프 전체가 함유되어 있음을 암시하는 본 발명이 친화성 결과와는 불일치하는 것이다. 따라서, 결합 영역으로서 D290을 제거하면, mAb806은 Y292/M294 주위의 영역과 상호작용해야 하며, 이 에피토프는 더욱 확장하여 D297을 포함할 수 있다. 이를 종합해 보면, 일치하는 유일한 결론은 mAb806이 이량체화되기 전 EGFR의 확장된 형태일 때 노출된 아미노산에만 결합한다는 것이다.
EGFR의 구성적으로 미테터링된 형태에 대한 mAb806의 결합
mAb806이 비이량체화된/미테터링된 EGFR에 우선적으로 결합하는지를 확인하기 위해, CR1 이량체화 아암이 결실된 EGFR의 돌연변이(탈CR1-루프)를 293 세포에서 안정적으로 발현시켰다(31). 이 영역은 활성 EGFR 이량체를 형성하는데 있어서의 역할로 인해, 그리고 테터링과 관련하여 CR1:CR2 상호작용에 CR1 이량체화 아암이 절대적으로 관여하기 때문에 선택했다. 즉, 탈2-7 EGFR과 같이 탈CR1은 항상성으로 미테터링되어야 한다. 293 모세포는 FACS를 통해 mAb528의 결합에서 확인되듯이(도 7) 소량의 야생형 EGFR(약 1x104 EGFR/세포)을 발현한다. 예상한 바와 같이, mAb806은 이들 세포에서 발현되는 내인성 EGFR에는 결합하지 않는다. 탈CR1-루프처럼 탈2-7 EGFR은 테터링할 수 없고 이량체화가 감소되어야 한다. 탈2-7EGFR에 의한 293 세포의 형질감염은 다른 세포주에서 종래 관찰되었듯이 mAb806의 강력한 결합을 유도했다(도 7). 탈CR1-루프 EGFR에 대한 높은 입체형태 의존적 mAb528의 결합은 그 입체형태에 상당한 변화가 없음을 입증한다(도 7). 실제, 본 발명자들은 종래 밝힌 바와 같이 탈CR1-루프 EGFR은 리간드에 결합할 수 있고, 이는 그 전체 구조가 본래 상태를 유지한다는 견해를 더욱 지지한다(31). 2개의 다른 탈CR1-루프 EGFR 발현 클론의 유동세포측정분석에서는 mAb806의 결합을 분명하게 나타냈다(도 7). 즉, 본 발명자들의 추측처럼, mAb806은 활성 이량체를 형성하기 전에 전이성 미테터링된 EGFR에 결합하는 것으로 보인다. 또한, mAb806은 테터링능이 감소된 EGFR 점 돌연변이에 대해 증가된 결합성을 나타낸다(이하 실시예 2 참조).
토론
탈2-7EGFR을 발현하는 마우스 섬유아세포에 예방접종 후, 탈2-7EGFR에 대한 높은 반응성과 야생형 EGFR에 대해 무시할 정도의 활성을 조사하는 복합 혈구흡착 분석(21)을 통해 mAb806을 수득했다. 또 다른 특성 분석을 통해, 야생형 EGFR이 과잉발현되는, 특히 EGFR 유전자가 증폭되는 세포주 및 신경아교종 표본을 mAb806이 인식하지만, 정상 조직은 인식하지 못하는 것이 확인되었다(21). 최근 본 발명자들은 mAb806이 소포체 내에 위치한 탈2-7 및 야생형 EGFR의 고 만노스 형태에 우선적으로 결합하는 것을 입증했다. 또한, 고 만노스 wtEGFR 중 일부가 세포가 수용체를 과잉발현 때 세포 표면으로 잘못 유도된다는 것도 입증했다. 하지만, 이러한 연구가 mAb806 에피토프를 동정하거나 mAb806에 의해 매개된 강력한 항종양 활성을 적절하게 설명하지는 못했다. 2가지 다른 방법에 의해 본 발명자들은 mAb806 에피토프를 함유하는 시스테인 루프(아미노산 287-302)를 동정했다. 잔기 287-302를 포함하는 합성 펩타이드에 대한 mAb806 친화성은 탈2-7 EGFR을 발현하는 세포주에서의 스캐챠드 분석을 통해 종래 측정한 결과(27)와 유사한 바, 이 잔기들에 완전한 에피토프 서열이 함유되어 있는 것을 확신한다. 분명한 것은, 이 펩타이드들이 항체 결합 시 이황화 결합된 루프 안에 분류되어 있지 않다는 점인데, 그 이유는 mAb806이 용액 중의 환원된 펩타이드, 티올-고정된 펩타이드 및 C302가 결실된 약하게 결 합된 용해성 펩타이드를 인식하기 때문이다.
면역침전과 스캐챠드 분석은 모두 EGFR 유전자의 증폭으로 인해 수용체를 과잉발현하는 세포주인 A431 세포의 표면에서 발현되는 야생형 EGFR의 5 내지 10% 사이를 인식한다는 것을 증명했다. 낮은 비율의 수용체에 대한 결합에도 불구하고, mAb806은 누드 마우스에서 성장한 A431 이종이식편에 대해 강력한 항종양 활성을 디스플레이한다(22, 23). mAb806이 미테터링된 EGFR에 우선적으로 결합한다는 본 발명자들의 관찰은 상기 항종양 활성의 가능성이 유망한 기작을 암시한다. EGFR 분자가 미테터링 상태가 될 때, 이 분자는 불활성 테터링과 활성 이량체 사이에 전이성 상태를 거친다(37). 이러한 EGFR의 전이성 미테터링 형태는 mAb806이 결합하는 형태이다. mAb806의 결합은 그 다음 시그널링 할 수 있는 EGFR 이량체의 형성을 차단한다(도 8). 즉, mAb806은 주어진 임의의 순간에 낮은 비율의 EGFR에 유일하게 결합하지만, EGFR 시그널링의 상당 부분은 장시간 동안 억제할 수 있으며, 결과적으로 생체내 항종양 효과를 나타낸다. mAb806이 결합된 EGFR의 운명은 종래 본 발명자들이 mAb806/탈2-7 EGFR 복합체의 내재화(27)를 밝히긴 했지만 알려진 바가 없다. 혹은, mAb806/EGFR은 EGFR에 특이적인 소분자량 티로신 키나제 억제제로 세포를 처리한 후와 마찬가지로 불활성 형태로 표면 위에 포착되어 있을 수 있다(28, 38). 야생형 EGFR과는 대조적으로, mAb806은 수용체 돌연변이에 특이적인 항체인 DH8.3(27)과 비교했을 때 세포 표면 상에 발현된 탈2-7 EGFR 분자의 약 절반을 인식한다. 이와 같은 탈2-7EGFR에 대한 mAb806의 반응성 증가는 이 수용체 돌연변이에는 CR1-이량체화 루프가 결실되어 있어서 테터링된 입체형태가 될 수 없다는 사 실과 일치한다.
mAb806이 정상이지만 비교적 농도가 낮은 전이성 형태의 EGFR을 인식한다면 "평균" 농도의 EGFR을 발현하는 세포주 또는 정상 조직에 결합하지 못하는 이유는 무엇인가? 이러한 관찰은 종래 연구에서 본 발명자들이 요오드화된 mAb806이 1x107 세포를 함유하는 U87MG 신경아교종(1x105 EGFR/세포) 세포 펠릿에 결합하지 않았음을 밝힌 바와 같이(이 연구는 더 작은 A431 세포 펠릿이 낮은 결합 농도를 측정하기에 충분하게 민감성이었었음을 기반을 두고 있다) 검출 민감성과는 무관한 것으로 보인다. 본 발명자들은 글리코실화가 mAb806 반응성에 영향을 미치며, 소포체 안에 보통 존재하는 EGFR의 고 만노스 형태를 mAb806이 우선적으로 인식하는 것을 측정했다. 또한, EGFR을 과잉발현하는 세포에서, 고 만노스 수용체의 일부는 세포 표면으로 잘못 유도되었다.
mAb806 에피토프의 서열 상동성은 ErbB3/B4에서 비교적 낮지만, 시스테인 루프의 크기와 위치는 관찰된다. 또한, 완전히 보존되는 2개의 아미노산 잔기(E293 및 G298)가 있고 전하가 보존되는 다른 2개의 아미노산 잔기(E295 및 R300)가 있다. 마지막으로, ErbB3( 및 아마도 ErbB4)의 전체 구조는 활성화 동안 아마도 미테터링되는 테터링된 형태라는 점에서 EGFR의 구조와 매우 유사하다(41). 이를 종합해보면, ErbB3/B4에서 등가의 시스테인 루프에 테터링된 항체는 mAb806과 성질이 유사(즉, 종양에 제한적인 특이성 및 수용체 활성화를 차단하는 성질)하다는 것을 암시한다. 더 확대해보면, 본 발명의 결과는 성장 인자 수용체의 전이성 형태에 대 한 항체 생성 방법이 항시그널링 활성을 유지시키면서 정상 조직 표적화를 감소시키는 새로운 방법임을 암시한다. 따라서, 활성(리간드 결합된) 수용체와 이의 불활성 대응물의 구조 간의 비교는 수용체 입체형태 변화 동안 일시적으로 노출되는 아미노산을 밝혀낼 것이다. 마지막으로, mAb806은 EGFR의 항상성 활성 돌연변이를 발현하는 세포의 면역화 후 이 돌연변이된 수용체에 특이적인 항체를 선발하여 제조했다. 즉, 항상성으로 활성인 수용체로의 면역화는 수용체의 전이성 형태를 인식하는 항체를 동정할 가능성을 증가시키는 보편적 전략을 제공할 수 있을 것이다.
참고문헌
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실시예 2
세포 표면의 표피 성장 인자 수용체의 기능에 미치는 CR1/CR2 도메인 상호작용의 분석
최근 표피 성장 인자 수용체(EGFR)의 분리된 세포외 도메인에 대한 결정학적 결과는 리간드에 의해 활성화되는 모델을 제시했다. 이러한 모델을 세포 표면에서 디스플레이되는 전장의 EGFR와 관련하여 검사하고자, 수용체 활성화의 조절에 중대한 것으로 생각되는 세포외 도메인의 두 영역(CR1 및 CR2)에 돌연변이를 도입시켰다. CR1 및 CR2 도메인의 돌연변이는 리간드 결합 친화성, 수용체 이량체화, 티로신 키나제 활성화 및 시그널링 역량에 대해 상반된 영향을 미친다. Tyr246은 CR1 루프에서 위치 결정 및 리간드 결합 후 수용체 이량체 계면의 안정화에 관여하는 중대한 잔기로서, Tyr246의 돌연변이는 수용체 기능을 손상 또는 무력화시킨다. 수용 체를 테터링된 상태에 있게 하는 상호작용을 약화시키는 CR2의 돌연변이는 리간드에 대한 친화성을 증가시켜 EGF에 대한 반응성을 증강시킨다. 하지만, CR1/CR2 상호작용의 약화는 수용체 키나제의 자발적인 활성화가 일어나게 하지 않는다. 본 발명자들은 리간드 결합 후 야생형 및 돌연변이체 EGF 수용체에서 입체형태적 변화가 일어나도록, 소극적으로 제한적인 테터링된 상태와 완전 활성형인 연속성 이량체 입체형태 사이에 EGF 수용체의 전이 상태를 인식하는 항체(mAb806)를 사용했다. 실험 결과, 세포 표면에 존재하는 EGFR은 미테터링될 수 있으나, 이 형태는 불활성형이다. 따라서, 수용체의 미테터링은 활성화에 충분하지 않으며, 리간드 결합이 키나제 활성화를 위하여 두 수용체 서브유닛이 정확하게 위치 결정하는데 반드시 필요하다.
개요
지난 20년 동안, EGF 수용체는 수용체가 결합된 세포내 티로신 키나제의 리간드 활성화를 연구하는데 중요한 기회를 제공했다(1-3). 최근, 여러 EGF 수용체계 성분(EGFR, ErbB-2 및 ErbB-3)에 대한 세포외 도메인(ECD)의 3차원 구조가 보고되었다(4-9). 이러한 구조는 EGF 수용체 ECD의 2가지 유의적으로 상이한 입체형태를 나타냈다(4;5;9). TGF-α(4) 또는 EGF(5)와 복합체를 이룬 EGFR의 용해성 절두형 ECD의 결정 구조에서 리간드는 L1 및 L2(리간드 결합) 도메인 사이에 개재되어 있고, ECD는 주로 2개의 연동식 CR1(시스테인 풍부) 도메인을 통해 연속 이량체를 형성하고; 이에 반해 EGF와 복합체를 이룬 자가억제된 EGFR의 결정 구조에서는 리간드가 L1 도메인에만 결합되고 이량체가 없으며 단량체 수용체의 주요 분자내 상호 작용이 CR1-루프와 CR2 도메인 사이에서 일어난다(9). 이 구조에서, L1과 L2 사이의 간격은 한 EGF 분자에 동시에 결합하기에는 너무 클 뿐만 아니라, L2는 또한 L1이 결합된 EGF로부터 멀리 회전한다. 즉, 2가지 중요한 특징이 EGF 수용체 ECD의 자가억제된(테터링된) 형태와 미테터링된 형태를 구별할 수 있다: 즉, 이량체가 없고 높은 친화성으로 리간드에 결합하지 못한다는 점이 그것이다. 흥미롭게도, 절두형 ErbB-2 ECD(7)의 입체형태와 전장 ErbB-2 ECD(7)의 입체형태는 연속 EGFR 이량체(4)와 유사한 반면, 리간드(6)의 부재하에서 ErbB-3 ECD(6)는 테터링된 EGFR-ECD(9)와 입체형태가 동일하다.
전장의 세포 EGFR을 이용한 연구는 EGFR 이량체화, 높은 친화성 결합 및 수용체 키나제 활성화 사이의 강한 연관성을 확립했다. 즉, 분리된 ECD의 결정 구조는 이러한 관찰(즉, 리간드가 수용체의 "테터링된" 형태에 더 높은 친화성으로 결합하면 단량체성 자가억제된 수용체로부터 평형이 이탈하여 활성 이량체의 형성이 유리해진다(9))의 이해를 돕는 개선된 골격을 제공하는 한편, 세포 환경에서 EGFR의 키나제와 경막 도메인 역시 이량체화에 기여한다. 실제, 세포 표면 이량체(또는 올리고머)는 미결합 이량체가 티로신 키나제 활성을 보유하지 않더라도 리간드 없이도 검출될 수 있다(10-16). 즉 전장의 세포 표면 EGF 수용체에서 리간드 결합은 이량체화를 유도할 뿐만 아니라 키나제 활성 입체형태를 형성하는 데에도 필요로 된다.
단편 또는 심지어 전장의 EGF 수용체 ECD의 구조 및 리간드 결합 성질은 세포 표면에 디스플레이된 수용체 유래의 시그널링의 복잡성을 해명할 수 없다. 본 발명에서는 리간드 결합, 수용체 입체형태 변화, 수용체 올리고머화 및 키나제 활성의 조절을 결정하는 과정들에서 일어나는 CR1-CR2 상호작용의 이해를 높이기 위해 전장 EGF 수용체 돌연변이체를 순수 포유동물(Baf/3) 세포에서 발현시켰다(17;18). BaF/3 세포는 내인성 EGF 수용체를 발현하거나 재조합(돌연변이) 수용체를 동요 및/또는 활성화시킬 수 있는 리간드의 검출가능한 농도를 발현하거나 하는 것이 아니다. CR1-루프와 CR2 EGFR 돌연변이체의 유용성과 입체형태 특이적 항체인 mAb528(19) 및 mAb806(20-23)의 유용성으로 인해, 테터링의 결정인자를 탐침하고 리간드가 수용체에 결합할 때 주요 입체형태 전이를 검출할 수 있었다.
실험 방법
시약
EGFR mAb528(19) 및 mAb806(20;21)에 대한 항체는 루드빅 암염구소(멜버른) GMP실에서 제조하여 정제했다. 항플래그(flag) 항체 M2는 시그마-알드리치에서 구입하고, 항포스포티로신(클론 4G10) 및 항EGFR(양 폴리클로날)은 업스테이트(Lake Placid; NY); 항포스포-p44/p42 MAPK 항체 및 항MAPK 항체는 셀 시그널링(Beverly, MA)에서 구입했다. HRP가 커플링된 래빗 항마우스 Ig 및 HRP 커플링된 래빗 항양 Ig은 각각 바이오래드(Hercules, CA) 및 다코(Fort Collins, CO)에서 구입했다. 알렉사 488-표지된 항마우스 면역글로불린은 몰리큘라 프로브스(Eugene, OR)에서 구입했다. 페닐아르신 옥사이드(PAO)는 시그마-알드리치에서 구입했다. 수용성의 동종이작용기성 가교결합 시약 BS3(스페이서 아암 길이: 11.4Å) 및 설포-EGS(스페이서 아암 길이: 16.1Å)는 피어스(Rockford, IL)에서 입수했다.
EGFR 돌연변이체 작제물의 제조
야생형 EGFR의 단독 점 돌연변이는 부위 지시성 돌연변이유발 키트(Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하여 제조했다. 각 돌연변이유발의 주형으로는 문헌(4)에 기술된 바와 같이 포유동물 발현 벡터 pcDNA3(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 리더 서열과 그 다음 FLAG 태그 암호화 서열을 함유하는 사람 EGFR cDNA(24)를 사용했다. 각 작제물의 자동 뉴클레오타이드 서열분석을 실시하여 각 EGF 수용체 돌연변이의 보존성을 확인했다. 이러한 EGFR 발현 작제물을 293 세포(미국 모세포배양 수집소, Manassas, VA)에서 일시적으로 발현시키고 수용체 단백질의 존재를 528 및 M2 항체로의 염색을 통해 측정하여 세포 표면에서의 발현을 확인하고 단백질 폴딩이 적당히 일어나게 했다(결과는 제시하지 않았다).
EGFR 작제물의 형질감염 및 안정한 세포주 제조
야생형 및 돌연변이형 EGFR 작제물을 이용하여 종래 기술된 바와 같이(25) IL-3 의존적 쥐 조혈 세포주 BaF/3을 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 G418에서 10일 동안 선발했다. EGFR 발현 여부를 플래그 태그에 대한 항체(M2: PBS/5% FCS/5mM EDTA 중의 10㎍/ml) 및/또는 EGFR 세포외 도메인에 대한 항체(mAb528: PBS/5%FCS/5mM EDTA 중의 10㎍/ml)를 사용한 뒤, Alexa 488 표지된 항마우스 Ig(최종 희석율 1:400)을 사용하여 FACStar(Beckton and Dickinson, Franklin Lakes, NJ)에서의 FACS 분석으로 조사하여 생세포를 선별했다. 배경 형광도는 상기 세포와 무관련 클래스 일치성 1차 항체를 항온처리한 뒤 측정했다. 양성 푸울을 FACS-DIVA(Becton and Dickinson)로 적당한 농도의 EGFR 발현 여부에 대해 분류했다. 최 종 선발 후, 각 세포주에서 mRNA를 분리하고 EGFR의 모든 돌연변이를 PCR 분석으로 확인했다. 모든 세포는 RPMI/10% FCS/10% WEHI3B 조정 배지(26) 및 1.5mg/ml G418에서 통상적으로 계대배양했다.
리간드 결합
마우스 상악하샘에서 정제한 쥐 EGF(27)를 비활성이 5-8 x 105cpm/pmol이 되게 요오도젠(28)을 사용하여 요오드화했다. wt 또는 돌연변이 EGFR을 발현하는 세포에 대한 리간드 결합은 저온 포화 실험을 통해 내재화 억제제 페닐아르신 옥사이드(PAO)(29)의 존재하에 실온에서 측정했다. 간략히 설명하면, 세포를 증가량의 미표지된 EGF(20pM - 5.12nM)의 존재 또는 부재와 일정량(300pM)의 125I EGF와 함께 PBS/1% BSA/30μM PAO 중에서 항온배양했다. 비특이적 결합성은 125I-EGF보다 500배 과량의 미표지된 EGF를 사용하여 측정했다. 모든 실험 포인트는 삼반복으로 제조했다. 항온배양이 끝나면 세포를 펠릿화하고 빙냉한 PBS로 2회 세척한 뒤, 새 튜브로 옮겨 Wallac WIZARD γ계수기(PerkinElmer, Boston, MA)로 계수했다. 리간드 결합 친화성과 수용체 수의 스캐챠드 플롯과 계산값은 Radlig 프로그램(BioSoft, Cambridge, UK)을 사용하여 수득했다.
수용체 가교결합, 티로신 인산화 및 MAPK 활성화
wt 또는 돌연변이된 EGFR을 발현하는 BaF/3 세포는 IL-3 및 FCS가 없는 배지에서 3시간 동안 항온배양했다. 원심분리하여 세포를 수집하고, PBS로 2회 세척한 뒤, EGF(100ng/ml)이 첨가되거나 첨가되지 않은 PBS에 넣어 실온에서 10분 동안 항 온배양했다. 가교결합 실험에 따라서, 세포를 PBS 또는 EGF 처리 후, 1.3mM BS3 또는 Sulpho-EGF(Pierce Biotechnologies, Rockford, IL)와 함께 실온에서 20분 동안 항온배양했다. 세포를 환원제(100mM β-머캅토에탄올)가 첨가되거나 첨가되지 않은 SDS/PAGE 시료 완충액에서 용해시켰다. 총 세포 용해물을 3-8% 트리스/아세테이트 또는 4-12% Bis/Tris 구배 겔(InVitrogen, Carlsbad, CA)을 이용한 SDS-PAGE로 직접 분석하고 PVDF 막으로 이동시킨 후, 항포스포티로신 항체(4G10, UBI, 1:1000 최종 희석률), 항-EGFR 항체(양 항-EGFR, UBI, 1:1000 최종 희석률) 또는 항포스포-MAPK 항체(1:1000 최종 희석률)와 후속으로 각각 HRP 커플링된 항마우스, 항양 또는 항래빗 Ig(모두 1:3000 최종 희석률)로 면역검출했다. 반응성 밴드는 ECL 시약(Amersham)으로 가시화했다. EGFR이 특이적 티로신 인산화를 측정하기 위하여 항포스포티로신 항체로 탐침한 막을 0.1M 글리신(pH 2.1) 용액으로 벗겨내고, 항EGFR 또는 항포스포MAPK 항체로 재탐침했다. 필름을 몰리큘라 다이나믹스 스캐닝 농도계측기(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)로 스캐닝하고 밴드 정량은 와이드 라인 피크 적분법을 사용하여 ImageQuant에서 수행했다.
EGF에 대한 유사분열 반응
성장 대수기에 있는 세포를 수거하고, 잔류 IL-3 제거를 위해 3회 세척했다. 세포를 RPMI 1640+10% FCS에 재현탁한 뒤, 96웰 평판에 Biomek 2000(Beckman)을 사용하여 200㎕당 2x104 세포로 접종하고 10% CO2 중 37℃에서 4시간 동안 항온배양했다. 1차 적정점에 EGF를 첨가하고 96웰 평판을 따라 2배 희석률로 2회 적정했다. 대조군 웰에는 최종 농도 5%(v/v)의 WEHI-3B 조정 배지를 첨가했다. 3H-티미딘(0.5μCi/웰)을 첨가하고 평판을 5% CO2, 37℃에서 20시간 동안 항온처리한 후, 자동 수거기(Tomtec, Connecticut, USA)를 사용하여 니트로셀룰로스 필터 매트 위에 수거했다. 매트를 마이크로웨이브에서 건조한 뒤, 플라스틱 계수 백에 넣고 섬광제(10ml)를 첨가했다. 혼입된 3H-티미딘은 베타 계수기(1205 Betaplate, Wallac, Finland)를 사용하여 측정했다.
입체형태 특이적 항체와의 반응성
항체 염색 및 FACS 분석 전에 세포를 항체, EGF 또는 대조군 배지와 함께 예비배양했다. 항체(mAb528, mAb806 또는 클래스 일치성 무관련 항체, 모두 10㎍/ml)와의 예비배양은 RPMI/10% FCS에서 30분 내지 16시간 동안 37℃에서 수행했다. EGF(빙냉 FACS 완충액 중의 100ng/ml)와의 예비배양은 20분 동안 얼음상에서 실시했다. 예비배양 후, 세포를 원심분리로 수거하고 대조군 항체 또는 검사 항체(모두 FACS 완충액 중에 10㎍/ml, 얼음 상에서 20분, FACS 완충액으로 세척함)로 염색한 다음 알렉사 488-항마우스 Ig(1:400 최종 희석률, 얼음상에서 20min)으로 염색하여 1차 항체를 수득했다. 세포를 빙냉한 FACS 완충액으로 세척한 뒤, 원심분리로 수거하고 FACScan으로 분석하고; 최고 평광도 채널과 중앙 형광도는 각 시료마다 CellQuest(Becton and Dickinson)의 통계 수단을 사용하여 측정했다. 배경(음성 대조군) 형광도는 모든 측정값에서 공제했다. 중앙 형광도 값은 피크 형태 및 형광 강도의 가장 대표적인 값으로 선택하고, mAb806 대 mAb528 결합율의 비를 유추하는 데 사용했다.
결과 및 토론
본 연구의 목적은 전장의 세포 표면에서 발현되는 EGFR의 입체형태적 우선성, 활성화 기작 및 시그널링능에 미치는 CR1-루프/CR2 상호작용을 측정하기 위한 것이다. 본 발명자들은 CR1/CR1 및/또는 CR1/CR2 상호작용을 동요시켜, 결과적으로 EGFR의 테터링된, 미테터링된, 불활성 및/또는 활성 상태 사이의 평형을 변경시킬 것으로 추정된 CR1 및 CR2 도메인에 점 돌연변이를 도입시켰다. 이러한 작제물의 발현은 내인성 ErbB 계 성분이 없는 조혈 세포주인 BaF/3을 사용하여 수행했다. 돌연변이가 EGFR의 기능에 미치는 효과를 분석하기 위해, 결합 동역학, 이량체화, 리간드 의존적 티로신 인산화 및 시그널, 및 EGF 의존적 방식의 DNA 합성 유도능을 측정했다. 하지만 이러한 변수들은 수용체 올리고머화, 형상 또는 입체형태 변화의 간접적인 척도이다; 따라서 EGFR의 "휴지기" 입체형태 및 리간드에 의해 유도되는 입체형태적 및 형상적 변화의 원동력에 미치는 효과를 평가하기 위한 기구로서 2가지 입체형태적으로 특이적인 항EGFR 항체인 mAb528(19) 및 mAb806(20;23;30)의 결합을 사용했다.
수용체 발현 및 예비 특성규명:
다음과 같은 6가지 점 돌연변이를 면밀하게 분석했다(도 9A, 9B 참조): Tyr246(Phe, Trp 및 Asp)에서의 3가지 CR1 돌연변이 및 Asp563(His으로), Glu578(Cys으로) 및 Val583(Asp로)에서의 3가지 CR2 치환. CR1/CR2 상호작용을 이황화 결합시키 기 위한 시도로, CR1과 CR2 각각에 치환(Leu245이 Cys으로 Glu578이 Cys으로)이 일어난 돌연변이체를 제조했다. 재조합 EGFR의 발현은 EGFR의 생화학적 특성규명에 이상적인 조혈 세포주 BaF/3을 사용하여 실시했다(18;25). G418에서 형질감염 및 선발 후, 수용체 발현은 EGFR의 세포외 도메인에 대해 지시되고, 리간드 결합을 차단하며(19), 수용체의 천연 형태만을 인식하는 것으로 보고된 모노클로날 항체 528뿐만 아니라 항플래그 항체 M2를 사용하여 모니터했다. 이들 항체와의 반응성을 기초로 할 때, 모든 돌연변이 수용체는 정확하게 폴딩되고 세포 표면에서 발현되는 것으로 보인다. FACS 분류를 수회 반복한 후, 돌연변이체 또는 wtEGFR의 유사 수준(20-40,000R/세포)을 발현하는 세포주를 수득했다(도 10). 수용체 발현은 세포당 수용체가 100,000개 이하인 것이 가장 중요하다: 즉 일시적 발현 실험은 보통 세포당 105을 초과하는 높은 농도의 세포 표면 EGFR을 생산하지만, 이러한 농도의 발현에서는 종종 EGFR의 자발적 활성화(즉, 리간드 독립적 티로신 인산화)가 일어난다. 이러한 활성화의 원인은 분명하지는 않지만 수용체의 올리고머화, 부정확한 프로세싱 또는 부정 폴딩때문일 수 있으며, 이에 본 발명자들은 <50,000R/세포을 발현하는 세포주를 생산하여 이러한 문제점을 피하고자 했다.
EGFR 돌연변이체에 의한 리간드 결합:
EGFR의 테터링된(9) 및 미테터링된 ECD의 결정 구조로부터 추정된 것은 이 두 형태에 대한 리간드의 친화성이 다소 상이할 것이라는 점이다. 미테터링된 입체형태일 때 리간드는 L1 및 L2 도메인 모두와 접촉할 수 있는 반면, 테터링된 입체 형태일 때 리간드는 L1 또는 L2 도메인 중 어느 하나에만 결합할 수 있다. 퍼거슨 등(9)은 CR1과 CR2 루프 사이의 상호작용 약화가 EGF에 대한 EGFR-ECD의 겉보기 친화성을 증가시킨다고 보고했지만, CR1-루프 및 CR2 도메인의 테터링과 리간드 결합 친화성 간의 연관성은 분리된 EGFR-ECD의 BIAcore 분석을 통해 수득한 결과를 기초로 했다(9;31). 세포 표면에 있는 전장의 EGFR에 대한 동역학적 결합 결과는 EGFR-ECD의 경우 20 내지 350nM인 것에 비해 적어도 2차수의 등급이 낮은 20pM 내지 2nM인 친화성 상수를 제공한다. 세포 상황에서 리간드에 대한 EGFR의 결합 동역학은 구조 독립적 요인, 예컨대 국소 수용체 밀도, 올리고머화 상태 및 세포질 또는 세포골격 인자들과의 상호작용과 같은 요인들로 인해 복잡해진다(32-34). 전장 수용체의 상황에서, 키나제, 경막 및/또는 C-말단 도메인의 변형 또한 그 리간드에 대한 EGFR의 친화성에 영향을 미친다(35-39). 따라서, 순수 세포에 존재하는 수용체의 리간드 결합 친화성, 올리고머화 상태 및 시그널링(이하 참조)에 미치는 CR1 및 CR2 돌연변이의 효과를 측정하는 것이 중요하다. 생리적 온도에서 리간드 결합을 평가하는 동안 내재화를 방지하기 위하여 친화성 측정은 30μM 페닐아르신 옥사이드의 존재하에서 수행했다(29): 이러한 분석 조건하에서 EGFR의 내재화는 >1%RK지 감소했다(결과는 제시하지 않았다). wt 및 돌연변이 EGFR에 대한 EGF 결합의 스캐챠드 분석 결과는 표 3과 도 11에 제시했고 이하에 정리했다.
Figure 112006068032313-PCT00009
125I-EGF 결합은 "재료 및 방법" 편에서 기술한 바와 같이 수행했다. 결과는 "Kell for Windows" RadLig 프로그램을 사용하여 분석했다.
(a): 세포당 수용체 수는 각 리간드 결합 실험에서 Bmax 및 세포수/튜브로부터 계산했다. 결과는 적어도 3회의 별도 실험의 평균과 표준오차이다.
(b): 스캐챠드 분석으로 측정한 수용체 수(Bmax)는 FACS 또는 면역블롯팅으로 측정한 수용체 수의 10% 미만이었다.
CR2 돌연변이: V583D 및 D563H 돌연변이는 CR2/CR1-루프 상호작용을 붕괴시키기 위해 설계했다. 테터링된 입체형태에서 V587 측쇄의 γ-메틸 기는 Y246과 밀접한 반데르발스 접촉되어 있다: Asp γ-카르복실을 치환시키면 CR1/CR2 계면이 붕괴될 것이다. 이와 마찬가지로, D563의 γ-카르복실은 테터링된 입체형태에서 Y246에 수소결합되어 있고, 아스파테이트 카르복시 기를 His의 이미다졸로 치환시키면 상호작용이 약화될 것이다. V583D를 발현하는 세포에서 고 친화성 EGF 결합 부위의 비율은 wtEGFR을 발현하는 세포에 비해 유의적으로 증가되어 있다(각각 12.6% vs 2.6%). 이러한 경향은 D563H 돌연변이체에서도 관찰되지만, 이 경우의 wt와의 차이는 통계학적으로 유의적인 것은 아니었다(표 3). 고 친화성 부위의 비율 증가는 수용체의 미테터링된 상태쪽으로의 평형 이동을 나타내는 것으로서, V583D와 D563H 돌연변이가 CR1/CR2 상호작용을 약화시킬 것이라는 가정을 지지한다. CR1과 CR2를 공유 결합시키는 이황화 결합을 형성시킬 수 있는 가능성을 조사하기 위하여 본 발명자들은 테터링된 입체형태에서 적당한 간격과 측쇄 배향을 갖는 2개의 잔기, 즉 Leu245 및 Glu578을 동정했다. 먼저, 본 발명자들은 단일 돌연변이 E578C를 만든 다음 이중 돌연변이 L245C/E578C를 만들었다. 흥미롭게도, E578 측쇄는 L245 및 P248 모두의 측쇄에 근접해 있어, E578C 치환은 이 잔기들의 소수성 상호작용을 증가시켜 CR1-루프/CR2 계면의 패킹(packing)을 증가시킬 것으로 예상된다. 실험적으로 E578C 돌연변이는 저 친화성 부위의 수에 영향을 미침이 없이 고 친화성 EGF 결합 부위를 완전히 없앤다(표 3). 이 위치에 시스테인의 도입은 시스테인 풍부 도메인 중 어느 하나 또는 둘 모두의 폴딩에 영향을 미치는 것으로 보이지 않는다: 즉 입체형태 의존적 항체 mAb528은 돌연변이 수용체에 결합하고, 그 인산화 및 시그널링도 EGF에 여전히 의존적이다(이하 참조).
CR-1 루프 돌연변이: Tyr246 대신에 3개의 다른 아미노산 치환(Phe, Trp 및 Asp)을 도입시켰다. 결정 구조는 Y246이 CR1/CR1 및 CR1/CR2 상호작용 모두에 중요하다는 것을 암시한다(도 9B, 9C). 테터링된 형상에서, CR1 루프는 CR2 도메인과 근접하게 상호작용하여, Tyr246이 Asp563의 카르복실 측쇄와 수소 결합한다. Asp563은 Lys585의 ε-아미노 기와 작은 가교를 통해 제 위치를 유지한다. Tyr246의 Phe으로의 돌연변이는 H 결합을 제거하여 테터를 더 약화시킬 것이다. Trp246 돌연변이체는 CR2 결합 부위에 끼워지기에는 너무 커서 사실상 Lys585-Asp563 염 가교를 붕괴시킨다. Tyr246의 Asp로의 치환은 소수성 패킹의 소실뿐만 아니라 Asp246과 Asp563 사이의 강한 반발 작용을 초래할 것이다. 즉, 모든 돌연변이는 테터링된 입체형태가 덜 바람직하도록 해야 한다. EGFR 키나제의 활성화를 위해서는 Tyr246의 하이드록실이 대향 사슬에 수소결합하도록 연속 이량체가 형성되어야 한다(도 9). 실제, 리간드의 존재 하에서 상기 하이드록실은 Ser262, Gly264 및 C283 잔기에서 주쇄와 수소결합한다. 이러한 3개의 수소 결합은 Phe246 및 Asp246 돌연변이체에서는 결실될 것이다. Tyr246과 대향 사슬 사이의 패킹은 Trp 잔기가 들어가기에는 좁아서 Trp246 이량체는 근접하게 패킹될 수 없을 것으로 생각된다. 실험적으로, 3개의 모든 돌연변이는 고 친화성 EGF 결합의 소실을 나타냈고(표 3 및 도 11), 이것은 CR1/CR2 결합의 미테터링에 의해 보상되지 않는 CR1/CR1 상호작용의 심각한 손상을 암시한다.
종합해보면, 이러한 관찰들은 EGFR의 "테터링된" 형태에 대한 리간드 결합이 저 친화성으로 일어난다는 것을 확인시켜주며, 이러한 저 친화성 EGF 결합은 L1 및 L2 도메인의 상대적 위치결정과 무관한 것으로 보인다. 결정 구조의 조사 결과, 두 도메인의 리간드 결합 표면이 테터링된 입체형태 및 미테터링된 입체형태 모두에서 유용한 것으로 보이며, 따라서 저 친화성 결합은 아마도 어느 한 부위에 대한 결합을 반영하거나 또는 독립적으로 양 부위에 대한 결합을 반영한다. 분명한 것은, 미테터링이 고 친화성 결합에 유용한 수용체의 비율을 증가시킬 수 있다는 점이다. 또한, 고 친화성 입체형태는 아마도 이량체 복합체에서 L1과 L2의 병치에 영향을 미침으로써 CR1 루프를 필요로 한다는 것을 유념하기 바란다.
수용체 이량체화 : 수용체의 세포외 도메인에 대한 EGF 결합은 키나제 활성 EGFR의 형성 또는 안정화를 유도한다. 리간드 유도성 CR1/CR1 상호작용은 활성 EGFR 복합체의 형성에 필수적이다. 즉, CR1 루프의 결실은 EGFR-ECD가 이량체화하는 능력이 전장 EGFR인 상황에서도 소실되게 한다(4). 분명한 것은, CR1 및 CR2 루프에서의 돌연변이가 EGF 결합 친화성에 유의적인 영향을 미친다는 점이며(도 11 및 표 3), 이에 기본 이량체화 및 리간드 매개 이량체화와 키나제 활성화에 미치는 상기 돌연변이의 효과를 측정하기로 했다. 세포를 EGF 및 동종이작용기성 세포 불투과성 가교결합제 BS3으로 실온에서 30분 동안 처리했다. 세포 용해물을 SDS-PAGE로 분리하고 항EGFR 항체 또는 항포스포티로신 항체로 면역블롯팅했다. 결과는 도 4에 나타내고 이하에 정리했다.
CR1-루프 돌연변이체는 리간드 의존적 이량체화의 감소를 나타냈고, 특히 Y246D 돌연변이는 리간드 의존적 이량체화를 완전 소실시켰다. 하지만, 기본 이량체화는 단지 최소 영향을 받았다. 이것은 자발적이며 리간드 매개의 이량체화 계면에 존재하는 Y246의 입체형태가 다른 역할을 한다는 것을 시사한다. CR1-루프 전체가 결실된 △-CR1-루프 수용체 중의 검출성 이량체가 완전 결실되면(4), 이 루프의 다른 영역이 미결합된 이량체의 형성에 기여할 수 있게 된다. 단량체 및 이량체성 Y246 돌연변이 수용체의 포스포티로신 함량은 둘 모두에서 감소되었는데, 이는 이량체가 형성될 때조차도 ECD 입체형태가 키나제를 활성화시키지 못한다는 것을 암시한다. 즉, Y246W 돌연변이체에서 일부 자발적 이량체가 검출될 수 있을지라도 리간드가 없을 때에는 사실상 이량체가 인산화되지 않는다. 분명한 것은, ECD 가교결합성 이량체의 형성이 모든 Y246 돌연변이체에서 감소되었다는 점이다. 특히, EGF 자극후 Y246 돌연변이체 단량체의 포스포티로신 함량이 특히 영향을 받은 점을 유념하기 바란다(도 12C). 이러한 단량체들은 가교결합하지 못한 이량체로부터 생성된 것이기 때문에, 이량체 복합체에서 상호작용이 변경된(더 약한) 분자의 아집단을 반영할 수 있다. Y246 돌연변이가 이량체의 안정성에 전반적인 영향을 미치는지, 이량체 서브유닛의 재배향 또는 키나제 활성화에 필수적인 고차수 올리고머 형성을 차단하는지 여부는 본 실험 시스템을 통해 직접 해명될 수는 없다.
CR2 돌연변이체는 기본 및 리간드 의존적 이량체화의 정상 수준은 갖고 있었다. 본 발명자들은 CR1/CR2 테터를 약화시킨 돌연변이 EGFR에서 이량체 비율에 유의적인 증가를 검출하지 못했는데, 이것은 그 돌연변이가 미테터링을 유도할 때조차도 BS3-가교결합성 이량체 복합체의 형성이 리간드의 결합에 의존적인 것을 암시한다. E578의 C로의 돌연변이는 쌍을 이루지 않은 시스테인을 도입시켜, 이황화 결합된 이량체의 형성을 유도할 수 있을 것으로 생각된다. 본 발명자들은 이러한 가능성을 여러 가지 스페이서-아암 길이의 가교결합제(BS3, 11.3Å 및 설포-EGF, 16.1Å)를 사용하고, 또한 환원 및 천연 조건 하에서 가교결합되지 않은 이량체를 분석하여 조사했고(결과는 제시하지 않았다), 그 결과 E578C 돌연변이체가 자발적으로 인량체화한다는 어떠한 증거가 발견하지 못했고, 이에 Cys578이 사슬간 이황화 결합의 형성을 유도하지 않는다는 결론을 얻었다.
리간드 의존적 티로신 인산화 및 MAPK 시그널링 : CR1-루프/CR2 상호작용은 EGFR의 키나제 불활성 입체형태를 안정화하고 자발적 활성화를 차단하는 것으로 보인다. 본 발명자들은 기본 및 EGF 의존적 티로신 인산화, 및 MAPK 활성화를 돌연변이 수용체를 발현하는 세포에서 모니터했다. 그 결과는 도 13에 제시했다. 리간드 결합은 대부분의 돌연변이 수용체 분자의 포스포티로신 함량을 약간 증가시키지만, 각 돌연변이체의 특이적 활성화(수용체 단백질에 대한 티로신 인산화 비율과 MAPK의 특이적 활성화: 도 13B, 13C)는 크게 달랐다. CR2 돌연변이체는 모두 wt 수용체와 유사한 농도에서 리간드에 의해 활성화된다. 단지 저 친화성 부위를 보유하며 이로 인해 테터링된(불활성) 형태에서 주로 나타날 E578C에서조차도, 고농도의 EGF(16nM)에서 완전하게 자극될 수 있다. 본 발명자들은 리간드 결합 친화성과 CR2 돌연변이체 수용체의 시그널링 사이의 상관관계를, 세포를 농도 증가되는 EGF(30pM에서 100nM)에 노출시키고 티로신 인산화 및 MAPK 활성화의 유도를 모니터하여 검사했다(도 14). E578C-EGFR 발현 세포에서 EGFR 및 시그널 변환기 Shc 및 MAPK의 최고 인산화는 wt에 비해 훨씬 높은 농도의 EGF에서만 달성되었다. 이에 반해, V583D 및 D563H-EGFR 발현 세포에 대한 수용체의 활성화는 wtEGFR보다 저 농도의 EGF에서 나타났다(도 14B, 14C). 이러한 결과는 CR2 도메인의 돌연변이가 수용체 기능을 유발시키는 후속 단계가 아닌 결합 친화성에 영향을 미친다는 생각을 지지한다. 포화량의 EGF에서도 Tyr246 돌연변이체는 모두 티로신 인산화 및 MAPK 활성화를 상당히 감소시켰다(도 13). 즉, 증식성 CR1/CR1 루프 상호작용을 형성하는 능력은 키나제 활성화에 매우 중요하다. CR1 루프 또는 이의 도킹 영역(Y251A, F263A)에 대한 다른 점 돌연변이는 EGFR 시그널링에 최소 영향을 미치는 것으로 보인다(5). 하지만, CR1 루프와 이의 도킹 부위가 모두 붕괴되면(예, Y251A/R285S 이중 돌연변이체: (5)), 시그널링은 완전히 붕괴된다. 이 저자는 또한 리간드 결합 농도의 감소를 보고했는데, 이것은 이량체화 도킹 부위의 체결이 EGF에 대한 반응으로 L1 및 L2 도메인이 재배향하는 능력에 영향을 미칠 수 있음을 암시한다.
EGFR 돌연변이체 유래의 유사분열 시그널링 . 궁극적으로, EGFR의 기능성은 생물학적 반응을 자극하는 능력을 통해 측정한다. 이러한 반응은 다수의 변수, 예컨대 리간드 결합의 친화성, 키나제 활성화 강도, 키나제 활성화의 등급, 시그널링 기간 등에 의존적이다. 본 발명자들은 EGFR 돌연변이체를 증가 농도량의 EGF에 노출시킨 후 "드 노보(de novo)" DNA 합성 유도 능력에 대해 [3H]티미딘 병입 분석법을 사용하여 검사했다. 결과는 도 15와 표 4에 제시했다. 먼저, 어떠한 세포주도 리간드 독립적인 [H]티미딘 병입을 나타내지 않았다: CR1 루프와 CR2 사이의 테터가 약화되었을 때조차도 유사분열 시그널링은 수용체 활성화를 위해 EGF 결합을 필요로 한다는 것은 분명하다. 일반적으로, EGF의 EC50은 고 친화성 수용체 점유와 양호한 상관관계를 보이지만(표 3 및 4 참조), E578C의 경우에 최대 [H]티미딘 병입률의 1/2 및 수용체의 최대 점유률의 1/2에 필요한 EGF 농도 사이에는 10배의 차이가 있다. 본 발명자들이 확인한 바로는, wtEGFR을 발현하는 BaF/3 세포주에서는 EGF에 대한 최대 반응의 1/2을 달성하는데 500R/세포 정도의 적은 수의 활성화를 필요로 한다(방법론 면에서 Walker et al. 1998 참조); 이러한 역치는 wtEGFR인 경우에는 약 15pM에서, E578C 세포인 경우에는 약 80pM EGF에서 도달된다(표 4). 동일한 계산법(각 EGF 농도에서 수용체/세포의 총 수와 비례 점유도를 기초로 한)을 사용하여, Y246W 돌연변이는 약 60pM의 EGF 농도에서, Y246D 돌연변이체는 약 400pM의 농도에서 최대 반응의 1/2에 도달할 것인지 평가했다. 유사분열 분석에서 이러한 돌연변이체들의 EGF에 대한 반응의 완전한 결여는 상기 EGFR들이 단순히 리간드 결합 친화성이 상실되었다기 보다는 증식성 시그널링 단위 형성에 무능함을 반영한다.
Figure 112006068032313-PCT00010
wt 또는 돌연변이 EGFR을 발현하는 BaF/3 세포는 농도 증가량의 EGF(0 내지 10ng/ml, 0 내지 1.7nM)에 노출시켰고, DNA 합성은 실험 방법편에 상세히 설명한 바와 같이 [3H]티미딘 병입율로 측정했다.
(a) 1nM EGF에서 wtEGFR-BaF/3 세포의 반응은 최대로 측정되었다. b) EC50은 도 7에 도시한 바와 같은 용량 반응 곡선에서 측정했다. c) 500R/세포를 점유하는데 필요한 EGF 농도는 수용체 점유도 대 EGF 농도의 플롯을 이용하는 스캐챠드 분석에서 수득한 Kd 및 Bmax 결과로부터 계산했다. EGF의 각 농도에서 점유된 EGFR의 수는 다음 식에서 따라 계산했다:
([L]/[L]+Kd1) x R1 + ([L]/[L]+Kd2) x R2
여기서, [L]은 EGF 농도이고; Kd1 및 Kd2는 평형 결합 상수이며; R1 및 R2는 고 친화성 수용체 및 저 친화성 수용체의 수이다.
결과는 적어도 3회의 독립 실험의 대표값이다.
EGFR 입체형태의 항체 모니터링. 지금까지 제시된 결과는 CR1 루프와 CR2 도메인 사이의 상호작용이 EGFR을 저 친화성 키나제 불활성 상태에 있게 하고(9), CR1/CR1 루프 상호작용이 EGFR의 리간드 유된성 키나제 활성화에 필수적이라는(4;5) 모델을 지지한다. "중간" 상태가 또한 존재하는지 여부(Ferguson et al., (9))에 의해 제안된 바와 같이), 또한 어떤 성질일지는 여전히 불분명하다. 본 발명자들의 예상으로는 이러한 형태의 수용체가 미테터링된, 더 고 친화성, 이량체성 및 키나제 불활성일 것이라고 생각한다. 리간드 부재 시, 정확한 CR1-CR1 상호작용은 형성되기 어렵거나 또는 키나제 활성화를 일으키기에는 지나치게 일시적일 것이다.
모노클로날 항체 528(19)은 사람 EGF 수용체에 대한 EGF 결합의 경쟁 항체로서 사용되었다. mAb528의 정확한 에피토프는 아직 지도제작되어야 하지만, mAb528은 △2-7 EGFR(L1과 대부분의 CR1 도메인이 결여된 것: (40))과 반응하며, wtEGFR에 대한 리간드 결합을 방해하여, 본 발명자들은 이 에피토프가 L2 도메인에 존재하는 것이라 생각한다. 이 항체는 사람 EGFR에 특이적이며 정확하게 폴딩된 수용체만을 인식한다(즉, 웨스턴 블롯 시, hEGFR의 환원 형태와는 반응하지 않는다). 본 연구에 사용된 모든 돌연변이체와 mAb528의 반응성은 약화되지 않으며, mAb528을 이용한 FACS 분석 또는 125I-EGF를 이용한 스캐챠드 분석에 의해 측정된 수용체 수는 항상 일치한다. 앞에서 언급한 바와 같이 L245C/E578C 돌연변이체는 mAb528과 완전히 반응하지만 저 친화성 EGF 결합 부위의 예상 수의 10% 만을 보유한다.
모노클로날 항체 806은 △2-7 절두형 EGFR뿐만 아니라 수용체를 과잉발현하는 세포에서 wtEGFR의 아집단을 인식하여(23;30), mAb806은 △2-7EGFR을 발현하는 아교모세포종 이종이식편에서 또는 wtEGFR을 과잉발현하는 암종에서 항종양제로서 활성적이다(22;41;42). 이 항체는 수용체의 활성화된 형태를 선택적으로 인식하는 것이 요구되었다(43). EGFR의 분리된 ECD에 대한 연구에서는 mAb806이 CR2 도메인이 결실된 ECD의 표면에 고정된 C-말단 절두 형태(aa1-501)와 반응하지만 N-말단 절두 형태(aa303-621)와는 반응하지 않는 것이 확인되었고, 이는 에피토프가 CR1 도메인의 C-말단 부분 쪽에 위치해 있음을 암시한다(Johns et al., 제출된 원고). mAb806은 약 40,000개 wtEGFR/세포을 발현하는 BaF/3 세포의 표면과 약하게 반응하지만, 유사한 수의 △2-7 수용체(L1과 CR1 도메인의 대부분이 결여된 것)를 발현하는 BaF/3 세포는 mAb806과 강하게 결합한다(도 16). 흥미롭게도, △CR1 루프 돌연변이체(aa 244-259가 결여된 것: (4))는 mAb806 반응성이 강하다. mAb528이 페소 표면에 존재하는 정확한 폴딩된 EGFR을 모두 인식할 수 있다면, FACS 분석을 사용하여, mAb806과 반응성인 EGFR의 비율을 mAb806 대 mAb528의 중앙 형광도 비를 계산하여 측정할 수 있다: 즉, 본 연구에서 두 항체를 포화 농도로 사용하고, 결합이 동일한 2차 항체(Alexa488 커플링된 항마우스 Ig)에 의해 검출되고 FACS 검출이 사용된 범위에서 선형이기 때문에 직접 비교가 가능하다. 이러한 분석 시, mAb806과 반응성인 수용체의 비율은 wtEGFR의 경우 6 내지 8%에서부터 △2-7 및 △CR1 루프 EGFR의 경우 70 내지 90%로 다양하다(mAb806 대 mAb528 결합의 비는 0.06 내지 0.08 대 0.069 내지 0.98이다: 도 14 및 결과는 도시하지 않았다). 종합해보면, 분리된 ECD 및 세포 수용체에 대한 결과는 에피토프가 CR1 도메인의 가장 C-말단인 부분에 존재하여 wt 수용체의 천연 입체형태에 의해서는 은폐될 수 있지만, CR1-루프의 결실에 의해 노출될 수 있다는 것을 암시한다. 실제, EGFR-ECD의 결정 구조 위에 mAb806 에피토프의 지도제작은 CR1 루프의 C 말단 옆에 바로 위치하고(도 9B, 9C 참조); 따라서 mAb806 에피토프는 연속 이량체 형태에서 CR1/CR1 계면에 매립될 가능성이 있다. mAb806 에피토프는 또한 수용체의 테터링된 형태에서 부분 매립될 수도 있다. 단지 추정상의 "중간" 상태인 수용체의 미테터링된 형태인 CR1-루프/CR2 또는 CR1/CR1 루프 상호작용에 의해 은폐되지 않은 경우에만 mAb806 에피토프가 유용해지는 것으로 보인다. 따라서, 이 항체는 테터링된, 미테터링된 및 완전 활성 EGFR 복합체를 분석할 수 있는 민감한 입체형태 프로브를 제공할 수 있다. 이 가설을 검사하기 위하여 본 발명자들은 mAb806 또는 EGF와의 예비항온배양 전 및 후에 wtEGFR을 발현하는 세포와 mAb806의 반응성을 모니터했다. mAb806이 수용체의 중간 형태를 인식하고, 이러한 중간 형태가 테터링된(CR1-루프/CR2) 상태와 CR1/CR1 미테터링된 상태와의 동적 평형 상태에 있다면 항체와의 예비항온배양은 이 종쪽으로 평형을 이동시키고, 결과적으로 반응성을 증가시킬 것이다. EGF와의 항온배양은 CR1/CR1 계면의 형성을 유리하게 함으로써 반응성을 감소시킬 것이다. wtEGFR/Baf 세포는 내재화 억제제 페닐아르신 옥사이드(29)의 존재 하에서 37℃(반응계의 에너지 최대화를 위해) 하에 mAb806에 노출되거나 4℃ 하에 EGF에 노출되면, 키나제 활성 상태가 형성되지만 내재화는 완전히 차단되었다. mAb806 처리는 EGFR의 총 수(125I-EGF 결합율로 측정했을 때)를 변경시키지 않았고, 두 조건 하에서 EGFR의 95%를 넘는 양이 세포 표면에 존재했다(결과는 제시하지 않았다). mAb806, EGF 또는 대조군 완충액으로 예비처리한 후, mAb528, mAb806 또는 대조군 항체와 wtEGFR 반응성을 FACS 분석으로 측정했다. 표 5는 mAb806 또는 EGF 예비처리에 의해 유발된 중앙 형광도 채널의 변화 및 mAb806 및 528 반응성 사이의 비를 정리한 것이다. 이러한 결과를 제공하기 위한 본 방법은 절대 중앙 형광도 값의 실험들 간의 변동을 극복하고(레이저 전류 및 검출기 부속품의 작은 변화에 매우 민감하다), 실험 결과가 수집되는 것으로 선택했다. mAb806 10㎍/ml와 37℃에서 1시간동안 세포의 예비배양은 528 반응성에 영향을 미침이 없이 mAb806과의 반응성을 2배보다 많이 증가시켰다. 즉, 두 항체 사이의 비는 크게 상승되었다. 동일한 조건 하에서 mAb528과의 예비항온배양은 후속 mAb528 또는 mAb806 결합에 어떠한 영향도 미치지 않았다(결과는 제시되지 않았다). 별도 실험으로, 본 발명자들은 증강된 mAb806 결합이 포화 결여 때문이 아니라는 것을 확인했다. 즉 mAb806의 농도 증가(10㎍/ml에서 50㎍/ml까지) 또는 2차 항온배양 동안 노출 시간의 증가(20분에서 1시간까지) 효과는 무시할 정도였다. mAb806과의 예비항온배양 효과는 시간 및 온도 의존적이어서, 37℃에서 3시간 동안 예비항온배양한 후 최대가 되었다(결과는 제시하지 않았다). 이러한 결과는 EGFR 수용체의 일시적인 미테터링된 형태에 mAb806이 포착되는 결과와 호환적이다. 반대로, EGF에서 세포의 예비항온배양은 mAb806과의 반응성을 급격하게 감소시킨다. 이러한 조건 하에서 수용체의 내재화는 <5%으로, mAb806 결합 감소에 크게 기여할 수 없다. 이러한 실험에서, mAb528과의 반응성은 에피토프의 입체장애 또는 은폐를 통해 EGF의 결합 후 약 20% 감소되었다. 종합해보면, 이러한 결과들은 mAb806이 수용체의 미테터링된, 미결합된 형태를 선택적으로 인식하는 것을 나타낸다.
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wtEGFR을 발현하는 BaF/3 세포를 대조군 완충액, mAb806(10㎍/ml, 37℃, 1시간: (a)) 또는 EGF(10ng/ml, 4℃에서 15분 (b))와 예비항온배양했다. 그 다음, 세포를 mAb806 또는 mAb528(각각 10㎍/ml)로 탐침한 다음 실험 방법편에 기술된 바와 같은 알렉사488 표시된 항마우스 Ig으로 탐침했다. FACScan으로 세포를 분석하고 중앙 형광도 값을 CellQuest의 통계 분석 프로그램을 사용하여 수득했다. 모의 예비항온배양 후 중앙 형광도 값은 mAb528에 대해서는 112+/-21, mAb806에 대해서는 7+/-1.9 및 대조군(클래스 부합성) 무관련 항체에 대해서는 0.5+/-0.3이었다. 음성 대조군 값은 모든 결과에서 삭감했다. 결과는 모의 시료와 비교했을 때 검사 시료의 중앙 형광도의 양성 또는 음성 변화율로서 나타냈다. mAb806과 mAb528의 중앙 형광도 사이의 비도 제시했다. 결과는 각각 3개의 실험값의 평균과 표준오차이다.
CR1-루프 또는 CR2 돌연변이체에 대한 mAb806 결합의 분석(표 4)는 다음을 지지한다: mAb806 반응성은 CR1 루프/CR2 상호작용이 약화된 돌연변이체(V583D 및 D563H)에서 wtEGFR보다 적어도 2배이고, CR1/CR1 상호작용을 형성할 수 없는 수용체(Y246 돌연변이체)의 경우에는 wtEGFR보다 약 3배 더 높았다. EGF와의 항온배양은 돌연변이체 두 종류에 반대 효과를 나타냈다: EGF는 활성 이량체를 형성할 수 있는 수용체들과 mAb806의 반응성을 감소시키는 반면(wt 및 CR2 돌연변이체 전체), mAb806과의 반응성은 변화가 없거나 심지어 CR1-루프 돌연변이체에서는 증강되었다. 이러한 돌연변이체에 미치는 EGF의 효과는 약한 CR1-루프/CR2 루프 상호작용이 EGF를 매개로 한 미테터링과 일치하고 이에 수반하여 CR1/CR1 루프 상호작용의 형성되지 않았다. EGF에 의한 mAb806 반응성 변조는 티로신 인산화 및 DNA 병입에 의해 측정되는 바와 같이(도 15 및 표 6 참조) EGFR 키나제를 활성화시키는 돌연변이 EGFR의 능력 여부와 양호한 상관성이 있다. 본 발명자들의 결과는 mAb806이 연속 이량체 입체형태로 형상화되어야 하는 EGFR의 미테터링된 형태를 우선적으로 인식하는 모델에서의 결과와 일치한다. mAb806은 리간드 결합 시 수용체 안에서 입체형태적 변화를 모니터하는 기구로서 사용될 수 있다. EGFR의 일시적인 미테터링된, 미결합된 입체형태는 어떠한 시기든지 총 EGFR의 소분획을 나타내지만, 수용체를 과잉발현하는 세포에서는 문헌(22;23;30)에 보고된 바와 같이 검출가능한 양으로 존재할 것이다. 본 발명자들의 결과 또한 종양 형성을 억제하는 mAb806 능력의 설명을 도울 수 있다: △2-7EGFR을 발현하는 세포에서, 항체의 결합은 수용체 복합체의 키나제 활성 입체형태의 형성을 입체적으로 방해하는 반면, wtEGFR을 과잉발현하는 세포에서는 미테터링된 EGFR 형태를 포착하여 CR1-루프 사이의 상호작용과 후속 활성화를 차단할 수 있다. 이러한 가설은 mAb806 처리 후 △2-7 EGFR의 키나제 활성화가 감소한다는 보고(42)와 일치한다.
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wt 또는 돌연변이 EGFR을 발현하는 BaF/3 세포는 표 3에 기술된 바와 같이 처리했다. 중앙 형광도 값과 mAb806과 mAb528 반응성 사이의 비율은 표 3에 기술된 바와 같이 계산했다. 각 실험에서 완충액 처리된 wtEGFR의 mAb806/mAb528 비를 1로 간주하고, 다른 모든 비를 wtEGFR 값으로 나누어 돌연변이체들 및 각 실험들을 직접 상호 비교했다. 결과는 적어도 4회의 각 실험들의 평균값과 표준오차이다.
결론
전장의 세포 EGFR의 상황에서 수용체내 테터링 및 수용체간 테터링(4;6;9)의 역할을 검사하기 위해 설계된 돌연변이들은 다음을 시사한다: 1) 고 친화성 EGF 결합 위의 수는 CR1-루프/CR2 테터에 의해 강한 영향을 받는데, 이것은 아마도 L1 및 L2 도메인의 상대적 위치결정을 반영하는 것으로 생각한다. CR1/CR2 테터의 약화는 고 친화성 부위의 비율을 증가시키고 CR1-루프/CR2 테터의 강화는 고 친화성 결합을 소실시킨다(표 3). 그럼에도 불구하고, 전장의 세포 수용체와 분리된 ECD, CR1 및 CR2 상호작용 사이에 리간드 결합 친화성의 유의적 차이는 두 분자에 동일한 상대적 변화를 유도한다(Ferguson et al.(9) 및 본 발명의 결과 참조). 세포내 성분에 의한 EGFR 친화성의 변조는 EGFR의 막인접 또는 키나제 도메인의 변형 때문인 바, 테터링된 상태와 미테터링된 상태 사이의 변경된 평형을 반영해야 한다. EGFR의 세포내 부분의 변형이 세포외 도메인의 입체형태에 변경을 유도하는 방식은 불분명하지만, 이것은 향후 흥미로운 도전 과제일 것이다. 2) EGFR의 리간드 독립적 이량체화(또는 올리고머화)는 CR1-루프 또는 CR2 도메인의 돌연변이에 의해 큰 영향을 받지 않는다. CR1-루프/CR2 테터의 약화는 구성적 이량체화를 유도하지 않고, 테터의 강화가 구성적 이량체화를 감소시키지도 않는다(도 12). 즉, CR1-루프가 수용체간 상호작용에 유용한 경우조차도(표 4의 mAb806 결과에 의해 암시되는 경우), 증식성 이량체화 및 활성화(포스포티로신 함량에 의해 간접적으로 평가됨)는 리간드 결합 없이 일어나지 않는다. 하지만, 리간드 매개의 EGFR 이량체화 및 활성화는 CR1 루프의 돌연변이에 의해 영향 받는다. 이러한 결과는 구성적이며 리간드 유도적인 이량체가 동등하지 않으며, 리간드 결합이 수용체 서브유닛의 미세한 위치결정과 후속되는 키나제 활성화에 엄격히 필요로 되는 것임을 시사한다(16). CR1-루프 중의 Tyr246은 활성화된 복합체 형성에 매우 중요한 것으로 보인다. 형식적으로 Tyr246의 모든 돌연변이가 테터링된 입체형태로 수용체를 고착시키는 것이 가능하지만, 입체형태 특이적 mAb806을 사용하여 수득한 본 발명자들의 결과(표 6)는 Tyr246 돌연변이체가 이량체성 복합체를 정확하게 배향시키지 못하는 것을 시사했다. 3) 본 발명자들은 EGFR의 미테터링 형태지만 불활성 형태를 선택적으로 인식하는 것으로 보이는 항체 mAb806을 사용하여 EGFR의 입체형태에 유의적인 변화를 모니터할 수 있었다. CR1/CR2 상호작용의 붕괴는 mAb806 반응성을 증가시키는 반면 리간드 결합은 그 반응성을 감소시킨다(표 6). 흥미롭게도, D563H 및 V583D 돌연변이와 Y246 돌연변이는 모두 CR1/CR2 상호작용을 약화시켜 mAb806과 높은 반응성을 유도했다. 더욱이, CR1/CR1 상호작용을 붕괴할 가능성이 가장 큰 Tyr246 돌연변이(트립토판 및 아스파르트산으로)를 갖는 돌연변이체는 EGF 결합 후 mAb806 반응성의 유의적 증가를 보여, 활성화된 CR1/CR1 배향이 감소되는 것을 확인했다. 4) 활성 이량체 형성능이 유지된다면, EGF에 대한 반응은 친화성과 수용체 수 사이의 평형에 의해서만 유일하게 좌우된다. 본 발명자들은 리간드 활성화성 EGFR을 발현하는 BaF/3 세포에서 최대 DNA 합성의 1/2을 자극하기 위하여 500수용체/세포 정도의 적은 수가 점유될 필요가 있고(표 4), 이것은 Shc 및 MAPK와 같은 하류 시그널링 작동인자의 역치 자극과 상관성이 있음을 확인했다(도 13). 즉, EGFR 인산화 자체는 수용체 점유도(그 결과 리간드 의존적 이량체화 및 활성화)를 계속 증가시키지만, 시그널링 경로는 훨씬 낮은 리간드 농도에서 완전히 활성화되고, 실제 유사분열 자극은 EGFR 인산화가 아닌 Shc 및 MAPK의 인산화가 쉽게 검출되는 EGF 농도에서 일어난다.
EGFR은 각각 리간드 결합 특징과 리간드에 의해 활성화능이 다른, 다양한 상태에서 존재할 수 있음이 분명해지고 있다. 즉 이러한 형태 사이의 평형의 약간의 이동은 특히 하류 시그널링 캐스케이드를 완전히 자극하기 위해 얼마나 적은 수의 수용체가 활성화될 필요가 있는지를 고려하면, EGFR 생물학에 유의적인 영향을 미칠 수 있다. 본 발명자들은 EGFR 대체 형태들에 대한 이해와 수용체 활성화에 미치는 역할에 대해서 정리했다(도 17).
참조문헌
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Figure 112006068032313-PCT00014
Figure 112006068032313-PCT00015
Figure 112006068032313-PCT00016
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실시예 3
랜덤 돌연변이유발 및 효모 표면 디스플레이를 통한 항표피 성장 인자 수용체 항체의 미세 에피토프 지도제작
표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 대한 치료적 관련이 있는 모노클로날 항체(mAb)의 미세 에피토프 지도제작은 랜덤 돌연변이유발 및 효모 표면 디스플레이를 통해 수행했다. EGFR의 외측도메인 단편(잔기 273-621)에 단일 점 돌연변이를 보유한 돌연변이체의 효모 표면에 디스플레이된 라이브러리는 랜덤 돌연변이유발을 통해 작제하고, 당해 mAb에 대한 결합 감소에 대하여 라이브러리를 분류했다. EGFR 돌연변이체가 mAb에 대한 결합 소실을 나타낸다면, 이것은 돌연변이된 잔기가 접촉 잔기일 가능성이 있다. 이 방법을 사용하여 본 발명자들은 EGFR에 대한 mAb806 결합에 효과적으로 중요한 핵심 잔기를 동정했다. mAb806 에피토프는 잔기 Cys287-Cys302로 구성된 루프의 한 면에 위치하고, 이황화 결합과 두 염 가교에 의해 분류되어 있다. 여기서 동정된 mAb806 에피토프는 자가억제된 EGFR 단량체 입체형태에 완전하게 근접할 수는 없는 것으로, 자가억제된 단량체에서 확장된 단량체로 변화할 때 EGFR의 전이성 형태에 대해 이루어지는 mAb806 결합과 일치하는 결과였다.
개요
에피토프 지도제작은 항체-항원 상호작용을 매개하는데 역할을 하는 항원 잔기의 측정이다. 종래의 에피토프 지도제작 방법은 박테리오파지(1), 대장균(2) 또는 효모(3)의 표면에서의 펩타이드 단편의 발현과 후속적으로 항체 결합 분석을 수반했다. 항체 결합의 지도제작은 또한 SPOT 합성을 통해서도 수행되었는데, 여기서 합성 펩타이드는 셀룰로스 막에 점적된 후, 항체 결합에 대해 분석되었다(4). 파지 디스플레이 및 SPOT 기술은 ErbB 수용체계 성분들에 대한 다양한 항체들의 에피토프를 측정하는데 이용되었다(5,6,7). 하지만, 펩타이드 기반 방법은 유일하게 연속적인 비입체형태적 에피토프를 동정할 수 있다. 불연속적인 에피토프를 동정하기 위해서는 H/D 교환 질량 분광분석법을 이용하여 불연속적인 단백분해 단편에 대한 에피토프를 국재화했다(8).
단백질-단백질 상호작용을 상세히 분석하는데 유용한 기구는 당해 잔기가 알라닌으로 돌연변이되고, 그 결과 결합의 변화를 측정하는 방법인 알라닌 스캐닝법이다(9). 이 방법은 적당한 폴딩을 위해 각 돌연변이체의 용해성 단백질 발현과 특성규명이 이루어질 것을 필요로 한다. 샷건(shotgun) 스캐닝 돌연변이유발법은 파지 디스플레이 라이브러리를 이용한 알라닌 스캐닝의 고처리량 방법으로서, 파라토프 지도제작 및 단백질-단백질 상호작용의 지도제작에 사용되었다(10,11). 하지만, 이러한 방법의 진핵생물외 발현계는 25개 이황화 결합과 10개의 N-결합된 글리코실화 부위를 함유하는 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 외측도메인과 같은 복잡한 진핵생물 당단백질의 에피토프 지도제작에 사용될 수 없다(12).
EGFR은 세포 증식 및 분화의 조절에 관여하는 170kDa 경막 당단백질 및 수용체 티로신 키나제이다(13, 14). EGFR(ErbB1, HER1)은 ErbB2(HER2, Neu), ErbB3(HER3) 및 ErbB4(HER4) 또한 포함하는 ErbB 수용체계의 성분이다. 다수의 리간드, 예컨대 표피 성장 인자(EGF) 및 형질전환 성장 인자-α(TGF-α)는 세포외 영역의 도메인 I 및 III에 결합하여 이량체화를 통해 EGFR을 활성화시킨다. 세포외 영역의 도메인 II는 이량체화 접촉을 매개하는데 관여하여 단량체 상태에서 도메인 IV와 자가억제성 접촉을 형성하기도 한다(구조는 (15)에서 검토되고 있다). EGFR 과잉발현은 다양한 악성 암, 예컨대 두경부암, 유방암, 방광암, 전립선암, 신장암 및 비소세포 폐암에서 관찰되었다(16). 이러한 과잉발현은 종종 생존률 감소 및 종양 재발과 상관성이 있어, 환자의 예후 지시인자로서 작용한다(17). 또한, 아미노산 잔기 6-273이 결실되고 이음부에 새로운 글리신이 삽입되어 있는 EGFR vIII으로 알려진 EGFR의 돌연변이체 형태는 다형성 아교모세포종과 같은 암에서 관찰되었다(18). 따라서, EGFR은 암 치료의 중요한 표적으로 부각되었고, 그 기능을 억제하기 위하여 EGFR 세포외 도메인에 결합하는 다양한 항체가 개발되었다.
mAb806은 임상전 개발 중이며 야생형 EGFR보다는 vIII 및 증폭된 EGFR을 우선적으로 인식하는 것으로 밝혀져 있다(19;22). mAb806은 vIII 또는 증폭된 EGFR을 발현하는 종양 이종이식편의 성장을 억제하는 것이 입증되어 있다(23).
최근, J.R. 코흐란 등은 EGFR의 효모 표면 디스플레이된 단편을 이용한 도메인 수준의 에피토프 지도제작 방법을 보고했다(27). EGFR의 복수 도메인이 일부에 포함되어 있기도 하는 대형 단편들은 효모 표면에서 발현되고 적절히 폴딩되었다. 이러한 단편을 연속 및 불연속 에피토프 모두에 대한 EGFR의 특정 도메인에 항체가 결합하는 위치를 찾는데 사용했다. 효모 표면 디스플레이법은 당해 단백질이 효모 Aga2 단백질에 대한 융합체로서 효모 표면에서 발현되는 방법이다. 진핵생물 숙주는 효모 분비 경로를 통해 단백질을 이동시켜, 효과적인 이황화물 이성체화 및 소포체 성질을 조절할 수 있다(28). 효모 표면 디스플레이법은 성숙 일본쇄 항체 단편을 친화성 정제하고(29, 30), 단백질 안정성 및 발현을 조작하며(31,32) 다양한 항원과 합텐에 대하여 선별할 수 있는 비면역 사람 항체 라이브러리를 디스플레이한다(33).
본 연구에서, 본 발명자들은 도메인 수준의 에피토프 지도제작을 자세히 설명하고 항체-항원 결합 상호작용의 더 미세한 잔기 수준의 분석을 위해 효모 표면 디스플레이를 이용한다. 종래 연구에서 밝혀진 바와 같이 mAb806은 EGFR 잔기 273-621에 위치한 에피토프에 결합한다(34). 이 단편을 원료로 하여 EGFR 273-621의 단일 점 돌연변이체의 효모 표면 디스플레이된 라이브러리를 랜덤 돌연변이유발을 통해 제조했다. 이 라이브러리는 mAb806에 대한 결합 소실을 통해 분류되었고, 그 클론들은 서열결정하고 분석했다. EGFR 돌연변이체가 mAb806에 대한 결합 소실을 나타낸다면, 이것은 항원-항체 접촉이 돌연변이로 소실되었음을 암시한다. 즉, 돌연변이된 잔기는 아마도 접촉 잔기일 것이다. 이러한 도메인 방법을 이용하여 EGFR에 대해 치료적 관련성이 있는 mAb806의 결합에 효과적으로 중요한 핵심 잔기를 동정했다.
결과
에피토프 지도제작 라이브러리의 작제 및 분류
미세 에피토프 지도제작 라이브러리는 EGFR 단편 273-621의 저 돌연변이율 오류 경향성 PCR 랜덤 돌연변이유발(low mutation rate error-prone PCR random mutagenesis)을 사용하여 작제했다. 이 단편은 효모 표면에서의 성공적인 EGFR 돌연변이체 디스플레이를 검출하기 위하여 C-말단 c-myc를 함유했다. 초기 라이브러리 크기는 5x105 클론이었고, 미선발된 클론 100개의 서열분석 결과 72%가 야생형 EGFR이고, 17%는 단일 아미노산 돌연변이체이며, 11%는 복수 돌연변이 또는 골격이동된 것이었다. 이것은 상기 349 잔기 단편의 단일 아미노산 돌연변이체들에 의한 이론적 최대 다양성(6.6x103)보다 더 큰 크기 등급이고 가능한 단일 뉴클레오타이드 돌연변이 1.0x103 보다 거의 2차수 등급 더 큰, 적절한 라이브러리 크기 8.5x104를 제공한다. 이러한 라이브러리 크기가 제공된다면, 상기 유전자 코드 중에서 단일 뉴클레오타이드 돌연변이에 의해 접근이 가능한 모든 아미노산이 상기 라이브러리에서 잘 나타날 수 있을 것이다. 이러한 라이브러리가 효모의 형질전환에 이용되었고 효모 Aga2 단백질에 대한 융합물로서 세포 표면에 EGFR 돌연변이체가 디스플레이되도록 유도되었다. 또한, 라이브러리는 야생형 겉보기 해리 상수보다 적어도 1등급 더 높은 고 농도 mAb로 표지되어 야생형 결합과 친화성 소실이 서로 구별되었다. 또한, 세포를 병아리 항-c-myc IgY로 표지하여 EGFR 273-621 발현을 검출했다. 효모 표면에 디스플레이되지만 mAb에 대한 친화성 소실을 나타내는 돌연변이체를 분리했다(도 18A 및 18B). 상당히 부정폴딩된 돌연변이체가 확인되고 분비성 제어 장치(31;35)에 의해 유지되어, 이러한 돌연변이체의 세포 표면 c-myc 면역형광도가 유의적으로 감소된 결과가 나타날 것으로 생각된다. 집단수의 농축이 충분히 관찰된 후, 단일 EGFR 돌연변이체 클론을 서열분석하고 특성규명했다.
mAb806 에피토프의 동정
mAb806의 에피토프 지도제작을 위해 라이브러리를 분류 1에는 10nM 806을, 분류 2와 3에는 75nM 806을 사용하고, 분류 2와 3 후 각 클론을 서열분석했다. 서열분석된 100개의 클론 중에서 약 20%는 복수의 돌연변이를 포함하여 이후 분석에서 제외시켰다. mAb806에 대한 결합 소실에 따라 라이브러리로부터 분리된 단일 돌연변이체는 표 7의 왼쪽 컬럼에 제시했다. 돌연변이는 모두 종래 측정되었던 것처럼(34) 시스테인 287과 302 사이의 이황화 결합된 루프에 국한되어 있다. 하지만, mAb806 에피토프에 대한 잔기 수준의 분석과 추가 정보를 본 방법을 사용하여 수득했다. mAb806에 대한 결합이 소실된 돌연변이체는 75nM 806에서 야생형(도 18D)과 비교했을 때 완전하거나 부분적인 결합 소실(도 18B 및 18C)을 나타낸다. 돌연변이체를 75nM 806에서 결합 정도에 따라 점수를 매겨, ++는 야생형 결합을 나타내고, +는 부분 결합 소실, -는 완전한 결합 소실을 나타낸다(표 7, 왼쪽 컬럼). 미세 에피토프 지도제작 라이브러리로부터 수득된 결과를 확인하기 위하여 전체 루프 287-302에 대해 부위 지시성 돌연변이유발(SDM)을 통한 알라닌 스캐닝을 수행했다(표 7, 오른쪽 컬럼). 알라닌 스캐닝 시 결합이 소실된 모든 부위(287, 293, 298 및 302)는 라이브러리에서 분리된 돌연변이체들과 일치했다. 이에 반해, 알라닌 외 다른 잔기로의 치환 시에만 mAb 결합 소실을 나타내는 부위(D297Y, R300C, R300P 및 K301E)는 알라닌 스캐닝에 의해 확인할 수 없지만, mAb806 에피토프의 효과적으로 중요한 구성인자임이 분명하다. 평균 6 내지 7개 아미노산 치환은 단일 뉴클레오타이드 돌연변이유발에 의해 접근용이하므로, 알라닌 스캐닝에 비해 더 광범위한 물리화학적 다양성이 시험될 수 있다. 미변경된 c-myc 면역형광 표지 강도를 보유하지만 75nM에서 mAb806 표지화가 감소된 돌연변이체는 항체에 대한 친화성이 감소될 것으로 추정될 수 있다. 75nM에서의 mAb806 표지화와 특정 친화성 상수의 정량적 상관성을 찾기 위하여 3개의 EGFR 단편을 가지고 효모 표면에 대한 적정을 수행하여, 야생형 273-621(++), C287R(+) 및 E293K(-)에 대한 mAb806의 겉보기 해리 상수를 측정했다. 결과는 도 19에 제시했다. 효모 표면에 디스플레이된 야생형 273-621에 대한 mAb806의 해리 상수는 2.13nM(68% 신뢰 구간 1.83-2.50nM)로서, EGFR vIII을 발현하는 세포에 대한 mAb806 결합의 스캐챠드 분석시 관찰되는 친화성(19)과 일치했다. C287R 치환은 이러한 해리 상수를 127nM(68% 신뢰 구간 103-160nM)까지 상승시켜, 야생형과 비교했을 때 △△G 값이 +2.4kcal/mol 이었고, 알라닌 스캐닝 분석결과로 표현하면 중간 결합 소실(36)이었다. E293K 치환은 적어도 30mM의 Kd 값을 제공하며, 이것은 +5.7kcal/mol의 △△G에 상응하는 것으로서, 결합의 "열점"을 시사한다. 상기 △△G 값은 이러한 돌연변이의 비교적 효과적인 중요성을 입증하는 바, 75nM 806에서의 결합 등급(++, + 또는 -)을 기초로 하여 다른 돌연변이체들의 대략적인 효과적인 중요성을 판단하는데 사용할 수 있다.
Figure 112006068032313-PCT00018
mAb806 에피토프는 구속되어 있다
mAb806 결합에서 효과적으로 중요한 것으로 확인된 잔기는 도 20에 제시했다. 이러한 잔기들은 루프 287-302의 한 면에 운집해 있고, 이는 이 부위가 mAb806 에피토프임을 시사한다. 흥미롭게도, Val299는 이러한 잔기들의 중앙에 위치하지만 라이브러리 또는 알라닌 스캐에서 확인되지 않았다. 따라서, V299K 및 V299D 부위 지시성 돌연변이체를 제조했고, 이 에피토프가 아무 영향없이 리신 잔기를 수용할 수 있지만, 아스파르트산 치환은 검출가능한 결합성을 제거했다(표 7). 이 또한 mAb806이 루프 287-302의 이 면에 접촉할 가능성이 있음을 시사한다. mAb806은 가열 및 SDS 변성된 EGFR에도 결합하는 바(34), 선형 에피토프일 것이지만, 이 에피토프는 라이브러리 분석으로 확인되듯이 완전히 연속적인 서열이 아니다. 이는 Glu293의 측쇄가 루프의 한 면에서 다른 추정상의 접촉 면으로 돌출해 있음을 보여주는 루프 287-302의 구조 조사에서 설명되었다. mAb806 에피토프는 이황화 결합과 2개의 염 가교, Glu293-Arg300 및 Asp297-Lys301에 의해 구속되어 있다(도 20C). 이러한 구속에 관여하는 총 6개의 잔기는 mAb806에 대한 결합 소실 분석을 통해 라이브러리로부터 분리했고, 이는 에피토프의 구속 성질의 중요성을 강조했다. 위치 287에 존재하는 시스테인은 중간 결합 소실을 유도하는 다양한 치환을 허용하는데(표 7), 이는 에피토프에 대한 상기 잔기의 효과적인 기여가 항체 접촉보다는 루프 구속에 의해 유발될 수 있음을 시사한다. 하지만, 위치 302의 시스테인은 방향족 특성을 보유한 큰 잔기로의 치환만을 허용하기 때문에 접촉 잔기일 가능성이 더 크다. 자가억제된 EGFR 단량체 구조의 상황에서 mAb806 에피토프는 도 20D에 제시했다. 이러한 입체형태에서 항체 결합 부위는 에피토프로부터 부분적으로 차단되어 있을 수 있고, 이는 mAb806이 용해성 EGFR에는 결합하지 않지만 자가억제된 입체형태에서 동요된 "미테터링된" EGFR 돌연변이체(34)에는 결합한다는 관찰과 일치하는 결과이다.
토론
본 연구는 효모 세포 표면에 디스플레이된 랜덤하게 돌연변이된 항원을 선별하는 방법을 이용한 새로운 미세 에피토프 지도제작 방법에 관한 것이다. 이 방법은 잠재적인 접촉 잔기를 사전에 알 필요 없이 복잡한 진핵생물 단백질에 대한 항체 결합의 비선형 에피토프를 동정할 수 있다. 이 방법은 펩타이드 에피토프 지도제작 방법 및 알라닌 스캐닝에 비해 몇 가지 장점이 있다. 효모 표면 디스플레이 기재(platform)는 각 돌연변이체를 용해화 발현 및 정제할 필요 없이 단백질 발현을 촉진시킨다. 돌연변이체 특성규명 및 적정도 효모 표면에서 효과적으로 수행된다. 이 방법은 mAb806에 대한 에피토프가 3차 구조에 의존적인 것이 아니어서 완전하게 동정할 수 있었다. 이 때문에, mAb806에 대한 결합 소실 분석을 위하여 라이브러로부터 분리한 모든 단일 돌연변이는 그럴듯한 단일 항체 접촉 면에 국한되어 존재했다.
이러한 에피토프 지도제작법을 이용할 때, mAb806에 대한 에피토프는 접촉 잔기들로서 작용하는 Asp297-Cys302, Glu293 및 아마도 Cys287을 보유한, 구속된 이황화 루프 287-302의 한 면에 국한되어 존재했다. 이러한 구조적 모티프는 시스틴 올가미(cystine noose)로서 종래 기술된, 결합 특이성에 중요한 이황화 구속되고 표면 노출된 루프(37)이다. 시스틴 올가미는 또한 소 호흡기 세포융합 바이러스 및 홍역 바이러스 헤마글루티닌 단백질을 비롯한 각종 단백질에서 주요 항원 에피토프로서 동정된 바 있다(38;39). 이것은 이황화 구속된 루프가 유리한 항원 구조이며, 이미 구속되어 있기 때문에 항체 결합 시 더 적은 엔트로피가 사용된다는 것을 암시한다. 즉, EGFR에 존재하는 많은 다른 이황화 루프들도 항체 결합의 잠재적인 에피토프 표적이다. mAb806은 도메인 II 이량체화 아암이 결실된 세포에서 EGFR에 대해 증가된 결합성을 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서, mAb806은 자가억제된 입체형태에서 확장된 단량체 입체형태로 변화할 때 수용체의 전이성 형태에 결합하는 것으로 가정되었다(앞의 실시예 및 (34) 참조). mAb806 결합 시 EGFR 단량체는 더 이상 이량체화하여 수용체를 활성화시킬 수 없었고, 이것이 항종양 활성을 나타내는 것으로 생각된다. 여기에 제시된 mAb806 에피토프는 본 가설과 일치했다. 이 에피토프는 자가억제된 단량체 구조에만 부분적으로 접근용이한데, 잔기 Glu293과 Cys302는 인접 도메인 II 잔기들로 인해 불명료했다(도 19D). 이들 잔기들은 전이성 입체형태에 노출되기 시작하면 mAb806이 결합되었다. 하나의 EGFR 단량체의 mAb806 에피토프는 EGFR 이량체 구조 중의 다른 단량체에 인접하며, 이러한 에피토프에 대한 항체 결합은 EGFR 이량체화를 입체적으로 방해할 수 있다.
재료 및 방법
에피토프 지도제작 라이브러리의 작제 및 발현
이러한 에피토프 지도제작 라이브러리는 저 돌연변이유발율을 제공하기 위해 Stratagene GeneMorph® 랜덤 돌연변이유발 키트를 사용하여 제작했다. 라이브러리 제작에 사용한 주형은 이황화 불일치쌍형성(mispairing)을 방지하기 위해 C283A 돌연변이시킨 EGFR 단편 273-621을 효모 디스플레이를 위해 삽입시킨 pCT302 주쇄이다(27). PCR 산물은 겔 정제하고 Quiagen Qiaquick 겔 추출 키트를 사용하여 추출했다. 라이브러리를 이용하여 Bio-Rad(Richmond, CA) 유전자 펄서 형질감염 장치를 통해 전기침투(40) 및 상동성 재조합(41)으로 사카로마이세스 세레비지에 균주 EBY100(28)을 형질전환시켰다. 최종 라이브러리는 Zymoprep™(Zymo Research)을 이용한 플라스미드 회수와 100개의 라이브러리 클론의 서열분석(MIT Biopolymers Laboratory)을 통해 입증되듯이 EGFR 단편에 대략 푸아송 분포의 아미노산 변화를 함유했다. 라이브러리의 성장 및 발현은 효모 표면 디스플레이를 이용하여 종래 기술된 바와 같이 수행했다(28).
라이브러리 표지화 및 분류
항사람 EGFR 마우스 모노클로날 항체 806은 루드빅 암 연구소에서 아낌없이 제공받았다. 항-c-myc 병아리 IgY 분획은 몰리큘르 프로브스(Eugene, OR)에서 구입했다. 적당한 수의 효모 세포(적어도 10x 라이브러리 크기)는 FACS 완충액(인산염 완충성 식염수, 1mg/ml 소 혈청 알부민 함유)으로 세척했다. 세포를 4㎍/ml 항-c-myc 병아리 IgY 및 적당한 농도의 mAb와 25℃에서 30분 동안 항온배양했다. 그 다음, 세포를 FACS 완충액으로 세척하고, 1:25 희석율의 피코에리트린 표지된 염소 항마우스 IgG(Sigma) 및 1:100 희석율의 Alexa Fluor® 488 염소 항병아리 IgG(Molecular Probes)과 4℃에서 30분 동안 항온배양했다. 표지된 세포를 세정하고, 세포 라이브러리는 MIT 유동세포측정 핵심실에서 MoFlo FACS 기기를 이용하여 분류했다.
단일 클론의 동정 및 검사
분류된 라이브러리 집단 유래의 플라스미드는 Zymoprep™을 사용하여 회수하고, MIT Biopolymers Laboratory에서 서열분석했다. 부위 지시성 돌연변이체는 QuickChange® 부위 지시성 돌연변여유발(Stratagene)을 사용하여 제조했다. 단일 클론을 EZ Yeast Transformation(Zymo Research)을 사용하여 효모 형질전환에 이용하고 최소 배지(효모 질소원, 카제인 가수분해물, 덱스트로스 및 인산염 완충액 pH 7.4)에서 하룻밤 동안 증식시켰다. 효모 표면 단백질 발현은 갈락토스를 함유한 최소 배지로 옮긴 다음 하룻밤 동안 항온배양하여 유도했다. 각 클론마다, 1x106 세포를 앞에서와 같이 항-c-myc 병아리 IgY, 적당한 mAb 및 2차 형광성 항체로 표지했다. 형광도 결과는 Coulter Epics XL 유동세포측정기(Beckman-Coulter)를 사용하여 수득하고 DakoCytomation Summit™ 소프트웨어로 분석했다.
mAb806에 대한 EGFR 단편의 적정
세포를 앞에서와 같이 증식시키고 유도했다. 1x106 세포를 적당한 농도의 mAb806, 항-c-myc 병아리 IgY 및 2차 형광성 항체를 사용하여 전술한 바와 같이 표지시켰다. c-myc 양성 효모의 형광도 결과는 Coulter Epics XL 유동세포측정기로 수득하고 최대 및 최소 평균 형광 강도로 표준화했다. 결합 상호작용은 리간드 소모 없는 단일 부위 결합 모델인 것으로 추정되었다. 적정 결과는 다음 수학식에 적용했다.
Figure 112006068032313-PCT00019
여기서, fmAb는 효모 표면에 디스플레이된 EGFR 273-621에 대한 mAb806의 결합 비율이고, [mAb]는 mAb806의 농도이고 Kd는 겉보기 해리 상수이다. 이러한 결과 세트들의 전체 적용은 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 수행했고, 68% 신뢰 구간은 (42)에 따라 계산했다.
단백질 이미지 및 표면적 계산
모든 EGFR 단백질 이미지는 PyMOL 소프트웨어(DeLano Scientific LLC, pymol.org)를 사용하여 제조했다. EGFR(PDB ID 1NQL) 각 잔기의 용매 접근가능한 표면적은 Getarea 1.1(Sealy Center for Structural Biology, University of Texas Medical Branch, at scsb.utmb.edu/cgi-bin/get_a_form.tcl)을 사용하여 계산했다. 표면에 존재하는 것으로 EGF 접촉 잔기를 정확하게 동정하기 위하여 1.0의 수 프로브 크기를 사용했다. 값이 20 또는 그 이상인 잔기가 표면 잔기인 것으로 간주되었다.
참고 문헌
Figure 112006068032313-PCT00020
Figure 112006068032313-PCT00021
Figure 112006068032313-PCT00022
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본 발명은 본 발명의 취지 또는 필수 특징들 안에서 다른 형식 또는 다른 방식으로 구체화될 수 있다. 따라서, 본 명세서는 후속되는 청구의 범위에 제시된 본 발명의 범위를 모든 관점에서 제한하는 것이 아닌 설명하는 것으로 간주되어야 하며, 등가의 의미 및 범위에 속하는 모든 변화는 본 발명에 포함되는 것으로 생각한다. 본 명세서를 통해 인용된 다양한 참고 문헌들은 그 전문이 본원에 참고인용되 었다.
<110> LUDWIG INSTITUTE FOR CANCER RESEARCH <120> EGF Receptor Epitope Peptides and Uses Thereof <130> 2332-1-011PCT <150> US 60/546,602 <151> 2004-02-20 <150> US 60/584,623 <151> 2004-07-01 <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> epitope Artificial Sequence <220> <223> epitope peptide <400> 1 Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope peptide <400> 2 Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope peptide <400> 3 Cys Gly Pro Asp Tyr Tyr Glu Val Glu Glu Asp Gly Ile Arg Lys Cys 1 5 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope peptide <400> 4 Cys Asn Thr Asp Thr Tyr Glu Val Glu Glu Asn Gly Val Arg Lys Cys 1 5 10 15 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope peptide <400> 5 Cys Gly Pro Asp Ser Tyr Glu Val Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys 1 5 10 15 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope peptide <400> 6 Cys Ser Ser Asp Ser Tyr Glu Val Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys 1 5 10 15 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope peptide <400> 7 Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Ala Val Arg Lys Cys 1 5 10 15 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope peptide <400> 8 Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg 1 5 10 15 Cys <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope peptide <400> 9 Cys Pro Pro Asp Lys Met Glu Val Asp Lys Asn Gly Leu Lys Met Cys 1 5 10 15 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope peptide <400> 10 Cys Pro Ser Ser Lys Met Glu Val Glu Glu Asn Gly Ile Lys Met Cys 1 5 10 15 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope peptide <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = G, P, N or S <221> 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<222> 4 <223> Xaa = D, E, H, R, K, S or T <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = S, Y, F, W, T, N, Q, K or R <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = Y, F, W, Q, N, M, V, A, L, I or P <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa = M, V, A, L, I or P <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa = E, D, T or S <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa = A, V, L, I, P, M or none <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa = D, E, K or R <221> VARIANT <222> (11)...(11) <223> Xaa = D, E, N or Q <221> VARIANT <222> (12)...(12) <223> Xaa = G, A, M, V, L, I or P <221> VARIANT <222> (13)...(13) <223> Xaa = V, I, L, M, A, P, S or T <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa = R, K, H, Q or N <221> VARIANT <222> (15)...(15) <223> Xaa = R, K, H, M, A, V, L, I or P <221> VARIANT <222> (16)...(16) <223> C or none <400> 12 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope peptide <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = G or A <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = A or K <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = D or A <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = S or A <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = Y or A <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa = M or A <221> VARIANT <222> (9)...(10) <223> Xaa = E or A <221> VARIANT <222> (11)...(11) <223> Xaa = D or A <221> VARIANT <222> (13)...(13) <223> Xaa = V, A or K <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa = R or A <221> VARIANT <222> (15)...(15) <223> Xaa = K or A <400> 13 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope peptide <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = G or A <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = A or K <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = D or A <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = S or A <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = Y or A <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa = M or A <221> VARIANT <222> (9)...(10) <223> Xaa = E or A <400> 14 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Asp Gly Val Arg Lys Cys 1 5 10 15 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope peptide <400> 15 Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly 1 5 10 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope peptide <400> 16 Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met 1 5 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope peptide <400> 17 Glu Glu Gly Val Arg Lys Cys 1 5

Claims (39)

  1. 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나의 아미노산 서열을 함유하는 분리된 수용체 폴리펩타이드 및 이의 면역원성 단편.
  2. 아미노산 서열 CGADSYEMEEDGVRKC (서열번호 1)를 갖는 분리된 펩타이드.
  3. 아미노산 서열 CGADSYEMEEDGVRK (서열번호 2)를 갖는 분리된 펩타이드.
  4. 아미노산 서열 CGPDYYEVEEDGIRKC (서열번호 3)를 갖는 분리된 펩타이드.
  5. 아미노산 서열 CNTDTYEVEENGVRKC (서열번호 4)를 갖는 분리된 펩타이드.
  6. 아미노산 서열 CGPDSYEVEEDGVRKC (서열번호 5)를 갖는 분리된 펩타이드.
  7. 아미노산 서열 CSSDSYEVEEDGVRKC (서열번호 6)를 갖는 분리된 펩타이드.
  8. 아미노산 서열 CGADSYEMEEDAVRKC (서열번호 7)를 갖는 분리된 펩타이드.
  9. 아미노산 서열 CPLHNQEVTAEDGTQRC (서열번호 8)를 갖는 분리된 펩타이드.
  10. 아미노산 서열 CPPDKMEVDKNGLKMC (서열번호 9)를 갖는 분리된 펩타이드.
  11. 아미노산 서열 CPSSKMEVEENGIKMC (서열번호 10)를 갖는 분리된 펩타이드.
  12. 하기 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 분리된 펩타이드.
    CX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15
    [여기서,
    X1은 G, P, N 또는 S;
    X2는 A, P, T, S 또는 L;
    X3은 D, H 또는 S;
    X4는 S, Y, T, N 또는 K;
    X5는 Y, Q 또는 M;
    X6은 M 또는 V;
    X7은 E, T 또는 D;
    X8은 A 또는 결실;
    X9는 E 또는 K;
    X10은 D 또는 N;
    X11은 G 또는 A;
    X12는 V, I, L 또는 T;
    X13은 R, Q 또는 K;
    X14는 R, K 또는 M;
    X15는 C 또는 결실이다]
  13. 하기 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 분리된 펩타이드.
    CX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15
    [여기서,
    X1은 G, P, N, Q, S 또는 T;
    X2는 A, P, T, S, L, M, V, I 또는 P;
    X3은 D, E, H, R, K, S 또는 T;
    X4는 S, Y, F, W, T, N, Q, K 또는 R;
    X5는 Y, F, W, Q, N, M, V, A, L, I 또는 P;
    X6은 M, V, A, L, I 또는 P;
    X7은 E, D, T 또는 S;
    X8은 A, V, L, I, P, M 또는 결실;
    X9는 D, E, K 또는 R;
    X10은 D, E, N 또는 Q;
    X11은 G, A, M, V, L, I 또는 P;
    X12는 V, I, L, M, A, P, S 또는 T;
    X13은 R, K, H, Q 또는 N;
    X14는 R, K, H, M, A, V, L, I 또는 P;
    X15는 C 또는 결실이다]
  14. 하기 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 분리된 펩타이드.
    CX1X2X3X4X5EX6X7X8X9GX10X11X12C
    [여기서, X1은 G 또는 A;
    X2는 A 또는 K;
    X3은 D 또는 A;
    X4는 S 또는 A;
    X5는 Y 또는 A;
    X6은 M 또는 A;
    X7은 E 또는 A;
    X8은 E 또는 A;
    X9는 D 또는 A;
    X10은 V, A 또는 K;
    X11은 R 또는 A;
    X12는 K 또는 A이다]
  15. 하기 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 분리된 펩타이드.
    CX1X2X3X4X5EX6X7X8DGVRKC
    [여기서, X1은 G 또는 A;
    X2는 A 또는 K;
    X3은 D 또는 A;
    X4는 S 또는 A;
    X5는 Y 또는 A;
    X6은 M 또는 A;
    X7은 E 또는 A;
    X8은 E 또는 A이다]
  16. 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나의 펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산.
  17. 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나의 면역원성 수용체 펩타이드 또는 이의 면역원성 단편.
  18. 성장 인자 수용체 에피토프 펩타이드 또는 이의 면역원성 단편을 투여하여, 비정상 또는 과잉발현된 성장 인자 수용체를 발현하는 세포에서는 노출되어 있으나 야생형 세포에서는 노출되어 있지 않은 에피토프 펩타이드와 면역반응성인 항체를 생성시키는 것을 포함하는, 포유동물의 면역화 방법.
  19. 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나의 EGF 수용체 펩타이드 또는 이의 면역원성 단편을 투여하여, 비정상 또는 과잉발현된 EGFR을 발현하는 세포에서는 노출되어 있으나 야생형 세포에서는 노출되어 있지 않은 에피토프 펩타이드와 면역반응성인 항체를 생성시키는 것을 포함하는, 포유동물의 면역화 방법.
  20. 서열번호 1 내지 14 중 하나 이상의 EGFR 펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 보강제(adjuvant)를 함유하는 백신.
  21. 서열번호 1 내지 14 중 하나 이상의 EGFR 펩타이드와 약제학적으로 허용되는 보강제를 함유하는 면역원성 조성물.
  22. 서열번호 1 내지 14 중 하나 이상의 EGF 계열 수용체 펩타이드와 약제학적으로 허용되는 보강제 및 추가로 하나 이상의 다른 종양 항원을 함유하는 항종양 또는 항암 백신.
  23. 제22항에 있어서, 종양 항원이 EGF 또는 EGFR 항원인 것이 특징인 백신.
  24. 서열번호 1 내지 14 중 하나 이상의 EGF 계열 수용체 펩타이드 또는 이의 면역원성 단편의 면역원성 양과 약제학적으로 허용되는 보강제를 함유하는, 두경부암, 유방암 또는 전립선암 및 신경아교종을 앓고 있는 포유동물 검체 치료용 백신.
  25. 제24항에 있어서, 펩타이드가 담체에 접합되어 있는 백신.
  26. 서열번호 1 내지 14 중 하나 이상의 펩타이드 중에서 선택되는 EGF 계열 수용체 펩타이드와 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물.
  27. 서열번호 1 내지 14 중 하나 이상의 펩타이드와 면역반응성인 EGF 계열 수용체 펩타이드 항체와 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물.
  28. 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나의 EGF 계열 수용체 펩타이드에 대한 정제된 항체.
  29. 제28항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
  30. 제28항에 있어서, 검출성 표지로 표지된 항체.
  31. 제28항에 있어서, 치료 목적 또는 진단 목적의 하나 이상의 다른 분자 또는 제제에 공유 결합되거나 다른 방식으로 연합되어 있는 항체.
  32. 제31항에 있어서, 다른 분자 또는 제제가 다른 특징을 갖는 다른 항체 또는 항체 단편, 독소, 리간드, 방사선 동위원소 및 화학치료제 중에서 선택되는 항체.
  33. 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나의 EGF 수용체 펩타이드 또는 이의 단편으로 동물을 면역화하는 단계 및 펩타이드 결합 항체를 분리하는 단계를 포함하여, 비정상 또는 과잉발현된 EGFR을 발현하는 세포에서는 노출되지만 야생형 세포에서 는 노출되지 않는 에피토프와 면역반응성인 항체의 제조방법.
  34. 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나의 EGF 수용체 펩타이드 또는 이의 단편으로 후보 항체, 또는 항체 또는 활성 항체 단편을 발현하는 세포를 선별하는 단계를 포함하여, 비정상 또는 과잉발현된 EGFR을 발현하는 세포에서는 노출되지만 야생형 세포에서는 노출되지 않는 에피토프와 면역반응성인 항체의 선별 방법.
  35. 면역원성 EGF 계열 수용체 펩타이드, 특히 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나의 펩타이드를 암호화하는 핵산을 함유한 핵산 백신 또는 DNA 백신.
  36. 제35항에 있어서, 종양 항원 또는 면역조절 분자 펩타이드를 암호화하는 핵산을 추가로 함유하는 백신.
  37. 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나의 EGF 수용체 에피토프 펩타이드의 존재 또는 노출을 검출하여 두경부암, 유방암, 또는 전립선 종양 및 신경아교종을 비롯한 종양 및 암을 측정하고 모니터하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, EGF 수용체 에피토프 펩타이드가
    a. 하기 항체와 하기 펩타이드가 결합되는 조건하에서, 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나의 EGF 수용체 에피토프 펩타이드의 존재 또는 노출이 의심되는 시료 를 상기 EGF 수용체 펩타이드에 대한 항체와 접촉시키는 단계; 및
    b. 시료 유래의 EGF 수용체 에피토프 펩타이드와 항체 사이에 결합의 발생 여부를 검출하는 단계
    에 의해 측정되고, 결합의 검출이 시료 중에 EGF 수용체 에피토프 펩타이드의 존재 또는 노출을 지시하는 것인, 방법.
  39. 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나의 EGF 수용체 에피토프 펩타이드와 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물의 일정량을 검체에게 투여하여 면역 반응을 유도하는 것을 포함하여, 두경부암, 유방암, 폐암, 난소암, 방광암, 후두암, 편평세포 암종 또는 전립선 종양 및 신경아교종을 비롯한 종양 또는 암이 있는 검체의 면역 반응을 유도하는 방법.
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