KR20070030827A - 마이크로제조된 통합된 ｄｎａ 분석시스템 - Google Patents

마이크로제조된 통합된 ｄｎａ 분석시스템 Download PDF

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KR20070030827A
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리차드 에이. 매티스
로버츠 블라제즈
충 리우
팔라니 쿠마레산
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Abstract

게놈 분석을 위한 방법과 기구가 제시된다. 미세유체 분산 채널(microfluidic distribution channel)을 보유하는 마이크로제조된 구조물(microfabricated structure)은 염기서열분석 주형(sequencing template)의 사본을 보유하는 마이크로반응기 요소(microreactor element)를 복수의 마이크로제조된 열 사이클링 챔버(microfabricated thermal cycling chamber)로 분산시키도록 배치된다. 마이크로반응기 요소에는 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로캐리어 요소(microcarrier system)가 포함된다. 마이크로캐리어 요소는 마이크로스피어를 포함할 수 있다. 하나의 마이크로스피어가 하나의 열 사이클링 챔버로 유동하도록 담보하기 위하여 열 사이클링 챔버의 출구 포트(exit port)에서 자동밸브(autovalve), 광 스캐너(optical scanner), 또는 시간 장치(timing arrangement)가 이용될 수 있는데, 여기서 열 사이클링 신장 단편(thermal cycling extension fragment)이 생산된다. 이들 신장 산물은 통합된 올리고뉴클레오티드 겔 포획 챔버(integrated oligonucleotide gel capture chamber)에서 포획되고 정제되며 농축된다. 마이크로제조된 성분 분리 기구(microfabricated component separation apparatus)를 이용하여 정제된 신장 단편을 분석한다. 마이크로제조된 구조물은 염기서열분석 및 DNA 또는 RNA의 다른 유전자 분석을 수행하기 위한 공정에 이용될 수 있다.
마이크로제조된 구조물(microfabricated structure)

Description

마이크로제조된 통합된 ＤＮＡ 분석시스템{MICROFABRICATED INTEGRATED DNA ANALYSIS SYSTEM}
관련된 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 "MICROBEAD INTEGRATED DNA ANALYSIS SYSTEM (MINDS)"의 명칭으로 2004년 6월 1일자로 제출된 U.S. 가출원 제 60/576,102호(Atty. Docket No. UCALP054P)로부터, 35 U.S.C. l19(e) 하에 우선권을 주장한다.
정부 후원을 받은 연구에 관한 진술
본 발명의 기술과 기계 장치는 NIH Grant No. HG001399, PO1 CA77664, UOlAI056472 하에, 정부 지원을 받아 만들어졌다.
본 발명은 마이크로제조된 구조물과 미세유체 구조물에 관계한다. 한 실례에서, 본 발명은 게놈 염기서열분석을 위한 마이크로제조된 시스템과 방법에 관계한다.
생물체의 게놈은 DNA(디옥시리보핵산), 또는 일부 바이러스의 경우에 RNA(리보핵산)에 의해 정의된다. 게놈 염기서열분석은 DNA 또는 RNA 가닥의 뉴클레오티드 또는 염기의 순서를 파악한다.
DNA의 게놈-규모 염기서열분석(genome-scale sequencing)을 위한 현재의 접 근법은 도 1에 도시한다. 이런 Shotgun 염기서열분석(Shotgun sequencing) 접근법(100)은 개별 게놈 DNA 단편을 조작하기 위하여, 박테리아 형질전환(bacterial transformation), 선별(selection), 성장을 이용한다. 이런 접근법의 초기 3 단계, 전단(shearing), 벡터 결찰(vector ligation), 형질전환(transformation)(단계 102, 104, 106)은 1회 수행만을 요한다. 따라서, 이들은 별다른 문제점을 유발하지 않는다. 마지막 단계, 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)(CE)(단계 114)은 마이크로제조(microfabrication)를 통하여 소형화되고 있다. 이는 상기 단계와 연관된 비용과 처리 시간을 감소시켰다. 하지만, 도말과 성장(단계 108) 및 채집, 성장, 추출 단계(단계 110)는 문제가 있다. Sanger 신장 단계(단계 112)를 선행하는 이들 단계는 클론 분리(clone isolation)와 삽입체 증폭(insert amplification)을 수행한다. 증폭은 박테리아, PCR(중합효소 연쇄 반응) 또는 RCA(롤링 서클 증폭, rolling circle amplification)일 수 있다. 이들 단계는 소형화(miniaturization)와 통합(integration)이 여전히 어렵다. 따라서, 현재의 현미경적 전범(macroscopic paradigm)은 이들 핵심 단계를 위한 가능 기술로서 로봇공학(robotics)에 의존해왔다. 하지만, 게놈에 대한 염기서열분석 주형을 산출하기 위하여 대략 3천만 개의 콜로니를 선택하고 성장시켜야 하기 때문에, 이는 해결해야 할 과제이다. 더 나아가, 이런 로봇공학 기술로 제조된 물질의 최소량은 현대의 마이크로제조된 CE 분석 시스템에 의해 요구되는 것보다 높은 크기 자리수(order of magnitude)이다.
이런 이유로, 게놈 염기서열분석의 처리 시간(processing time), 크기 규 모(volume scale), 통합 수준을 개선하는 것이 요구된다. 또한, 게놈 염기서열분석의 비용과 공간 요건을 감소시키는 것이 요구된다.
요약
한 측면에서, 본 발명은 클론 염기서열분석 주형(clonal sequencing template)의 복수 사본을 내포하는 마이크로반응기 요소(microreactor element)를 복수의 열 사이클링 챔버(thermal cycling chamber)에 분산시키는 분산 채널(distribution channel)을 보유하는 마이크로제조된 구조물에 관계한다. 단지 하나의 마이크로반응기 요소가 하나의 열 사이클링 챔버를 통과하고, 여기서 열 사이클링 신장 단편(thermal cycling extension fragment)이 마이크로반응기 요소로부터 생산된다. 이들 신장 단편을 포획하고 농축하기 위하여, 열 사이클링 챔버에 정제 챔버(purification chamber)가 연결된다. 이들 신장 단편을 분석하기 위하여, 정제 챔버에 성분 분리 채널(component separation channel)이 연결된다.
본 발명의 다양한 실시는 아래의 특징 중에서 한가지이상을 보유할 수 있다. 마이크로반응기 요소에는 클론 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로캐리어 요소(microcarrier element)가 포함된다. 상기 마이크로반응기 요소는 거환(bolus) 또는 마이크로에멀젼 액적(microemulsion droplet)이다. 마이크로반응기 요소에는 클론 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로스피어(microsphere)가 포함된다. 염기서열분석 주형은 DNA 또는 RNA 염기서열분석 주형이다.
다른 측면에서, 본 발명은 염기서열분석을 수행하기 위한 시스템에 관계한 다. 상기 시스템은 DNA 또는 RNA를 단편으로 전단하기 위한 수단 및 이들 단편을 결찰시켜 원하는 원형 산물(circular product)과 오염 선형 산물(linear product)의 혼합물을 형성하기 위한 수단을 보유한다. 상기 시스템은 오염 선형 산물을 선택적으로 제거하기 위한 수단 및 단일 염기서열분석 주형의 복수 클론 사본을 내포하는 마이크로반응기 요소를 생산하기 위한 수단을 추가로 보유한다. 상기 시스템은 또한, 어떤 마이크로반응기 요소가 염기서열분석 주형을 보유하는 지를 선택하기 위한 수단 및 염기서열분석 주형을 보유하는 선택된 마이크로반응기 요소를 열 사이클링 챔버로 분산시키기 위한 미세유체 분산 수단(microfluidic distribution means)을 보유한다. 부가적으로, 상기 시스템은 단지 하나의 마이크로반응기 요소가 하나의 열 사이클링 챔버로 유동하도록 담보하기 위한 수단 및 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로반응기 요소로부터 열 사이클링 신장 단편을 생산하기 위한, 열 사이클링 챔버를 비롯한 신장 수단(extension means)을 보유한다. 신장 단편을 포획하고 정제하며 농축하기 위한 정제 챔버 수단(purification chamber means) 및 신장 단편을 분석하기 위한 성분 분리 수단(component separation means) 역시 상기 시스템의 일부분이다.
본 발명의 다른 실시는 아래의 특징 중에서 한가지이상을 보유할 수 있다. 마이크로반응기 요소에는 클론 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로캐리어 요소가 포함된다. 상기 마이크로반응기 요소는 거환 또는 마이크로에멀젼 액적이다. 마이크로반응기 요소에는 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로스피어가 포함된다.
다른 측면에서, 본 발명은 클론 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로스피어를 복수의 열 사이클링 챔버에 분산시키는 분산 채널(distribution channel)을 보유하는 마이크로제조된 구조물에 관계한다. 단지 하나의 마이크로스피어가 하나의 열 사이클링 챔버(thermal cycling chamber)로 유동하도록 담보하기 위하여 열 사이클링 챔버의 출구 포트(exit port)에 자동밸브(autovalve)가 배치되고, 여기서 열 사이클링 신장 단편이 마이크로스피어로부터 생산된다. 이들 신장 단편을 포획하고 농축하기 위하여 열 사이클링 챔버에 정제 챔버가 연결된다. 이들 신장 단편을 분석하기 위하여 정제 챔버에 성분 분리 채널이 연결된다.
본 발명의 다양한 실시는 아래의 특징 중에서 한가지이상을 보유할 수 있다.
마이크로스피어의 직경은 대략 1 내지 100 마이크론이다. 마이크로스피어의 직경은 대략 10 마이크론이다. 각 열 사이클링 챔버는 분리 채널과 유체 소통(fluid communication)한다. 염기서열분석 주형은 DNA 또는 RNA 염기서열분석 주형이다.
다른 측면에서, 본 발명은 염기서열분석 주형을 내포하는 마이크로스피어를 열 사이클링 챔버에 분산시키기 위한 미세유체 분산 채널 수단을 보유하는 마이크로제조된 구조물에 관계한다. 단지 하나의 마이크로스피어가 하나의 열 사이클링 챔버(thermal cycling chamber)로 유동하도록 담보하기 위한 자동밸브 수단이 이용된다. 열 사이클링 챔버를 비롯한 신장 수단은 염기서열분석 주형을 내포하는 마이크로스피어로부터 열 사이클링 신장 단편을 생산한다. 이들 신장 단편을 포획하고 정제하며 농축하기 위하여, 통합된 정제 챔버 수단이 이용된다. 이들 신장 단편을 분석하기 위하여 성분 분리 수단이 이용된다.
본 발명의 다른 실시는 아래의 특징 중에서 한가지이상을 보유할 수 있다. 신장 수단은 복수의 열 사이클링 챔버를 보유하는 Sanger 신장 수단이다. 자동밸브 수단에는 열 사이클링 챔버의 출구 포트(exit port)에서 자동밸브가 포함된다. 정제 챔버 수단에는 열 사이클링 챔버에 연결된 정제 챔버가 포함된다. 성분 분리 수단은 정제 챔버에 연결된 복수의 마이크로채널을 보유하는 모세관 집적형 전기영동 수단(capillary array electrophoresis means)이다. 염기서열분석 주형은 DNA 또는 RNA 염기서열분석 주형이다.
다른 측면에서, 본 발명은 열 사이클링 챔버를 포함하는 마이크로제조된 기구(microfabricated apparatus)에 관계한다. 상기 열 사이클링 챔버는 클론 주형(clonal template)을 내포하는 마이크로스피어를 수용하도록 배치된다. 상기 챔버는 입구 포트(inlet port)와 출구 포트(outlet port)를 보유하고, 상기 출구 포트는 챔버에서 마이크로스피어를 트랩(trap)하고 열 사이클링 챔버로의 추가적인 유동을 실질적으로 차단하도록 배치된 조임 장치(constriction)를 보유한다.
본 발명의 다양한 실시는 아래의 특징 중에서 한가지이상을 보유할 수 있다. 조임 장치의 모양은 실질적으로 원형 또는 반원형이다. 첫 번째 밸브는 입구 포트와 유체 소통하는 입구 채널(inlet channel)에 배치되고, 두 번째 밸브는 출구 포트와 유체 소통하는 출구 채널(outlet channel)에 배치된다. 작동 중에, 두 번째 밸브는 열 사이클링에 앞서, 마이크로스피어를 조임 장치 외부와 열 사이클링 챔버의 주요 본체 부분으로 순차적으로 이동시키기 위하여 첫 번째 밸브에 앞서 닫힌 다. 정제 챔버는 열 사이클링 챔버의 출구 포트와 유체 소통하고, 정제 챔버의 출구 포트는 성분 분리 기구(component separation apparatus)와 유체 소통한다.
다른 측면에서, 본 발명은 염기서열분석을 수행하기 위한 시스템에 관계한다. 상기 시스템은 DNA 또는 RNA를 단편으로 전단하기 위한 수단 및 이들 단편을 결찰시켜 원하는 원형 산물과 오염 선형 산물의 혼합물을 형성하기 위한 수단을 보유한다. 상기 시스템은 오염 선형 산물을 선택적으로 제거하기 위한 수단 및 단일 염기서열분석 주형의 복수 클론 사본을 내포하는 마이크로스피어를 산출하기 위한 수단을 추가로 보유한다. 상기 시스템은 또한, 어떤 마이크로스피어가 염기서열분석 주형을 보유하는 지를 선택하기 위한 수단 및 염기서열분석 주형을 보유하는 선택된 마이크로스피어를 열 사이클링 챔버에 분산시키기 위한 미세유체 분산 채널 수단을 보유한다. 부가적으로, 상기 시스템은 통계학적으로, 하나의 마이크로스피어가 하나의 열 사이클링 챔버로 유동하도록 담보하기 위한 수단을 보유한다. 상기 시스템은 또한, 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로스피어로부터 열 사이클링 신장 단편을 생산하기 위한, 열 사이클링 챔버를 비롯한 신장 수단을 보유한다. 신장 단편을 포획하고 정제하며 농축하기 위한 정제 챔버 수단 및 신장 단편을 분석하기 위한 성분 분리 수단 역시 상기 시스템의 일부분이다.
본 발명의 다른 실시는 아래의 특징 중에서 한가지이상을 보유할 수 있다. 담보 수단(ensuring means)은 열 사이클링 챔버에서 자동밸브(autivalve), 광 검출기(optical detector), 시간 장치(timing mechanism) 중에서 적어도 하나이다. 광 검출기는 마이크로스피어로부터 산란된 광을 검출하는 광 스캐너(optical scanner) 이다. 시간 장치에는 열 사이클링 챔버의 입구에 인접하여 배치된 공기 입력기(pneumatic input)가 포함된다.
다른 측면에서, 본 발명은 DNA 염기서열분석을 수행하기 위한 시스템에 관계한다. 상기 시스템은 DNA를 DNA 단편으로 전단하기 위한 수단 및 DNA 단편을 결찰시켜 원하는 원형 산물과 오염 선형 산물의 혼합물을 형성하기 위한 수단을 수반한다. 상기 시스템은 또한, 오염 선형 산물을 선택적으로 제거하기 위한 엑소뉴클레아제 분해 수단 및 단일 DNA 염기서열분석 주형의 복수 클론 사본을 내포하는 마이크로스피어를 산출하기 위한 에멀젼 PCR 반응 수단을 보유한다. 부가적으로, 상기 시스템은 어떤 마이크로스피어가 DNA 염기서열분석 주형을 보유하는 지를 선택하기 위한 형광 활성화 세포 분류(fluorescent activated cell sorting, FACS) 수단을 보유한다. DNA 염기서열분석 주형을 보유하는 선택된 마이크로스피어를 열 사이클링 챔버에 분산시키기 위하여 미세유체 분산 채널 수단이 이용된다. 통계학적으로, 하나의 마이크로스피어가 하나의 열 사이클링 챔버로 유동하도록 담보하기 위하여 자동밸브 수단이 이용된다. DNA 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로스피어로부터 열 사이클링 신장 단편을 생산하기 위하여 열 사이클링 챔버를 비롯한 Sanger 신장 수단이 이용된다. 이들 신장 단편을 포획하고 정제하며 농축하기 위하여 통합된 정제 챔버 수단이 이용되고, 이들 신장 단편을 분석하기 위하여 모세관 집적형 전기영동 수단이 이용된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 염기서열분석을 수행하는 방법에 관계한다. 상기 방법은 DNA 또는 RNA를 단편으로 전단하고; 이들 단편을 결찰시켜 원하는 원형 산물과 오염 선형 산물의 혼합물을 형성하고; 오염 선형 산물을 선택적으로 제거하는 단계를 포함한다. 상기 방법에는 염기서열분석 주형의 복수 클론 사본을 내포하는 마이크로반응기 요소를 산출하고; 어떤 마이크로반응기 요소가 염기서열분석 주형을 보유하는 지를 선택하고; 염기서열분석 주형을 보유하는 선택된 마이크로반응기 요소를 열 사이클링 챔버에 분산시키는 단계를 포함한다. 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로반응기 요소로부터 열 사이클링 신장 단편이 생산된다. 이들 신장 단편을 포획되고 농축되며 분석된다.
본 발명의 다양한 실시는 아래의 특징 중에서 한가지이상을 보유할 수 있다. 마이크로반응기 요소에는 클론 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로캐리어 요소가 포함된다. 상기 마이크로반응기 요소는 거환 또는 마이크로에멀젼 액적이다. 마이크로반응기 요소에는 클론 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로스피어가 포함된다. 분산 단계(distributing step)는 하나의 마이크로반응기 요소가 하나의 열 사이클링 챔버를 통과하도록 수행된다. 하나의 마이크로반응기 요소가 하나의 열 사이클링 챔버로 유동하도록 담보하기 위하여 열 사이클링 챔버의 출구 포트에서 자동밸브가 이용된다. 산출 단계(generating step)는 에멀젼 PCR 반응 또는 유통(flow through) PCR 과정으로 염기서열분석 주형의 복수 클론 사본을 생산하는 과정을 포함한다. 선택 단계(selecting step)는 형광 활성 세포 분류(FACS)이다.
다른 측면에서, 본 발명은 DNA 염기서열분석을 수행하는 방법에 관계한다. 상기 방법은 DNA를 DNA 단편으로 전단하고; DNA 단편을 결찰시켜 원하는 원형 산물 과 오염 선형 산물의 혼합물을 형성하고; 엑소뉴클레아제 분해로 오염 선형 산물을 선택적으로 제거하는 단계를 포함한다. 에멀젼 PCR 반응으로, DNA 염기서열분석 주형의 복수 클론 사본을 내포하는 마이크로스피어가 산출된다. 형광 활성 세포 분류(FACS)로, DNA 염기서열분석 주형을 내포하는 마이크로스피어가 검출된다. DNA 염기서열분석 주형을 내포하는 마이크로스피어는 열 사이클링 챔버로 분산된다. 통계학적으로, 하나의 마이크로스피어가 하나의 열 사이클링 챔버로 유동하도록 담보하기 위하여 열 사이클링 챔버의 출구 포트에서 자동밸브가 이용된다. DNA 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로스피어로부터 열 사이클링 신장 단편이 생산된다. 신장 단편은 포획되고 정제되며 농축되고 분석된다.
본 발명의 다양한 실시는 아래의 특징 중에서 한가지이상을 보유할 수 있다. 포획 단계(capturing step)는 올리고뉴클레오티드 포획 매트릭스(oligonucleotide capture matrix)를 이용한다.
다른 측면에서, 본 발명은 염기서열분석에 이용되는 방법에 관계한다. 상기 방법은 열 사이클링 챔버의 입구 포트에서, 클론 주형을 내포하는 마이크로스피어를 수용하고; 상기 챔버의 출구 포트에서 조임 장치를 이용하여 챔버 내에서 마이크로스피어를 트랩하고 챔버로의 추가적인 유동을 실질적으로 차단하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 염기서열분석 주형을 내포하는 마이크로스피어를 산출하는 단계를 포함하는 분석 방법에 관계한다. 상기 마이크로스피어는 열 사이클링 챔버로의 추가 유동이 실질적으로 차단되도록 상기 챔버 내에 출구 포트에 서 조임 장치의 이용으로, 상기 챔버에 배치된다.
본 발명의 다양한 실시는 아래의 특징 중에서 한가지이상을 보유할 수 있다. 첫 번째 밸브는 열 사이클링 챔버의 입구 포트에 배치되고, 두 번째 밸브는 열 사이클링 챔버의 출구 포트에 배치되고, 상기 두 번째 밸브는 첫 번째 밸브에 앞서 닫힌다. 이로 인하여, 마이크로스피어는 열 사이클링에 앞서, 조임 장치 외부와 열 사이클링 챔버의 주요 본체 부분으로 순차적으로 이동된다.
본 발명은 아래의 이점 중에서 한가지이상을 보유할 수 있다. Shotgun 게놈 염기서열분석에 요구되는 수고스런 박테리아 조작이 편의하게 자동화되고 통합된 시험관내 단계로 대체된다. 이로 인하여, 무수한 수동이나 로봇 콜로니 선별 작업이 생략된다. 염기서열분석 신장 단편을 생산, 정제, 분리하는데 필요한 모든 유체와 온도 조절 구조가 마이크로제조된 장치에 통합된다. 상당한 비용, 시간, 공간이 절약될 수 있다. 다른 유전자 분석 기술이 수행될 수 있다.
본 발명의 이들 특징과 이점은 아래의 상세한 설명 및 동반된 도면에서 더욱 상세하게 기술되는데, 이들은 본 발명의 원리를 예시할 뿐 본 발명을 한정하지 않는다.
본 발명은 본 발명의 특정 구체예를 예시하는 동반된 도면과 함께, 아래의 상세한 설명을 참조하면 가장 효과적으로 이해될 것이다.
도 1은 전통적인 게놈-규모 염기서열분석 작업에 수반되는 단계의 도식적 표현이다.
도 2는 본 발명에 따른 게놈 염기서열분석 과정에 수반되는 단계의 도식적 표현이다.
도 3은 본 발명에 이용될 수 있는 클로닝 과정의 도식적 표현이다.
도 4A는 본 발명에 따른 단일-채널 마이크로장치(single-channel microdevice)의 도식적 표현이고, 도 4B는 도 4A의 장치의 일부 확대도이고, 도 4C는 상기 단일-채널 마이크로장치의 분해 조립도(exploded view)이다.
도 5A, 5B, 5C는 각각, 신장 단편의 포획, 세척, 샘플 주입 동안 본 발명에 따른 장치의 형광 이미지(fluorescent image)이다.
도 6A는 반응 챔버의 일부 확대도를 비롯하여, 본 발명에 따른 장치의 염기서열분석 반응 챔버의 도식적 표현이다; 도 6B는 도 6A의 라인 6B-6B를 따른 도면이다; 도 6C는 염기서열분석되는 DNA를 내포하는 비드를 트랩하는데 이용되는 도 6A의 반응 챔버의 조임 구역(constriction region)의 도식적 표현이다.
도 7A는 비어있는 염기서열분석 반응 챔버의 조임 구역의 명시야상(bright field image)이고, 도 7B는 조임 구역에서 용액으로 충전되지만 마이크로스피어가 존재하지 않는 염기서열분석 반응 챔버의 조임 구역의 명시야상이고, 도 7C는 염기서열분석 반응 챔버의 조임 구역에 배치된 마이크로스피어의 암시야상(dark field image)이다.
도 8A는 비드 포획(bead capture) 목적으로 설계된 염기서열분석 반응 챔버의 조임 구역의 대안적 구체예의 도식적 표현이고, 도 8B는 도 8A의 라인 8B-8B를 따른 도면이다.
도 9A는 통합된 염기서열분석 어레이 시스템의 한 사분면의 도식적 표현이고, 도 9B는 도 9A의 시스템의 일부 확대도이다.
도 10A는 연속 유통 PCR 마이크로제조된 장치의 도식적 표현이다; 도 10B는 도 10A의 라인 10B-10B에서 확대도이며, 마이크로제조된 장치의 "T"-주입기 구역(injector region)을 도시한다; 도 10C는 도 10A의 라인 10C-10C에서 확대도이며, 마이크로제조된 장치의 채널의 일부분을 도해한다.
본 발명을 수행하기 위하여 본 발명자에 의해 고려된 최적 양식을 비롯한 본 발명의 일부 특정 구체예를 상세히 기술한다. 이들 특정 구체예의 실례는 동반된 도면에 예시된다. 본 발명이 이들 특정 구체예에 관련하여 기술되긴 하지만, 본 발명은 이들 기술된 구체예에 한정되지 않는다. 이와 반대로, 이들 실시예의 대안, 개변, 등가물은 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 기술적 사상과 범위 내에 포섭된다.
아래의 상세한 설명에서는 본 발명의 완전한 이해를 제공하기 위하여 다수의 특정한 상세를 기술한다. 본 발명은 이들 특정한 상세와 일부 또는 완전히 무관하게 수행될 수 있다. 다른 경우에, 본 발명을 불필요하게 불명료하게 하지 않도록 하기 위하여 널리 공지된 공정은 기술하지 않는다.
더 나아가, 본 발명의 기술과 기계 장치는 명료하게 하기 위하여 단수로 기술된다. 하지만, 일부 구체예는 달리 명시하지 않는 경우에, 이들 기술의 복수 반복 또는 기계 장치의 복수 적용을 포함할 수 있다.
본 발명의 시스템과 방법은 DNA 염기서열분석과 관련하여 기술된다. 상기 시스템과 방법은 RNA 염기서열분석에도 이용될 수 있다. 부가적으로, 상기 시스템과 방법은 DNA 또는 RNA의 다른 유전자 분석에도 이용될 수 있다.
본 발명의 시스템과 방법은 마이크로에멀젼 액적 또는 거환과 같은 마이크로반응기 요소를 이용하는데, 여기에는 마이크로스피어 또는 비드와 같은 마이크로캐리어 요소가 포함된다. 거환 또는 마이크로에멀젼 액적에 함입된 마이크로캐리어 요소는 DNA 또는 RNA 산물을 포획하는데 유용하다; 다시 말하면, 증폭된 DNA 또는 RNA는 마이크로캐리어 요소에 화학적으로 연결될 수 있다. 대안으로, 증폭된 DNA 또는 RNA는 마이크로캐리어 요소의 사용 없이 마이크로반응기 요소에 의해 운반될 수 있다. 가령, 거환 또는 마이크로에멀젼 액적에서 PCR 반응이 수행되고, 이후 이들 거환 또는 마이크로에멀젼 액적이 상기 공정의 다음 단계로 넘어간다.
본 발명의 마이크로제조된 통합된 DNA 분석 시스템(MINDS)은 미세유체 샘플 성분 분리 장치와 편의하게 양립하는 시스템과 방법을 제공한다. 도 2에 도시된 바와 같이, 한 구체예에서, MINDS 공정(200)은 DNA의 DNA 단편으로의 전단(shearing)(단계 202)으로 시작된다. 이후, 이들 단편은 결찰되어 원하는 원형 산물과 오염 선형 산물의 혼합물을 형성한다(단계 204). 상기 오염 선형 산물은 예로써, 엑소뉴클레아제 분해(exonuclease degradation)로 선택적으로 제거한다(단계 206). DNA 염기서열분석 주형의 복수 클론 사본을 내포하는 마이크로스피어의 콜로니가 형성된다(단계 208). 상기 콜로니는 예로써, 에멀젼 PCR 반응으로 산출될 수 있다. 그 다음, DNA 염기서열분석 주형을 내포하는 마이크로스피어를 확인한다(단계 210). 이들 마이크로스피어는 형광 활성 세포 분류(FACS) 기술로 확인될 수 있다. 단지 1회의 작업만 요구되고, 완결하는데 6 시간 또는 그 이하의 시간이 소요된다. 이후, DNA 염기서열분석 주형을 내포하는 마이크로스피어는 열 사이클링 챔버 또는 염기서열분석 반응 챔버에 분산시키는데, 여기서 신장 단편이 생산된다; 그 후, 이들 단편은 정제하고 농축한다(단계 212). 그 다음, 이들 신장 단편은 샘플 성분 분리 기구, 예를 들면, CE 장치로 분석한다(단계 214).
한 구체예에서 MINDS 방법, 공정, 기구는 마이크로제조된 구조물을 포함하는데, 여기에 열 사이클링, 친화성 포획(affinity capture), 샘플 정제, 모세관 집적형 전기영동(CAE) 성분이 통합된다. 상기한 바와 같이, 이런 시스템은 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로스피어를 복수의 열 사이클링 챔버 또는 염기서열분석 반응 챔버에 분산시키기 위한 미세유체 분산 채널 수단을 보유한다. 단지 하나의 마이크로스피어가 각각의 열 사이클링 챔버로 유동하도록 담보하기 위하여 이들 챔버의 출구 포트에 자동밸브 수단이 배치될 수 있는데, 여기서 상기 마이크로스피어로부터 열 사이클링 신장 단편이 생산된다. 이들 신장 단편을 포획하고 정제하며 농축하기 위하여 정제 챔버가 열 사이클링 챔버에 연결된다. 이들 신장 단편을 분석하기 위하여 마이크로제조된 CE 분리 채널이 정제 챔버에 연결된다.
본 발명은 전통적인 염기서열분석의 생체내 클로닝(in vivo cloning), 선별(selection), 콜로니 분리(colony isolation), 증폭 단계에 소요되는 노력, 비용, 시간을 배제한다. 대신에, 이들 단계는 편의하게 소형화되고 자동화된 시험관내 단계로 대체된다.
마이크로스피어는 이상적인 운반체(carrier)이며, 크기, 표면, 형광, 자성에 융통성 있는 제어를 제공한다. 마이크로제조(microfabrication) 및 반응물 부피에서 부수적인 감소를 통한 염기서열분석 반응 챔버의 소형화는 충분한 DNA 염기서열분석 주형에 대한 운반체로서 단일 클론 마이크로스피어의 이용을 가능하게 한다. 이는 나노리터 신장(nanoliter extension), 정화(clean-up), 염기서열분석 과정으로, 직접적인 통합을 위한 클론 주형의 선별, 증폭, 분류를 허용하는 결합된 공정 흐름(matched process flow)의 이용을 가능하게 한다.
도 3에서는 MINDS와 함께 이용될 수 있는 클로닝 공정(cloning process, 300)의 개요를 제공한다. 한 구체예에서, 게놈 DNA가 전혈(whole blood)로부터 분리되고, 이후 DNA 단편을 산출하는 분무기(nebulizer)에서 전단된다(단계 302와 304). 그 다음, 이들 DNA 단편은 효소 처리되어 평활-말단(blunt-end) DNA를 산출한다(단계 306). 가공된 단편은 벡터에 결찰시켜 원하는 원형 산물과 오염 선형 산물의 혼합물을 산출한다(단계 308과 310). 이후, 엑소뉴클레아제 분해(exonuclease degradation)로 결찰 산물로부터 삽입체와 벡터, 오염 선형 산물을 선택적으로 제거하는데, 남아있는 벡터의 대략 95% 이상이 삽입체를 보유한다(원하는 원형 산물)(단계 312).
클로닝 공정(300)의 초기 5 단계(단계 302-310)는 표준 라이브러리 발생 절차(standard library creation procedure)를 추종한다. 더욱 구체적으로, Invitrogen(Carlsbad, CA)에서 TOPO Subcloning Kit(#K7000-01)를 제공하는데, 이는 2 시간 내에 1 내지 6 Kb 삽입 게놈 Shotgun 라이브러리(insert genomic shotgun library)를 산출할 수 있다. 상기 서브클로닝(subcloing) 키트는 대략 20 ㎍(microgram)의 게놈 DNA를 필요로 하는데, 이는 Qiagen(Oslo, Norway)의 Blood & Cell Culture DNA Mini Kit(#13323)를 이용하여 1 ㎖의 전혈로부터 획득될 수 있다. 상기 DNA는 1-6 Kb DNA 단편을 산출하는 분무기에서 전단한다. 이후, 이들 단편은 T4 DNA와 Klenow 중합효소(polymerase) 및 소 내장 인산염(calf intestinal phosphatase, CIP)로 효소 처리하여 탈인산화된 평활-말단 DNA를 산출한다. 그 다음, 가공된 단편은 Invitrogen의 pCR 4 Blunt-TOPO 벡터에 결찰시킨다. 공유 결합된 우두 바이러스 위상이성질화효소(vaccinia virus topoisomerase) I을 상기 클로닝 벡터에 이용함으로써, 신속하고 효율적인 결찰(5분간 실온 결찰이 95% 이상의 형질전환체(transformants)를 산출한다)을 달성하고 결찰에 앞서 삽입체를 탈인산화시켜 키메라 클론 형성(chimeric clone formation)을 예방한다.
본 발명의 시험관내 MINDS 공정에 적합하도록 변경된, 공인된 라이브러리 발생에서 최종 단계(단계 312)는 박테리아 형질전환(bacterial transformation)과 항생제 선별(antibiotic selection)이다. 엑소뉴클레아제 분해는 원하는 결찰 산물로부터 삽입체와 벡터를 선택적으로 제거한다. 상기 단계에 Lambda 엑소뉴클레아제(New England BioLabs #M0262S)가 사용될 수 있는데, 그 이유는 상기 엑소뉴클레아제가 5'-인산화된 이중-가닥 DNA와 비-인산화된 이중-가닥 DNA를 분해시키지만 결찰이후 벡터에 존재하는 새김눈(nick)에서 DNA 절단(DNA digestion)을 개시할 수 없기 때문이다. 출발 게놈 DNA의 비관적인 1% 회수를 가정하면, 생성 라이브러리는 10X 서열 범위(sequence coverage)에 필요한 6,000배 이상의 분자 과잉(molecular excess)을 보유하지만, 이런 과잉은 후술된 단일-분자 PCR 증폭 단계에서 희석을 통하여 감소된다.
삽입체 크기(insert size)에 대한 엄격한 제어가 끝이 짝지어진 전체-게놈 de novo 염기서열분석(paired-end whole-genome de novo sequencing)에 필요한 경우에, 겔 분리와 밴드 정제 단계가 DNA 전단(단계 304)이후에 수행될 수 있다. 대안으로, 삽입체 크기는 좁은 형광 강도 범위 내에서 마이크로스피어의 PCR 증폭 또는 유세포 선별(flow cytometric selection) 동안 한정된 신장 시간(extension time)을 이용하여 제한될 수 있다. 티아졸 오렌지(thiazole orange, TO)와 같은 DNA 삽입 염료(intercalating dye)로 마이크로스피어-클론을 표지하면, 앰플리콘 크기(amplicon size)에 비례하여 형광 신호가 산출된다. 유세포분석이 MINDS 공정에서 한 단계이기 때문에, 이는 감소된 수율이 유일한 단점인, >5% 재원형화된 벡터를 제거하는 매력적인 크기-선별 방법이다.
서브클로닝 키트에 이용되는 벡터는 삽입 부위로부터 멀리 떨어진 T7과 T3 시발 부위(priming site) 33 bp(염기쌍)으로 염기서열분석을 위하여 최적화될 수 있다. MINDS 벡터는 생물학적 제약으로부터 자유롭기 때문에, 염기서열분석 시발 부위가 삽입 부위에 더욱 가깝게 이동될 수 있고, pUC vi, fl ori, lacZ, 항생제 저항성 유전자가 제거될 수 있다. 향상된 샘플 정화(clean-up) 및 감소된 프라이머-다이머 형성(primer-dimer formation)을 위하여, 최적화된 아크리디트 포획 서열(acrydite capture sequence)과 호모 PCR 시발 부위가 삽입될 수 있다.
MINDS 공정에서 염기서열분석은 개별 마이크로스피어 또는 비드에 부착된 클론 주형 DNA를 이용할 수 있다. 이러한 클론 부착(clonal attachment)은 프라이머 중에서 하나를 마이크로스피어에 공유 결합시킴으로써 달성된다.
단일-분자 증폭을 통한 1,000 내지 100,000 DNA 분자의 클론 분리(가령, 마이크로에멀젼 폴로니) 또는 조합 혼성화(combinatorial hybridization) 방법이 확인되었다(참조: Mitra, R.D., et al., "Digital genotyping and haplotyping with polymerase colonies", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2003, 100(10): p 5926-5931; Dressman, D., et al., "Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations", Proceedings of the National Academy of Sciences of the united States of America, 2003, 100(15): p. 8817-8822; Brenner, S., et al., "Gene expression and analysis by massively parallel signature sequencing (MESS) on microbead arrays", Nature Biotechnology, 2000, 18(6): p. 630-634). 전통적인 마이크로칩 염기서열분석은 반응당 대략 l0억 개의 주형 DNA 분자를 필요로 한다. 20X 선형 Sanger-염기서열분석 증폭이후 20억 개의 신장 단편이 산출되는데, 이는 공초점 방사 스캐너(confocal radial scanner)를 이용한 높은 신호 대 잡음(signal-to-noise, SIN) 검출에서 20-배 과잉을 나타낸다(밴드당 1백만 개의 단편 X 1,000개의 밴드 = 10억 개의 분자). 이런 과잉이 필요한 이유는 교차-주입(cross-injection) 공정이 당량몰(equimolar) 혼합물이 교차점에서 획득될 때까지 신장 단편을 전체 분리 칼럼에 흘려보내고, 이후 전체 샘플의 대략 5%를 주입하는 단계를 요구하기 때문이다. 후술된 친화성 포획 직접-주입 전략은 20-배 과잉을 배제하고 단지 5천만 개의 초기 주형 사본을 필요로 한다.
CPG Biotech(Lincoln Park, NJ)에서는 8천만 개의 DNA 분자에 지속적으로 결합할 수 있는 아민 변형된 프라이머에 공유 부착을 위한 긴 사슬 알킬아민 링커(linker)를 보유하는 5 마이크론(㎛) 제어된 다공성 유리 상자성 마이크로스피어를 생산한다. 단일 DNA 분자로부터 시작하여, 30회 사이클의 PCR 이후 이론적으로, 10억 개에 도달한다. 실질적인 증가는 각 사이클에 대한 100% 이하의 효율, 후기 사이클에서 감소된 효소 활성, pL 규모 반응에서 한정된 반응물로 인하여 더욱 낮다. 클론 마이크로스피어를 생산하기 위하여, 단일 DNA 분자 및 단일 프라이머-결합된 마이크로스피어는 PCR 반응기에 놓여야 한다. 효율적인 단일-분자 PCR은 단일 DNA 분자의 효과적인 농도를 증가시키기 위하여, 극히 소량의 반응물(l - 10 pL)을 요한다. 인간-크기 게놈을 염기서열분석하기 위하여, 대략 3천만 개의 마이크로스피어 클론이 요구된다. 한 챔버에서 단일 마이크로스피어와 DNA 분자의 초고속 조합(high-throughput combination)은 통계학적으로 희석된 마이크로에멀젼 용액을 이용함으로써 가능하다. DNA 분자와 마이크로스피어가 한 종류가 10배의 반응기 부피(reactor volume)로 존재하도록 각각 희석되는 경우에, 반응기의 1%에서 동시발생(concurrence)의 가능성이 높다(99% 이상). 반응기의 99%가 비-생산적이기 때문에, 3천만 개의 마이크로스피어 클론을 산출하는데 l00-배 이상의 반응물(30억 개)이 요구된다.
다수의 소량 반응물을 산출하기 위한 2가지 가능 접근법은 마이크로제조된 PCR 장치와 에멀젼 PCR이다. 하지만, PCR 장치는 필요한 30억 개의 반응물을 달성하기 위하여 수천번의 작업을 요한다. 다른 한편, 에멀젼 PCR은 통상적인 유전자 증폭기(thermal cycler)를 이용하여, 단일 튜브에서 수백만 개 내지 수십업 개의 독립된 구획을 열 사이클링할 수 있는 능력을 갖고 있다. 에멀젼 PCR을 이용하여, 자석 입자에 부착된 클론 PCR 앰플리콘이 산출되었다. 평균적으로, 각 마이크로스피어는 각각 5 ㎛ 직경 구획에서 가용한 뉴클레오시드 삼인산염에 기초한 600,000개 앰플리콘의 이론적 최대치보다 낮은 수치인 10,000개 이상의 250 bp 앰플리콘을 보유하였다. 15개의 마이크론 마이크로에멀젼 PCR 구획이 확인되었는데, 여기서 1,000 bp 앰플리콘의 최대 수치는 최소한 요구되는 5천만 개의 초기 주형 사본보다 10배 낮은 수치인 5백만 개이다. 이런 문제점은 다양한 방법으로 해결될 수 있다.
먼저, 추가의 마이크로에멀젼 PCR 단계를 수행하여 비드에 연결된 DNA의 양을 증가시킬 수 있다. 둘째, 형광 유세포분석 단계이후 추가의 비-반응물-한정된 증폭 단계가 필요할 수 있다. 2차 PCR 증폭은 온-칩(on-chip), 공용 열 사이클링 챔버에서 수행될 수 있는데, 여기서 상자성 마이크로스피어는 개별 반응기로 유인되고 자성으로 유지된다. 새로운 PCR 혼합물은 상기 챔버에 통과시키고 l5X 열 사이클링하여 각 마이크로스피어를 최대 8천만 개의 주형으로 포화시킨다. 이 경우에, 자기장(magnetic field)이 유지되는데, 그 이유는 Sanger-염기서열분석 반응 혼합물이 챔버 내로 세척되고, 이후 고체-상 염기서열분석(solid-phase sequencing)이 수행되기 때문이다. 최종적으로, 스캐너의 S/N을 최대 10-배 향상시켜 앞서 계산된 것보다 대략 10배 낮은 수치의 주형을 염기서열분석할 수 있다.
대략 천오백만 개의 15 ㎛ 직경 구획이 25 ㎕ 수상(aqueous phase), 75 ㎕ 오일상(oil phase) 에멀젼에 발생될 수 있다. 3천만 개의 일치하는 단일 DNA 분자와 마이크로스피어 결과를 산출하기 위하여 30억 개의 구획이 요구된다. 따라서, 대략 2개의 100 ㎕ 96-웰 평판 반응이 요구된다. 이들 반응이 완결되면, 3억 개의 결합되지 않은 마이크로스피어의 배경으로부터 3천 개의 마이크로스피어 클론이 분리되어야 한다.
상기한 바와 같이, 염기서열분석 주형을 보유하는 비드는 FACS로 확인될 수 있다. 이용될 수 있는 시스템은 BD FACS ArrayBioanalyzer 시스템(BD Biosciences, San Jose, California)이다. BD FACSArray 유세포분석기는 초당 최대 15,000개의 결과를 처리할 수 있기 때문에, 6 시간 이내에 30억 개의 염기 게놈의 10X 범위(coverage)에 필요한 모든 클론을 분리할 수 있다. 이들 비드는 이중-가닥 DNA에 삽입될 때까지 비-형광인 DNA 삽입 염료, 예를 들면, TO로 처리된다. TO의 형광 강도는 DNA의 양에 선형으로 비례하기 때문에, 증폭된 DNA를 보유하는 비드와 그렇지 않은 비드를 편의하게 구별할 수 있다.
본 발명에 따른 단일-채널 마이크로장치(400)의 도식적 표현은 도 4A, 4B, 4C에 도시된다. 상기 장치는 미세유체 밸브, 히터, 저항 온도 감지기(RTD) 및 모든 반응, 포획, 정화 CE 구조를 통합하는 4층 유리-유리-PDMS(폴리디메틸실록산, polydimethysiloxane)-유리 샌드위치로서 제조될 수 있다. 상기 장치는 다른 외형에서, 유리-PDMS-유리-유리 스택(stack)으로 제조될 수 있다. 밸브, 히터, RTD, 챔 버, CE 구조를 비롯한 4층 마이크로제조된 시스템은 "Fluid Control Structures In Microfluidic Devices"의 명칭으로 2003년 12월 29일자로 제출된 미국 특허 출원 제 10/750,533에 기술된다.
상기 마이크로장치(400)는 신장 단편 생산, 반응 세척, 신장 단편 분리(도 2의 단계 212와 214)를 비롯한 MINDS 공정에서 모든 하류 단계를 수행할 수 있다. 상기 장치(400)는 열 사이클링이나 염기서열분석 반응 챔버(402), 포획이나 정제 챔버(404), 분리 채널(407)을 비롯한 CE 시스템(406)을 보유한다. 도시된 바와 같이, 상기 장치(400)의 이들 구성요소는 다양한 밸브와 채널로 연결된다. 히터(도시되지 않음), 예를 들면, kapton 히터를 이용하여 열 사이클링 챔버의 내용물을 가열할 수 있다. 상기 챔버의 주형은 RTD(405)에 의해 모니터된다.
도 4C에 도시된 바와 같이, 장치(400)는 채널 층(channel layer, 43O), 경유 층(via layer, 432), 복합 층(manifold layer, 434)을 비롯한 3개의 유리 층을 포함한다. PDMS 막 층(membrane layer, 436)은 경유 층(432)과 복합 층(434) 사이에 제공된다. 최상층(430)은 열 사이클링 반응기, 포획 챔버, CE 특징(feature)을 보유한다. 두 번째 층(432)은 유리 와이퍼의 최상위 표면에 RTD를 통합하고 최하부에 에칭된 특징(feature)을 통합하여, 막 층(436)이 아래에 위치하는 밸브와 펌프를 형성한다. 마지막 층(434)은 히터를 보유하고, 공압 구동 라인(pneumatic actuation line)과 배출 챔버(displacement chamber)로 밸브와 펌프 구조를 완결한다.
한가지 작동 방법에서, 염기서열분석 마스터 혼합물은 장치(400)의 포 트(408)로부터 마이크로밸브(410)를 통하여 열 사이클링 챔버(402)로 적하된다. 챔버(402)의 부피는 대략 250 nano-리터(nL)이다. CE 시스템(406)의 분리 채널은 포트(412)에서부터 포트(414)까지, 선형 폴리아크릴이미드로 충전된다. CE 시스템은 16-센티미터(㎝) 하이퍼턴(hyperturn) 시스템일 수 있다. 아크릴다이트(acrydite) 포획 매트릭스는 포획 챔버(404)와 삽입 조임(intervening pinched) 챔버(419)가 충전될 때까지 포트(416)로부터 포트(418)로 적하된다. 열 사이클링이후, 챔버(402), 신장 단편, 잔류 반응물은 밸브(420)와 채널(422)을 통하여 포획 챔버(404)로 전기역학적으로 이동된다. 이후, 포획된 신장 단편은 전동영동으로 세척되고, CE 시스템(406)에 의한 분리를 위하여 채널(424)로 주입된다.
이런 친화성 포획, 샘플 정화 마이크로장치의 이점은 정제된 신장 단편이 합성 동안 첨가된 아크리다이트 단량체(acrydite monomer)의 양에 의해 결정된 농도에서 1-10 nL에 유지될 수 있다는 점이다. 도 5A, 5B, 5C에서는 분리뿐만 아니라 샘플의 열 사이클링, 포획, 세척(정제), 농축이 수행된 장치(400)에서와 유사하게 마이크로장치(500)의 작동으로부터 형광 이미지(상대적 적용 전위(relative applied potential)는 "+"와 "-"로 표시된다)를 도시한다. 구체적으로, 아크리다이트 포획 매트릭스를 5% w/v 아크릴아마이드, 1X TTE(50 mM Tris, 50 mM TAPS 유리산, 1 mM EDTA, pH = 8.4), 20 nmol의 메타크릴레이트-변형된 올리고(methacrylate-modified oligo)(5'-Acrydite-ACTGGCCGTCGTTTTACAA-3', TM = 60.4℃, Operon Technologies, Emeryville, CA)의 2-㎖ 용액에서 합성하였다. 상기 용액은 0.015% w/v APS와 TEMED를 첨가하여 중합화(polymerization)를 개시하기에 앞 서 2 시간동안 아르곤을 살포하였다. 이후, 중합된 포획 매트릭스를 1 ㎖ 주사기를 이용하여 포획 챔버(504)에 적하하였다. 고압 겔 적하기(high-pressure gel loader)를 이용하여 중합체 염기서열분석 매트릭스(CEQ, Beckman Corp., Fullerton, CA)를 CE 시스템(506)으로 적하하였다. 80 nM ET-프라이머, 1X C 종결인자 혼합물(terminator mix)(Amersham), 4 nM PCR 산물을 함유하는 C-트랙 마스터 혼합물을 제조하고 250 nL 열 사이클링 챔버 또는 반응기(도시되지 않음)에 주입하였다. LabVIEW program(National Instruments, Austin, TX)을 이용하여 열 사이클링(35X, 94℃ 30초, 45℃ 40초, 70℃ 40초)을 온-칩(on-chip) 수행하였다.
염기서열분석 반응 정화는 먼저, 50℃ 가열된 장소에서 30초동안 마이크로장치를 평형화함으로써 수행되었다. 이후, 샘플 포획(도 5A)은 반응기 입구(도 4A의 포트(408))를 차단하면서 2000 V를 포획 챔버 출구(도 4A의 포트(416))에 가함으로써 개시된다. 따라서, 신장 단편과 잔류 뉴클레오티드를 포함하는 샘플, 프라이머, 염이 열 사이클링 챔버로부터 채널(522)을 통하여 포획 챔버(504)로 전기영동으로 이동된다. 신장 단편은 포획 챔버에서 아크리다이트 매트릭스에 혼성화되지만, 잔류 반응물은 통과한다. 올리고뉴클레오티드 포획이 완결되면, 존속된 신장 단편은 전기영동으로 30초간 세척하여(도 5B) 포획 챔버에 여전히 존재하는 과잉의 프라이머와 다른 오염물질을 제거하였다. 전기영동에 의한 세척이후, 상기 장소는 70℃로 상승시키고 60초간 평형화시켜 산물-매트릭스 이중나선을 완전히 변성시켰다. 변성된 샘플은 포획 챔버 출구를 차단하면서 2,500 V를 애노드(anode)에 가함으로써 CE 기구(506)의 분리 칼럼(507)로 직접 주입한다(이미지는 채널 구조를 강조하고 형광 표면 오염을 제거하도록 처리되었다).
대안으로, 직선 평행 교차-주입기(straight cross-injector)와 30-㎝ 분리 모세관을 이용할 수 있다. 이는 분석력(resolution)을 개선한다.
마이크로스피어-콜로니 발생 절차와 단일 반응기 마이크로장치는 재염기서열분석(resequencing) 노력에 적합한 단일-종단형 리드(single-ended read)를 산출할 수 있다. 복합 게놈의 de novo 전체-게놈 Shotgun 염기서열분석은 짧은 삽입체 클론 및 긴 삽입체 클론으로부터 쌍-종단형 리드(paired-end read)를 요한다. 일단의 마이크로스피어에 대구간(Long-range) PCR 및 형광 유세포분석을 순차적으로 이용하여 긴 삽입체 클론을 선별적으로 산출할 수 있다. 전통적인 쌍-종단형 염기서열분석은 클론 DNA가 마이크로스피어로부터 방출되고 유인되어 전방과 후방 염기서열분석 반응기가 분리될 수 있도록 절차와 마이크로장치의 변경을 요한다. 대안적 전략은 변경된 염기 라벨링 설계(base labeling scheme)를 이용하여 일단의 염기에서 동시에 전방과 후방 염기서열분석을 수행하는 것이다. 이들 쌍-종단형 리드는 서열 조합에서 4개-염기 단일-종단형 리드를 고정하는데 적합한 긴 단일 또는 이중-염기 리드를 산출한다.
도 6A, 6B, 6C에 예시된 바와 같이, 마이크로스피어(600)는 클론 주형을 염기서열분석 반응이 수행되는 열 사이클링이나 염기서열분석 반응 챔버(602)로 이전하는데 이용된다. 이런 과정은 하나의 마이크로스피어를 각각의 염기서열분석 반응 챔버에 도입할 것으로 요구한다. 염기서열분석 반응 챔버에 개별 마이크로스피어를 트랩하기 위한 자동밸브 기술은 개별적으로 시동되는 밸브와 검출장치의 필요 없 이, 이런 목적으로 이용된다.
도시된 바와 같이, 반응 챔버(602)는 도입 채널이나 팔(604) 및 출구 채널이나 팔(606)을 보유한다. 도입 채널은 반응 챔버의 입구 포트(605)와 유체 소통(fluid communication)하고, 출구 채널은 반응 챔버의 출구 포트(607)와 유체 소통한다. 자가-밸브(Self-valving)는 반응 챔버의 출구 단부 또는 포트(607)에 조임 장치 또는 조임 장치 구역(608)을 만듦으로써 달성된다. 상기 조임 장치 구역은 반-원형 형상이다.
상기 조임 장치는 마이크로스피어가 챔버를 빠져나가기 전에 이를 트랩한다. 트랩된 마이크로스피어는 유속(flow rate)을 감소시켜, 추가의 마이크로스피어가 챔버로 유동하는 것을 예방한다. 마이크로스피어의 희석도(dilution)는 첫 번째 마이크로스피어가 챔버를 차단하기 이전에 다른 마이크로스피어가 반응 챔버로 유동하는 가능성이 대략 0.5% 미만이 되도록 선택된다. 이런 통계학적 접근이 비현실적이거나, 또는 낮은 분류 비율(sorting rate)을 유발하면, 비드 광 산란(bead light scattering)에 대한 온-칩 센서가 이용될 수 있고, 일시적으로 더욱 균일한 비드 분포를 유도하기 위하여 분류 루프(sorting loop)에서 2개의 밸브가 추가될 수 있다.
유리 제조 공정(glass fabrication process)을 이용하여 도 6A-6C에 도시된 장치를 만들 수 있다. 한 실례에서, 조임 장치를 제외한 모든 특징(feature)은 30 ㎛의 깊이까지 등방성으로 식각하였다. 샘플 도입과 출구 채널은 70 ㎛ 너비와 15 ㎜ 길이로 설정되었다. 염기서열분석 반응 챔버는 250 nL의 부피를 보유하였다. 채 널과 반응 챔버에 대한 기초 제조 공정이 완결된 이후, 두 번째 마스크를 이용하여 조임 장치를 만들었다. 이를 위하여, 더욱 높은 점착성의 광경화성 수지(photoresist)(SJR 5740, Shipley, Marlborough, MA)를 2500 rpm에서 35초간 와이퍼에 스핀-코팅(spin-coating)하였다. 이후, 70℃에서 7분간 및 90℃에서 6분간 소프트 베이킹(soft baking)하였다. 더욱 높은 점착성의 광경화성 수지는 특징된 와이퍼(featured wafer)에 더욱 균일한 코팅을 제공한다. 밀착 프린터(contact printer)를 이용하여 조임 패턴(constriction pattern)을 코팅된 와이프로 옮겼다. 정렬 마크(alignment mark)를 이용하여, 조임 장치를 앞서 식각된 채널과 챔버와 함께 정렬(± 1 ㎛)하였다. 진전(development)이후, 무정형 실리콘 마스킹 층(amorphous silicon masking layer)은 플라즈마 식각(plasma etching)을 통하여 제거하고, 노출된 유리는 5:1BHF를 이용하여 습식 식각(wet etching)하는데, 효과적인 식각 비율은 1.5 시간동안 2 ㎛/hour이었다. 이는 3 ㎛의 수축 깊이 또는 높이(constriction depth or height)를 제공하였다. 조임 너비(constriction width)는 8 ㎛로 설정되었고, 길이는 15 ㎛로 설정되었다.
자가-밸브 개념의 검사는 1 마이크로스피어/3 ㎕의 최종 농도로 희석된, 1x Tris(pH 8.0)와 1% Triton X-100의 용액에 부유된 6 ㎛ 직경의 스트렙타비딘 코팅된 Fluoresbrite YG 카르복실화된 폴리스티렌 마이크로스피어(Polysciences Inc., Warrington, PA)를 이용하여 수행하였다. Poisson 분산을 이용하여, 반응 챔버 부피의 10x 희석도가 첫 번째 마이크로스피어가 조임 장치를 차단하기 이전에 다른 마이크로스피어가 250 nL 챔버로 유동하는 가능성을 0.5% 미만이 되도록 담보하는 것으로 산정되었다.
도 6A-6C에 도시된 것과 같은 장치는 1x Tris(pH 8.0)와 1% Triton X-100의 용액으로 미리-채웠다. 마이크로스피어 용액(6 ㎕)은 입구 접근 구멍(inlet access hole)에 피펫으로 옮겼다. 진공 라인(vacuum line)을 이용하여 챔버를 통하여 비드를 끌어당겼다. 마이크로스피어가 조임 장치에서 트랩되고 첫 60초 내에 차단이 발생하는 경우에, 압력 감소가 -60 kPa에서 -70 kPa로 증가하였다. 상기 실험은 12분간 지속되었는데, 챔버로 유동하는 다른 마이크로스피어가 전혀 관찰되지 않았다.
도 7A와 7B에서는 20x 확대도에서 각각, 비어있는 열 사이클링 챔버(702)의 조임 구역(708)의 명시야상(bright field image) 및 조임 구역에서 용액으로 충전되지만 마이크로스피어가 존재하지 않는 열 사이클링 챔버의 조임 구역의 명시야상을 도시한다. 도 7C에서는 조임 구역(708)에 트랩된 형광 마이크로스피어(700)를 포함하고 밸브로서 기능하는 열 사이클링 챔버(702)의 암시야상(dark field image)을 도시한다. 이들 실험은 대략 6 ㎛ 직경의 마이크로스피어에 대하여 수행하였다. 이런 개념은 반응기에서 주형의 총수를 증가시키기 위하여 더욱 큰 마이크로스피어로까지 편의하게 확대될 수 있다. 또한, 더욱 작은 마이크로스피어가 이용될 수도 있다. 이들 마이크로스피어는 특히, 대략 1 내지 100 ㎛ 직경을 보유할 수 있다. 한 구체예에서, 이들은 대략 10 ㎛ 직경을 보유한다.
완전한 흐름 차단(flow blockage)을 결과하는 대안적 자동밸브 구체예는 도 8A와 8B에 제시한다. 여기서, 반응 챔버(802)는 챔버 출구 포트(807)에 형성된 거의 원형의 조임 장치 또는 조임 장치 구역(808)을 보유한다. 상기 챔버와 조임 장 치는 이중-식각(double-etching)된다; 다시 말하면, 이들은 2개의 결합된 유리 표면 모두에서 식각된다. 이는 도 6A-6C의 구체예의 반-원형 조임 장치와 대조적으로, 거의 원형의 조임 장치를 산출한다. 이는 마이크로스피어(800)를 트랩하기 위한 우수한 밸브를 제공한다.
앞서 기술된 바와 같이, 밸브는 염기서열분석 반응이나 열 사이클링 챔버(402)의 한쪽 면에 통합된다(도 4A와 4B 참조). 마이크로스피어는 조임 장치에 일단 트랩되면, 중합효소, 프라이머, dNTP, ddNTP에 클론 주형의 우수한 접근가능성(accessibility)을 담보하기 위하여 열 사이클링 챔버를 향하여 후진되어야 한다. 입구 밸브(410)를 닫기에 앞서 상기 챔버의 출구에서 밸브(420)를 닫음으로써, 마이크로스피어는 이들 밸브의 제한된 정체 부피(finite dead volume)의 결과로써 챔버를 향하여 뒤로 밀려나게 된다. 이런 원리는 입구와 출구 밸브를 동시에 시동함으로써 어레이 시스템(array system)으로까지 편의하게 확대될 수 있다.
DNA 분석을 위한 초고속의 완전히 통합된 시스템을 구현하기 위하여, 열 사이클링 챔버, 정제 챔버, 염기서열분석 단편의 CE 분석을 위한 분리 채널을 통합하는 통합된 분석기의 마이크로제조된 어레이가 제공된다. 이런 시스템(900)의 개요는 도 9A와 9B에 도시된다. 상기 시스템은 도 4A-4C의 단일 채널 장치를 고도의 병렬 분석을 수행할 수 있는 어레이 구조로 확대한다.
다양한 구체예에서, 상기 시스템(900)은 복수의 열 사이클링 챔버(902) 및 연관된 샘플 정제 또는 포획 챔버(904)를 보유하는데, 이들은 대략 원형 축선으로 정렬되어 방사상으로 병렬 시스템을 형성한다. 열 사이클링 챔버와 샘플 정제 챔버 는 분리 채널 또는 마이크로채널(908)을 보유하는 CE 분석기 시스템(906)과 완전히 통합된다. 상기 CE 분석기는 공통의 중심 애노드(central anode)(A)(910), 캐소드 저장기(cathode reservoir)(C)(912), 폐기물 저장기(waste reservoir)(W)(914)를 보유한다. 상기 캐소드와 애노드 저장기는 인접한 일단의 분리 채널(908)과 연관된다. 마이크로채널(908)은 선행 문헌("High-throughput genetic analysis using microfabricated 96-sample capillary array electrophoresis microplates", Peter C. Simpson, et al., Proc. Nail. Acad. Sci. USA, Vol. 95, pp. 2256-2261, March 1998)에 언급된 유형의 회전 공초점 형광 스캐너(rotary confocal fluorescence scanner)를 이용한 검출을 위하여 애노드(910)에 연결된다.
시스템(900)은 분산 채널(916), 통합된 히터(918a와 918b), RTD(920)을 추가로 보유한다. 히터(918a와 918b)는 각각, 열 사이클링 챔버와 정제 챔버를 동시에 접근한다. 이와 같이, 열 사이클링과 샘플 정제 반응을 유도하기 위한 단순한 고리 히터(ring heater)의 이용이 매우 바람직하다.
이들 반응의 온도는 RTD에 의해 모니터된다. 한 구체예에서, 최적 열 사이클링 작업을 위한 정확한 온도 감지를 전체 히터(918a)에 제공하기 위하여, 4개의 동등하게 이격된 RTD가 기질에 통합된다. 유사하게, 4개의 동등하게 이격된 RTD를 이용하여 히터(918b)의 온도를 모니터할 수 있다.
시스템(900)은 시스템 흐름 공정을 제어하기 위한 통합된 밸브와 포트의 어레이를 또한, 보유한다. 이들 밸브는 모놀리스 엘라스토머(monolithic elastomer, PDMS) 막 밸브일 수 있다. 상기 시스템은 앞서 언급된 U.S. 특허 출원 제 10/750,533호에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 이와 같이, 상기 시스템은 미세유체 밸브와 펌프, RTD, 열 사이클링 챔버, 정화(clean-up)와 농축 챔버, CE 채널을 통합하는 4층 유리-유리-PDMS-유리 스택을 보유할 수도 있다.
한 구체예에서, 시스템(900)은 150-㎜ 직경 유리 기질의 사분면에 정렬된 24개의 열 사이클링 챔버, 24개의 정제 챔버, 24개의 CE 채널을 보유한다. 각 열 사이클링 챔버(~250 nL)는 PDMS 막 밸브(V1)(922)에 의해 분산 채널로부터 분리된다. 활동 밸브에 의한 챔버 부피의 엄밀한 억제는 열 사이클링 동안 거품-없는 로딩(loading)과 샘플의 고정화에 필요한데, 그 이유는 샘플 움직임(sample movement), 거품 형성, 샘플 증발이 작업에 심각한 영향을 줄 수 있기 때문이다.
RTD는 티타늄(Ti)과 플래티나(Pt)로 제조될 수 있다. 상이한 금속 침전(metal deposition) 기술, 예를 들면, 스퍼터링(sputtering) 및 열과 전자-빔 증발(thermal and electron-beam evaporation)로, 상이한 금속(Au, Al, Pt. Ni)을 이용하여 히터를 제조할 수 있다. 니켈 히터는 우수한 가열 균일성(heating uniformity)을 나타내고 우수한 긁힘 내성(scratch resistance)을 보유하며 수백번의 열 사이클 이후에도 눈에 띄는 성능 저하를 보이지 않으며, 편의하게 제조된다. 마이크로제조된 히터와 열 사이클링 챔버는 열 사이클링 동안 캐소드 저장소에서 완충액의 증발을 피하고 주입 구역의 가열을 최소화하기 위하여 CE 마이크로채널로부터 멀리 떨어져 배치된다. 저항성 고리 히터(resistive ring heater)는 히터와 챔버 사이에 우수한 열 전이(heat transfer)을 담보하기 위하여 바닥 와이퍼(bottom wafer)의 뒷면에 조립될 수 있다. 동등하게 이격된 RTD는 최적 성능을 위한, 전체 히터에 온도 균일성(temperature uniformity)을 담보하는 정확한 온도 감지를 제공하기 위하여 마이크로플레이트(microplate)에 통합된다.
열 사이클링 챔버는 LabVIEW 프로그램(National Instruments, Austin, TX)(LabView VI)으로 주기적으로 순환될 수 있다. 온도 제어는 LabVIEW 프로그램 내에서 할당(proportion)/통합(integration)/미분(differentiator)(PID) 모듈을 통하여 달성될 수 있다.
작동 중에, 한 구체예에서, 애노드(910)를 통한 양압(positive pressure)을 이용하여 염기서열분석 분리 매트릭스가 CE 분리 채널에 도입된다. 분리 매트릭스(separation matrix)는 캐소드 저장기(912), 폐기물 저장기(914), 교차-주입점(cross-injection point)을 연관된 샘플 정제 챔버에 연결하는 팔(924)을 충전한다. 충전율(filling rate)은 다양한 상호연결 채널의 너비와 길이의 조정을 통하여 조절될 수 있다. 캐소드와 애노드 저장기 및 연결 팔은 동일한 비율로 충전될 수 있다. 가령, 열 사이클링 챔버(902)와 샘플 정제 챔버(904)를 충전하여 후속 과정의 연속성(continuity)을 담보하기 위하여, 분산 채널(916)에 연결된 로딩(L) 포트(loading port, 926)로부터 물이 적하된다. 출구 포트(E)(936)는 2개의 열 사이클링 챔버(902)에 의해 공유된다.
포획 겔 매트릭스(capture gel matrix)는 포트(F)(928)를 통하여 샘플 정제 챔버로 도입된다. FACS를 이용하여 분류되고 제조된 클론 DNA 비드의 라이브러리는 예로써 주사기 펌프(syringe pump)에 의해, 포트(926)(열린 밸브 (V1)(922)와 (V2)(930) 및 닫힌 밸브(V3)(932))로 적하된다. 헤드 압력(head pressure)을 모니 터하기 위하여 입구에 압력 변환기(pressure transducer)가 이용된다. 비드가 앞서 기술된 바와 같이 자동밸브에 트랩되면, 열 사이클링 챔버의 출구 포트에서 자동밸브가 챔버로의 유동을 중단시킨다. 각각의 자동밸브가 각각의 열 사이클링 챔버에서 비드로 충전됨에 따라, 헤드 압력이 지속적으로 증가한다. 이런 방식으로, 각각의 열 사이클링 챔버에서 비드의 적하는 헤드 압력을 모니터함으로써 달성된다.
챔버를 충전한 이후, 밸브(V2)(930)와 (V1)(922)은 닫히고 열 사이클링 반응이 시작된다. 이들 비드가 열 사이클링 칵테일로 직접적으로 분류되기 때문에, 열 사이클링에 앞서 추가의 단계가 필요하지 않다. 대안으로, 시약 사용을 최소화하기 위하여 분류가 완충액에서 수행되고, 이후 열 사이클링 칵테일의 열 사이클링 챔버로의 도입이 수행될 수 있다. 상기한 바와 같이, 히터(918a와 918b)는 열 사이클링과 샘플 정제 반응을 유도하고, 반응 온도는 RTD(920)에 의해 모니터된다.
열 사이클링 산물은 밸브(V1)(922)과 (V3)(932)을 열어 둔 채로 포트(L)(926) 및 샘플 포트 또는 전기 접촉점(electrical contact point)(S)(934) 전체에 전기장을 가함으로서 정제 챔버로 유인된다. 비-포획된 시약의 플러싱(flushing)은 포트(S)(934)와 포트(F)(928) 사이에 전기장을 가함으로써 수행된다. 이후, 염기서열분석 산물은 포트(S)(934)와 폐기물 저장기(W)(914) 사이에 전위(potential)를 가함으로써, 정제 챔버로부터 CE 분리를 위한 연관된 마이크로채널(908)로 주입된다. 회전 공초점 형광 스캐너는 염기서열분석 샘플을 검출하는데 이용된다. 상기 스캐너는 스캐너 헤드(scanner head)의 각 회전에서 채널을 순차적으로 조사한다.
도시된 바와 같이, 정제된 DNA 염기서열분석 산물의 분리는 교차-주입(cross-injection)을 이용함으로써 달성된다. 대안으로, 직접 주입이 이용될 수 있다.
다른 구체예에서, 콜로니 형성(colony formation)의 마이크로에멀젼 PCR 방법은 PCR 기술을 통한 연속 유동으로 대체되는데, 여기서 주형의 단일-분자 PCR 증폭을 수행하기 위한 거환 또는 액적이 형성되고, 이후 증폭된다. 이들 거환 또는 플러그(plug)는 예로써 PCR 시약과 희석된 주형 단편의 수용액을 캐리어(carrier)로서 기능하는 소수성 용액과 혼합함으로써 형성된다. 이런 기술로 생산된 거환은 염기서열분석 주형의 통계학적으로 소수의 사본을 보유한다. 이상적으로, 10개의 거환 중에서 1개가 단일 염기서열분석 주형을 보유하도록 하는 농도가 선택된다. 이는 100개 중에서 단지 1개만이 원치않는 2개의 주형을 동시에 보유한다는 것을 의미한다. PCR 반응에서 이들 프라이머 중에서 하나를 내포하는 마이크로스피어 또는 비드 역시 이런 기술을 수행하는 과정에서 거환이나 액적 내에 혼입될 수 있다. 따라서, 콜로니는 단일 염기서열분석 주형의 복수 클론 사본을 내포하는 거환, 또는 이들 사본을 내포하는 마이크로스피어를 보유하는 거환을 포함할 수 있다.
도 1OA, 1OB, 10C에 도시된 바와 같이, 연속 유통 마이크로제조된 PCR 시스템(1000)은 포트(1002와 1004)를 보유한다. 한 구체예에서, 마이크로스피어, PCR 시약, 주형 단편의 수용액이 포트(1002)를 통하여 "T"-주입기 구역(1006)으로 도입되고, 소수성 담체 용액이 포트(1004)를 통하여 "T"-주입기 구역으로 도입된다.
시스템(1000)은 채널(1014)의 입력 단부 근처에서 "T"-주입기의 하류에 배치 된 광학 센서(optical sensor, 1007)를 추가로 보유한다(도 10B). 상기 센서는 비축 광 산란(off-axis light scattering)을 검출하는 정초점 레이저 빔(focused laser beam)과 광다이오드(photodiode)를 포함할 수 있다.
상기 센서는 비드를 포함하는 거환을 선별하고 비드가 없거나 하나 초과의 비드를 포함하는 거환을 거부하도록 배치된다. 거부된 거환은 밸브(1009) 및 폐기물 포트와 채널(1011)을 통하여 시스템으로부터 배출된다. 밸브(1009)는 개방시에, 거부된 거환이 폐기물 포트(1011)를 통하여 시스템을 빠져나가도록 하는 4층 PDMS 밸브일 수 있다. 상기 밸브는 밸브 시동 포트(valve actuation port, 1013)를 통하여 시동될 수 있다. 연속 유동 시스템의 유체 저항(fluidic resistance)이 매우 크기 때문에, 메인 채널(1014)에서 밸브가 필요하지 않다.
시스템(1000)은 2-단계 PCR에 맞춰 설계되는데, 여기서 어닐링(annealing)과 신장(extension) 단계가 통합된다. 이와 같이, 상기 시스템은 2개의 온도 지역(temperature zone, 1008과 1010)을 보유하고, 액적(1012)은 채널(1014)을 통한 유동으로 이들 지역을 통과한다. 장치(1000)는 상이한 온도 지역의 온도를 모니터하기 위하여 RTD(1016) 및 연관된 RID 접촉 패드를 보유한다. 2가지-온도 PCR이후, 거환과 마이크로스피어는 출구 포트(1020)를 통하여 상기 시스템을 빠져나간다.
상기한 바와 같이, 마이크로스피어는 이중-가닥 DNA에 삽입될 때까지 형광을 나타내지 않는, TO와 같은 DNA 삽입 염료(intercalating dye)로 처리될 수 있다. 이런 이유로, 증폭된 DNA를 보유하는 마이크로스피어는 포트(1020)를 통과한 이후, 예로써, FACS 기술로 확인될 수 있다. 이후, 이들 마이크로스피어는 장치(900)와 같은 장치의 분산 채널로 도입된다(도 9A와 9B 참조). 다른 한편, 증폭된 DNA를 보유하지 않는 마이크로스피어는 제거된다.
한 구체예에서, 연속 유통 PCR 시스템(1000)은 퍼플루오르하이드로카르본 캐리어(perfluorohydrocarbon carrier)에 부유된 PCR 시약의 나노리터 액적을 이용한다(참조: Song, H., et al., "A microfluidic system for controlling reaction networks in time", Angewandte Chemie-International Edition 42, 768-772 (2003)). 마이크로스피어, PCR 시약, 주형 단편을 포함하고 혼합불가능 액체에 의해 서로 분리된 액적이 마이크로제조된 T-주입기(1006)에서 형성된다. 이후, 이들 액적은 어닐링-신장-변성 온도로 유지된, 상기 장치의 구역(1008과 1010)을 통하여 유동한다. 상이한 온도 지역(1008과 1010)에서 채널(1014)의 길이는 이들 온도에서 필요한 잔류 시간(residence time)에 기초하여 선택된다. 이들 채널의 단면적(cross-section)과 유속(flow rate)은 안정적인 액적 형성을 달성하도록 선택된다. 상기 장치의 이들 파라미터는 90초간 변성 온도에서 핫 스타트(hot start), 이후 45초간 어닐링/신장(1초간 35회의 자동-신장(auto-extension) 및 15초 변성 시간)을 달성하도록 설정될 수 있다. 최종 15회 사이클은 80초간의 일정한 어닐링/신장 시간을 갖도록 구성된다.
장치(1000)는 2개의 1.1-㎜ 두께와 10-㎝ 직경 보로플로트 유리 와이퍼(borofloat glass wafer)를 포함할 수 있다. 상기 패턴 와이퍼(patterned wafer)에서 이들 채널은 대략 210 ㎛ 너비와 대략 95 ㎛ 깊이의 D-형상 횡단면을 보유할 수 있다. 다른 와이퍼에서, Ti/Pt RTD는 상기 장치에서 상이한 지점에서 온도 기울 기(temperature gradient)를 모니터하도록 제조될 수 있다. 채널에 접근하기 위한 구멍을 뚫고, 2개의 와이퍼를 가열하고 서로 결합시켜 봉입된 채널을 형성할 수 있다. 나노포트(1002와 1004)는 PEEK 관(tubing)을 통하여 상기 장치와 마이크로-리터 주사기를 접속시키는데 이용된다. 이들 채널의 유리 표면은 Srinivasan et al., "Alkyltrichlorosilane-based self-assembled monolayer films for stiction reduction in silicon micromachines", Journal of Microelectromechanical Systems 7, 252-260 (1998)에 기술된 절차에 기초하여, lH,lH,2H,2H-퍼플루오르데실트리클로로실란에 의한 실란화(silanization)를 통하여 소수성화될 수 있다. 2개의 주사기 펌프를 이용하여 물 및 perfluorodecalin(cis와 trans의 혼합물, 95%, Acros Organics, New Jersey, USA)과 lH,lH,2H,2H-퍼플루오르옥탄올(perfluorooctanol)(Acros Organics, New Jersey, USA)의 10:1 혼합물을 각각, 0.5 ㎕/min의 유속으로 분배할 수 있다. 도 10B에서는 대략 1 액적/s 비율로 T-주입기에서 액적 형성 과정을 도시하고, 도 10C에서는 채널을 통과하고 있는 액적을 도시한다.
한 구체예에서, 이러한 기술에는 10 nL 액적에 담긴 마이크로비드가 이용된다. 처리량(throughput)은 단일 주형 분자와 단일 비드를 모두 포함하는 10개의 액적 중에서 1개의 비율로 유지된다. 수성 PCR 혼합물은 10개의 액적당 1개의 분자에 상응하는, 100 nL의 혼합물당 1개의 주형 분자가 존재하도록 제조된다. 또한, PCR 혼합물에서 마이크로비드는 평균적으로 하나의 액적당 하나의 비드에 상응하는, 100 nL의 혼합물당 하나의 농도로 존재한다. Poisson 분산에 의해 지시된 바와 같 이, 10 nL 액적 중에서 37%는 단지 하나의 마이크로비드를 포함하고, 나머지는 마이크로비드를 포함하지 않거나 2개 이상의 마이크로비드를 포함한다. 앞서 기술된 바와 같이, 각 액적은 이후, 여기에 포함된 비드의 총수를 결정하기 위하여 광학적으로 스캔된다. 액적이 단일 마이크로비드를 포함하지 않으면, 밸브(1009)가 열리고 상기 액적은 폐기된다. 액적 중에서 대략 1/3이 단일 비드를 포함하고 메인 채널로 유인된다; 따라서, 평균 유속은 1.5s마다 대략 1 액적에 상당한다. 이와 같이, 메인 채널에서 모든 액적이 단일 마이크로비드를 포함하고, 또한 10개 중에서 1개가 단일 주형 분자를 포함한다.
장치(1000)의 단부에서, 이들 액적은 포트(1020)에서 표준 모세관(standard capillary)을 통하여 미세원침관(microfuge tube)으로 수집된다. 이들 액적은 원심분리를 통하여 파괴된다. 마이크로비드는 수집되고 1X TE에서 세척되며 다시 원심분리된다. 마이크로비드는 온-칩 검출(on-chip detection)과 함께, 자동밸브(autovalving) 또는 수동밸브(active valving)에 의해 장치(900)의 열 사이클링 챔버로 유인된다. 온-칩 검출에는 마이크로스피어가 열 사이클링 챔버의 입구에 인접하여 위치하는 시점을 결정하는 광 스캐너 또는 시간 장치(time arrangement)의 이용이 포함될 수 있다. 앞서 기술된 바와 같이, 광학 스캐너는 분산 채널 내에서 마이크로스피어의 위치를 결정하기 위하여 비드 광 산란(bead light scattering)을 이용할 수 있다. 시간 장치는 분산 채널에서 유체가 압찰될 수 없다는 사실에 기초한다. 이와 같이, 분산 채널 내에서, 예로써 열 사이클링 챔버의 입구에 인접하는 마이크로스피어의 위치는 마이크로스피어가 분산 채널에 존재해온 시간으로부터 산 정될 수 있다. 이는 예로써 분산 채널로부터 96개의 입력 각각에 밸브-조절 유입(valved entrance)이 단일 공기 입력기(single pneumatic input)에 의해 시동될 수 있다는 점에서, 유익하다. 또한, 공기 입력기(pneumatic input)는 검출된 비드가 비드를 아직 보유하지 않는 반응기에 반대되는 방향으로 유동될 때까지 시동되지 않는다.
2가지-온도 PCR을 이용하여 염기서열분석 주형을 산출하는 실현가능성을 예증하기 위하여, 고온 프라이머를 설계하고 통상적인 유전자 증폭기(thermal cycler)에서 검사하였다. 2가지 프라이머, M13_2T_F 5'-TTCTGGTGCCGGAAACCAGGCAAAGCGCCA-3' Tm = 70.3℃ 및 M13_2T_R 5'- ACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCA-3'Tm = 70.7℃를 설계하여 M13 게놈으로부터 943 bp 앰플리콘을 산출하였다. 11 nL 에멀젼 구획(emulsion compartment)에서 단일 주형 분자의 농도를 근사하기 위하여, 18.75 펨토그람(femtogram)의 M13 주형을 25 ㎕ PCR 반응(1.5분간 94℃, 이후 1 s/사이클의 자동-신장으로 10초간 94℃, 30초간 70℃의 50회 사이클)에서 주기적으로 순환시켰다. 생성된 앰플리콘은 대략 40 ng/㎕의 수율로, 예상된 크기에서 단일 완전 피크이었다.
이런 시스템이 게놈 DNA를 증폭하는데 이용되는 경우에, 1X 범위(coverage)와 1000 bps의 평균 단편 크기(average fragment size)를 위하여 대략 3백만 개의 단편이 증폭되어야 한다. 2개의 상이한 단편이 단일 액적에 함께 존재할 가능성은 평균적으로 10개의 액적 중에서 1개가 단편을 보유하도록 이들 단편을 PCR 시약에 희석함으로써 0.01 이하로 감소될 수 있다. 따라서, 상기 시스템은 3천만 개의 액 적을 처리해야 한다. 이러한 장치는 대략 1.5초마다 1개의 액적을 산출하도록 설계된다. 20개의 이와 같은 장치가 동시에 시동되면, 전체 게놈이 증폭되고 한 줄의 염기서열분석 장치(900)에 접속되어 1개월 만에 1X 범위(coverage)를 산출할 수 있다.
본 발명이 특정 구체예에 관하여 도시되고 기술되긴 했지만, 당업자가 인지하는 바와 같이, 본 발명의 기술적 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 이들 개시된 구체예의 형태와 상세에서 변화가 가능하다. 가령, 앞서 기술된 구체예는 다양한 재료를 이용하여 수행될 수 있다. 이런 이유로, 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해 결정된다.
SEQUENCE LISTING <110> Mathies, Richard A. Blazej, Robert Liu, Chung Kumaresan, Palani Yeung, Stephanie H.I. <120> MICROFABRICATED INTEGRATED DNA ANALYSIS SYSTEM <130> UCALP054/B04-099-2 <140> 11/139,018 <141> 2005-05-25 <150> 60/576,102 <151> 2004-06-01 <160> 3 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Selected as an example in the study of the operation of the MINDS system <400> 1 actggccgtc gttttacaa 19 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Selected as an example in the study of the operation of the MINDS system <400> 2 ttctggtgcc ggaaaccagg caaagcgcca 30 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Selected as an example in the study of the operation of the MINDS system <400> 3 acgcgcagcg tgaccgctac acttgcca 28

Claims (44)

  1. 단지 하나의 마이크로반응기 요소(microreactor element)가 하나의 열 사이클링 챔버(thermal cycling chamber)를 통과하도록 클론 염기서열분석 주형(clonal sequencing template)의 복수 사본을 내포하는 마이크로반응기 요소를 복수의 열 사이클링 챔버에 분산시키는 분산 채널(distribution channel), 여기서 열 사이클링 신장 단편(thermal cycling extension fragment)이 마이크로반응기 요소로부터 생산되고;
    상기 신장 단편을 포획하고 농축하기 위하여, 열 사이클링 챔버에 연결된 정제 챔버(purification chamber);
    상기 신장 단편을 분석하기 위하여, 정제 챔버에 연결된 성분 분리 채널(component separation channel)을 포함하는 마이크로제조된 구조물.
  2. 제 1항에 있어서, 마이크로반응기 요소에는 클론 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로캐리어 요소가 포함되는 것을 특징으로 하는 마이크로제조된 구조물.
  3. 제 1항에 있어서, 마이크로반응기 요소는 거환(bolus) 또는 마이크로에멀젼(microemulsion) 액적(droplet)인 것을 특징으로 하는 마이크로제조된 구조물.
  4. 제 3항에 있어서, 마이크로반응기 요소에는 클론 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로스피어가 포함되는 것을 특징으로 하는 마이크로제조된 구조물.
  5. 제 1항에 있어서, 염기서열분석 주형은 DNA 또는 RNA 염기서열분석 주형인 것을 특징으로 하는 마이크로제조된 구조물.
  6. 염기서열분석을 수행하기 위한 시스템에 있어서,
    DNA 또는 RNA를 단편으로 전단하기 위한 수단;
    이들 단편을 결찰시켜 원하는 원형 산물과 오염 선형 산물의 혼합물을 형성하기 위한 수단;
    오염 선형 산물을 선택적으로 제거하기 위한 수단;
    단일 염기서열분석 주형의 복수 클론 사본을 내포하는 마이크로반응기 요소를 생산하기 위한 수단;
    어떤 마이크로반응기 요소가 염기서열분석 주형을 보유하는 지를 선택하기 위한 수단;
    염기서열분석 주형을 보유하는 선택된 마이크로반응기 요소를 열 사이클링 챔버로 분산시키기 위한 미세유체 분산 수단(microfluidic distribution means);
    단지 하나의 마이크로반응기 요소가 하나의 열 사이클링 챔버로 유동하도록 담보하기 위한 수단;
    염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로반응기 요소로부터 열 사이클링 신장 단편을 생산하기 위한, 열 사이클링 챔버를 비롯한 신장 수단(extension means);
    신장 단편을 포획하고 정제하며 농축하기 위한 정제 챔버 수단(purification chamber means);
    신장 단편을 분석하기 위한 성분 분리 수단(component separation means)을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  7. 제 6항에 있어서, 마이크로반응기 요소에는 클론 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로캐리어 요소가 포함되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  8. 제 6항에 있어서, 마이크로반응기 요소는 거환 또는 마이크로에멀젼 액적인 것을 특징으로 하는 시스템.
  9. 제 8항에 있어서, 마이크로반응기 요소에는 클론 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로스피어가 포함되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  10. 클론 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로스피어(microsphere)를 복수의 열 사이클링 챔버에 분산시키는 분산 채널;
    단지 하나의 마이크로스피어가 하나의 열 사이클링 챔버(thermal cycling chamber)로 유동하도록 담보하는, 열 사이클링 챔버의 출구 포트(exit port)에서 자동밸브(autovalve), 여기서 열 사이클링 신장 단편이 마이크로스피어로부터 생산되고;
    상기 신장 단편을 포획하고 농축하기 위하여, 열 사이클링 챔버에 연결된 정제 챔버;
    상기 신장 단편을 분석하기 위하여, 정제 챔버에 연결된 성분 분리 채널을 포함하는 마이크로제조된 구조물.
  11. 제 10항에 있어서, 마이크로스피어의 직경은 1 내지 100 마이크론인 것을 특징으로 하는 마이크로제조된 구조물.
  12. 제 11항에 있어서, 마이크로스피어의 직경은 10 마이크론인 것을 특징으로 하는 마이크로제조된 구조물.
  13. 제 10항에 있어서, 각 열 사이클링 챔버는 분리 채널과 유체 소통(fluid communication)하는 것을 특징으로 하는 마이크로제조된 구조물.
  14. 제 10항에 있어서, 염기서열분석 주형은 DNA 또는 RNA 염기서열분석 주형인 것을 특징으로 하는 마이크로제조된 구조물.
  15. 염기서열분석 주형을 내포하는 마이크로스피어를 열 사이클링 챔버에 분산시키기 위한 미세유체 분산 채널 수단;
    단지 하나의 마이크로스피어가 하나의 열 사이클링 챔버(thermal cycling chamber)로 유동하도록 담보하기 위한 자동밸브 수단;
    염기서열분석 주형을 내포하는 마이크로스피어로부터 열 사이클링 신장 단편을 생산하기 위한, 열 사이클링 챔버를 비롯한 신장 수단;
    상기 신장 단편을 포획하고 정제하며 농축하기 위한 통합된 정제 챔버 수단;
    상기 신장 단편을 분석하기 위한 성분 분리 수단을 포함하는 마이크로제조된 구조물.
  16. 제 15항에 있어서, 신장 수단은 복수의 열 사이클링 챔버를 보유하는 Sanger 신장 수단인 것을 특징으로 하는 마이크로제조된 구조물.
  17. 제 16항에 있어서, 자동밸브 수단에는 열 사이클링 챔버의 출구 포트에서 자동밸브가 포함되는 것을 특징으로 하는 마이크로제조된 구조물.
  18. 제 17항에 있어서, 정제 챔버 수단에는 열 사이클링 챔버에 연결된 정제 챔버가 포함되는 것을 특징으로 하는 마이크로제조된 구조물.
  19. 제 18항에 있어서, 성분 분리 수단은 정제 챔버에 연결된 복수의 마이크로채 널을 보유하는 모세관 집적형 전기영동 수단(capillary array electrophoresis means)인 것을 특징으로 하는 마이크로제조된 구조물.
  20. 제 15항에 있어서, 염기서열분석 주형은 DNA 또는 RNA 염기서열분석 주형인 것을 특징으로 하는 마이크로제조된 구조물.
  21. 클론 주형을 내포하는 마이크로스피어를 수용하도록 배치된 열 사이클링 챔버를 포함하는 마이크로제조된 기구에 있어서, 상기 챔버는 입구 포트(inlet port)와 출구 포트(outlet port)를 보유하고, 상기 출구 포트는 챔버에서 마이크로스피어를 트랩하고 열 사이클링 챔버로의 추가적인 유동을 차단하도록 배치된 조임 장치(constriction)를 보유하는 것을 특징으로 하는 마이크로제조된 기구.
  22. 제 21항에 있어서, 조임 장치의 모양은 원형인 것을 특징으로 하는 마이크로제조된 기구.
  23. 제 21항에 있어서, 조임 장치의 모양은 반원형인 것을 특징으로 하는 마이크로제조된 기구.
  24. 제 21항에 있어서, 첫 번째 밸브는 입구 포트와 유체 소통하는 입구 채널에 배치되고, 두 번째 밸브는 출구 포트와 유체 소통하는 출구 채널에 배치되는 것을 특징으로 하는 마이크로제조된 기구.
  25. 제 21항에 있어서, 작동 중에, 두 번째 밸브는 열 사이클링에 앞서, 마이크로스피어를 조임 장치 외부와 열 사이클링 챔버의 주요 본체 부분으로 순차적으로 이동시키기 위하여 첫 번째 밸브에 앞서 닫히는 것을 특징으로 하는 마이크로제조된 기구.
  26. 제 21항에 있어서, 열 사이클링 챔버의 출구 포트와 유체 소통하는 정제 챔버 및 성분 분리 기구와 유체 소통하는 정제 챔버의 출구 포트를 추가로 보유하는 것을 특징으로 하는 마이크로제조된 기구.
  27. 염기서열분석을 수행하기 위한 시스템에 있어서,
    DNA 또는 RNA를 단편으로 전단하기 위한 수단;
    이들 단편을 결찰시켜 원하는 원형 산물과 오염 선형 산물의 혼합물을 형성하기 위한 수단;
    오염 선형 산물을 선택적으로 제거하기 위한 수단;
    단일 염기서열분석 주형의 복수 클론 사본을 내포하는 마이크로스피어를 산출하기 위한 수단;
    어떤 마이크로스피어가 염기서열분석 주형을 보유하는 지를 선택하기 위한 수단;
    염기서열분석 주형을 보유하는 선택된 마이크로스피어를 열 사이클링 챔버에 분산시키기 위한 미세유체 분산 채널 수단;
    통계학적으로, 하나의 마이크로스피어가 하나의 열 사이클링 챔버로 유동하도록 담보하기 위한 수단;
    염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로스피어로부터 열 사이클링 신장 단편을 생산하기 위한, 열 사이클링 챔버를 비롯한 신장 수단;
    신장 단편을 포획하고 정제하며 농축하기 위한 정제 챔버 수단;
    신장 단편을 분석하기 위한 성분 분리 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  28. 제 27항에 있어서, 담보 수단(ensuring means)은 열 사이클링 챔버에서 자동밸브(autovalve), 광 검출기(optical detector), 시간 장치(timing mechanism) 중에서 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 시스템.
  29. 제 27항에 있어서, 광 검출기는 마이크로스피어로부터 산란된 광을 검출하는 광 스캐너(optical scanner)인 것을 특징으로 하는 시스템.
  30. 제 27항에 있어서, 시간 장치에는 열 사이클링 챔버의 입구에 인접하여 배치된 공기 입력기(pneumatic input)가 포함되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  31. DNA 염기서열분석을 수행하기 위한 시스템에 있어서,
    DNA를 DNA 단편으로 전단하기 위한 수단;
    DNA 단편을 결찰시켜 원하는 원형 산물과 오염 선형 산물의 혼합물을 형성하기 위한 수단;
    오염 선형 산물을 선택적으로 제거하기 위한 엑소뉴클레아제 분해 수단;
    단일 DNA 염기서열분석 주형의 복수 클론 사본을 내포하는 마이크로스피어를 산출하기 위한 에멀젼 PCR 반응 수단;
    어떤 마이크로스피어가 DNA 염기서열분석 주형을 보유하는 지를 선택하기 위한 형광 활성화 세포 분류(FACS) 수단;
    DNA 염기서열분석 주형을 보유하는 선택된 마이크로스피어를 열 사이클링 챔버에 분산시키기 위한 미세유체 분산 채널 수단;
    통계학적으로, 하나의 마이크로스피어가 하나의 열 사이클링 챔버로 유동하도록 담보하기 위한 자동밸브 수단;
    DNA 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로스피어로부터 열 사이클링 신장 단편을 생산하기 위한, 열 사이클링 챔버를 비롯한 Sanger 신장 수단;
    신장 단편을 포획하고 정제하며 농축하기 위한 통합된 정제 챔버 수단;
    신장 단편을 분석하기 위한 모세관 집적형 전기영동 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  32. 염기서열분석을 수행하는 방법에 있어서,
    DNA 또는 RNA를 단편으로 전단하고;
    이들 단편을 결찰시켜 원하는 원형 산물과 오염 선형 산물의 혼합물을 형성하고;
    오염 선형 산물을 선택적으로 제거하고;
    염기서열분석 주형의 복수 클론 사본을 내포하는 마이크로반응기 요소를 산출하고;
    어떤 마이크로반응기 요소가 염기서열분석 주형을 보유하는 지를 선택하고;
    염기서열분석 주형을 보유하는 마이크로반응기 요소를 열 사이클링 챔버에 분산시키고;
    염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로반응기 요소로부터 열 사이클링 신장 단편을 생산하고;
    신장 단편을 포획하고 농축하며;
    열 사이클링 신장 단편을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 마이크로반응기 요소에는 클론 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로캐리어 요소가 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 32항에 있어서, 마이크로반응기 요소는 거환 또는 마이크로에멀젼 액적인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 34항에 있어서, 마이크로반응기 요소에는 클론 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로스피어가 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 32항에 있어서, 분산 단계(distributing step)는 하나의 마이크로반응기 요소가 하나의 열 사이클링 챔버를 통과하도록 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36항에 있어서, 하나의 마이크로반응기 요소가 하나의 열 사이클링 챔버로 유동하도록 담보하기 위하여 열 사이클링 챔버의 출구 포트에서 자동밸브를 이용하는 단계가 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 32항에 있어서, 산출 단계(generating step)는 에멀젼 PCR 반응 또는 유통(flow through) PCR 공정으로 염기서열분석 주형의 복수 클론 사본을 산출하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 32항에 있어서, 선택 단계(selecting step)는 형광 활성 세포 분류(FACS)인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. DNA 염기서열분석을 수행하는 방법에 있어서,
    DNA를 DNA 단편으로 전단하고;
    DNA 단편을 결찰시켜 원하는 원형 산물과 오염 선형 산물의 혼합물을 형성하고;
    엑소뉴클레아제 분해로 오염 선형 산물을 선택적으로 제거하고;
    에멀젼 PCR 반응으로 DNA 염기서열분석 주형의 복수 클론 사본을 내포하는 마이크로스피어를 산출하고;
    형광 활성 세포 분류(FACS)로 어떤 마이크로스피어가 DNA 염기서열분석 주형을 보유하는 지를 선택하고;
    DNA 염기서열분석 주형을 보유하는 선택된 마이크로스피어를 열 사이클링 챔버에 분산시키고;
    통계학적으로, 하나의 마이크로스피어가 하나의 열 사이클링 챔버로 유동하도록 담보하기 위한, 열 사이클링 챔버의 출구 포트에서 자동밸브를 이용하고;
    DNA 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로스피어로부터 열 사이클링 신장 단편을 생산하고;
    신장 단편을 포획하고 정제하며 농축하고;
    열 사이클링 신장 단편을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 40항에 있어서, 포획 단계(capturing step)는 올리고뉴클레오티드 포획 매트릭스(oligonucleotide capture matrix)를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 염기서열분석에 이용되는 방법에 있어서,
    열 사이클링 챔버의 입구 포트에서, 클론 주형을 내포하는 마이크로스피어를 수용하고;
    상기 챔버의 출구 포트에서 조임 장치를 이용하여 챔버 내에서 마이크로스피어를 트랩하고 챔버로의 추가적인 유동을 차단하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 분석 방법에 있어서,
    염기서열분석 주형을 내포하는 마이크로스피어를 산출하고;
    열 사이클링 챔버로의 추가 유동이 차단되도록 상기 챔버 내에 출구 포트에서 조임 장치의 이용으로, 상기 챔버에 상기 마이크로스피어를 배치하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  44. 제 43항에 있어서, 첫 번째 밸브는 열 사이클링 챔버의 입구 포트에 배치되고, 두 번째 밸브는 열 사이클링 챔버의 출구 포트에 배치되고, 상기 두 번째 밸브는 열 사이클링에 앞서, 마이크로스피어를 조임 장치 외부와 열 사이클링 챔버의 주요 본체 부분으로 순차적으로 이동시키기 위하여 첫 번째 밸브에 앞서 닫히는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
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