KR20060127043A

KR20060127043A - 녹내장성 망막병증 및 시각신경병증의 치료용 약제

Info

Publication number: KR20060127043A
Application number: KR1020067014097A
Authority: KR
Inventors: 로버트 에이. 랜더스; 이옥 호우 팡
Original assignee: 알콘, 인코퍼레이티드
Priority date: 2003-12-22
Filing date: 2004-12-17
Publication date: 2006-12-11
Also published as: DE602004005617D1; CY1106623T1; PL1803468T3; SI1803468T1; AU2004308919B2; EP1803468B1; PT1696958E; DK1803468T3; US20110144127A1; DE602004005617T2; CA2547852A1; EP1696958A1; US20050137146A1; DK1696958T3; PT1803468E; HK1097179A1; ZA200604862B; CN1897972A; HK1110772A1; BRPI0417987A

Abstract

Nrf2 단백질 핵 전위 및 독성 대사 산물을 해독하고 제거하는 유전자 산물의 이후의 증가를 촉진하는 약제는 녹내장성 망막병증 또는 시각 신경병증망막을 치료하는 방법을 제공한다. Nrf2/ARE 경로에 작용하는 구조적으로 다양한 약제는 독성 대사산물 및 생체이물에 대한 방어를 가지며 화학적으로 다양한 세포보호 특징을 가지는 효소와 단백질의 발현을 유도한다. 약제는 마이클 추가 수용체(Michael Addition acceptor), 디페놀, 티오카바마이트, 퀴논, 1,2-디티올-3-티온, 부틸화된 하이드록시아니솔, 플라보노이드, 이소티오시아네이트, 3,5-디-tert-부틸-4-하이드록시톨루엔, 에톡시킨, 쿠마린, 그의 조합물, 또는 약리학상 활성 유도체 또는 그의 유사체와 같은 구전자기 및 산화제를 포함한다.

Description

녹내장성 망막병증 및 시각신경병증의 치료용 약제{AGENTS FOR TREATMENT OF GLAUCOMATOUS RETINOPATHY AND OPTIC NEUROPATHY}

본 발명은 녹내장과 관련된 망막병증 및 시각신경병증에 대한 예방제 및 치료 분야에 관한 것이다.

녹내장은 시각신경 손상 및 망막 신경절 세포(RGC)의 선택적 세포 자살 죽음을 포함하는 임상적 특징의 유사한 세트를 가지는 질병 중 이종 그룹으로 시야 및 시각의 진행적 상실을 야기한다. 안구 내의 압력(IOP)의 비정상적인 증가는 녹내장의 대부분 유형과 관련되어 있다. 단지 가능한 치료는 약제 또는 수술 중 하나로 IOP를 낮추는 것이다. 낮은 IOP는 어떤 형태의 녹내장의 진행을 늦추고 이들의 손상 효과를 늦추는데 효과적이다. 그럼에도 불구하고, 녹내장 환자의 시야 손실이 항상 IOP와 상관 있지 않으며, 낮은 IOP만으로 질병 진행 과정을 완전하게 멈출 수는 없다. 이는 압력이 녹내장성 망막병증 및 시각 신경병증의 유일한 원인이 될 수 없다는 것과 관련된다. 여기에는 추가 메커니즘이 질병 진행 과정에 기여할 것이다. 녹내장성 망막병증은 통상적으로 망막 내의 기능성 장애 또는 병리학적 변화, 특히 PGC의 죽음로 이해되며 이는 녹내장에 걸린 환자 또는 동물에서 발견된다. 녹내장성 시각 신경병증은 RGC의 액손을 통과하는 시각 신경 내의 기능성 장애 또는 병리학적 변화를 의미한다.

성인의 망막을 통한 단면조사 결과 근위 또는 가장 안쪽 부위(유리체 쪽)에서부터 말초 또는 가장 바깥쪽 지역(맥락막 쪽)에 이르는 방향으로 나열된 하기 세포층이 나타낸다:

내경계막,

시각 섬유층,

신경절 세포층,

내얼기층,

내핵층,

외얼기층,

외핵층,

외경계막,

간상체 및 추상체의 내절,

간상체 및 추상체의 외절,

망막 색소 상피, 및

맥락막모세혈관층.

망막 색소 상피 및 맥락막모세혈관층은 맥락막 가까이에 있는 망막 뒤에서 발견되며, 내경계막은 유리체 쪽에 가까이 있다. 신경절 세포층은 광수용의 신호를 수집하고 신호를 시각 신경에서 뇌를 통과하는 유수 엑손을 통해 보낸다. 신경절 세포들은 녹내장에 걸릴 위험에 있는 세포이다.

RGC의 죽음에 기여하는 것으로 제시된 분자 메커니즘은 글루타메이트 독성, 신경향성 요소의 위축, 혈관 이상(허혈), 반응 신경아교증, 및 독성 유도된 산화질소를 포함한다. 그러나 이렇게 제안된 메커니즘은 이 분야의 연구원에 의해 통상적으로 받아들여지지 않는다.

WO 03/051313으로 출원된 Gao, X. 등의 PCT 특허 출원 제 PCT/US02/40457은 인간 망막 색소 상피 세포 내의 설포라페인에 의한 2차 해독 효소의 유도에 대해 알려주고 있다. Zhang, Y. 등에 의한 미국 특허 출원 번호 2002/0091087는 척수 조직, 알츠하이머병, 및 근위축성 측삭 경화증의 글루타티온 또는 2차 해독 효소를 증가시키는 화합물, 설포라페인을 통한 신경변성질환의 치료에 대해 알려주고 있다. 신경절 세포는 뉴런이고 망막 색소 상피 세포는 뉴런이 아니라는 점에서 망막 색소 신경절 세포 및 신경절 세포는 다르다. 또한, 특정 치료상 약제에 대한 망막과 같은 안구 조직의 생물학적 반응을 척수 조직 또는 뇌 조직에의 생물학적 반응으로부터 예측할 수 없다. 인용된 출원은 녹내장 내의 망막 신경절 세포(RGC) 및 시각신경병증의 손실용 치료 또는 보호를 해결하지 못했다.

녹내장성 망막병증 및 시각신경병증을 다루는 항-녹내장 치료 방법은 통상적으로 받아들여지지 않는다. 건강상 녹내장의 영향, 및 이전 치료 방법의 부적합성의 관점에서, 녹내장성 망막병증 및 시각신경병증을 해결하는 개선된 치료 방법을 가지는 것이 바람직하다.

[본 발명의 요약]

본 발명에 따라, Nrf2 단백질의 핵 전위 및 독성 대사 산물을 해독하고 제거하는 유전자 산물의 이후의 증가를 촉진하는 약제는 망막 신경절 세포의 손실 및 신각 신경에 대한 녹내장성 상해를 지연하거나 예방하는 보호상 또는 치료상 효과를 제공한다. 여기에서 사용된 "Nrf2 단백질 핵 전위에 대한 촉진 활성"은 핵으로의 Nrf2의 운반 또는 가능성을 증진시키는 약제를 의미한다. 핵으로의 Nrf2 단백질의 전위는 독성 대사 산물을 해독하고 제거하는 유전자 산물의 발현의 이후 증가를 가능하게 한다. 본 발명의 방법은 Nrf2 단백질 핵 전위에 대한 촉진 활성을 가지는 약제 및 허용가능한 담체를 포함하는 유효량의 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하는 대상의 녹내장성 망막병증 및 시각신경병증용 치료 방법을 제공한다. 대상은 녹내장성 망막병증 및 시각 신경병증으로 발전할 위험에 있거나 녹내장성 망막병증 및 시각신경병증의 증상을 가질 수 있다.

본 발명의 Nrf2 단백질의 핵 전위 및 독성 대사 산물을 해독하고 제거하는 유전자 산물의 이후의 증가를 촉진하는 약제는 마이클 추가 수용체(Michael Addition acceptor), 디페놀, 티오카바마이트, 퀴논, 1,2-디티올-3-티온, 부틸화된 하이드록시아니솔, 플라보노이드, 이소티오시아네이트, 3,5-디-tert-부틸-4-하이드록시톨루엔, 에톡시킨, 3-하이드록시쿠마린, 그의 조합물, 또는 그의 약리작용 활성 유도체 또는 유사체를 포함할 수 있다. 하나의 구체예에서, 약제는 설포라페인과 같은 이소티오시아네이트, 또는 그의 약리학상 활성 유도체를 포함한다. 다른 구체예에서, 약제는 올티프라즈와 같은 1,2-디티올-3-티온, 또는 그의 약리학상 활성 유도체를 포함한다.

Nrf2 단백질의 핵 전위 및 독성 대사 산물을 해독하고 제거하는 유전자 산물의 이후의 증가를 촉진하는 약제의 투여는 안구내 주입, 서방성 전달 기구의 이식, 또는 국소, 경구 또는 비강 내 투여, 전신 주입, 또는 다른 전신 투여가 될 수 있다.

본 발병 방법의 다른 구체예에서, 대상은 녹내장성 망막병증 및 시각 신경병증으로 진단받았고, 다른 구체예에서 대상은 녹내장성 망막병증 및 시각신경병증의 증상을 갖는다.

[본 발명의 상세한 설명]

본 발명은 녹내장성 망막병증 및 시각신경병증 치료 방법으로 Nrf2 단백질의 핵 전위 및 독성 대사 산물을 해독하고 제거하는 유전자 산물의 이후의 증가를 촉진하는 약제의 용도에 관한 것이다.

여기에서 사용되는 "녹내장성 망막병증 및 시각신경병증 치료"의 용어는 이들의 발달을 지연 또는 예방, 이들의 진행 억제, 또는 녹내장성 망막병증 또는 시각신경병증 또는 이들의 증상의 경감을 의미한다. Nrf2 단백질의 핵 전위 및 독성 대사 산물을 해독하고 제거하는 유전자 산물의 이후의 증가를 촉진은 시각 신경의 보호 및 망막 신경절 세포의 보호를 제공한다.

Nrf2의 핵 전위는 어떤 구전자기 및 산화제에 노출된 세포 내에서 유도된다. Nrf2의 핵 전위로 인해 유도된 유전자는 구전자기에 대한 보호를 향상시키고, 손상된 단백질의 복구 또는 분해를 증진시키는 해독 효소를 만든다. 이런 해독 효소의 유도는 전사 수준에서 조절되며, 특정 증강자, 항산화제 반응 요소 또는 유전자 인코딩된 효소의 프로모터에서 발견되는 ARE에 의해 매개된다. ARE의 전후 서열, 화학적 유도인자 성질, 및 세포 형태는 특정 유전자 내의 증강자의 활성에 영향을 준다.

전사 인자 Nrf2는 전사 인자 페밀리의 맴버이고 항산화제 반응 요소(ARE)-매개된 유전자 발현의 상향조절에 이용된다. Nrf2는 산화 스트레스 신호에 대한 반응 내에서 또는 구조적으로 유전자 전사를 활성화하는 프로모터의 ARE(항산화제 반응 요소)지역에 결합에 의한 유전자 발현을 유도한다. Nrf2는 정상 상태 하에서 액틴 세포 골격에 고정된 세포질 단백질인 억제 단백질 Keap1에 의해 결합되어 세포질에 존재한다고 여겨진다. 이론에 얽매이게 되는 것을 원하지 않더라도, 발명가는 Nrf2 단백질 핵 전위에 대한 촉진 활성을 가지는 약제가 Nrf2과 상호작용하는 세포질 인자 Keap1의 시스테인이 풍부한 조절 지역과 경쟁할 수 있다는 것을 믿었다(DinkovaKostova, A.T., et al., Proc Natl Acad Sci, USA, 99:11908-11913(2002)). 설포라페인과 같은 어떤 화합물에 의한 Nrf2-Keap1 복합체의 분열은 핵으로 전위하기 위해 Nrf2가 유리될 것이며, 이는 핵에서 ARE-조절된 유전자 발현의 유도를 일으키는 유전자의 ARE 지역에서 다른 전사 인자(즉, Maf, c-Jun 등)와 이질이합체할 수 있다.

이런 Nrf2/ARE 경로에 의해 발현된 효소 및 단백질은 화학적으로 다양한 세호 보호 특징을 가지고있으며, 독성 대사물질 및 생체 이물에 대한 방어이다. Nrf2/ARE 경로를 통해 발현되는 것으로 알려진 효소 및 단백질은 글루타티온-S-전이효소, UDP-글루쿠로노실전이효소(glucuronosyltransferase), NADP(H) 퀴논 산화환원효소, γ-글루타밀시스테인 합성효소, 샤프론/스트레스 반응 단백질, 및 유비퀴틴/프로테아좀 단백질을 포함한다.

Nrf2 단백질 핵 전위에 대한 촉진 활성을 갖는 약제는 하기의 예를 포함한다:

디에닐 말레이트 또는 디메틸푸마레이트와 같은 마이클 추가 수용체(Michael Addition acceptor)(예를 들어, α,β-불포화된 카보닐 화합물);

레스베라트롤과 같은 디페놀,

2(3)-tert-부틸-4-하이드록시아니솔과 같은 부틸화된 하이드록시아니솔 ,

피롤리딘디티오카바마이트와 같은 티오카바마이트,

tert-부틸-하이드로퀴논과 같은 퀴논,

설포라페인과 같은 이소티오시아네이트, 그의 전구물질 글루코시놀레이트, 글로코라파닌, 또는 페네틸 이소티오시아네이트(PEITC),

올티프라즈와 같은 1,2-디티올-3-티온,

에톡시킨,

3-하이드록시쿠마린과 같은 쿠마린,

케르세틴 또는 커큐민과 같은 플라보노이드,

디아릴 설피드,

인돌-3-카르비놀,

에피겔로-3-카테킨 겔레이트,

엘라직 산,

그의 조합, 또는 그의 약리학상 활성 유도체 또는 그의 유사체.

마이클 추가 수용체(Michael Addition acceptor)는 전자 끄는기(electron withdrawing group)에 인접한 알켄을 갖는 분자이다. 전자 끄는기는 통상적으로 또한 카르보닐이지만, 니트릴 또는 니트로 그룹이 될 수 있다. 비록 화학적으로 다양하지만, 이러한 화합물은 구전자기이고 친핵성 설프하이드릴기와 반응하는 능력을 가진다. "그의 약리학상 활성 유도체"는 Nrf2 단백질 핵 전위에 대한 촉진 활성을 가지는 상기 화합물 및 그로부터 유도가능한 어떤 것 및 예를 들어, 에테르, 아미드, 또는 그의 염이 될 수 있는 것과 구조적으로 관련된 약제이다. "약리학상 그의 활성 유사체"는 Nrf2 단백질 핵 전위에 대한 촉진 활성을 가지는 상기 화합물의 어느 것과 구조적으로 유사한 약제이나, 예를 들어, 다른 원소의 원자에 의한 원자 하나의 치환 또는 특정 기능기의 존재 하에서와 같은 조성물 내에서는 약간 차이가 있다. 하나의 구체예에서, 본 발명은 녹내장성 망막병증 및 시각신경병증에 대한 치료 방법 내에서 설포라페인, 올티프라즈, 약리학상 그의 활성 유사체, 또는 약제학적 그의 허용가능한 염을 제공한다.

설포라페인(Product 번호. S6317, Sigma-Aldrich)는 예를 들어, 퀴논 환원효소, 글루타티온-S-전이효소 및 글루타티온 환원효소를 유도하는 것으로 공지되어 있다. 효소 유도는 인간 성인 망막 색소 상피 세포를 포함하는 다양한 세포주(cell line)에서 관찰된다(Zhang, Y. 등., Proc Natl Acad Sci, USA, 89:2399-2403(1992)). 설포라페인 유사체는 예를 들어, 6-(이소티오시아나토-2-헥사논), 엑소-2-아세틸-6-이소티오시아나토노보네인, 엑소-2-(이소티오시아나토-6-메틸설포닐노보네인), 6-이소티오시아나토-2-헥사놀, 1-(이소티오시아나토-4-디메틸포스포닐부탄, 엑소-2-(1-하이드록시에틸)-5-)이소티오시아나토노보네인, 엑소-2-아세틸-5-이소티오시아나토노보네인, 1-(이소티오시아나토-5-메틸설포닐펜탄), 시스-3-(메틸설포닐)(사이클로헥실메틸이소티오시아네이트) 및 트랜스-3-(메틸설포닐)(사이클로헥실메틸이소티오시아네이트)를 포함한다.

투여 방법: 본 발명의 약제는 이 분야의 숙련된 자에 의해 잘 공지된 기술을 사용하여 안구에 (예를 들어: 국소 안구 점적제 또는 연고; 맹장 내 또는, 공막 또는 안구 내에 인접하게 이식된 서방성 장치(slow release device); 안구 주위, 결막, 서브-테논(sub-Tenons), 전방 내, 유리체 내 또는 소관 내의 주사) 또는 전신으로(예를 들어: 구강, 정맥내, 피하 또는 근육 내 주사; 비경구적, 피부 또는 비강 전달) 직접 전달될 수 있다. 또한 본 발명의 약제가 안구 내 투입 또는 이식 장치로 제제화될 수 있다는 것을 알게 되었다.

대상: 여기에 기재된 녹내장성 망막병증 또는 시각신경병증 치료를 받는 대상은 녹내장성 망막병증 또는 시각신경병증으로 발전할 위험에 있거나 녹내장성 망막병증 또는 시각신경병증의 증상을 갖는 인간 또는 다른 동물이 될 수 있다.

제제 및 복용량: 본 발명의 약제는 적절한 안구 담체 내에 용액, 현탁액, 또는 에멀젼(분산)으로 투여될 수 있다. 하기는 본 발명에 의해 구체화된 가능한 제제의 예이다.

	양(중량%)
Nrf2 단백질 핵 전위 촉진 약제	0.01 내지 5; 0.01 내지 2.0; 0.5 내지 2.0
하이드록시프로필메틸셀룰로오스	0.5
소듐 클로라이드	.8
벤잘코늄 클로라이드	0.01
EDTA	0.01
NaOH/HCl	qs pH 7.4
정제수	qs 100%

	양(중량%)
Nrf2 단백질 핵 전위 촉진 약제	0.00005 내지 0.5; 0.0003 내지 0.3; 0.0005 내지 0.03;0.001
인산 완충 식염수	1.0
벤잘코늄 클로라이드	0.01
폴리솔베이트80	0.5
정제수	qs 100%

	양(중량%)
Nrf2 단백질 핵 전위 촉진 약제	0.001
단염기 소듐 포스페이트	0.05
이염기 소듐 포스페이트 (무수)	0.15
소듐 클로라이드	0.75
디소듐 EDTA	0.05
크레모포 EL	0.1
벤잘코늄 클로라이드	0.01
NaOH 및/또는 HCl	pH 7.3 내지 7.4
정제수	qs 100%

	양(중량%)
Nrf2 단백질 핵 전위 촉진 약제	0.0005
인산 완충 식염수	1.0
하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린	4.0
정제수	qs 100%

다른 구체 예에서, 안구 조성물은 안구 내 농도가 약 0.1 내지 100 나노몰(nM) 또는, 다른 구체예에서는 1 내지 10nM을 제공하도록 제제화된다. 20 마이크로몰 이하의 혈청 농도 최고점은 전신 투여용으로 수득될 수 있다. 국소 조성물은 숙련된 임상의의 일반적인 재량에 따라 하루에 한번 내지 4번 눈의 표면에 투여된다. 제제의 pH는 4 내지 9 또는 4.5 내지 7.4가 되어야 한다. 전신성 제제는 예를 들어, 독성 대사 산물을 해독하고 제거하는 유전자 산물의 이후의 증가 및 Nrf2 단백질의 핵 전위를 촉진하는 약제의 약 10 내지 1000mg, 약 10 내지 500mg, 약 10 내지 100mg 또는 125mg을 포함할 수 있다.

"유효량"은 Nrf2 단백질의 핵 전위 및 독성 대사 산물을 해독하고 제거하는 유전자 산물의 이후의 증가를 촉진하는 약제의 양을 의미한다. 이와 같은 유전자 발현의 유도는 다른 독성 대사 산물뿐 아니라 반응 구전자기의 독성에 대한 방어를 제공한다. 그러므로, Nrf2 단백질의 핵 전위 및 독성 대사 산물을 해독하고 제거하는 유전자 산물의 이후의 증가를 촉진하는 약제는 세포독성에 대한 보호를 제공한다. 이와 같은 보호는 녹내장성 시각신경병 또는 녹내장성 망막병증으로 발전할 위험에 있는 대상의 증상의 발병을 예방하거나 지연할 수 있다. 제제의 유효량은 예를 들어, 대상의 나이, 인종 및 성, 또는 시각 신경병증의 심각성과 같은 요소에 따라 달라질 수 있다. 한 구체예에서, 약제는 눈에 국소적으로 투여되고 치료상 복용량이 망막 신경절세포에 도달되어 망막병증 또는 시각 신경병 진행을 개선한다.

정밀 요법(precise regimen)은 임상의의 재량에 의존하지만, 형성된 용액 또는 용액은 바람직하게는 눈에 각각 하루에 한번 내지 네번 각각의 용액을 한 방울씩 또는 임상의사의 지시에 따라 투여된다.

허용가능한 담체 : 안구에 허용가능한 담체는 안구에 대한 자극이 없도록 최대한 적게 자극을 야기하며, 필요한 경우 적절하게 보존을 제공하고 균일 용량(homogenous dosage) 내의 본 발명의 Nrf2 단백질의 핵 전위 및 독성 대사 산물을 해독하고 제거하는 유전자 산물의 이후의 증가를 자극하는 약제를 전달하는 하나 이상의 담체를 의미한다. 안구 전달을 위해, Nrf2 단백질의 핵 전위 및 독성 대사 산물을 해독하고 제거하는 유전자 산물의 이후의 증가를 촉진하는 약제는 안과학적으로 허용가능한 보존제, 공-용매(co-solvent), 계면활성제, 점성 증강자, 투과 증강자, 완충제, 소듐 클로라이드, 또는 물과 결합할 수 있어 수성, 무균 안구 현탁액, 용액, 점성 또는 반-점성 겔 또는 고체 또는 연고와 같은 반고체 조성물의 다른 유형을 형성한다. 안구 용액 제제는 생리학적으로 허용가능한 등장성 수성 완충액에 약제를 용해시켜 제조될 수 있다. 또한, 안구 용액은 약제 용해를 도와주는 안구학적으로 허용가능한 계면 활성제를 포함할 수 있다. 하이드록시메틸 셀룰로오스, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등 점성 형성 화합물은 화합물의 유지(retention)를 증진시키기 위해 본 발명에의 조성물에 첨가될 수 있다.

무균 연고 제제를 제조하기 위해, Nrf2 단백질의 핵 전위 및 독성 대사 산물을 해독하고 제거하는 유전자 산물의 이후의 증가를 촉진하는 약제는 광유, 액상 라놀린(liquid lanolin), 또는 흰색 페트롤라툼과 같은 적합한 매개체에서 보존제와 결합된다. 무균 안구 겔 제제는 다른 안구 제제에 대한 당 업계에 공지된 방법에 따라, 예를 들어, CARBOPOL^®-940(BF Goodrich, Chalotte, NC)의 조합하여 제조한 친수성 염기 내에서 약제에 현탁시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, VISCOAT^®(Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, TX)는 안구내 주사용으로 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 조성물은 안구내에 본 발명의 약제가 적게 투과될 때, CREMOPHOR^®(시그마 알드리치, St. Louis, MO) 및 TWEEN^®80(폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노라우레이트, 시그마 알드리치)과 같은 투과 증강제를 포함할 수 있다.

[도의 간략한 설명]

도는 배양한 성숙한 쥐의 망막 신경절 세포 내의 글루타메이트-유도된 독성에 대한 설포라페인의 효과를 보여준다. 세포를 지정된 화합물로 3일 동안 처리하였다. 생존률은 Thy-1-포지티브 건강한 세포를 계산하여 측정하였다. 별표는 Dunnett 테스트 후, 그룹 사이 분산의 한가지 방법 ANOVA 분석에 의해 측정된 대조군 값과 상당히 다름을 보여준다.

실시예 1 : Nrf2 단백질의 핵 전위에 대한 촉진 활성을 가지는 약제

보빈(bovine) 대동맥 상피 세포(BAEC, VEC Technologies, Rensselaer, NY)와 같은 혈관 상피 세포를 Nrf2 단백질의 핵 전위에 대한 촉진 활성을 가지는 약제를 결정하는데 사용하였다. 예를 들어, 보빈 대동맥 상피 세포의 융합성 단층을 24시간 이하 동안 1%의 태아 보빈 혈청과 함께 Dulbecco 제조된 Eagle 배지에서 후보 약제(candidate agent)에 노출시켰다. 세포 용해질, 세포질 추출물, 및 핵 추출물을 제조한 후에, 이뮤노블롯(immunoblotting)을 수행하였고, Buckley의 B.J., 등에 의해 기재된 것처럼 정량화하였다(Biochem Biophys Res Commum, 307:973-979(2003)). 약제를 처리하지 않은 대조군 세포와 비교하였을 때 핵 부분에서 발견된 Nrf2의 양을 증가시키는 약제를 실시예 2에 기재된 것처럼 망막 신경절 세포의 독성 에세이 내의 활성도를 그 후에 테스트하였다.

실시예 2 : Nrf2 단백질의 핵 전위에 대한 촉진 활성을 가지는 약제에 의한 쥐 망막 신경절세포의 보호

배양된 쥐 신경 망막 세포를 1내지 24시간 동안 Nrf2 단백질의 핵 전위를 촉진시키는 약제와 혼합한 후에, 혼합한 것을 페록사이드에 노출시켰다. 신경 망막 세포의 생존률은 페록사이드 없이 배양한 대조군과 비교했을 때 약제가 산화제로부터의 보호를 제공하는 것을 보여준다.

신생아 쥐 신경 망막 세포를 분리하여 Pang, I-H. 등에 기재된 것처럼 배양하였다(Invest Ophthalmol Vis Sci 40:1170-1176(1999)). "신경 망막"은 망막 색소 상피가 없는 망막을 의미한다. 따라서, 배양은 망막 세포 형태의 혼합된 집단을 포함한다. 간략하게, 2 내지 5일 된 신생아 Sprague-Dawley 쥐를 마취시키고 2mm 중앙선 열림(midline opening)을 꼬리에서 가로정맥굴의 두피 내에 만들었다. 망막 신경절 세포를 형광색소, Di-I(1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 퍼클로레이트), 균일한 라벨 뉴런인 친지질성 추적자(Molecular Probe, Eugene, OR)로 선택적 역방향 라벨링하였다. 주사 바늘의 끝(30ga)을 머리뼈 위의 아래쪽에 6mm 주입하였고, 5㎕ Di-I 용액을 둔덕 상부에 주사하였다. Di-I 용액에 90% 에탄올 및 10% 디메틸설폭사이드 내의 3mg/mL Di-I을 넣었다. 상처를 유연한 콜로디온을 적가하여 덮었다.

Di-I 주사한지 2 내지 4일에, 쥐를 마취시키고 단두로 희생시켰다. 쥐의 눈을 적출하고 Dulbecco에서 제조한 Eagle의 배지: 영양 혼합물 F12(1:1; DMEM/F12, Gibco, Gaithersburg, MD)에 넣었다. 각각의 눈에서 망막을 박리시키고 분리시켰다. 망막세포를 37℃에서 25분 동안 DMEM/F12 5ml 내의 10mg 파파인(34 units/ml), 2mg DL-시스테인(3.3mM) 및 2mg 보빈 혈청 알부민(0.4 mg/mL) 용액으로 해리시킨 후에 5mL RGC 배지(10% 태아 보빈 혈청, 4mM 글루타민, 100 units/mL 페니실린 및 100㎍/ML 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM)로 3번 씻었다. 망막 조각을 세포가 분산될 때까지 일회용 피펫에 여러번 통과시켜 조각으로 만들었다. 세포 현탁액(약 3X10⁶cells/mL)을 폴리-D-리신으로 코팅된 유리 바닥 배양 접시에 두었다. 이 세포를 37℃의 95% 대기/5% CO₂에서 배양하였다.

Nrf2 단백질 핵 전위에 대한 촉진 활성을 가지는 약제의 보호 효과를 배양을 1 내지 24시간 동안 후보 약제와 처리하여 결정한 후에 H₂O₂ 300μM을 첨가하였다. 배양한 RGCs를 Di-I 형광으로 확인하였다. 대조군과 비교했을 때 망막 신경절 세포의 생존률을 향상시키는 약제는 세포독성 손상으로부터의 RGC 보호를 제공하며 녹내장성 시각 신경병증 치료용으로도 유용하다.

실시예 3 : 설포라페인에 의한 글루타메이트-유도된 독성으로부터의 망막 신 경절 세포의 보호

성숙한 Sprague-Dawley 쥐를 CO₂ 질식으로 안락사시켰다. 이들의 눈을 적출하고 NEUROBASAL^TM 배지에 두었다(Gibco, Gaithersburg, MD). 각각의 눈 망막을 박리시키고 분리시켰다. 망막 세포를 37℃에서 25분 동안 5ml의 NEUROBASAL^TM 배지의 내의 10mg 파파인, 2mg DL-시스테인 및 2mg 보빈 혈청 알부민을 포함한 파파인 용액 5mL과 20개의 망막을 결합한 것으로 해리시킨 후에 실시예 2에 기재된 것 및 1% 어린 송아지 혈청이 첨가된 5mL RGC 배지(NEUROBASAL^TM 배지)로 3번 씻었다. 망막 조각을 세포가 분산될 때까지 불로 연마한 일회용 피펫에 여러번 통과시켜 조각으로 만들었다. 세포 현탁액을 폴리-D-리신- 및 라미닌-코팅된 8-웰(well) 방으로 이뤄진 배양 슬라이드에 두었다. 글루타메이트 및 설포라페인을 갖는 글루타메이트를 할당된 웰에 첨가하였다. 이후에 세포를 3일 동안 37℃의 95% 대기/5% CO₂에서 배양하였다.

인큐베이션 기간의 마지막에, 세포를 고정시키고 Thy-1, RGC 표지, 면역세포화학으로 라벨하였다. 세포 생존률은 각각의 웰 내의 Thy-1-포지티브 건강한 세포수를 손으로 세어서 정량화하였다. 결과 데이타는 도에 나타내었으며, 이 데이타는 3일 동안 글루타메이트(100μM)를 RGC에 처리시에 생존 세포를 40 내지 60% 감소시킨 것을 보여준다. 설포라페인(0.5μM)으로 처리된 세포는 이와 같은 독성을 예방하였다. 이와 같은 결과는 설포라페인이 망막 신경절세포의 손상을 보호한다는 것 을 보여준다.

여기에 기재된 참조 문헌은(실시예 또는 여기서 기재된 내용의 세부사항을 보충하는 정도까지) 명확하게 참조로 포함된다.

본 개시의 측면에서, 여기에 기재된 구체예의 변화를 알아낸 당 업계의 숙련자는 본 발명의 정신(spirit) 및 범위로부터 벗어나지 않고 제조할 수 있다. 여기에 개시된 모든 구체예는 본 개시의 측면에서 과도한 실험 없이 실시되고 제조될 수 있다. 본 발명의 총 범위는 기재 및 그의 구체예와 동일하게 시작한다. 이 명세서는 자격이 부여된 본 발명에 대한 보호의 총 범위를 지나치게 좁게 구성하지 않는다.

다르게 나타내지 않는 한, 여기에 사용된 용어는 "하나", "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미한다.

Claims

Nrf2 단백질의 핵 전위에 대한 촉진 활성을 갖는 약제 및 허용가능한 담체를 포함하는 유효량의 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 대상의 녹내장성 망막병증 또는 시각신경병증을 치료하는 방법.
제 1항에 있어서, 대상이 녹내장성 망막병증 및 시각신경병증으로 발전할 가능성이 있는 상태인 방법.
제 1항에 있어서, 대상이 녹내장성 망막병증 및 시각신경병증의 증상을 갖는 방법.
제 1항에 있어서, 약제가 마이클 추가 수용체(Michael Addition acceptor), 디페놀, 티오카바마이트, 퀴논, 1,2-디티올-3-티온, 부틸화된 하이드록시아니솔, 플라보노이드, 이소티오시아네이트, 3,5-디-tert-부틸-4-하이드록시톨루엔, 에톡시킨, 쿠마린, 그의 조합물, 또는 그의 약리학상 활성 유도체 또는 유사체를 포함하는 방법.
제 4항에 있어서, 약제가 이소티오시아네이트, 또는 그의 약리학상 활성 유도체를 포함하는 방법.
제 5항에 있어서, 이소티오시아네이트가 설포라페인, 또는 그의 약리학상 활성 유도체를 포함하는 방법.
제 4항에 있어서, 약제가 1,2-디티올-3-티온, 또는 그의 약리학상 활성 유도체를 포함하는 방법.
제 7항에 있어서, 1,2-디티올-3-티온이 올티프라즈, 또는 그의 약리학상 활성 유도체를 포함하는 방법.
제 4항에 있어서, 약제가 플라보노이드, 또는 그의 약리학상 활성 유도체를 포함하는 방법.
제 9항에 있어서, 플라보노이드가 케르세틴, 또는 그의 약리학상 활성 유도체를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 투여가 안구내 주입, 서방성 전달 기구의 이식, 또는 국소, 경구 또는 비강 내 투여에 의한 것인 방법.
제 1항에 있어서, 투여가 안구내 투여에 의한 것인 방법.
대상이 녹내장성 망막병증 또는 시각신경병증이 있는지 진단하고, Nrf2 단백질의 핵 전위에 대한 촉진 활성을 갖는 약제 및 허용가능한 담체를 포함하는 유효량의 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 대상의 녹내장성 망막병증 및 시각신경병증을 치료하는 방법.
제 13항에 있어서, 약제가 마이클 추가 수용체, 디페놀, 티오카바마이트, 퀴논, 1,2-디티올-3-티온, 부틸화된 하이드록시아니솔, 플라보노이드, 이소티오시아네이트, 3,5-디-tert-부틸-4-하이드록시톨루엔, 에톡시킨, 쿠마린, 그의 조합물, 또는 그의 약리학상 활성 유도체 또는 유사체를 포함하는 방법.
제 14항에 있어서, 약제가 이소티오시아네이트, 또는 그의 약리학상 활성 유도체를 포함하는 방법.
제 15항에 있어서, 이소티오시아네이트가 설포라페인, 또는 그의 약리학상 활성 유도체를 포함하는 방법.
제 14항에 있어서, 약제가 1,2-디티올-3-티온, 또는 그의 약리학상 활성 유도체를 포함하는 방법.
제 17항에 있어서, 1,2-디티올-3-티온이 올티프라즈, 또는 그의 약리학상 활성 유도체를 포함하는 방법.
제 13항에 있어서, 투여가 안구내 주입, 서방성 전달 기구의 이식, 또는 국소, 경구 또는 비강 내 투여에 의한 것인 방법.
제 13항에 있어서, 투여가 안구내 투여에 의한 것인 방법.
대상의 녹내장성 망막병증 또는 시각신경병증의 치료용 약제의 제조시, Nrf2 단백질의 핵 전위에 대한 촉진 활성을 갖는 약제 및 허용가능한 담체를 포함하는 유효량의 조성물의 용도.
제 21항에 있어서, 대상이 녹내장성 망막병증 및 시각신경병증으로 발전할 가능성이 있는 상태인 용도.
제 21항에 있어서, 대상이 녹내장성 망막병증 및 시각신경병증의 증상을 갖는 용도.
제 21항에 있어서, 약제가 마이클 추가 수용체, 디페놀, 티오카바마이트, 퀴논, 1,2-디티올-3-티온, 부틸화된 하이드록시아니솔, 플라보노이드, 이소티오시아 네이트, 3,5-디-tert-부틸-4-하이드록시톨루엔, 에톡시킨, 쿠마린, 그의 조합물, 또는 그의 약리학상 활성 유도체 또는 유사체를 포함하는 용도.
제 24항에 있어서, 약제가 이소티오시아네이트, 또는 그의 약리학상 활성 유도체를 포함하는 용도.
제 25항에 있어서, 이소티오시아네이트가 설포라페인, 또는 그의 약리학상 활성 유도체를 포함하는 용도.
제 24항에 있어서, 약제가 1,2-디티올-3-티온, 또는 그의 약리학상 활성 유도체를 포함하는 용도.
제 27항에 있어서, 1,2-디티올-3-티온이 올티프라즈, 또는 그의 약리학상 활성 유도체를 포함하는 용도.
제 24항에 있어서, 약제가 플라보노이드, 또는 그의 약리학상 활성 유도체를 포함하는 용도.
제 29항에 있어서, 플라보노이드가 케르세틴, 또는 그의 약리학상 활성 유도체를 포함하는 용도.
제 21항에 있어서, 약제가 안구내 주입용, 서방성 전달 기구의 이식용, 또는 국소, 경구 또는 비강 내 투여용으로 제조된 용도.
제 21항에 있어서, 약제가 안구내 투여용으로 제조된 용도.
Nrf2 단백질의 핵 전위에 대한 촉진 활성을 갖는 약제의 유효량, 및 허용가능한 담체를 포함하는, 대상의 녹내장성 망막병증 또는 시각 신경병증 치료용 조성물.
제 33항에 있어서, 대상이 녹내장성 망막병증 및 시각 신경병증으로 발전할 가능성이 있는 상태인 조성물.
제 33항에 있어서, 대상이 녹내장성 망막병증 및 시각 신경병증의 증상을 가지는 조성물.
제 33항에 있어서, 약제가 마이클 추가 수용체, 디페놀, 티오카바마이트, 퀴논, 1,2-디티올-3-티온, 부틸화된 하이드록시아니솔, 플라보노이드, 이소티오시아네이트, 3,5-디-tert-부틸-4-하이드록시톨루엔, 에톡시킨, 쿠마린, 그의 조합물, 또는 그의 약리학상 활성 유도체 또는 유사체를 포함하는 조성물.
제 36항에 있어서, 약제가 이소티오시아네이트, 또는 그의 약리학상 활성 유도체를 포함하는 조성물.
제 37항에 있어서, 이소티오시아네이트가 설포라페인, 또는 그의 약리학상 활성 유도체를 포함하는 조성물.
제 36항에 있어서, 약제가 1,2-디티올-3-티온, 또는 그의 약리학상 활성 유도체를 포함하는 조성물.
제 39항에 있어서, 1,2-디티올-3-티온이 올티프라즈, 또는 그의 약리학상 활성 유도체를 포함하는 조성물.
제 36항에 있어서, 약제가 플라보노이드, 또는 그의 약리학상 활성 유도체를 포함하는 조성물.
제 41항에 있어서, 플라보노이드가 케르세틴, 또는 그의 약리학상 활성 유도체를 포함하는 조성물.
제 33항에 있어서, 안구내 주입용, 서방성 전달 기구의 이식용, 또는 국소, 경구 또는 비강 내 투여용으로 제조된 조성물.
제 33항에 있어서, 안구내 투여용으로 제조된 조성물.