MXPA06006980A

MXPA06006980A - Agentes para tratamiento de retinopatia glaucomatosa y neuropatia optica.

Info

Publication number: MXPA06006980A
Application number: MXPA06006980A
Authority: MX
Inventors: Iok-Hou Pang; Robert A Landers
Original assignee: Alcon Inc
Priority date: 2003-12-22
Filing date: 2004-12-17
Publication date: 2006-12-14
Also published as: CN1897972A; KR20060127043A; ATE357932T1; ES2371364T3; CA2547852A1; CY1112393T1; PT1803468E; DK1803468T3; WO2005063295A1; ATE523208T1; HK1097179A1; EP1696958A1; EP1696958B1; HK1110772A1; DE602004005617D1; PL1696958T3; JP4755599B2; DK1696958T3; JP2011046736A; SI1803468T1

Abstract

Se proporcionan agentes que estimulan la translocacion nuclear de la proteina Nrf2 y el incremento subsecuente de los productos geneticos que destoxifican y eliminan metabolitos citotoxicos en un metodo para tratar retinopatia glaucomatosa o neuropatia optica. Los agentes estructuralmente diversos que actuan en la trayectoria Nrf2/ARE inducen la expresion de enzima y proteinas que poseen propiedades citoprotectivas quimicamente versatiles y son una defensa contra metabolitos toxicos y xenobioticos. los agentes incluyen ciertos electrofilos y oxidantes tales como el aceptor Michael Addition, difenol, tiocarbamato, quinona, 1, 2-ditiol-3-tiona, hidroxianisol butilado, flavonoide, un isotiocianato, 3,5-di-ter-butil-4-hidroxitolueno, etoxiquina, una coumarina, combinaciones de los mismos, o un derivado o analogo farmacologicamente activo de los mismos.

Description

retinopatia glaucomatosa y neuropatía óptica. Los mecanismos adicionales probablemente contribuyen al proceso de-enfermedad. La retinopatía glaucomatosa generalmente se entiende como alteraciones funcionales o cambios patológicos en la retina, especialmente la muerte de las RGC, que se encuentran en pacientes o animales con glaucoma. La neuropatía óptica glaucomatosa se refiere a alteraciones funcionales o cambios patológicos en el nervio óptico a través del cual pasan los axónes de las RGC. Un corte transversal a través de la retina de adulto humano muestra las siguientes capas de células listadas en la dirección de la región más cercana o más interna (lado vitreo) a la región distal o más externa (lado coroidal) : membrana limitante interna, capa de fibra óptica, capa de células ganglionarias , capa flexiforme interna, capa nuclear interna, capa flexiforme externa, capa nuclear externa, membrana limitante externa, segmentos internos de bastoncillos y conos, segmento externo de bastoncillo y conos, epitelio pigmentario retinal, y coriocapilares . El epitelio pigmentario retinal y los coriocapilares se encuentran en la parte trasera de la retina muy cercana a la membrana coroide, mientras que la membrana limitante interna se encuentra más cercana a la cámara vitrea. La capa de células ganglionares recolecta la entrada fotoreceptiva y envía la entrada mediante axones mielinados a través del nervio óptico hacia el cerebro. Las células ganglionares son las células que están en riesgo en el glaucoma . Los mecanismo moleculares propuestos para contribuir a la muerte de RGC incluyen toxicidad por glutamato, deprivación de factores neurotrópicos, anormalidad vascular (isquemia) , gliosis reactiva, y toxicidad inducida por oxido nítrico. Sin embargo, ninguno de estos mecanismos propuestos ha sido aceptado universalmente por investigadores en el campo. La solicitud de patente PCT número PCT/US02/40457 para Gao, X et al., publicada como WO 03/051313, supuestamente proporciona una inducción de una encima de destoxificación de fase II por sulforafano en células epiteliales pigmentarias retínales humanas . La Publicación de la Patente Norteamericana No. 2002/0091087, para Zhang, Y, et al, supuestamente proporciona el tratamiento para una enfermedad neurodegenerativa a través de un compuesto, sulforafano, que eleva el glutation o una encima de destoxificación de la Fase II en tejido de médula espinal, enfermedad de Alzheimer, y en esclerosis lateral amiotrófica. Las células epiteliales pigmentarias retinales difieren de las células ganglionares en que las células ganglionares son neuronas y las células epiteliales pigmentarias retinales no son neuronas. Además, la respuesta biológica de tejido ocular tal como la retina para agentes terapéuticos particulares no se puede predecir en la respuesta biológica de tejido de médula espinal y tejido de cerebro. Las solicitudes citadas no dirigen protección o tratamiento por la pérdida de células ganglionares retinales (RGC) y neuropatía óptica en glaucoma.. Generalmente no es aceptado un método terapéutico antiglaucoma para el manejo de la retinopatía glaucomatosa y la neuropatía óptica. En vista del impacto de glaucoma en la salud, y los inadecuados métodos anteriores de tratamiento, sería deseable tener un método mejorado de tratamiento que dirija la retinopatía glaucomatosa y la neuropatía óptica.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN De acuerdo a la presente invención, un agente que tiene actividad estimulante para la translocación nuclear de la proteina Nrf2 y el subsecuente incremento en productos genéticos que se destoxifican y eliminan metabolitos citotóxicos proporcionando un efecto terapéutico o protector retardando o previniendo la pérdida de células ganglionarias retínales y daño glaucomatoso al nervio óptico. Como se utiliza en la presente "actividad estimulante de la translocación nuclear de la proteína Nrf2" significa un agente que mejora la disponibilidad o el transporte de Nrf2 hacia el núcleo. La translocación de la proteína Nrf2 hacia el núcleo permite el subsecuente incremento en la expresión de productos genéticos que destoxifican y eliminan metabolitos citotóxicos. Los métodos de la presente invención proporcionan un método para tratamiento de retinopatía glaucomatosa y neuropatía óptica en un sujeto que comprendé la administración al sujeto de una cantidad efectiva de una composición que comprende un agente que tiene actividad estimulante de la translocación nuclear de la proteína Nrf2, y un portador aceptable. El sujeto debe estar en riesgo de desarrollar retinopatía glaucomatosa o neuropatía ópticá o deberá tener síntomas de retinopatía glaucomatosa o neuropatía óptica. El agente que estimula la translocación nuclear de la proteína Nrf2 y el subsecuente incremento en los productos genéticos que destoxifican y eliminan metabolitos citotóxicos de la presente invención pueden comprender un aceptor Michael Addition, difenol, tiocarbomato, quinona, 1, 2-ditiol-3-tiona, hidroxianisol butilado, flavonoide, un isotiocianato, 3,5-di- ter-butil-4-hidroxitolueno, etoxiquina, 3-hidroxicomarina, combinaciones de los mismos, o un derivado o análogo farmacológicamente activo de los mismos. En una modalidad el agente comprende un isotiocianato tal como sulforafano, o* un derivado farmacológicamente ¦ activo del mismo. En otra modalidad, el agente comprende 1, 2-dítiol-3-tiona tal como oltipraz, o un derivado farmacológicamente activo del mismo. La administración del agente que estimula la translocación nuclear de la proteina Nrf2 y el subsecuente incremento en los productos genéticos que destoxifican y eliminan metabolitos citotóxicos puede ser por inyección intraocular, implantación de un dispositivo de distribución de liberación lenta, o tópico, oral, administración intranasal, inyección sistémica, u otras administraciones sistémicas . En una modalidad adicional del presente método inventivo, el sujeto es diagnosticado con retinopatia glaucomatosa o neuropatía óptica y, en otra modalidad de la invención, el sujeto tiene síntomas de retinopatia glaucomatosa o neuropatía óptica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los dibujos demuestran el efecto de sulforafano, en Addition, difenol, tiocarbomato, quinona, 1, 2-ditiol-3-tiona, hidroxianisol butilado, flavonoide, un isotiocianato, 3,5-di- ter-butil-4-hidroxitolueno, etoxiquina, 3 -hidroxicomarina, combinaciones de los mismos, o un derivado o análogo farmacológicamente activo de los mismos. En una modalidad el agente comprende un isotiocianato tal como sulforafano, o un derivado farmacológicamente ' activo del mismo. En otra modalidad, el agente comprende 1, 2-ditiol-3-tiona tal como oltipraz, o un derivado farmacológicamente activo del mismo. La administración del agente que estimula la translocación nuclear de la proteína Nrf2 y el subsecuente incremento en los productos genéticos que destoxifican y eliminan metabolitos citotóxicos puede ser por inyección intraocular, implantación de un dispositivo de distribución de liberación lenta, o tópico, oral, administración intranasal, inyección sistémica, u otras administraciones sistémicas . En una modalidad adicional del presente método inventivo, el sujeto es diagnosticado con retinopatia glaucomatosa o neuropatía óptica y, en otra modalidad de la invención, el sujeto tiene síntomas de retinopatia glaucomatosa o neuropatía óptica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 demuestra el efecto de sulforafano en la toxicidad inducida por glutamato en un cultivo de células ganglionares retínales de rata adulta. Las células fueron tratadas con el componente indicado durante 3 dias. La supervivencia fue analizada contando células saludables positivas Thy-1. El asterisco * representa una diferencia significativa de los valores de control por un análisis ANOVA de una dirección única de varianza entre grupos, seguido de la prueba de Dunnett.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona al uso de agentes que estimulan la translocación nuclear de la proteina Nrf2 y el subsecuente incremento en productos genéticos que destoxifican y eliminan metabolitos citotóxicos como un método para tratar la retinopatia glaucomatosa y la neuropatía óptica. El término "tratamiento de la retinopatia glaucomatosa y neuropatía óptica", como se usa en la presente significa retardar o prevenir el desarrollo de, inhibir la progresión de, o aliviar los síntomas de la retinopatia glaucomatosa o neuropatía óptica o síntomas de los mismos. La estimulación de la translocación nuclear de la proteína Nrf2 y el subsecuente incremento en los productos genéticos que destoxifican y eliminan metabolitos citotóxicos sé proporciona para la protección células ganglionares retináles y para la protección del nervio óptico. La translocación nuclear de Nrf2 se induce en células expuestas a ciertos electrófilos y oxidantes. Los genes inducidos debido a la translocación nuclear de Nrf2 producen encimas de destoxxficación que mejoran la protección contra electrófilos y promueven la reparación o degradación de proteínas dañadas. La inducción- de estas encimas es regulada en el nivel transcripcional y está mediada por un reforzador específico, el elemento de respuesta antioxidantes o ARE, que se encuentran en el promotor del gen que codifica la encima. El contexto de la secuencia del ARE, la naturaleza de los inductores químicos, y el tipo celular afectan la actividad del reforzador en un gen particular. El factor de transcripción Nrf2 es un miembro de la familia del factor de transcripción NF-E2 y es responsable para sobreregular la expresión genética mediada por el elemento de respuesta antioxidante (ARE) . La expresión genética induce Nrf2 al unir a la región ARE (elemento, de respuesta antioxidante) del promotor para activar la transcripción genética activa constitutivamente o en respuesta o a una señal de estrés oxidativo. Bajo condiciones normales, se cree que Nrf2 está presente en el citoplasma unido a la proteína represora Keapl, una proteína citoplasmática anclada por el citoesqueleto de actina. No buscando unirse por teoría se cree que los agentes que tienen actividad estimulante para la translocación nuclear de la proteina Nrf2 pueden competir con la región que interviene con la cisteina rica de un factor Keapl citosólico por interacción con Nrf2 (Dinkova-Kostova, A.T., et al., Proc Nati Acad Sci, USA, 99:11908-11913 (2002)). La ruptura del complejo Nrf2-Keapl por ciertos compuestos tales como" el sulforafano pueden liberar Nrf2 para translocar dentro del núcleo donde este podrá heterodimerizarse con otros factores de transcripción (es decir, Maf, c-Jun, etc.) en las regiones ARE de los genes conduciendo la inducción de la expresión genética regulada por ARE. Las encimas y proteínas expresadas por esta trayectoria Nrf2/ARE poseen propiedades citoprotectivas químicamente versátiles y son una defensa contra metabolitos tóxicos y xenobióticos . Las encimas y proteínas conocidas se expresan a través de la vía Nrf2/ARE incluyen glutation-S-transferasas, UDP-glucoronosiltransferasas, NADP(H) quinonaoxidoreductasa, y-glutamilcisteína sintasa, proteínas de respuesta a chaperonas/estrés, y proteínas de ubiquitina/proteasoma . Los agentes que tienen actividad estimulante para translocación nuclear de la proteína Nrf2 incluyen, por ej emplo : Aceptores ichael addition (por ejemplo a, ß-compuestos carbonilo insaturados) , tales como maleato de dietilo o fumarato de dimetilo; difenoles tales como resveratrol, hidroxianisoles butilados tales como 2(3)-ter- butil-4-hidroxianisol; tiocarbamatos tales como pirrolidinditiocarbamato, quinonas tales como ter-butil-hidroquinona, isotiocianatos tales como sulforafano, su precursor glucosinolato, glucorafaniña, o fenetilisotiocianato (PEITC) , 1, 2-ditiol-3-tionas tales como oltipraz, 3, 5-di-ter-butil-4-hidroxitolueno, etoxiquina, coumarinas tales como 3-hidroxicoumarina, flavonides tales como quercetina o curcumina, sulfuro de dialilo, indol-3-carbinol, epigalo-3-catequin galato, ácido egalico, combinaciones de los mismos, o un derivado o análogo farmacológicamente activo de los mismos. Un aceptor Michael es una molécula que tiene un alqueno adyacente a un grupo deprivación de electrón. El grupo deprivación de electrón usualmente es un carbonilo, pero también puede ser un grupo nitrilo o nitro. Aunque químicamente diversos, estos componentes son electrófilos y tienen la capacidad de reaccionar con grupos silfidrilo nucleofilico . Un "derivado farmacológicamente activo del mismo", es un agente estructuralmente relacionado a cualquiera de los componentes arriba mencionados que tiene actividad estimulante para la translocación nuclear de la proteina Nrf2 y es derivable de estos y puede ser, por ejemplo, un éster, una amida, o una sal del mismo. Un "análogo farmacológicamente activo del mismo", es un agente que es estructuralmente similar a cualquiera de los compuestos arriba mencionados que tiene actividad estimulante de la translocación nuclear de la proteina Nrf2 pero difiere ligeramente en composición tal como, por ejemplo, en el reemplazo de un átomo por un átomo de un diferente elemento o en la presencia de un grupo funcional particular. En una modalidad, la presente invención proporciona sulforafano, oltipraz, un análogo farmacológicamente activo de los mismos o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos en un método de tratamiento para neuropatía óptica glaucomatosa o la retinopatía glaucomatosa . El sulforafano (Producto no. S6317, de Sigma-Aldrich) se conoce, por ejemplo, que induce quinoná reductasa, glutation-S-transferasa, y glutation reductasa .. Se ha observado la inducción de la encima en varias líneas celulares incluyendo células epiteliales pigmentarias retínales de adulto humano. (Zhang, Y. et al., Proc Nati Acad Sci, USA, 89:2399-2304 (1992)). Los análogos de sulforafano incluyen, por ejemplo, 6- (isotiocianato-2-hexanona) , exo-2- acetil-6-isotiocianatonorbornano, exo-2- (isotiocianato-6-metilsulfonilnorbornano) , 6~isotiocianato-2-hexanol, 1- (isotiocianato-4-dimetilfosfonilbutano, exo-2- (1-hidroxietil) -5-) isotiocianatonorbornano, exo-2-acetil-5~ isotiocianatonorbornano, 1- (isotiocianato-5-metilsulfonilpentano) , cis-3- (metilsulfonil) (ciclohexilmetilisotiocianato) y trans-3- (metilsulfonil) (ciclohexilmetilisotiocianato) .

Modo de administración: Los agentes de la presente invención se pueden depositar directamente al ojo (por ejemplo: gotas o ungüentos oculares tópicas; dispositivos de liberación lenta en el cul-de-sac o implantado adyacente a la esclerosis o en el interior del ojo; periocular, conjuntival, subespigado, intracameral, intravitreal, o inyecciones intracanaliculares) o sistemáticamente (por ejemplo: oralmente, intravenoso, subcutáneo o inyecciones intramusculares; parenteralmente, distribución dérmica o nasal) utilizando técnicas bien conocidas por aquellos de experiencia en la técnica. También se contempla que los agentes de la invención puedan ser formulados en insertos intraoculares o dispositivos implantados. Sujeto: ün sujeto tratado para retinopatia glaucomatosa o neuropatía óptica como se describe en la presente puede ser un humano o algún animal en riesgo de desarrollar retinopatía glaucomatosa o neuropatía óptica o que tiene los síntomas de retinopatía glaucomatosa" o neuropatía óptica. Formulaciones y Dosis: Los agentes de la presente invención pueden administrarse como soluciones, suspensiones, o emulsiones (dispersiones) en un portador oftálmico adecuado. Los siguientes son ejemplos de posibles formulaciones contenidas por esta invención.

Agente estimulante Cantidad en peso % de la translocación 0.01-5; 0.01-2.0; 0.5-2.0 nuclear de la proteína Nrf2 Hidroxipropilmetilcelulosa Cloruro de Sodio 0.5 Cloruro de Benzalconio .8 EDTA 0.01 NaOH/HCl 0.01 Agua purificada es pH 7.4 es a 100% Cantidad en peso % Agente estimulante 0.00005-0.5; 0.0003-0.3; 0.0035- de la translocación 0.03;0.001 nuclear de la proteina Nrf2 Amortiguador Salino de 1.0 Fosfatos . Cloruro de Benzalconio 0.01 Polisorbato 80 0.5 Agua purificada es. a 100% Cantidad en peso % Agente estimulante de la 0.001 translocación nuclear de la proteina Nrf2 Fosfato monobásico de sodio 0.05 Fosfato dibásico de sodio 0.15 (anhidro) Cloruro de Sodio 0.75 EDTA Disodio 0.05 Cremofor EL 0.1 Cloruro de Benzalconio 0.01 HC1 y/o NaOH pH 7.3-7.4 Agua purificadora c.s. a 100% Cantidad en peso % Agente estimulador de la 0.0005 translocación nuclear de la proteina Nrf2 Amortiguador salino de 1.0 fosfatos Hidroxipropil- -ciclodextrina 4.0 Agua purificada c.s. a 100 % En una ¦ modalidad adicional, las composiciones oftálmicas se formulan para proporcionar una concentración infraocular de aproximadamente 0.1-100 nanomolar (nM) o, en una modalidad adicional, 1-10 nM. Las concentraciones plasmáticas pico de hasta 20 micromolar pueden lograrse por administración sistémica. Las composiciones tópicas son suministradas a la superficie del, ojo de una a cuatro veces por dia de acuerdo al criterio rutinario de un médico experto. El pH de la formulación deberá estar en 4-9, ó 4.5 a 7.4. Las formulaciones sistémicas pueden contener, por ejemplo, de aproximadamente 10 mg a 1000 mg, de aproximadamente 10 mg a 500 mg, de aproximadamente 10 mg a 100 mg o hasta 125 mg, del agente que estimula la translocación nuclear de la proteina Nrf2 y el subsecuente incremento en los productos genéticos que destoxifican y eliminan metabolitos citotóxicos.

Una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad del agente que es posible estimule la translocación nuclear de la proteína Nrf2 y del subsecuente incremento en los productos genéticos que destoxifican y eliminan metabolitos citotóxicos. Tal inducción de la expresión genética proporciona una defensa contra la toxicidad de electrófilos reactivos así como contra otros metabolitos tóxicos. Por consiguiente, un agente que estimula la translocación nuclear de la proteína Nrf2 y el subsecuente incremento en ^los productos genéticos que destoxifican y eliminan metabolitos citotóxicos se proporcionan para protección contra la citotoxicidad. Tal protección retrasa o previene la aparición de síntomas en un sujeto que está en riesgo de desarrollar neuropatía óptica glaucomatosa o retinopatía glaucomatosa. La cantidad efectiva de una formulación puede depender de factores tales como, por ejemplo, la edad, raza, y sexo del sujeto, o la severidad de la neuropatía óptica. En una modalidad, el agente es suministrado tópicamente en el ojo y alcanza las células ganglionares retínales a dosis terapéuticas mejorando así el proceso de la enfermedad de retinopatía o neuropatía óptica. Aunque el régimen, preciso se deja a criterio .del médico, la solución o soluciones resultantes de preferencia son administradas colocando una gota de cada solución o soluciones en cada ojo de una a cuatro veces por día, o como sea decidido por el médico. Portadores aceptables : Un portador oftálmicamente aceptable se refiere a aquellos portadores que causan al menos, poco o nada de irritación ocular, proporcionan adecuada conservación como se requiere, y distribuyen uno o más agentes que estimulan la translocación nuclear de la proteina Nrf2 y el subsecuente incremento en productos genéticos que destoxifican y eliminan metabolitos citotóxicos de la presente invención en una dosis homogénea. Para distribución oftálmica, un agente que estimula la translocación nuclear de la proteína Nrf2 el subsecuente incremento en los productos genéticos que destoxifican y eliminan metabolitos citotóxicos puede ser combinado con conservadores oftalmológicamente aceptables, co-solventes, tensoactivos , reforzadores de viscosidad, reforzadores de penetración, amortiguadores, cloruro de sodio, o agua para formar una suspensión oftálmica estéril acuosa, solución o geles viscosos o semiviscosos u otro tipo de composición sólida o semisólida tal como un ungüento. Las formulaciones de las soluciones oftálmicas pueden ser preparadas disolviendo el agente en un amortiguador acuoso isotónico fisiológicamente aceptable. Adicionalmente, la solución oftálmica puede incluir un tensoactivo oftalmológicamente aceptable que auxilie en la disolución del agente. Los componentes que proporcionan viscosidad, tales como hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, metilcelulosa, polivinilpirrolidona, o similares, puede adicionarse a 5 la composición de la presente invención para mejorar la retención del compuesto. Con el objetivo de preparar una formulación estéril de ungüento oftálmico, el agente que estimula la translocación nuclear de la proteina Nrf2 y el subsecuente incremento en los productos genéticos que destoxifican y eliminan metabolitos citotóxicos es combinado con un conservador en un vehículo apropiado, tal como aceite mineral, lanolina líquida, o petrolato blanco. Las formulaciones oftálmicas estériles de gel se pueden preparar suspendiendo el agente en una base hidrofílica preparada por la combinación de por ejemplo, CARBOPOL® -940 (BF Goodrich, Charlotte, NC) , o similar, de acuerdo a los métodos conocidos en la técnica para otras formulaciones oftálmicas. Se puede utilizar VISCOAT® (Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, TX) por ejemplo, para inyección intraocular. Otras composiciones de la presente invención pueden contener materiales reforzadores de la penetración tales como CREMOPHOR® (Sigma Aldrich, St . Louis, · MO) y T EEN® 80 (monolaureato de polioxietileno de sorbitan, Sigma Aldrich) , en caso de que los agentes de la presente invención sean menos penetrantes en el ojo.

Ejemplo 1 Agentes que tienen Actividad Estimulante para la translocación Nuclear de la Proteina Nrf2 Las células endoteliales vasculares, tales como células endoteliales aórticas de bovino (BAEC, VEC Technologies Rensselaer, NY) , se usan para determinar aquellos agentes que tienen actividad estimulante para . la translocación nuclear de la proteina Nrf2. Por ejemplo, monocapas conjuntas de células endoteliales aórticas de bovino se exponen a agentes candidatos en un medio de Eagle modificado de Dulbecco con 1% de suero bovino fetal durante 24 horas. Se preparan Usados celulares, extractos citosólicos, y extractos nucleares, y se realiza inmunoabsorción y se cuantifica como se describe en Buckley, B.J., et al. (Biochem Biophys Res Commun, 307:973-979 (2003) ) . Los agentes que pueden incrementar la cantidad de Nrf2 detectado en la fracción nuclear cuando se compara con las células control sin el agente son después examinadas en un ensayo de toxicidad celular en células ganglionares retinales como se establece en el Ejemplo 2.

Ejemplo 2 Protección de Células ganglionares retinales de Rata por un Agente que Tiene Actividad Estimulante de la Translocación Nuclear de la Proteina Nrf2 Se combinan cultivos de células retinales neuronales de rata con un agente que estimula la translocación nuclear de la proteina Nrf2 durante 1 a 24 horas, después la combinación es expuesta a peróxido. La sobrevivencia de células retínales neuronales cuando se comparan con el cultivo control sin peróxido indica que el agente proporciona protección del oxidante. Se aislan y se cultivan células retinales neuronales de rata neonata como fue reportado en Pang, I-H., et al., (Invest Ophthalmol Vis Sci 40:1170-1176 (1999)). "Neural Retinal" se refiere a la retina sin el epitelio pigmentario retinal. De esta manera, los cultivos contienen una población mezclada de tipos celulares retinales. Previamente, ratas Sprague-Dawley neonatas de 2-5 días de nacidas son anestesiadas y se practica una abertura de 2 mm y en la línea media del cuero ' cabelludo de manera caudal al seno transversal. Las células ganglionares retinales se marcan de manera retrograda selectivamente con un pigmento fluorescente, Di-I, (1, 1' -dioctadecil-3, 3, 3' , 3' -tetrametilindocarbocianina de perclorato) , un trazador lipofílico que marca uniformemente las neuronas (Molecular Probes, Eugene, OR) . La punta de la aguja de inyección (30 ga) se inserta 6 mm por debajo de la parte superior del cráneo, y se inyectan 5 µ? de una solución de Di-I en el coliculo superior. La solución de Di-I contiene 3 mg/mL, de Di-I en 90% de etanol y 10% de dimetilsulfoxido . La herida se cubre con una gota de algún coloide flexible. De dos a 4 días después de la inyección de Di-I, las ratas son anestesiadas y sacrificadas por decapitación. Sus ojos son enucleados y puestos en un medio de Eagle modificado de Dulbecco: mezcla F12 Nutriente (1:1; DMEM/F12, Gibco, Gaithersburg, MD) . La retina de cada ojo es separada, y aislada. Las células retínales son disociadas por una solución que contiene 10 mg de papaina (34 unidades/mL) , 2 mg DL-cisteína (3.3 mM) y 2 mg de albúmina de suero bovino (0.4 mg/mL) en 5 mi de DMEM/F12 , durante 25 min. A 37 °C y después se lavan 3 veces con 5 mL de un medio RGC (DMEM, suplementado con 10% de suero bovino fetal, 4 mM de glutamina, --100 unidades/mL de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina) . Las piezas retínales son trituradas pasándolas a través de una pipeta desechable varias veces hasta que las células son dispersadas. La suspensiones celulares (aproximadamente 3 x 106 células/mL) se colocan en vidrios recubiertos de poli-D-lisina en el fondo de cajas de cultivo. Las células se cultivan con 95% de aire/5% de C02 a 37 °C.

Los efectos protectores de un agente que tiene actividad estimulante de la translocación nuclear de la proteina Nrf2 son determinados tratando los cultivos con un agente candidato por 1 a 24 horas, después se adicionan 300 µ? de ?202. Las RGC cultivadas se identifican por ' la fluorescencia de Di-I. La sobrevivencia de las RGC es evaluada contando el número de células que permanecen con la fluorescencia de Di-I . Los agentes que mejoran la sobrevivencia de células ganglionares retínales cuando se comparan contra el control se proporcionan para proteger las RGC de agresión citotóxica y son útiles para el tratamiento de la neuropatía óptica glaucomatosa.

Ejemplo 3 Protección por Sulforafano de Células Ganglionares Retínales de Rata de la Toxicidad Inducida por Glutamato Ratas Sprague-Dawley adultas fueron sacrificadas por asfixia con CO2. Sus ojos fueron enucleados y puestos en un medio NEUROBASAL™ (Gibco, Gaithersburg, MD) . La retina de cada ojo fue separada y aislada. Las células retínales fueron disociadas combinando más de 20 retinas con 5 mL de una solución de papaina que contiene 10 mg de papaina, 2 mg DL-cisteína, y 2 mg de albúmina de suero bovino en 5 mi de un medio NEUROBASAL™, durante 25 min. a 37 °C, después fueron lavadas 3 veces con 5 mL de un medio RGC (NEUROBASAL™) un medio suplementado como se cita en el Ejemplo 2 y con 1% de suero bovino fetal. Las piezas retínales fueron trituradas pasándolas varias veces a través de una pipeta desechable prendida con fuego hasta que las células fueron dispersas. La suspensión celular se colocó en un portaobjetos de cultivo de cavidades de 8 pozos recubiertos con laminina y poli-D- lisina. Se adicionó glutamato y glutamato con sulforafano en los pozos asignados. Las células fueron después cultivadas durante tres dias en 95% de aire/5% de C02 a 37 °C. Al final del periodo de incubación las células fueron fijadas y marcadas para Thy-1, un marcador de RGC 'por inmunocitoquimica . La sobrevivencia celular fue cuantificada manualmente contando las células saludables positivas a Thy-1 en cada pozo. Los datos resultantes se muestran en la figura y demuestran que el tratamiento de las RGC con glutamato (100 µ?) durante 3 dias causa la reducción de 40 a 60% de la sobrevivencia celular. Tratando las células con sulforafano (0.5 µ?) previene tal toxicidad. Estos resultados demuestran que el sulforafano es un protector contra las agresiones a las células ganglionares retínales. Las referencias citadas en la presente, a la magnitud que proporcionan procedimientos ejemplares u otros detalles suplementarios a aquellos establecidos en la presente, son incorporados específicamente para referencia'. Aquellos de experiencia ordinaria en la técnica, a la luz de la presente discusión, apreciarán que se pueden hacer modificaciones de las modalidades descritas en la misma sin desviarse del espíritu y el alcance de la invención. Todas las modalidades descritas en la presente pueden ser hechas y ejecutadas sin experimentación indebida a la luz de la presente descripción. El alcance completo de la invención es colocado en la descripción y modalidades equivalentes de la misma. La especificación no será interpretada indebidamente para estrechar el alcance completo de protección en la cual la presente invención está intitulada . Como se utiliza en la presente, y a menos que se indique lo contrario, los términos "un" y "uno" se considera que significan "un", "al menos uno" o "uno o más".

Claims

REIVINDICACIONES 1. El uso de una cantidad efectiva de una composición que comprende un agente que tiene actividad estimulante para la translocación nuclear de la proteina Nrf2, y un portador aceptable en la preparación de un medicamento para el tratamiento de retinopatia glaucomatosa o neuropatía óptica en un sujeto.
2. El uso de la reivindicación 1 en donde el sujeto está en riesgo de desarrollar retinopatia glaucomatosa o neuropatía óptica.
3. El uso de la reivindicación 1 en donde el sujeto tiene síntomas de retinopatia glaucomatosa o neuropatía óptica .
4. El uso de la reivindicación 1 en donde el agente comprende un aceptor Michael Addition, difenol, tiocarbamato, quinona, 1, 2-ditiol-3-tiona, hidroxianisol butilado, flavonoide, un isotiocianato, 3 , 5-di-ter-butil-4-hidroxitolueno, etoxiquina, una coumarina, combinaciones de los mismos, o un derivado o análogo farmacológicamente activo de los mismos.
5. El uso de la reivindicación 4 en donde el agente comprende un isotiocianato, o un derivado farmacológicamente activo del mismo.
6. El uso de la reivindicación 5 en donde el isotiocianato comprende sulforafano, o un derivado farmacológicamente activo del mismo.
7. El uso de la reivindicación 4 en donde el agente comprende 1, 2-ditiol-3-tiona, o un derivado farmacológicamente activo del mismo.
8. El uso de la reivindicación 7 en donde la 1,2- ditiol-3-tiona comprende oltipraz, o un derivado farmacológicamente activo del mismo.
9. El uso de la reivindicación 4 en donde el agente comprende un flavonoide, o un derivado farmacológicamente activo del mismo.
10. El uso de la reivindicación 9 en donde el flavonoide comprende quercetina o un derivado farmacológicamente activo del mismo.
11. El uso de la reivindicación 1 en donde el medicamento es preparado para inyección intraocular, para implantación de un dispositivo de distribución de liberación lenta, o para administración oral, tópica o intranasal.
12. El uso de la reivindicación 1 en donde el medicamento es preparado para administración intraocular.
13. Una composición para el tratamiento de la retinopatia glaucomatosa o neuropatía óptica en un sujeto, la composición comprende una cantidad efectiva de un agente que tiene actividad estimulante para la translocación nuclear de la proteina Nrf2 y un portador aceptable.
14. La composición de la reivindicación 13 en donde el sujeto está en riesgo de desarrollar retinopatia glaucomatosa o neuropatía óptica. ·
15. La composición de la reivindicación 13 en donde el sujeto tiene síntomas de retinopatia glaucomatosa o neuropatía óptica.
16. La composición de la reivindicación 13 en donde el agente comprende un aceptor Michael Addition, difenol, tiocarbomato, quinona, 1, 2-ditiol-3-tiona, hidroxianisol butilado, flavonoide, un isotiocianato, 3, 5-di-ter-butil-4-hidroxitolueno, etoxiquina, una coumarina, combinaciones de los mismos, o un derivado o análogo farmacológicamente activo de los mismos.
17. La composición de la reivindicación 16 en donde el agente comprende un isotiocianato o un derivado farmacológicamente activo del mismo.
18. La composición de la reivindicación 17 en donde el isotiocianato comprende sulforafano, o un derivado farmacológicamente activo del mismo.
19. La composición de la reivindicación 16 en donde el agente comprende 1, 2-ditiol-3-tiona, o un derivado farmacológicamente activo del mismo.
20. La composición de la reivindicación 19 en donde el 1 , 2-ditiol-3-tiona comprende oltipraz, o un derivado farmacológicamente activo del mismo.
21. La composición de la reivindicación 16 en donde el agente comprende un flavonoide, o un derivado farmacológicamente activo del mismo.
22. La composición de la reivindicación 21 en donde el flavonoide comprende quercetina, o un derivado farmacológicamente activo del mismo.
23. La composición de la reivindicación 13 en donde la composición esta preparada para inyección infraocular, implantación de un dispositivo de distribución de liberación lenta, o administración oral, tópica o intranasal.
24. La composición de la reivindicación 13 en donde la composición está preparada para administración infraocular .