KR20060121842A

KR20060121842A - β-카테닌/ＴＣＦ에 의해 활성화되는 전사의 조절

Info

Publication number: KR20060121842A
Application number: KR1020067004085A
Authority: KR
Inventors: 마이클 칸; 오세웅; 김대훈; 하종렬; 카타윤 호이자티-에마미
Original assignee: 주식회사 중외제약
Priority date: 2003-08-28
Filing date: 2004-08-27
Publication date: 2006-11-29
Also published as: WO2005021025A3; CA2537099A1; BRPI0413969A; AU2004268647B2; JP2007503816A; CN1871239A; NZ545568A; US7531320B2; US20050059628A1; AU2004268647A1; RU2383547C2; EP1660502A2; WO2005021025A2; RU2006109712A

Abstract

본 발명은 Wnt/β-카테닌 경로에 의해 표적이 되는 유전자들의 선택적 억제와 같은 β-카테닌/TCF 에 의해 활성화되는 전사를 조절하는 화합물 및 방법을 제공한다.

Wnt/β-카테닌 경로, CBP, p300

Description

β-카테닌/ＴＣＦ에 의해 활성화되는 전사의 조절{MODULATION OF β-CATENIN/TCF-ACTIVATED TRANSCRIPTION}

본 발명은 β-카테닌/TCF에 의해 활성화되는 전사의 조절, 예를 들면, Wnt/β-카테닌 경로에 의해 표적이 되는 유전자들의 선택적 억제를 위한 화합물 및 방법에 관한 것이다.

Wnt/β-카테닌 경로는 정상 발달 및 암의 개시 및 진전 모두에서 결정적인 신호 연속 단계를 개시시킨다 (Wodarz et al., "Mechanisms of Wnt signaling in development," Annu . Rev. Cell Dev . Biol . 14:59-88 (1998); Morin, P.J., "Beta-catenin signaling and cancer," Bioessays 21:1021-30 (1999); Moon et al., "The promise and perils of Wnt signaling through beta-catenin," Science 296:1644-46 (2002); Oving et al., "Molecular causes of colon cancer," Eur . J. Clin . Invest. 32:448-57 (2002)). 이 경로의 특징은 다기능 단백질인 β-카테닌의 전사에서의 역할을 활성화시키는 점이다. 정상 세포에서, β-카테닌의 대다수는 카드헤린(cadherin)에 결합되는 세포막에서 발견되는데, 이곳은 세포 부착에서 중요한 역할을 한다. β-카테닌의 다른 풀은 세포질 및 핵에서 발견되는데, 이곳에서 이들은 전사를 조절한다 (Gottardi et al., "Adhesion signaling: how beta-catenin interacts with its partners," Curr . Biol . 11:R792-4 (2001)). 형질막(plama membrane)에서 세포 부착의 매개자로서 및 전사 활성자로서의 다양한 역할에서, β-카테닌은 다수의 단백질과 상호작용하고, 그것들의 대부분은 상당한 서열 상동성이 결여되었음에도 불구하고, β-카테닌의 동일한 아르마딜로-반복(armadillo-repeats)에 대해 경쟁한다. 돌연변이 연구와 더불어 결정 구조는, 다양한 아르마딜로 반복에 여러 단백질들의 β-카테닌 결합 부위를 지도화(mapping)하였다 (Gottardi et al., "Adhesion signaling: how beta-catenin interacts with its partners," Curr . Biol . 11:R792-4 (2001); Huber et al., "The structure of the beta-catenin/E-cadherin complex and the molecular basis of diverse ligand recognition by beta-catenin," Cell 105:391-402 (2001)).

β-카테닌의 세포질 풀은 다른 것들 중에서 글리코겐 합성 효소 키나아제-3β (GSK-3β), 카세인 키나아제-1α (CK-1α), 골격 단백질(scaffold protein), 악신(Axin), 및 종양 억제 인자, 선종성 결장폴립증 (APC) 를 포함하는 "파괴 복합체(destruction complex)"에 의한 인산화를 통해 조절된다 (Behrens J., "Control of beta-catenin signaling in tumor development," Ann. N. Y. Acad . Sci . 910:21-33 (2000); discussion 33-5). Wnt 신호가 없으면, 인산화는 세포질의 β-카테닌을 Skp1-쿨린(Cullin)-F 박스(box) (SCF)-지시된 도처존재(ubiquitination) 및 프로테오솜의 분해로 특징지운다. Wnt 경로의 활성화는 GSK-3β의 기능을 비활성화시키고, β-카테닌 인산화를 방해하고, 그럼으로써 β-카테닌이 세포질에 축적되고 이어서 전사적으로 활성인 복합체를 형성하고 목표 유전자들의 발현을 일으키는 핵으 로 이동하게 한다. 표적 유전자들을 활성화시키는 핵심 단계는 β-카테닌 및 전사 인자들의 T-세포 인자 (TCF)/림프계 증강 인자 (LEF-1) 패밀리의 구성원들의 형성이다 (Brantjes et al., "TCF: Lady Justice casting the final verdict on the outcome of Wnt signaling," Biol . Chem . 383:255-61 (2002)). 전사적으로 활성인 복합체를 발생시키기 위해서, β-카테닌은 전사 공동 활성자인 CREB-결합 단백질 (CBP) 또는 그것의 밀접하게 관련된 상동체 p300 (Hecht et al., "The p300/CBP acetyltransferases function as transcriptional coactivators of beta-catenin in vertebrates," EMBO J. 19:1839-50 (2000); Takemaru et al., "The transcriptional coactivator CBP interacts with beta-catenin to activate gene expression," J. Cell Biol . 149:249-54 (2000)) 뿐만 아니라, 기본적인 전사 기구류들의 다른 구성요소들을 보충한다.

β-카테닌/TCF 복합체가 Wnt 반응 유전자들의 전사를 활성화시키는 정확한 기작은 명확하지 않지만, 전사 활성 작용에 관여하는 β-카테닌 도메인은 NH₂- 및 COOH- 말단에 지도화되어 왔다 (Staal et al., "Wnt signals are transmitted through N-terminally dephosphorylated beta-catenin," EMBO 3:63-68 (2002)). β-카테닌의 COOH-말단 부위(region)는 대략 100 아미노산으로 구성되고 TATA 결합 단백질 (TBP)와 상호 작용한다는 것이 보여져 왔다 (Hecht et al., "Functional characterization of multiple transactivating elements in beta-catenin, some of which interact with the TATA-binding protein in vitro," J. Biol . Chem . 274:18017-25 (1999)). LEF-1 에 융합될때, COOH-말단은 전사활성 작용 (transactivation)을 증진시키는 데 충분하다 (Vleminckx et al., "The C-terminal transactivation domain of beta-catenin is necessary and sufficient for signaling by the LEF-1/beta-catenin complex in Xenopus laevis," Mech . Dev . 81:65-74 (1999)). β-카테닌의 NH2-말단 부분(portion)은 프로테오솜 분해(degradation)에 필요한 GSK-3β 인산화 장소를 포함하는 대략 130 아미노산으로 구성된다.

Wnt/β-카테닌 경로는 보통 증식 및 분화를 증진시키는 데 관여하는 일정 범위의 유전자들의 발현을 조절한다. 그렇지만, 대장암의 >85% 에서, 파괴 복합체의 구성 성분들의 하나인 APC 및/또는 β-카테닌 자체가 돌연 변이되어, 핵의 β-카테닌 및 표적 유전자들의 구성 활성(constitutive activation)의 증가를 초래한다 (Fearnhead et al., "Genetics of colorectal cancer: hereditary aspects and overview of colorectal tumorigenesis," Br. Med . Bull. 64:27-43 (2002)). 세포 성장, 증식, 및 분화에 결정적인 역할을 하는 cyclin D1 (Shtutman et al., "The cyclin D1 gene is a target of the beta-catenin/LEF-1 pathway," Proc . Natl . Acad. Sci . USA 96:5522-27 (1999); Tetsu et al., "Beta-catenin regulates expression of cyclin D1 in colon carcinoma cells," Nature 398:422-26 (1999))" 및 c- myc (He et al., "Identification of c-MYC as a target of the APC pathway," Science 281:1509-12 (1998)) 을 포함하는 이들 많은 유전자들은, matrilysin (Crawford et al., "The metalloproteinase matrilysin is a target of beta-catenin transactivation in intestinal tumors," Oncogene 18:2883-91 (1999)), fibronectin (Gradl et al., "The Wnt/Wg signal transducer beta-catenin controls fibronectin expression," Mol . Cell. Biol . 19:5576-87 (1999)), CD44 (Wielenga et al., "Expression of CD44 in Apc and Tcf mutant mice implies regulation by the WNT pathway," Am. J. Pathol . 154:515-23 (1999)), 및 μPAR (Mann et al., "Target genes of beta-catenin-T cell-factor/lymphoid-enhancer-factor signaling in human colorectal carcinomas," Proc . Natl . Acad . Sci . USA 96:1603-08 (1999))와 같은 침습성(invasive) 성장에 필요한 유전자들과 함께 부적절하게 활성화된다.

결장직장 암의 대부분이 β-카테닌 신호 경로의 활성에 관여하고 있고, 복수의 돌연변이가 이 활성을 초래하는 점으로 보아, β-카테닌의 핵에서의 기능을 지연시키는 약물에 대한 명백한 수요가 있다. 본 발명은 β-카테닌/TCF 에 의해 매개되는 전사를 중화하는 약제를 제공하고, 하기 상술된 관련된 이점을 더 제공한다.

간단히, 본 발명은 β-카테닌/TCF 에 의해 매개되는 전사를 중화하는 약제 및 그들의 사용 방법을 제공한다. 하나의 특징에서, 본 발명은 β-카테닌/TCF에 반응하는 유전자들의 서브세트가 특이적으로 하향-조절되는 방법을 제공하고, 한편 관련 특징에서는 본 발명은 상기 방법에 유용한 화합물들을 제공한다. 또 다른 특징에서는 본 발명은 CBP 및 β-카테닌 간의 결합이 파괴되지만, 구조적으로 관련된 공동 활성자 (coactivator) 인 p300 및 β-카테닌 간의 결합은 파괴되지 않고, 한편 관련된 특징에서 본 발명은 상기 방법에 유용한 화합물들을 제공한다. 또 하나의 특징은, 본 발명은 CBP에 의해 촉진(promoted)되지만 p300에 의해서는 촉진되지 않는 유전자들이 선택적으로 활성화되는 방법을 제공하고, 관련된 특징으로는 본 발명은 p300에 의해 촉진(promoted)되지만 CBP에 의해서는 촉진되지 않는 유전자들이 선택적으로 활성화되는 방법을 제공하고, 관련된 특징에서 본 발명은 이 방법에 유용한 화합물을 제공한다. 또 다른 특징에서, 본 발명은 G₁-기에서 발달을 멈추도록 하기 위해서 암종(carcinoma) 세포들을 화학 약제(chemical agent)로 처리하는 방법을 제공하는데, 이때의 화학 약제에 의한 연장된 처리는 정상 대장세포들에서는 탐지되지 않는 세포자멸사(apoptosis)를 유도한다. 암종 세포는 예를 들면, 대장, 가슴, 전립선 등일 수 있다.

예를 들면, 하나의 특징에서, 본 발명은 β-카테닌에 의해 유도되는 유전자 발현을 조절하는 방법을 제공한다. 그 방법은 조성물을 약제와 접촉시키는 것을 포함하는데, 상기 약제는 β-카테닌, CBP 및 p300 을 포함하고, 상기 β-카테닌은 p300 보다는 CBP에 결합할 가능성이 높다. 상기 약제는 β-카테닌이 p300 대비 CBP 에 결합할 가능성을 변화시키는 유효량으로 조성물 내에 존재한다. 다시 말하면, 상기 약제가 없으면, 약제가 존재할 때에 비해, β-카테닌은 CBP 및 p300 에 상이한 정도로 결합한다. 예를 들면, 화학 구조에 따라서, 상기 약제는 하기를 행할 수 있다: CBP가 β-카테닌에 결합하는 것을 증가시킴, 이때 임의로 p300이 β-카테닌에 결합하는 것을 감소시킴; 또는 p300이 β-카테닌에 결합하는 것을 증가시킴, 이때 임의로 CBP가 β-카테닌에 결합하는 것을 감소시킴. 상기 방법은 생체 내 또는 생체 외에서 수행될 수 있다. 하나의 특징은, 상기 방법은 생체 외에서 수행되고, 그 조성물은 줄기 세포를 포함한다. 또 다른 특징은, 상기 방법은 생체 내에서 수행되고, 그 조성물은 포유 동물 내에 있다. 본 발명의 방법은, 다양한 의료 증상을 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 다양한 특징에서: 포유 동물이 암을 앓고 있고, 그 양이 암을 치료하는데에 유효하다; 조성물이 세포내에 있고, 그 약제가 세포가 분화하는 가능성을 증가시킨다; 조성물이 세포내에 있고, 그 약제가 세포가 증식하는 가능성을 증가시킨다.

또 다른 특징은, 본 발명은 β-카테닌, CBP, p300 및 약제를 포함하는 조성물을 제공한다. β-카테닌은 p300에 비해 CBP에 결합할 가능성이 높고, 상기 약제는 조성물 내에 p300 에 비해 CBP 에 결합할 가능성을 변경할 수 있는 유효한 양으로 존재한다. 다시 말하면, 상기 약제가 부존재하면, β-카테닌은 약제가 존재할 때에 관찰되는 것과는 상이한 정도로 CBP 및 p300에 결합한다. 예를 들면, 화학 구조에 따라서, 상기 약제는 하기를 행할 수 있다: CBP가 β-카테닌에 결합하는 것을 증가시킴, 이때 임의로 p300이 β-카테닌에 결합하는 것을 감소시킴; 또는 p300이 β-카테닌에 결합하는 것을 증가시킴, 이때, 임의로 CBP가 β-카테닌에 결합하는 것을 증가시킴. 상기 조성물은 생체 내 또는 생체 외에 존재할 수 있다. 하나의 특징은, 상기 조성물은 생체 외에 존재하고, 그 조성물은 줄기 세포를 더 포함한다. 또 다른 특징은 상기 조성물이 생체 내에 존재하고 그 조성물이 포유 동물, 예를 들면 마우스의 내부에 있는 것이다.

또 다른 특징에서, 본 발명은 Wnt 경로의 활성을 조절하는 방법을 제공하고, 이것은 하기를 포함한다: (a) Wnt 경로의 구성성분을 Wnt 경로를 활성화시키는 화합물과 접촉시켜, 활성화된 Wnt 경로를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 활성화된 Wnt 경로를 p300 및 카테닌 간의 결합을 완전히 또는 실질적으로 방해하지만 CBP 및 카테닌 간의 결합은 거의 또는 전혀 방해하지 않는 화학 약제와 접촉시키는 단계. 임의로, 상기 Wnt 경로는 세포 내에 존재할 수 있다. 임의로 상기 방법은 생체 외에서 수행된다. 임의로, Wnt 경로를 활성화시키는 상기 화합물은 LiCl 및 GSK 억제제로부터 선택된다.

또 다른 특징에서, 본 발명은 세포 증식을 조절하는 방법을 제공하고, 이것은 하기를 포함한다: (a) 모집단의 일부는 증식하고, 일부는 분화하는 조건 하에 세포 모집단(cell population)을 제공하는 단계; 및 (b) 모집단에 화학 약제를 첨가하는 단계, 이때 상기 약제는 분화하는 세포의 부분에 비해 증식하는 세포의 부분의 증가를 일으킨다. 상기 방법의 다양한 임의의 실시 태양에서: 상기 화합물은 p300 및 카테인 간의 결합을 방해한다; 상기 방법은 Wnt 경로를 활성화시키는 약제를 모집단에 첨가하는 것을 포함한다; 세포 모집단은 줄기 세포의 모집단이다; 상기 방법은 생체 외에서 수행된다; 상기 방법은 예를 들면, 모집단 내의 세포들이 분화되어 혈액 세포를 형성하거나, 또는 분화되어 신경 세포들을 형성하는 그러한 세포 모집단의 분화를 일으키는 약제를 더 포함하다.

또 다른 특징은, 본 발명은 미분화 상태의 줄기 세포를 유지시키는 방법을 제공하고, 이것은 줄기 세포를, 미분화상태의 줄기 세포를 유지하는 데 유효한 양의 세포 분화를 억제하거나 세포 증식을 증진시키는 약제로 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 실시 태양에서, 상기 방법에서 사용된 약제는 β-카테닌/CBP 상호 작용에 비해 β-카테닌/p300 상호 작용을 선택적으로 억제한다.

간단히, 또 다른 특징들에서, 본 발명을 하기를 제공한다:

β-카테닌/p300 상호 작용에 비해 β-카테닌/CBP 상호 작용을 선택적으로 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 화합물을 조성물에 투여하고, 그 조성물은 β-카테닌, CBP 및 p300을 포함하고, 그 화합물은 β-카테닌/p300 상호 작용에 비해 β-카테닌/CBP 상호 작용을 선택적으로 억제하는 것인 방법;

β-카테닌/CBP 상호 작용에 비해 β-카테닌/p300 상호 작용을 선택적으로 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 화합물을 조성물에 투여하고, 그 조성물은 β-카테닌, CBP 및 p300을 포함하고, 그 화합물은 β-카테닌/CBP 상호 작용에 비해 β-카테닌/p300 상호 작용을 선택적으로 억제하는 것인 방법;

핵으로부터 세포질로 β-카테닌을 전위(translocation)하는 것을 향상시키는 방법으로서, 상기 방법은 화합물을 세포에 투여하는 것을 포함하고, 상기 세포는 핵 및 세포질을 포함하고, 상기 핵은 β-카테닌을 포함하고, 상기 화합물은 β-카테닌의 핵으로부터 세포질로의 전위(translocation)를 일으키는 것인 방법;

Wnt/β-카테닌 경로에 의해 표적이 되는 유전자의 발현을 선택적으로 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 화합물을 조성물에 투여하는 것을 포함하고, 상기 조성물은 Wnt/β-카테닌 경로에 의해 표적이 되는 유전자들를 포함하고, 상기 화합물은 Wnt/β-카테닌 경로에 의해 표적이 되는 유전자들의 발현의 변화를 일으키는 것인 방법.

본 발명의 방법 및 조성물에서, 화학 약제는 식(I)의 화합물 및 및 그들의 입체이성질체들로부터 임의로 선택된다:

상기 식에서, A는 -(CHR₃)- 또는 -(C=O)-이고, B는 -(CHR₄)- 또는 -(C=O)-이고, D는 -(CHR₅)- 또는 -(C=O)-이고, E는 -(ZR₆)- 또는 -(C=O)-이고, G는 -(XR₇)_n-, -(CHR₇)-(NR₈)-, -(C=O)-(XR₉)-, 또는 -(C=O)-이고, W는 -Y(C=O)-, -(C=O)NH-, -(SO₂)-, 또는 부존재하고, Y는 산소 또는 황이고, X 및 Z는 독립적으로 질소 또는 CH이고, n=0 또는 1; 그리고 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ 및 R₉는 동일하거나 상이하고 아미노산 측쇄부분 또는 그의 유도체, 분자의 잔여부분으로부터 각각 독립적으로 선택된다.

특정 실시태양에서, 식(I)의 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ 및 R₉는 아미노C₂ _- ₅알킬, 구아니디노C₂ _- ₅알킬, C₁ _- ₄알킬구아니디노C₂ _- ₅알킬, 디C₁ _- ₄알킬구아니디노C₂ _- ₅알킬, 아미디노C_2-5알킬, C₁ _- ₄알킬아미디노C₂ _- ₅알킬, 디C₁ _- ₄알킬아미디노C₂ _- ₅알킬, C₁ _- ₃알콕시, 페닐, 치환된 페닐 (여기서 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C₁ _- ₄디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 벤질, 치환된 벤질 (여기서 벤질 상의 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C₁ _- ₄디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 나프틸, 치환된 나프틸 (여기서 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C₁ _- ₄디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 비스-페닐 메틸, 치환된 비스-페닐 메틸 (여기서 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C₁ _- ₄디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 피리딜, 치환된 피리딜, (여기서 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C₁ _- ₄디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 피리딜C₁ _- ₄알킬, 치환된 피리딜C₁ _- ₄알킬 (여기서 피리딘 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C_1-4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 피리미딜C₁ _- ₄알킬, 치환된 피리미딜C₁ _- ₄알킬 (여기서 피리미딘 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C₁ _- ₄디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 트리아진-2-일-C_1-4알킬, 치환된 트리아진-2-일-C₁ _- ₄알킬 (여기서 트리아진 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C₁ _- ₄디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 이미다졸C₁ _- ₄알킬, 치환된 이미다졸 C₁ _- ₄알킬 (여기서 이미다졸 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C₁ _- ₄디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C_1-4알킬, C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 이미다졸리닐C₁ _- ₄알킬, N-아미디노피페라지닐-N-C_0-4알킬, 히드록시C₂ _- ₅알킬, C₁ _- ₅알킬아미노C₂ _- ₅알킬, C₁ _- ₅디알킬아미노C_2-5알킬, N-아미디노피페리디닐C₁ _- ₄알킬 및 4-아미노사이클로헥실C₀ _- ₂알킬로부터 독립적으로 선택된다.

특정 실시 태양에서, A가 -(CHR₃)-이고, B가 -(C=O)-이고, D가 -(CHR₅)-이고, E가 -(C=O)-이고, G가 -(XR₇)_n- 이고, 상기 화합물은 하기 일반 식(II)를 갖는다:

상기 식에서, R₁, R₂, R₃, R₅, R₇, W, X, 및 n 은 식(I)에서 정의된 바와 같다.

특정 실시 태양에서, A가 -(C=O)-이고, B가 -(CHR₄)-이고, D가 -(C=O)-이고, E가 -(ZR₆)-이고, G가 -(C=O)-(XR₉)- 이고, 상기 화합물은 하기 일반식 (III)를 갖는다:

상기 식에서, R₁, R₂, R₄, R₆, R₉, W 및 X 는 식(I)에서 정의된 바와 같고, Z는 질소 또는 CH (Z가 CH일 때는 X는 질소이다)이다.

특정 실시 태양에서, A가 -(C=O)-이고, B가 -(CHR₄)-이고, D가 -(C=O)-이고, E가 -(ZR₆)-이고, G가 (XR₇)_n- 이고, 상기 화합물은 하기 일반식 (IV)를 갖는다:

상기 식에서, R₁, R₂, R₄, R₆, R₇, W, X 및 n은 식(I)에서 정의한 바와 같으며, Z는 질소 또는 CH (단 Z가 질소일 때 n은 0이며, 또한 Z가 CH일 때 X는 질소이고 n은 0이 아니다)이다.

특정 실시 태양에서, 상기 화합물은 하기 일반식 (VI)를 갖는다:

상기 식에서, R_a는 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 1 내지 3개 헤테로원자를 가질 수 있는 8 내지 11 환 구성원을 갖는 바이사이클릭(bicyclic) 아릴기이고, R_b 는 5 내지 7 환 구성원을 갖는 모노사이클릭 아릴기로, 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 1 내지 2개 헤테로원자를 가질 수 있으며 또한 화합물 중의 아릴 환이 할로겐화물(halide), 히드록시, 시아노, 저급 알킬, 및 저급 알콕시기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체를 가질 수 있다. 임의로, R_a는 나프틸, 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐기 이고, R_b 는 페닐, 피리딜 또는 피페리딜이고, 이들 모두는 할로겐화물, 히드록시, 시아노, 저급 알킬, 및 저급 알콕시기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있다. 특정 실시 태양에서, R_a는 나프틸이고, R_b 는 페닐이고, 할로겐화물, 히드록시, 시아노, 저급 알킬, 및 저급 알콕시기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있다.

특정 실시 태양에서, 상기 화합물은 화합물 1, 3, 4, 및 5로부터 선택된다.

다른 실시 태양에서, 본 발명은 스크린닝하는 방법, 즉 생물학적으로 활성인 화합물들이 식별되고 및/또는 그들의 효용이 평가될 수 있는 방법을 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 β-카테닌:CBP 상호작용을 억제하는 작은 분자를 식별하는 방법을 제공하는데, 이는 하기 단계를 포함한다: (a) 추정의 β-카테닌:CBP 작은 분자 억제제를 CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)과 접촉시키는 단계; (b) 상기 단계(a)의 혼합물을 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)과 접촉시키는 단계; (c) 상기 단계(a)의 상기 분자가, 상기 단계(b)의 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)이 단계(a)의 CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)과 결합하는 것을 억제하는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및 (d) 상기 단계(a)에서의 상기 분자가 CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)과 결합하는 것을 억제하는 지의 결정에 의해, 상기 단계(a)의 작은 분자를 β-카테닌:CBP 상호작용의 억제제로서 식별하는 단계.

임의로, 상기 방법은 하기 단계를 더 포함할 수 있다: (e) 상기 단계(d)의 식별된 β-카테닌:CBP 상호작용의 작은 분자 억제제를 (1) p300 1-111 을 포함하는 부분(moiety) 및 (2) β-카테닌을 포함하는 혼합물에 접촉시키는 단계; (f) 상기 단계(e)에서의 상기 분자가, 상기 p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및 (g) 상기 단계(e)에서의 상기 작은 분자가, 상기 p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는 것을 결정한 것에 의해, 상기 작은 분자가 β-카테닌:CBP 상호작용의 선택적 억제제인 것을 확인하는 단계.

본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 β-카테닌:CBP 상호작용의 작은 분자 억제제를 식별하는 방법을 제공한다: (a) 추정의 β-카테닌:CBP 상호작용의 작은 분자 억제제를 β-카테닌을 포함하는 부분으로 접촉시키는 단계; (b) 상기 단계(a)의 혼합물을 CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)과 접촉시키는 단계; (c) 상기 단계(a)의 상기 분자가, 상기 단계(b)의 CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 상기 단계(a)의 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)과 결합하는 것을 억제하는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및 (d) 상기 단계(a)에서의 상기 작은 분자가 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)이 CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)과 결합하는 것을 억제하는지의 결정에 의해, 상기 단계(a)의 작은 분자가 β-카테닌:CBP 상호작용의 억제제인지 여부를 식별하는 단계.

본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 β-카테닌:CBP 상호작용의 작은 분자 억제제를 식별하는 방법을 제공한다: (a) 추정의 β-카테닌:CBP 작은 분자 억제제를 CBP 1-111과 연합된(associated) β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)와 접촉시키는 단계; (b) 상기 단계(a)의 상기 분자가, β-카테닌으로부터 CBP 1-111를 분리시키는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및 (c) 상기 단계(a)의 상기 작은 분자가 β-카테닌으로부터 CBP 1-111를 분리시키는 것을 측정법에 의해 결정한 것에 의해, 상기 단계(a)의 작은 분자를 β-카테닌:CBP 상호작용의 억제제로 식별하는 단계.

임의로, 상기 방법은 하기 단계를 더 포함할 수 있다: (d) 상기 단계(c)에서 식별된 β-카테닌:CBP 상호작용의 작은 분자 억제제를 (1) p300 1-111 을 포함하는 부분(moiety) 및 (2) β-카테닌을 포함하는 혼합물에 접촉시키는 단계; (e) 상기 단계(d)에서의 상기 분자가, 상기 p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및 (f) 상기 단계(d)에서의 상기 작은 분자가, 상기 p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는 것을 결정한 것에 의해, 상기 작은 분자가 β-카테닌:CBP 상호작용의 선택적 억제제인 것을 확인하는 단계.

본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 β-카테닌:p300 상호작용의 작은 분자 억제제를 식별하는 방법을 제공한다: (a) 추정의 β-카테닌:CBP 상호작용의 작은 분자 억제제를 p300 1-111을 포함하는 부분으로 접촉시키는 단계; (b) 상기 단계(a)의 혼합물을 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)과 접촉시키는 단계; (c) 상기 단계(a)의 상기 분자가, 상기 단계(b)의 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)이 상기 단계(a)의 p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)과 결합하는 것을 억제하는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및 (d) 상기 단계(a)에서의 상기 작은 분자가 p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)과 결합하는 것을 억제하는지의 결정에 의해, 상기 단계(a)의 작은 분자를 β-카테닌:p300 상호작용의 억제제로서 식별하는 단계.

임의로, 상기 방법은 하기 단계를 더 포함할 수 있다: (e) 상기 단계(d)의 식별된 β-카테닌:p300 상호작용의 작은 분자 억제제를 (1) CBP 1-111 을 포함하는 부분(moiety) 및 (2)β-카테닌을 포함하는 혼합물에 접촉시키는 단계; (f) 상기 단계(e)에서의 상기 분자가, 상기 CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및 (g) 상기 단계(e)에서의 상기 작은 분자가, CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는 것을 결정한 것에 의해, 상기 작은 분자가 β-카테닌:p300 상호작용의 선택적 억제제인 것을 확인하는 단계.

본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 β-카테닌:p300 상호작용의 작은 분자 억제제를 식별하는 방법을 제공한다: (a) 추정의 β-카테닌:p300 상호작용의 작은 분자 억제제를 β-카테닌을 포함하는 부분으로 접촉시키는 단계; (b) 상기 단계(a)의 혼합물을 p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)과 접촉시키는 단계; (c) 상기 단계(a)의 상기 분자가, 상기 단계(b)의 p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 상기 단계(a)의 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)과 결합하는 것을 억제하는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및 (d) 상기 단계(a)에서의 상기 작은 분자가 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)이 p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)과 결합하는 것을 억제하는지의 결정에 의해, 상기 단계(a)의 작은 분자를 β-카테닌:p300 상호작용의 억제제로서 식별하는 단계.

임의로, 상기 방법은 하기 단계를 더 포함할 수 있다: (e) 상기 단계(d)의 식별된 β-카테닌:p300 상호작용의 작은 분자 억제제를 (1)CBP 1-111 을 포함하는 부분(moiety) 및 (2)β-카테닌을 포함하는 혼합물에 접촉시키는 단계; (f) 상기 단계(e)에서의 상기 분자가, CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및 (g) 상기 단계(e)에서의 상기 작은 분자가, CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는 것을 결정한 것에 의해, 상기 작은 분자가 β-카테닌:p300 상호작용의 선택적 억제제인 것을 확인하는 단계.

본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 β-카테닌:p300 상호작용의 작은 분자 억제제를 식별하는 방법을 제공한다: (a) 추정의 β-카테닌:p300 작은 분자 억제제를 (1) p300 1-111과 연합된(associated) β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)과 접촉시키는 단계; (b) 상기 단계(a)의 상기 분자가, β-카테닌으로부터 p300 1-111를 분리시키는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및 (c) 상기 단계(a)의 상기 분자가 β-카테닌으로부터 p300 1-111를 분리시키는 것을 측정법에 의해 결정한 것에 의해, 상기 단계(a)의 작은 분자를 β-카테닌:p300 상호작용의 억제제로서 식별하는 단계.

임의로, 상기 방법은 하기 단계를 더 포함할 수 있다: (d) 상기 단계(c)에서 식별된 β-카테닌:p300 상호작용의 작은 분자 억제제를 (1) CBP 1-111 을 포함하는 부분(moiety) 및 (2) β-카테닌 을 포함하는 혼합물에 접촉시키는 단계; (e) 상기 단계(d)에서의 상기 분자가, CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및 (f) 상기 단계(d)에서의 상기 작은 분자가, CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는 것을 결정한 것에 의해, 상기 작은 분자가 β-카테닌:p300 상호작용의 선택적 억제제인 것을 확인하는 단계.

다른 특징은, 본 발명은 핵산 및 펩티드 서열을 제공하고, 이들 서열들은 예를 들면, 치료제로서 또는 스크린닝 방법에서 유용하다. 그래서, 다양한 실험적 특징에서, 본 발명은 하기를 제공한다:

서열식별번호:1 또는 서열식별번호:1 과 80% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 서열, 단 상기 서열이 CBP 단백질을 엔코딩하지 않는다;

서열식별번호:1 의 단편 또는 상기 단편에 80% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 서열, 단 상기 서열이 CBP 단백질을 엔코딩하지 않는다;

서열식별번호:2 또는 서열식별번호:2 와 80% 이상의 상동성을 갖는 펩티드를 포함하는 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드, 단 상기 펩티드는 CBP 단백질이 아니다;

서열식별번호:2 의 단편 또는 상기 단편과 80% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드, 단 상기 펩티드는 CBP 단백질이 아니다;

서열식별번호:1 또는 서열식별번호:1 과 80% 이상의 상동성을 갖는 서열로 본질적으로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 서열, 단 상기 서열이 CBP 단백질을 엔코딩하지 않는다;

서열식별번호:1의 단편 또는 상기 단편과 80% 이상의 상동성을 갖는 서열로 본질적으로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 서열, 단 상기 서열이 CBP 단백질을 엔코딩하지 않는다;

서열식별번호:2 또는 서열식별번호:2 와 80% 이상의 상동성을 갖는 펩티드로 본질적으로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드, 단 상기 펩티드는 CBP 단백질이 아니다;

서열식별번호:2의 단편 또는 상기 단편과 80% 이상의 상동성을 갖는 서열로 본질적으로 구성되는 펩티드, 실질적으로 정제되고 분리된 서열, 단 상기 펩티드는 CBP 단백질이 아니다;

서열식별번호:1 또는 서열식별번호:1 과 80% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 서열, 단 상기 서열이 CBP 단백질을 엔코딩하지 않는다;

서열식별번호:1의 단편 또는 상기 단편과 80% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 서열, 단 상기 서열이 CBP 단백질을 엔코딩하지 않는다;

서열식별번호:2 또는 서열식별번호:2 와 80% 이상의 상동성을 갖는 펩티드로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드, 단 상기 펩티드는 CBP 단백질이 아니다;

서열식별번호:2의 단편 또는 상기 단편과 80% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드, 단 상기 펩티드는 CBP 단백질이 아니다;

서열식별번호:3 또는 서열식별번호:1 과 80% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 서열, 단 상기 서열이 p300 단백질을 엔코딩하지 않는다;

서열식별번호:1의 단편 또는 상기 단편과 80% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 서열, 단 상기 서열이 p300 단백질을 엔코딩하지 않는다;

서열식별번호:4 또는 서열식별번호:4 와 80% 이상의 상동성을 갖는 펩티드를 포함하는, 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드, 단 상기 펩티드는 p300 단백질이 아니다;

서열식별번호:4의 단편 또는 상기 단편과 80% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드, 단 상기 펩티드는 p300 단백질이 아니다;

서열식별번호:3 또는 서열식별번호:3 과 80% 이상의 상동성을 갖는 서열로 본질적으로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 서열, 단 상기 서열이 p300 단백질을 엔코딩하지 않는다;

서열식별번호:3의 단편 또는 상기 단편과 80% 이상의 상동성을 갖는 서열로 본질적으로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 서열, 단 상기 서열이 p300 단백질을 엔코딩하지 않는다;

서열식별번호:4 또는 서열식별번호:2 와 80% 이상의 상동성을 갖는 펩티드로 본질적으로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드, 단 상기 펩티드는 p300 단백질이 아니다;

서열식별번호:4 또는 상기 단편과 80% 이상의 상동성을 갖는 서열로 본질적으로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드, 단 상기 펩티드는 p300 단백질이 아니다;

서열식별번호:3 또는 서열식별번호:3 과 80% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 서열, 단 상기 서열이 p300 단백질을 엔코딩하지 않는다;

서열식별번호:3의 단편 또는 상기 단편과 80% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 서열, 단 상기 서열이 p300 단백질을 엔코딩하지 않는다;

서열식별번호:4 또는 서열식별번호:2와 80% 이상의 상동성을 갖는 펩티드로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드, 단 상기 펩티드는 p300 단백질이 아니다;

서열식별번호:4의 단편 또는 상기 단편과 80% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드, 단 상기 펩티드는 p300 단백질이 아니다;

이들 및 본 발명의 관련된 특징은 하기에 더 자세히 기술된다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 β-카테닌/TCF에 의해 매개되는 전사에 대해 반작용을(antagonize)하는 약제 및 그와 관련된 방법을 제공한다. 하나의 특징에서, 본 발명은 β-카테닌/TCF에 반응하는 유전자들의 서브세트가 특이적으로 하향조절되는 방법을 제공하고, 관련된 특징으로 본 발명은 CBP 및β-카테닌 간의 결합이 파괴되지만 구조적으로 연관된 공동 활성자 p300 및 β-카테닌 간의 결합은 파괴되지 않는 방법을 제공하고, 관련된 특징으로 본 발명은 상기 방법에 유용한 화합물들을 제공한다. 또 하나의 특징으로 본 발명은 CBP 에 의해 촉진되지만 p300에 의해서는 촉진되지 않는 유전자들이 선택적으로 활성되는 방법을 제공하고, 관련된 특징으로 본 발명은 이 방법에 유용한 화합물들을 제공한다. 또한, 본 발명은 p300에 의해 촉진되지만 CBP에 의해서는 촉진되지 않는 유전자들이 선택적으로 활성되는 방법을 제공하고, 관련된 특징으로 본 발명은 이 방법에 유용한 화합물을 제공한다. 또 다른 특징으로, 본 발명은 세포 주기의 G₁-기에서 발달을 정지시키기 위해 대장 암종 세포가 화학 약제로 처리되는 방법을 제공하는데, 여기서 화학 약제의 연장된 처리가 정상 결장 세포에서는 발견되지 않는 세포자멸사를 유도한다.

이들 방법 및 약제의 더 자세한 사항은 하기에 제공된다. 그렇지만, 이들 상세를 제공하기 전에, 하기 정의가 본 기술을 이해하는 데 독자에 도움을 주기 위해 제공된다.

정의

서열식별번호:1 은 핵산 서열이다: tgaggaatca acagccgcca tcttgtcgcg gacccgaccg gggcttcgag cgcgatctac tcggccccgc cggtcccggg ccccacaacc gcccgcgctc gctcctctcc ctcgcagccg gcagggcccc cgacccccgt ccgggccctc gccggcccgg ccgcccgtgc ccggggctgt tttcgcgagc aggtgaaaat ggctgagaac ttgctggacg gaccgcccaa ccccaaaaga gccaaactca gctcgcccgg tttctcggcg aatgacagca cagattttgg atcattgttt gacttggaaa atgatcttcc tgatgagctg.

서열식별번호:2 는 아미노산 서열이다: MAENLLDGPPNPKRAKLSSPGFSANDSTDFGSL

FDLENDLPDELIPNGGELGLLNSGNLVPDAASKHKQLSELLRGGSGSSINPGIGNVSASSPVQQGLGGQAQGQPNSAN.

서열식별번호:3은 핵산 서열이다: ccttgtttgt gtgctaggct gggggggaga gagggcgaga gagagcgggc gagagtgggc aagcaggacg ccgggctgag tgctaactgc gggacgcaga gagtgcggag gggagtcggg tcggagagag gcggcagggg ccagaacagt ggcagggggc ccggggcgca cgggctgagg cgacccccag ccccctcccg tccgcacaca cccccaccgc ggtccagcag ccgggccggc gtcgacgcta ggggggacca ttacataacc cgcgccccgg ccgtcttctc ccgccgccgc ggcgcccgaa ctgagcccgg ggcgggcgct ccagcactgg.

서열식별번호:4는 아미노산 서열이다: MAENVVEPGPPSAKRPKLSSPALSASASDGTDFG

SLFDLEHDLPDELINSTELGLTNGGDINQLQTSLGMVQDAASKHKQLSELLRSGSSPNLNMGVGGPGQVMASQAQQSSPGLGL.

작은 분자 억제제: 용어 "작은 분자"는 약 5000 g/mol 미만의 식량(formular weight)을 갖는 화학 화합물을 뜻한다. 그 화합물은 유기 또는 무기일 수 있고, 합성 또는 천연 고유일 수 있고, 예를 들면 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 펩티드 미메틱(mimetic), 올리고뉴클레오티드 미메틱, 올리고사카라이드, 올리고사카라이드 미메틱, 천연 산물 유사체 또는 유도체, 또는 예를 들면 하나 이상의 무고리기, 고리기, 탄소고리기, 이형고리기, 폴리고리기, 및/또는 방향족기를 삽입할 수 있는 순수한 합성 화합물로 분류될 수 있다. 용어 "억제제"는, 통계적으로 의미있는 정도로, 여기에 기술된 두 개의 폴리펩티드, 예를 들면, β-카테닌 및 CBP, 또는 β-카테닌 및 p300 간의 결합을 억제하는 화합물을 뜻한다. 다시 말하면, 억제제의 존재하에서, 두 개의 폴리펩티드 간의 결합이, 억제제가 부존재하는 경우에 일어난 결합에 비해여 통계적으로 의미있는 정도로 감소된다. 바람직하게는, 상기 억제제는 세포 속성, 예를 들면, 작은 분자 억제제를 투여받은 환자에서의 치료 반응에 영향을 달성하는 데 충분한 것이다.

β-카테닌:CBP 상호작용: 각각의 β-카테닌 및 CBP는 잘 알려진 폴리펩티드들이다. 예를 들면, Morin, P.J., Bioessays 21:1021-30 (1999) 및 Hecht et al. EMBO J. 19:1839-50 (2000) 를 참조하라. β-카테닌 과 CBP 의 상호작용은 문서화되었고 측정되었다. 예를 들면, Takemaru et al. J. Cell. Biol . 149:249-54 (2000) 를 참조하라. 용어 β-카테닌:CBP 상호작용은 이들 두 개의 단백질들 간에 일어나는 결합을 뜻한다.

추정(putative): 작은 분자가 활성에 대해 테스트 되기 전에, 예를 들면 β-카테닌/TCF 에 의해 활성화되는 전사의 조절자로서, 그 작은 분자는 추정 조절자로서 간주된다. 그 작은 분자가 조절 활성을 보였을 때에는, 그것은 β-카테닌/TCF 에 의해 활성화되는 전사 조절자라고 불릴 수 있다. 마찬가지로, 작은 분자가 예를 들면, β-카테닌:CBP 상호작용과 같은 단백질-단백질 상호작용의 억제제로서 테스트되기 전에는, 그 작은 분자는 β-카테닌:CBP 상호작용의 추정 억제제라고 불릴 수 있다.

접촉시킴(contacting): 두 개의 물질, 예를 들면 화학 화합물, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 등이 둘 다 액체 배지, 예를 들면 물 또는 완충액에 놓이고, 그 배지에서 그들의 움직임에 대한 장애가 놓여지지 않는 경우, 그들 두 개의 물질은 서로 접촉하게 된다. 또한, 두 물질이 서로 접촉할 수 있도록 서로 인접하게 놓여지면, 그들 물질들은 서로 접촉한다. 측정법을 수행하는데, 예를 들면, 그들이 측정 배지에 둘 다 놓여지면, 두 개의 물질은 서로 접촉되는 것이다.

β-카테닌은 당 업계에 잘 알려진 단백질을 말한다. Morin, P.J., Bioessays 21:1021-30 (1999); Gottardi et al., Curr. Biol. 11:R792-4 (2001); Huber et al., Cell 105:391-402 (2001) 를 참조하라. β-카테닌은 혈장막에서의 세포 부착의 매개자로서 그리고 전사 활성자로서 식별되었다.

용어 "측정법(assay)"는 다양한 물질들 (예를 들면, 화학물질들, 효소들, 등)이 탐지될 만한 사건을 일으키거나 일으키지 않는 선택된 조건하에서 서로 접촉되는 동안의 공정 또는 절차를 뜻한다. 그 사건이 탐지되는지 여부는 다양한 물질(들) 및/또는 선택된 조건(들)에 관한 정보를 보여준다.

용어 "결합을 억제", "상호작용을 억제", "복합체 형성을 억제" 등은 각각 두 단백질 간 결합을, 통계적으로 의미있는 정도로, 강도, 또는 도수(degree), 또는 정도(extent)를 감소시키는 것을 의미한다. 강한 결합은, 예를 들면, 두 단백질이, 복합되지 않은 형태에 비해 복합된 형태에서 상당히 더 안정되었을 때 일어날 수 있다. 단백질-단백질 결합의 정량 및 정성 연구는 당업계에 잘 알려져 있다. β-카테닌 결합과 관련된 예는 다음 문헌에 기술되어 있다: Brantjes et al., Biol . Chem. 383:255-61 (2002, for β-catenin binding with members of the T-cell factor (TCF)); Gottardi et al., Curr . Biol. 11:R792-4 (2001), for describing structural elements of β-catenin that interact with binding partners); 및 Takemaru et al., J. Cell Biol. 149:249-54 (2000, describing β-catenin interaction with CBP).

용어 "CBP 단백질"은 CREB-결합 단백질로 또한 알려진 단백질은 뜻하는데, CREB는 "cAMP-반응 요소 결합"의 약어이다. 이 단백질은 당 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, Takemaru et al., J. Cell Biol. 149:249-54 (2000) 및 미국 특허 번호 6,063,583 를 참조하라.

CBP 1-111은 CBP의 N-말단으로부터 식별된 단백질 CBP의 최초 111 아미노산을 뜻한다. 인간으로부터 분리된 CBP 의 아미노산 1-111 은 상기에 서열식별번호:2 로 기술되었다. 그에 상응하는 핵산 서열은 상기에 서열식별번호:1 로 기술되었다. 마우스으로부터 분리된 CBP 의 아미노산 1-111 은 서열식별번호:5로 하기와 같다:

MAENLLDGPPNPKRAKLSSPGFSANDNTDFGSLFDLENDLPDELIPNGELSLLNSGNLVPDAASKHKQLSELLRGGSGSSINPGIGNVSASSPVQQGLGGQAQGQPNSTN. 마우스으로부터 그에 상응하는 핵산 서열은 서열식별번호:6 으로서, 하기와 같다: atggccgaga acttgctgga cggaccgccc aaccccaaac gagccaaact cagctcgccc ggcttctccg cgaatgacaa cacagatttt ggatcattgt ttgacttgga aaatgacctt cctgatgagc tgatccccaa tggagaatta agccttttaa acagtgggaa ccttgttcca gatgctgcgt ccaaacataa acaactgtca gagcttctta gaggaggcag cggctctagc atcaacccag ggataggcaa tgtgagtgcc agcagccctg tgcaacaggg ccttggtggc caggctcagg ggcagccgaa cagtacaaac.

p300 1-111은 p300의 N-말단으로부터 식별된 단백질 p300의 최초 111 아미노산을 뜻한다. 인간으로부터 분리된 p300 의 아미노산 1-111 은 상기에 서열식별번호:4 로 기술되었다. 그에 상응하는 핵산 서열은 상기에 서열식별번호:3 으로 기술되었다.

β-카테닌은 p300 및 CBP를 포함하여 많은 수의 상이한 단백질들과 자연적으로 상호작용, 즉 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있다 (예를 들면, Hecht et al. EMBO J. 19:1839-50 (2000)를 참조하라). 복수의 상이한 잠재적 결합 파트너들이 존재할 때는, β-카테닌은 β-카테닌과 그들 잠재적 결합 파트너 간의 결합 강도에 따라, 그들 잠재적 결합 파트너들과 여러 정도로 결합할 것이다. β-카테닌 결합의 선택적 억제는 β-카테닌과 그들 결합 파트너들의 적어도 하나 (제1 결합 파트너)간의 결합 정도가, β-카테닌과 그들 결합 파트너들의 적어도 다른 하나 (제2 결합 파트너)간의 결합 정도에 비해 감소될 때 발생한다. 이러한 결합의 상대적인 감소는, β-카테닌 과 제2결합 파트너 간의 결합에 영향을 미치지 않고, β-카테닌 과 제1결합 파트너 간의 감소된 결합으로 보여질 수 있다; 또는 β-카테닌 과 제2결합 파트너 간의 결합이 증가하고, β-카테닌 과 제1결합 파트너 간의 감소된 결합으로 보여질 수 있다; 또는 그것은 β-카테닌 과 제1결합 파트너 간의 결합의 감소가 β-카테닌 과 제2결합 파트너 간의 결합의 감소보다 큰 것인 한, β-카테닌 과 제2결합 파트너 간의 결합이 감소함과 함께, β-카테닌 과 제1결합 파트너 간의 감소된 결합으로 보여질 수 있다.

용어 "p300 단백질"은 당업계에 잘 알려진 단백질을 의미한다. Gusterson, R.J. et al., J Biol Chem. 2003 Feb 28;278(9):6838-47; An and Roeder, J Biol Chem. 2003 Jan 17;278(3):1504-10; Rebel, V.I. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Nov 12;99(23):14789-94; 및 미국특허번호 5,658,784, 그리고 그 안에 인용된 참증을 참조하라.

실질적으로 정제하는 것은, 핵산 또는 폴리펩티드가 분리되고 본질적으로 다른 핵산 또는 폴리펩티드가 없다는 뜻이다. 즉 핵산 또는 폴리펩티드는 주 활성 구성 성분이다. 여기에 사용된 용어 "분리된(isolated)"은, 본래 상태에서 그것과 정상적으로는 연합된 다른 모든 분자들로부터 실질적으로 분리된 분자를 말한다. 실질적으로 정제된 및 분리된 분자는 조제에서 존재하는 우세한 종을 말한다. 실질적으로 분리된 분자는 자연 혼합물에 존재하는 다른 분자가 60% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더 바람직하게는 90 % 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 없는 (용매 제외) 것일 수 있다. 용어 "분리된"은 그들의 본래의 상태에서 존재하는 분자들을 포함하는 것을 의도하지는 않는다.

"p300 대비 CBP 에의 결합 가능성"이라는 구는 p300 대비 CBP 에 결합하는 β-카테닌 분자의 가능성을 말한다. 그러한 가능성은 주어진 조건하에서 CBP에 결합하는 β-카테닌 분자의 수 대 p300에 결합하는 β-카테닌의 분자의 수의 비율에 의해 표현됨 및/또는 측정된다. 마찬가지로, "p300 대비 CBP 에의 β-카테닌의 결합의 가능성을 변화시키는" 약제는, 반응 혼합물에 화합물이 부존재할 때의 비율과 비교하여 반응 혼합물 내에 화합물이 존재할 때 상기 기술된 바와 같은 비율을 변화시키는 화합물을 말한다.

"세포가 증식하기보다는 분화하는 가능성"이라는 어구는 세포가 증식하기보다는 분화할 가능성을 말한다. 그러한 가능성은 주어진 조건하에서 분화하는 세포의 수 대 증식하는 세포의 수의 비율에 의해 표현 및/또는 측정된다. "세포가 증식하기보다는 분화하는 가능성을 증가시키는" 약제는, 반응 혼합물에 화합물이 부존재할 때의 비율과 비교하여, 반응 혼합물 내에 화합물이 존재할 때 분화하는 세포의 수 대 증식하는 세포의 수의 비율을 증가시키는 화합물을 말한다. 마찬가지로 "세포가 분화하기보다는 증식하는 가능성을 증가시키는" 약제는, 반응 혼합물에 화합물이 부존재할 때의 비율과 비교하여 반응 혼합물 내에 화합물이 존재할 때 증식하는 세포의 수 대 분화하는 세포의 수의 비율을 증가시키는 화합물을 말한다.

"Wnt 경로"라는 어구는 Wnt 단백질 (분비된 당단백질(glycoprotein))이 프리즐된(frizzled) 7개의-막횡단-폭 수용체에 결합함에 의해 개시될 수 있다. 이 경로는 당 업계에 알려져 있고 특징이 밝혀졌고 많은 논문 및 리뷰의 대상이 되었다 (예를 들면, Huelsken and Behrens, J. Cell Sci . 115: 3977-8, 2002; Wodarz et al., Annu . Rev. Cell Dev . Biol . 14:59-88 (1998); Morin, P.J., Bioessays 21:1021-30 (1999); Moon et al., Science 296:1644-46 (2002); Oving et al., Eur. J. Clin . Invest. 32:448-57 (2002); Sakanaka et al., Recent Prog . Horm . Res. 55: 225-36, 2000 참조).

"Wnt 경로의 활성"이라는 어구는 그 경로의 하나 이상의 구성 성분의 활성을 말한다. 예를 들면, Wnt 경로의 활성은, 특정 실시 태양에서, β-카테닌이 표적 유전자들의 발현을 유도하는 활성을 뜻할 수 있다. Wnt 경로의 많은 구성 성분들이 당 업계에 알려져 있고, Cerberus (Cer), FrzB, Dickkopf (DKK), LRP, 헤테로트리머릭(heterotrimeric) G 단백질, Dsh, 카제인 키나아제 Iα (CKIα), GSK3β, TrCP, ACP, Axin, CBP, p300, β-카테닌, TCF, Froucho, 등을 포함하며 그렇지만 이에 제한되지는 않는다.

"Wnt 경로를 활성화시키는" 화합물은, Wnt 경로를 갖는 시스템에서 존재할 때 β-카테닌에 의해 유도된 표적 유전자들의 발현을 이끄는 화합물을 말한다. β-카테닌에 의해 발현이 유도되는 많은 표적 유전자들은 당 업계에 알려져 있으며, Conductin, Myc, Twin, Cyclin D1, Nkd, Ubx, En-2, PPARd, Xbra, ID2, Siamois, Xnr3, MMP7, TCF -1, survivin, 등을 포함하고 이에 제한되지 않는다. 그러한 유전자는 "Wnt/β-카테닌 경로에 의한 표적이 되는 유전자들"로서 언급될 수도 있다.

"Wnt/β-카테닌 경로에 의한 표적이 되는 유전자들의 발현의 선택적 억제"라는 어구는 Wnt/β-카테닌 경로에 의한 표적이 되는 유전자들의 서브세트의 발현을 억제하지만, Wnt/β-카테닌 경로에 의한 표적이 되는 나머지 다른 유전자들(the other genes)의 발현은 억제하지 않는 것을 뜻한다. 임의의 특정 기작에 속박되는 것을 원하지는 않지만, 본 발명의 발명자들은 유전자 발현의 선택적 억제가 β-카테닌 및 그것의 잠재적 결합 파트너들의 전부는 아닌 일부 간의 상호작용을 방해함으로써 달성될 수 있다는 것을 숙고하였다.

약제

본 발명의 한 가지 특징은 상기 기술된 방법에 사용될 수 있는 약제를 제공한다. 화합물 1 이외에, 본 발명의 방법에 유용한 다른 약제들이 일반식(I)의 화합물들 및 그들의 입체이성질체들을 스크린닝함으로써 식별될 수 있다.

상기 식에서, A는 -(CHR₃)- 또는 -(C=O)-이고, B는 -(CHR₄)- 또는 -(C=O)-이고, D는 -(CHR₅)- 또는 -(C=O)-이고, E는 -(ZR₆)- 또는 -(C=O)-이고, G는 -(XR₇)_n-, -(CHR₇)-(NR₈)-, -(C=O)-(XR₉)-, 또는 -(C=O)-이고, W는 -Y(C=O)-, -(C=O)NH-, -(SO₂)-, 또는 부존재하고, Y는 산소 또는 황이고, X 및 Z는 독립적으로 질소 또는 CH이고, n=0 또는 1; 그리고 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ 및 R₉는 동일하거나 상이하고 아미노산 측쇄 부분, 아미노산 측쇄 부분의 유도체, 또는 분자의 잔여 부분으로부터 각각 독립적으로 선택된다.

하나의 실시태양에서, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ 및 R₉는 아미노C₂ _- ₅알킬, 구아니딘C_2-5알킬, C₁ _- ₄알킬구아니디노C₂ _- ₅알킬, 디C₁ _- ₄알킬구아니디노C₂ _- ₅알킬, 아미디노C_2-5알킬, C₁ _- ₄알킬아미디노C₂ _- ₅알킬, 디C₁ _- ₄알킬아미디노C₂ _- ₅알킬, C₁ _- ₃알콕시, 페닐, 치환된 페닐 (여기서 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C₁ _- ₄디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 벤질, 치환된 벤질 (여기서 벤질 상의 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C₁ _- ₄디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 나프틸, 치환된 나프틸 (여기서 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C₁ _- ₄디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 비스-페닐 메틸, 치환된 비스-페닐 메틸 (여기서 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C₁ _- ₄디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 피리딜, 치환된 피리딜, (여기서 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C₁ _- ₄디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 피리딜C₁ _- ₄알킬, 치환된 피리딜C₁ _- ₄알킬 (여기서 피리딘 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C_1-4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 피리미딜C₁ _- ₄알킬, 치환된 피리미딜C₁ _- ₄알킬 (여기서 피리미딘 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C₁ _- ₄디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 트리아진-2-일-C_1-4알킬, 치환된 트리아진-2-일-C₁ _- ₄알킬 (여기서 트리아진 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C₁ _- ₄디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 이미다졸C₁ _- ₄알킬, 치환된 이미다졸 C₁ _- ₄알킬 (여기서 이미다졸 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C₁ _- ₄디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C_1-4알킬, C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 이미다졸리닐C₁ _- ₄알킬, N-아미디노피페라지닐-N-C_0-4알킬, 하이드록시C₂ _- ₅알킬, C₁ _- ₅알킬아미노C₂ _- ₅알킬, 하이드록시C₂ _- ₅알킬, C₁ _- ₅알킬아미노C₂ _- ₅알킬, C₁ _- ₅디알킬아미노C₂ _- ₅알킬, N-아미디노피페리디닐C₁ _- ₄알킬 및 4-아미노사이클로헥실C₀ _- ₂알킬로부터 독립적으로 선택된다.

하나의 실시 태양에서, E의 R₁, R₂, R₆ 그리고 G의 R₇, R₈ 및 R₉는 동일하거나 상이하며 화합물의 잔여 부분을 나타낸다. 그리고 A의 R₃, B의 R₄, 또는 D의 R₅는 아미노산 측쇄 부분 또는 이의 유도체로부터 선택된다.

또 하나의 실시태양에서, A의 R₃, D의 R₅, E의 R₆ 및 G의 R₇, R₈ 및 R₉는 동일하거나 상이하며 화합물의 잔여 부분을 나타내며, B의 R₁, R₂ 및 R₄ 중의 하나 이상, 또한 하나의 태양에서 이들 모두는, 아미노산 측쇄를 나타낸다. 이 경우에 용어 "화합물의 잔여 부분"은 R₃, R₅, R₆, R₇, R₈ 및/또는 R₉ 위치에서 리버스-턴 유사체 구조에 공유적으로 부착된 임의의 부분(moiety), 약제, 화합물, 지지체, 분자, 링커(linker), 아미노산, 펩티드 또는 단백질을 의미한다. 이 용어는 또한 아미노산 측쇄 부분과 이의 유도체를 포함한다.

여기서 사용되는 용어 "화합물의 잔여 부분"은 리버스-턴 유사체 구조에 공유적으로 부착된 임의의 부분, 약제, 화합물, 지지체, 분자, 링커(linker), 아미노산, 펩티드 또는 단백질을 의미한다. 이 용어는 또한 아미노산 측쇄 부분 및 그것의 유도체를 포함한다. 본 발명의 한 태양에서, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ 및/또는 R₉의 임의의 하나 이상은 화합물의 잔여부분을 나타낼 수 있다. 본 발명의 하나의 태양에서 R₁, R₂ 및 R₄의 하나 이상은 아미노산 잔기 또는 이의 유도체를 나타낼 수 있다.

여기서 사용되는 용어 "아미노산 측쇄 부분"은 표 A에 식별된 천연 아미노산 측쇄 부분을 포함하여 (이로 제한되지 않음) 천연 단백질에 존재하는 임의의 아미노산 측쇄 부분을 나타낸다. 본 발명의 다른 천연아미노산 측쇄 부분은 3,5-디브로모티로신, 3,5-디요오드(iodo)티로신, 하이드록시라이신, γ-카르복시글루타메이트, 포스포티로신 및 포스포세린의 측쇄 부분을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 그 외에, 글리코실화 트레오닌, 세린 및 아스파라긴을 포함하는 (그러나 이로 제한되지 않음) 글리코실화 아미노산의 측쇄 부분이 본 발명의 실시에 사용될 수도 있다.

아미노산 측쇄 부분 (amino acid side chain moiety)	아미노산
-H	글리신
-CH₃	알라닌
-CH(CH₃)₂	발린
-CH₂CH(CH₃)₂	류신
-CH(CH₃)CH₂CH₃	이소류신
-(CH₂)₄NH₃ ⁺	라이신
-(CH₂)₃NHC(NH₂)NH₂ ⁺	아르기닌
	히스티딘
-CH₂COO^-	아스파르트산
-CH₂CH₂COO^-	글루탐산
-CH₂CONH₂	아스파라긴
-CH₂CH₂CONH₂	글루타민
	페닐알라닌
	티로신
	트립토판
-CH₂SH	시스테인
-CH₂CH₂SCH₃	메티오닌
-CH₂OH	세린
-CH(OH)CH₃	트레오닌
	프롤린
	히드록시프롤린

천연 아미노산의 측쇄 부분 이외에, 본 발명의 아미노산 측쇄 부분은 또한 이들의 다양한 유도체를 포함한다. 여기서 사용되는 아미노산 측쇄 부분의 "유도체"는 천연 아미노산 측쇄 부분에 대한 변형 및/또는 변이체를 포함한다. 예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신 및 페닐알라닌의 아미노산 측쇄 부분은 일반적으로 저급 알킬, 아릴, 아릴알킬 부분으로 분류할 수 있다. 아미노산 측쇄 부분의 유도체는 다른 직쇄 또는 분지쇄, 환식 또는 비환식, 치환되거나 치환되지 않고, 포화되거나 또는 포화되지 않은 저급 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 부분을 포함한다.

여기서 사용되는 "저급 알킬 부분"은 탄소 원자를 1 내지 12개 포함하고, "저급 아릴 부분"은 탄소 원자를 6 내지 12개 포함하고, "저급 아르알킬 부분"은 탄소 원자를 7 내지 12개 포함한다. 따라서 하나의 실시 태양에서, 아미노산 측쇄 유도체는 C₁ _- ₁₂알킬, C₆ _- ₁₂아릴 및 C₇ _- ₁₂아릴알킬 로부터 선택되고, 더욱 바람직한 실시 태양에서는 아미노산 측쇄 유도체는 C₁ _- ₇알킬, C₆ _- ₁₀아릴 및 C₇ _- ₁₁아릴알킬로부터 선택된다.

본 발명의 아미노산 측쇄 유도체는 또한 저급 알킬, 아릴 및 아릴알킬 부분의 치환된 유도체를 포함하며, 여기서 치환체는 하기의 화학적 부분들: -OH, -OR, -COOH, -COOR, -CONH₂, -NH₂, -NHR, -NRR, -SH, -SR, -SO₂R, -SO₂H, -SOR 및 할로겐 (F, Cl, Br 및 I 포함)중 하나 이상으로부터 선택된다 (이들로 제한되지 않음). 여기서 상기 R은 각각 독립적으로 직쇄 또는 분지쇄, 환식 또는 비환식, 치환 또는 비치환, 포화 또는 불포화 저급 알킬, 아릴 및 아르알킬 부분으로부터 선택된다. 더욱이 본 발명의 환식 저급 알킬, 아릴 및 아릴알킬 부분은 나프탈렌 뿐만 아니라 티오펜, 피롤, 퓨란, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 피라졸, 3-피롤린, 피롤리딘, 피리딘, 피리미딘, 퓨린, 퀴놀린, 이소퀴놀린 및 카바졸과 같은 이형 고리 화합물을 포함한다. 아미노산 측쇄 유도체는 또한 알킬 및 아르알킬 포스포네이트 및 실란을 포함하여(이들로 제한되지 않음) 저급 알킬 및 아르알킬 부분의 알킬 부분의 헤테로 알킬 유도체를 포함한다.

대표적인 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, 및 R₉ 부분은 특히 (이들로 제한되지는 않지만) -OH, -OR, -COR, -COOR, -CONH₂, -CONR, -CONRR, -NH₂, -NHR, -NRR, -SO₂R 및 -COSR을 포함하며 여기서 R은 상기 정의한 바와 같다.

또 다른 실시태양에서, 아미노산 측쇄 부분 또는 이의 유도체 (또는 R₁, R₂, R₃, R₅, R₆, R₇, R₈ 및 R₉인 경우에 화합물의 잔여 부분) 이외에도, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ 또는 R₉는 다른 부분 또는 화합물에 대한 결합을 용이하게 하는 링커일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 진단 또는 스크린 분석을 위해 사용하기 위한 비오틴과 같은 공지된 하나 이상의 화합물에 연결될 수 있다. 또한 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ 또는 R₉는 고체 지지체 (예를 들어 고체상 펩티드 합성에 사용되는 지지체)에 화합물을 결합시키는 링커가 될 수 있다. 이 실시태양에서, 또 다른 부분 또는 화합물에의 또는 고체 지지체(solid supporter)에의 연결이 R₁, R₂, R₇ 또는 R₈ 또는 R₉ 위치에서 더욱 바람직하게는 R₁ 또는 R₂ 위치에서 이루어지는 것이 바람직하다.

A가 -(CHR₃)-이고, B가 -(C=O)-이고, D가 -(CHR₅)-이고, E가 -(C=O)-이고, 또한 G가 -(XR₇)_n-인 실시태양에서, 본 발명의 리버스-턴 유사 화합물은 다음 식 (II)를 갖는다:

상기 식에서, R₁, R₂, R₃, R₅, R₇, W, X 및 n은 상기 정의한 바와 같다. 바람직한 실시 태양에서, R₁, R₂ 및 R₇은 화합물의 잔여 부분을 나타내고, 또한 R₃ 또는 R₅는 아미노산 측쇄 부분으로부터 선택된다.

A가 -(C=O)-이고, B가 -(CHR₄)-이고, D가 -(C=O)-이고, E가 -(ZR₆)-이고, 또한 G가 -(C=O)-(XR₉)-인 하나의 실시태양에서, 본 발명의 리버스-턴 유사 화합물은 다음 일반식 (III)를 갖는다:

상기 식에서, R₁, R₂, R₄, R₆, R₉, W 및 X는 상기 정의한 바와 같으며, Z는 질소 또는 CH (단 Z가 CH일 때 X는 질소이다)이다. 바람직한 실시태양에서 R₁, R₂, R₆ 및 R₉는 화합물의 잔여 부분을 나타내고, 또한 R₄는 아미노산 측쇄 부분으로부터 선택된다.

A가 -(C=O)-이고, B가 -(CHR₄)-이고, D가 -(C=O)-이고, E가 -(ZR₆)-이고, 또한 G가 (XR₇)_n-인 더 자세한 실시태양에서, 본 발명의 리버스-턴 유사 화합물은 다음 식 (IV)를 갖는다:

상기 식에서, R₁, R₂, R₄, R₆, R₇, W, X 및 n은 상기 정의한 바와 같으며, 또한 Z는 질소 또는 CH 이다 (단 Z가 질소일 때 n은 0이며, 또한 Z가 CH일 때 X는 질소이고 n은 0이 아니다). 바람직한 실시태양에서 R₁, R₂, R₆ 및 R₇은 화합물의 잔여 부분을 나타내고, 또한 R₄는 아미노산 측쇄 부분으로부터 선택된다. 하나의 태양에서, R₆ 또는 R₇ 은 Z 및 X가 둘 다 CH일 때 아미노산 측쇄 부분으로부터 선택된다.

이들 화합물들은 적절한 출발 구성 분자 (이후에 "구성 조각"으로 언급함)를 사용하여 제조할 수 있다. 간단히 말하면, 일반식(I)의 구조를 갖는 리버스-턴 유사체의 합성에 있어서 제1 및 제2 구성조각을 짝지어서 결합된 제1-제2 중간체를 형성시키고, 필요에 따라, 제3 및/또는 제4 구성조각을 짝지어서 결합된 제3-제4 중간체 (또는 시판되는 경우, 단일 제3 중간체가 사용될 수 있음)를 형성하고, 결합된 제1-제2 중간체 및 제3-제4 중간체 (또는 제3 중간체)를 짝지어서 제1-제2-제3-제4 중간체 (또는 제1-제2-제3 중간체)를 수득하고, 이를 폐환시켜 본 발명의 리버스-턴 유사체를 수득한다. 또 다른 방법으로는, 식(I)의 리버스-턴 유사체는 개개의 구성조각들을 용액 중에서 단계별로 연속적으로 짝짓거나 또는 고체상 펩티드 합성에서 통상 실시되는 고체상 합성에 의하여 연속적으로 짝지어서 제조할 수 있다.

본 발명의 화합물들을 제조하기 위한 구체적인 구성조각 및 그의 조립체는 도 8에 예시되어 있다. 예를 들면, "제1 구성조각"은 다음 식 S1의 구조를 가질 수 있다:

상기 식에서, R₂는 상기 정의한 바와 같고, 또한 R은 펩티드 합성에 사용하기에 적합한 보호그룹이다. 이 보호 그룹은 고체 상 합성을 가능하게 하기 위해 고분자 지지체에 결합할 수 있다. 적합한 R그룹은 알킬 그룹을 포함하며 바람직한 실시태양에서 R은 메틸 그룹이다. 도 8에서 R그룹 중의 하나는 고분자(고체) 지지체이며, 상기 그림에서 "Pol"로 나타낸다. 이러한 제1 구성조각은 H₂N-R₂의 CH(OR)₂-CHO로의 환원성 아민화(amination)에 의해 또는 H₂N-R₂ 와 CH(OR)₂-CH₂-LG (여기서 LG는 이탈기, 예를 들면 할로겐(Hal) 그룹을 뜻한다)사이의 대치반응에 의해 용이하게 합성할 수 있다.

"제2 구성조각"은 다음 식 S2의 구조를 가질 수 있다.

상기 식에서, P는 펩티드 합성에 사용하기에 적합한 아미노 보호그룹이며, L₁은 하이드록실 또는 카르복실-활성화 그룹이며, 또한 R₄ 는 상기 정의한 바와 같다. 바람직한 보호 그룹은 t-부틸 디메틸실릴 (TBDMS), t-부틸옥시카르보닐(BOC), 메틸옥시카르보닐 (MOC), 9H-플루오레닐메틸옥시카르보닐(FMOC), 및 알릴옥시카르보닐 (Alloc)를 포함한다. N-보호된 아미노산은 상업적으로 시판되고 있으며; 예를 들면 FMOC 아미노산은 다양한 공급원으로부터 시판되고 있다. 제2 구성조각을 제1 구성조각과 반응시키기 위하여, L₁ 은 카르복실-활성화 그룹이며, 또한 카르복실 그룹을 활성화된 카르복실 그룹으로의 전환은 카르복실 그룹의 활성화에 대한 당해 분야에 공지된 방법으로 용이하게 달성할 수 있다. 적절한 활성화된 카르복실산 그룹은 산 할로겐화물 (acid halide) (여기서 L₁ 이 염소 또는 브롬 등의 할로겐화물임), 산무수물 (여기서 L₁은 아세틸과 같은 아실그룹, N-하이드록시 숙신이미드 에스테르 및 펜타플루오로페닐 에스테르와 같은 반응성 에스테르), 및 디시클로헥실카르보디이미드(DCC)와 같이 카르보디이미드를 사용하여 커플링 반응에서 형성된 활성 중간체와 같은 기타 활성화된 중간체를 포함한다. 따라서 상업적으로 시판되는 N-보호 아미노산은 당업계의 기술자에게 알려진 수단에 의해 카르복실 활성화 형태로 전환할 수 있다.

제2 구성조각으로 작용하는 아미노산의 아지도(azido) 유도체의 경우에, 이러한 화합물은 잘룸(Zaloom)등 (J. Org . Chem . 46:5173-76, 1981)에 기술된 반응에 의해 상응하는 아미노산으로부터 제조될 수 있다.

또 다른 방법으로는, 본 발명의 제1 구성조각은 다음 일반식 S1'를 가질 수 있다:

상기 식에서, R은 상기 정의한 바와 같고, 또한 L₂ 는 할로겐 원자 또는 토실그룹 같은 이탈기이고, 본 발명의 제2 구성조각은 다음 식 S2'의 구조를 가질 수 있다:

상기 식에서, R₂, R₄ 및 P는 상기 정의한 바와 같다.

본 발명의 "제3 구성조각"은 다음 식 S3의 구조를 가질 수 있다:

상기 식에서, G, E, L₁ 및 L₂ 은 상기 정의한 바와 같다. 적절한 제3 구성조각은 다양한 공급원으로부터 상업적으로 입수할 수 있거나 또는 유기화학에 잘 알려진 방법에 의해 제조할 수 있다.

도 8에서 식(1)의 화합물은 A가 -(C=O)-, B가 -(CHR₄)-, D가 -(C=O)-, 그리고 E가 -(CR₆)-이다. 카르보닐기가 위치 B에 있고 또한 R기가 위치 B에 있는 일반식(I)의 화합물, 즉 A가 -(CHR₃)-, B가 -(C=O)- 인 화합물은 도 9에 예시한 바와 같이, 도 8에 도시된 것과 유사한 방법으로 제조할 수 있다. 도 9는 또한 제1-제2 중간체 조각과 반응하기 전에 제4구성조각을 제3구성조각에 부착하는 것보다는 제1-제2-제3 구성 중간체에 제4성분을 첨가함을 예시하고 있다. 그 외에, 도 9는 D가 -(CHR₅)- (도 8에서와 같은 -(C=O)가 아님)이고 E가 -(C=O) (도 8에서와 같은 -(CHR₆)-가 아님)인 본 발명의 화합물의 제조를 예시하고 있다. 최종적으로, 도 9는 G가 NR₇인 화합물의 제조를 예시한다.

따라서 상기 예시한 바와 같이, 식(I)의 리버스-턴 유사체 화합물은 제1 구성조각을 제2 구성조각과 반응시켜 결합된 제1-제2 중간체를 생성시킨 다음 결합된 제1-제2 중간체를 제3 구성조각과 연속적으로 반응시켜 결합된 제1-제2-제3-제4 중간체를 생성시킨 다음 이 중간체를 폐환시켜 리버스-턴 유사체를 수득함으로써 합성될 수 있다.

식(III) 및 (IV)의 구조를 갖는 리버스-턴 유사체는 상술한 모듈 구성성분 합성법과 유사하나 그 구성조각에 적절한 변형을 가하는 기술로 제조할 수 있으며 구성조각에 따라 적절한 변형이 가능하다.

예를 들면, 본 발명에 유용한 화합물은 하기 일반식에 의해 기술될 수 있다:

상기 식에서, R₁ 은 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 1 내지 3개 헤테로원자를 가질 수 있는 8 내지 11 환 구성원을 갖는 바이사이클릭(bicyclic) 아릴기이고, R₂ 는 5 내지 7 환 구성원을 갖는 모노사이클릭 아릴기로, 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 1 내지 2개 헤테로원자를 가질 수 있으며 또한 화합물 중의 아릴 환 중 하나는 할로겐화물(halide), 히드록시, 시아노, 저급 알킬, 및 저급 알콕시기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체를 가질 수 있다.

바람직하게는, R₁ 은 나프틸, 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐기 이고, R₂ 는 페닐, 피리딜 또는 피페리딜이고, 더 바람직하게는 R₁ 는 나프틸이고, R₂ 는 페닐이다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 다음과 같은 (6S,10R)-구조(configuration)를 갖는다:

상기 식에서, R₁ 및 R₂ 는 상기 정의한 바와 같은 의미를 갖는다. 또 다른 바람직한 실시 태양에서, 일반식(I)의 화합물은 도1A 에 나타난 화학 구조를 갖고 그 화합물은 여기서 화합물1 이라고 불린다. 일반식(I)을 갖는 화합물은 Molecumetics Ltd. 에 이전된 미국 특허 번호 6,184,223 에 기술된 데로 제조될 수 있다. 앞선 논의는 화합물1의 활성에 의해 제시되었지만, 식(1)의 다른 화합물들은 본 방법에 활성에 대해 스크린닝될 수 있다.

본 발명에 유용한 추가의 예시적인 약제는 PCT 출원 공개 번호 WO03/031448, 미국 출원 공개 번호 US20040072831, 미국 출원 번호 10/803,179 및 10/826,972 에서 발견될 수 있는데, 모두 "리버스-턴 유사체 및 그에 관련된 방법" 이라는 제목으로 되어 있다.

핵산 분자

하나의 특징은, 본 발명은 β-카테닌과 p300 간의 상호작용에 비하여 β-카테닌과 CBP 간의 상호작용을 억제하는 약제를 스크린닝하는데 유용한 폴리펩티드를 엔코딩하는 다양한 핵산 분자를 공급한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명은 그 서열이 전체 길이의 인간 (또는 마우스) CBP 단백질을 엔코딩하지 않는다는 전제하에, 서열식별번호:1 (또는 서열식별번호:6) 또는 서열식별번호:1 (또는 서열식별번호:6) 에 대해 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 분자를 제공한다. 여기에 사용된 두 핵산들의 백분율 식별은 Altschul et al. (J. Mol . Biol . 215: 403-10, 1990)의 BLAST 프로그램을 그들의 기본 변수들과 함께 사용하여 측정되었다. 이들 프로그램을 Karlin 및 Altschul (Proc. Natl . Acad . Sci. USA 90:5873-7, 1993)에서 변형된 Karlin 및 Altschul (Proc . Natl . Acad . Sci. USA 87:2264-8, 1990)의 알고리듬을 수행한다. BLAST 프로그램들은 예를 들면 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov 에서 이용 가능하다. 바람직한 실시태양에서, 상기 핵산은 β-카테닌에 결합하는 펩티드를 엔코딩한다.

특정 실시 태양에서, 상기 핵산 분자는 자연 발생의 CBP 서열 (예를 들면, 인간 CBP 또는 마우스 CBP) 내에 존재하는 연속되는 아미노산 잔기 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 또는 300 개 이하를 포함하는 아미노산 서열을 엔코딩한다. 특정 실시 태양에서, 상기 핵산 분자는 서열식별번호:1 또는 서열식별번호:6 을 포함한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명은, 그 서열이 CBP 단백질을 엔코딩하지 않는다는 전제하에, 서열식별번호:1 (또는 서열식별번호:6)의 단편, 또는 상기 단편에 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 서열을 제공한다. 다양한 임의의 실시 태양에서, 상기 단편은 적어도 30, 또는 적어도 60, 또는 적어도 90, 또는 적어도 120, 또는 적어도 150, 또는 적어도 180, 또는 적어도 210, 또는 적어도 240, 또는 적어도 270, 또는 적어도 300 핵산을 갖고, 상기 단편은 독립적으로 300, 또는 270, 또는 240, 또는 210, 또는 180, 또는 150, 또는 120, 또는 90, 또는 60 핵산을 길이 (가능하다면, 단편의 최소 길이를 바탕으로)를 갖는다. 독립적으로, 그리고 또한 임의로, 핵산 서열 내의 상기 단편은 서열식별번호:1 (또는 서열식별번호:6)의 단편에 대해 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 바람직한 실시 태양에서, 핵산의 서열은 β-카테닌에 결합하는 펩티드를 엔코딩한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명은 서열식별번호:1 (또는 서열식별번호:6) 또는 서열식별번호:1 (또는 서열식별번호:6) 에 적어도 80% 의 동일성을 갖는 서열로 본질적으로 구성되는 실질적으로 정제되고 분리된 핵산을 제공한다. 다양한 임의의 실시 태양에서, 상기 서열은 서열식별번호:1 (또는 서열식별번호:6)에 대해 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 의 동일성을 갖는다. 바람직한 실시 태양에서 핵산 서열은 β-카테닌에 결합하는 펩티드를 엔코딩한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명은 서열식별번호:1 (또는 서열식별번호:6)의 단편 또는 상기 단편에 적어도 80% 의 동일성을 갖는 서열로 본질적으로 구성되는 실질적으로 정제되고 분리된 핵산을 제공한다. 다양한 임의의 실시 태양에서, 상기 단편은 적어도 30, 또는 적어도 60, 또는 적어도 90, 또는 적어도 120, 또는 적어도 150, 또는 적어도 180, 또는 적어도 210, 또는 적어도 240, 또는 적어도 270, 또는 적어도 300 핵산을 갖고, 상기 단편은 독립적으로 (가능하다면, 단편의 최소 길이를 바탕으로) 300, 또는 270, 또는 240, 또는 210, 또는 180, 또는 150, 또는 120, 또는 90, 또는 60 핵산을 길이를 갖는다. 독립적으로, 그리고 또한 임의로, 핵산 서열 내의 상기 단편은 서열식별번호:1 (또는 서열식별번호:6)의 단편에 대해 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 바람직한 실시 태양에서, 핵산의 서열은 β-카테닌에 결합하는 펩티드를 엔코딩한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명은 서열식별번호:1 (또는 서열식별번호:6) 또는 서열식별번호:1 (또는 서열식별번호:6) 에 적어도 80% 의 동일성을 갖는 서열로 구성되는 실질적으로 정제되고 분리된 핵산을 제공한다. 다양한 임의의 실시 태양에서, 상기 서열은 서열식별번호:1에 대해 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 의 동일성을 갖는다. 바람직한 실시 태양에서 핵산 서열은 β-카테닌에 결합하는 펩티드를 엔코딩한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명은 서열식별번호:1 (또는 서열식별번호:6) 의 단편 또는 상기 단편에 적어도 80% 의 동일성을 갖는 서열로 구성되는 실질적으로 정제되고 분리된 핵산을 제공한다. 다양한 임의의 실시 태양에서, 상기 단편은 적어도 30, 또는 적어도 60, 또는 적어도 90, 또는 적어도 120, 또는 적어도 150, 또는 적어도 180, 또는 적어도 210, 또는 적어도 240, 또는 적어도 270, 또는 적어도 300 핵산을 갖고, 상기 단편은 독립적으로 (가능하다면, 단편의 최소 길이를 바탕으로) 300, 또는 270, 또는 240, 또는 210, 또는 180, 또는 150, 또는 120, 또는 90, 또는 60 핵산을 길이를 갖는다. 독립적으로, 그리고 또한 임의로, 상기 핵산 서열 내의 상기 단편은 서열식별번호:1 (또는 서열식별번호:6)의 단편에 대해 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 바람직한 실시 태양에서, 핵산의 서열은 β-카테닌에 결합하는 펩티드를 엔코딩한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명은, 그 서열이 전체 길이의 인간 p300 단백질을 엔코딩하지 않는다는 전제하에, 서열식별번호:3 또는 서열식별번호:3 에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 분자를 제공한다. 특정 실시 태양에서, 상기 핵산 서열은 자연적으로 발생하는 p300 서열 (예를 들면, 인간 p300 또는 마우스 p300) 내에 존재하는 연속되는 아미노산 잔기 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 또는 300 개 미만을 포함하는 아미노산 서열을 엔코딩한다. 특정 실시 태양에서, 상기 핵산 분자는 서열식별번호:3을 포함한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명은, 그 단편이 전체 길이의 p300 단백질을 엔코딩하지 않는다는 전제하에, 서열식별번호:3 의 단편 또는 상기 단편에 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 서열을 제공한다. 다양한 임의의 실시 태양에서, 상기 단편은 적어도 30, 또는 적어도 60, 또는 적어도 90, 또는 적어도 120, 또는 적어도 150, 또는 적어도 180, 또는 적어도 210, 또는 적어도 240, 또는 적어도 270, 또는 적어도 300 핵산을 갖고, 상기 단편은 독립적으로 (가능하다면, 단편의 최소 길이를 바탕으로) 300, 또는 270, 또는 240, 또는 210, 또는 180, 또는 150, 또는 120, 또는 90, 또는 60 핵산의 길이를 갖는다. 독립적으로, 그리고 또한 임의로, 핵산 서열 내의 상기 단편은 서열식별번호:3 의 단편에 대해 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 바람직한 실시 태양에서, 핵산의 서열은 β-카테닌에 결합하는 펩티드를 엔코딩한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명은 서열식별번호:3 또는 서열식별번호:3 에 적어도 80% 의 동일성을 갖는 서열로 본질적으로 구성되는 실질적으로 정제되고 분리된 핵산을 제공한다. 다양한 임의의 실시 태양에서, 상기 서열은 서열식별번호:3에 대해 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 의 동일성을 갖는다. 바람직한 실시 태양에서 핵산 서열은 β-카테닌에 결합하는 펩티드를 엔코딩한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명은 서열식별번호:3 의 단편 또는 상기 단편에 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열로 본질적으로 이루어지는 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 서열을 제공한다. 다양한 임의의 실시 태양에서, 상기 단편은 적어도 30, 또는 적어도 60, 또는 적어도 90, 또는 적어도 120, 또는 적어도 150, 또는 적어도 180, 또는 적어도 210, 또는 적어도 240, 또는 적어도 270, 또는 적어도 300 핵산을 갖고, 상기 단편은 독립적으로 (가능하다면, 단편의 최소 길이를 바탕으로) 300, 또는 270, 또는 240, 또는 210, 또는 180, 또는 150, 또는 120, 또는 90, 또는 60 핵산의 길이를 갖는다. 독립적으로, 그리고 또한 임의로, 상기 핵산 서열 내의 상기 단편은 서열식별번호:3 의 단편에 대해 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 바람직한 실시 태양에서, 핵산 분자는 β-카테닌에 결합하는 펩티드를 엔코딩한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명은 서열식별번호:3 또는 서열식별번호:3 에 적어도 80% 의 동일성을 갖는 서열로 구성되는 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 서열을 제공한다. 다양한 임의의 실시 태양에서, 상기 서열은 서열식별번호:3 에 대해 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 의 동일성을 갖는다. 바람직한 실시 태양에서 핵산 서열은 β-카테닌에 결합하는 펩티드를 엔코딩한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명은 서열식별번호:3의 단편, 또는 상기 단편에 80% 이상의 동일성을 갖는 서열로 구성되는 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 서열을 제공한다. 다양한 임의의 실시 태양에서, 상기 단편은 적어도 30, 또는 적어도 60, 또는 적어도 90, 또는 적어도 120, 또는 적어도 150, 또는 적어도 180, 또는 적어도 210, 또는 적어도 240, 또는 적어도 270, 또는 적어도 300 핵산을 갖고, 상기 단편은 독립적으로 (가능하다면, 단편의 최소 길이를 바탕으로) 300, 또는 270, 또는 240, 또는 210, 또는 180, 또는 150, 또는 120, 또는 90, 또는 60 핵산을 길이를 갖는다. 독립적으로, 그리고 또한 임의로, 핵산 서열 내의 상기 단편은 서열식별번호:3 의 단편에 대해 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 바람직한 실시 태양에서, 핵산의 서열은 β-카테닌에 결합하는 펩티드를 엔코딩한다.

본 발명에 따른 핵산 분자는 전체 길이의 CBP 및 p300 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자를 제한 효소 또는 다른 핵산 분해 효소로 절단함으로써 얻어질 수 있다. 전체 길이의 CBP 및 p300 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자들은 당 업계에 알려진 방법으로 게놈 DNA 또는 cDNA로부터 분리될 수 있다 (Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 2001 참조). 서열식별번호:1, 3, 또는 6의 부위에 상응하는 핵산 탐침은 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 스크린닝하는데 사용될 수 있다. 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 스크린닝하는데 적합한 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 길이가 20~40 염기이고 탐지를 용이하게 하는 다양한 분자들로 표지될 수 있다 (예를 들면, 방사선핵종(radionuclide), 효소적 표지, 단백질 표지, 형광 표지 또는 비오틴). 게놈 또는 cDNA 라이브러리는 다양한 적합한 벡터에 제조될 수 있는데, 이에는 플라즈미드, 박테리오파지, 효모 인공 염색체 및 코스미드 벡터가 포함된다. 또 다른 방법으로는, 라이브러리는 시판되는 공급원으로부터 구입할 수 있다 (예를 들면, Clontech, Palo Alto, CA).

다른 방법들이 본 발명에 따른 핵산 분자들을 얻는데 사용될 수 있다. 하나의 바람직한 방법은 중합효소 연쇄 반응을 수행하여 CBP 및 p300 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자의 원하는 부위 (예를 들면, CBP 또는 p300 의 최초 111 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 부위)를 증폭시키는 것이다. PCR 증폭의 자세한 방법은 예를 들면, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, NY 1995 에 나와 있다.

핵산 분자를 얻는 또 다른 방법은 CBP 1-111 또는 p300 1-111 에 결합할 수 있는 폴리펩티드 탐침을 사용한 발현 클로닝에 의하는 것이다. 그 탐침은 CBP 1-111, p300 1-111, 또는 그것의 단편에 대한 항체를 포함할 수 있다. 발현 클로닝의 방법은 Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, NY 1995; 및 Blackwood and Eisenman, Methods in Enzymology 254: 229-40, 1995 에 기술되어 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 여기에 기술된 주어진 서열의 합성 화학 기법을 사용하여 만들어질 수 있다. 유전 코드의 디제너러시(degeneracy)는 서열식별기호:1, 3, 또는 6에 기술된 것처럼, 아미노산 서열을 엔코딩하는 서로 엇갈리는(alternate) 클레오티드 서열을 허용한다. 그러한 모든 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 범위 내이다.

CBP 또는 p300 단편을 엔코딩하는 핵산 서열은 예를 들면 친화성 태그 (예를 들면, GST 및 His-tag) 및 분비 신호를 엔코딩하는 것들과 같은 다양한 이종유래의(heterologous) 서열과 융합될 수 있다. 친화성 태그를 엔코딩하는 서열과의 융합은 융합된 태크를 통한 친화성 정제의 사용을 허용함으로써 엔코딩된 폴리펩티드의 정제를 용이하게 한다. 분비 신호를 엔코딩하는 서열과의 융합은 또한 세포 용해물, 원형질막주위공간, 체관부(phloem), 또는 성장 또는 발효 배지로부터 폴리펩티드의 회수를 허용함으로써 엔코딩된 폴리펩티드의 정제를 용이하게 한다. 사용에 적합한 분비 신호는 널리 이용되고 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들면, von Heijne, J. Mol . Biol . 184:99-105, 1985).

상기 기술된 바와 같이, 본 발명의 핵산 분자는 서열식별번호:1, 3, 또는 6 에 기술된 고유의 핵산 분자의 변이 (대립 유전자 포함)를 또한 포함할 수 있다. 그러한 변이들은 자연 변이들 (예를 들면, 디제너레이트(degenerate) 형태, 다형성(polymorphism), 스플라이스 변이 또는 돌연변이) 및 당 업계에 알려진 유전 공학에 의해 생산된 것들을 포함한다.

폴리펩티드 서열

하나의 특징은, 본 발명은 β-카테닌과 p300 간의 상호작용에 비하여 β-카테닌과 CBP 간의 상호작용을 선택적으로 억제하는 약제를 스크린닝하는데 유용한 다양한 폴리펩티드 분자를 공급한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명은 그 펩티드가 전체 길이의 CBP 단백질 (예를 들면, 인간 또는 마우스)이 아니라는 전제하에, 서열식별번호:2 (또는 서열식별번호:5) 또는 서열식별번호:2 (또는 서열식별번호:5) 에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 의 동일성을 갖는 펩티드를 포함하는 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드를 제공한다. 여기에 사용된 두 펩티드들의 백분율 식별은 Altschul et al. (J. Mol . Biol . 215: 403-10, 1990)의 BLAST 프로그램을 그들의 기본 변수들과 함께 사용하여 측정되었다. 이들 프로그램을 Karlin 및 Altschul (Proc. Natl. Acad . Sci . USA 90:5873-7, 1993)에서 변형된 Karlin 및 Altschul (Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87:2264-8, 1990)의 알고리듬을 수행한다. BLAST 프로그램들은 예를 들면 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov 에서 이용 가능하다. 바람직한 실시태양에서, 상기 펩티드는 β-카테닌에 결합한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명의 폴리펩티드 분자는 자연적으로 발생하는 CBP 서열 (예를 들면, 인간 CBP 또는 마우스 CBP) 내에 존재하는 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 또는 300 개 이하의 연속된 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시 태양에서, 상기 폴리펩티드 분자는 서열식별번호:2 또는 서열식별번호:5 를 포함한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명은, 그 펩티드가 전체 길이의 CBP 단백질이 아니라는 전제하에, 서열식별번호:2의 단편, 또는 상기 단편에 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드를 제공한다. 다양한 임의의 실시 태양에서, 상기 단편은 적어도 10, 또는 적어도 20, 또는 적어도 30, 또는 적어도 40, 또는 적어도 50, 또는 적어도 60, 또는 적어도 70, 또는 적어도 80, 또는 적어도 90 아미노산 (잔기)을 갖고, 상기 단편은 독립적으로 (가능하다면, 단편의 최소 길이를 바탕으로) 100, 또는 90, 또는 80, 또는 70, 또는 60, 또는 50, 또는 40, 또는 30, 또는 20 아미노산 (잔기)의 길이를 갖는다. 독립적으로, 그리고 또한 임의로, 펩티드 내의 상기 단편은 서열식별번호:2 의 단편에 대해 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 바람직한 실시 태양에서, 상기 펩티드는 β-카테닌에 결합한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명은 서열식별번호:2 또는 서열식별번호:2 에 적어도 80% 의 동일성을 갖는 펩티드로 본질적으로 구성되는 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드를 제공한다. 다양한 임의의 실시 태양에서, 상기 펩티드는 서열식별번호:2 에 대해 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 의 동일성을 갖는다. 바람직한 실시 태양에서 상기 펩티드는 β-카테닌에 결합한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명은 서열식별번호:2 의 단편 또는 상기 단편에 적어도 80% 의 동일성을 갖는 서열로 본질적으로 구성되는 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드를 제공한다. 다양한 임의의 실시 태양에서, 상기 단편은 적어도 10, 또는 적어도 20, 또는 적어도 30, 또는 적어도 40, 또는 적어도 50, 또는 적어도 60, 또는 적어도 70, 또는 적어도 80, 또는 적어도 90 아미노산 (잔기)을 갖고, 상기 단편은 독립적으로 (가능하다면, 단편의 최소 길이를 바탕으로) 100, 또는 90, 또는 80, 또는 70, 또는 60, 또는 50, 또는 40, 또는 30, 또는 20 아미노산 (잔기)의 길이를 갖는다. 독립적으로, 그리고 또한 임의로, 펩티드 내의 상기 단편은 서열식별번호:2 의 단편에 대해 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 바람직한 실시 태양에서, 상기 펩티드는 β-카테닌에 결합한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명은 그 펩티드가 CBP 단백질이 아니라는 전제하에, 서열식별번호:2 또는 서열식별번호:2 에 적어도 80% 의 동일성을 갖는 펩티드로 구성되는 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드을 제공한다. 다양한 임의의 실시 태양에서, 상기 펩티드는 서열식별번호:2 에 대해 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 의 동일성을 갖는다. 바람직한 실시 태양에서 상기 펩티드는 β-카테닌에 결합한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명은 서열식별번호:2 또는 상기 단편에 적어도 80% 의 동일성을 갖는 서열로 구성되는 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드를 제공한다. 다양한 임의의 실시 태양에서, 상기 단편은 적어도 10, 또는 적어도 20, 또는 적어도 30, 또는 적어도 40, 또는 적어도 50, 또는 적어도 60, 또는 적어도 70, 또는 적어도 80, 또는 적어도 90 아미노산 (잔기)을 갖고, 상기 단편은 독립적으로 (가능하다면, 단편의 최소 길이를 바탕으로) 100, 또는 90, 또는 80, 또는 70, 또는 60, 또는 50, 또는 40, 또는 30, 또는 20 아미노산 (잔기)의 길이를 갖는다. 독립적으로, 그리고 또한 임의로, 핵산 서열 내의 상기 단편은 서열식별번호:2의 단편에 대해 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 바람직한 실시 태양에서, 상기 펩티드는 β-카테닌에 결합한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명은, 그 펩티드가 전체 길이의 인간 p300 단백질을 엔코딩하지 않는다는 전제하에, 서열식별번호:4 또는 서열식별번호:3 에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 분자를 제공한다. 특정 실시 태양에서, 그 폴리펩티드는 자연적으로 발생하는 p300 서열 (예를 들면, 인간 p300 또는 마우스 p300) 내에 존재하는 연속되는 아미노산 잔기 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 또는 300 개 이하를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시 태양에서, 상기 폴리펩티드는 서열식별번호:3을 포함한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명은, 그 펩티드가 전체 길이의 p300 단백질이 아니라는 전제하에, 서열식별번호:4 의 단편 또는 상기 단편에 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드를 제공한다. 다양한 임의의 실시 태양에서, 상기 단편은 적어도 10, 또는 적어도 20, 또는 적어도 30, 또는 적어도 40, 또는 적어도 50, 또는 적어도 60, 또는 적어도 70, 또는 적어도 80, 또는 적어도 90 아미노산 (잔기)을 갖고, 상기 단편은 독립적으로 (가능하다면, 단편의 최소 길이를 바탕으로) 100, 또는 90, 또는 80, 또는 70, 또는 60, 또는 50, 또는 40, 또는 30, 또는 20 아미노산 (잔기)의 길이를 갖는다. 독립적으로, 그리고 또한 임의로, 상기 펩티드 내의 상기 단편은 서열식별번호:4 의 단편에 대해 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 바람직한 실시 태양에서, 상기 펩티드는 β-카테닌에 결합한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명은 서열식별번호:4 또는 서열식별번호:4 에 적어도 80% 의 동일성을 갖는 서열로 본질적으로 구성되는 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드를 제공한다. 다양한 임의의 실시 태양에서, 상기 서열은 서열식별번호:4에 대해 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 의 동일성을 갖는다. 바람직한 실시 태양에서 상기 펩티드는 β-카테닌에 결합한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명은 서열식별번호:4 의 단편 또는 상기 단편에 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열로 본질적으로 구성되는 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드를 제공한다. 다양한 임의의 실시 태양에서, 상기 단편은 적어도 10, 또는 적어도 20, 또는 적어도 30, 또는 적어도 40, 또는 적어도 50, 또는 적어도 60, 또는 적어도 70, 또는 적어도 80, 또는 적어도 90 아미노산 (잔기)을 갖고, 상기 단편은 독립적으로 (가능하다면, 단편의 최소 길이를 바탕으로) 100, 또는 90, 또는 80, 또는 70, 또는 60, 또는 50, 또는 40, 또는 30, 또는 20 아미노산 (잔기)의 길이를 갖는다. 독립적으로, 그리고 또한 임의로, 상기 펩티드 내의 상기 단편은 서열식별번호:4 의 단편에 대해 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 바람직한 실시 태양에서, 상기 펩티드는 β-카테닌에 결합한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명은 그 펩티드가 CBP 단백질이 아니라는 전제하에, 서열식별번호:4 또는 서열식별번호:4 에 적어도 80% 의 동일성을 갖는 펩티드로 구성되는 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드를 제공한다. 다양한 임의의 실시 태양에서, 상기 서열은 서열식별번호:4에 대해 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 의 동일성을 갖는다. 바람직한 실시 태양에서 상기 펩티드는 β-카테닌에 결합한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명은 서열식별번호:4의 단편 또는 상기 단편에 80% 이상의 동일성을 갖는 서열로 구성되는 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드를 제공한다. 다양한 임의의 실시 태양에서, 상기 단편은 적어도 10, 또는 적어도 20, 또는 적어도 30, 또는 적어도 40, 또는 적어도 50, 또는 적어도 60, 또는 적어도 70, 또는 적어도 80, 또는 적어도 90 아미노산 (잔기)을 갖고, 상기 단편은 독립적으로 (가능하다면, 단편의 최소 길이를 바탕으로) 100, 또는 90, 또는 80, 또는 70, 또는 60, 또는 50, 또는 40, 또는 30, 또는 20 아미노산 (잔기)의 길이를 갖는다. 독립적으로, 그리고 또한 임의로, 핵산 서열 내의 상기 단편은 서열식별번호:4 의 단편에 대해 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 바람직한 실시 태양에서, 상기 펩티드는 β-카테닌에 결합한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 보존적 아미노산 변경, 즉 서열식별번호:2 또는 4의 비슷하게 전하를 띤 또는 전하를 띠지 않은 아미노산의 치환을 포함한다. 보존적 아미노산 변경은 하나의 아미노산을 구조적으로 관련된 측쇄를 갖는 아미노산 패밀리의 다른 아미노산 자리에 치환하는 것을 수반한다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 일반적으로 네개의 패밀리로 구분된다: 산성 아미노산 (아스파르테이트(aspartate), 글루타메이트), 염기성 아미노산 (라이신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성 아미노산 (알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 전하를 띄지않은 극성(uncharged polar) 아미노산 (글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신). 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로 분류된다. 자연적으로 발생하지 않는 아미노산은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 형성하는 데 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 하나 이상의 이종유래의(heterologous) 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열에 융합된 CBP 또는 p300 단편 또는 이들의 동족체를 포함하는 CBP 또는 p300 융합 단백질을 제공한다. 그러한 이종유래의 폴리펩티드는 임의의 공급원의 자연적으로 발생하는 폴리펩티드에 사용할 수 있거나 또는 아미노산 서열에 재조합적으로 제조될 수 있다. 융합 단백질은 정제, 아미노산 서열에 대한 항체의 생성, 및 다양한 측정법 시스템에서 유용하다. 융합 단백질 구조에서 흔히 사용되는 단백질은 β-갈락토시데이즈, β-글루쿠로니데이즈, 녹색 형광 단백질 (GFP), 청색형광단백질 (BFP)을 포함하는 자동형광단백질, 글루타티온-S-전이효소 (GST), 루시퍼레이즈, 양고추냉이 페록시데이즈 (HRP), 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼레이즈 (CAT) 를 포함한다. 추가적으로, 에피토프 태그가 융합 단백질 구조에 사용될 수 있는데, 이에는 히스티딘 (His) 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그, 및 티오레독신 (Trx) 태그를 들 수 있다. 다른 융합 구조는 맥아당 결합 단백질 (MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인 (DBD) 융합, GAL4 DNA 결합 도메인 융합, 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) BP16 단백질 융합을 포함할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 당 업계에 알려진 다양한 방법에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들면, 서열식별번호:2 (또는 서열식별번호:4)를 포함하는 CBP (또는 p300) 단편이 친화 크로마토그래피와 같은 생화학적 방법에 의해 분리될 수 있다. CBP 또는 p300 폴리펩티드에 사용될 수 있는 친화 매트릭스는 서열식별번호:2 (또는 서열식별번호:4) 또는 그것의 단편에 대해 준비된 항-CBP 또는 항-p300 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 거기에 부착시킨 고체상일 수 있다. 또 다른 방법으로는, CBP 또는 p300 (예를 들면, β-카테닌)에 결합하는 것으로 알려진 폴리펩티드가 CBP 또는 p300 폴리펩티드 또는 그것의 단편을 분리하기 위해 친화 매트릭스로서 사용될 수 있다.

CBP, p300 또는 그것의 단편을 분리하기 위한 다른 생화학적 방법은 제조용 겔 전기영동, 겔 여과, 친화 크로마토그래피, 이온 교환 및 역상 크로마토그래피, 크로마토포커싱, 등전압포커싱 및 자당(sucrose) 또는 글리세롤 밀도 구배를 포함한다 (Deutscher, Methods in Enzymology : Guide to Protein Purification, Vol. 182, Academic Press, Inc., San Diego, Chapter 38, 1990; Balch et al., Methods in Enzymology, Vol. 257, Academic Press, Inc., San Diego, Chapter 8, 1995).

본 발명에 따른 폴리펩티드는 또한 화학 합성, 예를 들면, 고체상 펩티드 합성 방법 (Merrifield et al., J. Am. Chem . Soc. 85:2149, 1964) 에 의해 합성될 수 있다. 당 업계에 잘 알려진 표준 용액 방법이 또한 서열식별번호:2 또는 4 또는 그것의 동족체를 합성하는데 사용될 수 있다 (Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin, 1984; Bodanszky, Peptide Chemistry, SpringerVerlag, Berlin, 1993). 새로 합성된 폴리펩티드는 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있고 질량 분광법 또는 아미노산 서열 분석을 사용하여 특성을 밝힐 수 있다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 또한 재조합 DNA 방법에 의해 생산될 수 있다. 본 발명에 제공된 서열식별번호:2 또는 4 또는 그것의 동족체를 엔코딩하는 핵산은 적절한 발현 벡터로 클로닝될 수 있다. 그러한 벡터는 시판되고 있고 또는 당업자에 의해 제조될 수 있고 전사 및 해독에 필요한 발현 요소들을 포함하고 있다. 선택된 벡터는 적합한 기원의 발현 및 조절 요소가 제공된다면 또한 원핵 또는 진핵 숙주 시스템에서 사용될 수 있다. 숙주 세포에서 생산된 또는 그 세포로부터 분비된 재조합 폴리펩티드는 예를 들면, 서열식별번호:2 또는 4 또는 그것의 단편에 대한 항체로 친화 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, HPLC, 크기 제외 크로마토그래피, 암모늄 설페이트 결정화, 전기포커싱, 또는 제조용 겔 전기영동을 사용하여 분리될 수 있다 (Ausubel et al., supra; Sambrook et al., supra 일반 참조). 분리 정제된 단백질은 일반적으로 쿠마시 블루로 염색된 SDS-PAGE 겔상의 단일 밴드로서 확인된다.

본 발명은 또한 서열식별번호:2 또는 4 또는 그것의 동족체 및 이종유래의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 그러한 융합 단백질은 두개의 단백질 조각(segment)를 공유적으로 연결시킴 또는 분자 생물학 분야의 표준 절차에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 제조합 DNA 방법은, 당 업계에 잘려진 것과 같이, 적절한 제2단백질조각을 엔코딩하는 뉴클레오티드를 갖는 리딩프레임 내의 서열식별번호:2 또는 4 로부터 선택되는 코딩 서열을 포함하는 DNA 구성체를 만듬 및 상기 DNA 구성체를 숙주 세포에서 발현시킴으로써 융합 단백질을 제조하는데 사용될 수 있다. 융합 단백질을 구성하는 많은 키트가 연구실험실에 실험 도구를 공급하는 회사들, 예를 들면 Promega Corporation (Madison, WI), Stratagene (La Jolla, CA), Clontech (Mountain View, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), MBL International Corporation (MIC; Watertown, MA), 및 Quantum Biotechnologies (Montreal, Canada; 1-888-DNA-KITS)로부터 얻을 수 있다.

사용 방법

본 발명은 β-카테닌/TCF 에 의해 유도되는 전사의 서브세트를 억제하는 식(I)의 화합물을 제공한다. 예들 들면, 실시예에 상세히 기술된 바와 같이, 화합물1은 β-카테닌 및 CBP와 밀접하게 관련 있는 p300의 상호 작용을 방해하지 않고 β-카테닌 및 p300의 상호작용을 선택적으로 차단한다. 화합물1로 처리하면 β-카테닌의 핵으로부터 세포질로의 재배치를 초래하고, 특정 표적 유전자들 (예를 들면, c-myc 및 cyclin D1)의 프로모터로의 CBP의 연합을 억제하고, 그럼으로써 이들 유전자들의 발현을 억제한다. 또한, 화합물1은 형질전환된 대장 세포에서의 (그러나 정상 대장세포에서는 그렇지 않다) 세포자연사의 카스페이즈를 선택적으로 활성화시키고, 암세포의 G1/S-기 정지를 일으키고, 형질 전환된 직장결장 세포의 증식을 감소시킨다. 따라서 본 발명의 화합물은 암의 치료, 종양 성장의 감소, 세포 자연사의 증가, β-카테닌 유도의 유전자 발현의 조절 등과 같은 다양한 유용성을 갖을 수 있다.

하나의 특징은, 본 발명은 β-카테닌/p300 상호작용에 비하여 β-카테닌/CBP 상호작용을 선택적으로 억제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 β-카테닌, CBP, 및 p300 을 포함하는 조성물에 화합물을 투여하는 것을 포함하고, 상기 화합물은 β-카테닌/p300 상호작용에 비해 β-카테닌/CBP 상호작용을 선택적으로 억제한다.

또 다른 특징은, 본 발명은 β-카테닌/CBP 상호작용에 비해 β-카테닌/p300 상호작용을 선택적으로 억제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 β-카테닌, CBP, 및 p300 을 포함하는 조성물에 화합물을 투여하는 것을 포함하고, 상기 화합물은 β-카테닌/CBP 상호작용에 비해 β-카테닌/p300 상호작용을 선택적으로 억제한다. 화합물1의 특정 유사물은 β-카테닌/p300 단백질 복합체에 대해 선택적이다.

단백질-단백질 상호작용 (예를 들면, β-카테닌 과 p300 간, 및 β-카테닌 과 CBP 간의 상호작용) 뿐만 아니라, 단백질-단백질 상호작용에의 약제의 효과가 당 업계에 알려진 임의의 방법에 의해 특징지움 및/또는 측정될 수 있다. 그러한 방법은 친화 정제된 재조합 β-카테닌, CBP 및 p300 단백질 또는 그들의 단편들을 사용한 시험관 내 결합 측정법을 포함한다. 특정 실시 태양에서, 하나의 단백질 구성 성분은 고체 지지체 (예를 들면 ELISA 플레이트)에 최초 고정되어, 단백질-단백질 상호작용의 탐지 및 측정을 용이하게 할 수 있다. 단백질-단백질 상호작용은 또한 실시예에 기술된 면역침전 및 웨스턴 블롯 분석과 같은 생체 내 결합 측정법을 사용하여 특징화 될 수 있다.

또 다른 특징은, 본 발명은 β-카테닌을 핵으로부터 세포질로 전위(translocation)하는 것을 향상시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 화합물을 세포에 투여하는 것을 포함하고, 상기 세포는 핵 및 세포질을 포함하고, 상기 핵은 β-카테닌을 포함하고, 상기 화합물은 β-카테닌의 핵으로부터 세포질로의 전위(translocation)를 일으킨다. β-카테닌의 핵으로부터 세포질로의 전위는 실시예에 기술된 데로 면역형광 분석을 사용하여 탐지될 수 있다.

또 다른 특징은, 본 발명은 Wnt/β-카테닌 경로에 의해 표적되는 유전자의 발현을 선택적으로 억제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 조성물에 화합물을 투여하는 것을 포함하고, 상기 조성물은 Wnt/β-카테닌 경로에 의해 표적되는 유전자를 포함하고, 상기 화합물은 Wnt/β-카테닌 경로에 의해 표적되는 유전자의 발현의 변화를 일으킨다.

상기 지시된 바와 같이, 본 발명은 CBP에 의해 촉진된(promoted) 유전자 발현에 영향을 주기 위한 방법을 제공하고, 바람직한 실시 태양에서는 p300에 의해 촉진되는 유전자 발현에의 영향에 우선하여 CBP에 의해 촉진된(promoted) 유전자 발현에 우선적으로 영향을 주기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 CBP에 의해 촉진되는 유전자 발현에의 영향에 우선하여 p300에 의해 촉진된(promoted) 유전자 발현에 영향을 주기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 특히 CBP 및 p300 간의 구조적 유사성 및 당 업계의 많은 사람들이 CBP 및 p300을 본질적으로 동등한(equivalent) 생물학적 기능을 갖는 것으로 보는 사실의 관점에서 특히 현저하다. 이 효능은 예를 들면 설비빈(survivin) 발현에 영향을 주는 것에 적용될 수 있다.

하나의 특징은, 본 발명은 조성물을 약제에 접촉시키는 것을 포함하는, β-카테닌에 의해 유도되는 유전자 발현을 조절하는 방법을 제공하고, 이때 상기 조성물은 β-카테닌, CBP 및 p300을 포함하고, β-카테닌은 p300 보다는 CBP에 결합할 가능성이 있고, 상기 약제는 p300 대비 CBP에 β-카테닌이 결합하는 가능성을 변화시키는 유효량의 조성물로 접촉시킨다. 예시적인 특징에서, 상기 조절은 CBP의 β-카테닌에의 결합을 증가시키는 형태를 취할 수 있고, 이때 선택적으로 p300 의 β-카테닌에의 결합을 감소시키는 형태일 수 있다. 또는 상기 조절은 p300의 β-카테닌에의 결합을 증가시키는 형태를 취할 수 있고, 이때 선택적으로 CBP의 β-카테닌에의 결합을 감소시킬 수 있다. 상기 조성물은 세포일 수 있다.

관심있는 유전자들의 발현 및 이들 유전자들의 발현에의 약제의 영향은 당 업계에 알려진 임의의 적절한 방법에 의해 수행될 수 있다. 그러한 방법은 cDNA 마이크로어레이, 관심있는 유전자들의 증폭을 위한 프라이머를 사용한 RT-PCR 및 관심 있는 유전자들의 프로모터에 의해 추진되는 정보제공 활성의 측정 및 ChlP 측정법의 사용을 포함할 수 있다.

또 다른 특징에서, 본 발명은 Wnt 경로의 활성을 조절하는 방법을 제공하고, 이것은 하기를 포함한다:

(a) Wnt 경로의 구성성분을 포함하는 조성물 (i)을 Wnt 경로를 활성화시키는 화합물 (ii)과 접촉시켜서 활성화된 Wnt 경로를 제공하는 단계; 및

(b) p300 및 카테닌 간의 결합을 완전히 또는 실질적으로 방해하지만 CBP 및 카테닌 간의 결합은 거의 또는 전혀 방해하지 않는 화학 약제와 접촉시켜서 Wnt 경로의 활성을 조절하는 단계.

또 다른 특징에서, 본 발명은 세포 증식을 향상시키는 방법을 제공하고, 이것은 하기를 포함한다:

(a) 모집단의 일부는 증식하고 일부는 분화하는 세포 모집단(cell population)을 제공하는 단계; 및

(b) 모집단에 화학 약제를 첨가하는 단계, 이때 상기 약제는 분화하는 세포의 부분에 비해 증식하는 세포의 부분의 증가를 일으킨다.

세포 증식 및 세포 분화는 당 업계에 알려진 임의의 적절한 방법에 의해 특징지워질 수 있다. 그러한 방법은 실시예에 기술된 흐름세포측정법 분석 및 소프트 아가 측정법을 포함한다.

또 다른 특징은, 본 발명은 미분화 상태의 줄기 세포를 유지시키는 방법을 제공하고, 이것은 미분화상태의 줄기 세포를 유지하는 데 유효한 양의 세포 분화를 억제하거나 세포 증식을 증진시키는 약제로 줄기 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 실시 태양에서, 상기 약제는 β-카테닌 과 CBP의 상호 작용을 방해하지 않고 β-카테닌 과 p300의 상호 작용을 감소시킬 수 있다.

줄기 세포 치료법은 특정 세포 타입의 이상기능의 미성숙 사망 및 그 신체의 대체 또는 회복의 실패에 의해 야기되는 많은 퇴행성 질환을 치료하는 기회를 제공한다. 줄기 세포의 가능한 치료적 용도는 장기 이식을 위한 환자의 면역적 조건화(conditioning), 근육퇴행위축, 다발경화증 및 류머티스 관절염과 같은 자가면역 질환의 치료, 뇌졸중, 척수손상 및 화상과 같은 손상된 조직의 회복, 루게릭 질환 및 파킨슨씨, 헌팅턴씨, 및 알쯔하이머 질환과 같은 신경계 증상들과 같은 신경퇴행성 질환의 치료, 루키미아, 낫적혈구 빈혈, 심장 질환, 및 당뇨의 치료를 포함한다. 대부분의 줄기 세포 치료법을 위해, 배아 줄기 세포 또는 성체 줄기 세포가 시험관내에서 배양, 원하는 세포로의 분화 유도 및 환자에 이식될 수 있다. 줄기 세포의 성공적인 배양을 위해, 줄기 세포는 미분화 조건에 유지되어야 한다.

줄기 세포를 미분화 조건으로 유지시키기 위해, 세포 증식을 촉진하는 또는 세포 분화를 억제하는 화합물들과 같은 본 발명에 따른 화합물들은 줄기 세포 배양의 다양한 단계에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 그러한 화합물은 줄기 세포들이 그들의 원천 조직으로부터 분리될 때 사용될 수 있다. 다른 방법으로는, 그것은 배양의 특정 배양 기간 후에 배양 배지에 첨가될 수 있다. 그것은 또한 줄기 세포가 미분화 상태로 유지하기 위해 배양 배지에 계속 존재할 수도 있다. 화합물의 농도는 줄기 세포가 미분화 상태로 유지되는 또는 줄기 세포의 분화가 화합물이 없는 경우에 배양된 줄기 세포의 경우와 비교하여 감소되는 그리고 세포 배양물의 다른 특징이 역으로 영향 (예를 들면, 세포 생존율 및 세포 증식율) 받지 않는 수준으로 화합물의 양을 조정함으로써 최적화될 수 있다.

본 발명의 이들 및 다른 방법들은 화합물1 및 그것의 동족체로 여기에 식별된 화학 약제와 같은 화학 약제로 실행될 수 있다.

스크린닝 측정법

식(I)의 화합물 및 다른 약제들은 여기에 및 하기 방법에 따라 활성을 스크린닝할 수 있다.

예를 들면, 하나의 특징에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 β-카테닌:CBP 상호작용의 작은 분자 억제제를 식별하는 방법을 제공한다: (a) 추정의 β-카테닌:CBP 작은 분자 억제제를 CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)과 접촉시키는 단계; (b) 상기 단계(a)의 혼합물을 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)과 접촉시키는 단계; (c) 상기 단계(a)의 상기 분자가, 상기 단계(b)의 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)이 상기 단계(a)의 CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)과 결합하는 것을 억제하는지를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및 (d) 상기 단계(a)에서의 상기 분자가 CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)과 결합하는 것을 억제하는지의 결정에 의해, 상기 단계(a)의 작은 분자를 β-카테닌:CBP 상호작용의 억제제로서 식별하는 단계. 선택적으로, 상기 방법은 하기 단계를 더 포함할 수 있다: (e) 상기 단계(d)의 식별된 β-카테닌:CBP 상호작용의 작은 분자 억제제를 (1)p300 1-111 을 포함하는 부분(moiety) 및 (2)β-카테닌을 포함하는 혼합물에 접촉시키는 단계; (f) 상기 단계(e)에서의 상기 분자가, p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및 (g) 상기 단계(e)에서의 상기 작은 분자가, p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는 것을 결정한 것에 의해, 상기 작은 분자가 β-카테닌:CBP 상호작용의 선택적 억제제인 것을 확인하는 단계.

또 다른 특징은, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 β-카테닌:CBP 상호작용의 작은 분자 억제제를 식별하는 방법을 제공한다: (a) 추정의 β-카테닌:CBP 상호작용의 작은 분자 억제제를 β-카테닌을 포함하는 부분으로 접촉시키는 단계; (b) 상기 단계(a)의 혼합물을 CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)과 접촉시키는 단계; (c) 상기 단계(a)의 상기 분자가, 상기 단계(b)의 CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 상기 단계(a)의 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)과 결합하는 것을 억제하는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및 (d) 상기 단계(a)에서의 상기 작은 분자가 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)이 CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)과 결합하는 것을 억제하는지의 결정에 의해, 상기 단계(a)의 작은 분자를 β-카테닌:CBP 상호작용의 억제제로서 식별하는 단계. 선택적으로, 본 방법은 하기 단계를 더 포함할 수 있다: (e) 상기 단계(d)의 식별된 β-카테닌:CBP 상호작용의 작은 분자 억제제를 (1)p300 1-111 을 포함하는 부분(moiety) 및 (2)β-카테닌을 포함하는 혼합물에 접촉시키는 단계; (f) 상기 단계(e)에서의 상기 분자가, p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및 (g) 상기 단계(e)에서의 상기 작은 분자가, p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는 것을 결정한 것에 의해, 상기 작은 분자가 β-카테닌:CBP 상호작용의 선택적 억제제인 것을 확인하는 단계.

또 다른 특징은, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 β-카테닌:CBP 상호작용의 작은 분자 억제제를 식별하는 방법을 제공한다: (a) 추정의 β-카테닌:CBP 작은 분자 억제제를 CBP 1-111과 연합된(associated) β-카테닌을 포함하는 상기 부분(moiety)과 접촉시키는 단계; (b) 상기 단계(a)의 상기 분자가, β-카테닌으로부터 CBP 1-111를 분리시키는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및 (c) 상기 단계(a)의 상기 분자가 β-카테닌으로부터 CBP 1-111를 분리시키는 것을 측정법에 의해 결정한 것에 의해, 상기 단계(a)의 작은 분자를 β-카테닌:CBP 상호작용의 억제제로서 식별하는 단계. 선택적으로, 본 방법은 하기 단계를 더 포함할 수 있다: (d) 식별된 β-카테닌:CBP 상호작용의 작은 분자 억제제를 (1)p300 1-111 을 포함하는 부분(moiety) 및 (2)β-카테닌을 포함하는 혼합물에 접촉시키는 단계; (e) 상기 단계(d)에서의 상기 분자가, p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및 (f) 상기 단계(d)에서의 상기 작은 분자가, p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는 것을 결정한 것에 의해, 상기 작은 분자가 β-카테닌:CBP 상호작용의 선택적 억제제인 것을 확인하는 단계.

또 다른 특징은, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 β-카테닌:p300 상호작용의 작은 분자 억제제를 식별하는 방법을 제공한다: (a) 추정의 β-카테닌:p300 작은 분자 억제제를 p300 1-111을 포함하는 부분으로 접촉시키는 단계; (b) 상기 단계(a)의 혼합물을 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)과 접촉시키는 단계; (c) 상기 단계(a)의 상기 분자가, 상기 단계(b)의 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)이 상기 단계(a)의 p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)과 결합하는 것을 억제하는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및 (d) 상기 단계(a)에서의 상기 작은 분자가 p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)과 결합하는 것을 억제하는지의 결정에 의해, 상기 단계(a)의 작은 분자를 β-카테닌:CBP 상호작용의 억제제로서 식별하는 단계. 선택적으로, 본 방법은 하기 단계를 더 포함할 수 있다: (e) 상기 단계(d)의 식별된 β-카테닌:p300 상호작용의 작은 분자 억제제를 (1)CBP 1-111 을 포함하는 부분(moiety) 및 (2)β-카테닌을 포함하는 혼합물에 접촉시키는 단계; (f) 상기 단계(e)에서의 상기 분자가, CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및 (g) 상기 단계(e)에서의 상기 작은 분자가, CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는 것을 결정한 것에 의해, 상기 작은 분자가 β-카테닌:p300 상호작용의 선택적 억제제인 것을 확인하는 단계.

또 다른 특징은, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 β-카테닌:p300 상호작용의 작은 분자 억제제를 식별하는 방법을 제공한다: (a) 추정의 β-카테닌:p300 상호작용의 작은 분자 억제제를 β-카테닌을 포함하는 부분으로 접촉시키는 단계; (b) 상기 단계(a)의 혼합물을 p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)과 접촉시키는 단계; (c) 상기 단계(a)의 상기 분자가, 상기 단계(a)의 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)이 상기 단계(b)의 p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)과 결합하는 것을 억제하는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및 (d) 상기 단계(a)에서의 상기 작은 분자가 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)이 p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)과 결합하는 것을 억제하는지의 결정에 의해, 상기 단계(a)의 작은 분자를 β-카테닌:p300 상호작용의 억제제로서 식별하는 단계. 선택적으로, 본 방법은 하기 단계를 더 포함할 수 있다: (e) 상기 단계(d)의 식별된 β-카테닌:p300 상호작용의 작은 분자 억제제를 (1)CBP 1-111 을 포함하는 부분(moiety) 및 (2)β-카테닌을 포함하는 혼합물에 접촉시키는 단계; (f) 상기 단계(e)에서의 상기 분자가, CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및 (g) 상기 단계(e)에서의 상기 작은 분자가, CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 상기 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는 것을 결정한 것에 의해, 상기 작은 분자가 β-카테닌:p300 상호작용의 선택적 억제제인 것을 확인하는 단계.

또 다른 특징은, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 β-카테닌:p300 상호작용의 작은 분자 억제제를 식별하는 방법을 제공한다: (a) 추정의 β-카테닌:p300 작은 분자 억제제를 (1) p300 1-111과 연합된(associated) β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)과 접촉시키는 단계; (b) 상기 단계(a)의 상기 분자가, β-카테닌으로부터 p300 1-111을 분리시키는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및 (c) 상기 단계(a)의 상기 분자가 β-카테닌으로부터 p300 1-111을 분리시키는 것을 측정법에 의해 결정한 것에 의해, 상기 단계(a)의 작은 분자를 β-카테닌:p300 상호작용의 억제제로서 식별하는 단계. 선택적으로, 본 방법은 하기 단계를 더 포함할 수 있다: (d) 상기 단계(c)에서 식별된 β-카테닌:p300 상호작용의 작은 분자 억제제를 (1)CBP 1-111 을 포함하는 부분(moiety) 및 (2)β-카테닌을 포함하는 혼합물에 접촉시키는 단계; (e) 상기 단계(d)에서의 상기 분자가, CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및 (f) 상기 단계(d)에서의 상기 작은 분자가, CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는 것을 결정한 것에 의해, 상기 작은 분자가 β-카테닌:p300 상호작용의 선택적 억제제인 것을 확인하는 단계.

단백질-단백질 상호작용 (예를 들면, β-카테닌 및 p300 간의 상호작용 및 β-카테닌 및 CBP 간의 상호작용) 및 단백질-단백질 상호작용에의 약제의 효과는 당 업계에 알려진 임의의 적절한 방법에 의해 특징이 밝혀지거나 및/또는 측정될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 적합한 측정법 수단은 등온 적정 칼로리 측정법 (ITC)이 있다. ITC 실험은 MicroCal MCS 등온 적정 칼로리 측정기 (MicroCal, Northampton MA)를 제작자가 권고한 데로 본질적으로 사용하여 수행될 수 있다. 간단히 CBP C1 단편은 50mM PIPES (pH 7.5) 및 0.1mM EDTA를 포함하는 투석 완충액에 대해서 광범위하게 투석된다. DMSO 를 희석된 약물 샘플에 상응하도록 단백질 샘플에 최종 농도 0.05% 가 되도록 첨가된다. 단백질 농도는 소혈장감마글로불린을 표준으로 사용하는 Bradford 단백질 측정법 (Bio-Rad laboratories, Hercules CA) (Bio-Rad)을 사용하여 측정된다. 가용성 제약 때문에, ITC 실험은 5-15μl CBP C1 [223μM] 을 23.3μM 의 추정 작은 분자 억제제로 채워진 샘플 세포에 주입함에 의해 수행된다. 희석의 열은 샘플 세포 내의 추정 작은 분자 억제제의 포화 후에 산정되고 열역학적 변수들은 Origin 5.0 소프트웨어 패키지 (MicroCal)을 사용하여 계산된다. 희석의 더 높은 열은 추정의 작은 분자 억제제 및 CBP 단편 간의 더 강한 결합을 나타낸다. 추정의 작은 분자 억제제 및 CBP 단편 간의 더 강한 결합은 CBP 결합, 예를 들면 β-카테닌에로의 CBP 결합의 파괴에 더 효과적일 수 있는 작은 분자를 식별한다.

약학 조성물 및 투여

본 발명에 따른 핵산 분자들, 펩티드들 및 화합물들은 투여에 적합한 약학 조성물들에 포함될 수 있다. 그러한 조성물들은 전형적으로 핵산 분자들, 펩티드들 또는 화합물들 및 약학적으로 허용가능한 운반체를 포함한다. "약학적으로 허용가능한 운반체"는 약학 투여에 이용가능한 용매, 분산매, 코팅, 항세균 및 항진균제, 등장 및 흡수지연제 등을 말한다. 약학 활성 성분을 위한 그러한 매질 또는 약제의 이용은 당 업계에 잘 알려져 있다. 보조 활성 화합물이 또한 그 조성물에 포함될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 치료적 처치를 위해 비경구적, 국소적, 경구적 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 물, 완충수, 0.04 % 식염수, 0.3 % 글리신 등의 다양한 수성 운반체가 사용될 수 있고, 알부민, 지질단백, 글로불린 등과 같은 안정성을 강화하는 다른 단백질들을 포함할 수 있다. 그 결과 조성물은 기존의, 잘 알려진 멸균기법에 의해 멸균될 수 있다. 그 용액은 사용을 위해 포장될 수 있고, 무균 조건에서 여과되고 냉동 건조될 수 있고, 상기 냉동 건조된 제조물은 투여전에 멸균된 용액과 결합된다.

경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 운반체를 포함한다. 그들은 젤라틴 켑슐에 봉해 넣어지거나 또는 정제에 압축되어 있다. 경구 치료적 투여의 목적을 위해, 상기 활성 화합물은 부형제와 함께 포함되어 정제, 트로키 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 약학적으로 이용가능한 결합제, 및/또는 애주반트 물질이 상기 조성물의 부분으로서 포함될 수 있다. 상기 정제, 환, 캡슐, 트로키 등은 하기 성분 중 하나 또는 비슷한 속성의 화합물들을 포함할 수 있다: 바인더 (예를 들면, 미정질(微晶質)의 셀룰로스, 트래거캔쓰 고무 또는 겔라틴); 부형제 (예를 들면, 전분 또는 젖당), 붕해제(disintegrating agent) (예를 들면, 알긴산, 프리모겔, 또는 옥수수 전분); 윤활제 (예를 들면, 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스); 유동화제(glidant) (예를 들면, 콜로이드 실리콘 디옥사이드); 감미제 (예를 들면, 자당 또는 사카린); 또는 향미제 (예를 들면, 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지 향).

흡입에 의한 투여를 위해, 상기 화합물들은 예를 들면 이산화탄소와 같은 탄소 또는 네불라이저의 적합한 분사제를 포함하는 압축 용기 또는 분배기로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다.

전신 투여는 또한 점막 경우 또는 경피 수단에 의할 수 있다. 점막 경우 또는 경피 투여를 위해 스며들어야 할 장벽에 적합한 침투제가 조제에 사용된다. 그러한 침투제는 당 업계에 일반적으로 알려져 있고, 예를 들면 점막 경우 투여를 위해 세제, 담즙산염, 및 푸시딘산(fusidic acid) 유도체를 포함한다. 점막 경우 투여는 코 스프레이 또는 좌제의 사용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여를 위해서는, 활성 화합물은 당 업계에 일반적으로 알려진 연고(ointments), 고약(salves), 겔, 또는 크림으로 제조될 수 있다.

하나의 실시 태양에서, 그 활성 화합물들은 이식 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어된 방출 제형과 같은, 그 화합물을 체내로부터 급속 제거하는 것으로부터 보호하는 운반체와 함께 제조된다. 생분해 가능한, 생이용가능한 폴리머들이 사용될 수 있는데, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜린산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리젖산 등이 있다. 그러한 제형을 제조하는 방법은 당 업자에 명백할 것이다. 그 물질들은 또한 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc. 에서 시판된다.

투여의 편의성 및 복용량의 단일성을 위해 복용량 단위 형태로 경구 또는 비경구 조성물을 조제하는 것이 특히 이로운 점이 있다. 여기서 사용된 복용량 단위 형태는 처치되는 환자에 대한 단일 복용량으로서 적합한 물리적으로 구별된 단위를 말한다; 각각의 단위는 필요한 약학 운반체와 연합하여 소망하는 치료 효과를 산출하도록 계산된 활성 성분의 소정의 양을 포함한다. 본 발명의 복용량 단위 형태의 상세는 활성 성분의 독특한 특징 및 달성하고자 하는 특정 치료 효과 및 개개인의 치료를 위한 활성 화합물을 조제하는 기술에 고유한 제약에 직접적으로 의존하고, 그에 의해 지시된다.

그러한 화합물들의 독성 및 치료효과는 세포 배양에서의 표준 약학 절차 또는 실험 동물, 예를 들면 LD50 (모집단의 50%에 치사량) 및 ED50 (모집단의 50%에 치료적 유효량)의 결정을 위한 실험 동물에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 간의 양의 비율은 치료 지표이고 그것은 LD50/ED50으로 표현될 수 있다. 큰 치료 지표를 보이는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 보이는 화합물들이 사용될 수 있지만, 그러한 화합물들이 영향받는 조직의 부위에 도달하도록 하는 전달 시스템을 설계하는 데 감염되지 않은 세포에 잠재적 손상을 최소화하고, 그럼으로써 부작용을 줄이기 위해 주의를 기울여야 한다.

세포 배양 측정법 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간에 사용하기 위한 복용량의 범위를 공식화하는 데 사용될 수 있다. 그러한 화합물의 복용량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내이어야 한다. 복용량은 사용된 복용 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 변화될 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 임의의 화합물에 대해, 치료적 유효량은 처음에는 세포 배양 측정법으로 산정될 수 있다. 그 양은 세포 배양물에서 결정된 IC50 (증상의 최대치의 반 억제를 달성하는 테스트 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 공식화될 수 있다. 그러한 정보는 인간에서 유용한 양을 더 정확히 결정하는 데 사용될 수 있다. 혈장 내의 수준은, 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공되고 그것을 제한하는 것으로 해석되어서는 않 된다.

도1 . 화합물1은 β-카테닌/TCF 전사를 억제한다.

A(i) 및 A(ii). 화합물1, 화합물2, 화합물3, 화합물4, 및 화합물5의 구조.

B(i) 및 B(ii). 화합물1은 β-카테닌/TCF 정보제공 유전자(reporter gene) 구조체(construct)를 5μM 의 IC₅₀ 으로 억제한다. SW480 세포 (10⁵) (도1B(i)) 는 β-카테닌/TCF 루시퍼레이즈 구조체로 형질변환(transfect)되었다. 세포는 화합물1 (1-64 μM)로 처리되었다. 처리 후 24시간에 용해질(lysate)이 제조되었고 이중 루시퍼레이즈 측정법(dual luciferase assay)을 행하였다. 데이터는 도1B(ii)에 상이한 형태로 제시된다.

C. 화합물1은 NFAT 정보제공 구조체에 영향을 미치지 않는다. NFAT 정보제공 구조체로 안정하게 형질변환된 쥬르카트 세포(Jurkat cells) (우측 패널)는 PMA (10 ng/ml)/이오노마이신(Ionomycin) (1 g/ml) 으로 자극되었고, 화합물1 (0.781-50 μM)로 처리되었다. 처리 후 24시간에 용해질(lysate)이 제조되었고 이중 루시퍼레이즈 측정법(dual luciferase assay)을 행하였다. 모든 실험은 두벌씩 수행되었고 그 값은 평균 +/- 표준 편차로 플롯되었다.

D. CBP는 화합물1의 분자 표적이다. SW480의 핵 추출물은 화합물2 (25μM) 로 코팅된 스트렙타비딘-아가로스 비드(bead)와 함께 배양되었다. 비드는 세번 세척되었고, 용리된 것을 항-CBP 항체와 함께 겔 전기영동 및 면역블롯을 하였다. 화살표는 CBP에 대한 면역 활성에 의해 그리고 크기가 상응하는 밴드를 가리킨다.

E. ¹⁴C-표지된-화합물1은 CBP에 결합한다. 화합물1은 ¹⁴C-표지된 티로신의 삽입에 의해 제조되었다. SW480세포는 전체 길이의 Xenopus laevis β-카테닌을 발현하는 운반체 (2.2 ㎍) 또는 전체 길이의 마우스 CBP 을 발현하는 운반체(1.1 ㎍)로 형질변환되었다. 50㎍의 핵 용해질(lysate) (NE-PER kit, Pierce)이 20μM 의 ¹⁴C-표지된-화합물1 (7.16 X 10⁴ CPM)으로 DMSO (0.5%) 또는 100μM 및 200μM 의 차가운 화합물1로 처리되었다. 용해질(lysate)은 G-25 1cc 컬럼을 사용하여 제염(desalt)되어서 결합되지 않은 ¹⁴C-표지된-화합물1을 제거하였고, ¹⁴C-표지된-화합물1 삽입이 측정되었다.

도2 . CBP의 최초 111 아미노산은 화합물1에 특이적으로 결합하나, p300은 그렇지 않다.

A. 야생형 및 CBP 에 대한 결손(deletion) 구조체의 도식적 표현.

B. CBP (1-111)은 화합물1의 최소 결합 도메인을 포함한다. SW480 세포 내에서 CBP 결손 구조체의 발현 수준이 나타난다 (상부 패널). 10㎍의 총 단백질이 항-His 항체를 사용하여 전기 영동되었고 면역블롯을 하였다. CBP 결손 구조체를 발현하는 SW480 세포의 전체 세포 용해질은 100μM의 화합물2로 코팅된 스트렙타비딘-아가로스 비드에 결합되었다. 결합된 분획(fraction)은 항-His 항체를 사용하여 전기 영동 및 면역블롯 되었다 (하부 패널). 화살표는 화합물2로 코팅된 비드에 결합된 채로 남아있는 구조체를 가리킨다.

C. 과량의 화합물1은 CBP (1-111)을 경합하여 제거하지만, p300 (1-111)을 경합하여 제거하지는 않는다. CBP 결손 구조체들인 CBP (1-111), CBP (1-211) 및 CBP (1-351), 그리고 p300 결손 구조체들인 p300 (1-111), p300 (1-211), 및 p300 (1-351) 은 SW480 세포로 형질변환되었다. 전체 세포 용해질은 스트렙타비딘-아가로스 비드 또는 100μM의 화합물2로 코팅된 스트렙타비딘-아가로스 비드와 함께 배양되었다 (하부 패널). CBP 구조체 (1-111, 1-211, 및 1-351) 및 p300 구조체 (1-111, 1-211, 및 1-351) 의 비드로의 결합은 과량의 화합물1 (150 μM)로 도전된다 (challenged).

D. CBP (1-111)은 인산화 독립 방식으로 화합물1에 결합한다. CBP (1-111) 또는 p300 (1-111)은 E. coli 에서 발현되었고 Ni-NTA-아가로스 (코마시 블루 염색된 겔)에 의해 정제되었다. CBP (1-111)이 보인다 (상부, 우측). 1 및 3 ㎕ 의 정제된 단백질은 항-His 항체를 사용하여 면역블롯을 하였다. 화살표는 그들의 적절한 항체에 의해 인식되는 재조합 단백질을 지시한다. 증가하는 양의 정제된 CBP (1-111) (0.5, 1 및 3 ㎕) 및 p300 (1-111) (1, 3, 및 5 ㎕) 가 100μM의 화합물2로 코팅된 스트렙타비딘-아가로스 비드와 함께 배양되었다. 그 비드는 세척되었고 그 용리된 단백질들은 항-His 항체를 사용하여 전기영동 및 이어서 면역블롯되었다. 화살표는 PVDF 막상의 단백질들을 지시한다. 특이적 결합 상호작용은 과량의 화합물1 (300μM)을 사용하여 도전되었다(challenged).

E. CBP 의 Δ1-111 + NLS 구조체는 화합물1에 의해 억제되는 β-카테닌/TCF 전사를 구조(rescuing)할 수 없다. SW480 세포는 전체 길이 또는 CBP (Δ1-111 + NLS) 둘 중 하나를 발현하는 발현 벡터 (0.1 - 1)㎍ 으로 형질변환되었다. 형질변환 24시간 후에 세포는 화합물1 (25μM) 또는 대조군(0.5% DMSO)으로 처리되었다. 처치 24시간 후에 용해질이 제조되었고 이중 루시퍼레이즈 측정법을 수행하였다.

도3 . 화합물1은 β-카테닌:CBP 복합체를 파괴하나 p300/β-카테닌 복합체를 파괴하지는 않는다.

A. 전체-길이의 Xenopus laevis β-카테닌 (1.1, 2.2, 및 3.3 ㎍) 또는 마우스의(murine) CBP (0.14, 0.28, 0.55, 1.1, 및 2.2 ㎍) 플라즈미드가 β-카테닌/TCF (1.1㎍) 정보제공 유전자 구조체와 함께 SW480 세포 내에 공동 형질변환되었다. 빈(empty) pcDNA3 벡터가 각각의 반응에 사용된 DNA의 양을 동등하게 하기 위해 사용되었다. 이중 루시퍼레이즈 측정법이 화합물1 처리 24시간 후에 수행되었다. 모든 실험은 두벌씩 수행되었고 그 값은 평균 +/- 표준 편차로 플롯되었다.

B. 화합물1은 CBP에 대해 β-카테닌과 경합한다. SW480 세포는 5 또는 10 μM 의 화합물1 또는 대조군 (0.5% DMSO)으로 처리되었다. 처리 24시간 후에, 용해질은 대조군 항체 또는 항-CBP 또는 항-p300 항체로 코팅된 비드와 함께 배양되었다. 함께 면역침전된 단백질들은 항-β-카테닌 항체를 사용하여 겔 전기영동 및 면역블롯되었다. 화살표들은 면역침전된 β-카테닌을 지시한다 (이중선).

C. CBP (1-111)은 β-카테닌과의 상호작용의 최소한의 부위(region)이다. CBP 결손 시리즈로 형질변환된 SW480 세포는 단백질A-아가로스 비드로 코팅된 항-β-카테닌 항체를 사용하여 면역침전되었다. 면역 복합체는 세척되었고, 항-His 항체를 사용하여 겔 전기 영동 및 뒤이어 면역블롯 되었다. 화살표는 비드에 결합되어 남아있는 구조체를 지시한다.

D. 화합물1은 CBP에 대해 β-카테닌과 경합하지만 p300 구조체에 대해서는 경합하지 않는다. CBP (1-111, 1-211, 및 1-351) 및 p300 (1-111, 1-211, 및 1-351) 구조체가 SW480 세포 (하부 패널)에로 형질변환되었다. 형질변환 48시간 후에 모든 세포 용해질이 제조되었고, 상기 기술된 단백질A-아가로스-항-β-카테닌 항체를 사용하여 면역침전되었다 (중앙 패널). 면역 복합체는 세척되었고 항-His 항체를 사용하여 겔 전기영동 및 면역블롯되었다. 화살표는 결합된 단백질 (상부 패널)을 지시한다. 경합 측정법을 위해, 비드상의 면역 복합체들은 50μM의 화합물1로 도전되었다.

E. 공통 β-카테닌 결합 모티프를 갖는 CBP 및 p300의 서열 배열 (서열식별번호: 47-55). 공통 서열에 박스 되어있다. 배열은 NCBI 데이터베이스 내의 단백질 서열을 위한 프로그램 BLAST를 사용하여 수행되었다.

F. CBP 1-111 (CBP M1, 서열식별번호:2) 및 p300 1-111 (p300 M1, 서열식별번호:4) 의 서열 배열.

도4 . 화합물1은 핵의 β-카테닌을 감소시킨다.

A. β-카테닌 면역 형광 현미경검사. SW480의 로그기(log phase) ( 좌측) 및 HCT116 (우측) 세포가 항-β-카테닌 빨강(red) (상부 패널, A) 또는 항-CBP (상부 패널, B) 녹색(green) 으로 고정되고 염색되었다. 중앙 패널은 SW480 및 HCT 116 (우측) 세포 내의 중첩된(superimposed) β-카테닌 및 CBP 를 (좌측) 를 나타낸다. 하부 패널은, 화합물1 (25μM)을 24시간 동안 처치시 β-카테닌을 SW480 의 세포질 (좌측) 및 HCT116 세포의 세포질 막 (우측)에로의 재배열을 보여준다.

B. β-카테닌의 웨스턴블롯 분석. 화합물1의 24시간 처리한 또는 처리하지 않은 SW480 세포의 세포 추출물로부터의 25㎍의 총 단백질이 세포질 및 핵의 β-카테닌의 탐지를 위해 사용되었다.

도5 . 화합물1은 cyclin D1의 발현을 억제한다.

A. cyclin D1 수준은 화합물1의 처리로 감소한다. 웨스턴블롯 측정법이 25㎍의 화합물1 또는 대조군 (0.5% DMSO) 중 어느 하나로 4, 8, 또는 24 시간동안 처리된 25㎍의 SW480 전체 세포 용해질에 대해 수행되었다. 면역블롯이 항-Cyclin D1 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc.)를 사용하여 수행되었다.

B. CBP 및 p300 에 의한 cyclin D1 및 c- myc 프로모터의 생체 내 점유. ChIP (재료 및 방법 참조) 는 화합물1 처리시 c- myc 프로모터의 CBP 및 p300 점유를 보여준다. ChIP 측정법이 화합물1 (25μM) 또는 대조군 (0.5% DMSO)으로 8시간 동안 처리된 SW480 세포로부터 c- myc 프로모터에 대해 수행되었다. CBP (AC-26, 메사추세츠주 보스턴의 하버드 대학의 데이비드 리빙스턴 박사로부터의 관대한 선물) 또는 p300 (C-20, Santa Cruz Biotechnology Inc.) 특이성 항체들이 화합물1 또는 대조군 (DMSO) 처치의 존재하에서 CBP 또는 p300에 의한 프로모터 점유를 평가하기 위해 사용되었다.

도6 .

A. 화합물1은 세포를 G₁에서 정지시킨다. FACS 분석은 화합물1 (25 μM)(우측) 또는 대조군 (0.5% DMSO) (좌측) 으로 24시간 동안 처리된 SW480 (하부 패널) 및 HCT116 (상부 패널) 세포에 대해 수행하였다. 5.5x10⁶세포는 요오드화 프로피듐(PI)으로 고착 및 염색시켰다. G₀/G₁, S, 및 G₂/M 은 화살표에 의해 지시된다.

B. 화합물1는 대장 암종 세포주에서 카스파제를 선택적으로 활성화 시킨다. 정상 대장 세포 CCD18Co (우측 그래프)와 함께 SW480 및 HCT116 (좌측 그래프) 세포(10⁵)는 대조군 (0.5% DMSO) 또는 화합물1 (25μM)로 처리하였다. 처리 24시간 후, 세포는 용해되었고(lysed), 카스파제-3/7 효소활성을 측정하였다. 상대형광단위 (RFU)는 처리된 샘플 (화합물1 또는 대조군)로부터 블랭크(대조군, 세포 없음)의 단위 값을 빼서 계산한 다음 플롯하였다.

도7 . 화합물1은 용량 의존 방법으로 소프트 아가에서 콜로니 생장을 감소시킨다.

A. 증가하는 농도의 5-플루오로우라실 (5-FU) (0.5-32μM) 및 화합물1 (0.25-5μM)은 삼중 웰의 SW480 (5000 세포/웰)에 첨가하였다. 세포는 세척되었 고 소프트 아가 성장 배지에 현탁되었다. 8일 후 콜로니의 수 (60μM 직경이상의 콜로니)를 세고 화합물 농도에 대해 플롯 하였다. 3개 결정의 평균 ± SE 가 지시된다. 화합물의 부재 하에 대조군의 콜로니 수는 1,637±71이었다.

B. 화합물1의 효과의 개략적 표현. 그들의 이론에 속박될 의도는 없이, 출원인들은 β-카테닌/TCF 복합체가 공동활성자(coactivator) 의존 방식으로 그것의 다운스트림 표적 유전자들의 발현을 조절한다는 것을 제안한다. 더 자세히는, 핵의 β-카테닌/TCF는 CBP 또는 p300과 다르게(differentially) 연합된다는 것 및 그 3량체 복합체가 β-카테닌/TCF 반응 유전자의 서브세트의 발현을 추진한다는 것을 제시한다. 화합물1은 특이적으로 그리고 선택적으로 β-카테닌/TCF/CBP를 표적으로 하지만, β-카테닌/TCF/p300 복합체를 표적으로 하지는 않고, CBP 의존성인 cyclin D1, axin2, 및 hnkd 과 같은 유전자들의 발현을 하향 조절한다. 화합물1의 처리는 β-카테닌:CBP 상호작용의 차단을 통해서, 그것의 프로모터가 공동활성자를 이용할 수 있는 유전자 (c-myc) 또는 바람직하게는 p300을 공동활성자로서 이용할 수 있는 유전자 (c- jun 및 fra -1) 의 발현에 이용가능한 β-카테닌/TCF 복합체를 증가시킨다.

도8 은 본 발명의 실행에 유용한 화학 약제를 제조하기 위한 일반적인 합성 개략을 제공한다.

도9 는 본 발명의 실행에 유용한 화학 약제를 제조하기 위한 일반적인 합성 개략을 제공한다.

도10 . 화합물3의 대사 분석.

A. 래트에서의 화합물3 및 그것의 대사물에 대한 다이오드 어레이 트레이스(diode Array trace) (상부 패널) 및 총 이온 전류 (하부 패널).

B. 인간에서의 화합물3 및 그것의 대사물에 대한 다이오드 어레이 트레이스(diode Array trace) (상부 패널) 및 총 이온 전류 (하부 패널).

제조예

제조예 1

( N- Fmoc -N'- R ₃ - 메틸 히드라지노 )- 아세트산 의 제조

(1) N- Fmoc -N'-메틸 히드라진 의 제조

2L, 두 개의 목을 갖는, 둥근 바닥모양의 플라스크가 유리 스토퍼 및 칼슘 튜브와 함께 설치되었다. THF (300mL) 내의 메틸히드라진 설페이트 (20g, 139 mmol, R₃ 는 메틸)가 첨가되었고, THF 내의 DiBoc 용액 (33 g, 153 mmol)이 첨가되었다. 중탄산 나트륨 포화 수용액 (500 ml)이 한 방울씩 첨가 깔때기를 통해 격렬한 교반과 함께 2시간 동안 첨가되었다. 6시간 후에, THF 내의 Fmoc-Cl (39 g, 153 mmol) 용액이 천천히 첨가되었다. 그 결과 현탁액은 6 시간 동안 0 ℃ 에서 교반하였다. 그 혼합물은 에틸 아세테이트 (EA, 500 mL) 로 추출하였고, 유기층이 유지되었다. 그 용액을 황산 나트륨으로 건조시키고, 진공하에 증발시켰다. 그 다음 단계는 정제과정 없이 진행하였다.

1L, 두개의 목을 갖는, 둥근 바닥모양의 플라스크가 유리 스토퍼 및 칼슘 튜브와 함께 설치되었다. 이전 단계의 생산물 용액을 MeOH(300mL) 에 넣고 농축된 HCl (30 mL, 12 N) 이 얼음수 욕조에서 마그네틱 교반을 하며 첨가 깔때기를 통해 천천히 첨가되었고, 밤새 교반하였다. 상기 혼합물은 EA (1000mL) 로 추출되었고 유기층이 유지되었다. 그 용액을 황산 나트륨으로 건조시키고, 진공하에 증발시켰다. 그 나머지는 n-헥산 및 EA와 함께 재결정화에 의해 정제되어서 N-Fmoc-N'-메틸 히드라진 (32.2 g, 83%)을 얻었다. ¹HNMR (DMSO-D₆) δ 7.90~7.88 (d, J=6 Hz, 2H,), 7.73~7.70 (d, J=9 Hz, 2H,), 7.44~7.31 (m, 4H), 4.52~4.50 (d, J=6 Hz, 2H), 4.31~4.26 (t, J=6 Hz, 1H), 2.69 (s, 1H).

(2) (N-Fmoc-N'-메틸-히드라지노)-아세트산 t-부틸 에스테르의 제조

1L, 두개의 목을 갖는, 둥근 바닥모양의 플라스크가 유리 스토퍼 및 칼슘 튜브와 연결된 환류 냉각기(reflux condenser)와 함께 설치되었다. 톨루엔 내의 N-Fmoc-N'-메틸-히드라진 (20 g, 75 mmol) 용액 (300 mL)이 첨가되었다. 톨루엔 내의 t-부틸브로모 아세테이트 (22 g, 111 mmol) 용액 (50 mL)이 천천히 첨가되었다. Cs₂CO₃ (49 g, 149 mmol)가 천천히 첨가되었다. NaI (11 g, 74 mmol)가 격렬한 교반과 함께 천천히 첨가되었다. 반응 혼합물은 하루 이상 환류(reflux) 온도에서 교반 되었다. 생성 혼합물은 여과되고 EA (500 mL)로 추출되었다. 그 용액을 황산 나트륨으로 건조시키고, 진공하에 증발시켰다. 생성물은 헥산:EA =2:1 인 용액으로 크로마토그래피에 의해 정제되어 (N-Fmoc-N'-메틸-히드라지노)-아세트산 t-부틸 에스테르 (19.8 g, 70 %)를 얻었다. ¹H-NMR (CDCl₃-d) δ 7.78~7.75 (d, J=9 Hz, 2H,), 7.61~7.59 (d, J=6 Hz, 2H,), 7.43~7.26 (m, 4H), 4.42~4.40 (d, J=6 Hz, 2H), 4.23 (b, 1H), 3.57 (s, 2H), 2.78 (s, 3H), 1.50 (s, 9H).

(3) (N-Fmoc-N'-메틸-히드라지노)-아세트산의 제조

1L, 두 개의 목을 갖는, 둥근 바닥모양의 플라스크가 유리 스토퍼 및 칼슘 튜브에 연결된 환류 냉각기와 함께 설치되었다. (N-Fmoc-N'-메틸-히드라지노)-아세트산 t-부틸 에스테르 (20 g, 52 mmol) 가 첨가되었다. HCl 용액 (150mL, 디옥 산 내의 4M 용액) 격렬한 교반과 함께 얼음수 욕조내에서 천천히 첨가되었다. 상기 반응 혼합물은 실온에서 하루이상 교반되었다. 상기 용액은 감압하 40 ℃에서 완전히 농축되었다. 포화 NaHCO₃ 수용액 (100 mL) 이 첨가되었고, 그 수층(aqueous layer)은 디에틸 에테르 (100 mL)로 세척되었다. 농축된 HCl이 0 ℃ (pH 2-3) 에서 한방울씩 천천히 첨가되었다. 상기 혼합물은 추출되었고, 유기물층이 유지되었다(500 mL, MC). 상기 용액을 황산 나트륨으로 건조시키고, 진공하에 증발시켰다. 그 나머지는 n-헥산 및 에틸아세테이트로 재결정화에 의해 정제되어서 (N-Fmoc-N'-메틸-히드라지노)-아세트산 (12 g, 72 %)을 얻었다. ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12.38 (s, 1H), 8.56 (b, 1H), 7.89~7.86 (d, J=9 Hz, 2H,), 7.70~7.67 (d, J=9 Hz, 2H,), 7.43~7.29 (m, 4H), 4.29~4.27 (d, J=6 Hz, 2H), 4.25~4.20 (t, J=6 Hz, 1H), 3.47 (s, 2H), 2.56 (s, 3H).

제조예 2

( N- Fmoc - N'- R ₇ - 메틸 히드라지노 )- 아세트산 의 제조

(1) (N'-메톡시카르보닐-히드라지노)-아세트산 에틸 에스테르의 제조

MOC-NH-NH₂ (50 g, 0.55 mol) 가 DMF (300 ml)에 용해되었고, 이어서 에틸 브로모아세테이트 (68 ml, 0.555 mol) 및 포타슘 카르보네이트 (77 g, 0.555 mol) 가 반응조에 첨가되었다. 상기 혼합물은 5시간 동안 50 ℃로 유지되었다. 반응이 끝난후에, 혼합물은 여과되었고, EtOAc로 희석한 후, 소금물로 세척하였다 (3회). 조 생성물은 컬럼(용리액 : Hex/EtOAc = 4/1)으로 정제되어 색 없는 기름 72 를 얻었다.

(2) [N-R₇ -N'-메톡시카르보닐-히드라지노]-아세트산 에틸 에스테르

에틸 에스테르 (10 g, 0.05 mol), 포타슘 카르보네이트 (6.9 g, 0.05 mol), 및 R₇-브롬화물 (14.1 g, 0.06 mol) 이 DMF (200 ml)에 용해되었고, 그 혼합물은 5시간 동안 50 ℃ 로 유지되었다. 반응이 끝난 후에, 혼합물은 여과되었고, EtOAc 로 희석한후, 소금물로 세척하였다 (3회). 조 생성물은 크로마토그래피 (용리액 : Hex/EtOAc = 4/1)에 의해 정제되었다.

(3) [N-R₇ -N'-메톡시카르보닐-히드라지노]-아세트산

알킬화된 에틸 에스테르 (9.5 g, 0.03 mol)가 THF/물 (1/1, ml)에 용해되었 고, 2N NaOH (28.3 ml) 용액을 0 ℃에서 첨가하였다. 그 혼합물은 실온에서 2시간동안 교반되었다. 출발 에스테르가 UV 로 검출되지 않은 후에, 상기 용액은 EA 로 희석되었고, 그 후 분리되었다. 물층은 1N HCl 에 의해 pH 3~4 로 산성화되었고, 그 화합물은 DCM 에 의해 추출되었다 (3 회). 조합된 유기층은 MgSO₄ 건조되었고 증발되어서 노란색의 고체를 생성하였다.

제조예 3

(1) N ^β -Moc-N ^α -벤질-히드라지노글리신 의 제조

이 화합물은 문헌의 절차에 따라 제조되었다 (Cheguillaume et. al., Synlett 2000, 3, 331).

(2) 1-메톡시카르보닐-2,8-디벤질-6-메틸-4,7-디옥소-헥사히드로-피라지노 [2,1-c][1,2,4]트리아진 의 제조.

브로모아세탈 레진 (60 mg, 0.98 mmol/g) 및 DMSO (2.5 ml, 2 M) 내의 벤질 아민 용액을 나사뚜껑이 있는 유리병에 넣었다. 그 반응 혼합물이 회전 오븐 [Robbins Scientific]을 이용하여 60 ℃ 에서 12 시간 동안 흔들었다. 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF로 세척후, DCM으로 세척하여, 제1 구성 조각을 얻었다.

NMP (Advanced ChemTech)내의, Fmoc-알라닌 (4 당량, 상업적으로 이용가능, 제2 구성 조각), HATU (PerSeptive Biosystems, 4 당량), 및 DIEA (4 당량) 의 용액이 레진에 첨가되었다. 반응혼합물을 실온에서 4시간동안 흔든다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 DMF 로 세척하였다.

레진에 DMF내의 20% 피페리딘을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 8분동안 흔든 다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 DMF 로 세척하였다.

DMF 내의 N ^β -Moc-N ^α -벤질-히드라지노글리신 (4 당량, 제조예 2의 화합물 (3), 이때 R₇ 은 벤질, 제3 구성 조각), HOBT [Advanced ChemTech] (4 당량), 및 DIC (4 당량)의 용액이 상기 제조된 레진에 첨가되었다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 흔든 다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 MeOH 로 세척하였다. 레진은 실온에서 진공하에 건조되었다.

상기 레진은 실온에서 18시간 동안 포름산 (2.5 ml)에 의해 처리되었다. 레 진이 여과에 의해 제거된 후에, 여과액은 감압하에 농축되어 그 생산물을 기름으로 얻었다. ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ ppm; 1.51 (d, 3H), 2.99 (m, 1H), 3.39 (d, 1H), 3.69 (m, 1H), 3.75 (m, 1H), 3.82 (s, 3H), 4.02 (d, 1H), 4.24 (d, 1H), 4.39 (d, 1H), 4.75 (d, 1H), 5.14 (q, 1H), 5.58 (dd, 1H), 7.10-7.38 (m, 10H).

제조예 4

(1) N'-Fmoc-N-메틸-히드라지노카르보닐 클로라이드의 제조

얼음으로 냉각된, 15 ml CH₂Cl₂ 및 15 ml 의 NaHCO₃ 포화 수용액 내의 N-메 틸 히드라진 카르복실산 9H-플루오렌-9-일메틸 에스테르 (107 mg, 0.4 mmol)에 톨루엔 내의 1.93 M 포스겐 (1.03 ml, 2 mmol)을 하나의 부분으로 첨가되는 동안 급하게 교반되었다. 상기 반응 혼합물은 30분 동안 혼합되었고, 유기상이 수집되었으며, 물상(aqueous phase)이 CH₂Cl₂ 으로 추출되었다. 조합된 유기층은 MgSO₄로 건조되고, 여과되고, 진공에서 농축되어 128 mg (97 %) 의 카르바모일 클로라이드를 포음(foamy) 고체로 얻었다. [주의: 포스겐 증기는 독성이 강하다. 후드에서 사용하라]. 이 생산물은 더 이상의 정제없이 하기 고체상 합성에 사용되었다.

(2) 2,5-디메틸-7-벤질-3,6-디옥소-헥사히드로-[1,2,4] 트리아졸로[4,5-a]피라진- 1-카르복실산 벤질아미드 의 제조

브로모아세탈 레진 (30 mg, 0.98 mmol/g) 및 DMSO 내의 벤질 아민 용액 (1.5 ml, 2 M) 가 나사 뚜껑이 있는 유리병에 놓여졌다. 그 반응 혼합물이 회전 오븐[Robbins Scientific]을 이용하여 60 ℃ 에서 12 시간동안 흔들었다. 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF로 세척후, DCM으로 세척하여, 제1 구성 조각을 얻었다.

NMP (Advanced ChemTech) 내의, Fmoc-알라닌 (3 당량, 상업적으로 이용가능, 제2 구성 조각), HATU (PerSeptive Biosystems, 3 당량), 및 DIEA (3 당량)의 용액이 레진에 첨가되었다. 반응혼합물을 실온에서 4시간 동안 흔든 다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 DMF 로 세척하였다. 그렇게 하여 제2 구성 조각을 제1 구성 조각에 첨가하였다.

레진에 DMF 내의 20% 피페리딘을 첨가하였다. 반응 혼합물이 실온에서 8분 동안 흔든 다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 DMF 로 세척하였다.

DMF 내의 상기 단계 (1)에서 얻은 N'-Fmoc-N -메틸-히드라지노카르보닐 클로라이드 (5 당량, 조합된 제3 및 제4 구성 조각) 및 DIEA (5 당량) 의 용액이 상기 제조된 레진에 첨가되었다. 반응 혼합물이 실온에서 4시간 동안 흔든 다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 및 DMF 로 세척하였다.

레진에 DMF 내의 20% 피페리딘을 첨가하였다 (1g 의 레진당 10 ml). 반응 혼합물이 실온에서 8분 동안 흔든 다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 DMF 로 세척하였다.

상기 레진은 실온에서 4시간 동안 DCM 내의 벤질 이소시아네이트 (4 당량) 및 DIEA (4 당량)의 혼합물로 처리되었다. 레진이 여과에 의해 수집된후에, DMF, DCM 그 다음에는 MeOH로 세척하였다. 레진은 실온에서 진공 건조하였다.

상기 레진은 실온에서 14시간 동안 포름산에 의해 처리되었다. 레진이 여과에 의해 제거된 후에, 여과액은 감압하에 농축되어 그 생산물을 기름으로 얻었다. ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ ppm; 1.48 (d, 3H), 2.98 (s, 3H), 3.18 (m, 1H), 3.46 (m, 1H), 4.37-4.74 (m, 5H), 5.66 (dd, 1H), 6.18 (m, 1H), 7.10-7.40 (m, 10H).

제조예 5

2,5,7- 트리메틸 -3,6- 디옥소 - 헥사히드로 -[1,2,4] 트리아졸로 [4,5-A]피라진-1- 카르복실산 벤질아미드 의 제조

표제 화합물은 브로모아세탈 레진이 벤질 아민 대신 메틸 아민 용액과 반응하는 것을 제외하고는 제조예 4에 기술된 것과 동일한 절차에 의해 제조된다. ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ ppm; 1.48 (d, 3H), 2.99 (s, 3H), 3.03 (s, 3H), 3.38 (m, 1H), 3.53 (dd, 1H), 4.36 (dd, 1H), 4.52 (q, 1H), 4.59 (dd, 1H), 5.72 (dd, 1H), 6.19 (br.t, 1H), 7.10-7.38 (m, 5H).

제조예 6

2- 메틸 -5-( p - 히드록시페닐메틸 )-7- 나프틸메틸 -3,6- 디옥소 - 헥사히드로 -[1,2,4] 트리아졸로 [4,5-A]피라진-1-카르복실산 벤질아미드 의 제조

브로모아세탈 레진 (30 mg, 0.98 mmol/g) 및 DMSO 내의 나프틸메틸 아민 용액 (1.5 ml, 2 M) 이 나사 뚜껑이 있는 유리병에 놓여졌다. 그 반응 혼합물이 회전 오븐[Robbins Scientific]을 이용하여 60 ℃ 에서 12 시간 동안 흔들었다. 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF로 세척후, DCM으로 세척하여, 제1 구성 조각을 얻었다.

NMP (Advanced ChemTech)내의, Fmoc-Tyr(OBut)-OH (3 당량), HATU (PerSeptive Biosystems, 3 당량), 및 DIEA (3 당량)의 용액이 레진에 첨가되었다. 반응혼합물을 실온에서 4시간동안 흔든다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 DMF 로 세척하였다. 그렇게 하여 제2 구성 조각을 제1 구성 조각에 첨가하였다.

레진에 DMF 내의 20% 피페리딘을 첨가하였다. 반응 혼합물이 실온에서 8분동안 흔든다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 DMF 로 세척하였다.

DMF 내의 N'-Fmoc-N-메틸-히드라지노카르보닐 클로라이드 (5 당량) 및 DIEA (5 당량) 의 용액이 상기 제조된 레진에 첨가되었다. 반응 혼합물이 실온에서 4시간 동안 흔든 다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 DMF 로 세척하였다.

레진에 DMF내의 20% 피페리딘을 첨가하였다 (1g 의 레진당 10 ml). 반응 혼합물이 실온에서 8분 동안 흔든 다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 DMF 로 세척하였다.

상기 레진은 실온에서 4시간 동안 DCM 내의 벤질 이소시아네이트 (4 당량) 및 DIEA (4 당량) 의 혼합물로 처리되었다. 레진이 여과에 의해 수집되고, DMF, DCM 그 다음에는 MeOH로 세척하였다. 레진은 실온에서 진공 건조되었다.

상기 레진은 실온에서 14시간 동안 포름산으로 처리되었다. 레진이 여과에 의해 제거된 후에, 여과액은 감압하에 농축되어 그 생산물을 기름으로 얻었다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ ppm; 2.80-2.98 (m, 5H), 3.21-3.37 (m, 2H), 4.22-4.52 (m, 2H), 4.59 (t, 1H), 4.71 (d, 1H), 5.02 (dd, 1H), 5.35 (d, 1H), 5.51 (d, 1H), 6.66 (t, 2H), 6.94 (dd, 2H), 7.21-8.21 (m, 12H).

제조예 7

2- 메틸 -6-( p - 히드록시페닐메틸 )-8- 나프틸 -4,7- 디옥소 - 헥사히드로 -피라지노[2,1-c][1,2,4]트리아진-1-카르복실산 벤질아미드 의 제조

브로모아세탈 레진 (60 mg, 0.98 mmol/g) 및 DMSO 내의 나프틸 아민 용액 (2.5 ml, 2 M) 이 나사 뚜껑이 있는 유리병에 놓여졌다. 그 반응 혼합물이 회전 오븐[Robbins Scientific]을 이용하여 60 ℃ 에서 12 시간 동안 흔들었다. 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF로 세척후, DCM으로 세척하였다.

NMP (Advanced ChemTech) 내의, Fmoc-Tyr(OBut)-OH (4 당량), HATU [PerSeptive Biosystems] (4 당량), 및 DIEA (4 당량) 의 용액이 레진에 첨가되었다. 반응혼합물을 실온에서 4시간 동안 흔든 다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 DMF 로 세척하였다.

레진에 DMF내의 20% 피페리딘을 첨가하였다. 반응 혼합물이 실온에서 8분 동안 흔든 다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 DMF 로 세척하였다.

DMF 내의 N ^ß -Fmoc-N ^α -벤질-히드라지노글리신 (4 당량), HOBT [Advanced ChemTech] (4 당량), 및 DIC (4 당량)의 용액이 상기 제조된 레진에 첨가되었다. 반응 혼합물이 실온에서 3시간 동안 흔든 다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, 그 다음에는 DCM 으로 세척하였다. 그 레진에 DMF내의 20% 피페리딘을 첨가하였다 (1g 의 레진 당 10 ml). 반응 혼합물을 실온에서 8분 동안 흔든 다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 DMF 로 세척하였다.

상기 레진은 실온에서 4시간 동안 DCM 내의 벤질 이소시아네이트 (4 당량) 및 DIEA (4 당량) 의 혼합물로 처리되었다. 레진이 여과에 의해 수집된 후에, DMF, DCM 그 다음에는 MeOH로 세척하였다. 레진은 실온에서 진공 건조하였고, 상기 레진은 실온에서 18시간 동안 포름산(2.5 ml)으로 처리되었다. 레진이 여과에 의해 제거된 후에, 여과액은 감압하에 농축되어 그 생산물을 기름으로 얻었다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ ppm; 2.73 (s, 3H), 3.13 (d, 1H), 3.21-3.38 (m, 3H), 3.55 (d, 1H), 3.75 (t, 1H), 4.22 (dd, 1H), 4.36 (dd, 1H), 4.79 (d, 1H), 5.22 (t, 1H), 5.47 (m, 2H), 6.68 (d, 2H), 6.99 (d, 2H), 7.21-8.21 (m, 12H);

MS (m/z, ESI) 564.1 (MH⁺) 586.3 (MNa⁺).

실시예

플라즈미드

CBP 및 p300 의 결손 구성체가 시판되는 pTriEx-3 벡터 (Novagen, Madison, WI) 에서 발현되었다. 마우스의 CBP 의 결손 시리즈가 전체 길이의 마우스 CBP 플라즈미드 (오레곤주 포틀랜드의 Vollum Institute 의 Richard Goodman 박사로부터의 증여)로부터 PCR 에 의해 생성되었다. 증폭된 부위는 5'-말단에 BamH I 자리 및 3'-말단에 Not I 자리를 갖고 있어서 발현 벡터 pTriEx-3의 ATG를 갖는 프레임에 클로닝될 수 있다. 플라즈미드를 인식하고 정제하기 위하여, 플라즈미드는 또한 COOH-말단에 6X-히스티딘 및 단순 헤르페스 바이러스(Herpes Simplex Viral) (HSV) 태그를 갖는 프레임에 클로닝되었다. CBP의 C-말단쪽이 절단된 구조체를 클로닝하는데 사용된 순방향 프라이머(forward primers)는 5'-GATATCTGAGCTCGTGGATCCGATGGCCGAGAACTTGCTG-3' (서열식별번호: 7) 이다. CBP-C1 (1-334), -C2 (1-634), -C3 (1-1594), -C4 (1-2062), -C5 (1-2623), -C6 (1-3094), -C7 (1-3694)에 사용된 역방향 프라이머(reverse primers)는: C1: 5'-CGTGTATACAGCTGTGCGGCC-GCGTTTGTACTGTTCGGCTG-3' (서열식별번호: 8), C2: 5'-CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGCTCC-ATTCATGACTTGAGC-3' (서열식별번호: 9), C3: 5'-CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGCGCGTTTTT-CAGGGTCTGC-3' (서열식별번호: 10), C4: 5'-CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGC AGCTGGTAAAGC-TGGCTG-3' (서열식별번호: 11), C5: 5'-CGTGTATACAGCTGTG CGGCCGCATGTTGGAGAGAGGGC-AT-3' (서열식별번호: 12), C6: 5'-CGTGTATA CAGCTGTGCGGCCGCAGAACCTTGTAAATCCTC-3' (서열식별번호: 13), C7: 5'-CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGCGCTGTAGTAGGCTGCATC-3' (서열식별번호: 14)이다. CBP의 N-말단쪽이 절단된 구조체는 다음의 역방향 프라이머로 생성되었다: 5'-GTATACAGCTGTGCGGCCGCCAAACCCTCCACAA ACTTTTC-3' (서열식별번호: 15). CBP-C8 (4081-7324), -C9 (4534-7324), -C10 (5074-7324), -C11 (5674-7324), -C12 (6286-7324), -C13 (6754-7324) 를 위한 전방향 프라이머는: C8: 5'-GATATCTGAGCTCG-TGGATCCGGAAGCTGGGGAGGTTT TT-3' (서열식별번호: 16), C9: 5'-GATATCTGAGCTCGTGGAT-CCGAAGAAGATGC TGGACAAG-3' (서열식별번호: 17), C10: 5'-GATATCTGAGCTCGTGGATCCGT-CC AAATGGTCCACTCTG-3' (서열식별번호: 18), C11: 5'-GATATCTGAGCTCGTGGAT CCGTCTCCT-ACCTCAGCACCA-3' (서열식별번호: 19), C12: 5'-GATATCTGAGCTC GTGGATCCGAACATCCTTAA-ATCAAAC-3' (서열식별번호: 20), C13: 5'-GATATCTGAGCTCGTGGATCCGCAGCAGCAACGCATGGATATCT GAGCCGTGGATCCGCAGCAGCAACGCATG-CAA-3' (서열식별번호: 21)이다. C-말단이 절단된 구조체의 전방향 프라이머 및 N-말단이 절단된 구조체의 역방향 프라이머를 사용하여, 전체 길이의 마우스 CBP가 증폭되었고 pTriEx-3 벡터에 클로닝하였다. CBP (Δ1-111+NLS)는 전체 길이의 CBP의 PCR에 의해 CBP의 NLS 서열 (밑줄)의 위쪽 BamH I 자리를 포함하는 하기 전방향, PAGE 에 의해 정제된 프라이머: 5'-ATCTGAGCTCGTGGATCCGGGACCGCCCAACCCCAAACG

AGCCAAACTCCAGCCGAACAGTACAAACATGGCCAGCTTA-3' (서열식별번호: 22) 를 이용하여 생성되었고, 역방향 프라이머는 상기 언급된 CBP의 N-말단 절단된 구조체를 생성하는 프라이머를 사용하였다. 삽입체는 pTriEx-3 플라즈미드의 BamH I-Not I 자리에 클로닝되었다.

p300의 결손 구조체는 David Livingston 박사 (Harvard, MA)가 기증한 인간 p300 플라즈미드 (CMV-p300-CHA)의 PCR에 의해 생성되었다. 상기 PCR 생성물은 pTriEx-3 벡터의 Hind III-Not I 자리에 클로닝되었다. C-말단이 절단된 p300 구조체에 대한 전방향 프라이머는: 5'-GACGGTACCGGTTCGAAGCTTA-TGGCCGAGAATGTGGT-G-3' (서열식별번호: 23)이다. p300-P1 (1-334), p300-P2 (1-634) 및 p300-P3' (1-1054) 에 대한 역방향 프라이머는 다음과 같다: P1: 5'-CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGC-CAAACCTAATC CAGGACT-3' (서열식별번호: 24), P2: CGTG-TATACAGCTGTGCGGCCGCGTTGC CAGCACTTCCCAT-3' (서열식별번호: 25), P3: CGTGTATACA-GCTGTGCGGCCG CGGCCTGTTCCCGGCGCTG-3' (서열식별번호: 26).

β-카테닌/TCF 정보제공 플라즈미드는 4 일렬(tandem) TCF4 결합 부위 (CCAACCTTTGATCTTACCCCCTTTGATCTTACCCCCTTTGATCAG-GAATTCGGTTGGAAACTAGAATGGGGGAAA

CTAGAATGGGGGAAACTAGTCCTTAAG) (서열식별번호: 27)를 하류 루시퍼레이즈 유전자의 발현을 일으키는 SV40 프로모터의 상류에 pGL3 플라즈미드 (Promega)의 Xho I-Kpn I 자리에 삽입하여 생성되었다.

모든 프라이머는 Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)로부터 구입하였다. 클로닝에 사용되는 제한 효소는 밑줄쳤고 New England Biolabs, Beverly, MA 로부터 구입하였다.

세포 배양

인간 대장 암종 세포주 SW480 및 HCT116, 및 정상적인 대장세포 CCD18Co (ATCC, Manassas, VA) 가 5% CO₂ 기압하 37 ℃에서 10% 태아 송아지 혈청을 보충하며 DMEM (Invitrogen Gibco-BRL, Baltimore, MD)에서 성장되었다.

형질변환

기하급수적으로 자라는 SW480 및 HCT116 세포들 (10⁵)이 24-웰 플레이트 또는 100-mm 접시에서 배양되었고, 0.5 ㎍ 의 β-카테닌/TCF 정보제공자 및 이펙터(effector) 플라즈미드의 증가하는 농도 또는 10 ㎍ 의 발현 벡터로 각각 형질변환되었다. 세포들은 지시된 데로 FuGENE6 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) 또는 Superfect (Qiagen, Valencia, CA)로 형질변환되었다. 핵 추출물은 NE-PER 키트 (Pierce Biotechnology, Rockford, IL)에 기술된 절차에 따라 제조되었다.

루시퍼레이즈 측정법

다양한 그룹에 대한 루시퍼레이즈 측정법이 이중 루시퍼레이즈 측정법 (Promega)를 사용하여 형질변환 16-24 시간후에 지시된 데로 20 ㎕의 세포 용해물에 대해 수행되었다. 빈 발현 벡터인 pTriEx-3의 증가하는 농도가 수치화(normalization)를 위해 사용되었다.

소프트 아가 측정법

소프트 아가 콜로니 형성 측정법은 SW480 세포로 이미 기술된 절차(Moody et al., "혈관작용의 장내 펩티드 길항제는 작지 않은 세포 허파암 생장을 억제한다," Proc . Natl . Acad . Sci . USA. 90:4345-49 (1993))를 조금 변형하여 실시하였다.

6-웰 플레이트(Nalge Nunc International, Roskide, Denmark)의 각각의 웰 (35mm)은 10% 의 태아소혈청을 함유하는 DMEM 배지 내의 0.8% 바닥 아가 1ml 로 코팅되었다. 이것이 응고된 다음에, 0.4 % 의 상층 아가, 10% 의 태아소혈청, 두 배 농축된 화합물, 및 5,000 개의 단일 생 세포를 포함하는 DMEM 배지 1ml 을 각각의 웰에 첨가하였다. 상기 배양은 37 ℃에서 습도있는 5% CO₂ 인큐베이터에서 항온보관하였다. 소프트 아가 배지에서의 콜로니는 매일 모니터 되었고 8일간의 항온보관후에 사진을 찍었다. 직경 60 μm 를 초과하는 콜로니의 수를 세었다

면역 침전

세포들은 20 mM Hepes pH 7.9, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.5% Nonidet P-40, 6 mM MgCl₂, 5 mM 2-멀캅토에탄올(Mercaptoethanol), 및 Complete^TM 단백질분해효소 저해제 칵테일 (Roche Molecular Biochemicals) 의 1개 정을 포함하는 용해(lysis) 완충액에서 얼음상에서 30분간 용해되었고 원심분리에 의해 맑게 되었다(cleard). 모든 세포 용해질(lysate)은 Santa Cruz Biotechnology, Inc. 로부터의 CBP-C1, A-22 항체에 대한 특이적 항체, p300-P1, N-15 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA)에 대한 특이적 항체, 및 전체 길이의 내인성 β-카테닌에 대한 단백질 A-아가로스 비드 (Pierce, Rockford, IL)에 예비-결합된 모노클로널 항체 (Transduction Laboratories, Lexington, KY) 에 대한 특이적 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 항온 보관하였다. 면역 복합체는 HBS (100-150 mM NaCl (지시된 데로), 10 mM Hepes pH 7.9, 5 mM 2-멀캅토에탄올(Mercaptoethanol), 및 Complete^TM 단백질분해효소 저해제 칵테일)에서 여러 번 세척되었고 웨스턴 블롯을 수행하였다 (아래 참조). 그 다음에 상기 비드(beads)는 (20 mM Hepes pH 7.9, 500 mM NaCl, 및 Complete^TM 단백질분해효소 저해제 칵테일의 1정을 포함하는 5 mM 2-멀캅토에탄올(Mercaptoethanol))을 포함하는 완충액으로 여러 번 세척하였다.

풀-다운 측정법

25-100 μM 의 바이오티닐기가 삽입된 화합물2가 50% DMSO 및 50% 단백질 결합 완충액인 PBB (20 mM Hepes pH 7.9, 20% 글리세롤, 0.5 mM EDTA, 60 mM NaCl, 6 mM MgCl₂, 0.1% Nonidet P-40, 5 mM 2-멀캅토에탄올(Mercaptoethanol), 및 Complete^TM 단백질분해효소 저해제 칵테일 1정) 를 포함하는 완충액에서 하루밤 동안 실온에서 100㎕ 의 스트렙토비딘-아가로스 비드의 50% 슬러리 (Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL)에 결합되었다. 상기 비드는 PBB로 3번 세척되어 결합되지 않은 화합물2를 제거하였다. 과량 발현된 플라즈미드를 포 함하는 100-200 ㎕ 의 전체 세포 용해질은 (면역 침전 부분 참조) 실온에서 비드와 함께 3-4시간 동안 또는 4 ℃에서 하루 밤 동안 항온 보관되었다. 상기 비드는 그 다음에 PBB 완충액에서 3번 세척되었고 그 용리된 단백질들을 SDS-PAGE 전기영동 및 웨스턴 블롯을 수행하였다 (하기 참조). 경합 측정법에서, 과량의 화합물1은 각각의 실험에서 지시된 바와 같이, 한시간동안 실온에서 용해질과 함께 예비 항온보관되었다.

ChIP 측정법

SW480 세포들의 포름알데히드 교차결합 및 크로마틴 면역 침전 측정법은 전에 기술된 데로 수행되었다 (Barlev et al., "Acetylation of p53 activates transcription through recruitment of coactivators/histone acetyltransferases," Mol . Cell 8:1243-54 (2001); El-Osta et al., "Analysis of chromatin-immunopurified MeCP2-associated fragments," Biochem . Biophys . Res. Commun . 289:733-37 (2001); Shang et al., "Formation of the androgen receptor transcription Complex," Mol . Cell 9:601-10 (2002)). c- myc 및 cyclin D1 프로모터의 PCR 에 사용되는 프라이머는 하기와 같다: c- myc 순방향 프라이머: 5'-TGGTAGGCGCGCGTAGTTA-3' (서열식별번호: 28) 및 역방향 프라이머: 5'-GGGCGGAGATTAGCGAGAG-3' (서열식별번호: 29). Cyclin D1 순방향 프라이머: 5'-TGCTTAACAACA-GTAACGT-3' (서열식별번호: 30) 및 역방향 프라이머: 5'-GGGGCTCTTCCTGGGCAGC-3' (서열식별번호: 31). 이들 ChIP 프라이머들은 전사 개시 장소 가까운 프로모터 부위 내의 TCF4 결합 도메인의 하부 약 20 ~ 30 염기쌍을 설계하였다. PCR 생성물은 대략 크기가 200 염기쌍이다. 항-CBP, AC-26, 항체는 David Livingston 박사로부터의 친절한 선물이었다.

웨스턴 블롯 측정법

상기의 면역 복합체는 SDS-PAGE 상에서 분리되었고 이어서 (Millipore, Bedford, MA)로부터의 이모빌론-P 막 (PVDF) 으로 보내졌다. 상기 막은 TBST (15 mM Tris/HCl, pH 7.4, 0.9% NaCl, 및 0.05% Tween 20) 내의 5% 무지방 건조 우유로 차단되었고 이어서 특이적 항체로 블롯되었다. Qiagen Inc. 로부터의 항-His 항체가 pTriEx-3 에서 만들어진 단백질들을 탐지하는 데 사용되었다. 홍당무과산화물에 접합된 2차 항체들 (Santa Cruz Biotechnology Inc.)이 탐지에 사용되었다. 면역블롯은 ECL 탐지 키트 (Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 분석되었다.

면역형광

화합물1 (25μM) 또는 대조군 (0.5% DMSO)이 처치된 SW480 및 HCT116 내의 CBP 및 β-카테닌의 위치를 조사하기 위해, 면역 형광이 사용되었다. 로그기의 세포들이 파종되었고, 24시간 후에, 상기 세포들은 화합물1 또는 대조군으로 처리되었다. 처리 24 시간 후에 세포들은 고정되었다. 커버 슬립은 각각 CBP (A-22) 에 대한 항체 (Santa Cruz Biotechnology) 및 β-카테닌에 대한 항체 (Transduction Laboratories)로 항온보관되었다. 슬라이드는 FITC 또는 TRITC (Jackson ImmunoResearch, Westgrove, PA)에 접합된 2차 항체가 적용된 후에 Nikon PCM 2000 Laser Scanning Confocal Microscope을 이용하여 검사되었다.

플로우 계측 분석( FACS )

FACS 분석을 위해, PNRI 처리된 세포 또는 운반체-처리된 대략 5 X 10⁶ 세포들이 70% 냉각된 에탄올에 의해 고정되었고, 최소한 30분간 -20 ℃에 보관되었다. 세포는 1X PBS 로 한번 세척하였고, 프로피듐 요오드 (PI) 용액 (85 ㎍/ml 프로피듐 요오드(propidium iodine), 0.1% Nonidet P-40, 10 mg/ml RNAse) 과 함께 30 분간 실온에서 항온보관하였다. 각각의 샘플에서 10,000 개의 염색된 세포를 Beckman Coulter EPICS XL-MCL 플로우 세포계측기를 이용하여 얻었고, 세포 사이클의 다른 시기에 있는 세포의 백분율은 Expo32 ADC 소프트웨어 (Coulter Corporation, Miami, Florida, 33196) 에 의해 결정되었다.

단백질 정제

CBP (1-111) 및 p300 (1-111)은 6X-His 태그와 함께 융합 단백질로서 발현되었고, 그들의 6X-His-태그를 이용하여 박테리아의 용해질로부터 친화 정제(affinity-purified)되었다. 형질전환된 박테리아 펠릿 (1L 배양액) 은 5-10 ml 의 용해 완충액 (20 mM Hepes pH 7.9, 150 mM NaCl, 0.1% Nonidet P-40, 5 mM 2-멀캅토에탄올(Mercaptoethanol), 및 Complete^TM 단백질분해효소 저해제 칵테일 1정) 에 다시 현탁되었다. 세포들은 초음파파쇄에 의해 용해되었다. 맑게 된(cleared) 용해질은 500 ㎕ 의 Ni-NTA-아가로스 비드 (Qiagen)로 한시간 동안 4 ℃에서 항온 보관되었다. 결합된 단백질들은 500 ㎕ 의 용리 완충액 (20 mM Hepes pH 7.9 및 150 mM NaCl, 단백질분해효소 저해제 칵테일 1정, 5 mM 2-멀캅토에탄올 및 250 mM 이미다졸)로 용리되었다. 용리된 단백질들은 소량의 부분 씩으로 나누어 냉동되었다.

실시간 역전사 - PCR 분석

RNA 추출을 위해 RNeasy Midi Kit (Qiagen)가 사용되었고, SYBR Green PCR Master Mix Kit (Perkin Elmer Biosystems, Shelton, CT)에 제공된 프로토콜에 따라 실시간 RT-PCR을 수행하였다. cyclin D1, axin2, hnkd, c- myc, c- jun, 및 fra -1 증폭을 위해 사용된 프라이머는: cyclin D1 순방향 프라이머 :5'-AGATCGAAGC-CCTGCTG-3' (서열식별번호: 32) 역방향 프라이머: 대략 300 bp 크기의 생산물을 초래하는 5'-AGGGGGAAAGAGCAAAGG-3' (서열식별번호: 33); axin2 순방향 프라이머: 5'- GTGTGAGGTCCAC GGAAA-CT-3' (서열식별번호: 34) 및 역방향 프라이머: 5'-CTCGGGAAATGAGGTA-GAGA-3' (서열식별번호: 35); hnkd 순방향 프라이머: 5'-CTGGCTGCTGCTACCACCA TTGCGT-3' (서열식별번호: 36) 및 역방향 프라이머: 5'-CCAGGCCCAAATTGGG ACGT-3' (서열식별번호: 37); c-myc 순방향 프라이머: 5'-GAA-GAAATTCGAGCTG CTGC-3' (서열식별번호: 38) 및 역방향 프라이머: 5'-CACATACAGTCCTGGATGAT-G-3' (서열식별번호: 39); c- jun 순방향 프라이머: 5'- AGATGCCCGGCGAGACACCG-3' (서열식별번호: 40) 및 역방향 프라이머: 5'-AGCCCCCGACGGTCTCTTT-3' (서열식별번호: 41); fra -1 순방향 프라이머: 5'-ACC-CCGGCCAGGAG-TCATCCGGGCCC-3' (서열식별번호: 42) 및 역방향 프라이머: 5'-AGGCGCCTCACAAAGCGAGGAGGG-TT-3' (서열식별번호: 43) 이다. β-actin 이 수치화(normalization)를 위해 사용되었다. β-actin 을 위한 프라이머는: 순방향 프라이머: 5'-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3' (서열식별번호: 44) 및 역방향 프라이머 5'-CGTCATACTCCTCCTTGCYGATCCACA TCTGC-3' (서열식별번호: 45)이다. 각각의 프라이머 세트는 95℃ 에서 10분간, 95℃ 에서 15초간을 40 싸이클, 60℃ 에서 1분간 증폭되었다.

카스파제 -3 활성 측정법

SW480, HCT116, 및 CCD18Co 세포들이 웰당 10⁵세포(96-웰 플레이트)로 처리전에 24시간 동안 플레이트되었다. 25μM의 화합물 1 또는 대조군(control) (0.5% DMSO)이 각각의 웰에 첨가되었다. 처치 후 24시간에 세포는 융해되었고, 카스파제-3/7 활성 키트 (Apo-One Homogeneous caspase-3/7 assay, #G77905, Promega)를 사용하여 카스파제 활성이 측정되었다. 상대 형광 단위 (RFU) 는 실험 측청값으로부터 블랭크(대조군, 세포 없음) 의 단위 값을 빼서 얻었다.

표1은 화합물1 (25μ) 또는 대조군 (0.5% DMSO) 로 4, 8, 또는 24 시간 동안 처치된 SW480 세포의 정량적 실시간 역전사-PCR (RT-PCT) 분석의 결과를 보여준다. 각각의 시간 지점에서 1 ㎍의 mRNA 가 실시간 RT-PCR을 행하였다. 내인성(endogenous) cyclin D1, c- myc, fibronectin, hnkd, axin2, c- jun, 및 BMP-4 는 β-actin 에 상대적으로 측정되었다. Δ문턱 주기 (CT) 값의 정량은 각각의 세트의 평균 값에서 β-actin 에 대해 얻은 상응 평균값을 빼서 결정하였다. 모든 실험은 두벌씩 수행하였다.

화합물1은 CBP 에 의해 표적되는 β- 카테닌 / TCF 전사에 대항작용한다

APC 내의 돌연변이 때문에, TOPFLASH 정보제공 시스템에 의해 평가된 바에 의하면 SW480 대장 암종 세포는 β-카테닌의 핵으로의 구성성(constitutive) 전위(translocation)를 보이고, 그래서 높은 기초(basal) β-카테닌/TCF 전사를 보인다 (Korinek et al., "Constitutive transcriptional activation by a beta-catenin-Tcf complex in APC-/- colon carcinoma," Science 275:1784-87 (1997)). 관련된 정보제공자는 β-카테닌/TCF에 의해 매개되는 전사의 억제제를 위한 2차 구조-주형에 의한 작은 분자 라이브러리를 스크린닝하는데 사용되었다 (Ogbu et al., "Highly efficient and versatile synthesis of libraries of constrained b-strand mimetics," Bioorg . Med . Chem . Lett . 8:2321-26 (1998); Eguchi et al., "Solid-phase synthesis and structural analysis of Bicyclic β-Turn mimetics incorporating fnctionality at the i to i+3' positions," Amer . Chem . Soci. 102:22031-32 (1999)). 이 최초의 스크린닝으로부터, 우리는 5μM 의 IC₅₀ (도1B), 및 NFAT (도1C), CRE, 및 AP-1 (데이터 나타나지 않음)를 포함한 많은 다른 CBP-의존 정보제공자들에 비해 매우 좋은 선택성을 갖는 화합물1 (도1A) 을 선별하였다. β-카테닌 인산화 장소가 결핍되었지만 야생형 APC 를 발현하는 HCT116세포에서, 화합물1은 비슷한 활성을 보였다 (데이터 보이지 않음).

화합물1의 분자 표적(들)을 결정하기 위해, 우리는 친화 시약으로서 사용하기 위해 그것의 유도체를 만들어서, 화합물2 (도1A)를 공급했다. 핵 추출물들은 화합물1 또는 운반체로 예비처리 후에 480 세포로부터 제조되었고, 그 다음에 화합물2와 함께 배양하였다. 그 복합체는 그 다음에 스트렙타비딘-아가로스 비드로 분리되었고, 겔 전기영동을 실시하였다. 화합물2 친화 컬럼에서 SW480 핵 추출물로부터 얻어진 주 밴드는 겉보기 분자량 225 KDa를 갖으며 면역블롯에 의해 CREB 결합 단백질(CBP) 로 특정되었다 (도1D). 화합물1은 화합물2에 결합된 CBP를 특이적으로 용리시켰고 (도1D, 래인 7 을 8과 비교하라), 핵 추출물을 화합물1 (20μM) 로 친화 크로마토그래피 전에 예비 배양하면 CBP의 결합을 차단시켰다 (도1D, 래인9). 사용된 항체는 CBP에 특이적이었고 p300과 교차 반응하지 않는다. 따라서, 이들 데이터는 화합물1이 CBP와 결합한다는 것을 지시한다.

추가의 일련의 조사가 화합물1이 CBP에 결합한다는 것을 확인하기 위해 수행되었다. ¹⁴C 로 표지된 화합물1은 ¹⁴C로 표지된 티로신을 합성시에 삽입시킴으로서 합성되었다. β-카테닌 또는 CBP 발현 벡터로 형질전환되지 않은 또는 형질전환된 SW480 세포의 핵 용해질들은, DMSO 또는 차가운 화합물1과 함께 하루 밤 동안 ¹⁴C 로 표지된 화합물1로 처리되었다. 그 다음에 세포 용해질들은 G-25 컬럼을 사용하여 제염되어 결합되지 않은 ¹⁴C 으로 표지된 화합물1을 제거하였고, 방사성의 삽입이 측정되었다. 도1E 에서 보는 바와 같이, CBP로 형질변환된 핵 용해질들은 대조군에 비해 대략 4-6 배의 ¹⁴C 로 표지된 화합물1의 삽입 증가를 보였는데 (도1E, 래인 2를 6과 비교하라) 그것은 차가운 화합물1에 의해 용량 의존 양식으로 경합 배제되었다 (도1E 래인 6을 7 및 8로 비교하라).

이 증거에 기반하여, 화합물1은 CBP에 결합한다고 결론되었다. 따라서, 본발명의 하나의 특징은 CBP를 포함하는 조성물을 약제와 결합시키는 것을 포함하는 방법을 제공하고, 상기 약제는 CBP에 결합한다. CBP에의 상기 결합은 그렇지 않으면 CBP 가 겪을 임의의 다른 결합 반응을 방해한다. 그러므로, 본 발명은 CBP에 결합함으로써 환자를 치료하는 방법으로서 약제의 유효량을 필요로 하는 환자에게 투여하는 방법을 제공한다.

화합물1은 CBP 의 최초 111 아미노산과 특이적으로 상호작용한다

바이오틴이 삽입된 동족체(analog)인 화합물2 (도1A)는 화합물1을 결합하기 위해 필요한 CBP 의 최소 부위의 윤곽을 그리는데 사용되었다. 과량 발현된 CBP 단편을 포함하는 세포 용해질 (도2B, 상부 패널)들은 몇 시간동안 화합물2와 예비 결합된 스트렙타비딘-아가로스 비드와 함께 배양되었다. 상기 결합된 단백질들은 그 다음에 비드로부터 용리되었고 결합된 CBP 단편(들)을 탐지하기 위해서 항-His 항체를 사용하여 겔 전기영동 및 면역블롯되었다. 보이는 바와 같이 (도2B, 하부 패널), 화합물2가 특이적으로 결합하는 최소 부위는 CBP의 NH₂-말단의 아미노산 1-111 이었다 (래인 2, 3, 및 4 를 다른 것들과 비교하라). 공동-면역 침전 실험에서 예상된 것과 같이, SW480 세포에서 과량 발현된 p300 단편의 어느 것과도 결합이 탐지되지 않았다 (데이터는 보이지 않음, 하기 참조). p300 (1-111), p300 (1-211) 및 p300 (1-351)와 함께, CBP (1-111), CBP (1-211), 및 CBP (1-351)이 SW480 세포에서 과량 발현되면 (도2C, 하부 패널), 과량의 화합물1은 CBP 단편들의 결합을 강하게 경합하여 막지만 (도2C, 상부 패널, 래인 4-6 를 7-9와 비교하라) p300 단편들의 결합에 대해 어떠한 영향을 주는 것에 실패하였다 (도2C, 상부 패널, 래인 10-12 를 13-15와 비교하라). 따라서, 화합물1이 CBP의 최초 111 아미노산에 결합하지만, 관련 단백질인 p300에는 결합하지 않는 것으로 보였다.

다른 세포 구성 성분에 의해 매개되는 CBP 및 화합물1의 간접적인 연합의 가능성을 배제하기 위하여, 그리고 직접 결합을 테스트하기 위해, 우리는 6X-His-태그된 E. coli 발현 단백질들을 사용하여 CBP (1-111) 및 p300 (1-111)를 친화-정제하였다. 스트렙타비딘-아가로스 비드에 결합하는 화합물2를 사용하여, 우리는 CBP (1-111)의 화합물2에의 특이적 결합, 그러나 p300 (1-111)은 화합물2에 결합하지 않는 것을 보였고, 그것은 과량의 화합물1 (도2D, 우측, 래인 3-5를 6-8과 비교하라)에 의해 경합 배제되었다. 이 데이터는 시험관 내에서 CBP (1-111) 과 화합물 1 간의 직접 연합을 확인시킨다. 화합물1이 E. coli 에서 발현된 CBP에 결합하기 때문에, 이것은 CBP가 화합물1에 결합하기 위해서 포유동물 카이네이즈에 의한 인산화가 필요한 가능성을 감소시킨다.

CBP의 아미노 말단에 의한 결정적 역할의 추가 확인이 구조체 CBP (Δ1-111 + NLS)를 사용하여 얻어졌다. 전체 길이의 CBP의 발현이 용량 의존 양식으로 화합물1 (25μM)의 β-카테닌/TCF 프로모터 활성 억제를 구제하지만, CBP (Δ1-111 + NLS)의 발현은 영향을 미치지 않았다 (도2E).

그래서, 본 발명의 하나의 특징은, 조성물을 약제와 접촉시키는 것을 포함하는 β-카테닌에 의해 유도된 유전자 발현의 조절 방법으로서, 조성물을 약제에 접척시키고, 상기 조성물은 β-카테닌, CBP, 및 p300을 포함하고, 상기 약제는 β-카테닌이 p300에 결합하는 데는 전혀 또는 거의 영향이 없고 β-카테닌이 CBP에 결합하는 것을 감소시키는 유효한 양의 조성물에 접촉되는 것인 방법을 제공한다.

화합물1은 CBP 에 대해 β- 카테닌과 경합한다

CBP는 많은 전사 사건에서 속도-제한 인자이다. 도3A에서 보는 바와 같이, CBP를 농도를 증가시키면서 형질변환시키면 화합물1 (12.5μM) 의 IC₅₀ 이 용량-의존 방식으로 증가하고, 그러나 β-카테닌은 그렇지 않다. 화합물1이 β-카테닌의 CBP에로의 결합을 파괴하는 지를 결정하기 위해 SW480 세포들에 대해 면역 침강 측정법이 수행되었다. β-카테닌을 CBP로 면역침강시키는 것은 농도 의존 방식으로 화합물1에 의해 억제된다 (도3B, 래인 2, 3, 및 4를 비교하라, 래인1은 대조군으로 서 항체가 첨가되지 않았다). 화합물1의 CBP에로의 결합은 매우 특이적으로, 상기 화합물은 CBP 와 p300 이 매우 동종유래적 임에도 불구하고 β-카테닌이 p300에 결합하는 것을 방해하지 않는다 (도3B, 하부 패널, 래인 2-4를 비교하라).

상기 β-카테닌/CBP 상호작용을 더 확인하기 위해, SW480 세포들이 상기 기술된 CBP 및 p300 결손 구조체로 형질변환 되었다 (도2A). 뒤이은 비드의 세척 후에, p300 (1-111), p300 (1-211), 및 p300 (1-351) 뿐만 아니라 CBP (1-111), CBP (1-211), 및 CBP (1-351)은 면역침강된 β-카테닌에 특이적으로 결합된 채로 남아있었다 (도3C, 래인 2-4 를 5-15와 비교하라). 이들 결합 연구는 CBP 및 p300 모두의 NH₂-말단의 최초 111 아미노산이 β-카테닌에 결합한다는 것을 강조하였다. 이 부위가 화합물1의 CBP 결합 장소와 중첩된다는 것을 확인하기 위해, 우리는 과량의 화합물1의 존재하에서 CBP (1-111), CBP (1-211) 및 CBP (1-351) 및 p300 (1-111), p300 (1-211), 및 p300 (1-351)의 β-카테닌에로의 결합을 평가하였다. 도3D, 하부 패널은 SW480 세포들 내에서 이들 단편들의 발현 수준의 비교를 보여준다. 과량의 화합물1에 노출시키면 상기 단편들의 β-카테닌에로의 결합을 급격히 경합 배제시킨다 (도3D, 상부 패널, 4-9 을 10-15와 비교하라). 제시된 데이터로부터, 화합물1은 CBP(1-111 아미노산) 의 아미노 말단에 특이적으로 결합하여 두 개의 매우 동종 유래의 공동 활성자들인 CBP 와 p300 간을 구별하고, β-카테닌이 CBP와 상호작용하는 것을 경합 배제한다.

이들 결합 연구는 CBP 및 p300 두 개 모두의 최초 111 아미노산을 β-카테닌 과의 상호작용의 최소 부위로서 강조하였다. 이들 부위의 서열 배열은 이전에 출판된 TCF, APC 및 E-카드헤린(cadherin) 내에서 발견된 β-카테닌 결합 모티프와 현저한 유사성을 보인다. 서열 배열 데이터는 다른 β-카테닌 상호작용 단백질들과 처럼, CBP 가 β-카테닌 결합에 필요한 음으로 전하를 띤 아미노산의 보존된 신장부분 (conserved stretch)에 잠복한다는 것을 강하게 암시한다.

화합물1은 핵의 β- 카테닌을 감소시킨다

β-카테닌과 CBP의 세포내 분포가 둘 중 하나의 위치가 화합물1에 의해 영향을 받는 지를 결정하기 위해 조사되었다. SW480 세포내의 내인성 β-카테닌의 대다수는 CBP가 그러한 것 처럼 핵 내에서 발견되었다 (도4A). 화합물1로의 처리는 β-카테닌의 SW480 세포의 세포질로의 전위를 야기하고, 여기에서 내인성 E-카드헤린의 발현은 제한된다 (도4A, 대조군 (상부)을 처리된 세포들(하부 패널)과 비교하라) (de Vries et al., "In vivo and in vitro invasion in relation to phenotypic characteristics of human colorectal carcinoma cells," Br. J. Cancer 71:271-77 (1995)). 핵 전송 억제제 렙토마이신 B의 처리는 화합물1에 의해 유도되는 β-카테닌의 세포질 전송을 제거하는데, 이것은 도4A에서 관찰되는 β-카테닌의 방출이 β-카테닌/CBP 복합체의 파괴에 기인한다는 것을 시사한다 (데이터 보이지 않음). 따라서, 우리는 β-카테닌의 CBP로의 결합의 파괴가 β-카테닌의 핵 수준을 감소시킨다고 결론지었다. 화합물1에 의해 유도된 β-카테닌의 SW480 세포의 핵으로부터 세포질로의 전위는 웨스턴 블롯 분석에 의해 관찰되었다 (도4B).

β- 카테닌 표적 유전자들에 의한 차별 조절 및 공동 활성자 이용

cyclin D1 유전자는 많은 상이한 종양 타입에서 부적절하게 발현되고, Wnt/β-카테닌 경로의 직접적 표적으로 알려졌다 (Shtutman et al., "The cyclin D1 gene is a target of the beta-catenin/LEF-1 pathway," Proc . Natl . Acad . Sci . USA 96:5522-27 (1999); Tetsu et al., "Beta-catenin regulates expression of cyclin D1 in colon carcinoma cells," Nature 398:422-26 (1999)). Wnt/β-카테닌 경로의 이 직접적 표적의 발현에 대한 화합물1의 효과를 결정하기 위해, 실시간 역전사-PCR (RT-PCR) 이 화합물1 (25μM) 또는 대조군으로 처리된 세포로부터 추출된 mRNA 에 대해, 처리 후 4, 8, 또는 24 시간 지점에서 수행되었다 (표1). 표1은 화합물1 (25μM) 또는 대조군 (0.5% DMSO)으로 4, 8, 또는 24 시간 동안 처리된 SW480 세포들의 정량적 실시간 역전사-PCR (RT-PCR) 의 결과를 보여준다. 각각의 시간 지점에 대해, 1㎍의 mRNA가 실시간 RT-PCR 되었다. 내인성 cyclin D1, c- myc, fibronectin, hnkd, axin2, c- jun, 및 BMP- 4 의 발현 수준이 β- 액틴에 대해 상대적으로 측정되었다. Δ문턱 주기(CT) 값의 정량은 각각의 세트의 평균값에서 β-액틴에 대해 얻어진 상응하는 평균값을 감함으로써 결정되었다. 모든 실험은 두 벌씩 수행되었다.

실시간 RT-PCR

유전자	항온 보관 기간 (시간)	*ΔCT 화합물1 (25 μM)	mRNA
cyclin D1	4 24	0.6 3.1	↓
axin2	4 8	0.3 0.8	↓
hnkd	4 8	0.3 1.0	↓
c-jun	4 24	0 -2.9	↑
fra-1	4 8	-1.0 -1.4	↑
c-myc	4 8	-0.9 -2.4	↑

β- 액틴 유전자는 데이터를 수치화(normalize)하기 위해 사용되었다. Δ문턱 주기(CT) 값은 각각의 세트의 평균값으로부터 β- 액틴 유전자에 대해 얻어진 상응하는 평균값을 감함으로써 결정되었다. 세포 내에 mRNA 의 양이 적을 수록, 상응하는 ΔCT 값이 증가한다. 표1에 요약된 바와 같이, 대조군과 비교하여, 화합물1이 처리된 세포 내에 cyclin D1 메시지에 대한 ΔCT 값의 시간-의존성 방식 증가가 관찰되었다. 세포 내의 cyclin D1 단백질 수준은 또한 평가되었다. 처리된 SW480 세포의 모든 세포 용해질은 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯 분석이 수행되었다. 도5A에 나타난 바와 같이, 화합물1 (25μM) 로 처리시에 cyclin D1 수준의 명백한 감소가 있었고, 이는 처리 후 4시간 부터 시작되어 24시간에 증가하였다 (래인 1 을 2와, 3을 4와, 그리고 5를 6과 비교하라).

추가적으로, 유전자들의 서브세트들이 선택되었는데, 이것들은 이전에 문헌들에서 실시간 RT-PCR에 대해 β-카테닌/TCF 의 직접적인 표적임이 보고된 것들이다. 이들 세트들 중에서, axin2의 메시지 수준 및 human naked cuticel (hnkd) (Yan et al., "Elevated expression of axin2 and hnkd mRNA provides evidence that Wnt/beta-catenin signaling is activated in human colon tumors," Proc . Natl . Acad . Sci . USA 98:14973-78 (2001)) 이 예견된 데로 하향 조절되었다 (표1). 그렇지만, 여러 β-카테닌/TCF 에 의해 조절되는 유전자들에 대한 메시지 수준이 상당히 증가하였다. 예를 들면, c- myc (He et al., "Identification of c-MYC as a target of the APC pathway," Science 281:1509-12 (1998)), c- jun 및 fra -1 (표1) (Mann et al., "Target genes of beta-catenin-T cell-factor/lymphoid-enhancer-factor signaling in human colorectal carcinomas," Proc . Natl . Acad . Sci . USA 96:1603-08 (1999)). 그러므로, 화합물1은 오직 β-카테닌 표적 유전자들의 서브세트의 발현만을 억제한다.

화합물1이 β-카테닌 신호전달의 두 개의 표적 유전자인 c- myc은 억제하지 않고 cyclin D1 만을 억제하는 사실은, 화합물1이 CBP에 대해서만 특이성을 갖고 p300에는 그렇지 않은 것과 함께, c- myc 프로모터에 의한 p300의 선택적 이용이 화합물1에 의한 억압(repression)을 피하도록 해줄 수 있다는 것을 시사한다. 내인성 c- myc 프로모터의 공동활성자 사용을 평가하기 위해서, 화합물1 (25μM) 또는 대조군 (0.5% DMSO)으로 처리된 SW480 세포들에 대해 크로마틴 면역침강 (ChIP) 측정법이 수행되었다. 도5B에서 보는 바와 같이, c- myc 프로모터는 대조군 처리 세포에서 공동활성자 CBP 및 p300 모두에 의해 점유되고, 이때 대부분은 CBP에 의해 점유된다. 화합물1로 처리하면, CBP가 c- myc 프로모터에 연합하는 것을 완전히 그리고 선택적으로 차단하고, 동시에 연합된 p300 수준이 감소한다. c- myc 프로모터와 비슷하게, 화합물1로 처리하면, CBP가 cyclin D1 프로모터에 연합하는 것을 완전히 그리고 선택적으로 차단한다 (도5B, 하부 패널). 이와는 날카로운 대비로, p300은 cyclin D1 유전자의 프로모터에 결합하는 것에 대해 CBP를 대치할 수 없다. 이것은 실시간 RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석 (표1 및 도5A)으로 얻은 데이터와 잘 관련된다. 따라서, 화합물1은 CBP의 β-카테닌에 의해 조절되는 프로모터들의 서브세트와의 연합을 선택적으로 감소시키고, 그러나 p300에 대해서는 그렇지 않다.

화합물1의 선택성을 추가로 연구하기 위해, Clontech Atlas Human Cancer 1.2 Array (#7851-1)를 이용한 cDNA 마이크로어레이 분석이 수행되었다. 데이터는 화합물1이 전체 유전자 전사에 대해 매우 선택적인 효과를 갖는다는 것을 보여주었다 (표 2-5). SW480세포를 25μM의 화합물1로 처리한 8시간 후에, ~2%의 분석된 유전자들이 2배 이상 상향 조절되었고, 반면 ~0.3% 유전자들이 50% 이상 하향-조절되었다 (표 2-3).

SW480 세포에서 25 μM의 화합물1의 8시간 처리에 의해 하향-조절된 유전자들

유전자 코드	비율	단백질/유전자

A05i	0.57	G2/유사분열-특이적 cyclin B1 (CCNB1)
A10f	0.77	매트릭스 금속단백질분해효소 11 (MMP11); 스트로멜리신 3
B01m	0.74	T-세포 활성화를 위한 링커 (LAT)
B07l	0.85	태반 칼슘-결합 단백질; 칼바그쿨린
B12j	0.62	라스(ras)-관련 C3 보툴리눔 독소 기질 2; p21-rac2
B14n	0.74	레티논산 수용체 베타 (RXR-베타; RXRB)
C06f	0.38	MCM4 DNA 복제 라이센싱 인자; CDC21 동족체
C13e	0.38	증식하는 시클릭(cyclic) 핵 항원 (PCNA); cyclin
D08b	0.73	히스톤 H4
D11c	0.60	T-세포 표면 글리코단백질 CD3 엡실론 서브유닛 전구체
E01g	0.88	인터루킨-13 전구체 (IL-13); NC30
F07e	0.53	리보뉴클리오사이드-디포스페이트 환원효소 M2 서브유니트

SW480 세포에서 25 μM의 화합물1의 24시간 처리에 의해 상향-조절된 유전자들

유전자 코드	비율	단백질/유전자
A01c	1.34	원종양유전자 c-jun; 전사 인자 AP-1
A12d	2.51	표피성장인자 수용체 (EGFR)
A13c	1.99	포스(fos)-관련 항원 (FRA1)
C01j	1.71	ets 도메인 단백질 elk-3; NET; SRF 부속 단백질 2 (SAP2)
C05d	3.66	성장 정지 및 DNA-손상-유도가능 단백질 153 (GADD153)
D03e	2.99	인테그린 알파 3 (ITGA3); 갈락토단백질 B3 (GAPB3)
D03k	2.50	저-친화성 신경 성장 인자 수용체 (NGF 수용체; NGRF)
D06e	2.68	인테그린 베타 4 (ITGB4); CD104 항원
D08h	10.39	N-sam; 피브로블라스트 성장 인자 수용체 1 전구체 (FGFR1)
E02m	1.36	MHC 클래스 I 끝이잘린(truncated) HLA G 림프구 항원
E02n	2.35	78-kDa 포도당 조절된 단백질 전구체 (GRP 78)
E07f	1.98	인터루킨-1 베타 전구체 (IL-1; IL1B); 카타볼린
E09e	2.79	마크로파지 억제 사이토카인 1 (MIC1)
F04g	1.34	비멘틴 (VIM)
F04i	23.85	뉴트로필 겔라티네이즈와 연합된 리포칼린 전구체 (NGAL)
F06n	1.79	조기 성장 반응 알파 (EGR 알파)
F09g	8.46	그라빈
F09h	3.25	TRAM 단백질
F12l	2.07	BENE
F13k	2.02	글리실 tRNA 합성효소
G31	1.29	HLA 클래스 I 조직접합성 항원 C-4 알파 서브유니트 (HLAC)

SW480 세포에서 25μM의 화합물1 24시간 처리에 의해 하향-조절된 유전자들

유전자 코드	비율	단백질/유전자

A02b	0.52	EB1 단백질
A03g	0.43	c-myc 결합 단백질 MM-1
A06i	0.47	G1/S-특이성 cyclin D1 (CCND1); cyclin PRAD1; bcl-1 종양유전자
A10k	0.28	cyclin-의존 카이네이즈 조절 서브유니트 1 (CKS1)
A11k	0.40	cyclin-의존 카이네이즈 조절 서브유니트 (CKS2)
B02a	0.21	ADP/ATP 캐리어 단백질
B03m	0.45	14-3-3 단백질 시그마; 스트라티핀; 상피세포 마커 단백질 1
B07l	0.50	태아 칼슘-결합 단백질; 칼바스쿨린
C04b	0.73	종양 괴사 인자 타입 1 수용체 연합 단백질 (TRAP1)
C04h	0.36	HHR23A; UV 절제 수복 단백질 단백질 RAD23A
C05f	0.23	MCM2 DNA 복제 라이센싱 인자; 핵 단백질 BM28
C13e	0.33	증식하는 시클릭 핵 항원 (PCNA); cyclin
D06m	0.45	세포질 초과산화물 (超過酸化物) 디스뮤테이스 1 (SOD1)
D07b	0.35	고 유동성 그룹 단백질 HMG2
D07m	0.34	글루타티온 합성효소 (GSH 합성효소; GSH-S)
D08b	0.27	히스톤 H4
D09b	0.49	핵 단백질
D12a	0.70	크로마틴 조립(assembly) 인자 1 p48 서브유니트 (CAF1 p48 서브유니트)
E04i	0.45	PDGF 연합 단백질
E11l	0.66	CD59 글리코단백질 전구체
F03e	0.34	지방산 합성효소
F06d	0.40	L-젖산 탈수소효소 H 서브유니트 (LDHB)
F10c	0.68	이노신-5'-모노포스페이트 탈수소효소 2
F13j	0.55	신장 인자 2 (EF2)
G29	0.72	뇌-특이성 투불린 알파 1 서브유니트 (TUBA1)
G45	0.65	23-kDa 매우 염기성인(highly basic) 단백질; 60 리보솜 단백질 L13A

화합물1 는 G ₁ /S-기 정지를 일으키고, 카스파제 활성을 활성화시킨다

cyclin D1 유전자의 발현의 억제는 세포 주기의 G₁/S-기에서의 정지를 일으킨다는 것이 보여져 왔다 (Shintani et al., "침샘의 인두 포낭암에서의 RB 경로(Rb-p16INK4A-cyclin D1)의 드문 변경," Anticancer Res. 20:2169-75 (2000)). HCT116 (도6A, 상부 패널) 및 SW480 (도6A, 하부 패널) 세포들은 24시간 동안 화합물1 (25μM) (도6A, 우측 패널) 또는 대조군 (0.5% DMSO) (도6A, 좌측 패널)로 처치되었다. 세포들은 이어서 프로피듐 요오드 (PI) 로 염색되었고 FACS 세포형광계수기 (cytofluorometry)로 DNA 함량을 분석하였다. 예상한 대로 대조군 세포(control cells) (도6A, 좌측))는 정상적으로 사이클링 하는 반면, 화합물1 처치된 세포(도6A, 오른쪽)는 세포 주기의 G₁/S-기 에서의 축적이 증가하는 것을 보여주었다. 그래서, 화합물1이 G₁ 기에서 세포를 정지를 일으키는 것이 보일 수 있다.

카스파제는 시스테인 단백질 분해 효소로서, 일반적으로 세포 자멸 자극에 의해 유발되는 세포의 주어진 개체군에서 활성화된다. SW480, HCT116, 및 야생형 대장 세포들(colonocytes) (CCD18Co 세포들)에서 세포 자멸 유도를 평가하기 위해, 세포들을 화합물 (25μM) 또는 대조군(control) (0.5% DMSO) 중 하나로 24시간 동안 처리하였고, 이어서 카스파제-3/7 활성도를 분석하였다. 도6B에 나타난 바와 같이, 화합물1 은 CCD18Co 세포와 비교하여 SW480 및 HCT116 세포에서 카스파제-3/7 경로를 특이적으로 그리고 상당히 활성화시킨다.

화합물1은 형질전환된 직장결장세포(Colorectal Cells)의 증식을 감소시킨다

소프트 아가 콜로니 형성 측정법이 화합물1 (0.25 - 5μM) 및 5-플루오로우라실 (5-FU) (0.5 - 32μM)으로 처치된 SW480 세포를 사용하여 수행되었다. 도7A에 나타난 바와 같이, 화합물1은 콜로니 형성 수에 있어서 용량 의존 감소를 보여준다. 화합물1 및 5-FU 의 IC₅₀ 수치는 각각 0.87 ± 0.11μM 및 1.98 ± 0.17μM이었다. 그러므로, 화합물1 은 카스파제 활성도를 증가시켰고, ß-카테닌 신호를 활성화시키는 돌연변이에 의해 형질전환된 직장결장세포의 시험관 내에서의 성장을 감소시켰다.

화합물4 및 화합물5는 민 마우스 모델에서 종양 성장을 감소시킨다

화합물4, 화합물5, 또는 운반체가 야생형 및 민(Min) 마우스에 투여되었다. 화합물4는 또한 화합물1의 동족체(analog)이다 (도1A). 여러 처치 후에 이들 마우스의 소장 및 대장에 형성되는 폴립의 수를 측정하였다 (표6). 데이터는 화합물4 및 화합물5 모두에서, 약 300 mpk로 투여되는 경우, 운반체로만 처치한 대조 마우스에 비해 민 마우스에서 폴립의 수가 감소된다는 것을 보여준다.

민 마우스 모델에서 폴립의 수에 대한 화합물4 및 화합물5의 영향

그룹	폴립의 수( 평균 ± S.D.)			P (총합) Vs. VH	% 억제 vs. VH
그룹	소장	대장	총계	P (총합) Vs. VH	% 억제 vs. VH
야생형	0.0±0.0	0.0±0.0	0.0±0.0	-	-
운반체	65.8±15.9	1.8±1.5	67.7±15.3	-	-
화합물 5 -100 mpk	69.2±20.8	1.7±1.5	71.4±23.0	-	-
화합물 5 -300 mpk	46.1±17.1	1.1±1.2	47.0±16.9	<0.01	31
화합물 4 -300 mpk	45.2±22.1	1.4±0.9	46.8±17.0	<0.01	31
술린닥(Sulindac) -160 ppm	48.0±20.7	0.5±0.5	48.5±20.9	<0.05	28

화합물3의 세포 독성

화합물3 (화합물1의 동족체, 도1A)의 세포독성 및 다른 항암 치료제들이 다양한 기원의 암세포들을 사용하여 측정되었다. 결과는 화합물3은, 다른 항암 치료제들 (즉, 시스플라틴, 5-FU, ADR(아드리아마이신))에 대한 농도와 비슷하거나 더 적은 농도에서 암세포의 사망을 일으킨다는 것을 보여준다 (표7).

세포 독성 (표7의 값은 ㎍/ml 값이다)

기원	세포	화합물 3	시스플라틴	5-FU	ADR
백혈병	HL60	1.243	> 10	7.010	0.086
전립선	PC3	1.207	> 10	> 10	0.267
폐	A549	1.386	> 10	1.007	0.117
신장	293	0.731	6.641	2.015	<0.03
흑색종	RPMI7951	0.936	5.010	0.920	0.171
가슴	MCF7	7.355	> 10	1.751	1.424

래트 및 인간에서의 화합물3의 대사

화합물3의 대사는 그 화합물을 래트 또는 인간의 간 마이크로솜과 함께 5분 내지 1시간 동안 항온 보관, HPLC를 통해 처치된 마이크로솜의 분획추출, 그 분획에 대해 MS 분석을 함에 의해 분석되었다. 그 결과는 도10A 및 도10B에 나타난다. 여러 대사물들 (예를 들면, M1, M2, M3)가 두 개의 시스템 모두에서 관찰되었다.

화합물3 , 화합물4 , 및 화합물5의 생이용성 연구

화합물3, 화합물4, 및 화합물5의 생이용성이 마우스 및 래트에서 연구되었다. 이들 화합물들의 구조는 도1A에 나타난다. 이들 모든 화합물들은 동일한 운반체 (예를 들면, 20% Tween 80))를 이용하여 투여되었다(i.v 및 p.o, 10 mg/kg). 화합물3, 4, 및 5의 마우스에서의 생이용성은 각각 2% 미만, 2% 미만, 거의 0% 이었다. 래트에서의 화합물3의 생이용성은 약 24%이다.

논의

Wnt/β-카테닌 경로의 오조절이 암의 발달 및 진행에 관여한다는 증가하는 강력한 증거가 있다 (Morin, P.J., "Beta-catenin signaling and cancer," Bioessays 21:1021-30 (1999); Moon et al., "The promise and perils of Wnt signaling through beta-catenin," Science 296:1644-46 (2002); Oving et al., "Molecular causes of colon cancer," Eur . J. Clin . Invest. 32:448-57 (2002)). 여기서, 우리는 식(I)의 화합물들이 β-카테닌/TCF 전사의 서브세트를 억제한다는 발견을 기술하였다. 구성적으로 상승된 β-카테닌/TCF 전사를 초래하는 APC 유전자에서의 돌연변이를 갖는 SW480 대장 암종 세포 내의 2차 구조-주형의 화학 라이브러리를 이용하는 정보제공 유전자 스크린닝을 사용하여 이들 적은 분자량 억제제들의 생활성의 특성을 밝혔다. 바이오틴이 삽입된 동족체 (화합물2)를 사용한 친화 크로마토그래피는 공동활성자 단백질 CBP를 화합물1의 분자 표적으로서 식별하였다.

CBP의 형질변환은 ¹⁴C-표지된 화합물1의 SW480 핵 용해질에의 결합을 상당히 증가시켰고, 반면 β-카테닌의 형질변환은 그렇지 않았다. CBP를 화합물1의 분자 표적으로서 확인하기 위해, CBP 발현 벡터의 형질변환이 화합물1에 의한 β-카테닌/TCF 정보제공 유전자 구조체의 억제를 효력 없게 만들 수 있다는 것이 보여졌다. 더구나, 화합물1은 β-카테닌 및 CBP의 상호작용을 선택적으로 차단하고, 이때 β-카테닌이 밀접하게 관련된 공동활성자 p300과 상호작용을 하는 것은 방해하지 않았다. 또한, 화합물1은 SW480 세포 내에서 핵으로부터 세포질로의 β-카테닌의 재분포를 야기하였다. 마지막으로, 화합물1에 의해 매개되는 cyclin D1 발현의 억제가 G₁/S 세포 주기 정지를 초래하였고 연장된 처리는 SW480 세포(또는 HCT116) 세포에서 카스파제 활성을 야기하였고 반면 정상 대장세포에서는 그렇지 않았으며, 형질전환된 대장 암종 세포주의 세포 자멸사를 초래하였다. 따라서, 화합물1은 β-카테닌 경로의 억제제이고, CBP는 그것의 세포 표적이다.

화합물1의 선택성을 더 연구하기 위해, Clontech Atlas Human Cancer 1.2 Array (#7851-1)를 사용한 cDNA 마이크로어레이 분석이 수행되었다. 그 데이터는 화합물1이 전체 유전자 전사에 매우 선택적인 영향을 미친다는 것을 보여주었다 (표 2-5). SW480세포를 25μM의 화합물1로 처리한 8시간 후에, ~2%의 분석된 유전자들이 2배 이상 상향 조절되었고, 반면 ~0.3% 유전자들이 50% 이상 하향-조절되었다 (표 2-3).

프로모터-의존성 공동활성자 선택성은 β-카테닌/TCF 경로의 복잡성에 더한다. 예견된 데로, 화합물1은 cyclin D1, hnkd, 및 axin2 유전자들의 발현을 억제한다 (Yan et al., "Elevated expression of axin2 and hnkd mRNA provides evidence that Wnt/beta-catenin signaling is activated in human colon tumors," Proc. Natl . Acad . Sci . USA 98:14973-78 (2001)). 그와는 달리, c- myc 의 발현은(He et al., "Identification of c-MYC as a target of the APC pathway," Science 281:1509-12 (1998)) 및 c- jun (Mann et al., "Target genes of beta-catenin-T cell-factor/lymphoid-enhancer-factor signaling in human colorectal carcinomas," Proc . Natl . Acad . Sci . USA 96:1603-08 (1999)) β-카테닌/TCF 경로에서의 차별적 공동활성자의 사용 때문에 증가한다 (표1 및 도7B). ChIP 측정법을 사용하여, 화합물1은 CBP가 내인성 c- myc 및 cyclin D1 프로모터와 연합하는 것을 억제하고, 처리된 세포에서 c- myc 프로모터에 대해서는 p300에 의한 프로모터 점유가 증가했고 cyclin D1 프로모터에 대해서는 그렇지 않았다. 이것은 β-카테닌 co-IP 실험에서 얻어진 데이터 및 cyclin D1 에 대한 실시간 RT-PCR 데이터와 매우 잘 관계된다. β-카테닌/CBP 상호관계를 억제하는데 선택적인 화합물1 및 β-카테닌/p300 에 대해 선택적인 관계된 동족체(Kahn et al., 출판되지 않은 데이터)들은 β-카테닌/TCF 복합체가 프로모터-의존성 및 공동 활성자-특이적 방식 (도7B)으로 유전자 전사를 활성화시키는 기작을 서술하기 위한 새로운 화학유전체적 도구를 제공한다.

β-카테닌과 공동활성자 단백질들인 CBP 및 p300 간의 상호작용의 특이적 접촉 장소에 관한 문헌에는 상당한 모순이 있다. 이것은 아마도 CBP 및 p300 의 β-카테닌에 많은 표적 단백질들에 불규칙한 그리고 일반적으로 낮거나 완만한(moderate) 친화 결합에 관계가 있다. 우리는 이 상황을 명확히 하는 데에 우리가 CBP에 대한 화합물1의 결합특이성을 사용할 수 있다고 예상했다. 화합물1의 CBP 단편과의 결합 연구는 CBP 의 NH₂-말단 (아미노산 1-111)에서의 상호작용 최소부위의 발견을 이끌었다. 게다가, 화합물1은 p300 내의 동족 서열에는 결합하지 않는다. 화합물1은 p300(1-111)/β-카테닌 상호 작용을 방해하지 않고, 세포 내의 CBP(1-111) 및 β-카테닌간의 상호 작용을 선택적으로 차단한다. 이 부위의 서열 배열은 TCF, APC 및 E-카드헤린 에서 발견된 기존 출판된 β-카테닌 결합 모티프와 현저한 유사성이 있다 (도5A) (Huber et al., "The structure of the beta-catenin/E-cadherin complex and the molecular basis of diverse ligand recognition by beta-catenin," Cell 105:391-402 (2001)). CBP(1-111) 및 p300 (1-111) 모두 β-카테닌과 상호작용을 하기 위한 중요한 음성 전하를 띤 버튼 (DELIXXXXE)을 포함한다 (Graham et al., "Tcf4 can specifically recognize beta-catenin using alternative conformations," Nat. Struct . Biol . 8:1048-52 (2001)). APC 및 E-카드헤린에서 발견되는, X 가 비극성 지방족 R 기를 갖는 아미노산인 SXSSXS 모티프가 또한 CBP, SASSP (아미노산 89-93)에서 발견되고, 그러나 p300에는 없다. 비록 SW480 세포 내에서 화합물1이 p300(1-111) 에 비해 CBP(1-111) 에의 차별적으로 결합하는 것이 주로 차별적인 인산화에 기인하지만, 알려진 억제제 GSK-3β(Nikoulina et al., "Inhibition of glycogen synthase kinase 3' improves insulin action and glucose metabolism in human skeletal muscle," Diabetes 51:2190-98 (2002)) 또는 PKC (Bollag et al., "Effects of the selective protein kinase C inhibitor, Ro 31-7549, on the proliferation of cultured mouse epidermal keratinocytes," J. Invest. Dermatol . 100:240-46 (1993))의 사용은 화합물1의 결합 (데이터는 보이지 않음) 에 대해서는 보이는 효과가 없다. 게다가, E. coli 에서 발현된 정제된 재조합 CBP (1-111) 는 화합물1에 결합할 수 있었고, 공동 활성자 의존성 인산화에 대해 차별적 인자로서 더 다툰다. 그래서 화합물1을 도구로서 사용하여, 우리는 CBP의 β-카테닌과의 상호작용의 최소 부위를 CBP의 최초 111 아미노산에 구체적으로 위치 특정하였다.

우리의 위치 특정 연구에 대한 추가의 지원은 CBP 상의 β-카테닌 결합 모티프에 매우 근접한, 레티논산 (RA) 수용체 RXR/RAR 에 대한 CBP 상의 결합 장소의 존재로부터 나온다 (도3F). 이전에, RA 처리가 β-카테닌/TCF 신호전달을 억제한다는 것이 보여졌다 (Earswaran et al., "Cross-regulation of beta-catenin-LEF/TCF and retinoid signaling pathways," Curr . Biol . 9:1415-18 (1999)). 공통 (LXXLL) (서열식별번호: 46) RXR/RAR 결합 장소 (LSELL) 는 CBP 및 p300 모두의 우리의 제안된 β-카테닌 결합 장소 내의 아미노산 잔기 70 내지 74 에 위치한다 (Minucci et al., "Retinoid receptors in health and disease: co-regulators and the chromatin connection. Semin," Cell Dev . Biol . 10:215-25 (1999)).

화합물1은 또한 우리가 β-카테닌 신호전달 경로인 프로모터-의존성 공동 활성자-선택성의 이슈를 언급할 수 있게 해 준다. 화합물1의 처리는 p300이 β-카테닌과 상호작용하는 것을 억제하지 않고 (도3D), 처리된 세포에서 실제로 β-카테닌/p300 복합체의 형성을 증가시킨다 (도3B). 서열 배열에서 보는 바와 같이, 위치 결정된 β-카테닌 결합 모티프들 내에서 유사하지만, 이들 두개의 공동 활성자들간에는 화합물1의 CBP에 대한 그러나 p300에 대해서는 그렇지 않은 관찰된 특이성을 설명해준다. 이 연구에 근거하여, CBP/p300의 N-말단 111 아미노산 및 β-카테닌의 상호작용이 β-카테닌/TCF 전사 활성화에 필요한 것으로 보인다.

β-카테닌/TCF 전사의 선택적 작은 분자 억제제의 발견에서의 집중적인 흥미에도 불구하고, 우리가 아는 바로는, 화합물1은 이 경로의 직접적 작은 분자 억제제의 최초 예를 나타낸다. β-카테닌 및 TCF간의 정밀한 구조 연구 (Graham et al., "Crystal structure of a beta-catenin/Tcf complex," Cell 103:885-96 (2000); Graham et al., "Tcf4 can specifically recognize beta-catenin using alternative conformations," Nat. Struct . Biol . 8:1048-52 (2001); Poy et al., "Structure of a human Tcf4-beta-catenin complex," Nat. Struct . Biol . 8:1053-57 (2001)), 이 경로의 억제의 연역적인 매력적인 모드 에도 불구하고, β-카테닌의 중앙 Arm 반복에 또한 결합하는, TCF (예를 들면, APC 및 E-카드헤린)외의 다양한 파트너들에 기인한 특이적 억제제의 발달에 관한 관심이 일어난다 (Huber et al., "The structure of the beta-catenin/E-cadherin complex and the molecular basis of diverse ligand recognition by beta-catenin," Cell 105:391-402 (2001)). 화합물1의 정밀한 선택성은, 매우 동족의 공동 활성자 p300 (CBP 와 아미노산 수준에서 96% 까지의 동일성을 갖는다)와는 달리 그것의 β-카테닌/CBP 상호작용의 특이적 억제를 통해, β-카테닌/TCF-매개의 전사를 조사하기 위한 독특한 화학유전체 도구를 제공하였다. 화합물1의 특이성, 그것의 선택적으로 형질전환된 그러나 정상이 아닌 대장 세포에서 세포자멸사 카스파제를 활성화시키는 능력, 및 그것의 소프트 아가 콜로니 측정법에서의 효용은 그것의 대장암에서의 잠재적 치료 유용성을 북돋우는 신호들이다. 또한, 화합물1의 동족체들은, 마우스의 암 모델에서 제한된 독성으로 생체 내 효용을 보여왔다 (SW480 세포로 주사된 누드마우스 및 민 마우스 모델; Moser et al., "ApcMin: a mouse model for intestinal and mammary tumorigenesis," Eur . J. Cancer A:1061-64 (1995); Kahn et al., 출판되지 않은 데이터). 이것은 다른 초증식 장애에서 뿐만 아니라, 암 화학 치료에서의 잠재적 사용에 대한 β-카테닌/TCF/CBP 전사의 선택적 억제제의 용도를 확인시켜 준다.

이 명세서 및/또는 출원 데이터 시트에 기록된 상기 모든 미국 특허, 미국 특허출원 공개, 미국 특허 출원, 외국 출원, 최국 특허 출원 및 특허가 아닌 출판들은 여기에 그 전체가 인용으로서 삽입된다.

앞서로부터, 비록 본 발명의 특정 실시태양이 설명을 위해 기술되었지만, 다양한 변형이 본 발명의 범위 및 정신을 벗어나지 않고 만들어질 수 있고, 따라서 본 발명은 부록의 청구범위에 의한 예외를 제외하고는 제한되지 않는다.

SEQUENCE LISTING <110> Choongwae Pharma Corporation Kahn, Michael Oh, SeWoong Dae, HoonKim Ha, JongRyul <120> MODULATION OF BETA-CATENIN/TCF-ACTIVATED TRANSCRIPTION <130> 200146.404PC <140> PCT <141> 2004-08-27 <150> 60/498,451 <151> 2003-08-28 <160> 55 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tgaggaatca acagccgcca tcttgtcgcg gacccgaccg gggcttcgag cgcgatctac 60 tcggccccgc cggtcccggg ccccacaacc gcccgcgctc gctcctctcc ctcgcagccg 120 gcagggcccc cgacccccgt ccgggccctc gccggcccgg ccgcccgtgc ccggggctgt 180 tttcgcgagc aggtgaaaat ggctgagaac ttgctggacg gaccgcccaa ccccaaaaga 240 gccaaactca gctcgcccgg tttctcggcg aatgacagca cagattttgg atcattgttt 300 gacttggaaa atgatcttcc tgatgagctg 330 <210> 2 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Glu Asn Leu Leu Asp Gly Pro Pro Asn Pro Lys Arg Ala Lys 1 5 10 15 Leu Ser Ser Pro Gly Phe Ser Ala Asn Asp Ser Thr Asp Phe Gly Ser 20 25 30 Leu Phe Asp Leu Glu Asn Asp Leu Pro Asp Glu Leu Ile Pro Asn Gly 35 40 45 Gly Glu Leu Gly Leu Leu Asn Ser Gly Asn Leu Val Pro Asp Ala Ala 50 55 60 Ser Lys His Lys Gln Leu Ser Glu Leu Leu Arg Gly Gly Ser Gly Ser 65 70 75 80 Ser Ile Asn Pro Gly Ile Gly Asn Val Ser Ala Ser Ser Pro Val Gln 85 90 95 Gln Gly Leu Gly Gly Gln Ala Gln Gly Gln Pro Asn Ser Ala Asn 100 105 110 <210> 3 <211> 340 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ccttgtttgt gtgctaggct gggggggaga gagggcgaga gagagcgggc gagagtgggc 60 aagcaggacg ccgggctgag tgctaactgc gggacgcaga gagtgcggag gggagtcggg 120 tcggagagag gcggcagggg ccagaacagt ggcagggggc ccggggcgca cgggctgagg 180 cgacccccag ccccctcccg tccgcacaca cccccaccgc ggtccagcag ccgggccggc 240 gtcgacgcta ggggggacca ttacataacc cgcgccccgg ccgtcttctc ccgccgccgc 300 ggcgcccgaa ctgagcccgg ggcgggcgct ccagcactgg 340 <210> 4 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Glu Asn Val Val Glu Pro Gly Pro Pro Ser Ala Lys Arg Pro 1 5 10 15 Lys Leu Ser Ser Pro Ala Leu Ser Ala Ser Ala Ser Asp Gly Thr Asp 20 25 30 Phe Gly Ser Leu Phe Asp Leu Glu His Asp Leu Pro Asp Glu Leu Ile 35 40 45 Asn Ser Thr Glu Leu Gly Leu Thr Asn Gly Gly Asp Ile Asn Gln Leu 50 55 60 Gln Thr Ser Leu Gly Met Val Gln Asp Ala Ala Ser Lys His Lys Gln 65 70 75 80 Leu Ser Glu Leu Leu Arg Ser Gly Ser Ser Pro Asn Leu Asn Met Gly 85 90 95 Val Gly Gly Pro Gly Gln Val Met Ala Ser Gln Ala Gln Gln Ser Ser 100 105 110 Pro Gly Leu Gly Leu 115 <210> 5 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Met Ala Glu Asn Leu Leu Asp Gly Pro Pro Asn Pro Lys Arg Ala Lys 1 5 10 15 Leu Ser Ser Pro Gly Phe Ser Ala Asn Asp Asn Thr Asp Phe Gly Ser 20 25 30 Leu Phe Asp Leu Glu Asn Asp Leu Pro Asp Glu Leu Ile Pro Asn Gly 35 40 45 Glu Leu Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Leu Val Pro Asp Ala Ala Ser 50 55 60 Lys His Lys Gln Leu Ser Glu Leu Leu Arg Gly Gly Ser Gly Ser Ser 65 70 75 80 Ile Asn Pro Gly Ile Gly Asn Val Ser Ala Ser Ser Pro Val Gln Gln 85 90 95 Gly Leu Gly Gly Gln Ala Gln Gly Gln Pro Asn Ser 100 105 <210> 6 <211> 330 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 atggccgaga acttgctgga cggaccgccc aaccccaaac gagccaaact cagctcgccc 60 ggcttctccg cgaatgacaa cacagatttt ggatcattgt ttgacttgga aaatgacctt 120 cctgatgagc tgatccccaa tggagaatta agccttttaa acagtgggaa ccttgttcca 180 gatgctgcgt ccaaacataa acaactgtca gagcttctta gaggaggcag cggctctagc 240 atcaacccag ggataggcaa tgtgagtgcc agcagccctg tgcaacaggg ccttggtggc 300 caggctcagg ggcagccgaa cagtacaaac 330 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer used to clone the C-terminally truncated constructs of CBP <400> 7 gatatctgag ctcgtggatc cgatggccga gaacttgctg 40 <210> 8 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer used to clone the C-terminally truncated constructs of CBP <400> 8 cgtgtataca gctgtgcggc cgcgtttgta ctgttcggct g 41 <210> 9 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer used to clone the C-terminally truncated constructs of CBP <400> 9 cgtgtataca gctgtgcggc cgctccattc atgacttgag c 41 <210> 10 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer used to clone the C-terminally truncated constructs of CBP <400> 10 cgtgtataca gctgtgcggc cgcgcgtttt tcagggtctg c 41 <210> 11 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer used to clone the C-terminally truncated constructs of CBP <400> 11 cgtgtataca gctgtgcggc cgcagctggt aaagctggct g 41 <210> 12 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer used to clone the C-terminally truncated constructs of CBP <400> 12 cgtgtataca gctgtgcggc cgcatgttgg agagagggca t 41 <210> 13 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer used to clone the C-terminally truncated constructs of CBP <400> 13 cgtgtataca gctgtgcggc cgcagaacct tgtaaatcct c 41 <210> 14 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer used to clone the C-terminally truncated constructs of CBP <400> 14 cgtgtataca gctgtgcggc cgcgctgtag taggctgcat c 41 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer used to generate the N-terminally truncated constructs of CBP <400> 15 gtatacagct gtgcggccgc caaaccctcc acaaactttt c 41 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CBP-C8 <400> 16 gatatctgag ctcgtggatc cggaagctgg ggaggttttt 40 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CBP-C9 <400> 17 gatatctgag ctcgtggatc cgaagaagat gctggacaag 40 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CBP-C10 <400> 18 gatatctgag ctcgtggatc cgtccaaatg gtccactctg 40 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CBP-C11 <400> 19 gatatctgag ctcgtggatc cgtctcctac ctcagcacca 40 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CBP-C12 <400> 20 gatatctgag ctcgtggatc cgaacatcct taaatcaaac 40 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CBP-C13 <400> 21 gatatctgag ctcgtggatc cgcagcagca acgcatgcaa 40 <210> 22 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer used to generate CBP <400> 22 atctgagctc gtggatccgg gaccgcccaa ccccaaacga gccaaactcc agccgaacag 60 tacaaacatg gccagctta 79 <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for the C-terminal truncated p-300 constructs <400> 23 gacggtaccg gttcgaagct tatggccgag aatgtggtg 39 <210> 24 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for the C-terminal truncated p-300 constructs <400> 24 cgtgtataca gctgtgcggc cgccaaacct aatccaggac t 41 <210> 25 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for the C-terminal truncated p-300 constructs <400> 25 cgtgtataca gctgtgcggc cgcgttgcca gcacttccca t 41 <210> 26 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for the C-terminal truncated p-300 constructs <400> 26 cgtgtataca gctgtgcggc cgcggcctgt tcccggcgct g 41 <210> 27 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Four tandem TCF4 binding sites used to generate the beta-catenin/TCF reporter plasmid <400> 27 ccaacctttg atcttacccc ctttgatctt accccctttg atcaggaatt cggttggaaa 60 ctagaatggg ggaaactaga atgggggaaa ctagtcctta ag 102 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer used for PCR of c-myc promoters <400> 28 tggtaggcgc gcgtagtta 19 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer used for PCR of c-myc promoters <400> 29 gggcggagat tagcgagag 19 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer used for PCR of cyclin D1 promoters <400> 30 tgcttaacaa cagtaacgt 19 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer used for PCR of cyclin D1 promoters <400> 31 ggggctcttc ctgggcagc 19 <210> 32 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclin-D1 forward primer <400> 32 agatcgaagc cctgctg 17 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclin-D1 reverse primer <400> 33 agggggaaag agcaaagg 18 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> axin2 forward primer <400> 34 gtgtgaggtc cacggaaact 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> axin2 reverse primer <400> 35 ctcgggaaat gaggtagaga 20 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hnkd forward primer <400> 36 ctggctgctg ctaccaccat tgcgt 25 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hnkd reverse primer <400> 37 ccaggcccaa attgggacgt 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-myc forward primer <400> 38 gaagaaattc gagctgctgc 20 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-myc reverse primer <400> 39 cacatacagt cctggatgat g 21 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-jun forward primer <400> 40 agatgcccgg cgagacaccg 20 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-jun reverse primer <400> 41 agcccccgac ggtctcttt 19 <210> 42 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fra-1 forward primer <400> 42 accccggcca ggagtcatcc gggccc 26 <210> 43 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fra-1 reverse primer <400> 43 aggcgcctca caaagcgagg agggtt 26 <210> 44 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward primer <400> 44 atctggcacc acaccttcta caatgagctg cg 32 <210> 45 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin reverse primer <400> 45 cgtcatactc ctccttgcyg atccacatct gc 32 <210> 46 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus RXR/RAR binding site <221> VARIANT <222> 2, 3 <223> Xaa = Any Amino Acid <400> 46 Leu Xaa Xaa Leu Leu 1 5 <210> 47 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Asn Asp Glu Leu Ile Arg Phe Lys Asp Glu Gly Glu Gln Glu Glu 1 5 10 15 <210> 48 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Tyr Asp Ser Leu Leu Val Phe Asp Tyr Glu Gly Ser Gly Ser Ala Ala 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ser Leu 20 <210> 49 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Ala Asp Thr Leu Leu His Phe Ala Thr Glu Ser Ser Cys Ser Ser Ser 1 5 10 15 Leu Ser Ala Leu 20 <210> 50 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Leu Asp Thr Pro Ile Asn Tyr Ser Leu Lys Tyr Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 <210> 51 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Glu Asp Thr Pro Ile Cys Phe Ser Arg Cys Ser Ser Leu Ser Ser Leu 1 5 10 15 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Glu Asp Val Val Met Ala Phe Ser Arg Ser Glu Thr Glu Asp Arg 1 5 10 15 <210> 53 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Pro Asp Glu Leu Ile Pro Asn Gly Gly Glu Leu Gly Leu Leu Asn Ser 1 5 10 15 Ser Gly Ser Ser Ala Ser Ser Pro 20 <210> 54 <211> 23 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 54 Pro Asp Glu Leu Ile Pro Asn Gly Glu Leu Ser Leu Leu Asn Ser Ser 1 5 10 15 Gly Ser Ser Ala Ser Ser Pro 20 <210> 55 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Pro Asp Glu Leu Ile Asn Ser Thr Glu Leu Gly Leu Thr Asn Ser Ser 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Pro Gly Gln 20 12 EXPRESS MAIL NO: EV336655989US 1

Claims

조성물을 약제와 접촉시키는 것을 포함하는 β-카테닌에 의해 유도되는 표적 유전자의 발현을 조절하는 방법으로서, 상기 조성물은 β-카테닌, CBP 및 p300을 포함하고, β-카테닌은 p300 대비 CBP 에 결합할 가능성이 있고, 상기 약제는 β-카테닌이 p300 대비 CBP에 결합할 가능성을 변화시키는 데에 유효한 양으로 조성물과 접촉되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 약제가 CBP의 β-카테닌에의 결합을 증가시키는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 약제가 p300의 β-카테닌에의 결합을 감소시키는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 약제가 p300의 β-카테닌에의 결합을 증가시키는 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 약제가 CBP의 β-카테닌에의 결합을 감소시키는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 생체 외(ex vivo)에 존재하는 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 조성물이 줄기 세포를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 세포 또는 포유동물인 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 포유동물이 암을 앓고 있고, 상기 양이 상기 암을 치료하는 데 유효한 양인 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 암이 대장암인 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 암이 전립선암 및 유방암으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 세포이고, 상기 약제는 상기 세포가 증식하기보다는 분화할 가능성을 증가시키는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 세포이고, 상기 약제는 상기 세포가 분화하기보다는 증식할 가능성을 증가시키는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 약제가 하기 식(I) 및 그 이성질체로부터 선택되는 구조를 갖는 것인 방법:

상기 식에서, A는 -(CHR₃)- 또는 -(C=O)-이고, B는 -(CHR₄)- 또는 -(C=O)-이고, D는 -(CHR₅)- 또는 -(C=O)-이고, E는 -(ZR₆)- 또는 -(C=O)-이고, G는 -(XR₇)_n-, -(CHR₇)-(NR₈)-, -(C=O)-(XR₉)-, 또는 -(C=O)-이고, W는 -Y(C=O)-, -(C=O)NH-, -(SO₂)-, 또는 부존재하고, Y는 산소 또는 황이고, X 및 Z는 독립적으로 질소 또는 CH이고, n=0 또는 1 이고; 및 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ 및 R₉는 동일하거나 상이하고 각각 아미노산 측쇄 부분(side chain moiety), 아미노산 측쇄 부분의 유도체, 또는 분자의 잔여 부분으로부터 독립적으로 선택된다.
제14항에 있어서, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ 및 R₉는 아미노C₂ _- ₅알킬, 구아니디노C₂ _- ₅알킬, C₁ _- ₄알킬구아니디노C₂ _- ₅알킬, 디C₁ _- ₄알킬구아니디노C_2-5알킬, 아미디노C₂ _- ₅알킬, C₁ _- ₄알킬아미디노C₂ _- ₅알킬, 디C₁ _- ₄알킬아미디노C₂ _- ₅알킬, C₁ _-3알콕시, 페닐, 치환된 페닐 (여기서 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다 조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C₁ _- ₄디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C₁ _- ₄알킬, C_1-4알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 벤질, 치환된 벤질 (여기서 벤질 상의 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C₁ _- ₄디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 나프틸, 치환된 나프틸 (여기서 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C₁ _- ₄디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 비스-페닐 메틸, 치환된 비스-페닐 메틸 (여기서 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C₁ _- ₄디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 피리딜, 치환된 피리딜, (여기서 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C₁ _- ₄디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C₁ _- ₄알킬, C_1-4알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 피리딜C₁ _- ₄알킬, 치환된 피리딜C₁ _- ₄알킬 (여기서 피리딘 치 환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C₁ _- ₄디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 피리미딜C₁ _- ₄알킬, 치환된 피리미딜C₁ _- ₄알킬 (여기서 피리미딘 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C₁ _- ₄디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 트리아진-2-일-C_1-4알킬, 치환된 트리아진-2-일-C₁ _- ₄알킬 (여기서 트리아진 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C₁ _- ₄디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 이미다졸C_1-4알킬, 치환된 이미다졸 C₁ _- ₄알킬 (여기서 이미다졸 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C₁ _- ₄알킬아미노, C₁ _- ₄디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₄알킬, C₁ _- ₃알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 이미다졸리닐C₁ _- ₄알킬, N-아미디노피페라지닐-N-C_0-4알킬, 하이드록시C₂ _- ₅알킬, C₁ _- ₅알킬아미노C₂ _- ₅알킬, C₁ _- ₅디알킬아미노 C_2-5알킬, N-아미디노피페리디닐C₁ _- ₄알킬 및 4-아미노시클로헥실C₀ _- ₂알킬로부터 독립적으로 선택되는 것인 방법.
제14항에 있어서, A가 -(CHR₃)-이고, B가 -(C=O)-이고, D가 -(CHR₅)-이고, E가 -(C=O)-이고, G가 -(XR₇)_n- 이고, 상기 화합물이 하기 일반식 (II)를 갖는 것인 방법:

상기 식에서, R₁, R₂, R₃, R₅, R₇, W, X 및 n은 제1항에서 정의한 바와 같다.
제14항에 있어서, A가 -(C=O)-, B가 -(CHR₄)-, D가 -(C=O)-, E가 -(ZR₆)-, G가 -(C=O)-(XR₉)- 이고, 상기 화합물이 하기 일반식 (III)을 갖는 것인 방법:

상기 식에서, R₁, R₂, R₄, R₆, R₉, W 및 X는 제1항에서 정의한 바와 같으며, Z는 질 소 또는 CH 이고, 단 Z가 CH일 때 X는 질소이다.
제14항에 있어서, A가 -(C=O)-, B가 -(CHR₄)-, D가 -(C=O)-, E가 -(ZR₆)-, G가 (XR₇)_n-이며, 상기 화합물은 다음 일반식 (IV)를 갖는 것인 화합물:

상기 식에서, R₁, R₂, R₄, R₆, R₇, W, X 및 n은 제1항에서 정의한 바와 같으며, Z는 질소 또는 CH 이고, 단 Z가 질소일 때 n은 0이며, 또한 Z가 CH일 때 X는 질소이고 n은 0이 아니다.
제18항에 있어서, 상기 화합물은 하기 일반식 (VI)를 갖는 것인 방법:

상기 식에서, R_a는 질소, 산소 또는 황으로부터 선택되는 1 내지 3개 헤테로원자를 가질 수 있는 8 내지 11 환 구성원을 갖는 바이사이클릭(bicyclic) 아릴기이고, R_b 는 질소, 산소 또는 황으로부터 선택되는 1 내지 2개 헤테로원자를 가질 수 있는 5 내지 7 환 구성원을 갖는 모노사이클릭 아릴기이고, 화합물 중의 아릴 환이 할로겐화물(halide), 히드록시, 시아노, 저급 알킬, 및 저급 알콕시기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체를 가질 수 있다.
제19항에 있어서, R_a는 나프틸, 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐기 이고, R_b 는 페닐, 피리딜 또는 피페리딜이고, 이들 모두는 할로겐화물, 히드록시, 시아노, 저급 알킬, 및 저급 알콕시기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있는 것인 방법.
제20항에 있어서, R_a는 나프틸이고, R_b 는 페닐이고, 이들은 할로겐화물, 히드록시, 시아노, 저급 알킬, 및 저급 알콕시기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있는 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 약제가 화합물1인 것인 방법.
약제, β-카테닌, CBP 및 p300을 포함하는 조성물로서, β-카테닌이 p300 대비 CBP에 결합할 가능성을 갖고, 상기 약제가 β-카테닌이 p300 대비 CBP에 결합할 가능성을 변화시키는 데 유효한 양으로 조성물 내에 존재하는 것인 조성물.
제23항에 있어서, 상기 약제가 CBP의 β-카테닌에의 결합을 증가시키는 것인 조성물.
제24항에 있어서, 상기 약제가 p300의 β-카테닌에의 결합을 감소시키는 것인 조성물.
제23항에 있어서, 상기 약제가 p300의 β-카테닌에의 결합을 증가시키는 것인 조성물.
제26항에 있어서, 상기 약제가 CBP의 β-카테닌에의 결합을 감소시키는 것인 조성물.
제23항에 있어서, 상기 조성물이 생체 외(ex vivo) 상태에 있는 것인 조성물.
제28항에 있어서, 상기 조성물이 줄기 세포를 더 포함하는 것인 조성물.
제29항에 있어서, 상기 약제가 세포가 증식하기보다는 분화하는 가능성을 증가시키는 것인 조성물.
제29항에 있어서, 상기 약제가 세포가 분화하기보다는 증식하는 가능성을 증가시키는 것인 조성물.
제23항에 있어서, 상기 약제가 하기 식(I) 및 그 이성질체로부터 선택되는 구조를 갖는 것인 방법:

상기 식에서, A는 -(CHR₃)- 또는 -(C=O)-이고, B는 -(CHR₄)- 또는 -(C=O)-이고, D는 -(CHR₅)- 또는 -(C=O)-이고, E는 -(ZR₆)- 또는 -(C=O)-이고, G는 -(XR₇)_n-, -(CHR₇)-(NR₈)-, -(C=O)-(XR₉)-, 또는 -(C=O)-이고, W는 -Y(C=O)-, -(C=O)NH-, -(SO₂)-, 또는 부존재하고, Y는 산소 또는 황이고, X 및 Z는 독립적으로 질소 또는 CH이고, n=0 또는 1 이고; 및 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ 및 R₉는 동일하거나 상이하고 각각 아미노산 측쇄 부분, 아미노산 측쇄 부분의 유도체, 또는 분자의 잔여 부분으로부터 독립적으로 선택된다.
제32항에 있어서, 상기 약제가 화합물1인 것인 화합물.
(a) Wnt 경로의 구성요소를 포함하는 조성물(i)을 Wnt 경로를 활성화시키는 화합물(ii)에 접촉시켜, 활성화된 Wnt 경로를 제공하는 단계; 및

(b) p300 및 β-카테닌 간의 결합을 완전히 또는 실질적으로 방해하지만 CBP 및 β-카테닌 간의 결합은 거의 또는 전혀 방해하지 않는 화학 약제로 Wnt 경로의 활성을 조절하는 단계,

를 포함하는 Wnt 경로의 활성을 조절하는 방법.
제34항에 있어서, 상기 조성물이 세포인 것인 방법.
제34항에 있어서, 상기 방법은 생체 외(ex vivo)에서 수행되는 것인 방법.
제34항에 있어서, 상기 화합물이 LiCl 또는 GSK3 억제제인 것인 방법.
제34항에 있어서, 상기 화학 약제가 하기 식(I) 및 그 이성질체로부터 선택되는 구조를 갖는 것인 방법:

상기 식에서, A는 -(CHR₃)- 또는 -(C=O)-이고, B는 -(CHR₄)- 또는 -(C=O)-이고, D는 -(CHR₅)- 또는 -(C=O)-이고, E는 -(ZR₆)- 또는 -(C=O)-이고, G는 -(XR₇)_n-, -(CHR₇)-(NR₈)-, -(C=O)-(XR₉)-, 또는 -(C=O)-이고, W는 -Y(C=O)-, -(C=O)NH-, -(SO₂)-, 또는 부존재하고, Y는 산소 또는 황이고, X 및 Z는 독립적으로 질소 또는 CH이고, n=0 또는 1 이고; 및 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ 및 R₉는 동일하거나 상이하고 각각 아미노산 측쇄 부분, 아미노산 측쇄 부분의 유도체, 또는 분자의 잔여 부분으로부터 독립적으로 선택된다.
(a) 모집단의 일부는 증식하도록 하고, 모집단의 일부는 분화하도록 하는 조건하에 세포 모집단을 제공하는 단계; 및

(b) 상기 모집단에 화학 약제를 첨가하는 단계로서, 상기 약제가 세포가 분화하는 부분에 비해 세포가 증식하는 부분의 증가를 일으키는 것인 단계,

를 포함하는 세포 증식을 조절하는 방법.
제39항에 있어서, 상기 화합물은 p300 및 β-카테닌 간의 결합을 방해하는 것인 방법.
제39항에 있어서, 모집단에 Wnt 경로를 활성화시키는 약제를 첨가하는 단계를 더 포함하는 방법.
제39항에 있어서, 상기 세포 모집단은 줄기 세포의 모집단인 것인 방법.
제39항에 있어서, 상기 방법은 생체 외(ex vivo)에서 수행되는 것인 방법.
제39항에 있어서, 세포 모집단의 분화를 일으키는 약제를 첨가하는 단계를 더 포함하는 방법.
제44항에 있어서, 모집단의 세포가 분화하여 혈액 세포를 형성하는 것인 방법.
제44항에 있어서, 모집단의 세포가 분화하여 신경 세포, 근육 세포, 뼈 세포 또는 이자 베타-세포(pancreatic beta-cells)를 형성하는 것인 방법.
제44항에 있어서, 상기 화학 약제가 하기 식(I) 및 그 이성질체로부터 선택되는 구조를 갖는 것인 방법:

상기 식에서, A는 -(CHR₃)- 또는 -(C=O)-이고, B는 -(CHR₄)- 또는 -(C=O)-이고, D는 -(CHR₅)- 또는 -(C=O)-이고, E는 -(ZR₆)- 또는 -(C=O)-이고, G는 -(XR₇)_n-, -(CHR₇)-(NR₈)-, -(C=O)-(XR₉)-, 또는 -(C=O)-이고, W는 -Y(C=O)-, -(C=O)NH-, -(SO₂)-, 또는 부존재하고, Y는 산소 또는 황이고, X 및 Z는 독립적으로 질소 또는 CH이고, n=0 또는 1 이고; 및 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ 및 R₉는 동일하거나 상이하고 각각 아미노산 측쇄 부분, 아미노산 측쇄 부분의 유도체, 또는 분자의 잔여 부분으로부터 독립적으로 선택된다.
β-카테닌/p300 상호작용에 비해 β-카테닌/CBP 상호작용을 선택적으로 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 화합물을 조성물에 투여하는 것을 포함하고, 상기 조성물은 β-카테닌, CBP, 및 p300을 포함하고, 상기 화합물은 β-카테닌/p300 상호작용에 비해 β-카테닌/CBP 상호작용을 선택적으로 억제하는 것인 방법.
제48항에 있어서, 상기 화합물이 하기 식(I) 및 그 이성질체로부터 선택되는 구조를 갖는 것인 방법:

상기 식에서, A는 -(CHR₃)- 또는 -(C=O)-이고, B는 -(CHR₄)- 또는 -(C=O)-이고, D는 -(CHR₅)- 또는 -(C=O)-이고, E는 -(ZR₆)- 또는 -(C=O)-이고, G는 -(XR₇)_n-, -(CHR₇)-(NR₈)-, -(C=O)-(XR₉)-, 또는 -(C=O)-이고, W는 -Y(C=O)-, -(C=O)NH-, -(SO₂)-, 또는 부존재하고, Y는 산소 또는 황이고, X 및 Z는 독립적으로 질소 또는 CH이고, n=0 또는 1 이고; 및 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ 및 R₉는 동일하거나 상이하고 각각 아미노산 측쇄 부분, 아미노산 측쇄 부분의 유도체, 또는 분자의 잔여부분으로부터 독립적으로 선택된다.
β-카테닌/CBP 상호 작용에 비해 β-카테닌/p300 상호 작용을 선택적으로 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 화합물을 조성물에 투여하는 것을 포함하고, 상기 조성물은 β-카테닌, CBP 및 p300을 포함하고, 상기 화합물은 β-카테닌/CBP 상호 작용에 비해 β-카테닌/p300 상호 작용을 선택적으로 억제하는 것인 방법.
제50항에 있어서, 상기 화합물이 하기 식(I) 및 그 이성질체로부터 선택되는 구조를 갖는 것인 방법:

상기 식에서, A는 -(CHR₃)- 또는 -(C=O)-이고, B는 -(CHR₄)- 또는 -(C=O)-이고, D는 -(CHR₅)- 또는 -(C=O)-이고, E는 -(ZR₆)- 또는 -(C=O)-이고, G는 -(XR₇)_n-, -(CHR₇)-(NR₈)-, -(C=O)-(XR₉)-, 또는 -(C=O)-이고, W는 -Y(C=O)-, -(C=O)NH-, -(SO₂)-, 또는 부존재하고, Y는 산소 또는 황이고, X 및 Z는 독립적으로 질소 또는 CH이고, n=0 또는 1 이고; 및 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ 및 R₉는 동일하거나 상이하고 각각 아미노산 측쇄 부분, 아미노산 측쇄 부분의 유도체, 또는 분자의 잔여 부분으로부터 독립적으로 선택된다.
핵으로부터 세포질로의 β-카테닌의 전위(translocation)을 향상시키는 방법으로서, 상기 방법은 화합물을 세포에 투여하는 것을 포함하고, 상기 세포는 핵 및 세포질을 포함하고, 상기 핵은 β-카테닌을 포함하고, 상기 화합물은 핵으로부터 세포질로의 β-카테닌의 전위를 일으키는 것인 방법.
제52항에 있어서, 상기 화합물이 하기 식(I) 및 그 이성질체로부터 선택되는 구조를 갖는 것인 방법:

상기 식에서, A는 -(CHR₃)- 또는 -(C=O)-이고, B는 -(CHR₄)- 또는 -(C=O)-이고, D는 -(CHR₅)- 또는 -(C=O)-이고, E는 -(ZR₆)- 또는 -(C=O)-이고, G는 -(XR₇)_n-, -(CHR₇)-(NR₈)-, -(C=O)-(XR₉)-, 또는 -(C=O)-이고, W는 -Y(C=O)-, -(C=O)NH-, -(SO₂)-, 또는 부존재하고, Y는 산소 또는 황이고, X 및 Z는 독립적으로 질소 또는 CH이고, n=0 또는 1 이고; 및 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ 및 R₉는 동일하거나 상이하고 각각 아미노산 측쇄 부분, 아미노산 측쇄 부분의 유도체, 또는 분자의 잔여 부분으로부터 독립적으로 선택된다.
Wnt/β-카테닌 경로에 의해 표적이 되는 유전자들의 발현을 선택적으로 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 화합물을 조성물에 투여하는 것을 포함하고, 상기 조성물은 Wnt/β-카테닌 경로에 의해 표적이 되는 유전자들을 포함하고, 상기 화합물은 Wnt/β-카테닌 경로에 의해 표적이 되는 유전자들의 발현의 변화를 일으키는 것인 방법.
제54항에 있어서, 상기 화합물이 하기 식(I) 및 그 이성질체로부터 선택되는 구조를 갖는 것인 방법:

상기 식에서, A는 -(CHR₃)- 또는 -(C=O)-이고, B는 -(CHR₄)- 또는 -(C=O)-이고, D는 -(CHR₅)- 또는 -(C=O)-이고, E는 -(ZR₆)- 또는 -(C=O)-이고, G는 -(XR₇)_n-, -(CHR₇)-(NR₈)-, -(C=O)-(XR₉)-, 또는 -(C=O)-이고, W는 -Y(C=O)-, -(C=O)NH-, -(SO₂)-, 또는 부존재하고, Y는 산소 또는 황이고, X 및 Z는 독립적으로 질소 또는 CH이고, n=0 또는 1 이고; 및 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ 및 R₉는 동일하거나 상이하고 각각 아미노산 측쇄 부분, 아미노산 측쇄 부분의 유도체, 또는 분자의 잔여 부분으로부터 독립적으로 선택된다.
줄기 세포를 미분화 상태로 유지시키는 방법으로서, 세포 분화를 억제하거나 세포 증식을 촉진시키는 약제에, 줄기 세포를 미분화 상태로 유지하는 데 유효한 양으로 줄기 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
제56항에 있어서, 상기 약제는 β-카테닌/CBP 상호 작용에 비해 β-카테닌/p300 상호 작용을 선택적으로 억제하는 것인 방법.
β-카테닌:CBP 상호작용의 작은 분자 억제제를 식별하는 방법으로서:

(a) 추정의 β-카테닌:CBP 작은 분자 억제제를 CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)과 접촉시키는 단계;

(b) 상기 단계(a)의 혼합물을 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)과 접촉시키는 단계;

(c) 상기 단계(a)의 상기 분자가, 상기 단계(b)의 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)이 상기 단계(a)의 CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)과 결합하는 것을 억제하는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및

(d) 상기 단계(a)의 상기 작은 분자가 상기 CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 상기 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)과 결합하는 것을 억제하는 지의 결정에 의해, 상기 단계(a)의 작은 분자를 β-카테닌:CBP 상호작용의 억제제로서 식별하는 단계,

를 포함하는 방법.
제58항에 있어서:

(e) 상기 단계(d)의 식별된 β-카테닌:CBP 상호작용의 작은 분자 억제제를 p300 1-111 을 포함하는 부분(moiety)(1) 및 β-카테닌(2)을 포함하는 혼합물에 접촉시키는 단계;

(f) 상기 단계(e)에서의 상기 분자가, 상기 p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는 것을 측정법에 의해 결정하 는 단계; 및

(g) 상기 단계(e)에서의 상기 작은 분자가, 상기 p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는 것을 결정한 것에 의해, 상기 작은 분자가 β-카테닌:CBP 상호작용의 선택적 억제제인 것을 확인하는 단계,

를 더 포함하는 방법.
β-카테닌:CBP 상호작용의 작은 분자 억제제를 식별하는 방법으로서:

(a) 추정의 β-카테닌:CBP 작은 분자 억제제를 β-카테닌을 포함하는 부분과 접촉시키는 단계;

(b) 상기 단계(a)의 혼합물을 CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)과 접촉시키는 단계;

(c) 상기 단계(a)의 상기 분자가, 상기 단계(b)의 CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 상기 단계(a)의 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)과 결합하는 것을 억제하는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및

(d) 상기 단계(a)에서의 상기 작은 분자가 상기 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)이 CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)과 결합하는 것을 억제하는지 여부를 결정한 것에 의해, 상기 단계(a)의 작은 분자를 β-카테닌:CBP 상호작용의 억제제로서 식별하는 단계,

를 포함하는 방법.
제60항에 있어서:

(e) 상기 단계(d)의 식별된 β-카테닌:CBP 상호작용의 작은 분자 억제제를 p300 1-111 을 포함하는 부분(moiety)(1) 및 β-카테닌(2)을 포함하는 혼합물에 접촉시키는 단계;

(f) 상기 단계(e)에서의 상기 분자가, 상기 p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및

(g) 상기 단계(e)에서의 상기 작은 분자가, 상기 p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 상기 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는 것을 결정한 것에 의해, 상기 작은 분자가 β-카테닌:CBP 상호작용의 선택적 억제제인 것을 확인하는 단계,

를 더 포함하는 방법.
β-카테닌:CBP 상호작용의 작은 분자 억제제를 식별하는 방법으로서:

(a) 추정의 β-카테닌:CBP 작은 분자 억제제를 CBP 1-111과 연합된(associated) β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)과 접촉시키는 단계;

(b) 상기 단계(a)의 상기 분자가, β-카테닌으로부터 CBP 1-111를 분리시키는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및

(c) 상기 단계(a)의 상기 분자가 CBP 1-111 으로부터 β-카테닌의 결합을 분리시키는 것을 측정법에 의해 결정한 것에 의해, 상기 단계(a)의 작은 분자를 β- 카테닌:CBP 상호작용의 억제제로서 식별하는 단계,

를 포함하는 방법.
제62항에 있어서:

(d) 상기 단계(c)의 식별된 β-카테닌:CBP 상호작용의 작은 분자 억제제를 p300 1-111 을 포함하는 부분(moiety)(1) 및 β-카테닌(2)을 포함하는 혼합물에 접촉시키는 단계;

(e) 상기 단계(d)에서의 상기 분자가, 상기 p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및

(f) 상기 단계(d)에서의 상기 작은 분자가, 상기 p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 상기 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는 것을 결정한 것에 의해, 상기 작은 분자가 β-카테닌:CBP 상호작용의 선택적 억제제인 것을 확인하는 단계,

를 더 포함하는 방법.
β-카테닌:p300 상호작용의 작은 분자 억제제를 식별하는 방법으로서:

(a) 추정의 β-카테닌:CBP 작은 분자 억제제를 p300 1-111을 포함하는 부분과 접촉시키는 단계;

(b) 상기 단계(a)의 혼합물을 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)과 접촉시 키는 단계;

(c) 상기 단계(a)의 상기 분자가, 상기 단계(b)의 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)이 상기 단계(a)의 p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)과 결합하는 것을 억제하는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및

(d) 상기 단계(a)에서의 상기 작은 분자가 상기 p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)과 결합하는 것을 억제하는지의 결정에 의해, 상기 단계(a)의 상기 작은 분자를 β-카테닌:p300 상호작용의 억제제로서 식별하는 단계,

를 포함하는 방법.
제64항에 있어서:

(e) 상기 단계(d)의 식별된 β-카테닌:p300 상호작용의 작은 분자 억제제를 CBP 1-111 을 포함하는 부분(moiety)(1) 및 β-카테닌(2)을 포함하는 혼합물에 접촉시키는 단계;

(f) 상기 단계(e)에서의 상기 분자가, 상기 CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및

(g) 상기 단계(e)에서의 상기 작은 분자가, 상기 CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 상기 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는 것을 결정한 것에 의해, 상기 작은 분자가 β-카테닌:p300 상호작용의 선택적 억제제인 것을 확인하는 단계,

를 더 포함하는 방법.
β-카테닌:p300 상호작용의 작은 분자 억제제를 식별하는 방법으로서:

(a) 추정의 β-카테닌:p300 작은 분자 억제제를 β-카테닌을 포함하는 부분(moiety)으로 접촉시키는 단계;

(b) 상기 단계(a)의 혼합물을 p300 1-111을 포함하는 부분(moiety)과 접촉시키는 단계;

(c) 상기 단계(a)의 상기 분자가, 상기 단계(b)의 p300 1-111을 포함하는 부분이 상기 단계(a)의 β-카테닌을 포함하는 부분과 결합하는 것을 억제하는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및

(d) 상기 단계(a)에서의 상기 작은 분자가 상기 β-카테닌을 포함하는 부분이 p300 1-111을 포함하는 부분과 결합하는 것을 억제하는지의 결정에 의해, 상기 단계(a)의 작은 분자를 β-카테닌:p300 상호작용의 억제제로서 식별하는 단계,

를 포함하는 단계.
제66항에 있어서:

(e) 상기 단계(d)의 식별된 β-카테닌:p300 상호작용의 작은 분자 억제제를 CBP 1-111 을 포함하는 부분(moiety)(1) 및 β-카테닌(2)을 포함하는 혼합물에 접촉시키는 단계;

(f) 상기 단계(e)에서의 상기 분자가, 상기 CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및

(g) 상기 단계(e)에서의 상기 작은 분자가, 상기 CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 상기 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는 것을 결정한 것에 의해, 상기 작은 분자가 β-카테닌:p300 상호작용의 선택적 억제제인 것을 확인하는 단계,

를 더 포함하는 방법.
β-카테닌:p300 상호작용의 작은 분자 억제제를 식별하는 방법으로서:

(a) 추정의 β-카테닌:p300 작은 분자 억제제를 p300 1-111과 연합된(associated) β-카테닌(1)을 포함하는 부분(moiety)과 접촉시키는 단계;

(b) 상기 단계(a)의 상기 분자가 β-카테닌으로부터 p300 1-111를 분리시키는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및

(c) 상기 단계(a)의 상기 작은 분자가 p300 1-111으로부터 β-카테닌의 결합을 분리시키는 것을 측정법에 의해 결정한 것에 의해, 상기 단계(a)의 작은 분자를 β-카테닌:p300 상호작용의 억제제로서 식별하는 단계,

를 포함하는 방법.
제68항에 있어서:

(d) 상기 단계(c)에서 식별된 β-카테닌:p300 상호작용의 작은 분자 억제제를 CBP 1-111 을 포함하는 부분(moiety)(1) 및 β-카테닌(2)을 포함하는 혼합물에 접촉시키는 단계;

(e) 상기 단계(d)에서의 상기 분자가, 상기 CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는지 여부를 측정법에 의해 결정하는 단계; 및

(f) 상기 단계(d)에서의 상기 작은 분자가, 상기 CBP 1-111을 포함하는 부분(moiety)이 상기 β-카테닌과 결합하는 것을 억제하지 않는 것을 결정한 것에 의해, 상기 작은 분자가 β-카테닌:p300 상호작용의 선택적 억제제인 것을 확인하는 단계,

를 더 포함하는 방법.
서열이 전체 길이의 CBP 단백질을 엔코딩하지 않는다는 조건하에서, 서열식별번호:1 또는 서열식별번호:1 과 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 분자.
제70항에 있어서, 상기 핵산 분자는 상기 서열식별번호:1 에 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제70항에 있어서, 상기 핵산 분자는 β-카테닌에 결합하는 펩티드를 엔코딩 하는 것인 핵산 분자.
제70항에 있어서, 상기 핵산 분자가 CBP 단백질 내에 존재하는 연속된 아미노산 잔기 200 개 이하를 포함하는 펩티드를 엔코딩하는 것인 핵산 분자.
제70항에 있어서, 상기 핵산 분자가 CBP 단백질 내에 존재하는 연속된 아미노산 잔기 150 개 이하를 포함하는 펩티드를 엔코딩하는 것인 핵산 분자.
제74항에 있어서, 상기 펩티드가 서열식별번호:2 또는 서열식별번호:5 를 포함하는 것인 핵산 분자.
서열이 전체 길이의 CBP 단백질을 엔코딩하지 않는다는 조건하에서, 서열식별번호:1 의 단편 또는 상기 단편에 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 분자.
제76항에 있어서, 상기 단편이 90-300 핵산을 갖는 것인 핵산 분자.
제76항에 있어서, 상기 핵산 분자가 상기 단편에 90% 이상의 동일성을 갖는 것인 핵산 분자.
제76항에 있어서, 상기 단편이 β-카테닌에 결합하는 펩티드를 엔코딩하는 것인 핵산 분자.
펩티드가 전체 길이의 CBP 단백질이 아니라는 조건하에서, 서열식별번호:2 또는 서열식별번호:2 와 80% 이상의 동일성을 갖는 펩티드를 포함하는, 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드.
제80항에 있어서, 상기 펩티드가 서열식별번호:2 에 90% 이상의 동일성을 갖는 것인 펩티드.
제80항에 있어서, 상기 펩티드가 β-카테닌에 결합하는 것인 펩티드.
제80항에 있어서, 상기 펩티드가 CBP 단백질 내에 존재하는 연속된 아미노산 200 잔기 이하를 포함하는 것인 펩티드.
제80항에 있어서, 상기 펩티드가 CBP 단백질 내에 존재하는 연속된 아미노산 150 잔기 이하를 포함하는 것인 펩티드.
제84항에 있어서, 상기 펩티드가 서열식별번호:2 또는 서열식별번호:4 를 포함하는 것인 펩티드.
펩티드가 전체 길이의 CBP 단백질이 아니라는 조건하에서, 서열식별번호:2 의 단편 또는 상기 단편과 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드.
제86항에 있어서, 상기 단편이 30-100 아미노산을 갖는 것인 펩티드.
제86항에 있어서, 상기 펩티드는 상기 단편에 90% 이상의 동일성을 갖는 것인 펩티드.
제86항에 있어서, 상기 펩티드가 β-카테닌에 결합하는 것인 펩티드.
핵산 분자가 전체 길이의 CBP 단백질을 엔코딩하지 않는다는 조건하에서, 서열식별번호:1 또는 서열식별번호:1 에 80% 이상의 동일성을 갖는 서열로 본질적으로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 분자.
제90항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열식별번호:1 에 90% 이상의 동일성을 갖는 것인 핵산 분자.
제90항에 있어서, 상기 핵산 분자가 β-카테닌에 결합하는 펩티드를 엔코딩 하는 것인 핵산 분자.
서열식별번호:1 의 단편 또는 상기 단편에 80% 이상의 동일성을 갖는 서열로 본질적으로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 분자.
제93항에 있어서, 상기 단편은 90-300 뉴클레오티드를 갖는 것인 핵산 분자.
제93항에 있어서, 상기 핵산 분자가 상기 단편에 90% 이상의 동일성을 갖는 것인 핵산 분자.
제93항에 있어서, 상기 단편이 β-카테닌에 결합하는 펩티드를 엔코딩하는 것인 핵산 분자.
서열식별번호:2 또는 서열식별번호:2 에 80% 이상의 동일성을 갖는 펩티드로 본질적으로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드.
제97항에 있어서, 상기 펩티드가 서열식별번호:2 에 90% 이상의 동일성을 갖는 것인 펩티드.
제97항에 있어서, 상기 펩티드는 β-카테닌에 결합하는 것인 펩티드.
서열식별번호:2 의 단편 또는 상기 단편에 80% 이상의 동일성을 갖는 서열로 본질적으로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드.
제100항에 있어서, 상기 단편은 30-100 아미노산을 갖는 것인 펩티드.
제100항에 있어서, 상기 펩티드는 상기 단편에 90% 이상의 동일성을 갖는 것인 펩티드.
제100항에 있어서, 상기 펩티드는 β-카테닌에 결합하는 것인 펩티드.
서열식별번호:1 또는 서열식별번호:1 에 80% 이상의 동일성을 갖는 서열로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 분자.
제104항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열식별번호:1에 90% 이상의 동일성을 갖는 것인 핵산 분자.
제104항에 있어서, 상기 핵산 분자가 β-카테닌에 결합하는 펩티드를 엔코딩하는 것인 핵산 분자.
서열식별번호:1 의 단편 또는 상기 단편에 80% 이상의 동일성을 갖는 서열로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 분자.
제107항에 있어서, 상기 단편은 90-300 뉴클레오티드를 갖는 것인 핵산 분자.
제107항에 있어서, 상기 핵산 분자가 상기 단편에 90% 이상의 동일성을 갖는 것인 핵산 분자.
제107항에 있어서, 상기 단편이 β-카테닌에 결합하는 펩티드를 엔코딩하는 핵산 분자.
서열식별번호:2 또는 서열식별번호:2 에 80% 이상의 동일성을 갖는 펩티드로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드.
제111항에 있어서, 상기 펩티드는 서열식별번호:2 에 90% 이상의 동일성을 갖는 것인 펩티드.
제111항에 있어서, 상기 펩티드는 β-카테닌에 결합하는 것인 펩티드.
서열식별번호:2 의 단편 또는 상기 단편에 80% 이상의 동일성을 갖는 서열로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드.
제114항에 있어서, 상기 단편은 30-100 아미노산을 갖는 것인 펩티드.
제114항에 있어서, 상기 펩티드는 상기 단편에 90% 이상의 동일성을 갖는 것인 펩티드.
제114항에 있어서, 상기 펩티드는 β-카테닌에 결합하는 것인 펩티드.
서열이 전체 길이의 p300 단백질을 엔코딩하지 않는다는 조건하에서, 서열식별번호:3 또는 서열식별번호:3 과 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 분자.
제118항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열식별번호:3 에 90% 이상의 동일성을 갖는 것인 핵산 분자.
제118항에 있어서, 상기 핵산 분자가 β-카테닌에 결합하는 펩티드를 엔코딩하는 핵산 분자.
제118항에 있어서, 상기 핵산 분자가 p300 단백질 내에 존재하는 연속된 아미노산 200 잔기 이하를 포함하는 펩티드를 엔코딩하는 것인 핵산 분자.
제118항에 있어서, 상기 핵산 분자가 p300 단백질 내에 존재하는 연속된 아미노산 150 잔기 이하를 포함하는 펩티드를 엔코딩하는 것인 핵산 분자.
제122항에 있어서, 상기 펩티드가 서열식별번호:4 를 포함하는 것인 핵산 분자.
서열이 전체 길이의 p300 단백질을 엔코딩하지 않는다는 조건하에서, 서열식별번호:3 의 단편 또는 상기 단편과 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 분자.
제124항에 있어서, 상기 단편은 90 - 300 뉴클레오티드를 갖는 것인 핵산 분자.
제124항에 있어서, 상기 핵산 분자는 상기 단편에 90% 이상의 동일성을 갖는 것인 핵산 분자.
제124항에 있어서, 상기 단편은 β-카테닌에 결합하는 펩티드를 엔코딩하는 것인 핵산 분자.
펩티드가 전체 길이의 p300 단백질이 아니라는 조건하에서, 서열식별번호:4 또는 서열식별번호:4 와 80% 이상의 동일성을 갖는 펩티드를 포함하는, 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드.
제128항에 있어서, 상기 펩티드가 서열식별번호:4에 90% 이상의 동일성을 갖는 펩티드.
제128항에 있어서, 상기 펩티드가 β-카테닌에 결합하는 것인 펩티드.
제128항에 있어서, 상기 펩티드가 p300 단백질 내에 존재하는 연속된 아미노산 200 잔기 이하를 포함하는 것인 펩티드.
제128항에 있어서, 상기 펩티드가 p300 단백질 내에 존재하는 연속된 아미노산 150 잔기 이하를 포함하는 것인 펩티드.
제132항에 있어서, 상기 펩티드가 서열식별번호:4 를 포함하는 것인 펩티드.
펩티드가 전체 길이의 p300 단백질이 아니라는 조건하에서, 서열식별번호:4 의 단편 또는 상기 단편과 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드.
제134항에 있어서, 상기 단편이 30-100 아미노산을 갖는 것인 펩티드.
제134항에 있어서, 상기 펩티드가 상기 단편에 90% 이상의 동일성을 갖는 것인 펩티드.
제134항에 있어서, 상기 펩티드가 β-카테닌에 결합하는 것인 펩티드.
서열식별번호:3 또는 서열식별번호:3 에 80% 이상의 동일성을 갖는 서열로 본질적으로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 분자.
제138항에 있어서, 상기 핵산 분자가 서열식별번호:3 에 90% 이상의 동일성을 갖는 것인 핵산 분자.
제138항에 있어서, 상기 핵산 분자가 β-카테닌에 결합하는 펩티드를 엔코딩하는 것인 핵산 분자.
서열식별번호:3 의 단편 또는 상기 단편에 80% 이상의 동일성을 갖는 서열로 본질적으로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 분자.
제141항에 있어서, 상기 단편이 90-300 뉴클레오티드를 갖는 것인 핵산 분자.
제141항에 있어서, 상기 핵산 분자가 상기 단편에 90% 이상의 동일성을 갖는 것인 핵산 분자.
제141항에 있어서, 상기 단편이 β-카테닌에 결합하는 펩티드를 엔코딩하는 것인 핵산 분자.
서열식별번호:4 또는 서열식별번호:4 에 80% 이상의 동일성을 갖는 펩티드로 본질적으로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드.
제145항에 있어서, 상기 펩티드는 서열식별번호:4에 90% 이상의 동일성을 갖는 펩티드.
제145항에 있어서, 상기 펩티드가 β-카테닌에 결합하는 것인 펩티드.
서열식별번호:4 의 단편 또는 상기 단편에 80% 이상의 동일성을 갖는 서열로 본질적으로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드.
제148항에 있어서, 상기 단편은 30-100 아미노산을 갖는 것인 펩티드.
제148항에 있어서, 상기 펩티드는 상기 단편에 90% 이상의 동일성을 갖는 것인 펩티드.
제148항에 있어서, 상기 펩티드는 β-카테닌에 결합하는 것인 펩티드.
서열식별번호:3 또는 서열식별번호:3 에 80% 이상의 동일성을 갖는 서열로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 분자.
제152항에 있어서, 상기 핵산 분자가 서열식별번호:3 에 90% 이상의 동일성을 갖는 것인 핵산 분자.
제152항에 있어서, 상기 핵산 분자가 β-카테닌에 결합하는 펩티드를 엔코딩하는 것인 핵산 분자.
서열식별번호:3 의 단편 또는 상기 단편에 80% 이상의 동일성을 갖는 서열로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 핵산 분자.
제155항에 있어서, 상기 단편이 90-300 뉴클레오티드를 갖는 것인 핵산 분자.
제155항에 있어서, 상기 핵산 분자가 상기 단편에 90% 이상의 동일성을 갖는 것인 핵산 분자.
제155항에 있어서, 상기 단편이 β-카테닌에 결합하는 펩티드를 엔코딩하는 것인 핵산 분자.
서열식별번호:4 또는 서열식별번호:4 에 80% 이상의 동일성을 갖는 펩티드로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드.
제159항에 있어서, 상기 펩티드가 서열식별번호:4 에 90% 이상의 동일성을 갖는 펩티드.
제159항에 있어서, 상기 펩티드가 β-카테닌에 결합하는 것인 펩티드.
서열식별번호:4 의 단편 또는 상기 단편에 80% 이상의 동일성을 갖는 서열로 구성되는, 실질적으로 정제되고 분리된 펩티드.
제162항에 있어서, 상기 단편은 30-100 아미노산을 갖는 것인 펩티드.
제162항에 있어서, 상기 펩티드는 상기 단편에 90% 이상의 동일성을 갖는 것인 펩티드.
제162항에 있어서, 상기 펩티드는 β-카테닌에 결합하는 것인 펩티드.