KR20070008637A - 리버스-턴 유사체 및 이와 관련된 방법 - Google Patents

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Abstract

생물학적으로 활성을 갖는 펩티드 및 단백질의 리버스-턴 부위의 2차 구조와 유사한, 입체 구조가 제한된 화합물이 기술되었다. 그러한 리버스-턴 유사체는 진단 및 예방제로서의 사용을 포함하여 광범위한 분야에서 유용성이 있다. 본 발명의 리버스-턴 유사체를 포함하는 라이브러리가 또한 기술되었고, 생물학적으로 활성을 갖는 구성원들을 식별하기 위한 그 라이브러리를 스크린닝하는 방법 또한 기술되었다. 본 발명은 또한 그러한 화합물들을 Wnt-신호 경로에 의해 조절되는 질환, 즉 암과 같은, 특히 직장결장암, 혈관성형술(angioplasty)과 관련된 재협착(restenosis),다낭신질환, 비정상 혈관생성증, 류마티스 관절염, 결절경화증후군, 헤어(hair) 성장, 궤양성 대장염을 억제 또는 치료에의 용도에 관한 것이다.
리버스-턴 유사체, Wnt-신호 경로, 암

Description

리버스-턴 유사체 및 이와 관련된 방법{Reverse-turn mimetics and method relating thereto}
본 발명은 리버스-턴 유사체와 이와 관련된 화학 라이브러리(chemical library)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 의학적 증상, 예를 들어 암질환의 치료에의 응용 및 상기 유사체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 출원은 2004년 4월 16일 출원된 미국 출원 번호 10/826,972의 부분 계속 출원이며, 상기 미국 출원은 2004년 3월 17일 출원된 미국 출원 번호 10/803,179의 부분 계속 출원이고, 그 미국 출원은 2003년 4월 9일 출원된 미국 출원 번호 10.411,877의 부분 계속 출원(현재 포기됨)이고, 그것은 2002년 3월 1일 출원된 미국 출원 번호 10/087,443의 부분 계속 출원(현재 포기됨)이고, 그것은 2001년 10월 12일에 출원된 미국 출원 번호 09/976,470의 부분 계속 출원이다. 본 출원은 2002년 10월 11일에 출원된 PCT 출원 번호 PCT/KR02/01901에 또한 우선권을 주장한다. 이들 출원에 개시된 것들은 그 전체가 인용에 의해 여기에 삽입된다.
치료제로서 가능한 활성을 위한 분자의 무작위 스크리닝은 다년간 수행되어 왔고 그 결과로 수많은 중요한 약들이 발견되었다. 분자생물학과 전산화학의 발전으로 인해 "합리적인 약의 설계(rational drug design)"이라 명명되었던 분야에 대 한 관심이 증가 되었지만, 이러한 기술은 처음에 예상했던 것만큼 빠르거나 신뢰할 수 있다고 입증되지 못했다. 따라서 최근에는 무작위 약물 스크리닝에 관심이 재개되었고 이로 복귀하고 있다. 이를 위하여 조합화학(combinational chemistry)의 라이브러리들의 개발을 기초로 하는 새로운 기술 분야와 생물학적 활성 구성원(member)을 조사하기 위한 상기 라이브러리 스크리닝(screening)분야에서 특별한 진전이 이루어져 왔다.
일반적으로, 조합화학의 라이브러리들은 단순히 분자들의 집합체이다. 이러한 라이브러리들은 라이브러리 내의 화학적 종(species)에 의해서뿐 만 아니라, 라이브러리의 구성원(members)들을 발생시키거나 어느 구성원이 관심 있는 생물학적 표적과 상호 반응하는지를 동정(identify)하기 위해 사용하는 방법에 의해 다양해진다. 이 분야는 매우 초기 단계이지만, 라이브러리를 발생시키고 이를 스크리닝 하는 방법은 이미 상당히 다양하고 복잡해졌다. 예를 들면, 다양한 조합화학의 라이브러리의 최근의 논문들에서는 표지되거나 표지되지 않은 라이브러리의 구성원 모두의 사용을 포함하여 (참조: Janda, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91:10779-10785, 1994), 수많은 기술을 밝히고 있다 (참조: Dolle, J. Com. Chem ., 2(3): 383-433, 2000).
처음에는, 조합 화학 라이브러리는 펩티드 또는 뉴클레오티드 기원의 구성원들에 제한되었다. 이 목적을 위해, Houghten 등 에 의한 기법이 용해성 조합 펩티드 라이브러리를 분할 합성 기법 (Nature(London) 354:84-86, 1991; Biotechniques 13:412-421, 1992; Bioorg. Med . Chem . Lett . 3:405-412, 1993) 을 통해 어셈블 (assemble)하기 위한 "이중으로 정의된 반복" 이라고 불리는 방법의 예를 보여준다. 이 기법에 의해, 수십억의 구성원들을 포함하는 용해성 펩티드 라이브러리들을 얻을 수 있었다. 그러한 라이브러리들은 메티오닌- 및 루신(leucine)-엔케팔린과 같은 오피오이드 펩티드들을 식별하는데 효과적이라는 것이 밝혀졌고 (Dooley 및 Houghten, Life Sci . 52, 1509-1517, 1993), N-아실화 펩티드 라이브러리가 강력한 오피오이드 길항제인 아세탈린들을 동정하는데 사용되어 왔다 (Dooley 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:10811-10815, 1993). 최근에는, 모든 D-아미노산 오피오이드 펩티드 라이브러리가 구성되어 뮤 ("μ") 오피오이드 수용체에 대한 진통 활성(analgesic activity)를 스크린닝하였다 (Dooley 등, Science 266:2019-2022, 1994).
펩티드와 뉴클레오티드 기원의 구성원을 포함하는 조합 라이브러리들이 매우 중요한 의미를 갖지만, 여전히 다른 기원의 구성원을 포함하는 라이브러리의 필요성이 존재한다. 예를 들면 전통적인 펩티드 라이브러리 대부분은 라이브러리 구성원을 발생시키기 위해 단지 아미노산 서열을 다양하게 한 것뿐이다. 펩티드의 2차 구조가 생물학적 활성에 중요하다는 것은 인지되고 있지만, 이러한 펩티드 라이브러리는 라이브러리 구성원들에게 제한된 2차 구조를 부여하지 못한다.
이를 위하여, 일부 연구자들은 더 제한된 이차구조를 제공하기 위하여 이황가교(disulfide bridge)를 갖는 펩티드를 고리화시켰다 (Tumelty 등, J. Chem . Soc. 1067-68, 1994; Eichler 등, Peptide Res. 7:300-306, 1994). 그렇지만 이러한 고리화된 펩티드(cyclized peptide)는 일반적으로 매우 가변적이고 생체 이용률 이 매우 낮다. 따라서 제한적으로만 성공하였다.
더욱 최근에는, 생물학적으로 활성이 있는 단백질이나 펩티드에서 발견되는 리버스-턴의 2차 구조와 더 유사한 비-펩티드 화합물이 개발되었다. 예를 들면, 칸(Kahn)의 미국특허 5,440,013호 및 칸(Kahn)의 공개된 PCT출원 WO 94/03494, WO 01/00210A1 및 WO 01/16135A2 각각에는 리버스-턴의 3차 구조를 모방한, 입체 형태가 제한된 비-펩티드 화합물이 기술되어 있다. 그 외에, 칸(Kahn)의 미국특허 5,929,237호 및 그것의 일부계속(CIP) 미국특허 6,013,458호에는 생물학적으로 활성인 펩티드 및 단백질의 리버스-턴 영역의 2차 구조를 모방한 입체 형태가 제한된 화합물이 기술되어 있다. 입체 형태가 제한된, 리버스-턴 유사체의 합성 및 동정, 그리고 그들의 질병에의 적용은 오브레흐트(Obrecht)에 의해서도 잘 리뷰되었다 (Advances in Med. Chem., 4, 1-68, 1999).
입체 형태가 제한된 리버스-턴 유사체의 합성 및 동정 기술에 있어 상당한 진보가 있었지만, 펩티드의 2차 구조를 모방한 작은 분자에 대한 개발의 필요성은 당해분야에 여전히 존재하고 있다. 또한 당해 분야에서 이러한 구성원을 포함하는 라이브러리 뿐만 아니라 관심 있는 표적, 특히 생물학적 표적에 대한 라이브러리 구성원을 합성하고 스크리닝 하여 생활성 라이브러리 구성원을 동정하는 기술이 요구되고 있다.
본 발명은 또한 이러한 필요성을 충족하고, 생물학적으로 활성이 있는 펩티드 및 단백질의 리버스-턴 영역의 2차 구조를 모방한 입체형태가 제한된 화합물을 제공함으로써 이와 관련된 추가의 이점을 제공한다.
Wnt-신호 경로(Wnt signaling pathway)는 세포성장, 종양발생, 및 발달을 포함한 다양한 과정을 조절한다 (Moon 등, 1997, Trends Genet. 13, 157-162; Miller 등, 1999, Oncogene 18, 7860-7872; Nusse 및 Varmus, 1992, Cell 69, 1073-1087; Cadigan 및 Nusse, 1997, Genes Dev. 11, 3286-3305; Peifer 및 Polakis, 2000 Science 287, 1606-1609; Polakis 2000, Genes Dev. 14, 1837-1851). Wnt 신호 경로는 여러 생물체에서 연구되었다. Wnt-신호 전달이 TCF4/ß-카테닌에 의해 매개되는 전사를 활성화시키는 것은 그것의 생물학적 기능에 중요한 역할을 하는 것이 밝혀졌다 (Molenaar 등, 1996, Cell 86:391-399; Gat 등, 1998 Cell 95:605-614; Orford 등, 1999 J. Cell. Biol. 146:855-868; Bienz 및 Clevers, 2000, Cell 103:311-20).
Wnt 신호가 없는 경우, 선종성 결장 폴립증(adenomatous polyposis coli, APC)의 종양 억제 유전자는 동시에 세린 키나아제 글리코겐 합성효소 키나아제 (GSK)-3ß 및 ß-카테닌과 상호 작용한다 (Su 등, 1993, Science 262, 1734-1737: Yost 등, 1996 Genes Dev. 10, 1443-1454: Hayashi 등, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 242-247: Sakanaka 등, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 3020-3023: Sakanaka 및 William, 1999, J. Biol. Chem 274, 14090-14093). GSK-3ß에 의한 APC의 인산화는 APC 가 ß-카테닌과 상호작용하는 것을 조절하고, 이것은 다시 ß-카테닌의 신호전달 기능 (signaling function)을 조절할 수 있다. (B. Rubinfeld 등, Science 272, 1023, 1996). Wnt 신호 전달은 ß-카테닌을 안정화시켜 전사 인자들의 패밀리 림프계 증강 인자(lymphoid enhancer factor) (LEF1)/T- 세포인자 (TCF4)의 구성원들과 상호 작용하는 장소인 핵으로의 전위를 가능하게 한다 (Behrens 등, 1996 Nature 382, 638-642: Hsu 등, 1998, Mol. Cell. Biol. 18, 4807-4818: Roose 등, 1999 Science 285, 1923-1926).
최근에는 공지된 종양 유전자인 시-믹(c-myc)이 ß-카테닌/TCF4-매개의 전사에 대하여 표적 유전자가 되는 것으로 밝혀졌다 (He 등, 1998 Science 281 1509-1512: Kolligs 등, 1999 Mol. Cell. Biol. 19, 5696-5706). 종양발생과 관련된 사이클린 D1(cyclin D1), 금속단백 분해효소(metalloproteinase)를 포함한 많은 다른 중요한 유전자들이 TCF4/ß-카테닌 전사경로에 의해서 조절되는 것으로 밝혀졌다 (Crawford 등, 1999, Oncegene 18, 2883-2891: Shtutman 등, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 11, 5522-5527: Tetsu 및 McCormick, 1999, Nature, 398, 422-426).
더욱이, Wnt 신호의 여러 하류 매개체의 과다한 발현은 세포소멸을 조절하는 것으로 밝혀졌다 (Moris 등, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 7950-7954: He 등, 1999, Cell 99, 335-345: Orford 등, 1999 J. Cell Biol., 146, 855-868: Strovel 및 Sussman, 1999, Exp. Cell. Res., 253, 637-648). 사람의 결장직장암 (colorectal cancers) 세포에서의 APC의 과도한 발현은 세포소멸을 유도한다 (Moris 등, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93, 7950-7954). ß-카테닌의 이소(딴곳) 발현은 세포밖의 기질에 부착의 손실과 관련된 세포소멸을 억제한다 (Orford 등, 1999, J. Cell Biol. 146, 855-868). TCF4의 우성-음성 돌연변이체의 발현에 의한 TCF4/ß-카테닌 전사의 억제는 Wnt-1-매개의 세포 생존을 차단하였고 세포를 항암제제와 같은 세포 소멸 자극에 민감해지게 했다 (Shaoqiong Chen 등, 2001, J. Cell. Biol., 152, 1, 87-96). 그리고 APC 돌연변이는 잘 알려진 항-세포소멸 단백질인, 구성적 설비빈(survivin) 발현을 억제한다 (Tao Zhang 등, 2001, Cancer Research, 62, 8664-8667).
Wnt 유전자에서의 돌연변이는 인체의 암에서는 발견되지 않았지만, 결장직장 종양의 대부분의 경우에서와 같이 APC나 ß-카테닌의 돌연변이는 부적절한 TCF4의 활성, 시-믹(c-myc)의 과다한 발현 및 종양 성장을 야기시킨다 (Bubinfeld 등, 1997, Science, 275, 1790-1792: Morin 등, 1997, Science, 275, 1787-1790: Casa 등, 1999, Cell. Growth. Differ. 10, 369-376). 종양 억제 유전자(APC)는 85%의 결장직장암과 여러 다른 암에서 또한 소실되거나 불활성화 된다 (Kinzler 및 Vogelstein, 1996, Cell 87, 159-170). APC의 주된 역할은 Wnt 신호 전달의 연쇄 단계의 음성 조절자라는 점이다. 본 경로의 핵심 사항은 APC를 포함하는 커다란 악신계(Axin-based) 복합체와의 상호작용에 의한 ß-카테닌의 세포질 풀의 안정성의 조절 및 국소화(localization)를 포함한다. 이러한 상호작용은 ß-카테닌을 인산화하고, 그렇게 하여 분해의 표적이 되게 한다.
CREB 결합 단백질(CBP)/p300은 단백질 상호작용 측정법으로 처음으로 확인되었다. 즉 먼저 전사요소 CREB과의 관련에 의해 (Chrivia 등, 1993, Nature, 365, 855-859) 또한 나중에 그것의 아데노바이러스 전환(adenoviral-transforming) 단백질 E1A와의 상호반응에 의해 확인되었다 (Stein 등, 1990, J. Viol., 64, 4421-4427: Eckner 등, 1994, Genes. Dev., 8, 869-884). CBP는 전사 공동활성 기능 (transcriptional coactivator function)을 포함하는 다양한 세포 기능에 참여할 수 있는 가능성이 있다 (Shikama 등, 1997, Trends. Cell. Biol., 7, 230-236: Janknecht 및 Hunter, 1996, Nature, 383, 22-23). CBP/p300은 알려진 Wnt 표적인 시아모이스(siamois) 프로모터의 ß-카테닌 매개의 활성을 가능하게 한다 (Hecht 등, 2000, EMBO J. 19, 8, 1839-1850). ß-카테닌은 CBP의 CREB-결합 영역과 직접적으로 상호작용하고, ß-카테닌은 CBP 와 상승작용하여 TCF4/ß-카테닌의 전사 활성을 자극한다 (Ken-Ichi Takemaru 및 Randall T. Moon, 2000, J. Cell. Biol., 149, 2, 249, 254).
이러한 배경으로부터, Wnt 경로의 TCF4/ß-카테닌과 CBP 복합체는 세포성장, 종양형성, 세포의 소멸 등의 조절을 위한 표적 분자들로서 작용할 수 있다. 따라서 본 발명은 CBP의 억제의 의한 TCF4/ß-카테닌의 전사 경로를 차단하는 화합물의 필요성을 밝힌다. 그리고 그 결과 암의 치료 특히 결장직장암의 치료에 사용할 수 있다.
간략하게, 본 발명은 생물학적 활성 펩티드와 단백질의 리버스-턴 영역의 2차 구조를 모방한 새로운 타입의 입체형태로 제한된 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 화합물을 포함하는 라이브러리 및 그의 합성과 스크리닝을 기술하고 있다.
본 발명의 화합물은 다음 일반식(I) 을 갖는 화합물 또는 그 이성질체이다:
Figure 112006074580183-PCT00001
상기 식에서,
A는 -(CHR3)- 또는 -(C=O)-, B는 -(CHR4)- 또는 -(C=O)-이고, D는 -(CHR5)- 또는 -(C=O)-, E는 -(ZR6)- 또는 -(C=O)-, G는 -(XR7)n-, -(CHR7)-(NR8)-, -(C=O)-(XR9)-, 또는 -(C=O)-이고, W는 -Y(C=O)-, -(C=O)NH-, -(SO2)-, 또는 부존재하고, Y는 산소, 황, 또는 -NH-이고, X 및 Z는 독립적으로 질소 또는 CH이고, n=0 또는 1; 그리고 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 및 R9는 동일하거나 상이하고 아미노산 측쇄 부분(moiety) 또는 그의 유도체, 및 분자의 잔여부분으로부터 독립적으로 선택된다.
A가 -(CHR3)-이고, B가 -(C=O)-이고, D가 -(CHR5)-이고, E가 -(C=O)-이고, 또한 G가 -(XR7)n-인 하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 다음 일반식 (II)를 갖는다:
Figure 112006074580183-PCT00002
상기 식에서, W, X, Y 및 n는 상기 정의한 바와 같으며, 또한 R1, R2, R3, R5 및 R7은 다음의 상세한 설명에서 정의된 바와 같다.
A가 -(C=O)-이고, B가 -(CHR4)-이고, D가 -(C=O)-이고, E가 -(ZR6)-이고, 또한 G가 -(C=O)-(XR9)-인 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 다음 일반식 (III)를 갖는다:
Figure 112006074580183-PCT00003
상기 식에서, W, X 및 Y는 상기 정의한 바와 같으며, Z는 질소 또는 CH (단 Z가 CH일 때 X는 질소이다)이며, 또한 R1, R2, R4, R6 및 R9는 다음의 상세한 설명에서 정의된 바와 같다.
A가 -(C=O)-이고, B가 -(CHR4)-이고, D가 -(C=O)-이고, E가 -(ZR6)-이고, 또한 G가 (XR7)n-인 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 다음 일반식 (IV)를 갖는다:
Figure 112006074580183-PCT00004
상기 식에서, W, Y 및 n은 상기 정의한 바와 같으며, Z는 질소 또는 CH (단 Z가 질소일 때 n은 0이며, 또한 Z가 CH일 때 X는 질소이고 n은 0이 아니다)이며, 또한 R1, R2, R4, R6 및 R7은 다음의 상세한 설명에서 정의된 바와 같다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 하기 일반식 (VI)를 갖는다:
Figure 112006074580183-PCT00005
(VI)
상기 식중, Ra는 페닐기; 하나 이상의 치환체를 갖는 치환된 페닐기(이때, 하나이상의 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 및 하이드록실기 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다); 벤질기; 하나 이상의 치환체를 갖는 치환된 벤질기(이때, 하나 이상의 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 및 하이드록실기 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다); 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 1 내지 3개 헤테로원자를 가질 수 있는 8 내지 11 환 구성원을 갖는 바이사이클릭(bicyclic) 아릴기이다; Rb 는 5 내지 7 환 구성원을 갖는 모노사이클릭 아릴기로, 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 1 내지 2개 헤테로원자를 가질 수 있으며 또한 화합물 중의 아릴 환이 할로겐화물(halide), 히드록시, 시아노, 저급 알킬, 및 저급 알콕시기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환체를 가질 수 있다; Rc는 포화 또는 불포화 C1 - 6알킬, C1 - 6알콕시, 퍼플루오로C1-6알킬기이며; 그리고 X1, X2, 및 X3은 동일 또는 상이하며 또한 수소, 하이드록실, 및 할로겐화물로부터 독립적으로 선택된다.
본 발명은 또한 식 (I)의 하나 이상의 화합물을 포함하는 라이브러리를 사용하는 프로드러그(prodrug)에 관한 것이다 프로드러그란 효소적 및/또는 화학적 가수분해에 의해 흡수 도중 또는 후에 체내에 활성 약물을 방출하기 위해 설계된 것이다. 프로드러그 접근법은 물에 용해성이 더 높은 화합물로 화학적 유도체화함으로써 물에의 용해성이 낮은 약물의 경구 생이용성 또는 정맥(i.v.) 투여를 향상시키는 효과적인 수단이다. 하이드록실기를 갖는 약물의 수용성을 증가시키기 위해 가장 흔히 사용되는 프로드러그 접근법은 이온화가능한 기, 예를 들면, 인산기, 카르복실레이트기, 알킬아미노기를 포함하는 에스테르를 생산하는 것이다 (Fleisher 등, Advanced Drug Delivery Reviews, 115-130, 1996; Davis 등, Cancer Res., 7247-7253, 2002, Golik 등, Bioorg . Med . Chem . Lett ., 1837-1842, 1996).
특정 실시태양에서, 본 발명의 프로드러그는 하기 일반식 (VII)를 갖는다:
(VI)-Y-R10
여기서, (VI)는 상기 기술된 바와 같은 일반식 (VI)이고; Y는 Ra, Rb, Rc, X1, X2 및 X3로부터 선택되는 기의 산소, 황, 또는 질소이고; R10은 인산염, 헤미숙시네이트, 헤미말레이트, 포스포릴옥시메틸옥시카르보닐, 디메틸아미노아세테이트, 디메틸아미노알킬카르바메이트, 하이드록시알킬, 아미노산, 글로코실, 치환된 또는 치환되지않은 피페리딘 옥시카르보닐, 또는 그들의 염이고; 상기 프로드로그는 포스포테이즈 또는 카르복실레이즈의 기질로서 작용할 수 있고 그럼으로써 일반식 (VI)를 갖는 화합물로 전환될 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 일반식 (VII)의 R10은 아미노산기 또는 포스포-아미노산기가 아니다.
본 발명은 또한 상기 일반식(I)의 화합물을 포함하는 라이브러리 뿐만 아니라 이러한 라이브러리의 합성방법, 및 생물학적으로 활성인 화합물을 동정하기 위해 상기 라이브러리를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 약제학적으로 허용되는 운반체 또는 희석제와 결합된, 본 발명의 화합물을 함유하는 조성물도 또한 기술되어 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 일반식(I) 화합물을 함유하는 라이브러리를 사용하여 생물학적으로 활성인 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다. 관련된 태양에서, 본 발명은 (a) 제 1 공동활성자 및 상호작용하는 단백질을 함유하며, 이때 상기 제1 공동활성자가 LXXLL, LXXLI 또는 FXXFF (여기서 X는 임의의 아미노산임)의 결합 모티프를 함유하는 조성물을 제공하며; (b) 제1 공동활성자 및 상호작용하는 단백질을 시험 화합물과 결합시키며; 또한 (c) 일반식(I)을 갖는 화합물의 존재 하에 제1 공동활성자 및 상호반응 단백질 사이의 결합의 변형을 탐지하는 것을 포함하는, 결합분석을 수행하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 Wnt-신호 경로와 관련된 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 화합물 또는 조성물을 사용하여 치료 또는 예방할 수 있는 장애는 종양 또는 암 (예, KSHV-관련 종양), 혈관 성형술 관련 재발협착증, 다낭성 신장질환, 이상 혈관형성 질환, 류머티스성 관절염, 궤양성 대장염, 결절성 경화 합병증, 탈모 및 알쯔하이머 질환을 포함한다. 이러한 방법은 목적한 결과를 얻는데 유효한 양으로 본 발명의 화합물 또는 조성물을 대상에게 투여함을 포함한다.
관련된 태양에서, 본 발명은 추가로 신경돌기 생장, 신경줄기 세포의 분화, 및 암세포의 세포소멸을 촉진하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 본 발명의 화합물 또는 조성물을 원하는 결과를 얻는데 유효한 량으로 적절한 세포에 투여함을 포함한다.
본 발명의 이들 및 다른 양상들은 첨부된 도면과 다음의 발명의 상세한 설명을 참고하면 더욱 분명해 질 것이다. 이를 위하여 여기서 다양한 참고문헌이 나열될 것이다. 이것은 특정 과정, 화합물들 및/또는 조성물들에 대해서 상술하고 있다. 그리고 그들 전체가 인용에 의해 포함된다.
본발명의 상세한 설명
본 발명은 생물학적 펩티드와 단백질의 리버스-턴 영역의 2차 구조를 모방한 입체 형태가 제한된 화합물 (또한 이하에서는 '리버스-턴 유사체'라고 지칭한다)과 이것과 관련된 화학 라이브러리에 관한 것이다.
본 발명의 리버스-턴 유사체 구조물은 진단제, 예방제 및/또는 치료제로서의 사용을 포함하여 (그러나 이로 제한되지 않음), 생활성제로 유용하다. 본 발명의 리버스-턴 유사체 라이브러리는 이러한 용도를 갖는 활성제의 동정에 유용하다. 본 발명의 실시에서, 라이브러리는 수십 개 내지 수백 수천 개 (또는 그 이상)의 개별적인 리버스-턴 구조들을 포함한다. (또한 이하에서는 "구성원들(members)"이라고 지칭한다).
본 발명의 한 가지 태양에서는 다음 일반식(I) 또는 그 이성질체의 리버스-턴 유사체 구조가 기술된다.
Figure 112006074580183-PCT00006
상기 식에서, A는 -(CHR3)- 또는 -(C=O)-이고, B는 -(CHR4)- 또는 -(C=O)-이고, D는 -(CHR5)- 또는 -(C=O)-이고, E는 -(ZR6)- 또는 -(C=O)-이고, G는 -(XR7)n-, -(CHR7)-(NR8)-, -(C=O)-(XR9)-, 또는 -(C=O)-이고, W는 -Y(C=O)-, -(C=O)NH-, -(SO2)-, 또는 부존재하고, Y는 산소, 황, 또는 -NH-이고, X 및 Z는 독립적으로 질소 또는 CH이고, n=0 또는 1; 그리고 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 및 R9는 동일하거나 상이하고 아미노산 측쇄부분 또는 그의 유도체, 및 분자의 잔여부분으로부터 독립적으로 선택된다.
하나의 실시태양에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 및 R9는 아미노C2 - 5알킬, 구아니딘C2-5알킬, C1 - 4알킬구아니디노C2 - 5알킬, 디C1 - 4알킬구아니디노C2 - 5알킬, 아미디노C2-5알킬, C1 - 4알킬아미디노C2 - 5알킬, 디C1 - 4알킬아미디노C2 - 5알킬, C1 - 3알콕시, 페닐, 치환된 페닐 (여기서 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 벤질, 치환된 벤질 (여기서 벤질 상의 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 나프틸, 치환된 나프틸 (여기서 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 비스-페닐 메틸, 치환된 비스-페닐 메틸 (여기서 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 피리딜, 치환된 피리딜, (여기서 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 피리딜C1 - 4알킬, 치환된 피리딜C1 - 4알킬 (여기서 피리딘 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1-4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 피리미딜C1 - 4알킬, 치환된 피리미딜C1 - 4알킬 (여기서 피리미딘 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 트리아진-2-일-C1-4알킬, 치환된 트리아진-2-일-C1 - 4알킬 (여기서 트리아진 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 이미다졸C1 - 4알킬, 치환된 이미다졸 C1 - 4알킬 (여기서 이미다졸 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1-4알킬, C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 이미다졸리닐C1 - 4알킬, N-아미디노피페라지닐-N-C0-4알킬, 하이드록시C2 - 5알킬, C1 - 5알킬아미노C2 - 5알킬, 하이드록시C2 - 5알킬, C1 - 5알킬아미노C2 - 5알킬, C1 - 5디알킬아미노C2 - 5알킬, N-아미디노피페리디닐C1 - 4알킬 및 4-아미노사이클로헥실C0 - 2알킬로부터 독립적으로 선택된다.
하나의 실시 태양에서, E의 R1, R2, R6 그리고 G의 R7, R8 및 R9는 동일하거나 상이하며 화합물의 잔여부분을 나타낸다. 그리고 A의 R3, B의 R4, 또는 D의 R5는 아미노산 측쇄 부분 또는 이의 유도체로부터 선택된다. 본 명세서에서 사용되는 "화합물의 잔여부분"은 R1, R2, R5, R6, R7, R8 및/또는 R9 위치에서 리버스-턴 유사체 구조에 공유적으로 부착된 임의의 부분(moiety), 제제, 화합물, 지지체, 분자, 링커(linker), 아미노산, 펩티드 또는 단백질을 의미한다. 이 용어는 또한 아미노산 측쇄 부분와 이의 유도체를 포함한다.
또 하나의 실시태양에서, A의 R3, D의 R5, E의 R6 및 G의 R7, R8 및 R9는 동일하거나 상이하며 화합물의 잔여부분을 나타내며, B의 R1, R2 및 R4중의 하나 이상 또한 하나의 태양에서 이들 모두는 아미노산 측쇄를 나타낸다. 이 경우에 용어 "화합물의 잔기"는 R3, R5, R6, R7, R8 및/또는 R9 위치에서 리버스-턴 유사체 구조에 공유적으로 부착된 임의의 잔기, 제제, 화합물, 지지체, 분자, 링커(linker), 아미노산, 펩티드 또는 단백질을 의미한다. 이 용어는 또한 아미노산 측쇄 부분와 이의 유도체를 포함한다.
여기서 사용되는 용어 "화합물의 잔여부분"은 리버스-턴 유사체 구조에 공유적으로 부착된 임의의 잔기, 제제, 화합물, 지지체, 분자, 링커(linker), 아미노산, 펩티드 또는 단백질을 의미한다. 이 용어는 또한 아미노산 측쇄 부분 및 그것의 유도체를 포함한다. 본 발명의 한 태양에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 및/또는 R9의 하나 이상은 화합물의 잔여부분을 나타낼 수 있다. 본 발명의 하나의 태양에서 R1, R2 및 R4의 하나 이상은 아미노산 잔기 또는 이의 유도체를 나타낼 수 있다.
여기서 사용되는 용어 "아미노산 측쇄 부분"는 표 1에 나타낸 천연 아미노산 측쇄부분를 포함하여 (이로 제한되지 않음) 천연 단백질에 존재하는 임의의 아미노산 측쇄부분를 나타낸다. 본 발명의 다른 천연아미노산 측쇄부분은 3,5-디브로모티로신, 3,5-디이오도티로신, 하이드록시라이신, γ-카르복시글루타메이트, 포스포티로신 및 포스포세린의 측쇄 부분을 포함하지만 이로 제한되는 것은 아니다. 그 외에, 글리코실화 트레오닌, 세린 및 아스파라긴을 포함하는 (그러나 이로 제한되지 않음) 글리코실화 아미노산의 측쇄부분이 본 발명의 실시에 사용될 수도 있다.
아미노산 측쇄부분 (amino acid side chain moiety) 아미노산
-H 글리신
-CH3 알라닌
-CH(CH3)2 발린
-CH2CH(CH3)2 류신
-CH(CH3)CH2CH3 이소류신
-(CH2)4NH3 + 라이신
-(CH2)3NHC(NH2)NH2 + 아르기닌
Figure 112006074580183-PCT00007
 히스티딘
-CH2COO- 아스파르트산
-CH2CH2COO- 글루탐산
-CH2CONH2 아스파라긴
-CH2CH2CONH2 글루타민
Figure 112006074580183-PCT00008
 페닐알라닌
Figure 112006074580183-PCT00009
 티로신
Figure 112006074580183-PCT00010
 트립토판
-CH2SH 시스테인
-CH2CH2SCH3 메티오닌
-CH2OH 세린
-CH(OH)CH3 트레오닌
Figure 112006074580183-PCT00011
 프롤린
Figure 112006074580183-PCT00012
 하이드록시프롤린
천연 아미노산의 측쇄부분 이외에, 본 발명의 아미노산 측쇄 부분은 또한 이들의 유도체를 포함한다. 여기서 사용되는 아미노산 측쇄부분의 "유도체"는 천연 아미노산 측쇄 부분에 대한 변형 및/또는 변이체를 포함한다. 예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신 및 페닐알라닌의 아미노산 측쇄 부분은 일반적으로 저급 알킬, 아릴, 아릴알킬 부분으로 분류할 수 있다. 아미노산 측쇄 부분의 유도체는 다른 직쇄 또는 측쇄, 환식 또는 비환식, 치환되거나 치환되지 않고, 포화되거나 또는 포화되지 않는 저급 알킬, 아릴 또는 알킬 부분을 포함한다.
여기서 사용되는 "저급 알킬 부분"는 탄소원자를 1 내지 12개 포함하고, "저급아릴 부분"는 탄소원자를 6 내지 12개 포함하고, "저급 아르알킬 부분"는 탄소원자를 7 내지 12개 포함한다. 따라서 하나의 태양에서, 아미노산 측쇄 유도체는 C1-12알킬, C6 - 12아릴 및 C7 - 12아릴알킬로부터 선택되고, 더욱 바람직한 태양에서는 아미노산 측쇄유도체는 C1 - 7알킬, C6 - 10아릴 및 C7 - 11아릴알킬로부터 선택된다.
본 발명의 아미노산 측쇄 유도체는 또한 저급 알킬, 아릴 및 아릴알킬 부분의 치환된 유도체를 포함하며, 여기서 치환체는 화학적 부분들: -OH, -OR, -COOH, -COOR, -CONH2, -NH2, -NHR, -NRR, -SH, -SR, -SO2R, -SO2H, -SOR 및 할로겐 (F, Cl, Br 및 I 포함)중 하나 이상으로부터 선택된다 (이들로 제한되지 않음). 여기서 상기 R은 각각 독립적으로 직쇄 또는 측쇄, 환식 또는 비환식, 치환 또는 비치환, 포화 또는 불포화 저급 알킬, 아릴 및 아르알킬 부분으로부터 선택된다. 더욱이 본 발명의 환식 저급 알킬, 아릴 및 아릴알킬 부분은 나프탈렌 뿐만 아니라 티오펜, 피롤, 퓨란, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 피라졸, 3-피롤린, 피롤리딘, 피리딘, 피리미딘, 퓨린, 퀴놀린, 이소퀴놀린 및 카바졸과 같은 헤테로고리 화합물을 포함한다. 아미노산 측쇄 유도체는 또한 알킬 및 아르알킬 포스포네이트 및 실란을 포함하여(이들로 제한되지 않음) 저급 알킬 및 아르알킬 부분의 알킬부분의 헤테로 알킬 유도체를 포함한다.
대표적인 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, 및 R9 부분은 특히 (제한되지는 않지만) -OH, -OR, -COR, -COOR, -CONH2, -CONR, -CONRR, -NH2, -NHR, -NRR, -SO2R 및 -COSR을 포함하며 여기서 R은 상기 정의한 바와 같다.
또 다른 실시태양에서, 아미노산 측쇄 부분 또는 이의 유도체 (또는 R1, R2, R3, R5, R6, R7, R8 및 R9인 경우에 화합물의 잔여부분) 이외에도, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 또는 R9는 다른 부분 또는 화합물에 대한 결합을 용이하게 하는 링커일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 진단 또는 스크린 분석을 위해 사용하기 위한 비오틴과 같은 공지된 하나 이상의 화합물에 연결될 수 있다. 또한 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 또는 R9는 고체 지지체 (예를 들어 고체상 펩티드 합성에 사용되는 지지체)에 화합물을 결합시키는 링커가 될 수 있거나 또는 지지체 자체일 수 있다. 이러한 실시태양에서, 또 다른 부분 또는 화합물에의 또는 고체 지지체(solid supporter)에의 연결이 R1, R2, R7 또는 R8 또는 R9 위치에서 더욱 바람직하게는 R1 또는 R2 위치에서 이루어지는 것이 바람직하다.
A가 -(CHR3)-이고, B가 -(C=O)-이고, D가 -(CHR5)-이고, E가 -(C=O)-이고, 또한 G가 -(XR7)n-인 실시태양에서, 본 발명의 리버스-턴 유사 화합물은 다음 식 (II)를 갖는다:
Figure 112006074580183-PCT00013
상기 식에서, R1, R2, R3, R5, R7, W, X 및 n은 상기 정의한 바와 같다. 바람직한 실시태양에서, R1, R2 및 R7은 화합물의 잔여부분을 나타내고, 또한 R3 또는 R5는 아미노산 측쇄 부분으로부터 선택된다.
A가 -(C=O)-이고, B가 -(CHR4)-이고, D가 -(C=O)-이고, E가 -(ZR6)-이고, 또한 G가 -(C=O)-(XR9)-인 하나의 실시태양에서, 본 발명의 리버스-턴 유사 화합물은 다음 식 (III)를 갖는다.
Figure 112006074580183-PCT00014
상기 식에서, R1, R2, R4, R6, R9, W 및 X는 상기 정의한 바와 같으며, Z는 질소 또는 CH (단 Z가 CH일 때 X는 질소이다)이다. 바람직한 실시태양에서 R1, R2, R6 및 R9는 화합물의 잔여부분을 나타내고, 또한 R4는 아미노산 측쇄 부분으로부터 선택된다.
A가 -(C=O)-이고, B가 -(CHR4)-이고, D가 -(C=O)-이고, E가 -(ZR6)-이고, 또한 G가 (XR7)n-인 하나의 실시태양에서, 본 발명의 리버스-턴 유사 화합물은 다음 식 (IV)를 갖는다.
Figure 112006074580183-PCT00015
상기 식에서, R1, R2, R4, R6, R7, W, X 및 n은 상기 정의한 바와 같으며, 또한 Z는 질소 또는 CH 이다 (단 Z가 질소일 때 n은 0이며, 또한 Z가 CH일 때 X는 질소이고 n은 0이 아니다). 바람직한 실시태양에서 R1, R2, R6 및 R7은 화합물의 잔여부분을 나타내고, 또한 R4는 아미노산 측쇄 부분으로부터 선택된다. 하나의 태양에서, R6 또는 R7은 Z 및 X가 둘 다 CH일 때 아미노산 측쇄 부분으로부터 선택된다.
이들 화합물은 적절한 출발성분 분자 (이후에 "구성 조각"으로 언급함)를 사용하여 제조할 수 있다. 요컨대, 일반식(I)의 구조를 갖는 리버스-턴 유사체의 합성에 있어서 제1 및 제2 구성 조각을 짝지어서 결합된 제1-제2 중간체를 형성시키고, 필요에 따라, 제3 및/또는 제4 구성 조각을 짝지어서 결합된 제3-제4 중간체 (또는 상업적으로 입수 가능한 경우, 단일 제3 중간체가 사용될 수 있음)를 형성하고, 결합된 제1-제2 중간체 및 제3-제4 중간체 (또는 제3 중간체)를 짝지어서 제1-제2-제3-제4 중간체 (또는 제1-제2-제3 중간체)를 수득하고, 이를 폐환시켜 본 발명의 리버스-턴 유사체를 수득한다. 또 다른 방법으로는, 일반식(I)의 리버스-턴 유사체는 개개의 구성 조각들을 용액 중에서 단계별로 연속적으로 짝짓거나 또는 고체상 펩티드 합성에서 통상 실시되는 고체상 합성에 의하여 연속적으로 짝지어서 제조할 수 있다.
본 발명의 화합물을 제조하기 위한 구체적인 구성 조각 및 그의 조립체는 도 1에 예시되어 있다. 예를 들면, "제1 구성 조각"은 다음 일반식 S1의 구조를 가질 수 있다:
Figure 112006074580183-PCT00016
상기 식에서, R2는 상기 정의한 바와 같고, 또한 R은 펩티드 합성에 사용하기에 적합한 보호그룹이다. 이 보호 그룹은 고체 상 합성을 가능하게 하기 위해 고분자 지지체에 결합할 수 있다. 적합한 R그룹은 알킬 그룹을 포함하며 바람직한 실시태양에서 R은 메틸 그룹이다. 도 1에서 R그룹 중의 하나는 고분자(고체) 지지체이며, 도면에서 "Pol"로 나타낸다. 이러한 제1 구성 조각은 CH(OR)2-CHO와 H2N-R2의 환원성 아민화(amination)에 의해 또는 H2N-R2 와 CH(OR)2-CH2-LG (여기서 LG는 이탈기, 예를 들면 할로겐(Hal) 그룹을 뜻한다)사이의 대치반응에 의해 용이하게 합성할 수 있다.
"제2 구성 조각"은 다음 일반식 S2의 구조를 가질 수 있다.
Figure 112006074580183-PCT00017
상기 식에서, P는 펩티드 합성에 사용하기에 적합한 아미노 보호그룹이며, L1은 하이드록실 또는 카르복실-활성화 그룹이며, 또한 R4는 상기 정의한 바와 같다. 바람직한 보호 그룹은 t-부틸 디메틸실일 (TBDMS), t-부틸옥시카르보닐(BOC), 메틸옥시카르보닐 (MOC), 9H-플루오렌일메틸옥시카르보닐(FMOC), 및 알릴옥시카르보닐 (Alloc)를 포함한다. N-보호된 아미노산은 상업적으로 시판되고 있으며; 예를 들면 FMOC 아미노산은 다양한 공급원으로부터 시판되고 있다. 제2 구성 조각을 제1 구성 조각과 반응시키기 위하여, L1은 카르복실-활성화 그룹이며, 또한 카르복실 그룹을 활성화된 카르복실 그룹으로의 전환은 카르복실 그룹의 활성화에 대해 당해 분야에 공지된 방법으로 용이하게 달성할 수 있다. 적절한 활성화된 카르복실산 그룹은 산 할로겐화물 (acid halide) (여기서 L1이 클로라이드 또는 브로마이드 등의 할라이드임), 산무수물 (여기서 L1은 아세틸과 같은 아실그룹, N-하이드록시 숙신이미드 에스테르 및 펜타플루오로페닐 에스테르와 같은 반응성 에스테르), 및 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC)와 같이 카르보디이미드를 사용하여 커플링 반응에서 형성된 활성 중간체와 같은 기타 활성화된 중간체를 포함한다. 따라서 상업적으로 시판되는 N-보호 아미노산은 당업계의 기술자에게 알려진 수단에 의해 카르복실 활성화 형태로 전환할 수 있다.
제2 구성 조각으로 작용하는 아미노산의 아지도(azido) 유도체의 경우에, 이러한 화합물은 잘룸(Zaloom)등 (J. Org . Chem . 46:5173-76, 1981)에 기술된 반응에 의해 상응하는 아미노산으로부터 제조할 수 있다.
또 다른 방법으로는, 본 발명의 제1 구성 조각은 다음 일반식 S1'를 가질 수 있다.
Figure 112006074580183-PCT00018
상기 식에서, R은 상기 정의한 바와 같고, 또한 L2는 할로겐 원자 또는 토실그룹 같은 이탈기이다.
본 발명의 제2 구성 조각은 다음 일반식 S2'의 구조를 가질 수 있다.
Figure 112006074580183-PCT00019
상기 식중, R2, R4 및 P는 상기 정의한 바와 같다.
본 발명의 "제3 구성 조각"은 다음 일반식 S3의 구조를 가질 수 있다.
Figure 112006074580183-PCT00020
상기 식에서, G, E, L1 및 L2은 상기 정의한 바와 같다. 적절한 제3 구성 조각은 다양한 공급원으로부터 상업적으로 입수할 수 있거나 또는 유기화학에 잘 알려진 방법에 의해 제조할 수 있다.
도 1에서 일반식(1)의 화합물은 A가 -(C=O)-, B가 -(CHR4)-, D가 -(C=O)- 또한 E가 -(CR6)-이다. 카르보닐기가 위치 B에 있고 또한 R기가 위치 B에 있는 일반식(I)의 화합물, 즉 A가 -(CHR3)-, B가 -(C=O)- 인 화합물은 도 2에 예시한 바와 같이, 도 1에 도시된 것과 유사한 방법으로 제조할 수 있다. 도 2는 또한 제1-제2 중간체 조각과 반응하기 전에 제4구성 조각을 제3구성 조각에 부착하는 것보다는 제1-제2-제3 성분 중간체에 제4성분을 첨가함을 예시하고 있다. 그 외에, 도 2는 D가 -(CHR5)- (도 1에서와 같은 -(C=O)가 아님)이고 E가 -(C=O) (도 1에서와 같은 -(CHR6)-가 아님)인 본 발명의 화합물의 제조를 예시하고 있다. 최종적으로, 도 2는 G가 NR7인 화합물의 제조를 예시한다.
따라서 상기 예시한 바와 같이, 일반식(I)의 리버스-턴 유사체 화합물은 제1 구성 조각을 제2 구성 조각과 반응시켜 결합된 제1-제2 중간체를 생성시킨 다음 결합된 제1-제2 중간체를 제3 구성 조각과 연속적으로 반응시켜 결합된 제1-제2-제3-제4 중간체를 생성시킨 다음 이 중간체를 폐환시켜 리버스-턴 유사체를 수득함으로써 합성될 수 있다.
본 발명의 대표적인 구성 조각은 제조예와 실시예에 기술되어 있다.
일반식 (III) 및 (IV)의 구조를 갖는 리버스-턴 유사체는 상술한 모듈 성분 합성법과 유사한 기술로 제조할 수 있으며 구성 조각에 따라 적절한 변형이 가능하다.
본 발명의 리버스-턴 유사체는 진단제, 예방제 및 치료제와 같은 생활성제로서 유용하다. 예를 들면, 본 발명의 리버스-턴 유사체는 일반식(I)의 화합물의 유효량을 동물에게 투여함을 포함하는 방법에 의해, 온혈동물에서 세포 신호 전사 인자 관련 펩티드(a cell signaling transcription factor related peptides)를 조절하기 위해 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 리버스-턴 유사체는 온혈동물에서 PTB 영역들에 펩티드가 결합하는 것을 억제하기 위해; 온혈동물의 G 단백질 커플된 수용체 (GPCR)와 이온 채널을 조절하기 위해; 온혈동물에서 시토카인(cytokines)을 조절하기 위해, 또한 효과적일 수 있다.
반면, 일반식(I)의 구조를 갖는 특히 일반식(VI)의 구조를 갖는 화합물들은 암, 특히 직장결장암과 같은 Wnt-신호 경로 조절에 의한 질병을 억제하거나 치료하기 위하여 효과적이다.
Figure 112006074580183-PCT00021
(VI)
상기 식중, Ra는 페닐기; 하나 이상의 치환체를 갖는 치환된 페닐기(이때, 하나이상의 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 및 하이드록실기 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다); 벤질기; 하나 이상의 치환체를 갖는 치환된 벤질기(이때, 하나 이상의 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 및 하이드록실기 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다); 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 1 내지 3개 헤테로원자를 가질 수 있는 8 내지 11 환 구성원을 갖는 바이사이클릭(bicyclic) 아릴기이다; Rb 는 5 내지 7 환 구성원을 갖는 모노사이클릭 아릴기로, 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 1 내지 2개 헤테로원자를 가질 수 있으며 또한 화합물 중의 아릴 환이 할로겐화물(halide), 히드록시, 시아노, 저급 알킬, 및 저급 알콕시기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환체를 가질 수 있다; Rc는 포화 또는 불포화 C1 - 6알킬, C1 - 6알콕시, 퍼플루오로C1-6알킬기이며; 그리고 X1, X2, 및 X3은 동일 또는 상이하며 또한 수소, 하이드록실, 및 할로겐화물로부터 독립적으로 선택된다.
또 하나의 실시태양에서, 본 발명의 목적은 안전하고 유효한 양의 일반식(VI)을 갖는 화합물 및 약제학적으로 허용되는 운반체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다. 그리고 이 조성물은 Wnt-신호 경로에 의한 조절에 의한, 특히 TCF4-ß-카테닌-CBP 복합체에 의한 조절에 의한 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 상술한 조성물을 사용하여 종양의 생장을 억제하기 위한 방법; 본 발명의 상술한 조성물을 사용하여 종양세포의 소멸을 유도하는 방법; 본 발명의 상술한 조성물을 사용하여 TCF4-ß 카테닌-CBP 복합체 관련 질환을 치료하는 방법; 및 본 발명의 조성물과 5-플루오로 우라실(5-FU), 탁솔, 시스플라틴, 미토마이신C, 테가푸르, 랠티트렉스드(raltitrexed), 카페시타빈(capecitabine) 및 이리노테칸(irinotecan) 등과 같은 다른 항암제를 함께 투여하여 직장결장암과 같은 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 다음과 같은 (6S,10R)-구조(configuration)를 갖는다:
Figure 112006074580183-PCT00022
상기 식에서, Ra 및 Rb는 상기 정의한 바와 같은 의미를 갖는다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 일반식 (I)을 갖는 화합물로부터 유래된 프로드러그가 기술된다. 상기 프로드러그는 일반적으로 수용성을 증가시키고 그래서 일반식 (I)을 갖는 화합물의 생이용성을 증가시킨다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 상기 프로드러그는 하기 일반식 (VII)을 갖는다:
(VI)-Y-R10
여기서, (VI)는 상기 기술된 바와 같은 일반식 (VI)이고; Y는 Ra, Rb, Rc, X1, X2 및 X3로부터 선택되는 그룹의 산소, 황, 또는 질소이고; R10은 인산염, 헤미숙시네이트, 헤미말레이트, 포스포릴옥시메틸옥시카르보닐, 디메틸아미노아세테이트, 디메틸아미노알킬카르바메이트, 하이드록시알킬, 아미노산, 글로코실, 치환된 또는 치환되지않은 피페리딘 옥시카르보닐, 또는 그들의 염이고; 상기 프로드로그는 포스포테이즈 또는 카르복실레이즈의 기질로서 작용할 수 있고 그럼으로써 일반식 (VI)를 갖는 화합물로 전환될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 일반식 (VII)의 R10은 아미노산기 또는 포스포-아미노산기가 아니다.
본 발명의 또 하나의 특징은, 본 발명의 리버스-턴 유사체 구조를 포함하는 라이브러리가 기술된다. 일단 결집되면, 본 발명의 라이브러리를 스크리닝하여 생활성을 갖는 개별 구성원들을 식별할 수 있다. 이러한 생활성 구성원에 대한 라이브러리의 스크리닝은 예를 들면, 라이브러리의 구성원의 결합 활성을 평가하거나 라이브러리 구성원이 기능분석에 미치는 효과를 평가하는 것을 포함한다. 스크리닝(screening)은 보통 예를 들어 항체, 효소, 수용체, 또는 세포 주와 같은 관심 있는 표적과 함께 라이브러리 구성원 (또는 라이브러리 구성원의 아그룹)들을 접촉시킴으로써 달성된다. 관심 있는 표적과 함께 상호 반응할 수 있는 라이브러리 구성원들은 이하에는 이를 "생활성 라이브러리 구성원" 또는 "생활성 유사체"라고 부른다. 예를 들면, 생활성 유사체는 항체 또는 수용체와 결합할 수 있거나 또는 효소를 억제할 수 있는 라이브러리 구성원이 될 수 있다고, 또는 기능성 반응, 예를 들면 세포 주와 관련된 기능성 반응을 유도하거나 길항시킬 수 있는 라이브러리 구성원이 될 수 있다. 다시 말하면, 본 발명의 라이브러리 스크리닝은 어떠한 라이브러리 구성원이 관심 있는 하나 이상의 생물학적 표적과 상호 작용할 수 있는지를 결정한다. 또한 상호작용이 일어나면, 생활성이 있는 유사체 (또는 유사체들)는 라이브러리 구성원들로부터 식별될 수 있다. 라이브러리로부터 단일 (또는 제한된 수)의 생활성 유사체를 식별하면 그 자체가 생물학적으로 활성인 리버스-턴 유사체를 수득한다. 그래서 진단제, 예방제 또는 치료제로서 유용하고, 또한 당해 분야에서 주도 화합물들의 식별을 상당히 진보시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 라이브러리의 펩티드 유사체의 합성은 본 발명의 제1, 제2, 제3 구성 조각을 함께 결합해서 공지된 펩티드 합성 기술을 사용해서 수행할 수 있다. 더욱 구체적으로, 임의의 아미노산 순서는 입체 형태로 제한된 리버스-턴 유사체의 N-말단 및/또는 C-말단에 첨가될 수 있다. 이 목적을 위하여 유사체는 공지 기술에 따라 PAM 수지와 같은 고체 지지체에서 합성하거나 (참조: John M. Stewart 및 Janis D. Young. 고체상 펩티드 합성, 1984, Pierce Chemical Comp., Rockford, III) 또는 알코올 부착에 의해 실릴-연결된 수지에서 합성될 수 있다 (참조: Randolph 등, J. Am Chem . Soc . 117: 5712-14, 1995).
그 외에, 용액 및 고체상의 합성을 조합한 기술을 사용하여 본 발명의 펩티드 유사체를 합성할 수 있다. 예를 들면, 고체 지지체를 사용하여 입체 형태가 제한된 리버스-턴이 서열에 첨가되는 지점까지 선형 펩티드 서열을 합성할 수 있다. 용액 합성 기술에 의해 이전에 합성된 적합한 입체 형태가 제한된 리버스-턴 유사체를 고체상 합성에서 다음의 "아미노산"에 첨가시킬 수 있다. (즉, N-말단과 C-말단을 갖는 입체 형태가 제한된 리버스-턴 유사체를 선형 펩티드에 첨가할 다음 아미노산으로 사용할 수 있다). 입체 형태가 제한된 리버스-턴 유사체 구조를 서열(sequence)에 혼합할 때, 추가의 아미노산을 고체 지지체에 결합한 펩티드를 완성시키기 위해 첨가할 수 있다. 선택적으로는, 선형 N-말단과 C-말단이 보호된 펩티드 서열을 고체 지지체에서 합성할 수 있고, 지지체로부터 제거할 수 있고 공지된 용액 커플링 기술을 사용하여 용액내에서 입체 형태가 제한된 리버스-턴 유사체에 커플링 시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징은, 라이브러리를 구성하는 방법이 기재되어 있다. 전통적인 조합화학 기술(참조: Gallop 등, J. Med . Chem . 37: 1233-1251, 1994)은 방대한 수의 화합물이 기본적인 분자 골격에서 시약들의 순차적인 조합에 의해 신속하게 제조되게 된다. 조합 기술은 천연 아미노산으로부터 유도된 펩티드 라이브러리를 구성하는데 사용되어 왔다. 예를 들면 20개의 적합하게 보호된 상이한 아미노산으로 이루어진 20개의 혼합물을 취하고 각각을 20개의 아미노산 중 하나와 커플링 시킴으로써 400(즉 202)개의 디펩티드로 이루어진 라이브러리가 생성된다. 이러한 과정을 7번 반복함으로써 약 260억(208)개의 옥타펩티드로 이루어진 펩티드 라이브러리를 제조한다.
구체적으로는, 본 발명의 라이브러리의 펩티드 유사체의 합성은 공지된 펩티드 합성 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면 리버스-턴 유사체 라이브러리 [4,4,0]의 일반적인 도식(scheme)은 다음과 같다.
Figure 112006074580183-PCT00023
본 발명의 펩티드 유사체의 라이브러리의 합성은 공지된 기술인 96웰 플레이트를 갖는 플렉스켐 반응조 블록(FlexChem Reactor Block)을 사용하여 수행되었다. 상기 과정에서 "Pol"은 브로모아세탈 수지(Advanced ChemTech 사)를 나타내며 또한 상세한 과정이 아래에 예시되어 있다.
제1 단계
브로모아세탈 수지 (37mg, 0.98mmol/g)와 DMSO(1.4mL)에 R2-아민을 넣은 용액을 96개의 웰 판을 갖는 로빈 블록(Robbins block; FlexChem)에 넣었다. 반응 혼합물은 회전식 오븐[Robbins Scientific]을 사용하여 12시간 동안 약 60℃에서 흔들었다. 수지는 DMF, MeOH로 세척한 후 DMC로 세척하였다.
제2 단계
상업적으로 시판중인 DMF에 FmocAmino Acids(4당량), PyBob(4당량), HOAt(4당량), 그리고 DIEA (12당량)을 녹인 용액을 수지에 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 12시간 동안 흔든 후 수지를 DMF, MeOH로 세척한 후 DCM으로 세척하였다.
제 3 단계
반응 전에 DMF에 의해 팽윤된 수지에 DMF 속의 25% 피페리딘을 첨가하고 반응 혼합물을 상온에서 30분 동안 흔들었다. 이러한 탈보호(deprotection) 단계를 다시 반복하고 수지는 DMF, 메탄올로 세척한 후 DCM으로 세척하였다. DMF중에 히드라진 산(4당량), HOBt(4당량), 그리고 DIC(4당량)을 녹인 용액을 수지에 첨가하고 반응 혼합물을 상온에서 약 12시간 동안 흔들었다. 수지는 DMF, MeOH로 세척한 후 DCM으로 세척하였다.
제 4a 단계 (히드라진 산이 MOC 카르바메이트인 경우)
제3 단계에서 얻은 수지를 상온에서 18시간 동안 포름산으로 처리하였다 (각 웰마다 1.2ml씩). 수지를 여과에 의하여 제거한 후, 여과액은 생성물을 오일의 형태로 얻기 위해 스피드 백(SpeedVac, SAVANT)을 사용하여 감압 하에 농축하였다. 생성물은 50%의 물/아세토니트릴로 희석한 다음 동결(freezing)후에 동결 건조(lyophilization)시켰다.
제4b 단계 (Fmoc 히드라진 산이 이소시아네이트를 통해 요소를 만드는데 사용되는 경우)
반응 전에 DMF에 의해 팽윤된 수지에 DMF내의 25% 피페리딘을 첨가하고, 반응혼합물을 상온에서 약 30분 동안 흔들었다. 이러한 탈보호 과정을 다시 반복하고 수지는 DMF, 메탄올로 세척한 후 DCM으로 세척하였다. 반응 전에 DCM에 의해서 팽윤된 수지에 DCM중의 이소시아네이트(5 당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 약 12시간 동안 흔든 후, 수지를 DMF, MeOH로 세척한 후 DCM으로 세척하였다. 수지는 상온에서 포름산으로 (각 웰당 1.2ml 씩) 약 18시간 동안 처리하였다. 수지를 여과에 의해서 제거한 후 여과액은 스피드 백[SAVANT]을 사용하여 감압 하에 농축시켜 오일 형태의 생성물을 얻었다. 생성물은 50% 물/아세토니트릴로 희석시킨 후 동결건조 시켰다.
제4c 단계 (Fmoc-히드라진 산이 활성 카바메이트를 통해 요소를 만드는데 사용되는 경우)
반응 전에 DMF에 의해 팽윤된 수지에 DMF내의 25% 피레리딘을 첨가하고, 반응혼합물을 상온에서 약 30분 동안 흔들었다. 이러한 탈보호 과정을 다시 반복하고 수지는 DMF, 메탄올로 세척한 후 DCM으로 세척하였다. 반응 전에 DCM에 의해서 팽윤된 수지에 DCM중의 p-니트로페닐 클로로포르메이트(5 당량) 및 디이소프로필 에틸아민(5당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 약 12시간 동안 흔든 후, 수지를 DMF, MeOH로 세척한 후 DCM으로 세척하였다. 수지에 DCM 중의 1차 아민을 실온에서 12시간 동안 첨가하고, 수지를 DMF, MeOH로 세척한 후, DCM으로 세척하였다. 반응 후 수지는 실온에서 약 18시간 동안 포름산으로 처리하였다 (각 웰당 1.2ml 씩). 수지를 여과에 의해서 제거한 후 여과액은 생성물을 스피드 백[SAVANT]을 사용하여 감압 하에 농축시켜 오일 형태의 생성물을 얻었다. 생성물은 50% 물/아세토니트릴로 희석시킨 후 동결 후에 동결건조시켰다.
블록 라이브러리를 만들기 위하여, 제조예에 예시된 절차를 따라 핵심이 되는 중간체 히드라진 산을 합성하였다.
표 2A 및 2B는 본 발명에 따라 제조될 수 있는 [4,4,0] 리버스-턴 유사체 라이브러리를 보여준다. 이것의 대표적인 제조예는 실시예 4에 기술하였다.
[4,4,0] 리버스-턴 유사체 라이브러리
Figure 112006074580183-PCT00024
번호 R2 R4 R7 R1 - Y' 분자량 M+H
1 2,4-Cl2 -벤질 4-HO-벤질 알릴 OCH3 533 534
2 2,4-Cl2-벤질 4-NO2 -벤질 알릴 OCH3 562 563
3 2,4-Cl2-벤질 2,4-F2-벤질 알릴 OCH3 553 554
4 2,4-Cl2-벤질 4-Cl-벤질 알릴 OCH3 552 553
5 2,4-Cl2-벤질 2,2-비스페닐에틸 알릴 OCH3 594 595
6 2,4-Cl2-벤질 3-t-Bu-4-HO-벤질 알릴 OCH3 590 591
7 2,4-Cl2-벤질 4-Me-벤질 알릴 OCH3 531 532
8 2,4-Cl2-벤질 시클로헥실메틸 알릴 OCH3 523 524
9 2,4-Cl2-벤질 4-F-벤질 알릴 OCH3 535 536
10 2,4-Cl2-벤질 2-Cl-벤질 알릴 OCH3 552 553
11 2,4-Cl2-벤질 2,4-Cl2-벤질 알릴 OCH3 586 587
12 2,4-Cl2-벤질 나프트-2-일메틸 알릴 OCH3 567 568
13 2,4-Cl2-벤질 4-HO-벤질 벤질 OCH3 583 584
14 2,4-Cl2-벤질 4-NO2-벤질 벤질 OCH3 612 613
15 2,4-Cl2-벤질 2,4-F2-벤질 벤질 OCH3 603 604
16 2,4-Cl2-벤질 4-Cl-벤질 벤질 OCH3 602 603
17 2,4-Cl2-벤질 2,2-비스페닐에틸 벤질 OCH3 644 645
18 2,4-Cl2-벤질 3-t-Bu-4-HO-벤질 벤질 OCH3 640 641
19 2,4-Cl2-벤질 4-Me-벤질 벤질 OCH3 582 583
20 2,4-Cl2-벤질 시클로헥실메틸 벤질 OCH3 574 575
21 2,4-Cl2-벤질 4-F-벤질 벤질 OCH3 585 586
22 2,4-Cl2-벤질 2-Cl-벤질 벤질 OCH3 602 603
23 2,4-Cl2-벤질 2,4-Cl2-벤질 벤질 OCH3 636 637
24 2,4-Cl2-벤질 나프트-2-일메틸 벤질 OCH3 618 619
25 2,4-Cl2-벤질 4-HO-벤질 알릴 OCH3 479 480
26 2,4-Cl2-벤질 4-NO2-벤질 알릴 OCH3 508 509
27 2,4-Cl2-벤질 2,4-F2-벤질 알릴 OCH3 499 500
28 2,4-Cl2-벤질 4-Cl-벤질 알릴 OCH3 497 498
29 펜에틸(phenethy) 2,2-비스페닐에틸 알릴 OCH3 539 540
30 펜에틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 알릴 OCH3 535 536
31 펜에틸 4-Me-벤질 알릴 OCH3 477 478
32 펜에틸 시클로헥실메틸 알릴 OCH3 469 470
33 펜에틸 4-F-벤질 알릴 OCH3 481 482
34 펜에틸 2-Cl-벤질 알릴 OCH3 497 498
35 펜에틸 2,4-Cl2-벤질 알릴 OCH3 531 532
36 펜에틸 나프트-2-일메틸 알릴 OCH3 513 514
37 펜에틸 4-HO-벤질 벤질 OCH3 529 530
38 펜에틸 4-NO2-벤질 벤질 OCH3 558 559
39 펜에틸 2,4-F2-벤질 벤질 OCH3 549 550
40 펜에틸 4-Cl-벤질 벤질 OCH3 547 548
41 펜에틸 2,2-비스페닐에틸 벤질 OCH3 589 590
42 펜에틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 벤질 OCH3 585 586
43 펜에틸 4-Me-벤질 벤질 OCH3 527 528
44 펜에틸 시클로헥실-메틸 벤질 OCH3 519 520
45 펜에틸 4-F-벤질 벤질 OCH3 531 532
46 펜에틸 2-Cl-벤질 벤질 OCH3 547 548
47 펜에틸 2,4-Cl2-벤질 벤질 OCH3 582 583
48 펜에틸 나프트-2-일메틸 벤질 OCH3 563 564
49 펜에틸 4-HO-벤질 알릴 OCH3 497 498
50 펜에틸 4-NO2-벤질 알릴 OCH3 526 527
51 펜에틸 2,4-F2-벤질 알릴 OCH3 517 518
52 펜에틸 4-Cl-벤질 알릴 OCH3 515 516
53 4-F-페닐에틸 2,2-비스페닐에틸 알릴 OCH3 557 558
54 4-F-페닐에틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 알릴 OCH3 553 554
55 4-F-페닐에틸 4-Me-벤질 알릴 OCH3 495 496
56 4-F-페닐에틸 시클로헥실-메틸 알릴 OCH3 487 488
57 4-F-페닐에틸 4-F-벤질 알릴 OCH3 499 500
58 4-F-페닐에틸 2-Cl-벤질 알릴 OCH3 515 516
59 4-F-페닐에틸 2,4-Cl2-벤질 알릴 OCH3 549 550
60 4-F-페닐에틸 나프트-2-일메틸 알릴 OCH3 531 532
61 4-F-페닐에틸 4-HO-벤질 벤질 OCH3 547 548
62 4-F-페닐에틸 4-NO2-벤질 벤질 OCH3 576 577
63 4-F-페닐에틸 2,4-F2-벤질 벤질 OCH3 567 568
64 4-F-페닐에틸 4-Cl-벤질 벤질 OCH3 565 566
65 4-F-페닐에틸 2,2-비스페닐에틸 벤질 OCH3 607 608
66 4-F-페닐에틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 벤질 OCH3 603 604
67 4-F-페닐에틸 4-Me-벤질 벤질 OCH3 545 546
68 4-F-페닐에틸 시클로헥실-메틸 벤질 OCH3 537 538
69 4-F-페닐에틸 4-F-벤질 벤질 OCH3 549 550
70 4-F-페닐에틸 2-Cl-벤질 벤질 OCH3 565 566
71 4-F-페닐에틸 2,4-Cl2-벤질 벤질 OCH3 599 600
72 4-F-페닐에틸 나프트-2-일메틸 벤질 OCH3 581 582
73 4-F-페닐에틸 4-HO-벤질 알릴 OCH3 509 510
74 4-F-페닐에틸 4-NO2-벤질 알릴 OCH3 538 539
75 4-F-페닐에틸 2,4-F2-벤질 알릴 OCH3 529 530
76 4-F-페닐에틸 4-Cl-벤질 알릴 OCH3 527 528
77 4-MeO-페닐에틸 2,2-비스페닐에틸 알릴 OCH3 569 570
78 4-MeO-페닐에틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 알릴 OCH3 565 566
79 4-MeO-페닐에틸 4-Me-벤질 알릴 OCH3 507 508
80 4-MeO-페닐에틸 시클로헥실-메틸 알릴 OCH3 499 500
81 4-MeO-페닐에틸 4-F-벤질 알릴 OCH3 511 512
82 4-MeO-페닐에틸 2-Cl-벤질 알릴 OCH3 527 528
83 4-MeO-페닐에틸 2,4-Cl2-벤질 알릴 OCH3 561 562
84 4-MeO-페닐에틸 나프트-2-일메틸 알릴 OCH3 543 544
85 4-MeO-페닐에틸 4-HO-벤질 벤질 OCH3 559 560
86 4-MeO-페닐에틸 4-NO2-벤질 벤질 OCH3 588 589
87 4-MeO-페닐에틸 2,4-F2-벤질 벤질 OCH3 579 580
88 4-MeO-페닐에틸 4-Cl-벤질 벤질 OCH3 577 578
89 4-MeO-페닐에틸 2,2-비스페닐에틸 벤질 OCH3 619 620
90 4-MeO-페닐에틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 벤질 OCH3 615 616
91 4-MeO-페닐에틸 4-Me-벤질 벤질 OCH3 557 558
92 4-MeO-페닐에틸 시클로헥실메틸 벤질 OCH3 549 550
93 4-MeO-페닐에틸 4-F-벤질 벤질 OCH3 561 562
94 4-MeO-페닐에틸 2-Cl-벤질 벤질 OCH3 577 578
95 4-MeO-페닐에틸 2,4-Cl2-벤질 벤질 OCH3 612 613
96 4-MeO-페닐에틸 나프트-2-일메틸 벤질 OCH3 593 594
97 이소아밀 4-HO-벤질 스티릴메틸 OCH3 521 522
98 이소아밀 4-NO2-벤질 스티릴메틸 OCH3 550 551
99 이소아밀 2,4-F2-벤질 스티릴메틸 OCH3 541 542
100 이소아밀 4-Cl-벤질 스티릴메틸 OCH3 539 540
101 이소아밀 2,2-비스페닐에틸 스티릴메틸 OCH3 581 582
102 이소아밀 3-t-Bu-4-HO-벤질 스티릴메틸 OCH3 497 498
103 이소아밀 4-Me-벤질 스티릴메틸 OCH3 519 520
104 이소아밀 시클로헥실메틸 스티릴메틸 OCH3 511 512
105 이소아밀 4-F-벤질 스티릴메틸 OCH3 523 524
106 이소아밀 2-Cl-벤질 스티릴메틸 OCH3 539 540
107 이소아밀 2,4-Cl2-벤질 스티릴메틸 OCH3 574 575
108 이소아밀 나프트-2-일메틸 스티릴메틸 OCH3 555 556
109 이소아밀 4-HO-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 563 564
110 이소아밀 4-NO2-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 592 593
111 이소아밀 2,4-F2-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 583 584
112 이소아밀 4-Cl-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 582 583
113 이소아밀 2,2-비스페닐에틸 2,6-Cl2-벤질 OCH3 624 625
114 이소아밀 3-t-Bu-4-HO-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 540 541
115 이소아밀 4-Me-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 562 563
116 이소아밀 시클로헥실메틸 2,6-Cl2-벤질 OCH3 554 555
117 이소아밀 4-F-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 565 566
118 이소아밀 2-Cl-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 582 583
119 이소아밀 2,4-Cl2-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 616 617
120 이소아밀 나프트-2-일메틸 2,6-Cl2-벤질 OCH3 598 599
121 3-MeO-프로필 4-HO-벤질 스티릴메틸 OCH3 523 524
122 3-MeO-프로필 4-NO2-벤질 스티릴메틸 OCH3 552 553
123 3-MeO-프로필 2,4-F2-벤질 스티릴메틸 OCH3 543 544
124 3-MeO-프로필 4-Cl-벤질 스티릴메틸 OCH3 541 542
125 3-MeO-프로필 2,2-비스페닐에틸 스티릴메틸 OCH3 583 584
126 3-MeO-프로필 3-t-Bu-4-HO-벤질 스티릴메틸 OCH3 499 500
127 3-MeO-프로필 4-Me-벤질 스티릴메틸 OCH3 521 522
128 3-MeO-프로필 시클로헥실-메틸 스티릴메틸 OCH3 513 514
129 3-MeO-프로필 4-F-벤질 스티릴메틸 OCH3 525 526
130 3-MeO-프로필 2-Cl-벤질 스티릴메틸 OCH3 541 542
131 3-MeO-프로필 2,4-Cl2-벤질 스티릴메틸 OCH3 575 576
132 3-MeO-프로필 나프트-2-일메틸 스티릴메틸 OCH3 557 558
133 3-MeO-프로필 4-HO-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 565 566
134 3-MeO-프로필 4-NO2-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 594 595
135 3-MeO-프로필 2,4-F2-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 585 586
136 3-MeO-프로필 4-Cl-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 584 585
137 3-MeO-프로필 2,2-비스페닐에틸 2,6-Cl2-벤질 OCH3 626 627
138 3-MeO-프로필 3-t-Bu-4-HO-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 541 542
139 3-MeO-프로필 4-Me-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 563 564
140 3-MeO-프로필 시클로헥실-메틸 2,6-Cl2-벤질 OCH3 556 557
141 3-MeO-프로필 4-F-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 567 568
142 3-MeO-프로필 2-Cl-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 584 585
143 3-MeO-프로필 2,4-Cl2-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 618 619
144 3-MeO-프로필 나프트-2-일메틸 2,6-Cl2-벤질 OCH3 600 601
145 4-MeO-페닐에틸 4-HO-벤질 스티릴메틸 OCH3 585 586
146 4-MeO-페닐에틸 4-NO2-벤질 스티릴메틸 OCH3 614 615
147 4-MeO-페닐에틸 2,4-F2-벤질 스티릴메틸 OCH3 605 606
148 4-MeO-페닐에틸 4-Cl-벤질 스티릴메틸 OCH3 603 604
149 4-MeO-페닐에틸 2,2-비스페닐에틸 스티릴메틸 OCH3 645 646
150 4-MeO-페닐에틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 스티릴메틸 OCH3 561 562
151 4-MeO-페닐에틸 4-Me-벤질 스티릴메틸 OCH3 583 584
152 4-MeO-페닐에틸 시클로헥실-메틸 스티릴메틸 OCH3 575 576
153 4-MeO-페닐에틸 4-F-벤질 스티릴메틸 OCH3 587 588
154 4-MeO-페닐에틸 2-Cl-벤질 스티릴메틸 OCH3 603 604
155 4-MeO-페닐에틸 2,4-Cl2-벤질 스티릴메틸 OCH3 638 639
156 4-MeO-페닐에틸 나프트-2-일메틸 스티릴메틸 OCH3 619 620
157 4-MeO-페닐에틸 4-HO-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 628 629
158 4-MeO-페닐에틸 4-NO2-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 657 658
159 4-MeO-페닐에틸 2,4-F2-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 648 649
160 4-MeO-페닐에틸 4-Cl-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 646 647
161 4-MeO-페닐에틸 2,2-비스페닐에틸 2,6-Cl2-벤질 OCH3 688 689
162 4-MeO-페닐에틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 604 605
163 4-MeO-페닐에틸 4-Me-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 626 627
164 4-MeO-페닐에틸 시클로헥실메틸 2,6-Cl2-벤질 OCH3 618 619
165 4-MeO-페닐에틸 4-F-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 630 631
166 4-MeO-페닐에틸 2-Cl-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 646 647
167 4-MeO-페닐에틸 2,4-Cl2-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 680 681
168 4-MeO-페닐에틸 나프트-2-일메틸 2,6-Cl2-벤질 OCH3 662 663
169 테트라히드로퓨란-2-일메틸 4-HO-벤질 스티릴메틸 OCH3 535 536
170 테트라히드로퓨란-2-일메틸 4-NO2-벤질 스티릴메틸 OCH3 564 565
171 테트라히드로퓨란-2-일메틸 2,4-F2-벤질 스티릴메틸 OCH3 555 556
172 테트라히드로퓨란-2-일메틸 4-Cl-벤질 스티릴메틸 OCH3 553 554
173 테트라히드로퓨란-2-일메틸 2,2-비스페닐에틸 스티릴메틸 OCH3 595 596
174 테트라히드로퓨란-2-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 스티릴메틸 OCH3 511 512
175 테트라히드로퓨란-2-일메틸 4-Me-벤질 스티릴메틸 OCH3 533 534
176 테트라히드로퓨란-2-일메틸 시클로헥실-메틸 스티릴메틸 OCH3 525 526
177 테트라히드로퓨란-2-일메틸 4-F-벤질 스티릴메틸 OCH3 537 538
178 테트라히드로퓨란-2-일메틸 2-Cl-벤질 스티릴메틸 OCH3 553 554
179 테트라히드로퓨란-2-일메틸 2,4-Cl2-벤질 스티릴메틸 OCH3 588 589
180 테트라히드로퓨란-2-일메틸 나프트-2-일메틸 스티릴메틸 OCH3 569 570
181 테트라히드로퓨란-2-일메틸 4-HO-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 577 578
182 테트라히드로퓨란-2-일메틸 4-NO2-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 606 607
183 테트라히드로퓨란-2-일메틸 2,4-F2-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 597 598
184 테트라히드로퓨란-2-일메틸 4-Cl-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 596 597
185 테트라히드로퓨란-2-일메틸 2,2-비스페닐에틸 2,6-Cl2-벤질 OCH3 638 639
186 테트라히드로퓨란-2-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 553 554
187 테트라히드로퓨란-2-일메틸 4-Me-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 575 576
188 테트라히드로퓨란-2-일메틸 시클로헥실-메틸 2,6-Cl2-벤질 OCH3 568 569
189 테트라히드로퓨란-2-일메틸 4-F-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 579 580
190 테트라히드로퓨란-2-일메틸 2-Cl-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 596 597
191 테트라히드로퓨란-2-일메틸 2,4-Cl2-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 630 631
192 테트라히드로퓨란-2-일메틸 나프트-2-일메틸 2,6-Cl2-벤질 OCH3 612 613
193 펜에틸 4-HO-벤질 메틸 (4-Me-페닐)아미노 528 529
194 펜에틸 4-HO-벤질 메틸 (4-Cl-페닐)아미노 548 549
195 펜에틸 4-HO-벤질 메틸 페닐아미노 514 515
196 펜에틸 4-HO-벤질 메틸 ((R)-α-메틸벤질)아미노 542 543
197 펜에틸 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 528 529
198 펜에틸 4-HO-벤질 메틸 (4-MeO-페닐)아미노 544 545
199 펜에틸 4-HO-벤질 메틸 (4-Br-페닐)아미노 592 593
200 펜에틸 4-HO-벤질 메틸 (4-CF3-페닐)아미노 582 583
201 펜에틸 4-HO-벤질 메틸 펜틸아미노 508 509
202 펜에틸 4-HO-벤질 메틸 (2-페닐에틸) 아미노 542 543
203 펜에틸 4-HO-벤질 메틸 (4-MeO-벤질)아미노 558 559
204 펜에틸 4-HO-벤질 메틸 시클로헥실아미노 520 521
205 2,2-비스페닐에틸 4-HO-벤질 메틸 (4-Me-페닐)아미노 604 605
206 2,2-비스페닐에틸 4-HO-벤질 메틸 (4-Cl-페닐)아미노 624 625
207 2,2-비스페닐에틸 4-HO-벤질 메틸 페닐아미노 590 591
208 2,2-비스페닐에틸 4-HO-벤질 메틸 ((R)-α-메틸벤질)아미노 618 619
209 2,2-비스페닐에틸 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 604 605
210 2,2-비스페닐에틸 4-HO-벤질 메틸 (4-MeO-페닐)아미노 620 621
211 2,2-비스페닐에틸 4-HO-벤질 메틸 (4-Br-페닐)아미노 669 670
212 2,2-비스페닐에틸 4-HO-벤질 메틸 (4-CF3-페닐)아미노 658 659
213 2,2-비스페닐에틸 4-HO-벤질 메틸 펜틸아미노 584 585
214 2,2-비스페닐에틸 4-HO-벤질 메틸 (2-페닐에틸) 아미노 618 619
215 2,2-비스페닐에틸 4-HO-벤질 메틸 (4-MeO-벤질)아미노 634 635
216 2,2-비스페닐에틸 4-HO-벤질 메틸 시클로헥실아미노 596 597
217 펜에틸 3,4-Cl2-벤질 메틸 (4-Me-페닐)아미노 581 582
218 펜에틸 3,4-Cl2-벤질 메틸 (4-Cl-페닐)아미노 601 602
219 펜에틸 3,4-Cl2-벤질 메틸 페닐아미노 566 567
220 펜에틸 3,4-Cl2-벤질 메틸 ((R)-α-메틸벤질)아미노 595 596
221 펜에틸 3,4-Cl2-벤질 메틸 벤질아미노 581 582
222 펜에틸 3,4-Cl2-벤질 메틸 (4-MeO-페닐)아미노 597 598
223 펜에틸 3,4-Cl2-벤질 메틸 (4-Br-페닐)아미노 645 646
224 펜에틸 3,4-Cl2-벤질 메틸 (4-CF3-페닐)아미노 634 635
225 펜에틸 3,4-Cl2-벤질 메틸 펜틸아미노 561 562
226 펜에틸 3,4-Cl2-벤질 메틸 (2-페닐에틸) 아미노 595 596
227 펜에틸 3,4-Cl2-벤질 메틸 (4-MeO-벤질)아미노 611 612
228 펜에틸 3,4-Cl2-벤질 메틸 시클로헥실아미노 573 574
229 2,2-비스페닐에틸 3,4-Cl2-벤질 메틸 (4-Me-페닐)아미노 657 658
230 2,2-비스페닐에틸 3,4-Cl2-벤질 메틸 (4-Cl-페닐)아미노 677 678
231 2,2-비스페닐에틸 3,4-Cl2-벤질 메틸 페닐아미노 643 644
232 2,2-비스페닐에틸 3,4-Cl2-벤질 메틸 ((R)-α-메틸벤질)아미노 671 672
233 2,2-비스페닐에틸 3,4-Cl2-벤질 메틸 벤질아미노 657 658
234 2,2-비스페닐에틸 3,4-Cl2-벤질 메틸 (4-MeO-페닐)아미노 673 674
235 2,2-비스페닐에틸 3,4-Cl2-벤질 메틸 (4-Br-페닐)아미노 721 722
236 2,2-비스페닐에틸 3,4-Cl2-벤질 메틸 (4-CF3-페닐)아미노 711 712
237 2,2-비스페닐에틸 3,4-Cl2-벤질 메틸 펜틸아미노 637 638
238 2,2-비스페닐에틸 3,4-Cl2-벤질 메틸 (2-페닐에틸) 아미노 671 672
239 2,2-비스페닐에틸 3,4-Cl2-벤질 메틸 (4-MeO-벤질)아미노 687 688
240 2,2-비스페닐에틸 3,4-Cl2-벤질 메틸 시클로헥실아미노 649 650
241 이소아밀 4-HO-벤질 메틸 (4-Me-페닐)아미노 478 479
242 이소아밀 4-HO-벤질 메틸 (4-Cl-페닐)아미노 498 499
243 이소아밀 4-HO-벤질 메틸 페닐아미노 464 465
244 이소아밀 4-HO-벤질 메틸 ((R)-α-메틸벤질)아미노 492 493
245 이소아밀 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 478 479
246 이소아밀 4-HO-벤질 메틸 (4-MeO-페닐)아미노 494 495
247 이소아밀 4-HO-벤질 메틸 (4-Br-페닐)아미노 542 543
248 이소아밀 4-HO-벤질 메틸 (4-CF3-페닐)아미노 532 533
249 이소아밀 4-HO-벤질 메틸 펜틸아미노 458 459
250 이소아밀 4-HO-벤질 메틸 (2-페닐에틸) 아미노 492 493
251 이소아밀 4-HO-벤질 메틸 (4-MeO-벤질)아미노 508 509
252 이소아밀 4-HO-벤질 메틸 시클로헥실아미노 470 471
253 이소아밀 4-HO-벤질 메틸 (4-Me-페닐)아미노 554 555
254 이소아밀 4-HO-벤질 메틸 (4-Cl-페닐)아미노 574 575
255 이소아밀 4-HO-벤질 메틸 페닐아미노 540 541
256 이소아밀 4-HO-벤질 메틸 ((R)-α-메틸벤질)아미노 568 569
257 이소아밀 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 554 555
258 이소아밀 4-HO-벤질 메틸 (4-MeO-페닐)아미노 570 571
259 이소아밀 4-HO-벤질 메틸 (4-Br-페닐)아미노 619 620
260 이소아밀 4-HO-벤질 메틸 (4-CF3-페닐)아미노 608 609
261 이소아밀 4-HO-벤질 메틸 펜틸아미노 534 535
262 이소아밀 4-HO-벤질 메틸 (2-페닐에틸) 아미노 568 569
263 이소아밀 4-HO-벤질 메틸 (4-MeO-벤질)아미노 584 585
264 이소아밀 4-HO-벤질 메틸 시클로헥실아미노 546 547
265 4-메틸벤질 3,4-Cl2-벤질 메틸 (4-Me-페닐)아미노 526 527
266 4-메틸벤질 3,4-Cl2-벤질 메틸 (4-Cl-페닐)아미노 546 547
267 4-메틸벤질 3,4-Cl2-벤질 메틸 페닐아미노 512 513
268 4-메틸벤질 3,4-Cl2-벤질 메틸 ((R)-α-메틸벤질)아미노 540 541
269 4-메틸벤질 3,4-Cl2-벤질 메틸 벤질아미노 526 527
270 4-메틸벤질 3,4-Cl2-벤질 메틸 (4-MeO-페닐)아미노 542 543
271 4-메틸벤질 3,4-Cl2-벤질 메틸 (4-Br-페닐)아미노 591 592
272 4-메틸벤질 3,4-Cl2-벤질 메틸 (4-CF3-페닐)아미노 580 581
273 4-메틸벤질 3,4-Cl2-벤질 메틸 펜틸아미노 506 507
274 4-메틸벤질 3,4-Cl2-벤질 메틸 (2-페닐에틸) 아미노 540 541
275 4-메틸벤질 3,4-Cl2-벤질 메틸 (4-MeO-벤질)아미노 556 557
276 4-메틸벤질 3,4-Cl2-벤질 메틸 시클로헥실아미노 518 519
277 4-메틸벤질 3,4-Cl2-벤질 메틸 (4-Me-페닐)아미노 602 603
278 4-메틸벤질 3,4-Cl2-벤질 메틸 (4-Cl-페닐)아미노 622 623
279 4-메틸벤질 3,4-Cl2-벤질 메틸 페닐아미노 588 589
280 4-메틸벤질 3,4-Cl2-벤질 메틸 ((R)-α-메틸벤질)아미노 616 617
281 4-메틸벤질 3,4-Cl2-벤질 메틸 벤질아미노 602 603
282 4-메틸벤질 3,4-Cl2-벤질 메틸 (4-MeO-페닐)아미노 618 619
283 4-메틸벤질 3,4-Cl2-벤질 메틸 (4-Br-페닐)아미노 667 668
284 4-메틸벤질 3,4-Cl2-벤질 메틸 (4-CF3-페닐)아미노 656 657
285 4-메틸벤질 3,4-Cl2-벤질 메틸 펜틸아미노 582 583
286 4-메틸벤질 3,4-Cl2-벤질 메틸 (2-페닐에틸)아미노 616 617
287 4-메틸벤질 3,4-Cl2-벤질 메틸 (4-MeO-벤질)아미노 632 633
288 4-메틸벤질 3,4-Cl2-벤질 메틸 시클로헥실아미노 594 595
289 나프트-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 (N-Cbz-3-인돌에틸)아미노 751 752
290 나프트-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 (나프트-2-일메틸)아미노 614 615
291 나프트-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 (2-페닐에틸)아미노 578 579
292 나프트-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 [2-(4-MeO-페닐)에틸]아미노 608 609
293 나프트-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 (3-CF3-벤질)아미노 632 633
294 나프트-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 (4-MeO-벤질)아미노 594 595
295 나프트-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 (4-F-페닐에틸)아미노 596 597
296 나프트-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 (3,4-Cl2-벤질)아미노 633 634
297 나프트-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 (2-HO-에틸)아미노 518 519
298 나프트-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 (3-MeO-프로필)아미노 546 547
299 나프트-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 (테트라히드로퓨란-2-일메틸)아미노 558 559
300 나프트-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 (시클로헥실메틸)아미노 570 571
301 나프트-1-일메틸 4-HO-벤질 프로필 (N-Cbz-3-인돌에틸)아미노 779 780
302 나프트-1-일메틸 4-HO-벤질 프로필 (나프트-2-일메틸)아미노 642 643
303 나프트-1-일메틸 4-HO-벤질 프로필 (2-페닐에틸)아미노 606 607
304 나프트-1-일메틸 4-HO-벤질 프로필 [2-(4-MeO-페닐)에틸]아미노 636 637
305 나프트-1-일메틸 4-HO-벤질 프로필 (3-CF3-벤질)아미노 660 661
306 나프트-1-일메틸 4-HO-벤질 프로필 (4-MeO-벤질)아미노 622 623
307 나프트-1-일메틸 4-HO-벤질 프로필 (4-F-페닐에틸)아미노 624 625
308 나프트-1-일메틸 4-HO-벤질 프로필 (3,4-Cl2-벤질)아미노 661 662
309 나프트-1-일메틸 4-HO-벤질 프로필 (2-HO-에틸)아미노 546 547
310 나프트-1-일메틸 4-HO-벤질 프로필 (3-MeO-프로필)아미노 574 575
311 나프트-1-일메틸 4-HO-벤질 프로필 (테트라히드로퓨란-2-일메틸)아미노 586 587
312 나프트-1-일메틸 4-HO-벤질 프로필 (시클로헥실메틸)아미노 598 599
313 나프트-1-일메틸 3,4-F2-벤질 메틸 (N-Cbz-3-인돌에틸)아미노 771 772
314 나프트-1-일메틸 3,4-F2-벤질 메틸 (나프트-2-일메틸)아미노 634 635
315 나프트-1-일메틸 3,4-F2-벤질 메틸 (2-페닐에틸)아미노 598 599
316 나프트-1-일메틸 3,4-F2-벤질 메틸 [2-(4-MeO-페닐)에틸]아미노 628 629
317 나프트-1-일메틸 3,4-F2-벤질 메틸 (3-CF3-벤질)아미노 652 653
318 나프트-1-일메틸 3,4-F2-벤질 메틸 (4-MeO-벤질)아미노 614 615
319 나프트-1-일메틸 3,4-F2-벤질 메틸 (4-F-페닐에틸)아미노 616 617
320 나프트-1-일메틸 3,4-F2-벤질 메틸 (3,4-Cl2-벤질)아미노 653 654
321 나프트-1-일메틸 3,4-F2-벤질 메틸 (2-HO-에틸)아미노 538 539
322 나프트-1-일메틸 3,4-F2-벤질 메틸 (3-MeO-프로필)아미노 566 567
323 나프트-1-일메틸 3,4-F2-벤질 메틸 (테트라히드로퓨란-2-일메틸)아미노 578 579
324 나프트-1-일메틸 3,4-F2-벤질 메틸 (시클로헥실메틸)아미노 590 591
325 나프트-1-일메틸 3,4-F2-벤질 프로필 (N-Cbz-3-인돌에틸)아미노 799 800
326 나프트-1-일메틸 3,4-F2-벤질 프로필 (나프트-2-일메틸)아미노 662 663
327 나프트-1-일메틸 3,4-F2-벤질 프로필 (2-페닐에틸)아미노 626 627
328 나프트-1-일메틸 3,4-F2-벤질 프로필 [2-(4-MeO-페닐)에틸]아미노 656 657
329 나프트-1-일메틸 3,4-F2-벤질 프로필 (3-CF3-벤질)아미노 680 681
330 나프트-1-일메틸 3,4-F2-벤질 프로필 (4-MeO-벤질)아미노 642 643
331 나프트-1-일메틸 3,4-F2-벤질 프로필 (4-F-페닐에틸)아미노 644 645
332 나프트-1-일메틸 3,4-F2-벤질 프로필 (3,4-Cl2-벤질)아미노 681 682
333 나프트-1-일메틸 3,4-F2-벤질 프로필 (2-HO-에틸)아미노 566 567
334 나프트-1-일메틸 3,4-F2-벤질 프로필 (3-MeO-프로필)아미노 594 595
335 나프트-1-일메틸 3,4-F2-벤질 프로필 (테트라히드로퓨란-2-일메틸)아미노 606 607
336 나프트-1-일메틸 3,4-F2-벤질 프로필 (시클로헥실메틸)아미노 618 619
337 나프트-1-일메틸 4-비페닐일-메틸 메틸 (N-Cbz-3-인돌에틸)아미노 811 812
338 나프트-1-일메틸 4-비페닐일메틸 메틸 (나프트-2-일메틸)아미노 674 675
339 나프트-1-일메틸 4-비페닐일메틸 메틸 (2-페닐에틸)아미노 638 639
340 나프트-1-일메틸 4-비페닐일메틸 메틸 [2-(4-MeO-페닐)에틸]아미노 668 669
341 나프트-1-일메틸 4-비페닐일메틸 메틸 (3-CF3-벤질)아미노 692 693
342 나프트-1-일메틸 4-비페닐일메틸 메틸 (4-MeO-벤질)아미노 654 655
343 나프트-1-일메틸 4-비페닐일메틸 메틸 (4-F-페닐에틸)아미노 656 657
344 나프트-1-일메틸 4-비페닐일메틸 메틸 (3,4-Cl2-벤질)아미노 693 694
345 나프트-1-일메틸 4-비페닐일메틸 메틸 (2-HO-에틸)아미노 578 579
346 나프트-1-일메틸 4-비페닐일메틸 메틸 (3-MeO-프로필)아미노 606 607
347 나프트-1-일메틸 4-비페닐일메틸 메틸 (테트라히드로퓨란-2-일메틸)아미노 618 619
348 나프트-1-일메틸 4-비페닐일메틸 메틸 (시클로헥실메틸)아미노 630 631
349 나프트-1-일메틸 4-비페닐일메틸 프로필 (N-Cbz-3-인돌에틸)아미노 839 840
350 나프트-1-일메틸 4-비페닐일메틸 프로필 (나프트-2-일메틸)아미노 702 703
351 나프트-1-일메틸 4-비페닐일메틸 프로필 (2-페닐에틸)아미노 666 667
352 나프트-1-일메틸 4-비페닐일메틸 프로필 [2-(4-MeO-페닐)에틸]아미노 696 697
353 나프트-1-일메틸 4-비페닐일메틸 프로필 (3-CF3-벤질)아미노 720 721
354 나프트-1-일메틸 4-비페닐일메틸 프로필 (4-MeO-벤질)아미노 682 683
355 나프트-1-일메틸 4-비페닐일메틸 프로필 (4-F-페닐에틸)아미노 684 685
356 나프트-1-일메틸 4-비페닐일메틸 프로필 (3,4-Cl2-벤질)아미노 721 722
357 나프트-1-일메틸 4-비페닐일메틸 프로필 (2-HO-에틸)아미노 606 607
358 나프트-1-일메틸 4-비페닐일메틸 프로필 (3-MeO-프로필)아미노 634 635
359 나프트-1-일메틸 4-비페닐일메틸 프로필 (테트라히드로퓨란-2-일메틸)아미노 646 647
360 나프트-1-일메틸 4-비페닐일메틸 프로필 (시클로헥실메틸)아미노 658 659
361 나프트-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 메틸 (N-Cbz-3-인돌에틸)아미노 807 808
362 나프트-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 메틸 (나프트-2-일메틸)아미노 670 671
363 나프트-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 메틸 (2-페닐에틸)아미노 634 635
364 나프트-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 메틸 [2-(4-MeO-페닐)에틸]아미노 664 665
365 나프트-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 메틸 (3-CF3-벤질)아미노 688 689
366 나프트-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 메틸 (4-MeO-벤질)아미노 650 651
367 나프트-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 메틸 (4-F-페닐에틸)아미노 652 653
368 나프트-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 메틸 (3,4-Cl2-벤질)아미노 689 690
369 나프트-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 메틸 (2-HO-에틸)아미노 574 575
370 나프트-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 메틸 (3-MeO-프로필)아미노 602 603
371 나프트-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 메틸 (테트라히드로퓨란-2-일메틸)아미노 614 615
372 나프트-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 메틸 (시클로헥실메틸)아미노 626 627
373 나프트-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 프로필 (N-Cbz-3-인돌에틸)아미노 835 836
374 나프트-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 프로필 (나프트-2-일메틸)아미노 698 699
375 나프트-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 프로필 (2-페닐에틸)아미노 662 663
376 나프트-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 프로필 [2-(4-MeO-페닐)에틸]아미노 692 693
377 나프트-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 프로필 (3-CF3-벤질)아미노 716 717
378 나프트-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 프로필 (4-MeO-벤질)아미노 678 679
379 나프트-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 프로필 (4-F-페닐에틸)아미노 680 681
380 나프트-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 프로필 (3,4-Cl2-벤질)아미노 717 718
381 나프트-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 프로필 (2-HO-에틸)아미노 602 603
382 나프트-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 프로필 (3-MeO-프로필)아미노 630 631
383 나프트-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 프로필 (테트라히드로퓨란-2-일메틸)아미노 642 643
384 나프트-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 프로필 (시클로헥실메틸)아미노 654 655
385 4-메톡시벤질 OCH3 5-F-벤질 OCH3 470 471
386 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 스티릴메틸 OCH3 591 592
387 나프틸-1-일메틸 4-NO2-벤질 스티릴메틸 OCH3 620 621
388 나프틸-1-일메틸 3,4-F2-벤질 스티릴메틸 OCH3 611 612
389 나프틸-1-일메틸 4-Cl-벤질 스티릴메틸 OCH3 609 610
390 나프틸-1-일메틸 4-페닐-벤질 스티릴메틸 OCH3 651 652
391 나프틸-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 스티릴메틸 OCH3 647 648
392 나프틸-1-일메틸 4-메틸-벤질 스티릴메틸 OCH3 589 590
393 나프틸-1-일메틸 시클로헥실메틸 스티릴메틸 OCH3 581 582
394 나프틸-1-일메틸 4-F-벤질 스티릴메틸 OCH3 593 594
395 나프틸-1-일메틸 2-Cl-벤질 스티릴메틸 OCH3 609 610
396 나프틸-1-일메틸 3,4-Cl2-벤질 스티릴메틸 OCH3 644 645
397 나프틸-1-일메틸 나프틸-1-일메틸 스티릴메틸 OCH3 625 626
398 3,4-Cl2-벤질 4-HO-벤질 스티릴메틸 OCH3 610 611
399 3,4-Cl2-벤질 4-NO2-벤질 스티릴메틸 OCH3 639 640
400 3,4-Cl2-벤질 3,4-F2-벤질 스티릴메틸 OCH3 629 630
401 3,4-Cl2-벤질 4-Cl-벤질 스티릴메틸 OCH3 628 629
402 3,4-Cl2-벤질 4-페닐-벤질 스티릴메틸 OCH3 670 671
403 3,4-Cl2-벤질 3-t-Bu-4-HO-벤질 스티릴메틸 OCH3 666 667
404 3,4-Cl2-벤질 4-메틸-벤질 스티릴메틸 OCH3 608 609
405 3,4-Cl2-벤질 시클로헥실메틸 스티릴메틸 OCH3 600 601
406 3,4-Cl2-벤질 4-F-벤질 스티릴메틸 OCH3 611 612
407 3,4-Cl2-벤질 2-Cl-벤질 스티릴메틸 OCH3 628 629
408 3,4-Cl2-벤질 3,4-Cl2-벤질 스티릴메틸 OCH3 662 663
409 3,4-Cl2-벤질 나프틸-1-일메틸 스티릴메틸 OCH3 644 645
410 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 634 635
411 나프틸-1-일메틸 4-NO2-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 663 664
412 나프틸-1-일메틸 3,4-F2-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 654 655
413 나프틸-1-일메틸 4-Cl-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 652 653
414 나프틸-1-일메틸 4-페닐-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 694 695
415 나프틸-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 690 691
416 나프틸-1-일메틸 4-메틸-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 632 633
417 나프틸-1-일메틸 시클로헥실메틸 2,6-Cl2-벤질 OCH3 624 625
418 나프틸-1-일메틸 4-F-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 636 637
419 나프틸-1-일메틸 2-Cl-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 652 653
420 나프틸-1-일메틸 3,4-Cl2-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 686 687
421 나프틸-1-일메틸 나프틸-1-일메틸 2,6-Cl2-벤질 OCH3 668 669
422 3,4-Cl2 -벤질 4-HO-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 652 653
423 3,4-Cl2 -벤질 4-NO2-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 681 682
424 3,4-Cl2 -벤질 3,4-F2-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 672 673
425 3,4-Cl2 -벤질 4-Cl-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 671 672
426 3,4-Cl2 -벤질 4-페닐-벤질 2,6-Cl2 -벤질 OCH3 712 713
427 3,4-Cl2 -벤질 3-t-Bu-4-HO-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 708 709
428 3,4-Cl2 -벤질 4-메틸-벤질 2,6-Cl2 -벤질 OCH3 650 651
429 3,4-Cl2 -벤질 시클로헥실메틸 2,6-Cl2-벤질 OCH3 642 643
430 3,4-Cl2 -벤질 4-F-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 654 655
431 3,4-Cl2 -벤질 2-Cl-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 671 672
432 3,4-Cl2 -벤질 3,4-Cl2-벤질 2,6-Cl2-벤질 OCH3 705 706
433 3,4-Cl2 -벤질 나프틸-1-일메틸 2,6-Cl2-벤질 OCH3 686 687
434 2-피페리딘-1-일-에틸 (S)-4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 535 536
435 3,4-Cl2 -벤질 (S)-4-HO-벤질 메틸 2-피페리딘-1-일-에틸아미노 604 605
436 3,4-Cl2 -벤질 (S)-4-HO-벤질 메틸 2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸아미노 604 605
437 3-피리딜메틸 (S)-4-HO-벤질 메틸 3,4-Cl2 -벤질아미노 583 584
438 2-모르폴린-4-일-에틸 (S)-4-HO-벤질 메틸 3,4-Cl2 -벤질아미노 606 607
439 3,4-Cl2 -벤질 (S)-4-HO-벤질 메틸 3-피리딜메틸아미노 583 584
440 3,4-Cl2 -벤질 (S)-4-HO-벤질 메틸 2-모르폴린-4-일-에틸아미노 606 607
441 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 3-이미다졸-1-일-프로필아미노 582 583
442 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 4-아미노펜에틸아미노 593 594
443 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 3-피리딜메틸아미노 565 566
444 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 2-(3-피리딜에틸)아미노 579 580
445 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 4-피리딜메틸아미노 565 566
446 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 벤질옥시카르보닐아미노 622 623
447 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 4-F-벤질아미노 582 583
448 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 4-CO2H-벤질아미노 608 609
449 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 4-CF3 -벤질아미노 632 633
450 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 (S)-알파-메틸벤질아미노 578 579
451 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 (R)-알파-메틸벤질아미노 578 579
452 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 2-F-벤질아미노 582 583
453 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 2,3-디메톡시벤질아미노 624 625
454 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 시아노메틸아미노 513 514
455 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 페닐히드라지노 565 566
456 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 4-아미노벤질아미노 579 580
457 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 (S,S) {2-[(2-히드록시-1-메틸-2-페닐-에틸)-메틸-카르바모일]-에틸}-아미노 693 694
458 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 [4-(1,3-디옥소-1,3-디히드로- 이소인돌-2-일메틸)-시클로헥실]-메틸아미노 715 716
459 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 인단-1-일아미노 590 591
460 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 페닐글라이신 622 623
461 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 2,6-F2-벤질아미노 600 601
462 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 3-F-벤질아미노 582 583
463 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 벤즈이미다졸-2-일-아미노 604 605
464 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 디페닐메틸아미노 640 641
465 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 퓨란-2-일-메틸아미노 554 555
466 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 4-디메틸아미노-벤질아미노 607 608
467 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 티오퓨란-2-일-메틸아미노 584 585
468 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 4-NO2 -벤질아미노 609 610
469 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 BnO 565 566
470 4-메톡시-나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 594 595
471 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 펜에틸 563 564
472 나프틸-1-일메틸 4-메톡시-벤질 메틸 벤질아미노 578 579
473 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 4-CF3-페닐아미노 618 619
474 나프틸-1-일메틸 4-NO2 -벤질 메틸 4-CF3-페닐아미노 647 648
475 나프틸-1-일메틸 4-NO2 -벤질 메틸 벤질아미노 593 594
476 벤질 나프틸-1-일메틸 4-CN-벤질 OCH3 574 575
477 티오퓨란-2-일-메틸 나프틸-1-일메틸 4-CN-벤질 OCH3 594 595
478 4-디메틸아미노-벤질 나프틸-1-일메틸 4-CN-벤질 OCH3 617 618
479 펜에틸 나프틸-1-일메틸 4-CN-벤질 OCH3 588 589
480 8-퀴놀린-1일-메틸 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 565 566
481 4-피리딜메틸 나프틸-1-일메틸 벤질 OCH3 550 551
482 3,4-디메톡시벤질 나프틸-1-일메틸 벤질 OCH3 609 610
483 3,4-디메톡시-펜에틸 나프틸-1-일메틸 벤질 OCH3 623 624
484 티오퓨란-2-일-메틸 나프틸-1-일메틸 벤질 OCH3 569 570
485 나프틸-1-일메틸 3-피리딜메틸 메틸 벤질아미노 549 550
486 나프틸-1-일메틸 펜타플루오로벤질 메틸 벤질아미노 638 639
487 나프틸-1-일메틸 3-F-4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 582 583
488 4-F-펜에틸 4-메틸-벤질 메틸 4-CF3-페닐아미노 598 599
489 4-메톡시펜에틸 4-메틸-벤질 메틸 4-CF3-페닐아미노 610 611
490 3,4-디메톡시-펜에틸 4-메틸-벤질 메틸 4-CF3-페닐아미노 640 641
491 나프틸-1-일메틸 4-메틸-벤질 메틸 4-CF3-페닐아미노 616 617
492 3,4-디메톡시벤질 나프틸-1-일메틸 4-CN-벤질 OCH3 634 635
493 3,4-디메톡시-펜에틸 나프틸-1-일메틸 4-CN-벤질 OCH3 648 649
494 4-퀴놀린-1일-메틸 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 565 566
495 2-피리딜메틸 4-메틸-벤질 메틸 4-CF3-페닐아미노 567 568
496 3-피리딜메틸 4-메틸-벤질 메틸 4-CF3-페닐아미노 567 568
497 3,4-디메톡시벤질 4-메틸-벤질 메틸 4-CF3-페닐아미노 626 627
498 4-메틸-벤질 4-메틸-벤질 메틸 4-CF3-페닐아미노 580 581
499 티오퓨란-2-일-메틸 4-메틸-벤질 메틸 4-CF3-페닐아미노 572 573
500 4-CF3 -벤질 4-메틸-벤질 메틸 4-CF3-페닐아미노 634 635
501 2,6-F2-벤질 4-메틸-벤질 메틸 4-CF3-페닐아미노 602 603
502 4-F-벤질 4-메틸-벤질 메틸 4-CF3-페닐아미노 584 585
503 티오퓨란-2-일-에틸 4-메틸-벤질 메틸 4-CF3-페닐아미노 586 587
504 3,4-Cl2 -벤질 4-메틸-벤질 메틸 4-CF3-페닐아미노 634 635
505 4-CO2H-벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 558 559
506 나프틸-1-일메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 620 621
507 나프틸-1-일메틸 3,4-(OH)2-벤질 메틸 벤질아미노 580 581
508 2-F-벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 532 533
509 3-F-벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 532 533
510 4-F-벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 532 533
511 2,4-F2-벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 550 551
512 2,6-F2-벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 550 551
513 2,5-F2-벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 550 551
514 3-CF3 -벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 582 583
515 4-CF3 -벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 582 583
516 3,4,5-F3-벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 568 569
517 2-Cl-벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 548 549
518 3-Cl-벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 548 549
519 2,4-Cl2 -벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 582 583
520 (S)-메틸페닐 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 528 529
521 (R)-메틸페닐 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 528 529
522 4-메틸-벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 528 529
523 4-메톡시벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 544 545
524 3,4-디메톡시벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 574 575
525 퓨란-2-일-메틸아미노 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 504 505
526 (R)-메틸나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 578 579
527 (S)-메틸나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 578 579
528 나프틸-1-일메틸 3-옥시-피리딘-1-일메틸 메틸 벤질아미노 565 566
529 (R)-알파-메틸벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 578 579
530 나프틸-2-일메틸 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 564 565
531 4-F-나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 582 583
532 2-메톡시벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 544 545
533 4-Cl-벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 548 549
534 3,4-Cl2-벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 582 583
535 2-CF3O벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 598 599
536 2-CF3S벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 614 615
537 2-CF3벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 582 583
538 5-퀴놀린-1일-메틸 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 565 566
539 8-퀴놀린-1일-메틸 3-t-Bu-4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 621 622
540 8-퀴놀린-1일-메틸 4-NO2 -벤질 메틸 벤질아미노 594 595
541 8-퀴놀린-1일-메틸 (1H-피롤-2-일)-메틸 메틸 벤질아미노 538 539
542 나프틸-1-일메틸 4-벤질옥시-카르보닐아미노벤질 메틸 벤질아미노 697 698
543 2,3-Cl2 -벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 582 583
544 펜타플루오로벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 604 605
545 벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 514 515
546 퀴녹살린-5일-메틸 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 566 567
547 8-퀴놀린-1일-메틸 3-피리딜메틸 메틸 벤질아미노 550 551
548 8-퀴놀린-1일-메틸 펜타플루오로벤질 메틸 벤질아미노 639 640
549 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노(티오우레아) 580 581
550 나프틸-1-일메틸 4-아미노-벤질 메틸 벤질아미노 563 564
551 3,4,5-트리-메톡시벤질 4-아미노-벤질 메틸 벤질아미노 603 604
552 나프틸-1-일메틸 4-피리딜메틸 메틸 벤질아미노 549 550
553 나프틸-1-일메틸 (R) 4-HO-페닐 메틸 벤질아미노 550 551
554 2-HO-3-메톡시-벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 560 561
555 나프틸-1-일메틸 3-니트로-4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 609 610
556 나프틸-1-일메틸 4-CO2H-CH2O-벤질 메틸 벤질아미노 622 623
557 나프틸-1-일메틸 1-나프토일아미노-메틸 메틸 벤질아미노 641 642
558 나프틸-1-일메틸 4-옥시-피리딜메틸 메틸 벤질아미노 565 566
559 4-F-알파-메틸벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 546 547
560 나프틸-1-일메틸 벤조일아미노에틸 메틸 벤질아미노 605 606
561 8-퀴놀린-1일-메틸 3,4-(OH)2-벤질 메틸 벤질아미노 581 582
562 4-N,N-디메틸아미노-벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 557 558
563 나프틸-1-일메틸 (R) 4-F-벤질 메틸 벤질아미노 609 610
564 나프틸-1-일메틸 4-HO-벤질 메틸 2-클로로에틸아미노 536 537
565 나프틸-1-일메틸 4-HO-펜에틸 메틸 벤질아미노 578 579
566 4-F-벤질 3-F,4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 550 551
567 2,4-F2-벤질 3-F,4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 568 569
568 3-CF3벤질 (R) 4-HO-페닐 메틸 벤질아미노 568 569
569 (S)-메틸나프틸-1-일메틸 (R) 4-HO-페닐 메틸 벤질아미노 514 515
570 (R)-메틸나프틸-1-일메틸 (R) 4-HO-페닐 메틸 벤질아미노 514 515
571 2,3,6-F3-벤질 (R) 4-HO-페닐 메틸 벤질아미노 554 555
572 3-F-벤질 (R) 4-HO-페닐 메틸 벤질아미노 518 519
573 4-Cl-벤질 (R) 4-HO-페닐 메틸 벤질아미노 534 535
574 3-Cl-벤질 (R) 4-HO-페닐 메틸 벤질아미노 534 535
575 2-Cl-벤질 (R) 4-HO-페닐 메틸 벤질아미노 534 535
576 3,4-Cl2 -벤질 (R) 4-HO-페닐 메틸 벤질아미노 568 569
577 3-CF3O-벤질 (R) 4-HO-페닐 메틸 벤질아미노 584 585
578 4-F-벤질 (R) 4-HO-페닐 메틸 벤질아미노 518 519
579 2,4-F2-벤질 (R) 4-HO-페닐 메틸 벤질아미노 536 537
580 3-(2-클로로-에틸)-우레이도]-벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 634 635
581 3-아미노벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 529 530
582 3-N-메틸아미노벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 543 544
583 3-N,N-디메틸아미노벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 557 558
584 1H-벤조이미다졸-4-일메틸 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 554 555
585 2-HO-벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 530 531
586 2-피리딜메틸 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 515 516
587 4-피리딜메틸 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 515 516
588 8-퀴놀린-2-일메틸 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 565 566
589 8-벤조퓨란-4-일메틸 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 554 555
590 나프틸-1-일메틸 4-HO-페닐 메틸 벤질아미노 550 551
591 4-F-벤질 4-HO-페닐 메틸 벤질아미노 518 519
592 2,4-F2-벤질 4-HO-페닐 메틸 벤질아미노 536 537
593 (R)-톨루일메틸 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 542 543
594 (S)-톨루일메틸 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 542 543
595 1,2,3,4-테트라히드로-나프탈렌-2-일 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 554 555
596 나프틸-1-일메틸 3,4-디메톡시벤질 메틸 벤질아미노 608 609
597 2-디메틸아미노-6-F-벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 575 576
598 2-디메틸아미노벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 557 558
599 나프틸-1-일메틸 4-CN-벤질 메틸 벤질아미노 573 574
600 4-F-2-CF3 -벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 599 600
601 4-Cl-2-디메틸아미노벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 591 592
602 3-N,N-에틸메틸l아미노-벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 571 572
603 3-디에틸아미노벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 585 586
604 4-Cl-3-디메틸아미노벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 591 592
605 4-F-2-디메틸아미노벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 575 576
606 3,5-(CH3)2-2-디메틸아미노-벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 585 586
607 3-(CH3)-2-디메틸아미노벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 571 572
608 6-(CH3)-2-디메틸아미노벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 571 572
609 3,4-F2-2-디메틸아미노벤질 4-HO-벤질 메틸 벤질아미노 593 594
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또한, 본 발명의 라이브러리의 펩티드 유사체의 합성은 하기와 같은 [4,3,0] 리버스-턴 유사체 라이브러리의 개략스킴을 이용하여 성취될 수 있다.
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본 발명의 바이사이클릭 템플레이트 라이브러리의 펩티드 유사체의 합성은 공지된 기술인 96웰 플레이트를 갖는 플렉스켐 반응조 블록(FlexChem Reactor Block)을 사용하여 수행되었다. 상기 과정에서 "Pol"은 브로모아세탈 수지(Advanced ChemTech 사)를 나타내며 또한 상세한 과정이 아래에 예시되어 있다.
제1 단계
브로모아세탈 수지 (1.6 mmol/g)와 DMSO(2M 용액)내의 R1-아민 용액을 96개의 웰 판을 갖는 로빈스 블록(Robbins block; FlexChem)에 넣었다. 반응 혼합물은 회전식 오븐[Robbins Scientific]을 사용하여 12시간 동안 약 60℃에서 흔들었다. 수지는 DMF, MeOH로 세척한 후 DMC로 세척하였다.
제2 단계
상업적으로 시판중인 DMF에 FmocAmino Acids(4당량), PyBob(4당량), HOAt(4당량), 그리고 DIEA (12당량)을 녹인 용액을 수지에 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 12시간 동안 흔든 후 수지를 DMF, MeOH로 세척한 후 DCM으로 세척하였다.
제 3 단계
반응 전에 DMF에 의해 팽윤된 수지에 DMF 속의 25% 피페리딘을 첨가하고 반응 혼합물을 상온에서 30분 동안 흔들었다. 이러한 탈보호(deprotection) 단계를 다시 반복하고 수지는 DMF, 메탄올로 세척한 후 DCM으로 세척하였다. DMF중에 히드라진 카르바모일 클로라이드 (4당량), HOBt(4당량), 그리고 DIC(4당량)을 녹인 용액을 수지에 첨가하고 반응 혼합물을 상온에서 약 12시간 동안 흔들었다. 수지는 DMF, MeOH로 세척한 후 DCM으로 세척하였다.
제 4 단계
반응 전에 DMF에 의해 팽윤된 수지에 DMF내의 25% 피페리딘을 첨가하고, 반응혼합물을 상온에서 약 30분 동안 흔들었다. 이러한 탈보호 과정을 다시 반복하고 수지는 DMF, 메탄올로 세척한 후 DCM으로 세척하였다. 반응 전에 DCM에 의해서 팽윤된 수지에 DCM중의 R1-이소시아네이트(5 당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 약 12시간 동안 흔든 후, 수지를 DMF, MeOH로 세척한 후 DCM으로 세척하였다.
제 5 단계
수지를 상온에서 18시간 동안 포름산으로 처리하였다 (각 웰마다 1.2ml씩). 수지를 여과에 의하여 제거한 후, 여과액은 생성물을 오일의 형태로 얻기 위해 스피드 백(SpeedVac, SAVANT)을 사용하여 감압 하에 농축하였다. 생성물은 50%의 물/아세토니트릴로 희석한 다음 동결 후에 동결 건조시켰다.
표 3은 본 발명에 따라 제조될 수 있는 [4,3,0] 리버스-턴 유사체 라이브러리를 보여준다. 이것의 대표적인 제조예는 실시예 5에 기술하였다.
표3. [4,3,0] 리버스-턴 유사체 라이브러리
Figure 112006074580183-PCT00277
번호 R1 R4 R6 R1 분자량 M+H
610 이소아밀 4-HO-페닐 메틸 페닐 466 467
611 이소아밀 4-HO-페닐 메틸 4-Me-페닐 480 481
612 이소아밀 4-HO-페닐 메틸 3,5-Me2-페닐 494 495
613 이소아밀 4-HO-페닐 메틸 4-MeO-페닐 496 497
614 이소아밀 4-HO-페닐 메틸 4-CF3-페닐 534 535
615 이소아밀 4-HO-페닐 메틸 시클로헥실 472 473
616 이소아밀 4-HO-페닐 메틸 벤질 480 481
617 이소아밀 4-HO-페닐 메틸
Figure 112006074580183-PCT00278
 494 495
618 이소아밀 4-HO-페닐 메틸 4-MeO-벤질 510 511
619 이소아밀 4-HO-페닐 메틸 펜에틸 494 495
620 이소아밀 4-HO-페닐 메틸 펜틸 460 461
621 이소아밀 4-HO-페닐 메틸 헥실 474 475
622 벤질 4-HO-페닐 메틸 페닐 486 487
623 벤질 4-HO-페닐 메틸 4-Me-페닐 500 501
624 벤질 4-HO-페닐 메틸 3,5-Me2-페닐 514 515
625 벤질 4-HO-페닐 메틸 4-MeO-페닐 516 517
626 벤질 4-HO-페닐 메틸 4-CF3-페닐 554 555
627 벤질 4-HO-페닐 메틸 시클로헥실 492 493
628 벤질 4-HO-페닐 메틸 벤질 500 501
629 벤질 4-HO-페닐 메틸
Figure 112006074580183-PCT00279
 514 515
630 벤질 4-HO-페닐 메틸 4-MeO-벤질 530 531
631 벤질 4-HO-페닐 메틸 펜에틸 514 515
632 벤질 4-HO-페닐 메틸 펜틸 480 481
633 벤질 4-HO-페닐 메틸 헥실 494 495
634 나프트-1-일메틸 4-HO-페닐 메틸 페닐 536 537
635 나프트-1-일메틸 4-HO-페닐 메틸 4-Me-페닐 550 551
636 나프트-1-일메틸 4-HO-페닐 메틸 3,5-Me2-페닐 564 565
637 나프트-1-일메틸 4-HO-페닐 메틸 4-MeO-페닐 566 567
638 나프트-1-일메틸 4-HO-페닐 메틸 4-CF3-페닐 604 605
639 나프트-1-일메틸 4-HO-페닐 메틸 시클로헥실 542 543
640 나프트-1-일메틸 4-HO-페닐 메틸 벤질 550 551
641 나프트-1-일메틸 4-HO-페닐 메틸
Figure 112006074580183-PCT00280
 564 565
642 나프트-1-일메틸 4-HO-페닐 메틸 4-MeO-벤질 580 581
643 나프트-1-일메틸 4-HO-페닐 메틸 펜에틸 564 565
644 나프트-1-일메틸 4-HO-페닐 메틸 펜틸 530 531
645 나프트-1-일메틸 4-HO-페닐 메틸 헥실 544 545
646 시클로헥실메틸 4-HO-페닐 메틸 페닐 492 493
647 시클로헥실메틸 4-HO-페닐 메틸 4-Me-페닐 506 507
648 시클로헥실메틸 4-HO-페닐 메틸 3,5-Me2-페닐 520 521
649 시클로헥실메틸 4-HO-페닐 메틸 4-MeO-페닐 522 523
650 시클로헥실메틸 4-HO-페닐 메틸 4-CF3-페닐 560 561
651 시클로헥실메틸 4-HO-페닐 메틸 시클로헥실 468 469
652 시클로헥실메틸 4-HO-페닐 메틸 벤질 506 507
653 시클로헥실메틸 4-HO-페닐 메틸
Figure 112006074580183-PCT00281
 520 521
654 시클로헥실메틸 4-HO-페닐 메틸 4-MeO-벤질 536 537
655 시클로헥실메틸 4-HO-페닐 메틸 펜에틸 520 521
656 시클로헥실메틸 4-HO-페닐 메틸 펜틸 486 487
657 시클로헥실메틸 4-HO-페닐 메틸 헥실 500 501
658 4-메틸벤질 4-HO-페닐 메틸 페닐 500 501
659 4-메틸벤질 4-HO-페닐 메틸 4-Me-페닐 514 515
660 4-메틸벤질 4-HO-페닐 메틸 3,5-Me2-페닐 528 529
661 4-메틸벤질 4-HO-페닐 메틸 4-MeO-페닐 530 531
662 4-메틸벤질 4-HO-페닐 메틸 4-CF3-페닐 568 569
663 4-메틸벤질 4-HO-페닐 메틸 시클로헥실 506 507
664 4-메틸벤질 4-HO-페닐 메틸 벤질 514 515
665 4-메틸벤질 4-HO-페닐 메틸
Figure 112006074580183-PCT00282
 528 529
666 4-메틸벤질 4-HO-페닐 메틸 4-MeO-벤질 544 545
667 4-메틸벤질 4-HO-페닐 메틸 펜에틸 528 529
668 4-메틸벤질 4-HO-페닐 메틸 펜틸 494 495
669 4-메틸벤질 4-HO-페닐 메틸 헥실 508 509
670 메톡시프로필 4-HO-페닐 메틸 페닐 468 469
671 메톡시프로필 4-HO-페닐 메틸 4-Me-페닐 482 483
672 메톡시프로필 4-HO-페닐 메틸 3,5-Me2-페닐 496 497
673 메톡시프로필 4-HO-페닐 메틸 4-MeO-페닐 498 499
674 메톡시프로필 4-HO-페닐 메틸 4-CF3-페닐 536 537
675 메톡시프로필 4-HO-페닐 메틸 시클로헥실 474 475
676 메톡시프로필 4-HO-페닐 메틸 벤질 482 483
677 메톡시프로필 4-HO-페닐 메틸
Figure 112006074580183-PCT00283
 496 497
678 메톡시프로필 4-HO-페닐 메틸 4-MeO-벤질 512 513
679 메톡시프로필 4-HO-페닐 메틸 펜에틸 496 497
680 메톡시프로필 4-HO-페닐 메틸 펜틸 462 463
681 메톡시프로필 4-HO-페닐 메틸 헥실 476 477
682 펜에틸 4-HO-페닐 메틸 페닐 500 501
683 펜에틸 4-HO-페닐 메틸 4-Me-페닐 514 515
684 펜에틸 4-HO-페닐 메틸 3,5-Me2-페닐 528 529
685 펜에틸 4-HO-페닐 메틸 4-MeO-페닐 530 531
686 펜에틸 4-HO-페닐 메틸 4-CF3-페닐 568 569
687 펜에틸 4-HO-페닐 메틸 시클로헥실 506 507
688 펜에틸 4-HO-페닐 메틸 벤질 514 515
689 펜에틸 4-HO-페닐 메틸
Figure 112006074580183-PCT00284
 528 529
690 펜에틸 4-HO-페닐 메틸 4-MeO-벤질 544 545
691 펜에틸 4-HO-페닐 메틸 펜에틸 528 529
692 펜에틸 4-HO-페닐 메틸 펜틸 494 495
693 펜에틸 4-HO-페닐 메틸 헥실 508 509
694 2,2-비스페닐에틸 4-HO-페닐 메틸 페닐 576 577
695 2,2-비스페닐에틸 4-HO-페닐 메틸 4-Me-페닐 590 591
696 2,2-비스페닐에틸 4-HO-페닐 메틸 3,5-Me2-페닐 604 605
697 2,2-비스페닐에틸 4-HO-페닐 메틸 4-MeO-페닐 606 607
698 2,2-비스페닐에틸 4-HO-페닐 메틸 4-CF3-페닐 644 645
699 2,2-비스페닐에틸 4-HO-페닐 메틸 시클로헥실 582 583
700 2,2-비스페닐에틸 4-HO-페닐 메틸 벤질 586 587
701 2,2-비스페닐에틸 4-HO-페닐 메틸
Figure 112006074580183-PCT00285
 604 605
702 2,2-비스페닐에틸 4-HO-페닐 메틸 4-MeO-벤질 620 621
703 2,2-비스페닐에틸 4-HO-페닐 메틸 펜에틸 604 605
704 2,2-비스페닐에틸 4-HO-페닐 메틸 펜틸 570 571
705 2,2-비스페닐에틸 4-HO-페닐 메틸 헥실 584 585
706 나프트-1-일메틸 벤질 메틸 페닐 520 521
707 나프트-1-일메틸 벤질 메틸 4-Me-페닐 534 535
708 나프트-1-일메틸 벤질 메틸 3,5-Me2-페닐 548 549
709 나프트-1-일메틸 벤질 메틸 4-MeO-페닐 550 551
710 나프트-1-일메틸 벤질 메틸 4-CF3-페닐 588 589
711 나프트-1-일메틸 벤질 메틸 시클로헥실 526 527
712 나프트-1-일메틸 벤질 메틸 벤질 534 535
713 나프트-1-일메틸 벤질 메틸
Figure 112006074580183-PCT00286
 548 549
714 나프트-1-일메틸 벤질 메틸 4-MeO-벤질 564 565
715 나프트-1-일메틸 벤질 메틸 펜에틸 548 549
716 나프트-1-일메틸 벤질 메틸 펜틸 514 515
717 나프트-1-일메틸 벤질 메틸 헥실 528 529
718 나프트-1-일메틸
Figure 112006074580183-PCT00287
 메틸 페닐 498 499
719 나프트-1-일메틸
Figure 112006074580183-PCT00288
 메틸 4-Me-페닐 512 513
720 나프트-1-일메틸
Figure 112006074580183-PCT00289
 메틸 3,5-Me2-페닐 526 527
721 나프트-1-일메틸
Figure 112006074580183-PCT00290
 메틸 4-MeO-페닐 528 529
722 나프트-1-일메틸
Figure 112006074580183-PCT00291
 메틸 4-CF3-페닐 566 567
723 나프트-1-일메틸
Figure 112006074580183-PCT00292
 메틸 시클로헥실 504 505
724 나프트-1-일메틸
Figure 112006074580183-PCT00293
 메틸 벤질 512 513
725 나프트-1-일메틸
Figure 112006074580183-PCT00294
 메틸
Figure 112006074580183-PCT00295
 526 527
726 나프트-1-일메틸
Figure 112006074580183-PCT00296
 메틸 4-MeO-벤질 542 543
727 나프트-1-일메틸
Figure 112006074580183-PCT00297
 메틸 펜에틸 526 527
728 나프트-1-일메틸
Figure 112006074580183-PCT00298
 메틸 펜틸 492 493
729 나프트-1-일메틸
Figure 112006074580183-PCT00299
 메틸 헥실 506 507
730 나프트-1-일메틸 나프트-1-일메틸 메틸 페닐 570 571
731 나프트-1-일메틸 나프트-1-일메틸 메틸 4-Me-페닐 584 585
732 나프트-1-일메틸 나프트-1-일메틸 메틸 3,5-Me2-페닐 598 599
733 나프트-1-일메틸 나프트-1-일메틸 메틸 4-MeO-페닐 600 601
734 나프트-1-일메틸 나프트-1-일메틸 메틸 4-CF3-페닐 638 639
735 나프트-1-일메틸 나프트-1-일메틸 메틸 시클로헥실 576 577
736 나프트-1-일메틸 나프트-1-일메틸 메틸 벤질 584 585
737 나프트-1-일메틸 나프트-1-일메틸 메틸
Figure 112006074580183-PCT00300
 598 599
738 나프트-1-일메틸 나프트-1-일메틸 메틸 4-MeO-벤질 614 615
739 나프트-1-일메틸 나프트-1-일메틸 메틸 펜에틸 598 599
740 나프트-1-일메틸 나프트-1-일메틸 메틸 펜틸 564 565
741 나프트-1-일메틸 나프트-1-일메틸 메틸 헥실 578 579
742 나프트-1-일메틸 시클로헥실메틸 메틸 페닐 526 527
743 나프트-1-일메틸 시클로헥실메틸 메틸 4-Me-페닐 540 541
744 나프트-1-일메틸 시클로헥실메틸 메틸 3,5-Me2-페닐 554 555
745 나프트-1-일메틸 시클로헥실메틸 메틸 4-MeO-페닐 556 557
746 나프트-1-일메틸 시클로헥실메틸 메틸 4-CF3-페닐 594 595
747 나프트-1-일메틸 시클로헥실메틸 메틸 시클로헥실 532 533
748 나프트-1-일메틸 시클로헥실메틸 메틸 벤질 540 541
749 나프트-1-일메틸 시클로헥실메틸 메틸
Figure 112006074580183-PCT00301
 554 555
750 나프트-1-일메틸 시클로헥실메틸 메틸 4-MeO-벤질 570 571
751 나프트-1-일메틸 시클로헥실메틸 메틸 펜에틸 554 555
752 나프트-1-일메틸 시클로헥실메틸 메틸 펜틸 520 521
753 나프트-1-일메틸 시클로헥실메틸 메틸 헥실 534 535
754 나프트-1-일메틸 4-클로로벤질 메틸 페닐 554 555
755 나프트-1-일메틸 4-클로로벤질 메틸 4-Me-페닐 568 569
756 나프트-1-일메틸 4-클로로벤질 메틸 3,5-Me2-페닐 582 583
757 나프트-1-일메틸 4-클로로벤질 메틸 4-MeO-페닐 584 585
758 나프트-1-일메틸 4-클로로벤질 메틸 4-CF3-페닐 622 623
759 나프트-1-일메틸 4-클로로벤질 메틸 시클로헥실 560 561
760 나프트-1-일메틸 4-클로로벤질 메틸 벤질 568 569
761 나프트-1-일메틸 4-클로로벤질 메틸
Figure 112006074580183-PCT00302
 582 583
762 나프트-1-일메틸 4-클로로벤질 메틸 4-MeO-벤질 598 599
763 나프트-1-일메틸 4-클로로벤질 메틸 펜에틸 582 583
764 나프트-1-일메틸 4-클로로벤질 메틸 펜틸 548 549
765 나프트-1-일메틸 4-클로로벤질 메틸 헥실 562 563
766 나프트-1-일메틸 메틸 메틸 페닐 444 445
767 나프트-1-일메틸 메틸 메틸 4-Me-페닐 458 459
768 나프트-1-일메틸 메틸 메틸 3,5-Me2-페닐 472 473
769 나프트-1-일메틸 메틸 메틸 4-MeO-페닐 474 475
770 나프트-1-일메틸 메틸 메틸 4-CF3-페닐 512 513
771 나프트-1-일메틸 메틸 메틸 시클로헥실 450 451
772 나프트-1-일메틸 메틸 메틸 벤질 458 459
773 나프트-1-일메틸 메틸 메틸
Figure 112006074580183-PCT00303
 472 473
774 나프트-1-일메틸 메틸 메틸 4-MeO-벤질 488 489
775 나프트-1-일메틸 메틸 메틸 펜에틸 472 473
776 나프트-1-일메틸 메틸 메틸 펜틸 438 439
777 나프트-1-일메틸 메틸 메틸 헥실 452 453
778 나프트-1-일메틸 이소부틸 메틸 페닐 486 487
779 나프트-1-일메틸 이소부틸 메틸 4-Me-페닐 500 501
780 나프트-1-일메틸 이소부틸 메틸 3,5-Me2-페닐 514 515
781 나프트-1-일메틸 이소부틸 메틸 4-MeO-페닐 516 517
782 나프트-1-일메틸 이소부틸 메틸 4-CF3-페닐 554 555
783 나프트-1-일메틸 이소부틸 메틸 시클로헥실 492 493
784 나프트-1-일메틸 이소부틸 메틸 벤질 500 501
785 나프트-1-일메틸 이소부틸 메틸
Figure 112006074580183-PCT00304
 514 515
786 나프트-1-일메틸 이소부틸 메틸 4-MeO-벤질 530 531
787 나프트-1-일메틸 이소부틸 메틸 펜에틸 514 515
788 나프트-1-일메틸 이소부틸 메틸 펜틸 480 481
789 나프트-1-일메틸 이소부틸 메틸 헥실 494 495
790 나프트-1-일메틸 메틸티오에틸 메틸 페닐 504 505
791 나프트-1-일메틸 메틸티오에틸 메틸 4-Me-페닐 518 519
792 나프트-1-일메틸 메틸티오에틸 메틸 3,5-Me2-페닐 532 533
793 나프트-1-일메틸 메틸티오에틸 메틸 4-MeO-페닐 534 535
794 나프트-1-일메틸 메틸티오에틸 메틸 4-CF3-페닐 572 573
795 나프트-1-일메틸 메틸티오에틸 메틸 시클로헥실 510 511
796 나프트-1-일메틸 메틸티오에틸 메틸 벤질 518 519
797 나프트-1-일메틸 메틸티오에틸 메틸 532 533
798 나프트-1-일메틸 메틸티오에틸 메틸 4-MeO-벤질 548 549
799 나프트-1-일메틸 메틸티오에틸 메틸 펜에틸 532 533
800 나프트-1-일메틸 메틸티오에틸 메틸 펜틸 498 499
801 나프트-1-일메틸 메틸티오에틸 메틸 헥실 512 513
본 발명의 또 다른 특징은, 본 발명이 생활성에 대해 라이브러리를 스크린닝하는 방법과 생활성있는 라이브러리 구성원들을 동정하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 특징은, 본 발명이 결합 분석을 수행하는 방법을 제공한다는 것이다. 그 방법은 제1공동활성자, 상호작용 단백질 및 시험 화합물을 포함하는 조성물을 제공하는 것을 포함한다. 제1 공동활성자의 아미노산 구조는 LXXLL, LXXLI 또는 FXXFF의 결합 모티프를 포함하는데, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 그 방법은 또한 화합물의 존재에 기인한 제1공동 활성자와 상호작용하는 단백질간의 결합에서의 변형을 탐지하는 것과, 그때 시험 화합물의 결합에의 영향을 알아내는 것을 포함한다.
분석은 시험 화합물이 두개의 단백질간의 결합에 미치는 영향을 측정할 수 있는 임의의 방법으로 수행할 수 있다. 그러한 방법들이 당업계에 많이 알려져 있고, 본 발명의 방법에 사용될 수 있는데, 소위 말하는 투-하이브리드(Two-Hybrid) 및 스플릿-하이브리드(Split-Hybrid) 시스템을 들수 있다.
투-하이브리드 시스템과 이 시스템을 사용하여 분석을 수행하는 많은 방법은 미국특허 US 6,410,245 에 기술되어 있다. 스플릿-하이브리드 시스템은(Split-Hybrid system) 예를 들면, Hsiu-Ming Shiu 등. Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 93:13896-13901, November 1996; 및 ohn D. Crispino, 등 Molecular Cell, 3:1-20, February 1999 에 기술되어 있다. 스플릿-하이브리드 시스템에서, 퓨전 단백질(fusion protein) 이 사용되는데, 이때, 단백질 X 는 lexA DNA 결합 부위 (pLexA)에 퓨전되고 단백질Y 는 전사 촉진자인 VP16 (pSHM.1-LacZ )에 퓨전된다. lexA-X 및 VP16-Y 간의 상호작용은 테트라사이클린 억제 단백질 (TetR)을 발현하도록 만든다. TetR 은 HIS3 정보제공 유전자의 전사를 방해하고, 세포가 히스티딘 결여된 배지에서 자랄수 없도록 만든다. 단백질-단백질 상호작용의 붕괴는 테트라사이클린 억제자의 발현을 폐쇄함으로써 세포가 그러한 배지에서 자랄수 있는 능력을 회복시킨다. 따라서, 본발명의 화합물은 성장중인 세포에 첨가될 수 있고, 만약 그 첨가가 세포가 배지에서 자랄 수 있는 능력을 회복시킨다면, 그 화합물은 단백질-단백질 상호작용의 효과적인 파괴자로 볼 수 있는 것이다.
스플릿-하이브리드 시스템을 만드는데 필요한 효모 균주는, Stanley M. Hollenberg 등 Molecular and Cellular Biology 15(7):3813-3822, July 1995 에 기술된 것과 같은 두개의 하이브리드체 LexA/VP16 를 사용할 수 있다. 스플릿-하이브리드 시스템의 유용한 변경은 Takemaru, K. I. 미 Moon, R. T. J. of Cell Biol . 149:249-254 에 의해 활용되었다.
다른 분석 형식도 또한 적합하다. 예를 들면, AP-1, ELISA 에 대한 정보제공 유전자 분석을 들 수 있는데, 예를들면 IL-2 전사 억제자를 찾기 위해 CD3 및 CD28로 자극 후에 T-세포주에 의한 IL-2의 생산을 차단한다. 직접 결합 분석 (공동활성자들 및 그들의 파트너간) 은 표면 플라즈몬 공면 분광기(surface plasmon resonance spectroscopy (Biacore, Sweden, manufactures suitable instruments)) 또는 ELISA에 의해 수행될 수 있다.
전사 조절자의 예로는 VP16, VP64, p300, CBP, PCAF,SRC1 PvALF, AtHD2A 및 ERF-2를 들 수 있는데 이에 제한되지 않는다. (참조, 예를 들면, Robyr 등 (2000) Mol. Endocrinol. 14:329-347; Collingwood 등 (1999) J. Mol . Endocrinol . 23:255-275; Leo 등 (2000) Gene 245:1-11; Manteuffel-Cymborowska (1999) Acta Biochim. Pol. 46:77-89; McKenna 등 (1999) J. Steroid Biochem . Mol . Biol. 69:3-12; Malik 등 (2000) Trends Biochem . Sci . 25:277-283; 및 Lemon 등 (1999) Curr . Opin . Genet. Dev. 9:499-504). 다른 전사 조절자의 예로는 OsGAI, HALF-1, C1, AP1, ARF-5, -6, -7, 및 -8, CPRF1, CPRF4, MYC-RP/GP, 및 TRAB1 를 들 수 있는데 이에 제한되지 않는다. 참조는, 예를들면 Ogawa 등 (2000) Gene 245:21 -29; Okanami 등 (1996) Genes Cells 1:87-99; Goff 등 (1991) Genes Dev. 5:298 -309; Cho 등 (1999) Plant Mol . Biol. 40:419-429; Ulmason 등 (1999) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 96:5844-5849; Sprenger-Haussels 등 (2000) Plant J. 22:1-8; Gong 등 (1999) Plant Mol . Biol . 41:33-44; 및 Hobo 등 (1999) Proc . Natl . Acad . Sci. USA 96:15,348-15,353.
바람직한 실시 태양에서, 전사 공동활성자는 인간 전사 공동활성자이다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 전사 공동활성자는 히스톤 아세틸트랜스퍼래이즈 활성을 갖는 공동활성자의 p300/CBP 패밀리의 구성원이다. p300은 예를들면 Eckner 등, 1994 에 의해 기술되어 있고, CBP 는 Bannister 및 Kouzarides에 의해 1996에 기술되었다. 본 발명의 목적을 위해, p300/CBP의 인용은 인간의 p300의 대립(allelic) 및 합성 변이체를 언급하고, 다른 포유동물의 변이체 및 그것의 대립 및 합성 변이체를 언급할 뿐 아니라, 상기 인간 및 포유동물의 p300 형태를 언급한다. 이 분석의 한 특징은 상호 작용하는 단백질이 전사 인자 또는 제2 공동 활성자라는 것이다.
이 분석의 한 특징은, 상호작용하는 단백질이 다음 중에서 임의의 것이 될 수 있다는 것이다: RIP140; SRC-1 (NCoA-1); TIF2 (GRIP-1; SRC-2); p (CIP; RAC3; ACTR; AIB-1; TRAM-1; SRC-3); CBP (p300); TRAPs (DRIPs); PGC-1; CARM-1; PRIP (ASC-2; AIB3; RAP250; NRC); GT-198; 및 SHARP (CoAA; p68; p72). 이 분석의 다른 특징은, 상호작용하는 단백질이 다음 중에서 임의의 것이 될 수 있다는 것이다: TAL 1; p73; MDm2; TBP; HIF-1; Ets-1; RXR; p65; AP-1; Pit-1; HNF-4; Stat2; HPV E2; BRCA1; p45 (NF-E2); c-Jun; c-myb; Tax; Sap 1; YY1; SREBP; ATF-1; ATF-4; 쿠비투스(Cubitus); 인터랍터스(Interruptus); Gli3; MRF; AFT-2; JMY; dMad; PyLT: HPV E6; CITTA; Tat; SF-1; E2F; junB; RNA 헬리케이즈(helicase) A; C/EBP ß GATA-1; Neuro D; 마이크로프탈리미아(Microphthalimia); E1A; TFIIB; p53; P/CAF; Twist; Myo D; pp9O RSK; c-Fos; 및 SV40 Large T. 이 분석의 다른 특징은, 상호작용하는 단백질이 다음 중에서 임의의 것이 될 수 있다는 것이다: ERAP140; RIP140; RIP160; Trip1; SWI1 (SNF); ARA70; RAP46; TIF1; TIF2; GRIP1; 및 TRAP. 이 분석의 다른 특징은, 상호작용하는 단백질이 다음 중에서 임의의 것이 될 수 있다는 것이다: VP16; VP64; p300; CBP; PCAF; SRC1 PvALF; AtHD2A; ERF-2; OsGAI; HALF-1; C1; AP-1; ARF-5; ARF-6; ARF-7; ARF-8; CPRF1; CPRF4; MYC-RP/GP; 및 TRAB1. 본 발명의 또 다른 특징은, 제1 공동활성자가 CBP 또는 p300 이다.
시험 화합물은 여기 기술된 화합물들로부터 선택된다. 예를 들면, 일반식 (I), (II), (III), (IV), (VI) 및 (VIa) 를 갖는 화합물을 들 수 있다. 전형적으로는, 시험 화합물은 여러 다른 농도에서 검토될 것인데, 이들 농도들은 부분적으로는 분석조건에 기반하여 선택될 것이고, 분석조건의 예를 들면, 제1공동활성자 및 상호작용하는 단백질이다. 약 0.1 내지 10 μM 내의 농도가 전형적이다. 하나의 특징은 이 분석이 두개의 단백질간의 결합 상호작용에 영향을 미치는 두개의 화합물의 상대적인 효용을 평가한다는 것인데, 이 두개의 화합물 중 하나의 화합물이 본 발명의 화합물이다. 더 효과적인 화합물이 화합물 구조와 화합물 활성 간의 관계를 연구하는데에 참조 화합물로 될 수 있다.
본 발명의 라이브러리는 여러 기술과 방법에 의해 생활성에 대해 스크린닝하였다. 일반적으로, 스크리닝 분석은 (1) 라이브러리의 유사체를 수용체와 같은 관심 있는 생물 표적과 접촉시켜서, 라이브러리의 유사체와 표적 간에 결합이 일어나도록 하는 단계, 및 (2) 적당한 분석, 예를 들면 Lam 등 (Nature 354:82-84, 1991) 또는 Griminski 등 (Biotechnology 12:1008-1011, 1994) (둘다 인용으로 편입됨)에 기술된 열량 분석법(calorimetric assay)에 의해 결합을 탐지하는 단계, 에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 실시 태양에서, 라이브러리 구성원은 용액 내에 있고, 그 목표는 고체상에 고정되어 있다. 다른 방법으로는, 그 라이브러리는 고체상에 고정될 수도 있고, 그것을 수용액 내의 목표와 접촉시킴으로써 탐침될 수도 있다.
하기 표 4는 본발명의 라이브러리로부터 선택된 생활성 테스트를 위한 화합물 및 그것의 IC50 수치를 보여주는데, 그것은 실시예 6에서 기술된 정보제공 유전자에 의해 측정되었다.
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본 발명에 따르면 일반식(I)의 화합물들 및 특히 일반식(VI)의 화합물들은 암세포에서 그들의 CBP에의 특이 결합 때문에, CBP 매개의 전사 활성을 억제할 수 있다는 것이 발견되었다. 이 결론은 SW480 세포의 CBP 가 본 발명의 화합물과 함께 면역 침강 반응을 하는 것에 의해 지지된다.
본 발명의 화합물은 또한 SW480 세포에서 설비빈(survivin)의 발현을 억제할 수 있고, 그래서 암세포에서 종양형성 활성을 억제한다. 본 발명의 화합물은 암세포를 억제하는데 사용될 수 있어서, 세포 성장을 조절하는데 유용할 수 있다. 그러한 결과를 지지하는데에, 본 발명의 화합물들은 그것이 SW480 세포에서 카스파제(caspase)-3 활성화를 유도할 수 있다는 것을 보여준다. 본 발명의 화합물들은 또한 세포들의 자멸사를 유도하는데 유리하게 사용될 수 있다.
암세포에서 종양유발 활성을 확인하기 위해, 시험관내 MTS 세포독성 분석이 하기 방법에 의해 시험되었다.
(1) 세포독성 테스트
SW480 또는 HCT116 세포를 96 웰 마이크로플레이트에 놓고 (104세포/웰), 24시간동안 37℃로 항온 보관하였다. 세포들은 TCF4 화합물로 24시간 동안 여러 농도로 처리하였다. 20㎕ 의 MTS 용액 (프로메가) 이 각각의 웰에 첨가되었고, 2시간동안 37℃로 항온 보관하였다. 세포의 생활성(viability)은 마이크로플레이트 판독기 (reader) (Molecular Device)를 사용하여 490 nm의 흡광도를 읽어서 측정하였고, 각각의 농도에서의 화합물의 세포독성을 계산하였다.
(2) 성장 억제 측정법
SW480 또는 HCT116 세포를 96 웰 마이크로플레이트에 놓고 (104세포/웰), 24시간동안 37℃로 항온 보관하였다. 20㎕의 [3-(4,5- 디메틸티아졸-2-일)-5-(3- 카르복시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸리움, 내염(內鹽)](MTS) 용액 (프로메가) 를 각각의 웰에 첨가하고 37℃ 에서 2시간 후에 흡광도를 읽었다. 그리고 나서, 세포를 48시간 동안 여러 농도의 TCF4 화합물로 처리하였다. 20 ㎕ 의 MTS 용액 (프로메가) 이 각각의 웰에 첨가되었고, 2시간 동안 37℃로 항온 보관하였다. 세포의 생활성(viability)은 마이크로플레이트 판독기 (reader) (Molecular Device)를 사용하여 490 nm의 흡광도를 읽어서 측정하였고, 각각의 농도에서의 화합물의 세포독성을 계산하였다.
선택된 라이브러리 화합물의 종양유발 활성도의 결과는 표 5에 도시되었다. 표 5의 화합물 번호는 표4의 화합물 번호와는 관계가 없다.
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본 발명의 다른 특징은, 본 발명은 일반식(I), 또는 일반식(II), 또는 일반식(III), 또는 일반식(IV), 또는 일반식(VI)의 구조를 갖는 화합물을 함유하는 약리적 조성물을 제공한다. 이들 조성물은 하기에 상세히 설명되는 바와 같이 다양한 방법(예, 암 또는 알쯔하이머 질환의 치료)에 사용할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 목적한 투여방법에 적합하게 제형화 할 수 있다. 투여방법의 예는 비경구적, 예를 들어 정맥내, 피내, 피하, 경구 (예, 흡입), 경피 (국소), 점막, 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음 성분들: 멸균 희석제 예를 들어 주입 수, 염수 용액, 고정오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균제 예를 들어 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제 예를 들어 아스코르빈산 또는 소듐 비설파이트; 킬레이팅제 예를 들어 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제 예를 들어 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 긴장성 조절제(agent for the adjustment of tonicity) 예를 들로 염화 나트륨 또는 덱스트로스를 포함한다. 그 외에, pH는 염산 또는 수산화 나트륨 등의 산 또는 염기로 조절할 수 있다. 비경구 제제는 암포울(ampoules), 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 만든 다중 용량 바이얼에 동봉할 수 있다.
주사용에 적합한 약학 조성물은 멸균 수용액 (여기서 가용성 물) 또는 분산액 및 멸균 주사용액 또는 분산액의 즉시 사용용 제제를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적절한 운반체는 생리적 염수, 정균수(bacteriostatic water), Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) 또는 인산염 완충 염수 (PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균상태이어야 하며 또한 용이하게 주사될수 있을 정도로 유동성이어야 한다. 제조 및 저장 상태 하에 안정해야 하며 또한 박테리아 및 진균 등의 미생물이 염색되지 않고 보존되어야 한다. 운반체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등) 그리고 그들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매체일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴(lecithin)등의 피복물의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자크기의 유지에 의해 또한 계면활성제의 사용에 의해 유지할 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르빈산, 티머로살(thimerosal) 등에 의해 달성할 수 있다. 많은 경우에, 조성물중에 등장제(isotonic agents), 예를 들어 당, 마니톨 등의 폴리알코올, 소르비톨, 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사성 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연하는 약제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시켜 일어날 수 있다.
멸균된 주사용액은 필요에 따라 상기 열거된 성분들의 하나 또는 조합으로 적절한 용매 중에 필요한 량으로 일반식(I), (II), (III), (IV) 또는 (VI)의 구조를 갖는 화합물인 활성 화합물을 혼입시킨 다음 여과에 의한 멸균에 의해 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 상기 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분 및 분산 배지를 함유하는 멸균 매개체 내에 활성 화합물을 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사용액의 제조를 위한 멸균분말의 경우에, 바람직한 제조방법은 진공건조 및 동결건조를 시켜 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 특정의 추가적인 원하는 성분 및 활성성분의 분말을 생산한다.
경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 운반체를 포함한다. 이들은 젤라틴 캡슐 내에 밀봉하거나 또는 정제 내에 압축할 수 있다. 경구 치료 투여 목적을 위하여, 활성화합물은 부형제와 함께 혼입할 수 있으며 또한 정제, 트로키 또는 캡슐의 형태로 사용할 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강 세척제로 사용하기 위한 유동 운반체를 사용하여 제조할 수 있으며, 여기서 유동 운반체중의 상기 화합물은 경구적으로 적용되고 튀겨 뱉어 지거나 또는 삼켜진다. 약제학적으로 적합한 결합제 및/또는 보조제 물질은 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캡슐제, 트로키제 등은 다음 성분들, 또는 유사한 성질의 화합물의 어느 것을 포함할 수 있다: 결합제 예를 들어 미세결정 셀룰로오스, 고무 트라가칸트(tragacanth) 또는 젤라틴; 부형제 예를 들어 전분 또는 락토오스, 붕괴제(disintegrating agent) 예를 들어 알긴산, 프리모겔, 또는 옥수수 전분; 윤활제 예를 들어 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate) 또는 스테로테스(Sterotes); 활제(glidant) 예를 들어 콜로이덜 실리콘 디옥사이드; 감미제 예를 들어 수크로오스 또는 사카린; 또는 향미제 예를 들어 박하정제, 메틸살리실레이트, 또는 오렌지 향미제를 포함할 수 있다.
흡입 투여의 경우, 화합물은 적절한 추진제, 예를 들어 이산화탄소 등의 기체 또는 분무제를 함유하는 가압 컨테이너 또는 분산기로부터 에어로졸 분사 형태로 공급된다.
전신 투여는 또한 점막관통 또는 경피 수단에 의할 수 있다. 점막통과 또는 경피 투여의 경우, 침투하려는 장벽에 적절한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있으며 또한 예를 들어 점막 투여의 경우 세제, 담즙산염(bile salts) 및 푸시딘산(fusidic acid) 유도체를 포함한다. 점막관통 투여는 코 분사 또는 좌약(suppositories)의 사용에 의해 달성할 수 있다. 경피투여의 경우 활성화합물은 당해 분야에 일반적으로 공지된 바와 같이 연고, 고약, 또는 크림 형태로 제형화 된다.
화합물은 또한 좌약 (예, 코코아 버터 및 다른 글리세라이드 등의 통상적인 좌약 베이스(base)와 함께) 또는 직장 투여를 위한 잔류 관장제의 형태로 제조할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 활성 화합물은 임플란트 및 마이크로캡슐(microencapsulated) 전달 시스템을 포함한, 통제되는 방출 제형(controlled release formulation) 과 같이, 신체로부터 빠른 제거에 대해 화합물을 보호하는 운반체와 함께 제조된다. 생분해성, 생체적합성 고분자, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조방법은 당해 분야의 기술자들에게 자명할 것이다. 물질은 또한 Alza Corporation 및 Noval Pharmaceuticals로부터 상업적으로 구할 수 있다. 리포조말 현탁제 (바이러스성 항원에 대한 모노클로날 항체로 감염된 세포로 표적된 리포좀을 포함)는 또한 약제학적으로 허용되는 운반체로 사용될 수 있다. 이들은 예를 들어 미국특허 4,522,811호에 기술된 바와 같이 당해 분야에 기술자들에게 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다.
투여의 용이성 및 용량의 균일성을 위해 투용량 단위 형태로 경구 또는 비경구 조성물을 제형화 하는 것이 특히 유리하다. 여기서 사용되는 투용량 단위 형태는 치료 대상의 환자를 위한 단일 용량으로 적합한 물리적으로 구별된 단위를 언급하며; 각각의 단위는 필요한 약제학적 운반체와 결합되게 원하는 치료효과를 생기게 하기 위해 계산된 소정 량의 활성화합물을 함유한다. 본 발명의 용량 단위 형태의 명세서는 활성화합물의 독특한 특징, 달성하려는 특별한 치료효과, 및 개개의 치료를 위한 활성화합물을 복합하는 기술에 고유한 제한들에 의해 지시되거나 이들에 의해 직접 의존한다.
이러한 화합물의 독성 및 치료효과는, 예를 들어 LD50 (모집단의 50% 치사하는 용량) 및 ED50 (모집단의 50%에 치료적으로 유효한 용량)을 측정하기 위한, 세포 배양 또는 실험동물의 표준 약학 절차에 의해 결정할 수 있다. 독성과 치료효과 간의 용량 비는 치료지수이며 또한 이것은 LD50/ED50의 비율로 표현할 수 있다. 큰 치료지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있지만, 감염되지 않은 세포에 가능한 손상을 최소화시키기 위하여 감염된 조직의 부위에 이러한 화합물을 보내는 전달 시스템을 디자인하기 위해 주의를 기울여야 하고, 그럼으로써 부작용을 줄여야 한다.
세포 배양 분석 및 동물연구로부터 얻은 데이터는 인간에 사용되는 투여량의 범위를 정하는데 사용할 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환하는 농도 범위 내로 하는 것이 바람직하다. 투약량은 사용된 조제 형태 및 사용된 투여경로에 따라 이 범위 내에서 변화할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 어떠한 화합물의 경우에라도, 치료에 효과적인 용량이 처음에는 세포 배양 분석으로부터 산정할 수 있다. 용량은 순환 혈장 농도를 달성하기 위해 동물 모델에서 공식화할 수 있는데, 이는 세포 배양에서 결정되는 IC50 (즉, 증상의 최대억제의 절반을 달성하는 시험화합물의 농도)을 포함한다. 이러한 정보는 사람에서 유용한 용량을 더욱 정확하게 결정하기 위해서 사용할 수 있다. 혈장 농도는 예를 들어 HPLC에 의해 측정할 수 있다.
예를 들면, 특정한 실시태양에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 약 1mg 내지 약 1g의 본 발명 화합물을 함유하는 정제 또는 캡슐 등의 단위 용량 형태로 경구 투여에 적합한 것이다. 몇몇 다른 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 피하 또는 근육내 주사에 적합하다. 환자는 예를 들어 본 발명 화합물 약 1㎍/kg 내지 약 1g/kg의 정맥내, 피하 또는 근육내 용량을 투여 받을 수 있다. 정맥내, 피하 또는 근육내 용량은 큰 덩어리 주사에 의해 또는 일정 기간 동안 연속 주입에 의해 공급할 수 있다. 또는 환자는 일일 비경구 용량과 거의 동일한 일일 경구 용량을 투여 받을 것이며, 조성물은 하루에 1 내지 4번 투여한다.
다음 표는 사람의 치료나 예방을 위해서 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 함유하는 대표적인 약학 투여량의 형태를 나타낸 것이다:
정제 1 mg/정제
화합물 100
락토오스 Ph. Eur 179
크로스카멜로스 소디움 12.0
폴리비닐피롤리돈 6
마그네슘 스테아레이트 3.0
정제 2 mg/정제
화합물 50
락토오스 Ph. Eur 229
크로스카멜로스 소디움 12.0
폴리비닐피롤리돈 6
마그네슘 스테아레이트 3.0
정제 3 mg/정제
화합물 1.0
락토오스 Ph. Eur 92
크로스카멜로스 소디움 4.0
폴리비닐피롤리돈 2.0
마그네슘 스테아레이트 1.0
캡슐 mg/캡슐
화합물 10
락토오스 Ph. Eur 389
크로스카멜로스 소디움 100
마그네슘 스테아레이트 1.0
주사제 1 (500mg/ml)
화합물 0.5% w/v
등장 수용액 100%까지
일반식(I) 또는 (II) 또는 (III) 또는 (IV) 또는 (VI)의 화합물을 함유하는 약학 조성물은 Wnt 신호 경로 변이에 의한 질병, 특히 암, 특히 직장암의 치료에 사용될 수 있다.
하나의 특징은, 본 발명은 δ 및 μ 아편 수용체에 방사선 표지된 엔케팔린 유도체의 결합을 억제하는 화합물을 제공한다. 따라서 본 발명의 리버스-턴 유사체는 수용체 작용물질(agonist)로서 및 잠재성 마취제로서 사용할 수 있다.
또 하나의 특징은, 본 발명은 종양 생장을 억제하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 종양 생장을 억제하는데 유효한 량으로 일반식 (I), 특히 일반식(VI)를 갖는 화합물로 종양을 갖는 환자(예, 포유동물 대상)에게 투여하는 단계를 포함한다. 화합물 또는 조성물은 종양크기가 치료하지 않은 것보다 화합물 또는 조성물의 치료를 받은 대상에게 통계적으로 현저하게 더 적은 경우에 종양 생장을 억제한다.
종양 생장에 대한 본 발명의 특별한 화합물 또는 조성물의 억제효과는 당해분야에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 알수 있다. 예를 들면, 설비빈(survivin) 발현에 대한 화합물 또는 조성물의 효과를 측정할 수 있다. 설비빈 발현을 다운-조절하는 화합물 또는 조성물은 종양 생장에 대한 억제효과를 낼 것으로 보인다. 그 외에, 종양 세포주를 사용한 분석 (예, SW480세포를 사용한 연질 한천 분석) 및 종양생장의 동물모델 (예, 종양 세포를 이식한 누드 마우스 및 Min 마우스 모델)은 또한 실시예에 상세히 기술된 바와 같이 소정의 화합물 또는 조성물의 종양 생장에 대한 억제효과를 평가하는데 사용할 수 있다. 종양 생장에 대한 다른 예시적인 동물모델 또는 이종이식(xenograft)은 유방암 (Guo 등, Cancer Res. 62: 4678-84, 2002; Lu등, Breast Cancer Res. Treat. 57: 183-92, 1999), 췌장암 (Bouvet 등, Cancer Res. 62: 1534-40, 2002), 난소종양 (Nilsson 등, Cancer Chemother. Pharmacol . 49: 93-100, 2002; Bao 등, Gynecol . Oncol. 78: 373-9, 2000), 흑색종 (Demiderm 등, Cancer Res . 61: 2294-300, 2001), 직장암 (Brown 등, Dig. Dis . Sci . 45: 1578-84, 2000; Tsunoda 등, Anticancer Res. 19: 1149-52, 1999; Cao 등, Clin . Cancer Res. 5: 267-74, 1999; Shawler 등, J. Immunother . Emphasis Tumor Immunol . 17: 201-8, 1995; McGregor 등, Dis . Colon. Rectum. 36: 834-9, 1993; Verstijnen 등, Anticancer Res. 8: 1193-200, 1988), 간세포암 (Labonte 등, Hepatol . Res. 18: 72-85, 2000), 및 위암 (Takahashi 등, Int . J. Cancer 85: 243-7, 2000) 에 대한 것을 포함한다.
종양 생장을 억제하는 화합물 또는 조성물은 예를 들어 종양이 잔류하는 조직에 따라 적절한 경로를 거쳐 종양을 가진 대상에서 투여할 수 있다. 적절한 용량은 상술한 바와 같이 당해 분야에 공지된 지식 및 기술을 사용하여 결정할 수 있다. 종양 생장에 대한 화합물 또는 조성물의 치료 효과는 또한 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 모니터 될 수 있다. 예를 들면, 다양한 방법이 결장경 검사, S상결장 검사, 생체검사, 컴퓨터 단층촬영, 초음파, 자기공명 이미지, 및 양전자방출 단층촬영을 포함하여, 직장암의 전개 및/또는 생장을 검색하는데 사용할 수 있다. 난소암의 진행 및/또는 생장을 검색하는 방법은 예를 들어 초음파, 컴퓨터 단층촬영, 자기공명 이미지, 흉부 X-선, 복강경, 및 조직 샘플링을 포함한다.
관련된 특징은, 본 발명은 암 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 대상 환자의 암을 치료 또는 예방하는데 유효한 양으로 일반식(I), 특히 일반식(VI)의 구조를 갖는 화합물 또는 조성물을 대상 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 암 치료는 암 진행 (예 암 생장 및 전이)를 감소 또는 제거함을 포함하는 것으로 이해된다. 암 예방은 암의 개시를 방지 또는 지연함을 포함하는 것으로 이해된다. 다양한 유형의 암이 본 발명에 의해 치료 또는 예방될 수 있다. 이들은 제한되지 않지만 폐암, 유방암, 직장암, 위암, 췌장암, 간암, 자궁암, 난소암, 글리오마, 멜라노마, 림포마 및 백혈병을 포함한다.
치료를 필요로 하는 대상 환자는 다양한 유형의 암에 걸린 사람 또는 비-인간 영장류 또는 다른 동물일 수 있다. 예방이 필요로 하는 대상은 암이 발생할 수 있는 위험이 있는 사람 또는 비-인간 영장류 또는 다른 동물일 수 있다. 암을 진단하고 또한 암의 위험이 큰 개개 환자를 스크리닝 하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며 또한 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들면, 직장암은 배설물 잠혈시험(潛血試驗). S상결장 검사, 결장경 검사, 공기대조 바륨 관장, 및 실제 결장경 검사에 의해 진단할 수 있다. 직장암의 위험이 높은 개개 환자는 하나 이상의 직장 암 위험요소, 예를 들어 강한 패밀리 병력의 직장암 또는 점막비후, 공지된 패밀리 병력의 유전적 직장암 증후군, 개인 병력의 아데노마 점막비후, 및 개개 병력의 만성 염증 내장 질환을 갖는다.
암 치료 또는 예방에 유용한 일반식(I)의 화합물은 당해 분야에 공지된 적절한 방법에 의해 동정할 수 있다. 상술한 바와 같이 종양 생장에 억제효과를 위한 화합물을 선택하는데 사용할 수 있는 방법이 또한 사용될 수 있다. 투여 경로, 소정 화합물의 투여량, 치료의 효과는 당해 분야에 공지된 지식 및 기술을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 결정을 하는데 고려될 수 있는 인자는 예를 들어 치료할 암의 유형 및 단계를 포함한다.
암 치료 및 예방에 유용한 일반식(I)의 화합물은 항-종양제와 조합으로 투여할 수 있다. 항 종양제는 종양 생장을 억제하는 화합물을 언급한다. 예시적인 항-종양제는 플루오로우라실; 5-플루오로-2,4(1H,3H)-피리미딘디온(pyrimidinedione) (5-FU), 탁솔, 시스프라틴, 미토마이신 C, 테가푸르, 랄티트렉스드(raltitrexed), 카페시타빈, 및 이리노테칸을 포함한다 (Arango 등, Cancer Research 61, 2001 4910-4915). 항-종양제와 조합으로 투여된 일반식(I)의 화합물은 화합물 및 항-종양제가 동시에 투여할 것을 반드시 요구하지는 않는다. 화합물 및 약제는 한 번에 이들 두 가지가 동일한 암세포에 효과를 미치는 한, 별개로 투여할 수 있다.
추가의 관련된 특징은, 본 발명은 암세포에서 세포소멸을 촉진하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 이들 세포에서 세포소멸을 촉진하는데 유효한 량으로 일반식(I)의 화합물, 특히 일반식(VI)의 화합물로 암세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 화합물은 세포소멸을 행하는 암세포의 수가 화합물의 부재하에서 보다 화합물의 존재 하에 통계적으로 현저히 더 큰 경우에 세포소멸을 촉진한다. 이러한 화합물은 배양된 암세포주, 이종이식(xenograft) 또는 동물 암 모델을 사용하여 방해 분야에 공지된 방법 (예, 카스파제 활성 및/또는 세포사명을 측정)에 의해 동정할 수 있다. 바람직하게는, 화합물은 정상세포에서보다 암세포에서 세포소멸을 촉진하는데 더욱 활성이다. 다양한 조직 기원의 암세포가 본 발법에 의해 치료 가능하다.
본 발명의 또 하나의 특징은, 일반식(I)의 화합물, 특히 일반식(VI)의 화합물의 안전하고 유효한 양을 환자에게 투여함을 포함하는, Wnt 신호경로에 의해 조절되는 장애를 치료하는 방법이 기술된다. 본 발명의 화합물을 함유하는 약학 조성물은 또한 이 목적을 위해 사용할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명에서는 일반식(I)의 화합물, 특히 일반식(VI)의 화합물 또는 이를 함유하는 약학 조성물이 Wnt 신호경로에 관련된 암세포의 과잉 발현을 개시하는데 관여하는 것으로 믿어지는, TCF-4-ß 카테닌-CBP 복합물에 의해 조절되는 질환의 치료에 유용하다. 따라서 본 발명의 또 하나의 특징은 일반식(I)의 화합물, 특히 일반식(VI)의 화합물을 사용하여 TCF-4-ß카테닌-CBP 복합물에 의해 조절되는 질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한 설비빈(survivin) 발현을 억제하는 화합물 및 방법을 제공한다. 설비빈은 TCF/베타-카테닌 경로의 표적유전자이며, 또한 더욱 구체적으로는 TCF/베타-카테닌/CBP 경로의 표적유전자이다. 이것은 단백질의 IAP (세포소멸 단백질의 억제제) 패밀리의 구성원이다. 설비빈과 관련된 생물학적 활성은: 세포사이클 입구 및 출구를 조절하는 G2/M에서 고도로 발현; 세포 사이클 상에 따라 미소관, 중심체(centrosome), 중심절(centromere) 및 중심체(midbody)와 관련; 카스파제(예, 카스파제 3, 7 및 9)로 직접 또는 간접적으로 상호작용을 통한 항-세포소멸을 포함한다. 암과 관련하여, 설비빈은 종양 세포에 광범위하고 고도로 발현되지만, 정상 조직 세포에서는 거의 또는 전혀 발현 되지 않는다. 또한, 종양이 설비빈을 발현한 암환자는 전체적인 생존율이 감소하는 것이 관찰되었다. 더욱이, 설비빈 발현정도는 다른 암 마커들, 예를 들어 Ki67, PNCA, p53, APC 등과 상호관련되어 있다.
설비빈 발현에 대한 본 발명의 특별한 화합물의 영향은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 특징을 알수 있다. 이러한 방법은 전사 또는 해독 수준에서 설비빈 발현을 특성지우는 방법을 포함한다. 전사 수준에서 설비빈 발현을 특성지우는 예시적인 방법은 cDNA 미소배열, 역전사-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR), 크로마틴 면역침강 (ChIP), 및 설비빈 프로모터에 의해 추진된 정보제공 활성의 분석이다. 해독 수준에서 설비빈 발현을 특징지우는 예시적 방법은 Western 블롯 분석, 면역화학 및 카스파제 활성이다. 상기 예시적 방법의 상세한 설명은 하기 실시예에서 발견할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 설비빈 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 설비빈 발현을 억제하는데 유효한 양으로 본 발명의 화합물로 설비빈-발현 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 세포내의 설비빈 발현이, 화합물의 부재 하에서의 설비빈 발현에 비하여 화합물의 존재 하에서 감소되는 경우 화합물은 설비빈 발현을 억제한다. 설비빈-발현 세포는 예를 들어 폐암, 유방암, 위암, 췌장암, 간암, 자궁암, 난소암, 글리오마, 멜라노마, 직장암, 림포마 및 백혈병등으로부터의 또는 내의 세포를 발현시키는 종양 세포를 포함한다. 설비빈-발현 세포를 화합물로 접촉시키는 단계는 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 수행할 수 있다. 설비빈 발현을 억제하는데 유용한 화합물은 동정할 수 있으며, 또한 본 발명의 특정 화합물의 효과는 상기 상세히 기술한 바와 같이 당해 분야에 공지된 적절한 방법에 의해 특성지울 수 있다.
본 발명의 화합물은 설비빈의 발현을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 블랑크-브루드((Blanc-Drude) 등, Nat. Medicine 8: 987, (2002)은 설비빈이 병리학상의 관-벽 재성형(vessel-wall remodeling)에서 중요한 연질 근육 세포의 세포소멸의 중요한 조절자임을 보였다. 따라서 본 발명의 또 다른 특징은 환자의 필요에 따라 본 발명의 리버스-턴 유사체의 안전하고 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 혈관 확장술과 관련이 있는 재협착을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 태양에서는 재협착(restenosis)을 치료한다. 즉. 본 발명의 리버스-턴 유사체를 재협착이 발생한 환자에게 투여하면 재협착의 경중도, 범위 또는 정도등를 감소시킬 수 있다. 또한 본 발명은 다른 실시태양에서는 재협착을 예방한다. 즉 새로운 또는 추가의 재협착이 발생할 것으로 예상되는 환자에게 본 발명의 리버스-턴 유사체를 투여하면 재협착에 의한 경중도, 범위 또는 정도등을 감소시킬 수 있다. 임의적으로 대상은 포유동물이다.
본 발명의 화합물은 TCF/ß-카테닌의 전사를 억제하는 것으로 나타났다. 로도바 (Rodova) 등, J. Biol . Chem . 227: 29577, 2002)는 PKD-1 프로모터가 ß-카테닌/TCF 경로의 표적이 됨을 보였다. 따라서 본 발명의 또 다른 태양은 환자의 필요에 따라 본 발명의 리버스-턴 유사체의 안전하고 유효한 양을 투여하는 것을 특징으로 하는 다낭신 질환(polycystic kidney disease)을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 하나의 태양에서 본 발명은 다낭신 질환을 치료한다. 즉 본 발명의 리버스-턴 유사체를 다낭신 질병이 있는 환자에게 투여하여 다낭신 질환의 경중도, 범위 또는 정도등을 감소시킬 수 있다. 다른 실시 태양에서 본 발명은 다낭신 질병을 예방한다. 즉 본 발명의 리버스-턴 유사체를 새로운 또는 추가의 다낭신 질병의발생할 것으로 예상되는 환자에게 투여하면 다낭신 질환의 예상되는 경중도, 범위 또는 정도등을 감소시킬 수 있다. 임의적으로 대상은 포유동물이다.
본 발명의 화합물은 Wnt 신호의 발현을 억제하는 것으로 나타났다. 하나이 (Hanai)등, J. Cell Bio. 158: 529, (2002)는 혈관생성 억제 요소(anti-angiogenic factor)로 알려진 엔도스타틴이 Wnt 신호를 억제함을 보였다. 따라서 본 발명의 다른 양태는 필요에 따라 본 발명의 리버스-턴 유사체의 안전하고 유효한 양을 투여하는 것을 특징으로 하는 비정상 혈관 생성 질병(aberrant angiogenic)을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 하나의 실시 태양은 이상 혈관 생성 질병을 치료하는 것이다. 즉 본 발명의 리버스-턴 유사체를 비정상 혈관 생성질병이 있는 환자에게 투여하여 이상 혈관 생성 질병의 경중도, 범위 또는 정도등을 감소시킬 수 있다. 다른 태양에서 본 발명은 비정상 혈관 생성 질병을 예방한다. 즉 본 발명의 리버스-턴 유사체를 새로운 또는 추가의 이상 혈관 생성 질병이 발생할 것으로 예상되는 환자에게 투여하면 이상 혈관 생성 질병의 예상되는 경중도, 범위 또는 정도등을 감소시킬 수 있다. 임의적으로 환자는 포유동물체이다.
본 발명의 화합물은 Wnt 신호의 발현을 억제하는 것으로 나타났다. 센 (Sen)등, P.N.A.S. (USA): 2791, (2000)은 류머티스성 관절염이 걸린 포유류에서 RA 활액(synovial) 조직에서 Wnt와 Fz의 발현이 증가됨을 보였다. 따라서 본 발명의 다른 양태는 환자의 필요에 따라 본 발명의 리버스-턴 유사체의 안전하고 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 류머티스성 관절염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 하나의 실시 태양은 류머티스성 관절염을 치료하는 것이다. 즉 본 발명의리버스-턴 유사체를 류머티스성 관절염이 있는 환자에게 투여하여 류머티스성 관절염의 경중도, 범위 또는 정도등을 감소시킬 수 있다. 다른 실시 태양에서 본 발명은 류머티스성 관절염을 예방한다. 즉 본 발명의 리버스-턴 유사체를 새로운 또는 추가의 류머티스성 관절염이 발생할 것으로 예상되는 환자에게 투여하면 류머티스성 관절염의 예상되는 경중도, 범위 또는 정도등을 감소시킬 수 있다. 임의적으로 환자는 포유동물체이다.
본 발명의 화합물은 Wnt 신호의 발현을 억제하는 것으로 나타났다. 유토프 (Uthoff)등, Int . J. Oncol . 19: 803, (2001)은 궤양성 대장염(크론 질병(Chron's disease)환자와 비교하여)에서 흐트러진 그리고 fz(Wnt경로 분자)의 특이형태 상향 조절이 일어난다는 것을 보였다. 따라서 본 발명의 다른 특징은 환자의 필요에 따라 본 발명의 리버스-턴 유사체의 안전하고 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 궤양성 대장염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 하나의 실시 태양은 궤양성 대장염을 치료한다. 즉 본 발명의 리버스-턴 유사체를 궤양성 대장염이 있는 환자에게 투여함으로써 궤양성 대장염의 경중도, 범위 또는 정도등을 감소시킬 수 있다. 다른 실시 태양에서 본 발명은 궤양성 대장염을 예방한다. 즉 본 발명의 리버스-턴 유사체를 새로운 또는 추가의 궤양성의 대장염의 발병이 예상되는 환자에게 투여하면 궤양성 대장염의 예상되는 경중도, 범위 또는 정도등을 감소시킬 수 있다. 임의적으로 환자는 포유동물체이다.
본 발명의 화합물은 Wnt TCF/카테닌 신호를 억제하는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 또 하나의 특징은 본 발명의 리버스-턴 유사체의 안전하고 유효한 양을 환자에게 필요에 따라 투여를 포함하여 이루어지는 결절경화군(tuberious sclerosis complex) (TSC)의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. TSC를 갖는 대상환자는 전형적으로 뇌, 심장, 신장 및 다른 조직에서 다발성 소성병변을 나타낸다 (참조, 예를 들어 Gomez, M.R. Brain Dev . 17(suppl): 55-57 (1995)). 포유 동물 세포연구는 TSC1 (하마르틴(hamartin)을 발현함) 및 TSC2 (튜베린을 발현함)의 과잉발현이 세포증식을 음성으로 조절하며 또한 G1/S정지를 유발하는 것으로 나타났다 (참조, 예를 들면 Miloloza, A. 등, Hum. Mol . Genet. 9: 1721-1727 (2000)). 다른 연구들은 하마르틴 및 튜베린이 ß-카테닌 분해 복합물의 수준에서 작용하며 또한 더욱 구체적으로 이들 단백질이 베타-카테닌 분해 복합물에 참여함으로써 베타-카테닌 안정성 및 활성도를 음으로 조절하는 것으로 나타났다 (참조: 예, Mak, B.C. 등, J. Biol . Chem . 278(8): 5947-5951, (2003)). 베타-카테닌은 막-결합 카드헤린 패밀리의 구성원과의 결합을 통해 세포 접착에 참여하며 또한 Wnt/Wingless 경로의 핵심성분으로 세포 증식 및 분화에 참여하는 95-kDa 단백질이다 (참조: 예, Daniels, D. L. 등, Trends Biochem . Sci . 26: 672-678 (2001)). 이 경로의 조절 잘못은 사람 및 설치류 동물에서 종양을 발생시키는 것으로 나타났다. 본 발명은 ß-카테닌 활성 및 특히 다른 단백질과의 그의 상호작용을 조절하는 화합물을 제공하며, 따라서 TSC의 치료에 사용될 수 있는 화합물을 제공한다. 따라서 하나의 실시태양에서 본 발명은 TSC를 치료한다. 즉 본 발명의 리버스-턴 유사체를 TSC가 있는 환자에게 투여함으로써 TSC의 경중도, 범위 또는 정도등을 감소시킬 수 있다. 또 하나의 실시태양에서 본 발명은 TSC를 예방한다. 즉 본 발명의 리버스-턴 유사체를 새로운 또는 추가의 TSC의 발병이 예상되는 환자에게 투여하면 TSC의 예상되는 경중도, 범위 또는 정도등을 감소시킬 수 있다. 임의적으로 환자는 포유동물체이다.
본 발명의 화합물은 Wnt 신호의 발현을 억제하는 것으로 나타났다. Kaposi의 육종-관련된(associated) 헤르페스바이러스 (KSHV) 잠복기-관련된(associated) 핵 항원(LANA)은 일차 삼출액 임파종 (PEL) 및 다중심성 카스틀맨 질병(Castleman's disease)과 같은 카포시의 육종(KS) 및 ß-세포 암을 포함하는, 모든 KSHV-관련 종양에서 발현된다. Fujimuro, M. 등, Nature Medicine 9(3): 300-306 (2003)은 LANA가 외관상으로는 네가티브 레귤러 GSK-3ß의 재분배에 의해 ß-카테닌을 안정화하는 작용을 한다. 본 발명은 ß-카테닌 단백질 상호작용, 예를 들어 ß-카테닌/TCF 복합물 형성을 억제하는 화합물 및 방법을 제공한다. 따라서 본 발명의 화합물은 ß-카테닌/TCF 복합물의 LANA-유발 축적 및 적어도 부분적으로 KSHV 감염의 결과를 방해한다. 따라서 본 발명의 또 하나의 특징은 카르포시의 육종-관련 헤르페스바이러스(KSHV)의 감염으로 인한 증상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 이러한 증상은 카포시의 육종(KS) 및일차 삼출액 임파종 (PEL)을 포함한 KSHV-관련 종양을 포함한다. 본 방법은 본 발명의 리버스-턴 유사체의 안전하고 유효한 량을 환자에게 필요에 따라 투여함을 포함한다. 하나의 실시 태양에서 본 발명은 KSHV-관련 종양을 치료한다. 즉 KSHV-관련 종양이 있는 환자에게 본 발명의 리버스-턴 유사체를 투여함으로써 종양의 경중도, 범위 또는 정도등을 감소시킬 수 있다. 또 하나의 실시태양에서 본 발명은 KSHV-관련 종양을 예방한다. 즉 본 발명의 리버스-턴 유사체를 새로운 또는 추가의 KSHV-관련 종양의 발병이 예상되는 환자에게 투여하면 예상되는 종양의 경중도, 범위 또는 정도등을 감소시킬 수 있다. 임의적으로 환자는 포유동물체이다.
LEF/TCF DNA-결합 단백질은 활성화된 ß-카테닌 (Wnt 신호의 생성물)과 함께 작용하여 하류 표적 유전자를 전이활성시킨다. DasCupta, R. 및 Fuchs, E. Development 126(20):4557-68 (1999)은 세포운명의 변화 및 분화가 일어나는 경우 헤어(hair) 발달 및 사이클링에서 특정 시간에 활성화된 LEF/TCF 복합물의 중요성을 보였다. 더욱이, 피부 형태발생에서, ß-카테닌은 모낭형성, 쥐에서 "모피" 표현형의 원인이 되는 그의 과잉 발현에 필수적인 것으로 나타났다 (Gat, U. 등, Cell 95:605-614 (1998) 및 Fuchs, E. Harvey Lect. 94: 47-48 (1999). 또한 참조, Xia, X 등, Proc. Natl . Aad . Sci . USA 98:10863-10868 (2001). 본 발명의 화합물은 Wnt 신호의 발현을 억제하고 또한 ß-카테닌 복합물의 형성을 방해하는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명은 본 발명의 리버스-턴 유사체의 안전하고 유효한 량을 환자에게 필요에 따라 투여함을 특징으로 하는 모발생장을 조절하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 량은 환자에서 모발생장을 조절하는데 효과적이다. 임의적으로 환자는 포유동물체이다.
본 발명은 알쯔하이머 질환을 치료 또는 예방하는데 유용한 화합물을 제공한다. 알쯔하이머 질환(AD)은 진행성 치매가 있는 신경퇴행성 질환이다. 이 질환은 뇌에서 3개의 주요 구조 변화, 즉 i) 세포내 단백질 침착물 (또한 신경원섬유 엉킴, NFT로 알려져 있음), ii) 영양실조의 신경염에 의해 둘러싸여 있는 아밀로이드 플라크로 불리우는 세포외 단백질 침착물, 및 iii) 뉴런의 분산상실을 수반한다.
본 발명의 화합물 또는 조성물은 프레세닐린-1 돌연변이에 의해 생긴 뉴런 분화의 흠결을 치유하며 또한 뉴런 전구체 집단이 알쯔하이머 뇌에서 뉴런으로 분화하는 수 또는 속도를 감소시킬 수 있다. 프레세닐린은 그이 작용이 노치 및 아밀로이드 전구 단백질(Notch 및 Amyloid Precursor Protein)의 트래픽킹(trafficking), 턴오버(turnover) 및 개열(cleavage)과 관련된 막횡단 단백질이다. 프레세닐린 1 (PS-1)에서 과오돌연변이(missense mutation)는 이른 발병의 패밀리 알쯔하이머 병과 관련되어 있다 (Fraser 등, Biochem . Soc . Symp. 67, 89 (2001)). 본 발명의 화합물은 PS-1 패미리 알쯔하이머 돌연변이의 개개 환자 뿐만 아니라 일반적 알쯔하이머 환자에게도 적용할 수 있다.
그 외에, 본 발명은 본 발명의 리버스-턴 유사체를 안전하고 유효한 량으로 환자에게 투여하며, 여기서 상기 량은 대상 환자에서 알쯔하이머 질환을 치료 또는 예방하는데 효과적인 알쯔하이머 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 알쯔하이머 질환 치료는 알쯔하이머 질환의 증상 특성의 징후를 감소 또는 제거하거나 또는 이 질환의 진행을 지연시킴을 포함하는 것으로 이해된다. 알쯔하이머 질환의 예방은 이 질환의 발병을 예방 또는 지연시킴을 포함하는 것으로 이해된다.
치료를 필요로 하는 대상은 알쯔하이머 질환의 다양한 단계에 있는 인간 또는 비-인간 영장류 동물 또는 다른 동물일 수 있다. 알쯔하이머 질환을 진단하는 방법은 신경정신적 조치, 기능성 이미지 조치, 생물학적 마커, 및 뇌조직의 검시를 포함하여, 당해 분야에 공지되어 있다 (참조: Dinsmore, J. Am. Osteopath, Assoc . 99(9 Suppl.): S1-6, 1999; Kurz 등, J. Neural Transm . Suppl . 62: 127-33, 2002; Storey 등, Front Viosci . 7:e155-84, 2002; Marin 등, Geriatrics 57: 36-40, 2002; Kril 및 Halliday, Int. Rev. Neurobiol. 48: 167-217, 2001; Gurwitz, Trends Neurosci. 23: 386, 2000; Muller-Spahn 및 Hock, Eur . Arch. Psychiatry Clin. Neurosci. 249 Suppl. 3: 37-42; Fox 및 Rossor, Rev. Neuro . (Paris) 155 Sippl. 4: S33-7, 1999). 예방이 필요한 대상은 알쯔하이머 질환을 진행할 위험에 있는 인간 또는 비-인간 영장류 동물 또는 다른 동물, 예를 들어 이 질환에 관여하는 특정한 유전자 및/또는 이 질환에의 발병에 수반된 유전자 (예, 아폴리단백질 E 유전자)의 돌연변이를 갖는 개개 환자 (예, 아밀로이드 전구 단백질,프레세닐린 1, 및 프레세닐린 2를 엔코딩하는 유전자) 일 수 있다 (Rocchi 등, Brain Res. Bull. 61: 1-24, 2003).
일반식(I)에서 기술된 구조를 갖는 화합물은 당해 분야에 공지된 적절한 방법에 의해 알쯔하이머 질환을 치료 또는 예방하는 데 그의 활성을 스크리닝될 수 있다. 이러한 스크리닝은 처음에는 시험관내 배양된 세포 (예, 실시예 8에 기술된 PC-12)를 사용하여 수행하였다. 프레세닐린 1 돌연변이에 의해 생기는 뉴런 분화의 결함을 치유할 수 있는 화합물은 알쯔하이머 질환에 대한 다양한 동물 모델을 사용하여 더욱 스크리닝할 수 있다. 또는, 일반식(I)에 기술된 구조를 갖는 화합물은 알쯔하이머 질환의 동물모델에서 직접 시험할 수 있다. 많은 모델 시스템이 당해 분야에 공지되어 있으며 또한 본 발명에 사용할 수 있다 (참조, Rowan 등, Philos . Trans. R. Soc . Lond . B. Biol . Sci . 358:821-8, 2003; Sant'Angelo 등, Neureochem. Res. 28: 1009-15, 2003; Weiner Harv . Rev. Psychiatry 4: 306-16, 1997). 알쯔하이머 질환을 치료 또는 예방하는 것에 대한 선택된 화합물의 효과는 알쯔하이머 질환의 진행을 분석하기 위해 당해 분야에 공지된 방법에 의해 특성화 또는 검색할 수 있는데, 이는 이 질환의 진단에 대해 상기 기술된 것들을 포함한다.
본 발명은 또한 신경돌기 생성(outgrowth)을 촉진하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 신경돌기 생성을 촉진하는데 유효한 양으로 일반식(I)에 따른 화합물로 뉴런을 접촉시키는 단계를 포함한다. 이들 방법은 신경퇴행성 질환 (예, 녹내장, 반점변성, 파킨슨 질환, 및 알쯔하이머 질환) 및 신경계의 손상을 치료하는데 유용하다. 화합물은 뉴런의 신경돌기 길이가 화합물의 부재하 에서보다 화합물의 존재 하에서 통계적으로 현저하게 더 길면 신경돌기 생성을 촉진한다. 이러한 화합물은 시험관내 배양 세포(예, PC-12 세포, 뉴로블라스토마 B1-4 세포) (Bitar 등, Cell Tissue Res. 298: 233-42, 1999; Pellitteri 등, Eur . J. Histochem . 45: 367-76, 2001; Satoh 등, Biochem . Biophys . Res. Commun . 258:50-3, 1999; Hirata 및 Fujisawa, J. Neurobiol . 32:415-25, 1997; Chauvet 등, Glia 18: 211-23, 1996; Vetter 및 Bishop, Curr . Biol . 5: 168-78, 1994; Koo 등, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 90; 4748-52, 1993; Skubitz 등, J. Cell Biol. 1137-48, 1991; O'Shea 등, Neuron 7: 231-7, 1991; Rydel 및 Greene, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1257-61, 1998)를 사용하거나 또는 외식편 (Kato 등, Brain Res. 31: 143-7, 1983; Vanhems 등, Eur . J. Neurosci . 2: 776-82, 1990; Carri 등, Int . J. Dev. Neurosci . 12:567-78, 1994)을 사용하여 동정할 수 있다. 본 발명에 따른 화합물로 뉴런을 접촉시킴은 시험관내 또는 생체내에서 수행할 수 있다. 수득된 처리된 뉴런은 시험관내 생성된다면 필요로 하는 조직에 이식할 수 있다 (Lacza 등, Brain Res. Brain Res. Protoc . 11: 145-54, 2003; Chu 등, Neurosci. Lett 343: 129-33, 2003; Fukunaga 등, Cell Transplant 8: 435-41, 1999).
본 발명은 또한 신경줄기 세포의 분화를 촉진하는데 유효한 양으로 일반식시킴을 포함하는 신경줄기세포의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 또한 신경퇴행성 질환 (예, 녹내장, 반점변성, 파킨슨 질환, 및 알쯔하이머 질환) 및 신경계의 손상을 치료하는데 유용하다. "신경줄기세포"(neural stem cell)는 적절한 조건하에 뉴런, 성상세포 또는 회돌기교 세포로 분화할 수 있는 클론원성, 미분화된, 다능성 세포를 뜻한다. 화합물은 신경줄기세포가 화합물의 부재 하에서 보다 화합물의 존재 하에서 통계적으로 현저하게 더 높은 분화정도를 나타내면 신경줄기세포의 분화를 촉진하는 것이다. 이러한 화합물은 시험관내 배양 줄기세포 또는 동물모델들과 관계된 분석을 사용하여 확인될 수 있다 (Albranches 등, Biotechnol. Lett . 25: 725-30, 2003; Deng 등, Exp . Neurol. 182: 373-82, 2003; Munoz-Elias 등, Munoz-Elias 등, Stem Cells 21: 437-48, 2003; Kudo 등, Biochem. Pharmacol . 66: 289-95, 2003; Wan 등, Chin. Med . J. 116: 428-31, 2003; Kawamorita 등, Hum. Cell 15: 178-82, 2002; Stavridis 및 Smith, Biochem. Soc . Trans. 31: 45-9, 2003; Pachernik 등, Reprod . Nutr . Dev . 42: 317-26, 2002; Fukunaga 등, supra). 신경줄기세포는 배양된 줄기 세포, 그의 원조직으로부터 새로 분리된 줄기세포, 또는 그의 원생물체내의 줄기세포일 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 화합물로 신경줄기세포를 접촉시킴은 시험관내 (배양된 또는 새로 분리된 줄기세포의 경우) 또는 생체 내 (그의 근원 생물체 내의 줄기세포)로 수행할 수 있다. 수득된 분화된 신경 세포는, 시험관내에서 생성된다면, 필요로 하는 조직으로 이식될 수 있다 (Lacza 등, supra; Chu 등, supra; Fukunaga 등, supra). 이러한 조직은 외상 또는 신경퇴행성 질환을 겪고 있는 뇌조직 또는 다른 신경조직을 포함한다.
도 1은 본 발명의 리버스-턴 유사체를 제조하는 일반 합성 개략도이다.
도 2는 본 발명의 리버스-턴 유사체를 제조하는 일반 합성 개략도이다.
도 3은 SW480 세포를 사용하여 본 발명의 화합물 A의 IC50의 측정에 기반한 그래프이다. 실시예 4에서 준비된 화합물의 다양한 농도에서 SW480 세포의 세포 생장 억제를 측정하여 IC50값을 얻었다. 특히 당해 시험 화합물에 의한 반딧불 형광 억제의 정도와 레닐라 루시퍼라제 활성이 결정되었다. 그 결과 SW480 세포의 생장에 대한 화합물 A 의 IC50은 표 4에 기술되었다. 상세한 과정은 실시예 6에 나타낸 것과 같다.
도 4. PC-12 세포들은 피복된 접시에서 배양하고 50ng/ml 신경 성장 인자(NGF)에서 10일간 분화되었다 (실시예 7에 기술된 바와 같음). (A,B) 운반체가 형질변환된 PC-12세포(A) 및 wt PS-1를 과량 발현하는 PC-12세포(B)는 NGF에서 10일 후 광범위한 신경돌기 생장을 나타낸다. (C) 돌연변이 PS-1/L286V 를 발현하는 PC-12세포는 동일한 배양조건 하에 상당한 신경돌기를 나타내지 않는다. (D,E) (실시예 7에 기술된 바와 같은) GAP-43의 면역 형광 분석, 신경돌기 생장의 분자 마커는, PC-12 세포에서 벡터가 형질변환(transfection)된 것 및 PS-1/WT의 과도한 발현(E) 신경돌기 에서 GAP-43에 대한 강한 염색(D)을 나타낸다. (F) 신경돌기 생장의 결핍은 돌연변이 세포에서 약한 GAP-43 면역 염색에 상응한다. (G) 분화된 세포는 톱 플라쉬(Topflash), TCF/ß-카테닌 정보제공 구조물로 형질전환된다. 세포는 융해되고 루시페라제 활성은 (실시예 7에 기술된 바와 같이) 형질변환 6시간후에 측정하였다. 데이터는 3개의 독립적 실험의 평균 (±SD) 을 나타낸다. 별표는 P＜0.05를 나타낸다.
도 5. 화합물D는 PC-12 과량 발현 돌연변이 PS-1/286V 세포에서 결손된 신경 분화를 표현형상으로(phenotypically) 옳게 고친다. 돌연변이 세포는 분화 기간 도중에 NGF 이외에 10 μM 의 화합물 D에 노출되었다 (Minser 등, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 98, 11714 (2001)). (A) 신경돌기 신장(elongation) 및 연장은 화합물D로 처리시 PS-1/L286V를 과잉 발현하는 PC-12 세포에서 관찰되었다. (B) GAP-43 (녹색)은 돌연변이 세포에서 현저하게 상승하고, 또한 신경돌기에서 나타난다. (C) PC-12세포에서 신경돌기 생장의 정량. 두개의 세포 직경보다 더 큰 신경돌기 길이를 갖는 돌연변이세포의 수는 PC-12세포에서 운반체로 형질변환된 것 및 과잉 발현되는 PS-1/WT의 수보다 10% 미만이었다. 정해진 신경돌기 길이를 갖는 돌연변이체 PS-1/L286V의 수는 10 μM 의 화합물 D 로 처리한 후 상당히 증가하였다. 그 결과는 3개의 독립적 측정의 평균 (±SD)이다. 별표는 P＜0.05를 나타낸다.
도 6. 에프린 B2 (EphB2) 수용체 발현. 면역 형광 분석 및 RT-PCR은 (실시예 7에 기술된 바와 같은) EphB2 수용체 발현을 탐지하기 위해 수행하였다. (A,B) EphB2 수용체는 운반체 형질변환된 것 및 과잉 발현 PS-1/WT 세포의 신경돌기에서 분명히 나타난다. 염색의 강도는 높은 발현 수준과 상호 관련한다. (C) 반면, PS-1/L286V PC-12 세포는 EphB2 수용체 발현이 현저하게 감소하였다. (D) 화합물 D로 돌연변이 세포를 처리하면 EphB2 수용체 발현의 증가를 초래하는데, 이것은 신경돌기 생장의 지점에 집중된다. (E) EphB2 수용체의 발현은 이전에 전사적으로 조절되는 것으로 밝혀졌다 (Guo 등, J. Neurosci . 17, 4212 (1997)). 래인 1, 벡터로 형질변환된 PC-12 세포, 래인 2 과잉 발현 PS-1/WT 세포, 래인 3, 과잉 발현 돌연변이 PS-1/L286V 세포, 래인 4, 화합물 D로 처리된 돌연변이 세포. RT-PCR 분석은 과량 발현 돌연변이 PS-1/L286V 세포에서 EphB2 수용체에 대한 메시지가, 벡터로 형질변환된 및 과잉 발현 wt PS-1 PC-12 세포에서의 것 둘 다에 비해 감소된다. 10 μM 의 화합물 D로 처리는 EphB2 메시지를 상향 조절한다. GAPDH는 내부 조절을 사용한다.
도 7. 화합물D는 G1의 세포를 정지시킨다. FACS 분석은 화합물 D (25μM)(우측) 또는 대조군 (0.5% DMSO (좌측))으로 24시간 동안 처리된 SW480 (하부 패널) 및 HCT116 (상부패널) 세포에 대해 수행되었다. 5.5x106세포는 요오드화 프로피듐(PI)으로 고착 및 염색시켰다. B. 화합물 D는 대장 암종 세포주에서 카스파제를 선택적으로 활성화 시킨다. 정상 대장세포 CCD18Co (우측 그래프)와 함께 SW480 및 HCT116 (좌측 그래프) 세포(105)는 대조군 (0.5% DMSO) 또는 화합물 D (25μM)로 처리되었다. 처리 24시간 후, 세포는 용해되었고, 카스파제-3/7 효소활성을 측정하였다. 상대 형광 단위 (RFU)는 처리된 샘플 (화합물 D 또는 대조군)로부터 블랭크(대조군, 세포 없음)의 단위 값을 빼서 계산한 다음 플롯 하였다.
도 8. 화합물 D는 용량 의존 방법으로 소프트 아가 내의 콜로니 성장을 감소시킨다. 증가하는 농도의 5-플루오로우라실 (5-FU) (0.5-32μM) 및 화합물 D (0.25-5μM)은 삼중 웰의 SW480 에 첨가하였다 (5000 세포/웰). 세포들은 세척되었고 소프트 아가 성장 배지에 현탁되었다. 8일 후 콜로니의 수 (60μM 직경 이상의 콜로니)를 세고 화합물 농도에 대해 플롯 하였다. 3개 결정의 평균 ± SE 가 표시되었다. 화합물의 부재 하에 대조군의 콜로니 수는 1,637±71이었다.
도 9. A. 화합물 C는 누드 마우스 모델의 종양 상장을 감소시킨다. B. 화합물 C는 누드 마우스 모델의 체중을 약간 감소시킨다.
도 10. 설비빈 전사 활동은 Wnt1에 의해 상승 조절되었지만, 화합물D에 의해 노우트-다운(knout-down)되었다. 루시퍼라제 활성의 백분율은 Wnt1 및 화합물 D의 부재 하에, 또는 Wnt1, 화합물 D 또는 이들 둘 다의 존재 하에, 야생형, CBP+/-, 및 p300+/- 3T3세포에서 측정되었다.
도 11. 화합물 A (우측 그래프) 및 화합물 D (좌측 그래프)는 SW480 세포의 설비빈 루시페라제 정보제공자의 활성을 억제한다. 설비빈 프로모터의 조절 하에 있는 루시퍼라제 활성은 다양한 농도의 화합물 A 또는 화합물 D로 처리된 SW480 세 포에서 측정되었다.
도 12. RT-PCT 분석은 화합물 D 처리가 설비빈 유전자의 발현정도를 감소시킴을 나타낸다.
도 13. 화합물 D는 설비빈 프로모터와 다양한 단백질의 연합을 감소시킨다. 화합물 D (25μM) 또는 대조군 (0.5% DMSO)으로 18일간 처리된 SW480에 대한 ChIP측정법을 수행하였다.
도 14. 화합물 D는 전사 수준에서 설비빈 발현(survivin expression)을 감소시킨다. 운반체 (0.5% DMSO) 단독, 10μM 또는 25μM 화합물 D, 또는 5μM 5-Fu로 처리된 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석은 설비빈 6E4 모노크로날 항체 (Cell Signaling Technology)를 사용하여 수행하였다. B. 설비빈 면역형광 현미경 검사. 배양된 암세포가 항-설비빈 그린으로 고착 및 염색되었다. C. 설비빈 면역형광 현미경 검사. 화합물 D로 처리된 SW480 세포가 항-설비빈 그린으로 고착 및 염색되었다.
도 15. 화합물 D는 설비빈 발현의 억제를 통해 카스파제 3 활성을 활성화시킨고, 그러나 카스파제 2 의 활성은 그렇지 않다. 설비빈 유전자를 함유하는 구조물의 형질변환의 존재 하에 또는 부존재 하에 배양된 세포는 스타우스포린(0.5μM), 화합물 D (2.5μM 또는 5.0μM), 또는 이들 둘 다로 처리하였다. 이들 세포 중에 카스파제 2 및 카스파제 3 활성을 측정하였다.
도 16. 화합물 D는 설비빈 발현의 억제를 통해 세포 사멸을 촉진한다. 설비빈 유전자를 함유하는 구조물의 형질변환의 존재 하에 또는 부존재 하에 배양된 암 세포는 스타우스포린(0.5μM), 화합물 D (5.0μM), 또는 이들 둘 다로 처리하였다. 이들 세포들의 세포 사멸을 측정하였다.
도 17. 화합물 D는 G0 기의 세포수를 증가시킨다. 설비빈 유전자를 함유하는 구조물의 형질변환의 존재 하에 또는 부존재 하에 배양된 암 세포는 스타우스포린(0.5μM), 화합물 D (5.0μM), 또는 이들 둘 다로 처리하였다. FCAS 분석은 이들 세포에 대해 수행하였으며 G0 기의 세포의 백분율을 나타내었다.
도 18은 프로드러그 A를 정맥내 볼루스(bolus) 주사 후의 시간의 경과에 따른 마우스 혈장 내의 프로드러그 A 및 그것의 모 화합물의 농도의 변화를 보여준다.
하기 실시예는 본 발명의 화합물, 조성물 및 사용 방법을 보여주는데, 이에 제한되지는 않는다.
제조예 1
( N- Fmoc -N' - R3 - 메틸 히드라지노 )- 아세트산 의 제조
(1) N- Fmoc -N'-메틸 히드라진 의 제조
Figure 112006074580183-PCT00417
2L, 두개의 목을 갖는, 둥근 바닥모양의 플라스크가 유리 스토퍼 및 칼슘 튜브와 함께 설치되었다. THF (300mL) 내의 메틸히드라진 설페이트 (20g, 139 mmol, R3 는 메틸)가 첨가되었고, THF 내의 DiBoc 용액 (33g, 153 mmol)이 첨가되었다. 중탄산나트륨 포화 수용액 (500 ml)이 한방울씩 첨가 깔때기를 통해 격렬한 교반과 함께 2시간 동안 첨가되었다. 6시간 후에, THF 내의 Fmoc-Cl (39g, 153 mmol) 용액이 천천히 첨가되었다. 그 결과 현탁액은 6 시간 동안 0℃ 에서 교반하였다. 그 혼합물은 에틸 아세테이트 (EA, 500 mL) 로 추출하였고, 유기층이 유지되었다. 그 용액을 황산 나트륨으로 건조시키고, 진공하에 증발시켰다. 그 다음 단계는 정제과정 없이 진행하였다.
1L, 두개의 목을 갖는, 둥근 바닥모양의 플라스크가 유리 스토퍼 및 칼슘 튜브와 함께 설치되었다. 이전 단계의 생산물 용액을 MeOH(300mL) 에 넣고 농축된 HCl (30 mL, 12 N) 이 얼음수 욕조에서 마그네틱 교반을 하며 첨가 깔때기를 통해 천천히 첨가되었고, 밤새 교반하였다. 상기 혼합물은 EA (1000mL) 로 추출되었고 유기층이 유지되었다. 그 용액을 황산 나트륨으로 건조시키고, 진공하에 증발시켰다. 그 나머지는 n-헥산 및 EA와 함께 재결정화에 의해 정제되어서 N-Fmoc-N'-메틸 히드라진 (32.2g, 83%)을 얻었다. 1HNMR (DMSO-D6) δ 7.90~7.88 (d, J=6 Hz, 2H,), 7.73~7.70 (d, J=9 Hz, 2H,), 7.44~7.31 (m, 4H), 4.52~4.50 (d, J=6 Hz, 2H), 4.31~4.26 (t, J=6 Hz, 1H), 2.69 (s, 1H).
(2) (N-Fmoc-N'-메틸-히드라지노)-아세트산 t-부틸 에스테르의 제조
Figure 112006074580183-PCT00418
1L, 두개의 목을 갖는, 둥근 바닥모양의 플라스크가 유리 스토퍼 및 칼슘 튜브와 연결된 환류 냉각기(reflux condenser)와 함께 설치되었다. 톨루엔 내의 N-Fmoc-N'-메틸-히드라진 (20g, 75 mmol) 용액 (300 mL)이 첨가되었다. 톨루엔 내의 t-부틸브로모 아세테이트 (22g, 111 mmol) 용액 (50 mL)이 천천히 첨가되었다. Cs2CO3 (49g, 149 mmol)가 천천히 첨가되었다. NaI (11g, 74 mmol)가 격렬한 교반과 함께 천천히 첨가되었다. 반응 혼합물은 하루 이상 환류 온도에서 교반 되었다. 생성 혼합물은 필터되고 EA (500 mL)로 추출되었다. 그 용액을 황산 나트륨으로 건조시키고, 진공하에 증발시켰다. 생성물은 헥산:EA =2:1 인 용액으로 크로마토그래피에 의해 정제되어 (N-Fmoc-N'-메틸-히드라지노)-아세트산 t-부틸 에스테르 (19.8g, 70%)를 얻었다. 1H-NMR (CDCl3-d) δ 7.78~7.75 (d, J=9 Hz, 2H,), 7.61~7.59 (d, J=6 Hz, 2H,), 7.43~7.26 (m, 4H), 4.42~4.40 (d, J=6 Hz, 2H), 4.23 (b, 1H), 3.57 (s, 2H), 2.78 (s, 3H), 1.50 (s, 9H).
(3) (N-Fmoc-N'-메틸-히드라지노)-아세트산의 제조
Figure 112006074580183-PCT00419
1L, 두개의 목을 갖는, 둥근 바닥모양의 플라스크가 유리 스토퍼 및 칼슘 튜브에 연결된 환류 냉각기와 함께 설치되었다. (N-Fmoc-N'-메틸-히드라지노)-아세트산 t-부틸 에스테르 (20g, 52 mmol) 가 첨가되었다. HCl 용액 (150mL, 디옥산 내의 4M 용액) 격렬한 교반과 함께 얼음수 욕조내에서 천천히 첨가되었다. 상기 반응 혼합물은 실온에서 하루 이상 교반되었다. 상기 용액은 감압하 40℃에서 완전히 농축되었다. 포화 NaHCO3 수용액 (100 mL) 이 첨가되었고, 그 수층(aqueous layer)은 디에틸 에테르 (100 mL)로 세척되었다. 농축된 HCl이 0℃ (pH 2-3) 에서 한방울씩 천천히 첨가되었다. 상기 혼합물은 추출되었고, 유기물층이 유지되었다(500 mL, MC). 상기 용액을 황산 나트륨으로 건조시키고, 진공하에 증발시켰다. 그 나머지는 n-헥산 및 에틸아세테이트로 재결정화에 의해 정제되어서 (N-Fmoc-N'-메틸-히드라지노)-아세트산 (12g, 72%)을 얻었다. 1H-NMR (DMSO-d6) δ 12.38 (s, 1H), 8.56 (b, 1H), 7.89~7.86 (d, J=9 Hz, 2H,), 7.70~7.67 (d, J=9 Hz, 2H,), 7.43~7.29 (m, 4H), 4.29~4.27 (d, J=6 Hz, 2H), 4.25~4.20 (t, J=6 Hz, 1H), 3.47 (s, 2H), 2.56 (s, 3H).
제조예 2
( N- Fmoc - N'- R 7 - 메틸 히드라지노 )- 아세트산 의 제조
(1) (N'-메톡시카르보닐-히드라지노)-아세트산 에틸 에스테르의 제조
Figure 112006074580183-PCT00420
MOC-NH-NH2 (50g, 0.55 mol) 가 DMF (300ml)에 용해되었고, 이어서 에틸 브로모아세테이트 (68ml, 0.555 mol) 및 포타슘 카르보네이트 (77g, 0.555mol) 가 반응조에 첨가되었다. 상기 혼합물은 5시간 동안 50℃로 유지되었다. 반응이 끝난후에, 혼합물은 여과되었고, EtOAc로 희석한 후, 소금물로 세척하였다 (3회). 조 생성물은 컬럼(용리액 : Hex/EtOAc = 4/1)으로 정제되어 색 없는 기름 72를 얻었다.
(2) [N-R7 -N'-메톡시카르보닐-히드라지노]-아세트산 에틸 에스테르
Figure 112006074580183-PCT00421
에틸 에스테르 (10g, 0.05 mol), 포타슘 카르보네이트 (6.9g, 0.05 mol), 및 R7-브롬화물 (14.1g, 0.06 mol)이 DMF (200ml)에 용해되었고, 그 혼합물은 5시간 동안 50℃로 유지되었다. 반응이 끝난 후에, 혼합물은 여과되었고, EtOAc로 희석한후, 소금물로 세척하였다 (3회). 조 생성물은 크로마토그래피(용리액 : Hex/EtOAc = 4/1)에 의해 정제되었다.
(3) [N-R7 -N'-메톡시카르보닐-히드라지노]-아세트산
Figure 112006074580183-PCT00422
알킬화된 에틸 에스테르 (9.5g, 0.03mol)가 THF/물 (1/1, ml)에 용해되었고, 2N NaOH (28.3ml) 용액을 0℃에서 첨가하였다. 그 혼합물은 실온에서 2시간 동안 교반되었다. 출발 에스테르가 UV로 검출되지 않은 후에, 상기 용액은 EA로 희석되었고, 그 후 분리되었다. 수층은 1N HCl 에 의해 pH 3~4 로 산성화되었고, 그 화합물은 DCM 에 의해 추출되었다 (3 회). 조합된 유기층은 MgSO4 건조되었고 증발되어서 노란색의 고체를 생성하였다.
실시예 1
Figure 112006074580183-PCT00423
(1) N β -Moc-N α -벤질-히드라지노글리신 의 제조
Figure 112006074580183-PCT00424
이 화합물은 문헌의 절차에 따라 제조되었다 (Cheguillaume 등, Synlett 2000, 3, 331).
(2) 1-메톡시카르보닐-2,8-디벤질-6-메틸-4,7-디옥소-헥사히드로-피라지노 [2,1-c][1,2,4]트리아진 의 제조.
브로모아세탈 레진 (60mg, 0.98 mmol/g) 및 DMSO (2.5 ml, 2 M)내의 벤질 아민 용액을 나사뚜껑이 있는 유리병에 넣었다. 그 반응 혼합물이 회전 오븐[Robbins Scientific]을 이용하여 60℃ 에서 12시간 동안 흔들었다. 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF로 세척후, DCM으로 세척하여, 제1 구성 조각을 얻었다.
NMP (Advanced ChemTech)내의, Fmoc-알라닌 (4 당량, 상업적으로 이용가능, 제2 구성 조각), HATU (PerSeptive Biosystems, 4 당량), 및 DIEA (4 당량) 의 용액이 레진에 첨가되었다. 반응혼합물을 실온에서 4시간동안 흔든다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 DMF 로 세척하였다.
레진에 DMF내의 20% 피페리딘을 첨가하였다. 반응 혼합물이 실온에서 8분동안 흔든다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 DMF 로 세척하였다.
DMF 내의 N β -Moc-N α -벤질-히드라지노글리신 (4 당량, 제조예 2의 화합물 (3), 이때 R7 은 벤질, 제3 구성 조각), HOBT [Advanced ChemTech] (4 당량), 및 DIC (4 당량)의 용액이 상기 제조된 레진에 첨가되었다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간동안 흔든 다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 MeOH 로 세척하였다. 레진은 실온에서 진공하에 건조되었다.
상기 레진은 실온에서 18시간 동안 포름산 (2.5 ml)에 의해 처리되었다. 레진이 여과에 의해 제거된 후에, 여과액은 감압하에 농축되어 그 생산물을 기름으로 얻었다. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm; 1.51 (d, 3H), 2.99 (m, 1H), 3.39 (d, 1H), 3.69 (m, 1H), 3.75 (m, 1H), 3.82 (s, 3H), 4.02 (d, 1H), 4.24 (d, 1H), 4.39 (d, 1H), 4.75 (d, 1H), 5.14 (q, 1H), 5.58 (dd, 1H), 7.10-7.38 (m, 10H).
실시예 2
Figure 112006074580183-PCT00425
(1) N'-Fmoc-N-메틸-히드라지노카르보닐 클로라이드의 제조
Figure 112006074580183-PCT00426
얼음으로 냉각된, 15 ml CH2Cl2 및 15 ml 의 NaHCO3 포화 수용액 내의 N-메틸 히드라진 카르복실산 9H-플루오렌-9-일메틸 에스테르 (107 mg, 0.4 mmol)에 톨루엔 내의 1.93 M 포스겐 (1.03 ml, 2 mmol)을 하나의 부분으로 첨가되는 동안 급하게 교반되었다. 상기 반응 혼합물은 30분 동안 혼합되었고, 유기상이 수집되었으며, 물상(aqueous phase)이 CH2Cl2로 추출되었다. 조합된 유기층은 MgSO4로 건조되고, 여과되고, 진공에서 농축되어 128mg (97%) 의 카르바모일 클로라이드를 포음의(foamy) 고체로 얻었다. [주의: 포스겐 증기는 독성이 강하다. 후드에서 사용하라]. 이 생산물은 더 이상의 정제없이 하기 고체 상 합성에 사용되었다.
(2) 2,5-디메틸-7-벤질-3,6-디옥소-헥사히드로-[1,2,4] 트리아졸로[4,5-a]피라진- 1-카르복실산 벤질아미드 의 제조
브로모아세탈 레진 (30mg, 0.98 mmol/g) 및 DMSO 내의 벤질 아민 용액 (1.5 ml, 2 M) 가 나사 뚜껑이 있는 유리병에 놓여졌다. 그 반응 혼합물이 회전 오븐[Robbins Scientific]을 이용하여 60℃에서 12 시간 동안 흔들었다. 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF로 세척 후, DCM으로 세척하여, 제1 구성 조각을 얻었다.
NMP (Advanced ChemTech)내의, Fmoc-알라닌 (3 당량, 상업적으로 이용가능, 제2 구성 조각), HATU (PerSeptive Biosystems, 3 당량), 및 DIEA (3 당량)의 용액이 레진에 첨가되었다. 반응혼합물을 실온에서 4시간 동안 흔든 다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 DMF로 세척하였다. 그렇게 하여 제2 구성 조각을 제1 구성 조각에 첨가하였다.
레진에 DMF내의 20% 피페리딘을 첨가하였다. 반응 혼합물이 실온에서 8분 동안 흔든 다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 DMF로 세척하였다.
DMF 내의 상기 단계 (1)에서 얻은 N'-Fmoc-N -메틸-히드라지노카르보닐 클로라이드 (5 당량, 조합된 제3 제4 구성 조각) 및 DIEA (5 당량) 의 용액이 상기 제조된 레진에 첨가되었다. 반응 혼합물이 실온에서 4시간 동안 흔든 다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, DMF 로 세척하였다.
레진에 DMF내의 20% 피페리딘을 첨가하였다 (1g 의 레진당 10 ml). 반응 혼합물이 실온에서 8분동안 흔든다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 DMF 로 세척하였다.
상기 레진은 실온에서 4시간 동안 DCM 내의 벤질 이소시아네이트 (4 당량) 및 DIEA (4 당량)의 혼합물로 처리되었다. 레진이 여과에 의해 수집된 후에, DMF, DCM 그 다음에는 MeOH로 세척하였다. 레진은 실온에서 진공 건조하였다.
상기 레진은 실온에서 14시간 동안 포름산에 의해 처리되었다. 레진이 여과에 의해 제거된 후에, 여과액은 감압하에 농축되어 그 생산물을 기름으로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm; 1.48 (d, 3H), 2.98 (s, 3H), 3.18 (m, 1H), 3.46 (m, 1H), 4.37-4.74 (m, 5H), 5.66 (dd, 1H), 6.18 (m, 1H), 7.10-7.40 (m, 10H).
실시예 3
2,5,7- 트리메틸 -3,6- 디옥소 - 헥사히드로 -[1,2,4] 트리아졸로 [4,5-A]피라진-1- 카르복실산 벤질아미드 의 제조
표제 화합물은 브로모아세탈 레진이 벤질 아민 대신 메틸 아민 용액과 반응하는 것을 제외하고는 실시예 2에 기술된 것과 동일한 절차에 의해 제조된다. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm; 1.48 (d, 3H), 2.99 (s, 3H), 3.03 (s, 3H), 3.38 (m, 1H), 3.53 (dd, 1H), 4.36 (dd, 1H), 4.52 (q, 1H), 4.59 (dd, 1H), 5.72 (dd, 1H), 6.19 (br.t, 1H), 7.10-7.38 (m, 5H).
실시예 4
2- 메틸 -5-(p- 히드록시페닐메틸 )-7- 나프틸메틸 -3,6- 디옥소 - 헥사히드로 -[1,2,4] 트리아졸로 [4,5-a]피라진-1-카르복실산 벤질아미드 의 제조
브로모아세탈 레진 (30 mg, 0.98 mmol/g) 및 DMSO 내의 나프틸메틸 아민 용 액 (1.5 ml, 2 M) 이 나사 뚜껑이 있는 유리병에 놓여졌다. 그 반응 혼합물이 회전 오븐[Robbins Scientific]을 이용하여 60℃ 에서 12 시간동안 흔들었다. 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF로 세척후, DCM으로 세척하여, 제1 구성 조각을 얻었다.
NMP (Advanced ChemTech) 내의, Fmoc-Tyr(OBut)-OH (3 당량), HATU (PerSeptive Biosystems, 3 당량), 및 DIEA (3 당량)의 용액이 레진에 첨가되었다. 반응혼합물을 실온에서 4시간 동안 흔든 다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 DMF 로 세척하였다. 그렇게 하여 제2 구성 조각을 제1 구성 조각에 첨가하였다.
레진에 DMF 내의 20% 피페리딘을 첨가하였다. 반응 혼합물이 실온에서 8분 동안 흔든 다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 DMF 로 세척하였다.
DMF 내의 N'-Fmoc-N-메틸-히드라지노카르보닐 클로라이드 (5 당량) 및 DIEA (5 당량) 의 용액이 상기 제조된 레진에 첨가되었다. 반응 혼합물이 실온에서 4시간 동안 흔든 다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 DMF 로 세척하였다.
레진에 DMF내의 20% 피페리딘을 첨가하였다 (1g 의 레진당 10 ml). 반응 혼합물이 실온에서 8분 동안 흔든 다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 DMF 로 세척하였다.
상기 레진은 실온에서 4시간 동안 DCM 내의 벤질 이소시아네이트 (4 당량) 및 DIEA (4 당량) 의 혼합물로 처리되었다. 레진이 여과에 의해 수집되고, DMF, DCM 그 다음에는 MeOH로 세척하였다. 레진은 실온에서 진공 건조하였다.
상기 레진은 실온에서 14시간 동안 포름산으로 처리되었다. 레진이 여과에 의해 제거된후에, 여과액은 감압하에 농축되어 그 생산물을 기름으로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm; 2.80-2.98 (m, 5H), 3.21-3.37 (m, 2H), 4.22-4.52 (m, 2H), 4.59 (t, 1H), 4.71 (d, 1H), 5.02 (dd, 1H), 5.35 (d, 1H), 5.51 (d, 1H), 6.66 (t, 2H), 6.94 (dd, 2H), 7.21-8.21 (m, 12H).
실시예 5
2- 메틸 -6-( p - 히드록시페닐메틸 )-8- 나프틸 -4,7- 디옥소 - 헥사히드로 -피라지노[2,1-c][1,2,4]트리아진-1-카르복실산 벤질아미드 의 제조
브로모아세탈 레진 (60 mg, 0.98 mmol/g) 및 DMSO 내의 나프틸 아민 용액 (2.5 ml, 2 M) 이 나사 뚜껑이 있는 유리병에 놓여졌다. 그 반응 혼합물이 회전 오븐[Robbins Scientific]을 이용하여 60℃ 에서 12 시간동안 흔들었다. 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF로 세척후, DCM으로 세척하였다.
NMP (Advanced ChemTech)내의, Fmoc-Tyr(OBut)-OH (4 당량), HATU [PerSeptive Biosystems] (4 당량), 및 DIEA (4 당량) 의 용액이 레진에 첨가되었다. 반응혼합물을 실온에서 4시간 동안 흔든 다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 DMF 로 세척하였다.
레진에 DMF내의 20% 피페리딘을 첨가하였다. 반응 혼합물이 실온에서 8분 동안 흔든 다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 DMF 로 세척하였다.
DMF 내의 N ß -Fmoc-N α -벤질-히드라지노글리신 (4 당량), HOBT [Advanced ChemTech] (4 당량), 및 DIC (4 당량)의 용액이 상기 제조된 레진에 첨가되었다. 반응 혼합물이 실온에서 3시간 동안 흔든 다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, 그 다음에는 DCM 으로 세척하였다. 그 레진에 DMF내의 20% 피페리딘을 첨가하였다 (1g의 레진 당 10 ml). 반응 혼합물을 실온에서 8분 동안 흔든 다음, 레진은 여과에 의해 수집되었고, DMF, DCM, 그 다음에는 DMF 로 세척하였다.
상기 레진은 실온에서 4시간동안 DCM 내의 벤질 이소시아네이트 (4 당량) 및 DIEA (4 당량) 의 혼합물로 처리되었다. 레진이 여과에 의해 수집된후에, DMF, DCM 그 다음에는 MeOH로 세척하였다. 레진은 실온에서 진공 건조하였고, 상기 레진은 실온에서 18시간동안 포름산(2.5 ml)로 처리되었다. 레진이 여과에 의해 제거된후에, 여과액은 감압하에 농축되어 그 생산물을 기름으로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm; 2.73 (s, 3H), 3.13 (d, 1H), 3.21-3.38 (m, 3H), 3.55 (d, 1H), 3.75 (t, 1H), 4.22 (dd, 1H), 4.36 (dd, 1H), 4.79 (d, 1H), 5.22 (t, 1H), 5.47 (m, 2H), 6.68 (d, 2H), 6.99 (d, 2H), 7.21-8.21 (m, 12H);
MS (m/z, ESI) 564.1 (MH+) 586.3 (MNa+).
실시예 6
SW480 세포의 IC 50 측정 및 세포주에 대한 세포독성 시험에 대한 생물학적 분석
이 실시예에 이용된 시험 화합물 (화합물 A) 는 실시예 4에서 제조되었다.
Figure 112006074580183-PCT00427
a. 정보 제공 유전자 측정법 (Reporter Gene Assay)
SW480 세포는 SuperfectTM 형질변환 시약(transfect reagent) (Qiagen, 301307)을 사용하여 형질 변환 되었다. 형질변환 하루 전에 세포는 간단하게 트립신 처리 되었고, 6 웰 플레이트 (5 x 105 세포/웰) 에 형질변환일에 50-80% 가 융합하도록 플레이트되었다.
4 마이크로그램 (TOPFlash) 및 1 마이크로 그램 (pRL-null) 의 DNA 가 150 ㎕ 의 혈청 없는 배지에서 희석되었고, 30 ㎕ 의 SuperfectTM 형질변환 시약이 첨가되었다. DNA-Superfect 혼합물은 실온에서 15분간 항온 보관하였고, 그후 1 ml 의 10% FBS DMEM 이 추가의 3시간 동안의 항온보관 동안 이 복합체에 첨가되었다. 복 합체가 형성되는 동안, 세포는 항생제 없이 PBS로 두번 세척되었다.
DNA-SuperfectTM 형질변환 시약 복합체는, 3시간 동안 5% 의 CO2 에서 37℃ 로 항온보관하기 전에 적용되었다. 항온 보관 이후에, 10% FBS의 회복 배지가 첨가되어 최종 용적이 1.18 ml 이 되었다. 3시간의 항온보관 후에, 세포는 수확되고 96 웰 플레이트(3 x 104 세포/웰)에 다시 접종되었다. 5% 의 CO2 에서 37℃ 로 밤새 항온 보관한 후, 세포는 화합물 A로 24시간 동안 처리되었다. 마지막으로 활성도가 루시페레이즈 측정법 (Promega, E1960)에 의해 측정되었다.
도 3 은 SW480 세포에 대한 화합물 A의 IC50 측정 결과를 보여준다.
b. 설포로다민 B (SRB) 측정법
화합물 A의 하기 기재된 세포에 대한 성장 억제 효과는 설포로다민 B (SRB) 측정법에 위해 측정되었다. 100 ㎕ 배지 내의 SW480 세포들은 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 플레이트되었고 24시간 동안 고착되도록 허용하였다. 화합물 A는 웰에 첨가되어 원하는 최종 농도를 생산하도록 하였고, 그 플레이트는 48 시간 동안 37℃ 에서 항온보관하였다. 상기 세포들은 100 ㎕의 차가운 (4℃) 10% 트리클로로아세트산 을 각각의 웰에 첨가함으로써 고정되었고, 이어서 1시간 동안 4℃ 에서 항온보관하였다. 플레이트는 탈이온수로 5회 세척하였고 공기 건조를 시켰다. 세포는 이어서 15분간 웰에 100 ㎕의 SRB 용액 (1% 아세트산 (v/v) 내에 0.4% SRB(w/v))의 첨가에 의해 염색되었다. 염색 후에, 플레이트는 재빨리 1% 아세트산으로 5회 세척하여 결합되지 않은 색소를 제거하였고, 공기 건조시켰다. 결합된 색소는 플레이트를 판독하기 전에 10 mmol/L 트리스 베이스 (Tris base) (pH 10.5)로 용해시켰다. Molecular Device로 515 nm의 파장으로 플레이트 판독기에서 광학 밀도(OD)를 읽었다. 성장의 억제는 상대 생존율 (대조군의(of control) %)로 표현되고 GI50 가 로그/프로빗 변형(transformation) 후에 농도-반응 커브로부터 계산되었다.
표 6은 실시예 4에서 얻은 화합물 A 에 대한 시험관내 세포독성 (SRB) 측정법 데이터를 보여준다. 표 6의 수치는 ㎍/ml 로 나타낸다.
기원 세포 실시예4 시스플라틴 5-FU
대장 T84 1.134 > 10 1.816
LOVO 0.532 > 10 1.029
HT29 1.694 > 10 5.334
DLD-1 1.775 > 10 > 10
COLO205 1.136 > 10 1.130
CACO-2 1.201 > 10 0.451
SW480-Kribb 1.137 > 10 > 10
SW480-CWP 0.980 4.502 > 10
SW620 1.426 > 10 5.570
KM12 1.451 > 10 2.729
HCT15 2.042 > 10 1.179
HCT116 0.96 > 10 1.039
HCC2998 1.047 > 10 5.486
786-0 1.417 3.347 0.584
백혈병 HL60 1.243 > 10 7.010
RPMI8226 1.1.177 > 10 > 10
K562/VIN 1.640 > 10 7.071
K562/ADR 7.682 > 10 > 10
K562 1.247 > 10 6.133
전립선 PC3 1.207 > 10 > 10
HT1080 1.469 > 10 0.798
폐 A549 1.386 > 10 1.007
NCI H460 1.498 > 10 1.397
NCI H23 1.296 5.176 2.254
신장 293 0.731 6.641 2.015
CAKI-1 0.467 > 10 0.925
ACHN 1.263 5.019 5.062
흑색종 RPMI7951 0.936 5.010 0.920
M14 2.289 3.447 1.225
HMV-II 4.834 3.190 0.695
HMV-I 1.153 5.478 2.110
G361 0.584 4.827 1.539
CRL1579 1.830 0.699 > 10
A431 1.083 3.722 0.404
A253 1.398 2.084 2.926
UACC62 0.563 > 10 1.093
SK-MEL-28 1.291 > 10 > 10
SK-MEL-5 0.888 > 10 2.434
LOX-IMVI 1.526 > 10 > 10
A375 1.391 > 10 1.464
가슴 MCF7/ADR 9.487 9.907 > 10
MCF7 7.355 > 10 1.751
실시예 7
민 마우스(Min Mouse) 모델
본 발명의 선택된 화합물들 (화합물 B 및 화합물 C)는 그들의 항암제로서의 효능을 평가하기 위해 민 마우스 모델에서 평가하였다.
Figure 112006074580183-PCT00428
화합물 B
Figure 112006074580183-PCT00429
화합물 C
민 마우스 모델은 이러한 종류의 효능을 시험하기 위해 널리 사용되는 모델이다. 여러 처치 후에 이들 마우스의 소장 및 대장에 형성되는 폴립의 수를 측정하였다 (표 7). 데이터는 두개 화합물 모두, 약 300 mpk로 투여되는 경우, 운반체로만 처치한 대조 마우스에 비해 민 마우스에서 폴립의 수가 감소 된다는 것을 보여준다.
민 마우스 모델 데이터
그룹 폴립의 수( 평균 ± S.D.) P (총합) Vs. VH % 억제 vs. VH
소장 대장 총계
야생형 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 - -
운반체 65.8±15.9 1.8±1.5 67.7±15.3 - -
화합물 C -100 mpk 69.2±20.8 1.7±1.5 71.4±23.0 - -
화합물 C -300 mpk 46.1±17.1 1.1±1.2 47.0±16.9 <0.01 31
화합물 B -300 mpk 45.2±22.1 1.4±0.9 46.8±17.0 <0.01 31
술린닥(Sulindac) -160 ppm 48.0±20.7 0.5±0.5 48.5±20.9 <0.05 28
실시예 8
프레세닐린 -1 돌연변이에 의해 야기된 신경세포 분화의 CBP /ß- 카테닌 상호작용 구조 결함의 화학유전자 억제
하기 화합물 (화합물 D) 이 본 실시예에서 사용되었다:
Figure 112006074580183-PCT00430
재료 및 방법
플라즈미드 . 톱플래쉬(TOPFLASH) 및 폽플래쉬(FOPFLASH) 정보제공자 구조체가 DH5α 적격세표 (competent cell)로 표준 규약에 의해 형질전환되었다. 형질변환 측정법에 사용된 플라즈미드는 EndoFree Maxi Kit (Qiagen, Valencia, CA)을 사용하여 분리 정제 되었다.
PC-12 세포 배양. PC-12 세포는 10% 말 혈청, 5% 태아 소 혈청, 4.5 g/L 포도당, 2 mM L-글루타민, 1.0 mM 소디움 피루베이트 및 10 ㎍/ml 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 에서 보육되었다.
세포 분화. 세포 배양 접시는 하루밤동안 0.25 mg/ml 의 콜라겐 (Cohesion, CA), 10 ㎍/ml 폴리-L-리신 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 및 12 ㎍/ml 의 폴리에틸렌이민 (ICN, La Mesa, CA)으로 예비 코팅하였다. 세포들은 코팅된 접시에서 15,000 세포/cm2 으로 배양되었고, 50 ng/ml 의 신경 성장 인자 (NGF) (Sigma-Aldrich)를 포함하는 감소된 혈청 (1% 태아 소 혈청)의 배지에서 10일간 항온 보관하여 뉴런비슷한 표현형으로 분화하였다. NGF를 포함하는 배지는 매 2-3일 마다 갈아주었다.
화합물 D 로 처치. 카테닌/CBP 상호작용의 작은 분자 억제자인 화합물 D 는 DMSO 에 스톡 농도 100 mM 로 용해되었다. 분화된 PC-12/L286V 세포들은 4시간 동안 이 화합물의 증가하는 농도로 처치하였다. 이 처치기 후에 형질변환이 개시되었다. 세포 분화 실험을 위해, 화합물 D 가 전체 분화 시기를 통해 10μM 의 농도로 NGF 와 함께 첨가되었다.
형질변환( Transfection ). PC-12 세포는 60-mm 접시에서 배양하였고 분화되었다. 10 일간의 분화기간 끝에, 세포는 60-mm 접시당 2 ㎍의 정보제공 구성체, TOPFLASH 및 FOPFLASH로 유전자 전달(transfect)되었다. 형질변환은 Superfect (Qiagen)을 이용하여 제작자의 지시대로 수행되었다.
루시퍼레이즈 분석. 세포가 형질변환 6시간 후 100 ㎕의 세포배양 용해 시약 (CellCulture Lysis Reagent (Promega, Madison, WI)) 으로 용해되었고, 마이크로센트리퓨지 튜브에 긁어 넣었다. 그후 튜브를 12000 rpm 에서 잠시 (약 10초간) 원심분리하여 세포 찌꺼기의 펠릿을 얻었다. 루시페레이즈 활성도는 20 ㎕의 세포 용해질 (lysate) 및 100 ㎕의 루시페레이즈 분석 시스템 (Luciferase Assay System (Promega))으로부터의 기질에 대해 측정하였다. 루시페레이즈 활성도는 ackard LumiCount. (Hewlett Packard)를 이용하여 측정하였다. 루시페레이즈의 정량은 3겹으로 수행되었고, 최소한 세번의 독립된 실험에서 반복되었다.
면역 형광 검사( Immunofluorescence ). 세포들은 10,000 세포/cm2 의 밀도로 6-웰 배양 플레이트내의 멸균된 코팅된 22x22 mm 커버유리에 플레이트 되었다. 앞서 기술한대로, 10일동안 분화가 개시되었다. 분화된 세포들은 -20℃에서 15분간 메탄올로 고정되었다. 이어서 이것을 PBS + 0.1% Triton X-100로 15분간 항온 보관하였다. 커버유리는 에프린 B2 수용체 (Santa Cruz Biotechnology) 및 Gap-43 (Novus Biologicals)에 대한 항체와 함께 37℃에서 40분간 항온 보관되었다. PBS-Triton X-100로 연속하여 세척한후에, FITC 에 접합된 2차 항체(Jackson ImmunoResearch, Westgrove, PA) 가 적용되었다. 모든 슬라이드 이미지가 Nikon Eclipse E600 직립 현미경에 장착된 Nikon PCM2000 레이저 스캐닝 공동초점 현미경 (Nikon, Melville, NY)을 사용하여 얻어졌다.
신경돌기 성장의 정량. 세포수가 여섯개의 임의적으로 선택된 현미경적 시야 (10X) 로부터 세어졌다. 각각의 시야에서, 세포의 총수뿐 아니라, 세포 몸체의 길이보다 두배 더 큰 신경돌기를 보이는 세포가 측정되었다. 수치는 세개의 독립적인 실험으로부터의 복사본으로부터 얻어진 것이다.
RT- PCR. 에프린 B2 (EphB2) 수용체에 대한 mRNA 수준을 분석하기 위해, 총 RNA 가 Trizol (Invitrogen-GIBCO-BRL, Baltimore, MD)을 이용하여 분화된 세포로부터 분리되었다. 2㎍ RNA 가 임의의 육합체(hexamer) (50 ng)를 갖는 총 용적 20 ㎕ 내에서 Superscript II 역전사 시스템 (Invitrogen-GIBCO-BRL)을 이용하여, 제작자의 지시에 따라 역전사 되었다. PCR은 5 ㎕ cDNA, 100 pmol 의 프라이머, 100 μM dNTPs, 1X 태그 완충제 (Taq buffer) 및 1.5 mM MgCl2 를 갖는 50 ㎕ 용적내에서 수행되었다. 반은 혼합물은 80℃로 10분간 가열하였고, 그후 태그(tag)를 넣어 주었다. cDNAs는 25 (EphB2 수용체) 또는 15 (GAPDH) 사이클 동안 증폭되었다. 증폭의 1회전은 94℃에서 1분으로 구성되고, 60℃에서 2분, 및 72℃ 에서 2분으로 이루어지고, 최종 연장시간은 72℃ 에서 10분이다. PCR 생산물은 2% 젤에서 에티디움 브로마이드에 의해 염색되어, 전기영동에 의해 분석되고 시각화된다. EphB2 수용체의 PCR 프라이머는 5'-CACTACTGGACCGCACGATAC-3' 및 5'-TCTACCGACTGGATCTGGTTCA-3' 이 사용된다. GAPDH 를 위한 프라이머 짝은 5'-GGTGCTGAGTATGTCGTGGA-3' 및 5'-ACAGTGTTCTGGGTGGCAGT-3' 이다.
결과
래트 PC-12 세포는 신경 융기 계보로부터 유래하고, 신경 성장 인자(NGF) 처리로 신경돌기를 지닌 교감신경-유사 뉴런으로 분화를 겪는다 (Greene 및 Tischler, Proc Natl Acad Sci U S A 73, 2424 (1976)). PC-12 세포 기반 모델을 사용하여, 일찍 개시된 FAD 관련된 PS-1 돌연변이인 PS-1/L286V의, TCF/β-카테닌에 매개된 전사 및 신경 분화에 대한 영향이 특징지워졌다. TCF/β-카테닌/CBP 에 의해 매개되는 전사를 특이적으로 블로킹하면, 신경 분화에서 PS-1에 의해 유도된 결함이 경감된다는 것이 입증되었다.
야생형 PS-1 (PS-1/WT) 또는 돌연변이 PS-1 (PS-1/L286V) 둘중 하나를 안정적으로 과량 발현시키는 PC-12 세포 및 벡터만을 형질변환시킨 대조군 세포 주가 (Guo 등, Neuroreport , 8,379 (1996)) 콜라겐, 폴리-L-리신 및 폴리-에텔렌이민을 코팅한 접시에 플레이트되었다. 50ng/ml 의 NGF 를 10 일간 처치함으로써 분야가 유도되었다. 과량 발현되는 PS-1/WT 세포 또는 벡터가 형질변환된 세포는 광범위한 신경돌기 형성을 보인 반면 (ATCC 로부터의 PC-12 세포 클론과 유사), PS-1/L286V 돌연변이 세포들은 오직 땅딸막한(stubby) 신경돌기 형성만을 보였다 (도 4A-C). 게다가, 벡터가 형질변환된 PC-12 대조군(control) 및 PS-1/WT 세포들은 신경 분화 마커 GAP-43 의 광범위한 발현을 나타낸 반면(Gorgels 등, Neurosci Lett. 83,59 (1987)) (도 4D, E), PS-1/L286V 세포들은 본질적으로 이 마커가 없었다 (도 4F).
PS-1/L286V 돌연변이의, 표준적인 Wnt/β-카테닌 신호에 대한 효과를 평가하기 위해, 우리는 일시적으로 NGF 처리된 PC-12 세포들을 톱플래쉬, Wnt/β-카테닌 신호 정보제공 구성체로 형질변환시켰다 (Morin 등, Science 275, 1787 (1997)). 도 4F 에서 보는 바와 같이, 과량발현되는 PS-1/WT 세포는, 벡터 대조군 세포들과 비교하여 비슷한 수준의 TCF/β-카테닌 신호를 갖는다. 그렇지만, PS-1/L286V 돌연변이 세포들은 톱플래쉬 발현이 상당히 (10배) 증가되는 것을 보여준다. 이와는 대조적으로, 음성 대조 정보제공 구성체인 폽플래쉬(Fopflash) 는 어떤 상당한 차이를 보이지 않는다.
PS-1/L286V 돌연변이 세포 내의 조절곤란된 TCF/β-카테닌 신호계가 분화의 결함 및 신경돌기 생장에 원인인 것으로 가정되었다. 이 가정을 시험하기 위해, TCF/ß-카테닌 신호의 특정 적은 분자 억제자인 화합물 D를 사용하였다 (Emami 등, Cancer Cell, in press). 이 작은 분자는 선택적으로 β-카테닌/CBP 상호작용을 방해하지만, 그러나 β-카테닌/p300 의 상호작용을 막지는 않아서, TCF/β-카테닌 전사의 서브세트를 가로막는다. PS-1/L286V 돌연 변이 세포를 10μM 의 화합물 D 및 NGF 로 처치하면 TCF/β-카테닌 정보제공 유전자 전사가 감소하고, 과량 발현되는 PS-1/WT 세포에서 본 것처럼(Figs.5 A, B), 처치되지 않은 세포와 비교할때 (도 4C) 본질적으로 정상인 신경돌기 생장 및 분화를 이끈다 (도 5A). 또한, 화합물 D 를 처리한 PS-1/L286V 돌연변이는 PS-1/WT 및 벡터가 형질변환된 세포에 착색된 것과 비슷한 강도의 GAP-43 를 보였다(도 4B). 화합물 D 가 처리된 돌연변이 세포가 벡터 대조군 또는 PS-1/WT 세포의 것과 비슷한 신경 돌기를 나타냈다는 것을 증명하기 위해, 세포 몸체의 길이의 두배보다 더 큰 신경 돌기를 갖는 세포의 수를 세었다. 화합물 D 를 처리하면, 신경돌기를 갖는 세포의 백분율을, 벡터가 형질변환된 것 및 과량발현되는 PS-1/WT 세포의 것에 비슷한 수준으로 상당히 증가시킨다 (도 5C). TCF/β-카테닌/CBP에 의해 매개되는 전사를 막으면 PS-1/L286V 돌연변이체에 기인한 신경돌기 생장 및 신경 분화에서의 많은 표현형상의 결함을 교정시킨다는 결론을 얻었다.
에프린 B2 수용체 (EphB2)는 시냅스 형성에 연관되어 왔고 (Wilkinson, Nat. Rev. Neurosci. 2, 155 (2001)) 에프린 A 패밀리는 최근에 (뇌의) 해마상(狀)융기 가지돌기 가시 (hippocampal dendritic spine morphology) 형태학에 역할을 하는 것으로 보여졌다 (Murai 등, Nat. Neurosci . 6, 153 (2003)). 집중된 EphB2 발현이 관찰되었는데, 이것은 벡터 및 PS-1/WT가 형질변환된 세포에서 신경 공정과 함께 위치결정된 반면 (도 6A, B), PS-1/L286V 돌연변이 세포는 매우 약하고 흩어진 EphB2 신호를 나타냈다 (도 6C). PS-1/L286V 돌연변이 세포에서 증가된 TCF/β-카테닌 신호는 RT-PCR에서 판단된 것처럼 그 자체로서 감소된 EphB2 발현을 나타낸다 (도 6E, 래인 3). 또한, 10 μM 의 화합물 D 의 첨가는 이들 세포에서 EphB2 발현뿐 아니라 (도 6D) EphB2 메시지의 증가를 가져왔다. 이들 결과는 바틀과 그 동료들의 데이타와 일치하는데 (Batlle 등, Cell 111,251 (2002)) 그들은 최근에 EphB2/EphB3 수용체 및 그들의 리간드 에프린-B1 의 발현이 대장의 소낭(crypts) 내에서 TCF/β-카테닌 전사를 통해 역으로 조정된다는 것 및 적절한 조절이 적절한 세포 증식, 분화, 분류에 중요하다는 것을 보였다. 우리는 PS-1/L286V 돌연변이가 증가된 TCF/β-카테닌 신호를 통해 EphB2 수용체의 발현을 감소시키고, 이것은 화합물 D에 의해 매개되는 β-카테닌/CBP 상호작용의 억제에 의해 교정된다는 증거를 제시한다.
실시예 9
화합물 D 는 G1 /S-기 정지를 일으키고, 카스파제 활성을 활성화시킨다
플로우 세포 계측 분석( FACS )
FACS 분석을 위해, 대략 5 X 106 화합물 D 처치된 세포 또는 벡터-처치된 세포가 70% 냉각된 에탄올에 의해 고정되었고, 최소한 30분간 -20℃에 보관되었다. 세포는 1X PBS 로 한번 세척하였고, 요오드화 프로피듐 (PI) 용액 (85 ㎍/ml 요오드화 프로피듐(propidium iodine), 0.1% Nonidet P-40, 10 mg/ml RNAse) 과 함께 30 분간 실온에서 항온보관하였다. 각각의 샘플에서 10,000 개의 염색된 세포를 Beckman Coulter EPICS XL-MCL 플로우 세포계측기를 이용하여 얻었고, 세포 사이클의 다른 시기에 있는 세포의 백분율은 Expo32 ADC 소프트웨어 (Coulter Corporation, Miami, Florida, 33196) 에 의해 결정되었다.
카스파제 -3 활성도 분석
SW480, HCT116, 및 CCD18Co 세포들이 웰당 105 세포(96웰 플레이트)로 처리전에 24시간 동안 플레이트되었다. 25 μM 의 화합물 D 또는 대조군(control) (0.5% DMSO) 이 각각의 웰에 첨가되었다. 처리 후 24시간에 세포는 용해되었고, 카스파제-3/7 활성도 키트 (Apo-One Homogeneous caspase-3/7 assay, #G77905, Promega)를 사용하여 측정되었다. 상대 형광 단위 (RFU) 는 실험 측청 값으로부터 블랭크(대조군, 세포 없음) 의 단위 값을 빼서 얻었다.
화합물 D 는 G1 /S-기 정지를 일으키고, 카스파제 활성을 활성화시킨다
시클린 D1 ( cyclin D1)유전자의 발현의 억제는 세포 사이클의 G1/S-기에서의 정지를 일으킨다는 것이 보여져 왔다 (Shintani 등, "침샘의 인두 포낭암에서의 RB 경로(Rb-p16INK4A-cyclin D1)의 드문 변경," Anticancer Res. 20:2169-75 (2000)). HCT116 (도 7A, 윗쪽 패널) 및 SW480 (도 7A, 아래쪽 패널) 세포들은 24시간동안 화합물 D (25μM) (도 7A, 오른쪽) 또는 대조군 (0.5% DMSO) (도 7A, 왼쪽)로 처치되었다. 세포들은 이어서 요오드화 프로피듐 (PI) 로 염색되었고 FACS 세포형광계수기 (cytofluorometry)로 DNA 함량을 분석하였다. 예상한 대로 대조군 세포(control cells, (도 7A, 왼쪽))는 정상적으로 사이클링 하는 반면, 화합물 D 처치된 세포(도 7A, 오른쪽)는 세포 주기의 G1/S-기 에서의 축적이 증가하는 것을 보여주었다. 그래서, 화합물 D가 G1기에서 세포를 정지를 일으키는 것을 볼 수 있다.
카스파제는 시스테인 단백질 분해 효소로서, 일반적으로 세포자멸 자극에 의해 유발되는 세포의 주어진 모집단에서 활성화된다. SW480, HCT116, 및 야생형 대장 세포들 (CCD18Co 세포들)에서 세포자멸 유도를 평가하기 위해, 세포들을 화합물 (25μM) 또는 대조군(control) (0.5% DMSO) 중 하나로 24시간 동안 처리하였고, 이어서 카스파제-3/7 활성도를 분석하였다.
도 7B에 나타난 바와 같이, 화합물 D 는 CCD18Co 세포와 비교하여 SW480 및 HCT116 세포에서 카스파제-3/7 경로를 특징적으로 그리고 상당히 활성화시킨다.
실시예 10
화합물 D 형질전환된 직장결장세포(Colorectal Cells)의 증식을 감소시킨다
소프트 아가 (Soft Agar) 측정법
소프트 아가 콜로니 형성 측정법은 SW480 세포로 이미 기술된 절차(Moody 등, "혈관작용의 장내 펩티드 길항제는 작지 않은 세포 허파암 성장을 억제한다," Proc. Natl . Acad . Sci . USA. 90:4345-49 (1993))를 조금 변형하여 실시하였다.
6-웰 플레이트(Nalge Nunc International, Roskide, Denmark)의 각각의 웰 (35mm)은 태아소혈청 10%를 함유하는 DMEM 배지내의 0.8% 바닥 아가 1ml 로 코팅되었다. 이것이 응고된 다음에, 0.4% 의 상층 아가, 10% 의 태아소혈청, 두배 농축된 화합물, 및 5,000 개의 단일 생세포를 포함하는 DMEM 배지 1ml 을 각각의 웰에 첨가하였다. 상기 배양은 37℃에서 습도있는 5% CO2 인큐베이터에서 항온보관하였다. 소프트 아가 배지에서의 콜로니는 매일 모니터되었고 8일간의 항온보관 후에 사진을 찍었다. 직경 60μm 를 초과하는 콜로니의 수를 세었다.
화합물 D 는 형질전환된 직장결장세포(Colorectal Cells)의 증식을 감소시킨다
소프트 아가 콜로니 형성 측정법은 화합물 D (0.25-5 μM) 및 5-플루오로우라실 (5-FU) (0.5-32 μM)으로 처치된 SW480 세포를 사용하여 수행되었다. 도 8A에 나타난 바와 같이, 화합물 D 콜로니 형성 수에 있어서 용량 의존 감소를 보여준다. 화합물 D 및 5-FU 의 IC50 수치는 각각 0.87 ± 0.11 μM 및 1.98 ± 0.17 μM이었다. 그러므로, 화합물 D 는 카스파제 활성도를 증가시켰고, ß-카테닌 신호 전달을 활성화시키는 돌연변이에 의해 형질전환된 직장결장세포의 시험관 내 성장을 감소시켰다.
실시예 11
화합물 C 는 누드 마우스 모델에서 종양 성장을 감소시킨다
SW620 세포 (9 X 106 세포/마우스) 가 0 일째 에 누드 마우스에 피하적으로 이식되었다. 1일째로부터 시작하여 화합물 C를 격일로 300 mg/kg 을 4회 복강내 주사한후, 21일째까지 격일로 200 mg/kg 을 복강내 주사하였다. 화합물 C 는 벡터 대조 마우스와 비교하여 처치된 마우스에서 종양 성장을 감소시켰고 (도 9A), 벡터 대조 마우스와 비교하여 처치된 마우스의 체중을 약간 감소시켰다 (도 9B).
실시예 12
화합물 D 는 설비빈 ( Survivin ) 발현을 억제한다
화합물 D 의 설비빈 발현에 대한 효과는 전사 및 해독 수준에서 연구되었다. 전사수준에서의 연구는 cDNA 미세배열 분석(cDNA microarray analysis), RT-PCR, 설비빈 정보제공 분석 및 크로마틴 면역침강(ChIP) 을 포함한다. 해독 수준에서 사용되는 방법은 웨스턴 블롯 및 면역화학을 포함한다.
설비빈 프로모터의 조정하에 있는 루시페라제를 포함하는 플라즈미드가 구성되어 야생형, CBP+/-, 또는 p300+/- 3T3 세포에 형질변환되었다. 그 결과 (도 10)는 Wnt 1 이 세가지 타입의 세포 모두에서 설비빈 유전자의 발현을 자극하는 것을 보여준 반면, 화합물 D 는 설비빈 유전자의 발현을 감소시키고 이들 세포에서의 Wnt1에 의한 설비빈 유전자 발현의 자극을 감소시키는 것을 보여준다. 마찬가지로 화합물 D 및 이의 동족체(analog) (화합물 A)은 SW480 세포의 설비빈 발현을 억제하는 것을 나타냈다 (도 11).
실시간 역전사-PCT 분석이 SYBR Green PCR Master Mix Kit (Perkin Elmer Biosystems, Shelton, ST)이 제공한 실험계획안(protocol)에 따라 수행되었다. RT-PCT 반응을 위한 모든 RNA 주형이 화합물 D (25 μM) 또는 대조 (0.5%DMSO) 를 처리한 세포로부터 처치 24시간 후에 RNeasy Midi Kit (Qiagen)를 사용하여 추출되었다. RT-PCR 반응에 사용된 프라이머는 5'-AGCCCTTTCTCAAGGACCAC-3' 및 5'-GCACTTTCTTCGCAGTTTCC-3'이다. 표 8은 분석의 결과를 보여준다. 0.5 미만의 비율은 화합물 D의 처치에 의한 유전자 발현의 상당한 감소를 뜻하는 반면, 1.5 이상의 비율은 유전자 발현의 상당한 증가를 뜻한다. 약 1 의 비율은 변화가 없는 것을 의미한다. 표 8 및 도 12 에 나타난 것과 같이, 설비빈 유전자의 발현은 대조군과 비교하여 화합물 D 의 존재시에 상당히 감소하였다.
화합물 D 존재시 및 부존재시의 유전자 발현
유전자 비율 (처리됨/DMSO 대조군)
유비퀴틴 0.98
GADPH 0.98
HLAC 1.01
설비빈 0.30
PCNA 0.33
항원KI-67 0.45
MIC-1 7.0
GADD-153 7.00
화합물 D (25 μM) 또는 대조군 (0.5% DMSO) 가 처리된 SW 480 세포에 대한 ChIP 측정법을 수행하였다. 도 13 에 나타난 바와 같이, 설비빈 프로모터는 대조군 처리 세포에서 CBP, ß-카테닌, Tcf4 및 아세틸화된 히스톤에 의해 점유되었다. 화합물 D 에 의한 처리는 이들 모든 단백질의 설비빈 프로모터와의 연합을 감소시켰다.
해독 수준에서 설비빈 발현에 대한 화합물 D 의 특성을 알기위해, 오직 벡터만 (0.5% DMSO), 10 μM 또는 25 μM 의 화합물 D, 또는 5 μM 의 5-FU 로 처리된 세포의 추출물에 대해 설비빈 6E4 모노클로날 항체(Cell Signaling Technolgy)를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 그 결과는 (도 14A) 화합물 D 두 가지 농도 모두 및 5-FU 에 의한 처치는 설비빈 단백질의 양을 감소시켰다는 것을 보여준다. 두가지 농도의 화합물 D의 처리는 두가지 모두 5-FU 와 함께 처리하는 것보다 설비빈 발현을 감소시키는데 더 효과적이었고, 더 높은 농도의 화합물 D (즉 25 μM)로 처리하는 것이 가장 효과적이었다.
화합물 D 의 해독수준에서의 설비빈 발현에 대한 효과는 면역형광 현미경을 사용하여 더 조사되었다. 화합물 D 의 부존재시에, 설비빈은 유사분열방추기구에 위치하고 있는데, 이는 설비빈이 염색체 분리에 관계한다는 개념과 일치한다 (도 14B). 이러한 발현양식은 SW480 세포에서 화합물 D 가 처리된 후 설비빈 단백질이 거의 또는 전혀 탐지되지 않았다 (도 14C).
실시예 13
여러 화합물들의 설비빈 및 TCF4 발현에의 효과
일반식 (I) 을 갖는 여러 화합물들의 설비빈 및 TCF4 발현에의 효과가 특징지워졌다. 그 결과는 표 9에 나타난다.
설비빈 및 TCF4 발현에 대한 화합물들의 영향
설비빈 억제 (%) TCF4 IC50 (uM)
5uM 25uM
Figure 112006074580183-PCT00431
 100 99 ~2
Figure 112006074580183-PCT00432
 97 100 ~2.2
Figure 112006074580183-PCT00433
 51 93 ~6.3
Figure 112006074580183-PCT00434
 41 92 5.2 ± 0.7
Figure 112006074580183-PCT00435
 0 6 18.2 ± 2.4
Figure 112006074580183-PCT00436
 0 80 1.3 ± 0.1
Figure 112006074580183-PCT00437
 0 93 2.2 ± 0.2
Figure 112006074580183-PCT00438
 46 96 4.4 ±0.6
Figure 112006074580183-PCT00439
 0 77 3.5 ± 0.3
Figure 112006074580183-PCT00440
 0 92 7.3 ± 0.6
Figure 112006074580183-PCT00441
 79 81 1.7 ± 0.2
Figure 112006074580183-PCT00442
 0 84 4.8 ± 0.4
Figure 112006074580183-PCT00443
 0 68 10.9 ±1.3
Figure 112006074580183-PCT00444
 8 4 NA
Figure 112006074580183-PCT00445
 9 91 1.4 ± 0.2
Figure 112006074580183-PCT00446
 5 91 6.3 ± 0.431
Figure 112006074580183-PCT00447
 0 94 2.6 ± 0.4
Figure 112006074580183-PCT00448
 0 21 7.3 ± 1.1
Figure 112006074580183-PCT00449
 0 91 5.2 ± 1.1
Figure 112006074580183-PCT00450
 45 88 13.2 ±4.1
Figure 112006074580183-PCT00451
 9 92 5.9 ±0.5
Figure 112006074580183-PCT00452
 6 58 11.2 ± 1.5
Figure 112006074580183-PCT00453
 48 96 3.9 ± 0.55
Figure 112006074580183-PCT00454
 0 32 50.4 ± 7.0
Figure 112006074580183-PCT00455
 86 91 2.6 ± 0.6
Figure 112006074580183-PCT00456
 27 98 10.7 ± 1.7
Figure 112006074580183-PCT00457
 80 97 4.6 ±0.7
Figure 112006074580183-PCT00458
 82 97 2.8 ±0.4
Figure 112006074580183-PCT00459
 6 89 13.9 ±2.3
Figure 112006074580183-PCT00460
 14 99 10.7 ± 1.9
Figure 112006074580183-PCT00461
 25 44 27.1 ± 4.6
실시예 14
화합물 D는 설비빈 발현의 억제를 통하여 세포자멸을 촉진한다
화합물 D 의 세포소멸에 대한 효과 및 그러한 효과에서의 설비빈의 역할을 결정하기 위해, 화합물 D 또는 대조군으로 처리된 배양된 종양 세포 내의 카스파제 2 및 3 의 활성을 측정하였다. 그 결과 (도 15) 는 (1) 화합물 D (2.5 μM 또는 5.0 μM) 는 카스파제 3 활성을 활성화시키지만, 카스파제 2의 활성을 활성화시키지는 않았다; (2) 스타우스포린 (0.5 μM) 는 카스파제 2 및 3 의 활성 모두를 증가시켰다; (3) 스타우스포린 및 화합물 D 의 공동 처치는 카스파제 3의 활성을 공동작용하여 자극하였으나, 카스파제 2 의 활성을 공동 작용으로 자극하지 않았다; 그리고 (4) 설비빈 유전자의 형질변환은, 스타우스포린 또는 화합물 D 처리에 의해 유도된 카스파제 3의 활성화 및 스타우스포린 및 화합물 D 의 공동 처치에 의해 유도되는 카스파제 3의 활성의 상승작용(synergic) 자극을 감소시켰다. 상기 결과는 화합물 D 가 설비빈 유전자의 발현을 억제하는 것을 통하여 카스파제 3의 활성을 자극한다는 것을 암시한다.
화합물 D 의 세포소멸에 대한 효과 및 그러한 효과에서의 설비빈의 역할을 알기 위해, 스타우스포린(0.5μM), 화합물 D (5.0 M) 또는 둘 다로 처리된 배양된 종양 세포의 세포 사멸을 측정하였다. 그 결과 (도 16) 는 화합물 D 및 스타우스포린은 둘 다 세포 사멸을 촉진시키고, 설비빈 유전자로 형질변환시킨 경우, 스타우스포린, 화합물 D 또는 둘 다의 처리로 인해 유도된 세포 사멸의 증가를 감소시켰다. 상기 결과는 화합물 D 가 설비빈 유전자의 발현을 억제하는 것을 통하여 세포자멸사를 촉진한다는 것을 암시한다.
화합물 D 의 세포 주기에 대한 효과 및 그러한 효과에서의 설비빈의 역할을 알기 위해, 설비빈 유전자를 포함하는 구성체로 형질변환하거나/하지않은 배양된 종양세포에 대해 스타우스포린(0.5μM), 화합물 D (5.0μM) 또는 둘다로 처리된 것을 가지고 FACS 분석을 수행하였다. 그 결과 (도 17) 는 화합물 D 및 스타우스포린 둘다 G0 기의 세포수를 증가시키고, 세포내에서 설비빈의 과량발현은, 스타우스포린, 화합물 D 또는 둘다의 처리의 효과를 감소시켰다. 상기 결과는 화합물 D 가 세포 주기에 영향을 주는 것은 최소한 부분적으로는 설비빈 유전자의 발현을 억제하는 것을 통하여 이루어지는 것일 수가 있다는 것을 암시한다.
실시예 15
프로드러그의 제조 및 활성
(1) 페닐기의 인산화에 의한 프로드러그의 제조를 위한 일반적인 절차
출발물질인 페놀 (26.06mmol)이 테트라히드로퓨란 (130ml)에 용해되었고, 뒤이어 실온에서 트리에틸아민(TEA) (10.9 ml, 78.18 mmol)이 첨가되었다. 그 반응 혼합물은 5℃로 냉각되었고, 그후 POCl3 (12.2 ml, 130.3 mmol)이 천천히 첨가되었다. 첨가가 끝난후, 그 혼합물은 실온으로 되도록 하였고, 그 온도에서 5시간 동안 교반하였다. 반응이 종결된 후에, 그 혼합물은 셀리트-패드(celite-pad) 필터 깔때기에 부어 TEA-HCl 염을 제거하였다. 유기물(organics)은 5℃에서 물로 희석되었고, 뒤이어 소듐 비카르보네이트(sodium bicarbonate) (50g)을 사용하여 pH 7~8로 조정하였고, 그 결과의 염기성 용액은 실온에서 밤새 교반되었다. 얻어진 수성층은 EtOAc (100ml)로 세척하였고, 그 후 냉동건조(lyophilized)되었다. 조 생성물은 메틸렌 클로라이드 (100ml)에 용해되었고, 실온에서 1시간이 뒤따랐다. 무기염은 셀리트 패드를 이용한 여과에 의해 제거되었고, 이어 용매를 증발시켰다. 조 생성물은 재결정화(EA/에테르)에 의해 정제되어 오프-화이트(off-white)색의 고체로서의 포스포릴화된(phosphorylated) 생성물을 얻었다.
(2) 인산의 유리형태에 대한 전형적인 워크업 (work-up) 절차
얻어진 염기성 수성층을 세척한 후에, 그 용액은 1N HCl을 사용하여 pH 3~4로 산성화되었고, 그 후 인산염 유리 형태는 클로로포름 (300ml)으로 두번 추출되었다. 그 유기층은 소듐 설페이트로 건조되었고, 그 조 생성물은 재결정에 의해 정제되었다.
(3) 유리 형태로부터 디-소듐( di -sodium) 형태로의 전환 방법
A. 적정법(titration method)
유리 형태의 인산염은 적정(titration)에 의해 디-소듐염 형태로 변형될 수 있는데, 이는 많은 무기 염기들을 사용할 수 있다. 예를 들면, 소듐 카르보네이트, 소듐 바이카르보네이트, 및 소듐 하이드록사이드가 디-소듐 형태를 생산하기 위해 본 실험에 사용될 수 있다. 다른 양이온들이 상이한 디-염(di-salt) 형태를 만드는데 사용될 수 있다.
1. 적정을 위한 분석법 및 도구
a. 도구: TitraLab (RADIOMETER COPENHAGEN)
전극: pHG201 pH 유리 전극 (RADIOMETER COPENHAGEN, 945-462)
KCl 염-브리지 용액과의 REF201 참조 전극 (RADIOMETER COPENHAGEN, 945-463)
적정제: 10M Na2CO3
뷰렛 속도 (적정 속도): 15% (=1.5 ml/분)
샘플: 증류수 (30ml)에 용해된 50 mg
b. 결과
pH 4(출발 pH=2)
n 출발 pH EP1 EP2
pH 적정제(ml) pH 적정제(ml)
1 2.10 4.21 9.50 8.15 19.03
2 2.08 4.26 10.28 8.02 19.12
평균 2.09 4.24 9.89 8.09 19.08
B. 유기 나트륨 공여자 사용
무기 염기를 사용하는 적정의 기본적인 결점은 물이 반드시 그 용매로 사용되어야 한다는 점이다. 그러므로 정상적인 유기 용매에 자유롭게 용해되는 나트륨 공여자를 검색하는 것이 그 문제를 해결하는 가장 쉬운 방법이다. 소듐 아세테이트 및 소듐 에틸헥사논산(ethylhexanoic acid)과 같은 여러 시약이 테스트되었고 디-소듐 염 형태를 만드는데 유용하다는 것을 알았다.
표 10은 본 발명의 프로드러그들로부터 선택된 생이용성 테스트 및 그들의 IC50 값을 보여주는데, 이는 실시예 6에 기술된 바와 같은 정보제공 유전자 측정법 (RGA) 및 MTS 에 의한 암유발성(oncogenic) 활성 또는 설포로다민 B 측정법에 의해 측정된다. 표10의 화합물 번호는 표 4 또는 표 5의 것들과는 관계가 없다.
선택된 프로드러그 화합물들에 대한 정보제공 유전자 측정법 (RGA) 및 MTS 에 의한 암유발성(oncogenic) 활성 또는 설포로다민 B 측정법
번호 구조 측정법
RGA, TopF IC50, uM RGA, Survivin IC50, uM MTS, SW480 ( uM ) MTS, HCT116 ( uM )
LD50 GI50 LD50 GI50
1
Figure 112006074580183-PCT00462
 4.2 6.4 17.0 2.0 16.1 2.2
2
Figure 112006074580183-PCT00463
 3.5 5.7 8.2 3.1 23.2 6.6
3
Figure 112006074580183-PCT00464
 11.5 ND up to 50uM 3.0 41.9 3.1
4
Figure 112006074580183-PCT00465
 7.3 6.5 ND up to 50uM 6.9 49.3 11.4
5
Figure 112006074580183-PCT00466
 26.0 34.0 5.2 ND up to 50uM 16.5
6
Figure 112006074580183-PCT00467
 0.8 0.1 9.2 0.5 6.4 0.4
7
Figure 112006074580183-PCT00468
 2.3 1.0 12.9 2.2 12.0 1.8
8
Figure 112006074580183-PCT00469
 1.4 0.9 21.6 2.1 23.2 1.9
9
Figure 112006074580183-PCT00470
 9.6 6.0 ND up to 50uM 7.6 ND up to 50uM 14.7
10
Figure 112006074580183-PCT00471
 2.8 1.7 9.4 0.9 7.9 0.8
11
Figure 112006074580183-PCT00472
 10.3 6.7 ND up to 50uM 6.5 ND up to 50uM 6.3
12
Figure 112006074580183-PCT00473
 1.0 0.7 ND up to 50uM 1.0 19.3 1.2
13
Figure 112006074580183-PCT00474
 1.8 0.9 21.1 2.3 20.0 1.7
14
Figure 112006074580183-PCT00475
 1.7 1.2 21.1 2.3 16.0 2.1
실시예 16
선택된 프로드러그들의 가용성
프로드러그들의 가용성 테스트의 일반적 절차
각각의 프로드러그들의 약 2mg이 아래 지시된 바와 같이 1 ml의 JP1 또는 JP2 용액에 용해되었다. 37℃의 온도에서 배양한 후에, 0시간, 2시간, 20시간에 200㎍의 샘플을 빼냈다. 빼낸 샘플은 0.45㎛의 주사기 필터를 통해 여과되었고 HPLC 시스템에 의해 분석되었다.
인공 위-창자( gastro -intestinal) 액의 조성 ( JP1 , JP2 )
JP1 JP2
PH 1.2 pH 6.8
NaCl 2.0 g 0.2 M KH2PO4 250 ml
10% HCl 24.0 ml 0.2N NaOH 118 ml
증류된 H2O 1L 로 조정됨 증류된 H2O 1L 로 조정됨
하기 표 11은 선택된 프로드러그들의 가용성 테스트 결과를 보여준다. 표 11의 화합물 번호는 표 4, 5, 또는 10의 번호들과는 관계가 없다.
선택된 프로드러그 화합물들의 수용성
번호 구조 가용성 (37℃, ug/mL) 0 시간, 2 시간, 20 시간
JP1 ( pH 1.2 ) JP2 ( pH 6.8 )
1
Figure 112006074580183-PCT00476
 60.1 87.3 92.8 1797 1867 1894
2
Figure 112006074580183-PCT00477
 122 173 160 1950 1939 1940
3
Figure 112006074580183-PCT00478
 1878 1971 2036 1325 1902 2005
4
Figure 112006074580183-PCT00479
 554 646 756 1982 2014 2030
5
Figure 112006074580183-PCT00480
 406 532 684 1761 1778 1758
6
Figure 112006074580183-PCT00481
 1453 1724 1787 1829 1864 1867
7
Figure 112006074580183-PCT00482
 309 446 521 2145 2221 2239
8
Figure 112006074580183-PCT00483
 671 775 921 2295 2317 2272
9
Figure 112006074580183-PCT00484
 2251 2275 2403 2322 2353 2421
10
Figure 112006074580183-PCT00485
 2292 2274 2327 2028 2055 2027
11
Figure 112006074580183-PCT00486
 2006 2000 1998 1636 1654 1651
실시예 17
디메틸- 카르바민산 ( carbamic acid)-4-[2-알릴- 1벤질카르바모일 -8-(2,4- 디플루오로 -벤질)-4.7-디옥소-옥타히드로-피라지노[2,1-c][1,2,4]트리아진-6-일메틸]-페닐 에스테르의 제조
Figure 112006074580183-PCT00487
디메틸포름아미드 내의 출발 물질 (SM) (8.0g, 13.9 mmol) 및 포타슘 카르보네이트 (5.8g, 41.7 mmol)의 교반되는 용액에 디메틸카르바밀 클로라이드 (3.0g, 27.8 mmol)이 첨가되었다. 반응 혼합물은 밤새 교반되었고 그후 EtOAc에 용해되고, 물로 5회 세척되었다. 조합된 유기층이 염수로 세척되었고, 소듐 설페이트로 건조되었고, 진공에서 농축되었다. 잔류물은 니트(neat) EtOAc과의 실리카 겔에서 크로마토그래피되어 생산물 (4.2g, 32%)을 얻었다. 그 결과의 생산물을 질량 분광법 및 NMR에 의해 분석한 데이터는 다음과 같다:
MS (ESI) : m/e 647 (M+1), 669 (M+Na).
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.27-7.39 (6H, m), 6.78-7.13 (6H, m), 6.68 (1H, t, J=6.0 Hz), 5.61-5.70 (2H, m), 5.34 (1H, t, J=6.0 Hz), 5.06-5.20 (2H, m), 4.31-4.69 (4H, m), 3.24-3.58 (8H, m), 3.07 (3H, s), 및 2.99 (3H, s).
실시예 18
탄산(carbonic acid) 4-[2-알릴-1- 벤질카르바모일 -8-(2,4- 디플루오로 -벤질)-4,7- 디옥소 -옥타히드로-피라지노[2,1-c][1,2,4]트리아진-6-일메틸]-페닐 에스테르 4-니트로-페닐 에스테르(2)의 제조
Figure 112006074580183-PCT00488
_
THF (40ml)내의 2-알릴-8-(2,4-디플루오로-벤질)-6-(4-히드록시-벤질)-4,7-디옥소헥사히드로-피라지노[2,1-c][1,2,4]트리아진-1-카르복실산-벤질아민(1) (2 g, 3.47mmol) 에 트리에틸아민 (0.97 ml, 6.95mmol) 및 4-니트로페닐클로로포르메이트 (0.7 g, 3.47 mmol)이 첨가되었다. 실온에서 밤새 교반후에, 그 용매는 감압하에서 제거되었다. 그 조 화합물은 크로마토그래피 (헥산:EtOAc 1:1)로 정제하여 그 화합물 (1.59 g, 62%)을 얻었다. TLC 시스템 및 NMR에 의해 정제된 화합물을 분석한 데이터는 하기와 같다:
TLC 시스템: Rf = 0.3 (n-헥산:EtOAc 1:1)
1H NMR (300MHz, CDCl3): δ 3.25-3.60 (m, 8H), 4.35 (dd, J=14.9 Hz, 5.7 Hz, 1H), 4.43 (dd, J=14.8 Hz, 6.1 Hz,1H), 4.52 (d, 14.5 Hz, 1H), 4.68 (d, 14.1H), 5.10 (d, 17.1 Hz, 1H), 5.21 (d, 10.3 Hz, 1H), 5.34 (t, J=6.1 Hz, 1H), 5.58 (dd, J=11.1 Hz , 4.1 Hz, 1H), 5.67 (m, 1H), 6.71 (t, J=6.1 Hz, NH), 6.75-6.98 (m, 2H), 7.13 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.21 (d, J=8.7 Hz, 2H), 7.23-7.39 (m, 6H), 7.46 (d, J=9.5 Hz, 2H), 및 8.30 (d, J=9.5 Hz, 2H).
실시예 19
(2-디메틸아미노-에틸)- 카르바민산 ( carbamic acid) 4-[2-알릴-1- 벤질카르바모일 -8-(2,4- 디플루오로 -벤질)-4,7- 디옥소 - 옥타히드로 -피라진[2,1-c][1,2,4]트리아진-6-일메틸]-페닐 에스테르 히드로클로라이드 염(3)의 제조
DHF (25ml)내의 탄산(carbonic acid) 4-[2-알릴-1-벤질카르바모일-8-(2,4-디플루오로-벤질)-4,7-디옥소-옥타히드로-피라지노[2,1-c][1,2,4]트리아진-6-일메틸]-페닐 에스테르 4-니트로-페닐 에스테르(2) (1.2g, 1.62 mmol) 에 N,N-디메틸에틸렌디아민 (0.26 ml, 2.43 mmol)이 첨가되었다. 실온에서 밤새 교반후에, 그 용매는 감압하에서 제거되었다. 그 잔류물은 EtOAc로 희석되었고, 물, 염수로 세척되었다. 유기층은 Na2SO4 로 건조되었고, 진공에서 농축되었다. 그 조 화합물은 크로마토그래피 (n-헥산:EtOAc 1:1; EtOAc; CH2Cl2: MeOH, 9:1)로 정제되었다. 그 화합물에 물을 붓고 1N 수성 HCl로 pH 5-6으로 유지하여 HCl염을 만들었고, 그 후 냉동건조하여 화합물 (0.75g, 60%)을 얻었다. TLC 시스템 및 NMR에 의해 정제된 화합물을 분석한 데이터는 하기와 같다:
TLC 시스템: Rf = 0.35 (CH2Cl2:MeOH, 9:1)
ESI-MS: M + H+ 690.39
1H NMR (300MHz, CDCl3): δ2.56 (d, J=4.6 Hz, 6H), 3.18 (bm, 4H), 3.41-3.58 (m, 4H), 3.75 (t, J=10.3 Hz, 1H), 4.21 (bt, 2H), 4.35 (d, J=14.9Hz 1H), 4.70 (d, J=14.9 Hz 1H), 5.05 (m, 1H), 5.12 (m, 1H), 5.42 (m, 6H), 5.80 (m, 1H), 6.91 (d, J=7.6 Hz, 2H), 7.04 (d, J=7.3, 2H), 7.09 (m, 1H), 7.18-7.26 (m, 6H), 7.31 (d, J=6.9 Hz, 2H), 7.33 (m, 1H), 7.84 (bt, NH), 7.98 (bt, NH), 10.7 (bs, 1H)
실시예 20
단일 정맥내 볼루스 주사 후의 프로드러그 A의 마우스 생체내 PK 연구
동물 실험
약물은 10% Tween 80 내의 10mg/kg/5ml으로 제조되었다. 연구는 ICR 마우스에 대해 수행되었다. 꼬리 정맥을 통한 정맥내 볼루스 주사 후에, 혈액 샘플은 여러 시간 지점에서 하대정맥(inferior vena cava)으로부터 얻었고 원심분리에 의해 혈장으로 분리되었다. 혈장 샘플은 분석될 때까지 20℃에서 보존되었다. 출혈 시간 지점은 3, 6, 9, 17, 34, 67, 134, 202, 302 분이었다. N=4.
샘플 준비
보정곡선(calibration curve)을 위해 대조군 마우스 혈장의 98 ㎕ 분량이 2 ㎕의 약물 스톡 용액이 첨가되었고 2 ㎕ 내표준 스톡 용액, 5 ㎍/ml의 내표준(internal standard)이 첨가되었다. 보정 샘플(calibration sample)의 최종 농도는 1, 10, 100, 1000 ng/ml 및 10 ㎍/ml 이었다. 동물 실험으로부터의 혈장 샘플에 대해, 100 ㎕의 혈장이 2 ㎕의 내표준이 첨가되었다. 그리고 나서, 모든 샘플은 500 ㎕의 아세토니트릴, 500 ㎕의 에틸아세테이트 및 100 ㎕의 DW 가 첨가되었다. 샘플은 10분간 혼합되었고, 원심분리되었다. 상층액은 다른 튜브로 옮겨졌고 증발되었다. 200 ㎕의 40% 아세토니트릴을 첨가하고, 다시 구성되어 LC-MS 시스템으로 분석되었다.
결과
프로드러그 A의 정맥내 볼루스 주사 후의 시간의 경과에 따른 마우스 혈장 내의 프로드러그 A프로드러그 A 및 그것의 모 화합물의 농도의 변화는 도 18에 나타난다. 사각형: 모 화합물; 다이아몬드: 프로드러그 A.
Figure 112006074580183-PCT00489
Figure 112006074580183-PCT00490
프로드러그 A 모(Patent)
비록 본 발명의 특정 실시 태양이 설명하기 위해 여기에 기술되었지만, 많은 변형이 본 발명의 요점 및 범위를 벗어나지 않고 만들어질 수 있다는 것으로 생각된다. 그러므로, 본 발명은 첨부된 청구범위를 제외하고는 제한되지 않는다.
미국특허출원번호 10/087,443 (2002 년 3월 1일 출원), 및 미국특허출원번호 09/976,470 (2001년 10월 12일 출원)을 포함하여, 명세서 및/또는 서지사항에 언급된 상기 모든 미국특허, 미국 특허출원공개, 미국 특허 출원, 외국 출원, 외국 특허 출원 및 비특허공개는 여기에 인용에 의해 삽입된다.
상기에 의해, 비록 본 발명의 특정 실시 태양이 설명하기 위해 여기에 기술되었지만, 많은 변형이 본 발명의 요점 및 범위를 벗어나지 않고 만들어질 수 있다는 것으로 생각된다. 그러므로, 본 발명은 첨부된 청구범위를 제외하고는 제한되지 않는다.

Claims (42)

  1. 하기 일반식 (I) 을 갖는 화합물 또는 그 이성질체:
    Figure 112006074580183-PCT00491
    상기 식에서, A는 -(CHR3)- 또는 -(C=O)-이고, B는 -(CHR4)- 또는 -(C=O)-이고, D는 -(CHR5)- 또는 -(C=O)-이고, E는 -(ZR6)- 또는 -(C=O)-이고, G는 -(XR7)n-, -(CHR7)-(NR8)-, -(C=O)-(XR9)-, 또는 -(C=O)-이고, W는 -Y(C=O)-, -(C=O)NH-, -(SO2)-, 또는 부존재하고, Y는 산소, 황, 또는 -NH-이고, X 및 Z는 독립적으로 질소 또는 CH이고, n=0 또는 1; 그리고 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 및 R9는 동일하거나 상이하고 아미노산 측쇄 부분(side chain moiety) 또는 그의 유도체, 분자의 잔여부분으로부터 독립적으로 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화합물에서 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 및 R9는 아미노C2-5알킬, 구아니디노C2 - 5알킬, C1 - 4알킬구아니디노C2 - 5알킬, 디C1 - 4알킬구아니디노C2-5알킬, 아미디노C2 - 5알킬, C1 - 4알킬아미디노C2 - 5알킬, 디C1 - 4알킬아미디노C2 - 5알킬, C1 -3알콕시, 페닐, 치환된 페닐 (여기서 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드 라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1-4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 벤질, 치환된 벤질 (여기서 벤질 상의 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 나프틸, 치환된 나프틸 (여기서 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 비스-페닐 메틸, 치환된 비스-페닐 메틸 (여기서 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 피리딜, 치환된 피리딜, (여기서 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1-4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 피리딜C1 - 4알킬, 치환된 피리딜C1 - 4알킬 (여기서 피리딘 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 피리미딜C1 - 4알킬, 치환된 피리미딜C1 - 4알킬 (여기서 피리미딘 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 트리아진-2-일-C1-4알킬, 치환된 트리아진-2-일-C1 - 4알킬 (여기서 트리아진 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 이미다졸C1-4알킬, 치환된 이미다졸 C1 - 4알킬 (여기서 이미다졸 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 또는 하이드록실 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다), 이미다졸리닐C1 - 4알킬, N-아미디노피페라지닐-N-C0 - 4알킬, 하이드록시C2 - 5알킬, C1 - 5알킬아미노C2 - 5알킬, C1-5디알킬아미노C2-5알킬, N-아미디노피페리디닐C1 - 4알킬 및 4-아미노사이클로헥실C0 - 2알킬로부터 독립적으로 선택되는 것인 화합물 또는 그 이성질체.
  3. 제1항에 있어서, A가 -(CHR3)-이고, B가 -(C=O)-이고, D가 -(CHR5)-이고, E가 -(C=O)-이고, G가 -(XR7)n- 이고, 다음 일반식 (II)를 갖는 화합물 또는 그 이성질체:
    Figure 112006074580183-PCT00492
    상기 식에서, R1, R2, R3, R5, R7, W, X 및 n은 제1항에서 정의한 바와 같다.
  4. 제1항에 있어서, A가 -(C=O)-, B가 -(CHR4)-, D가 -(C=O)-, E가 -(ZR6)-, G가 -(C=O)-(XR9)- 이고, 하기 일반식 (III)을 갖는 화합물 또는 그 이성질체:
    Figure 112006074580183-PCT00493
    상기 식에서, R1, R2, R4, R6, R9, W 및 X는 제1항에서 정의한 바와 같으며, Z는 질 소 또는 CH 이고, 단 Z가 CH일 때 X는 질소이다.
  5. 제1항에 있어서, A가 -(C=O)-, B가 -(CHR4)-, D가 -(C=O)-, E가 -(ZR6)-, G가 (XR7)n-이며, 다음 일반식 (IV)를 갖는 화합물 또는 그 이성질체:
    Figure 112006074580183-PCT00494
    상기 식에서, R1, R2, R4, R6, R7, W, X 및 n은 제1항에서 정의한 바와 같으며, Z는 질소 또는 CH 이고, 단 Z가 질소일 때 n은 0이며, 또한 Z가 CH일 때 X는 질소이고 n은 0이 아니다.
  6. 제5항에 있어서, 상기 화합물이 하기 일반식(VI)를 갖는 화합물 또는 그 이성질체:
    Figure 112006074580183-PCT00495
    상기 식에서, Ra는 페닐기; 하나 이상의 치환체를 갖는 치환된 페닐기 (이때, 하나이상의 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 및 하이드록실기 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다); 벤질기; 하나 이상의 치환체를 갖는 치환된 벤질기 (이때, 하나 이상의 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 및 하이드록실기 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다); 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 1 내지 3개 헤테로원자를 가질 수 있는 8 내지 11 환 구성원을 갖는 바이사이클릭(bicyclic) 아릴기이다; Rb 는 5 내지 7 환을 갖는 모노사이클릭 아릴기로, 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 1 내지 2개 헤테로원자를 가질 수 있으며 또한 화합물중의 아릴 환이 할로겐화물(halide), 히드록시, 시아노, 저급 알킬, 및 저급 알콕시기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환체를 가질 수 있다; Rc는 포화 또는 불포화 C1 - 6알킬, C1 - 6알콕시, 퍼플루오로C1-6알킬기이며; 그리고 X1, X2, 및 X3은 동일 또는 상이하며 또한 수소, 하이드록실, 및 할로겐화물로부터 독립적으로 선택된다.
  7. 제6항에 있어서, Ra는 페닐기; 하나 이상의 치환체를 갖는 치환된 페닐기(이때, 하나 이상의 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 및 하이드록실기 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다); 벤질기; 하나 이상의 치환체를 갖는 치환된 벤질기(이때, 하나 이상의 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 -4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 및 하이드록실기 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다); 나프틸기; 퀴놀리닐기; 또는 이소퀴놀리닐기이고; Rb 는 페닐, 피리딜 또는 피페리딜 이고, 이들 모두는 할로겐화물(halide), 히드록시, 시아노, 저급 알킬, 및 저급 알콕시기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있는 것인 화합물 또는 그 이성질체.
  8. 하기 일반식 (VII)을 갖는 화합물:
    (VI)-Y-R10
    여기서, (VI)는 하기 일반식을 갖고:
    Figure 112006074580183-PCT00496
    상기 식중, Ra는 페닐기; 하나 이상의 치환체를 갖는 치환된 페닐기(이때, 하나이상의 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 및 하이드록실기 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다); 벤질기; 하나 이상의 치환체를 갖는 치환된 벤질기(이때, 하나 이상의 치환체는 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미다조닐, C1 - 4알킬아미노, C1 - 4디알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오로C1 - 4알킬, C1 - 3알콕시, 니트로, 카르복시, 시아노, 설푸릴 및 하이드록실기 중의 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다); 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 1 내지 3개 헤테로원자를 가질 수 있는 8 내지 11 환 구성원을 갖는 바이사이클릭(bicyclic) 아릴기이고;
    Rb 는 5 내지 7 환 구성원을 갖는 모노사이클릭 아릴기로, 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 1 내지 2개 헤테로원자를 가질 수 있으며 또한 화합물 중의 아릴 환이 할로겐화물(halide), 히드록시, 시아노, 저급 알킬, 및 저급 알콕시기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환체를 가질 수 있고;
    Rc는 포화 또는 불포화 C1 - 6알킬, C1 - 6알콕시, 퍼플루오로C1 - 6알킬기이며; 및
    X1, X2, 및 X3은 동일 또는 상이하며 또한 수소, 하이드록실, 및 할로겐화물로부터 독립적으로 선택되고;
    Y는 Ra, Rb, Rc, X1, X2 및 X3로부터 선택되는 기의 산소, 황, 또는 질소이고;
    R10은 인산염, 헤미숙시네이트, 헤미말레이트, 포스포릴옥시메틸옥시카르보닐, 디메틸아미노아세테이트, 디메틸아미노알킬카르바메이트, 하이드록시알킬, 아미노산, 글로코실, 치환된 또는 치환되지 않은 피페리딘 옥시카르보닐, 또는 그들의 염이고;
    일반식 (VII)를 갖는 화합물은 포스포테이즈 또는 카르복실레이즈의 기질로서 작용할 수 있고 그럼으로써 일반식 (VI)를 갖는 화합물로 전환된다.
  9. 제1항에 있어서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 또는 R9가 고체 지지체 또는 고체 지지체 유도체에 결합되는 것인 화합물 또는 그 이성질체.
  10. 제2항에 있어서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 또는 R9가 고체 지지체 또는 고체 지지체 유도체에 결합되는 것인 화합물 또는 그 이성질체.
  11. 제3항에 있어서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 또는 R9가 고체 지지체 또는 고체 지지체 유도체에 결합되는 것인 화합물 또는 그 이성질체.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 및 약리학적으로 허용되는 운반체를 포함하는 약리학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 조성물이 화합물의 안전하고 유효한 양을 포함하는 것인 약리학적 조성물.
  14. 제1항 내지 제8항의 어느 한 항에 기재된 화합물을 하나 이상을 포함하는, 화합물의 라이브러리.
  15. 생물학적 활성을 갖는 화합물을 식별하는 방법으로서, 생물학적 활성을 갖는 화합물을 검출 또는 스크린닝하기 위해 제14항의 라이브러리를 표적(target)에 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  16. 결합 분석(binding assay)을 수행하는 방법으로서,
    a) 제 1 공동활성자 및 상호작용하는 단백질을 함유하며, 상기 제1 공동활성자가 LXXLL, LXXLI 또는 FXXFF (여기서 X는 임의의 아미노산임)의 결합 모티프를 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
    b) 상기 제1 공동활성자 및 상기 상호작용하는 단백질을 시험 화합물과 결합시키는 단계; 및
    c) 화합물의 존재 하에서 제1 공동활성자 및 상호반응 단백질 사이의 결합의 변형을 탐지하는 단계를,
    포함하는 방법으로, 이때 상기 시험 화합물은 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 결합분석을 수행하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 상호작용하는 단백질이 전사 인자 또는 제2 공동 활성자인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 상호작용하는 단백질이 RIP140; SRC-1 (NCoA-1); TIF2 (GRIP-1; SRC-2); p (CIP; RAC3; ACTR; AIB-1; TRAM-1; SRC-3); CBP (p300); TRAPs (DRIPs); PGC-1; CARM-1; PRIP (ASC-2; AIB3; RAP250; NRC); GT-198; 및 SHARP (CoAA; p68; p72) 로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  19. 제16항에 있어서, 상기 상호작용하는 단백질이 TAL 1; p73; MDm2; TBP; HIF-1; Ets-1; RXR; p65; AP-1; Pit-1; HNF-4; Stat2; HPV E2; BRCA1; p45 (NF-E2); c-Jun; c-myb; Tax; Sap 1; YY1; SREBP; ATF-1; ATF-4; 쿠비투스(Cubitus); 인테룹투 스(Interruptus); Gli3; MRF; AFT-2; JMY; dMad; PyLT: HPV E6; CITTA; Tat; SF-1; E2F; junB; RNA 헬리케이즈 A; C/EBP ß; GATA-1; Neuro D; 마이크로프탈리미아(Microphthalimia); E1A; TFIIB; p53; P/CAF; 트위스트(Twist); Myo D; pp9O RSK; c-Fos; 및 SV40 Large T 로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  20. 제16항에 있어서, 상기 상호작용하는 단백질이 ERAP140; RIP140; RIP160; Trip1; SWI1 (SNF); ARA70; RAP46; TIF1; TIF2; GRIP1; 및 TRAP 로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  21. 제16항에 있어서, 상기 상호작용하는 단백질이 VP16; VP64; p300; CBP; PCAF; SRC1 PvALF; AtHD2A; ERF-2; OsGAI; HALF-1; C1; AP-1; ARF-5; ARF-6; ARF-7; ARF-8; CPRF1; CPRF4; MYC-RP/GP; 및 TRAB1 로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  22. 제16항에 있어서, 상기 제1 공동 활성자가 CBP 또는 p300 인 것인 방법.
  23. 종양 성장을 억제하는 방법으로서, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 제12항 또는 제13항 기재의 조성물을 종양이 있는 포유동물 대상에, 상기 포유동물 대상내의 종양의 성장을 억제하는 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 종양이 암성(cancerous)인 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 종양이 직장결장암(colorectal cancer)인 것인 방법.
  26. 암을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 투여가 필요한 대상에게 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 제12항 또는 제13항에 기재된 조성물을 상기 암을 치료 또는 예방하는데 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 암을 치료 또는 예방하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 암은 직장결장암(colorectal cancer)인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 화합물 또는 상기 조성물이 항종양제와 함께 투여되는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 항종양제는 5-FU, 탁솔, 시스플라틴, 미토마이신 C, 테가푸르(tegafur), 랠티트렉스트(raltitrexed), 카페시타빈(capecitabine), 및 이리노테칸(irinotecan) 으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  30. 혈관성형술(angioplasty)과 관련된 재협착(restenosis)을 치료 또는 예방하 는 방법으로서, 투여가 필요한 대상에게, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 제12항 또는 제13항에 기재된 조성물을 상기 재협착을 억제하는데 유효한 양을 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 혈관성형술과 관련된 재협착을 치료 또는 예방하는 방법.
  31. 다낭신질환(polycystic kidney disease)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 투여가 필요한 대상에게, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 제12항 또는 제13항에 기재된 조성물을 상기 다낭신질환을 치료하는데 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 다낭신질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  32. 비정상 혈관생성증(aberrant angiogenesis disease)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 투여가 필요한 대상에게, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 제12항 또는 제13항에 기재된 조성물을 상기 비정상 혈관생성증을 치료하는데 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 비정상 혈관생성증을 치료 또는 예방하는 방법.
  33. 류마티스 관절염을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 투여가 필요한 대상에게, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 제12항 또는 제13항에 기재된 조성물을 상기 류마티스 관절염을 치료하는데 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 류마티스 관절염을 치료 또는 예방하는 방법.
  34. 궤양성 대장염(ulcerative colitis)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 투여가 필요한 대상에게, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 제12항 또는 제13항에 기재된 조성물을 상기 궤양성 대장염을 치료하는데 유효한 양을 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 궤양성 대장염을 치료 또는 예방하는 방법.
  35. 결절경화증후군(TSC)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 투여가 필요한 대상에게, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 제12항 또는 제13항에 기재된 조성물을 상기 TSC를 치료 또는 예방하는데 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 TSC를 치료 또는 예방하는 방법.
  36. KSHV 관련 종양을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 투여가 필요한 대상에게, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 제12항 또는 제13항에 기재된 조성물을 상기 KSHV 관련 종양을 치료 또는 예방하는데 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 KSHV 관련 종양을 치료 또는 예방하는 방법.
  37. 헤어(hair) 성장을 조절하는 방법으로서, 투여가 필요한 대상에게, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 제12항 또는 제13항에 기재된 조성물을 헤어 성장을 조절하는데 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 헤어 성장을 조절하는 방법.
  38. 알쯔하이머 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 투여가 필요한 대상에게, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 제12항 또는 제13항에 기재된 조성물을 알쯔하이머 질환을 치료 또는 예방하는데 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 알쯔하이머 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  39. 신경돌기 성장을 촉진하는 방법으로서, 뉴런(neuron)을, 신경돌기 성장을 촉진하는데 유효한 양의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 제12항 또는 제13항에 기재된 조성물에 접촉시키는 것을 포함하는 신경돌기 성장을 촉진하는 방법.
  40. 신경 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법으로서, 신경 줄기 세포를, 신경 줄기 세포의 분화를 촉진하는데 유효한 양의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 제12항 또는 제13항에 기재된 조성물에 접촉시키는 것을 포함하는 신경 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법.
  41. 암세포의 세포자멸사를 촉진하는 방법으로서, 암세포를, 암세포의 세포자멸사를 촉진하는데 유효한 양의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 제12항 또는 제13항에 기재된 조성물에 접촉시키는 것을 포함하는 암세포의 세포자멸사를 촉진하는 방법.
  42. 세포내의 설비빈(survivin) 발현을 억제하는 방법으로서, 설비빈을 발현하는 세포를, 설비빈 발현을 억제하는데 유효한 양의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 제12항 또는 제13항에 기재된 조성물에 접촉시키는 것을 포함하는 세포내의 설비빈(survivin) 발현을 억제하는 방법.
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